Автореферат и диссертация по медицине (14.01.24) на тему:Разработка биоматериалов для реконструктивной хирургии на основе ксеноперикардиальной ткани

Венедиктов Алексей Александрович

писи

РАЗРАБОТКА БИОМАТЕРИАЛОВ ДЛЯ РЕКОНСТРУКТИВНОЙ ХИРУРГИИ НА ОСНОВЕ КСЕНОПЕРИКАРДИАЛЬНОЙ ТКАНИ

14.01.24 - Трансплантология и искусственные органы 03.01.04- Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

^ май т

Москва-2014

005548535

005548535

Работа выполнена в ФГБОУ ВПО «Пензенский государственный университет» и ФГБУ «Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И.Шумакова» Министерства здравоохранения России.

Научные руководители:

Доктор биологических наук, профессор

Доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты:

Немченко Евгений Владимирович

Городков Александр Юрьевич

Виктор Иванович Севастьянов

Михаил Трофимович Генгин

Доктор медицинских наук ФГБУ «Федеральный центр сердечнососудистой хирургии» Минздрава России,

заведующий отделением № 1

Доктор биологических наук ФГБУ "Научный центр сердечнососудистой хирургии им. А.Н. Бакулева РАМН"

и/о зав. лабораторией моделирования патологии сердца и сосудов с оперблоком и виварием

Ведущее учреждение: ГКО У ВПО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Защита диссертации состоится «2-Ц» иЛгОУ^З- 2014 года в [ЬД/Огасов на заседании Диссертационного Совета (Д.208.055.01) ФГБУ «Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов им. академика В.И. Шумакова» Минздрава России, по адресу: 123182, г. Москва, ул. Щукинская, д.1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов им. академика В.И. Шумакова» Минздрава России и на сайте http://www.transpl.ru.

Автореферат диссертации разослан « ^л^-риА 2014 года.

Ученый секретарь Диссертационного Совета (Д.208.055.01) Доктор медицинских наук

Шаршаткин Алексей Вячеславович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В биологических материалах с заданными и контролируемыми характеристиками нуждаются многие технологии реконструктивной и заместительной хирургии, направленные на восполнение потери и активизацию регенераторных процессов мягких тканей организма. Медицинские имплантаты, созданные на основе синтетических искусственных материалов, имеют определенные достоинства, однако они не в состоянии повторить пространственную архитектонику и физиологическую активность биологических материалов. Несмотря на то, что большое количество исследователей делает акцент на производство и внедрение синтетических материалов, в настоящее время большое внимание уделяется разработке медицинских изделий на основе биоматериалов биологического происхождения, таких как биополимеров или биотканей. Биологические материалы, помимо высокой степени биосовместимости с организмом, являются высокоэффективными биостимуляторами, а продукты биодеструкции таких материалов безопасны и, в ряде случаев, могут быть веществами, включаемыми в метаболизм клеток. Сфера применения таких биоимплантатов непрерывно расширяется, что диктует необходимость создания медицинских изделий на их основе с широким спектром свойств, разным поведением и разным биологическим действием.

Наиболее перспективным направлением на сегодняшний день является разработка биоимплантатов на основе коллагенсодержащих биотканей. Одной из разновидностей подобных материалов является обработанный разными способами ксеноперикард крупного рогатого скота.

Настоящая работа направлена на разработку и исследование биоимплантатов на основе ксеноперикардиальной ткани с разными физико-механическими и биорезорбируемыми свойствами для различных областей реконструктивной и заместительной хирургии.

Цель работы: разработка способов обработки ксеноперикардиальной ткани для получения биоимплантатов с заданными физико-механическими и биорезорбируемыми свойствами.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Найти режимы многостадийной химико-ферментативной обработки ксеноперикардиальной ткани, позволяющие варьировать физико-механическими и биорезорбируемыми свойствами биоткани.

2. Провести сравнительный анализ физико-мсханических и биорезорбируемых свойств полученных ксеноперикардиальных биоматериалов.

3. Изучить местное действие полученных ксеноперикардиальных биоматериалов после имплантации в ткани животных.

4. Провести оценку функциональных свойств разработанных ксеноперикардиальных биоматериалов в условиях in vivo.

Научная новизна работы. Впервые показано, что изменением параметров ключевых стадий химико-ферментативной обработки ксеноперикардиальной ткани (концентрация фермента, температура ферментативной инкубации, инкубация в средах с разным осмотическим давлением, концентрация сшивающего агента) можно направленно влиять на структуру и свойства биоткани. Разработана оригинальная методика химико-ферментативной обработки ксеноперикардиальной ткани. Разработаны 2 протокола обработки ксеноперикарда, позволяющие получать биосовместимые материалы с разными физико-механическими и биорезорбируемыми свойствами. Проведен сравнительный анализ физико-механических и

биорезорбируемых свойств в условиях in vitro двух видов разработанных биоматериалов с контролем (известным запатентованным способом). В экспериментах in vivo доказано, что независимо от выбранных режимов обработки, полученные биоматериалы не вызывают отторжения, подвергаются процессам биоинтеграции и замещаются новообразованной васкуляризованной тканью. На экспериментальных моделях имплантации в условиях in vivo в брюшную стенку и стенку мочевого пузыря доказаны высокие адаптационные и интеграционные свойства разработанных ксеноперикардиальных биоматериалов к мягким тканям.

Научная н практическая значимость работы. Разработанные протоколы обработки биоткани позволили создать два вида биоматериала, отличающихся физико-механическими и биорезорбирующими свойствами, как потенциальных имплантатов для реконструктивно-восстановительной и пластической хирургии мягких тканей.

«Ксеноперикардиальный биоматериал I» характеризуется высокими показателями прочности и упругости, обладает низкой скоростью резорбции и относительно медленным замещением собственными тканями. Он может быть преимущественно использован в качестве биоматериала, замещающего поврежденные ткани, подверженные механической нагрузке, например, в реконструктивных операциях для пластики дефектов сухожильно-связочных структур, в герниопластике, гинекологии, а также в антирефлоксной хирургии.

«Ксеноперикардиальный биоматериал II» с относительно низкими показателями упруго-деформативных свойств, но с большей скоростью резорбции и высокой степенью биоинтеграции, может быть преимущественно использован в качестве биоматериала, замещающего поврежденные ткани, не подверженные механической нагрузке, например, в реконструктивных операциях для протезирования твердой мозговой оболочки, укрытия культи почки, пластике мочевого пузыря и мочеточников, корпоропластике при болезни Пейрони и других операциях.

Положения, выносимые на защиту.

1. Экспериментально установлено, что изменение параметров ключевых стадий многостадийной химико-ферментативной обработки ксеноперикарда (концентрация фермента, температура ферментативной инкубации, инкубация в средах с разным осмотическим давлением, концентрация сшивающего агента) существенно влияет на структурные свойства биоткани.

2. Показана возможность получать ксеноперикардиальные биоматериалы с различной скоростью резорбции и физико-механическими характеристиками.

3. Разработана оригинальная химико-ферментативная методика обработки ксеноперикарда.

4. На основе разработанных протоколов химико-ферментативной обработки ксеноперикарда получены два вида биоматериала с заданными физико-механическими свойствами и скоростью резорбции.

5. Доказано, что независимо от режима обработки биоткани, разработанные ксеноперикардиальные биоматериалы обладают высокими биосовместимыми свойствами: не вызывают реакции отторжения при имплантации, биорезорбция имплантата в условиях in vivo сопровождается замещением новообразованной тканью животного и процессами неоваскуляризации.

