Автореферат и диссертация по медицине (14.00.51) на тему:Противоопухолевые эффекты иглорефлексотерапии паранихиальных точек, оригинального фитосбора и адамантильного производного мурамилдипептида в эксперименте

на правах рукописи

КУЗОВЛЕВ ФЕДОР НИКОЛАЕВИЧ

ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЕ ЭФФЕКТЫ ИГЛОРЕФЛ ЕКСОТЕРАПИИ ПАРАНИХИЛЛЫ1ЫХТОЧЕК, ОРИГИНАЛЬНОГО ФИТОСБОРА И АДАМАНТИЛЬНОГО ПРОИЗВОДНОГО МУРАМИЛДИПЕПТИДА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

14.00.51. - «Восстановительная медицина, лечебная физкультура

и спортивная медицина, курортология и физиотерапия»

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

МОСКВА - 2003

Работа выполнена в Московской медицинской академии им. И.М.Сеченова (119992, Москва, Б.Пироговская ул., д.2/6). НИИ Морфологии Человека РАМН (117418, Москва, ул. Цюрупы, 3).

Научные руководители:

академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор Зилов В.Г.

доктор медицинских наук Калюжин О. В.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Веневцева Ю. Л. доктор медицинских наук Смирнова 3. С.

Ведущая организация: Российский научный центр восстановительной медицины и курортологии Министерства здравоохранения РФ (121099, г. Москва, ул. Новый Арбат, 32).

Защита диссертации состоится 6 марта 2003 г.

в 13 часов на заседании диссертационного совета Д. 212.271.06 при Тульском государственном университете (300600 г. Тула ул. Болдина, 128)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Тульского государственного университета (300600, г. Тула, ул. Болдина, 128). Автореферат разослан 6 феврвля 2003 года

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук Гуссейнов А.З.

Список сокращений: ИРТ - иглорефлексотерапия

МДП - мурамилдипептид

ТА - точка акупунктуры

ТМ - торможение метастазирования

ТРО - торможение роста опухоли

УПЖ - увеличение продолжительности жизни

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Борьба со злокачественными новообразованиями является одной из наиболее актуальных проблем в медицине и биологии и затрагивает многие аспекты социальной жизни общества. В мире ежегодно заболевает злокачественными новообразованиями 6 млн. человек. Среди причин смерти людей в большинстве промышленно развитых стран данная нозологическая группа занимает 2 - 3-е место (Parkin et al., 1984; Muir, 1986). Лечение опухолей хирургическим путем занимает ведущее место в спектре лечебных мероприятий. Апробированными методами являются адъювантная и неоадъювантная химио- и лучевая терапия. Больные после развернутых мультиорганных операций, после завершения курсов лучевой или химиотерапии, с химиорезистентными формами опухолей, а также больные в терминальной стадии с болевым синдромом нуждаются в применении методов восстановительной медицины. При этом целью является профилактика рецидива и прогрессирования заболевания или улучшение качества жизни, в зависимости от стадии заболевания.

В настоящее время методы восстановительной медицины, в частности, иглорефлексотерапия (ИРТ) и фитотерапия, находят все более широкое клиническое применение. Многие онкологические больные, не удовлетворенные возможностями традиционных методов лечения, обращаются за помощью к специалистам комплементарной терапии. В США, Западной Европе, Австралии процент онкологических больных, прибегающих к методам комплементарной медицины, колеблется между 14-16%, доля ИРТ среди этих методов составляет около 62% (Coss R.A., 1999; Hardell L. et al., 1998). Накопленные факты свидетельствуют о том, что эффекты ИРТ опосредованы работой нервной, а через нее эндокринной и иммунной систем организма (Василенко A.M., 1997). Учитывая, что при воздействии канцерогенных факторов на организм наиболее рано нарушаются именно информационные и регуляторные механизмы нервной системы (Сиротин Б.З., 1968), применение методов рефлексотерапии в онкологии представляется вполне обоснованным. Тем не менее, анализ возможности обращения к методу ИРТ при неопластических заболеваниях в свете актуальных проблем онкологии (Козлов A.M., 1997) выявил ряд открытых вопросов:

- Возможно ли с помощью ИРТ подавлять канцерогенез в индуктивной фазе и, напротив, может ли ИРТ - воздействие быть нндуктором опухолевого роста?

- Каково влияние различных вариантов ИРТ на постадинную динамику роста опухолей различной локализации и гистогенеза?