6. Активность процесса новообразования соединительной ткани в месте имплантации ксеноперикардиального биоматериала через год после операции превосходит на 25% аналогичный показатель, полученный в тканях вокруг полипропиленовой сетки.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены и обсуждены на многих российских и международных конференциях и выставках медицинских изделий:

• региональная научно-техническая конференция «Инновационные технологии в экономике, информатике и медицине» Пенза, 2010;

• научно-практическая конференция «Достижения и перспективы развития биотехнологии», Пенза 2010

• научно-практическая конференция «Фундаментальные исследования в Пензенской области: состояние и перспективы», Пенза 2010

• межрегиональная научно-практическая конференция памяти академика H.H. Бурденко «Актуальные проблемы современного практического здравоохранения», Пенза 2010.

• общероссийский съезд травматологов-ортопедов России, Саратов 2010

• XVI Всероссийский съезд сердечно-сосудистых хирургов, г. Москва, 2010

• XVII Всероссийский съезд сердечно-сосудистых хирургов, г. Москва, 2011

• XVIII Всероссийский съезд сердечно-сосудистых хирургов, г. Москва, 2012

• Международная выставка медицинских изделий «Medica 2011» (Дюссельдорф, Германия)

• Международный съезд кистевых хирургов «FESSH 2012» (г. Антверпен, Бельгия)

• Международный съезд сердечно-сосудистых и торакальных хирургов «The 20st annual meeting of the ASCVTS-2012» (г. Нуса-Дуа, Индонезия)

• Международный съезд сердечно-сосудистых и торакальных хирургов «The 26st annual meeting of the EACTS-2012» (г. Барселона, Испания)

• Международный съезд сердечно-сосудистых и торакальных хирургов «The 21st annual meeting of (he ASCVTS-2013» (г. Кобе, Япония)

• Научно-практическая конференция «Инновационные имплантаты в хирургии» (Пенза, 2014)

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 19 печатных работ, в том числе 9 статей в журналах, рекомендованных ВАК РФ, поданы 2 заявки на патент РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций, экспериментально-клинических данных применения разработанных биоматериалов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 125 страницах, иллюстрирована 47 рисунком и 12 таблицами. Список цитируемой литературы включает 128 источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Экспериментальный материал: реактивы производства компаний «Sigma-Aldrich Chemie GmbH» (Германия) и «Panreac Química SA» (Испания), перикардиальная ткань телят и быков, забранная у здоровых животных с ОАО МПК «Пензенский» в соответствии с требованиями международных стандартов серии ISO 9001 и ISO 22442 и доставленная в химико-биологическую лабораторию в течение не более 3 часов в изотермических контейнерах («Campingaz» вертикальный 30 л.) в физиологической изотонической среде с аккумуляторами холода.

Определение физико-механических параметров ксеноиерикарда. Физико-механические параметры полученных биоматериалов оценивали по четырем параметрам: модуль упругости, максимальная нагрузка, напряжение при растяжении при максимальной нагрузке и относительное удлинение при растяжении. Исследование зависимости «напряжение — относительное удлинение» для расчета модуля упругости проводилось на экспериментальной разработанной установке. Для исследования выбирались однородные по толщине образцы ткани перикарда, толщина ткани определялась микрометром не менее чем в 10 точках, на ткани выбирались участки одинаковой толщины, после чего из нее специальным приспособлением вырубались образцы шириной 2 мм и длиной 20-30 мм. Образцы закреплялись в зажимах таким образом, что бы рабочая часть образца составляла 1820 мм. Используемая установка позволяла оценивать ряд физико-механических свойств образцов при их нахождении в физиологическом растворе. Расчет сечения растянутого образца выполняли с учетом его не сжимаемости. Все исследования зависимости напряжение - относительное удлинение проводили в области упругих деформаций. Область упругих деформаций определяли по следующим признакам. Если после каждого цикла нагружение — снятие нагрузки образец мгновенно восстанавливал свои первоначальные размеры, то данная область относилась к области упругих деформаций. Модуль упругости вычисляли по тангенсу угла наклона прямых в координатах «напряжение - относительное удлинение». Исследование остальных физико-механических характеристик экспериментального материала определяли на испытательной машине «Instron Biopuls 3342 (0,5 кН)» с анализом следующих параметров: максимальная нагрузка, напряжение при разрушении, относительное удлинение.

Исследование скорости резорбции биоматериалов в условиях in vitro. На модели in vitro определяли время резорбции образцов ксеноперикарда в боратном буферном растворе (рН=7,4). Испытание окислительной деструкции образцов проводили в реактиве Фентона (рН=7,4) следующего состава: 100 мкмоль/л сульфата железа (Fe2+) и 1 ммоль/л 3 % Н202. Перед экспериментом образцы высушивали до постоянной массы при 70-85°С с точностью до 0,0001 г. Затем образцы инкубировали при 37°С в модельной среде в течение 2, 4 и 12 недель. После окончания каждой серии эксперимента образцы высушивали до постоянной массы и взвешивали. Частота смены среды: 1 раз в 3 дня.

Исследование местного действия биоматериалов после имплантации. Для изучения тканевой реакции на имплантируемый материал и процесса его биоинтеграции образцы биоматериалов имплантировали под кожу крысам (Wistar, самцы, масса 220-260 г.) в область межлопаточного пространства. Операцию выполняли в стерильных условиях под эфирным наркозом.

Гистологическое исследование образцов. Исследования проводили в соответствии с ГОСТ Р ИСО 10993-6-2009 "Исследование местного действия после имплантации". Изменение структуры биоматериала после имплантации анализировали методом световой микроскопии с окраской препаратов гематоксилин-эозином и по Вейгерт-Ван-Гизону. Гистологические срезы изучали с использованием микроскопа Zeiss Imager Al (Zeiss). Изображения получали с помощью камеры AxioCam MRc 5 (Zeiss).

Экспериментальные модели для оценки функциональных свойств ксеноперикардиальных биоматериалов в условиях in vivo. В качестве экспериментальных животных были выбраны кролики породы Шиншилла массой до 3,5 кг. Была создана модель имплантации исследуемого ксеноперикардиалыюго биоматериала, максимально приближенную к условиям протезирования брюшной

стенки человека, а также протезирования стенки мочевого пузыря. Гистологическому исследованию подвергались микроирепараты, изготовленные из фрагментов брюшной стенки и стенки мочевого пузыря, содержащих имплантаты. Изучали основные морфологические параметры тканевой реакции.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 1. РАЗРАБОТКА ПРОТОКОЛОВ ОБРАБОТКИ

КСЕНОПЕРИКАРДИАЛЫЮЙ ТКАНИ

За основу разработки был взят способ подготовки биоткани для ксснопротезирования, описанный в патенте РФ № 2197818. Обработка ксеноперикарда с целью получения биоматериала для имплантируемых изделий -многостадийный процесс. Были выделены следующие ключевые параметры обработки:

• концентрация фермента

• температура ферментативной инкубации

• инкубация в средах с разным осмотическим давлением

• концентрация сшивающего агента.

После экспериментального изучения параметров обработки биоткани были выбраны «рабочие» режимы каждого из них. Исходя из этих данных, была составлена матрица параметров протокола обработки биоматериала. На основании требований к разрабатываемым биоматериалам путем комбинации параметров по матрице были разработаны протоколы обработки ксеноперикарда для каждого вида биоматериала.

В эксперименте участвовало 3 группы образцов.

Протокол №1. Образцы ксеноперикардиальной ткани обрабатывали следующим образом. После первичной обработки образцы подвергали экспозиции в растворе хлористого натрия в течение 1 ч (концентрация соли в гипертонической среде - 2%), затем промывали проточной водой и проводили ферментацию с концентрацией протеолитического фермента 10 ПЕ в боратном буферном растворе (рН=8.2) в умеренно щелочной среде при температуре 37°С в течение 4 часов для разрушения клеточных элементов и сохранения белкового каркаса. После нейтрализации фермента пикельным раствором (9,5% хлористого натрия + 4 % раствор уксусной кислоты) последний нейтрализовали 0,1 М раствором гидрокарбоната натрия в течение 20 минут. Продукты протеолиза удаляли в дистиллированной воде в течение 1 ч с последующей гипертонической экстракцией в растворах с нарастающей концентрацией. Соли удаляли проточным промыванием в течение 10 минут. Далее обработанный перикард помещали на специальные приспособления в ненапряженном состоянии для придания соответствующей формы и проводили структурную стабилизацию в 0,25% растворе глутарового альдегида на боратном буфере (в кислой среде). Затем материал с заданной формой снимали с приспособлений и подвергали химической стерилизации. Образцы этой группы обработаны в соответствии со способом подготовки биоткани для ксенопротезирования, описанном в патенте РФ № 2197818. Эта группа образцов служила контрольной группой сравнения в экспериментальном исследовании. Шифр образцов «Контроль».

Протокол №2. Образцы ксеноперикардиальной ткани обрабатывали следующим образом. После первичной обработки образцы подвергали экспозиции в растворе хлористого натрия в течение 1 ч (концентрация соли в гипертонической среде - 2%), затем, в отличие от контроля, не промывая проточной водой, погружали

ткань в 4% раствор хлористого натрия для создания пониженного осмотического давления и помещали образцы в ультразвуковую ванну, в отличие от контроля, на определенное время. Подобная обработка ткани позволяет уменьшить количество используемого фермента на последующей стадии, не затрагивая целостности коллагеновых и эластических волокон. Затем проводили ферментацию с пониженной в отличие от контроля концентрацией протеолитического фермента хПЕ (где х<5) в ацетатном буферном растворе (рН=5.4) в кислой среде (в отличие от контроля) при температуре 37 С в течение 40 минут (в отличие от контроля) для разрушения клеточных элементов и сохранения белкового каркаса. Замена буферного раствора с боратного на ацетатный за счет смены среды с основной на кислую позволяет сократить время действия фермента при инкубации. После нейтрализации фермента пикельным раствором (9,5% хлористого натрия + 4 % раствор уксусной кислоты) последний нейтрализовали 0,1 М раствором гидрокарбоната натрия в течение 20 минут. Продукты протеолиза удаляли в дистиллированной воде в течение 1 ч с последующей гипертонической экстракцией в растворах с нарастающей концентрацией. Соли удаляли проточным промыванием в течение 10 минут. Далее обработанный перикард помещали на специальные приспособления в ненапряженном состоянии для придания соответствующей формы и проводили структурную стабилизацию в многократно заменяемых растворах глутарового альдегида с повышенной восходящей концентрацией (0,25% + 0,5%) в отличие от контроля для создания более «зашитого» матрикса. Затем биоматериал с заданной формой снимали с приспособлений и подвергали химической стерилизации. Шифр образцов «Ксеноперикардиальный биоматериал I - КБ-1».

Протокол №3. Образцы ксеноперикардиальной ткани обрабатывали следующим образом. После первичной обработки образцы подвергали экспозиции в растворе хлористого натрия в течение 1 ч (концентрация соли в гипертонической среде - 2%), затем, в отличие от контроля, не промывая проточной водой погружали ткань в 4% раствор хлористого натрия для создания пониженного осмотического давления и помещали образцы в ультразвуковую ванну в отличие от контроля на определенное время. Затем проводили ферментацию с пониженной в отличие от контроля и повышенной в отличие от образцов «КБ-1» концентрацией протеолитического фермента 2хПЕ (где х<5) в ацетатном буферном растворе (рН=5.4) в кислой среде (в отличие от контроля) при температуре 350С в течение 1 часа (в отличие от контроля и «КБ-1»), Комбинацию трех параметров с более высокой концентрацией фермента, низкой температурой и увеличенной экспозицией применяли для увеличения коллагеназной и эластазной активности фермента, что позволяло получить более рыхлую структуру биоматериала. После нейтрализации фермента пикельным раствором (9,5% хлористого натрия + 4 % раствор уксусной кислоты) последний нейтрализовали 0,1 М раствором гидрокарбоната натрия в течение 20 минут. Продукты протеолиза удаляли в дистиллированной воде в течение 1 ч с последующей гипертонической экстракцией в растворах с нарастающей концентрацией. Соли удаляли проточным промыванием в течение 10 минут. Далее обработанный перикард помещали на специальные приспособления в ненапряженном состоянии для придания соответствующей формы и проводили структурную стабилизацию в растворе глутарового альдегида с фиксированной низкой (0,1%) концентрацией в отличие от контроля и группы «КБ-1». Полученная биоткань, будучи слабо «зашитой», должна обладать максимальной, в ряду полученных биоматериалов, скоростью биорезорбции. Шифр образцов «Ксеноперикардиальный биоматериал II -КБ-Н».

СТАДИЯ ОБРАБОТКИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ГРУППЫ

контроль КБ -I КБ-П

i Обработка хлористым натрием 2% (1 ч) 2% (1 ч) 2% (1 ч)

г Промывка проточной водой + — —

3 Гипертонический шок — 4% (2ч) 4% (2ч)

4 Воздействие УЗ — + +

5 Е Буферный раствор боратный (рН=8.2) ацетатный (рН=5.4) ацетатный (рН=5.4)

Концентрация фермента 10ПЕ хПЕ 2х ПЕ

Время инкубации 4ч 40 мин 1 час

Температура (град.С) 37 37 35

6 Инактивация 9,5% КАС1 + 4% УК 9,5% NAC] + 4% УК 9,5% НАС!+ 4% УК

7 Нейтрализация (гидро карбонат) 0,1М 0,1М 0,1М

8 Промывка дистиллированной водой + + +

9 Возрастающие концентрации ГА 0,1% 0,25% 0,1%

0,25% 0,5%

Таким образом, общими основными отличительными особенностями технологии обработки экспериментальных групп от способа, описанного в патенте РФ № 2197818, являются следующие:

1. Отсутствие стадии промывки проточной водой перед ферментацией после выдержки в растворе хлористого натрия.

2. Воздействие ультразвука на ткань перед стадией ферментации.

3. Использование ацетатного буферного раствора с кислой средой на стадии инкубации биоткани в ферментном растворе.

4. Снижение концентрации фермента.

5. Уменьшение времени инкубации биоткани в ферментном растворе (в 4 раза).

Дополнительно технология обработки каждой из экспериментальных групп

также имеет свои отличительные особенности по сравнению с контролем и друг с другом (Таб. 1).

Глава 2. ФИЗИКО-МЕХАНИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА КСЕНОПЕРИКАРДИАЛЬНЫХ БИОМАТЕРИАЛОВ

Ксеноперикардиальные биоматериалы, полученные по разработанным Протоколам, обладают различными упруго-деформативными и прочностными характеристиками.

2.1. Модуль упругости (модуль Юнга). Согласно Рис. 1А модуль упругости образцов «КБ-1» превосходит аналогичный показатель для образцов «КБ-П» в ~ 2 раза. Модули упругости образцов «Контроль» и «КБ-П» достоверно не различаются.

Подобное изменение упругих свойств связано с экспозицией материала в фиксирующих растворах с разными концентрациями. Относительно сравнения данных значений модуля упругости групп «Контроль» и «КБ-1», логично предположить наличие более плотной пространственной сети из образованных на матриксе сшивок во втором случае. Образцы «КБ-Н» обрабатывались только низкой концентрацией глутарового альдегида (0,1%) по сравнению с группой «Контроль» (0,1% + 0,25%) и это привело к незначительному снижению упругих свойств

биоткани без достоверных отличий. Вероятно, качество пространственного расположения поперечных сшивок сопоставимо в образцах обеих тканей и поэтому в зоне абсолютно упругих деформаций материалы ведут себя схожим образом.

2.2. Максимальная нагрузка. Согласно полученным данным (Рис. 1 Б), образцы «КБ-1» обладают самыми высокими прочностными показателями. Максимальная нагрузка образцов этой группы выше аналогичных показателей группы «Контроль» в 1,36 раза. Полученные данные подтверждают и дополняют результаты исследования модуля упругости образцов. Материал, обработанный сшивающим агентом более высокой концентрации, является более прочным. Это связано с образованием большего количества поперечных сшивок и как следствие получения более прочного материла. Разумеется, количество сшивок в биоматериале - это не единственный критерий, по которому можно оценить прочность биоматериала и его физико-механические параметры в целом. Требуется комплексный подход к изучению этих параметров. В случае с образцами «КБ-П» достоверных отличий относительно показателя максимальной нагрузки не наблюдается.

Рисунок 1 - А) Значения модуля упругости групп образцов (здесь: ** - достоверно р<0,01) Б) Значения максимальной нагрузки групп образцов (здесь: ** - достоверно р<0,01) В) Значения напряжения при растяжении при максимальной нагрузке групп образцов (здесь:** - достоверно р<0,01) Г) Значения показателя относительного удлинения при растяжении образцов биоматериала (* - достоверно р<0,05)

2.3. Напряжение при разрушении при максимальной нагрузке. Величина НРМН у образцов «КБ-11» ниже по сравнению с группой «Контроль» в 1,55 раза (Рис. 1 В). Это связано с более глубоким изменением нативной структуры биоткани, сопряженной с утратой некоторого количества слабых и прочных молекулярных

взаимодействий. Обработка слабыми растворами сшивающего агента ксеиоперикарда по Протоколу №3 сильно влияет на архитектонику матрикса и на распределение сил при одноосном растяжении за счет изменения пространственной структуры самих структурных белков и образованных поперечных сшивок. У образцов «КБ-1» значение НРМН практически не отличается от аналогичных показателей группы «Контроль» и не обнаруживает достоверных отличий. Следовательно, такой вид обработки биоткани не влияет на распределение сил между волокнами структурных белков при приложении нагрузки в виде одноосного растяжения, а значит, среди всех типов обработки именно Протокол № 2 дает возможность получить архитектонику матрикса сходную со структурой материала после ферментативной обработки и процесса кросс-линга по Протоколу №1.

2.4 Относительное удлинение при растяжении (ОУР). Величина ОУР образцов «КБ-1» ниже аналогичного параметра образцов группы «Контроль» в 1,32 раза (Рис 1Г). Показатели ОУР образцов «КБ-П» и группы «Контроль» достоверно не отличатся. Обработка биоткани по Протоколу № 2 дает менее растяжимый материал. Результаты дополняют данные предыдущих экспериментов по изучению физико-механических свойств и подтверждают наличие у образцов «КБ-1» более плотную и прочную сшивку матрикса глутаровым альдегидом. Качество и количество поперечных сшивок в случае с обработкой по Протоколу № 3 согласно полученным данным сопоставимо с аналогичными у образцов, обработанных по Протоколу №1.

Таким образом, после обработки биоткани по Протоколу № 2 получен материал, который обладает более высоким модулем упругости, он выдерживает более высокие нагрузки, и меньше деформируется при максимальной нагрузке. Кроме того, такой биоматериал обладает более высоким напряжением при разрушении. Это биоматериал с более плотно зашитой белковой матрицей и как следствие более прочной и менее растяжимой структурой. Изученные физико-механические свойства образцов ксеноперикардиального биоматериала, обработанного по Протоколу № 3, дают представление об организационной структуре матрицы после данной обработки. Практически по всем свойствам значения параметров физико-механических характеристик этой группы образцов сходны с параметрами образцов группы «Контроль». Это говорит о сходстве в архитектонике матриксов биоткани этих групп, однако, отличие значений максимального напряжения при разрушении указывает на то, что пространственная сеть сшивок глутаровым альдегидом матрицы в этих случаях устроена не одинакова.

Глава 3. ИССЛЕДОВАНИЕ СКОРОСТИ РЕЗОРБЦИИ КСЕНОПЕРИКАРДИАЛЬНЫХ БИОМАТЕРИАЛОВ В УСЛОВИЯХ IN VITRO

После имплантации материала в ткани животных, он может подвергнуться воздействию агрессивной окисляющей среды, которая формируется при развитии клеточного ответа, например, вызванного развитием реакции на инородное тело. Химия реакций клеточного ответа может описываться реакцией Фентона и сопровождаться внутриклеточным накоплением избытка ионов железа (один из компонентов реактива Фентона). Были смоделированы условия окисления in vitro и изучена скорость деструкции экспериментальных образцов ксеиоперикарда в реактиве Фентона (рН=7,4). Была изучена резорбция разрабатываемых материалов при продолжительной инкубации в нейтральной и окисляющей средах.

Имплантаты, в зависимости от вида замещающей ткани должны обладать разной скоростью биорезорбции после имплантации. В настоящей главе представлены результаты исследования скорости резорбции образцов полученных ксеноперикардиальных биоматериалов при продолжительной инкубации в

нейтральной и окисляющей средах. Экспериментальные образцы всех полученных биоматериалов были стабильны в боратном буфере (рН=7,4) и в течение 8 недель их масса изменялась не более чем на 15 % (Рис. 5) Средняя скорость резорбции образцов в боратном буферном растворе (рН=7,4) составила 1,5%, 1,3%, 2,3% в неделю у образцов «Контроль», «КБ-I» и «КБ-П» соответственно. После имплантации материала в ткани животных, он может подвергнуться воздействию агрессивной окисляющей среды, которая формируется при развитии клеточного ответа, например, вызванного развитием реакции на инородное тело. Химия реакций клеточного ответа может описываться реакцией Фентона и сопровождаться внутриклеточным накоплением избытка ионов железа (один из компонентов реактива Фентона). В эксперименте были смоделированы такие агрессивные условия in vitro и изучена скорость резорбции экспериментальных образцов ксеноперикарда в реактиве Фентона (рН=7,4).

Быстрая резорбция материала в условиях in vitro предполагает и быструю биорезорбцию тканеинженерной конструкции из ксеноперикарда в условиях выраженного клеточного ответа или при развитии воспалительных процессов в организме человека. Под воздействием гидроксильных радикалов реактива Фентона образцы из разных экспериментальных групп претерпевали разную скорость резорбции, отличную от резорбции, наблюдаемой в образцах с инкубацией в боратном буфере (Рис. 2).

«Контроль»

0 2 4 8

Время инкубации, недели

«КБ-Н»

0 2 4 8

Время инкубации, недели

«КБ-1»

0 2 4 8

Время инкубации, недели

■ боратный буфер 1 ректив Фемтона

Рисунок 2 - Динамика резорбции образцов ксеноперикардиальных биоматериалов в боратном буфере и реактиве Фентона

Глава 4. ИССЛЕДОВАНИЕ МЕСТНОГО ДЕЙСТВИЯ КСЕНОПЕРИКАРДИАЛЬНЫХ БИОМАТЕРИАЛОВ ПОСЛЕ ИМПЛАНТАЦИИ

4.1. Гистологическое исследование образцов группы «Контроль»

окраска гематоксилин-эозин окраска Вейгерт Ван Гизон увеличение х 200 увеличение х 200

Рисунок 3 - Гистологические срезы образцов «Контроль» перед имплантацией и после имплантации на сроках 14, 30 и 60 суток. (Окраска гематоксилин-эозин и Вейгерт Ван гизон, ув.х200)

При проведении гистологического исследования (Рис. 3) ксеноперикарда, обработанного по Протоколу № 1 перед имплантацией было выявлено:

• при окраске гематоксилином и эозином клеточные элементы не встречались;

при окраске по Вейгерт-Ван-Гизону выявлено, что состояние эластических и коллагеновых волокон оставалось без изменений.

14 сутки. В исследуемых образцах при окраске гематоксилином и эозином отмечено в 2-х образцах слабо выраженная лимфоцитарная инфильтрация (на толщину 2/3 от толщины ксеноперикардиальной пластины) с включением эпителиоидных и клеток фибропластического ряда, в 1-м образце умеренно выраженная лимфоцитарная инфильтрация. Вокруг образцов ксеноперикарда сохранялась умеренная клеточная инфильтрация, наблюдалось образование грануляционной ткани с единичными новообразованными сосудами. При анализе гистологических препаратов окрашенных по Вейгерт-Ван-Гизону выявлено разрушение коллагеновых и эластических волокон средней степени выраженности. Что свидетельствует о процессах биорезорбции исследуемого объекта и перестройки материала.

30 сутки. В тканевом ложе трансплантата отмечаются выраженные пролиферативные процессы. Биоматериал трансплантата имеет однородную структуру, по наружной поверхности инфильтрирован лимфоцитами и гистиоцитами. Трансплантат окружен выраженным инфильтрационным валом. В составе клеточного инфильтрата выявляются лимфоциты, гистиоциты, плазматические клетки, клетки фибробластического ряда. В зоне непосредственного контакта с биоматериалом превалируют лимфоциты и гистиоциты, на периферии грануляционного вала пролиферирующие фибробласты и очаги новообразованного коллагена. В реактивной зоне вокруг ксеноперикарда определяются новообразованные кровеносные сосуды. При окраске по Вейгерт-Ван-Гизону выявлены формирующиеся собственные коллагеновые и эластические волокна.

60 сутки. Через два месяца начинают проявляться явления биорезорбции биоматериала на наружной его поверхности, отмечено практически полное прорастание собственной соединительной ткани и новообразованных сосудов. Отмечается значительное уменьшение количества лимфоцитов и макрофагов в воспалительном инфильтрате. Пролиферирующие фибробласты активно синтезируют соединительнотканный каркас вокруг трансплантата. При окраске по Вейгерт-Ван-Гизону выявляется большее количество новообразованных собственных коллагеновых и эластических волокон. Данные изменения свидетельствуют об активном процессе биорезорбции имплантата и интеграции собственной соединительной ткани в ксеноперикард с последующим его замещением.

4.2. Гистологическое исследование образцов «Ксеноперикардиального биоматериала -1».

окраска гематоксилин-эозин окраска Вейгерт Ван Гизон увеличение х 200 увеличение х 200

Рисунок 4 - Гистологические срезы образцов «КБ-1» перед имплантацией и после имплантации на сроках 14, 30 и 60 суток. (Окраска гематоксилин-эозин и Вейгерт Ван гизон, ув.х200)

При проведении гистологического исследования (Рис. 4) ксеноперикарда, обработанного по Протоколу № 2 перед имплантацией было выявлено:

при окраске гематоксилином и эозином клеточные элементы не

встречались;

при окраске по Вейгерт-Ван-Гизону выявлено, что состояние эластических и коллагеновых волокон оставалось без изменений, но имели более плотное расположение.

14 сутки. В образцах при окраске гематоксилином и эозином отмечена умеренная лимфогистиоцитарная инфильтрация в 1 образце отмечаются процессы разрастания соединительной ткани по периферии ксеноперикарда, т.е. инкапсуляции, в остальных образцах лейкоциты проникают на 1/3 в толщу пластины.

При анализе гистологических препаратов окрашенных по Вейгерт-Ван-Гизону выявлено частичное разрушение коллагеновых и эластических волокон на всю толщу лимфоцитарной инфильтрации, а в толще ксеноперикардиальной пластины наблюдается не измененные коллагеновые и эластические волокна. Что свидетельствует о слабоактивных процессах биоинтеграции исследуемого объекта.

30 сутки. К концу первого месяца эксперимента в тканевом ложе трансплантата отмечаются выраженные пролиферативные процессы. Биоматериал трансплантата имеет однородную структуру, по наружной поверхности инфильтрирован лимфоцитами и гистиоцитами. Трансплантат окружен выраженным инфильтрационным валом. В составе клеточного инфильтрата выявляются лимфоциты, гистиоциты, плазматические клетки, клетки фибробластического ряда. В зоне непосредственного контакта с биоматериалом превалируют лимфоциты и гистиоциты, на периферии грануляционного вала пролиферирующие фибробласты и очаги новообразованного коллагена. В реактивной зоне вокруг ксеноперикарда определяются новообразованные кровеносные сосуды. При окраске по Вейгерт-Ван-Гизону выявлены формирующиеся собственные коллагеновые и эластические волокна.

60 сутки. Начинают проявляться явления биорезорбции биоматериала на наружной его поверхности, отмечено практически полное прорастание собственной соединительной ткани и новообразованных сосудов. Отмечается значительное уменьшение количества лимфоцитов и макрофагов в воспалительном инфильтрате. Пролиферирующие фибробласты активно синтезируют соединительнотканный каркас вокруг трансплантата.

При окраске по Вейгерт-Ван-Гизону выявляется большее количество новообразованных собственных коллагеновых и эластических волокон. Данные изменения свидетельствуют об активном процессе биорезорбции ксеноперикардиальной пластины и интеграции собственной соединительной ткани в пластину ксеноперикарда с последующим его замещением.

Таким образом, отмечено, что процессы биоинтеграции и замещения собственными тканями «Ксеноперикардиального биоматериала - I» протекаю! гораздо медленнее по сравнению с контрольной группой. Кроме того, эспериментальное исследование подтверждает возможность применения образцов «Ксеноперикардиального биоматериала - I» для восстановления целостности и структуры мягкой соединительной ткани.

4.3. Гистологическое исследование образцов «Ксеноперикардиального биоматериала - II»

Рисунок 5 - Гистологические срезы образцов «КБ-Н» перед имплантацией и после имплантации на сроках 14, 30 и 60 суток. (Окраска гематоксилин-эозин и Вейгерт Ван гизон, ув.х200)

окраска Вейгерт Ван Гизон увеличение х 200

окраска гематоксилин-эозин увеличение х 200

При проведении гистологического исследования (Рис. 5) ксеноперикарда, обработанного по Протоколу № 3 перед имплантацией было выявлено:

• при окраске гематоксилином и эозином клеточные элементы не встречались;

• при окраске по Вейгерт-Ван-Гизону выявлено, что состояние коллагеновых волокон оставалось без изменений. Эластические частично разрушены.

14 сутки. При окраске гематоксилином и эозином отмечено в 2-х образцах слабо выраженная лимфоцитарная инфильтрация (на толщину 2/3 от толщины ксеноперикардиальной пластины) с включением эпителиоидных и клеток фибропластического ряда, в 1-м образце умеренно выраженная лимфоцитарная инфильтрация. Вокруг образцов ксеноперикарда сохранялась умеренная клеточная инфильтрация, наблюдалось образование грануляционной ткани с умеренным количеством новообразованных сосудов.

При анализе гистологических препаратов окрашенных по Вейгерт-Ван-Гизону выявлено разрушение коллагеновых и эластических волокон средней степени выраженности. Что свидетельствует об активных процессах биорезорбции и биоинтеграции в ткань реципиента исследуемого объекта.

30 сутки. В тканевом ложе трансплантата отмечаются выраженные пролиферативные процессы. Биоматериал трансплантата имеет однородную структуру, по наружной поверхности инфильтрирован лимфоцитами и гистиоцитами. Трансплантат окружен слабо выраженным инфильтрационным валом. В составе клеточного инфильтрата выявляются лимфоциты, гистиоциты, плазматические клетки, клетки фибробластического ряда. В зоне непосредственного контакта с биоматериалом превалируют лимфоциты и гистиоциты, на периферии грануляционного вала пролиферирующие фибробласты и очаги новообразованного коллагена. В реактивной зоне вокруг ксеноперикарда определяются новообразованные кровеносные сосуды. При окраске по Вейгерт-Ван-Гизону выявлены формирующиеся собственные коллагеновые и эластические волокна.

60 сутки. Начинают проявляться явления биорезорбции биоматериала на наружной его поверхности, отмечено практически полное прорастание собственной соединительной ткани и новообразованных сосудов. Отмечается значительное уменьшение количества лимфоцитов и макрофагов в воспалительном инфильтрате. Пролиферирующие фибробласты активно синтезируют соединительнотканный каркас вокруг трансплантата.

При окраске по Вейгерт-Ван-Гизону выявляется большее количество новообразованных собственных коллагеновых и эластических волокон. Данные изменения свидетельствуют об активном процессе биоинтеграции ксеноперикардиальной пластины и интеграции собственной соединительной ткани в пластину ксеноперикарда с последующим его замещением.

Таким образом, отмечено, что процессы биоинтеграции и замещения собственными тканями «Ксеноперикардиалыюго биоматериала - II» протекают значительно активнее по сравнению с контрольной группой. Кроме того, отсутствие иммунных реакций и явления отторжения имплантата подтверждает возможность применения образцов «Ксеноперикардиального биоматериала - II» для восстановления целостности и структуры мягкой соединительной ткани.

Глава 5. ОЦЕНКА ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СВОЙСТВ РАЗРАБОТАННЫХ КСЕНОПЕРНКАРДИАЛЬНЫХ БИОМАТЕРИАЛОВ В УСЛОВИЯХ IN VIVO

Оценку функциональных свойств биоматериала «КБ-1» проводили путем сравнительного анализа интеграции полипропиленовой сетки и ксеноперикарда в ткани экспериментального животного . Изучение процесса роста соединительной ткани в зоне имплантации проводили путем подсчета количества соединительно тканных клеточных элементов (фибробластов и фиброцитов), а также площадь коллагеновых и эластиновых волокон через 3, 6, и 12 месяцев после имплантации (Таб. 2).

Таблица 2 - Количество клеток (клетки в поле зрения) и относительная площадь компонентов соединительной ткани в зоне имплантации полипропиленовой сетки и ксеноперикарднального биоматериала в разные сроки после операции

Срок (мес.) Матер нал Фибробласты (ФБ) Фиброциты (ФЦ) ФБ/ФЦ S (общ), % S(K), ,% S(3), ,%

ППС 99,29±10,34 69,74±4,8й 1,42 49,35±2,78 35,17±3,21 14,18±2,12

3 КБ-1 151,01 ±9,67 79,43±5,32 1,9 55,89±2,81 40,37±3,03 15,52±2,29

Р р<0,05 р<0,05 - р<0.05 р<0,05 р<0,05

ППС 180,11 ±8,47 99,49±8,25 1,81 54,22±3,18 38.73±1,47 15,49±3,38

6 КБ-1 257,06±14,60 98,70±10,25 2,6 62,78±1,35 45,87±1,99 16,91 ±2,03

Р р<0,05 р>0,05 - р<0,05 р<0,05 р<0,05

ППС 60,27±4,76 59,96±4,50 1 63,03±2,15 45,12±1,29 17,91*2,14

12 КБ-1 350,48±19,33 252,74±18,44 1,39 78,18±2,09 53,27±1,22 24,91±1,71

Р р<0,05 р<0,05 - р<0,05 р<0,05 р<0,05

где ППС - полипропиленовая сетка; КБ — ксеноперикардиальный биоматериал; 5 (общ) - общая площадь волокон, 5 (к) — площадь коллагеновых волокон, 8 (э) — площадь эластических волокон, р - достоверность

различий между группами

Количество фибробластов в зоне имплантации полипропиленовой сетки через 3 месяца после имплантации составило 99,29±10,34, через 6 месяцев - увеличение до 180,11 ±8,47, через 12 месяцев - резкое уменьшение до 60,27±4,76. Количество фибробластов в зоне имплантации ксеноперикарднального биоматериала через 3 и 6 месяцев после имплантации превысило количество фибробластов и фиброцитов в зоне имплантации сетки на 34,25% и 29,93% соответственно (р<0,05). Через 12 месяцев после операции вокруг ксеноперикарднального имплантата количество фибробластов продолжало увеличиваться, превысив аналогичный показатель в зоне сетки на 82,8% (р<0,05). Через три месяца количество фиброцитов в зоне имплантации полипропиленовой сетки составил 69,74±4,86 единиц, через 6 месяцев он возрастал до 99,49±8,25 единиц, а через 12 месяцев после операции наблюдалось снижение количества клеток до 59,96±4,50 единиц. При анализе количества фиброцитов в зоне имплантации ксеноперикарда было выявлено, что спустя три месяца после имплантации число клеток превышает аналогичный показатель, полученный вокруг сетки, на 12,12%, а к году уже на 76,28% (р<0,05). Соотношение фибробластов и фиброцитов, говорящее об активности синтетических процессов через шесть месяцев после имплантации в тканях, окружающих ксеноперикард, на 30,4% превосходил аналогичный показатель, полученный в тканях вокруг полипропиленовой сетки. Кроме того, спустя три месяца после операции, отмечали прорастание соединительнотканных волокон в ксеноперикардиальный имплантат, в то время как в зоне полипропиленовой сетки рыхлые коллагеновые и эластические волокна свободно лежали вокруг нитей сетки. Спустя 12 месяцев после имплантации лишь часть нитей полипропиленовой сетки была оплетена соединительнотканными

волокнами, часть волокон полипропиленовой сетки была инкапсулирована. Ткань ксеноперикарда резорбировалась, волокна истончались и замещались собственными коллагеновыми и эластическими волокнами животного. Через 12 месяцев после имплантации граница между имплантатом и соединительной тканью стиралась. Биоматериал полностью пророс собственной тканью животного. Площадь коллагеновых и эластических волокон в области имплантации ксеноперикарда превышала аналогичный показатель в области полипропиленовой сетки - через 3 и 6 месяцев - на 11,7% и 13,63% соответственно (р<0,05). Через год после имплантации увеличение площади соединительной ткани вокруг ксеноперикарда превосходило площадь вокруг сетки на 19,38% (р<0,05).Активность процесса новообразования соединительной ткани в месте имплантации ксеноперикардиального биоматериала через год после операции превосходит на 25% аналогичный показатель, полученный в тканях вокруг полипропиленовой сетки.

Оценку функциональных свойств биоматериала «КБ-П» проводили путем размещения его образца в теле мочевого пузыря гладкой поверхностью в просвет пузыря, ворсинчатой - к брюшине. За время наблюдения отторжения материала и развития инфекционных или иных осложнений не отмечено. Через 6 месяцев после имплантации отмечена умеренная нейтрофильная инфильтрация в зоне оперативного вмешательства (Рис. 6).

Рисунок 6 - А) - фрагменты ксеноперикардиального биоматериала в стенке мочевого пузыря через 6 месяцев. Окраска гематоксилин-эозин. Ув. х40., Б) - отсутствие нейтрофильной и макрофагальной инфильтрации в зоне имплантации ксеноперикардиального биоматериала через 1 год. Окраска гематоксилин-эозин. Ув. х 100.

Через год в препаратах нейтрофильная и макрофагальная инфильтрация отсутствуют. Вокруг ксеноперикарда определяется грануляционная ткань с новообразованными сосудами. В зоне имплантации ксеноперикардиальной пластины полностью отсутствуют признаки воспаления. Видны участки новообразованной соединительной ткани, практически полностью проросшая ткань ксеноперикарда. Слизистая оболочка полностью восстановлена (Рис. 47).

Инертные свойства ксеноперикардиального биоматериала позволяют адаптироваться к ткани мочевых путей, пройдя этап асептического воспаления, и в течение полугода полностью замещается собственной соединительной тканью. Как видно из эксперимента под воздействием мочи полностью перестраивается коллагеновая структура ксеноперикардиального биоматериала и появляется эпителизация со стороны слизистой оболочки. Полученные результаты говорят о перспективах применения ксеноперикардиального биоматериала в этой области. Исследования продолжаются.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Восстановление поврежденных тканей человека - одна из наиболее актуальных проблем в реконструктивной хирургии. Актуальность обусловлена тем, что восстановление дефектов тканей не представляется возможным без применения пластического материала. Разнородность строения и функций тканей, подвергающихся протезированию, диктуют требования к имплантатам. До сих пор продолжается поиск оптимальных материалов для протезирования, удовлетворяющих требованиям оперативного вмешательства в той или иной области хирургии. Вместе с тем уже на протяжении нескольких десятилетий в хирургии сердца и сосудов широко примененяется ксеноперикард, который доказал свою высокую эффективность применения в этой области медицины. К сожалению, разработчики и производители ксеноперикарда ориентированы только на рынок сердечно-сосудистой хирургии и не заинтересованы в диверсификации производства и освоении новых областей, например общей хирургии, урогинекологии, нейрохирургии, тканевой инженерии и других. Первые экспериментальные исследования по возможности применения ксеноперикардиальной ткани в этих областях показали перспективность данного подхода и большой потенциал разработки в этом направлении.

В настоящем исследовании была предпринята попытка создания биоматериалов с заданными свойствами из ксеноперикардиальной ткани для протезирования широкого спектра пораженных мягких тканей. На основе сформулированных требований к имплантатам были разработаны протоколы обработки биоткани и в результате получены четыре вида биоматериала, характеризующиеся разными физико-механическими свойствами и скоростью биорезорбции. Исследования местного действия ксеноперикардиальных биоматериалов после имплантации в ткани животных доказали безопасность их применения, а начатые медико-биологические исследования разрабатываемых материалов в клинической практике показывают их эффективность.

ВЫВОДЫ

1. На основе анализа имеющихся подходов к созданию биосовместимых материалов для восстановительно-реконструктивной хирургии и результатов собственных экспериментальных исследований разработана оригинальная методика химико-ферментативной обработки ксеноперикардиальной ткани.

2. Доказано, что параметры ключевых стадий многостадийной химико-ферментативной обработки ксеноперикарда (концентрация фермента, температура ферментативной инкубации, инкубация в средах с разным осмотическим давлением, концентрация сшивающего агента) существенно влияют на структурные свойства биоткани.

3. Разработаны два протокола с оптимальными режимами химико-ферментативной обработки ксеноперикардиальной ткани, позволяющие получить биоматериалы с заданными физико-механическими и биорезорбируемыми свойствами.

4. В зависимости от выбранного протокола обработки ксеноперикарда биоматериалы различаются по модулю упругости в ~ 2 раза, напряжением при растяжении при максимальной нагрузке ~ 1,7 раза и относительным удлинением при растяжении ~ в 1,3 раза.

5. Показана возможность получать ксеноперикардиальные биоматериалы с разной скоростью резорбции. Потеря массы образцов биоматериалов после 8 недель инкубации в модельной среде реактива Фентона (рН = 7,4), моделирующего

воспалительную реакцию организма на инородное тело, изменяется от ~ 40% до ~80%. Показано, что после обработки ксеноперикарда глутаровым альдегидом более высокой концентрации скорость резорбции биоматериала снижается. Обнаружено существенное уменьшение скорости резорбции всех биоматериалов после двух недель инкубации в окисляющей среде, однако биоматериалы теряют массу в этот период с разной скоростью.

6. Сравнительное гистологическое изучение области имплантации ксеноперикардиальных биоматериалов в подкожной жировой клетчатке крыс, а также анализ морфологических признаков-критериев, отражающих дистрофические, воспалительные и репаративные процессы в операционной ране, свидетельствуют об ослаблении воспалительного процесса (уменьшение лимфогистиоцитарной инфильтрации, лимфоцитов, макрофагов) к 30 суткам после операции, а также заметном усилении и ускорении репаративиого компонента (увеличение количества клеток фибробластического ряда) с 30-х суток для образцов разработанных биоматериалов.

7. Доказано, что независимо от режима обработки биоткани, разработанные ксеноперикардиальные биоматериалы обладают высокими биосовместимыми свойствами: не вызывают реакции отторжения при имплантации, биорезорбция имплантата в условиях in vivo сопровождается замещением новообразованной тканью животного и процессами неоваскуляризации.

8. На экспериментальных моделях имплантации в условиях in vivo в брюшную стенку и стенку мочевого пузыря доказаны высокие адаптационные и интеграционные свойства разработанных ксеноперикардиальных биоматериалов к мягким тканям.

Практические рекомендации

1. Имплантаты из «Кееноперикардиального биоматериала I» предполагается преимущественно использовать в качестве материала замещающего ткани, подверженные механической нагрузке, например, в реконструктивных операциях для пластики дефектов сухожильно-связочных структур, герниопластике, гинекологии, а также в антирефлюксной хирургии.

2. Имплантаты из «Кееноперикардиального биоматериала II» предполагается преимущественно использовать в качестве материала замещающего ткани, не подверженные механической нагрузке, например в реконструктивных операциях для протезирования твердой мозговой оболочки, укрытия культи почки, пластике мочевого пузыря, мочеточников, корпоропластика при болезни Пейрони.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи и материалы конференций:

1. Баулин A.B., Середин С. А., Квасов А.Е., Венедиктов A.A. Ксеноперикардиальная герниопластика: возможности и перспективы. IIБюллетень медицинских интернет-конференций. 2011. X» 5. Том 1. С. 26-32

2. Баулина O.A., Вихрев Д.В., Федорова М.Г., Баулин A.B., Баулин В.А., Венедиктов A.A. Изучение перспективы применения ксеноперикардиальной пластины в урогннекологии. ИФундаментальные исследования. Медицинские науки. 2012. MIO. С. 20-24.

3. Баулина O.A., Вихрев Д.В., Федорова М.Г., Г.аулин A.B., Баулин В.А., Венедиктов A.A. Внедрение ксенобиоматериалов в геринологию и урогннекологию. //Фундаментальные исследования. Медицинские науки. 2012 №10, С. 228-231.

4. Венедиктов A.A.. Живаева JI.B., Никишин Д.В., Генгин М.Т., Евдокимов C.B. Получение бссклеточного материала сухожилия теленка с целью создания протеза передней крестообразной связки. // Известия ПГЛУ. Естественные науки 2012. №29 С.280-284.

5. Гамзин С.С., Кручишша А.Д., Венедиктов A.A.. Генгин М.Т. Сравнительное исследование биомеханических свойств говяжьего ксеноперикарда после различных обработок. // Известия ПГПУ. Естественные науки//2012. №29 С.25-29.

6. Митрошин А.Н., Баулина У.В., Щербаков М.А., Венедиктов A.A. Пластика сухожилий сгибателей пальцев кисти протезом «Кардиоплант» //Вопросы реконструктивной и пластической хирургии. 2012. № 2(41). Том 15. С. 67-68

7. Калмин О. В., Живаева Л. В., Венедиктов А. А.. Никишин Д. В., Фуки В. К., Генгин М. Т. Изучение in vivo свойств ксеноперикарда, прошедшего различную обработку химико-ферментативным методом. Известия высших учебных заведений. Поволжский регион. Медицинские науки. Теоретическая медицина. № 2 (26), 2013 С. - 15-26.

8. Муйземнек А .Ю., Евдокимов C.B., Венедиктов A.A.. Живаева Л.В., Будникова Ю.А. Исследование влияния технологических параметров на механические свойства ксеноперикардиальных пластин // Известия высших учебных заведений. Поволжский регион. Медицинские науки" №3, 2013 С. 21-33

9. Никольский В.И., Калмин О.В., Титова Е.В., Венедиктов A.A.. Федорова М.Г. Клинико-морфологическое обоснование ксенопластики вентральных грыж. // Известия высших учебных заведений. Поволжский регион. Медицинские науки" Xsl, 2012 С. 11 - 17.

10. Ivanov A., Glamazda S., Venediktov A., Fuki V. Thirty years of the surgical use of a cell-free biological and plastic material to treat congenital heart, acquired heart and great vessel diseases. FGBU FNC of Transplantology and artificial organs, named after academic Shumakov V.l. 21st Annual Meeting of the Asian Society for Cardiovascular and Thoracic Surgery in 2013, Kobe, Japan.

11. Mitroshin A., Baulina U., Venediktov A., Shcherbakov M. Cardioplant. New in plastic tendon operation. //Poster Presentation FESSH20/2.

12. Венедиктов A.A., Генгин M.T., Евдокимов C.B, Современное состояние проблемы химико-ферментативной обработки ксеноперикардиалыюй ткани. //Фундаментальные исследования в Пензенской области: состояние и перспективы// Материалы научно-практической конференции. С.26-28

13. Живаева Л. В., Венедиктов А. А., Евдокимов С. В., Фуки В. К., Генгин М. Т., Гамзин С. С., Кручинина А. Д. Сравнительное исследование физико-механических характеристик ферментативно-химически обработанных биоматериалов ксеногенного происхождения. Материалы региональной конференции «Исследования и инновационные разработки в сфере медицины и фармакологии». Пенза, 2011 г. С. 45-49

14. Митрошин А.Н., Абдуллаев А.К, Венедиктов A.A. и соавт. Возможности и результаты применения ксеноперикарда при повреждении сухожилий и связок. Инновационные имташпаты в хирургии: сб. тр. Ч. 3. М.: НЦССХ им. А.Н. Бакхтева РАМН-, ISBN 978-5-7982-0325-3 2014 С. 187 - 192.

15. Баулина У.В., Сиваконь C.B., Млтрошин А.Н., Венедиктов A.A. и соавт. Анализ результатов лечения пациентов после пластики сухожилий сгибателей пальцев кисти кссноперикардиальным протезом. Инновационные гшплантаты в хирургии: сб. тр. Ч. 3. M.: НЦССХим. А.Н. Бакулева РАМН; ISBN 978-5-7982-0325-3 2014 С. 183- 187.

16. Никольский A.B., Башков В.А., Венедиктов A.A. и соавт. Применение ксенопластики в урологии, андрологии и урогинекологии (пилотное исследование) Инновационные штлантаты в хирургии: сб. тр. Ч. 3. М.: НЦССХ im. А.Н. Бакулева РАМН; ISBN 978-5-7982-0325-3 2014 С. 193 - 196.

17. Баулина O.A., Баулин В.А. Венедиктов A.A. и соавт. Первый опыт применения ксеноперикардиальной ленты в антирефлюксной хирругии. Инновационные имтантаты в хирургии: сб. тр. Ч. 3. М.: НЦССХим. А.Н. Бакулева РАМН; ISBN 978-5-7982-0325-3 2014 С. 168 - 172.

18. Никольский В.И., Титова Е.В. и соавт. Опыт применения ксеноперикарда «Кардиоплант» при послеоперационных вентральных грыжах. Инновационные ичппаптаты в хирургии: сб. тр. Ч. 3. М.: НЦССХ им. А.Н. Бакулева РАМН; ISBN 978-5-7982-0325-3 2014 С. 196- 199.

19. Никольский В.И., Янгуразова Е.В. и соавт. Возможность использования ксеноперикарда для формирования лапаростомы. Инновационные гшплантаты в хирургии: сб. тр. Ч. 3. ht: НЦССХим. А.Н. Бакулева РАМН; ISBN 978-5-7982-0325-3 2014 С. 199-201.

Патенты:

1. Заявка на патент на изобретение «Способ модификации биоткани для протезирования» (отчет об информационном поиске от ФГУ «ФИПС» № 2012150213/13 (080348) от 16 июля 2013 г.).

2. Заявка на патент на изобретение «Биологический эндопротез для хирургического лечения недержания мочи при напряжении» (экспертиза по существу по заявке № 2011150608/14(075954) от 03.08.2012 г.)

Подписано к печати 05.05.2014. Формат 60X84 1/16 Бумага типогр. №1. Печать ризография. Шрифт Times New Roman. Усл. печ. л. 1,4. Заказ № 758. Тираж 110 экз.

Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии «Копи-Ризо» Пенза, ул. Московская, 74, к.211. Тел. 56-25-09. e-mail: tipograf_PopovaMG@inbox.ru