- Может ли ИРТ выступить в качестве средства профилактики метастазирования после выполнения радикальной операции?

- Возможно ли повышение эффективности лучевой и химиотерапии, уменьшение побочных эффектов при комбинировании их с ИРТ?

Исследования по экспериментальной электро- и иглорефлексотерапии опухолей апеллируют к очень незначительному числу из общего перечня активных точек и рефлексогенных зон. В литературе мы не встретили работ с использованием классических точек акупунктуры (ТА), локализованных сбоку от ногтевой зоны роста (паранихий). Между тем, данная группа ТА отличается наличием высокого потенциала биологической активности (Нгуен Ван Нги, 1992). Кроме того, на грызунах данная группа ТА' анатомически наиболее доступна и представляет интерес для изучения на моделях опухолей.

Применение лекарственных растений в терапии онкологических заболеваний имеет давнюю историю. Народной медициной для этой цели рекомендуется не один десяток растений (Балицкий К.П. с соавт., 1976). Для онкологии растения представляют двоякий интерес: как сырье для получения новых химиопрепаратов и в качестве самостоятельных средств восстановительной медицины. В литературе широко представлены экспериментальные данные о возможности подавления опухолевого роста фитопрепаратами. К настоящему времени цитостатическая активность выявлена практически у всех групп химических соединении, входящих в состав растений: кумаринов, лигнинов, флавоноидов, протеинов, полисахаридов, серосодержащих соединений и др. (Lutomski J. et al., 1983: Шленкевич M.A. с соавт., 1993). Стадию доклинического изучения прошли соединения всех перечисленных групп. Тестирование цельных компонентов растительного сырья на наличие противопухолевой активности является первым этапом доклинических испытаний.

Предварительные результаты клинических исследований свидетельствуют, что Герань кровянокрасная (Geranium sanguineum), Ярутка полевая (Thiaspi arvense) и Дурнишник обыкновенный (Xanthium stnimarium) способны подавлять опухолевый рост и уменьшать побочное действие лучевой терапии (Бойчак М.П., Собецкий В.В., Цветкова В.В., 2000). Учитывая эти сведения, целесообразно изучить степень противоопухолевой активности у данных растений экспериментально.

За прошедшие десять - пятнадцать лет широкое распространение и развитие получила иммунотерапия опухолей. Уже примерно 25 лет в мире ведутся интенсивные исследования и поиски наиболее эффективных производных Ы-ацетилмурамил-Ь-апаннл-О-изоглутамина

(мурамилдипептида, МДП) - компонента пептидогликана группы А

клеточной стенки ряда бактерий. Аналоги МДП присутствуют в организме животных и человека в малых количествах, являясь факторами сна, витаминами, обезболивающими и нейротропными медиаторами, иммуномо'дуляторами. Основная область применения этих веществ - это модуляция иммунных реакций, в частности, стимуляция противоопухолевого и противоинфекционного иммунного ответа.

МДП является весьма эффективным модулятором иммунных реакций. Но из-за высокой токсичности и быстрого выведения из организма он не получил клинического применения. На данный момент ведется активный поиск новых, более эффективных и менее токсичных синтетических аналогов МДП (Kalyuzhin O.V. et al., 1996). Перспективным веществом этой группы является р5-адамантилгликозид-МДП. Его фармакокипетические и иммунотроиные свойства изучены достаточно хорошо и ввиду возможного комплексного применения Р-адамантилгликозид-МДП в онкологии существует потребность в экспериментальных исследованиях.

В свете поставленных вопросов особенно актуальна оценка эффективности вышеперечисленных методов восстановительной медицины и иммунологии на опухолевых моделях in vivo рекомендованных Минздравом РФ для доклинического исследования противоопухолевой активности фармакологических веществ (Трещалина Е.М. с соавт., 2000).

Цель работы:

исследовать противоопухолевые эффекты на моделях неопластических заболеваний in vivo: фитотерапии настоем из компонентов Ярутки полевой (Thiaspi arvense), Дурнишника обыкновенного (Xanthium strumarium), Герани кровяно-красной (Geranium sanguineum), иммунотерапии адамантилгликозидом мурамилдииептида, иглорефлексотерапии паранихиальных точек.

"Задачи исследовании:

1. Изучить влияние иглорефлексотерапии паранихиальных точек на динамику опухолевого роста, продолжительность жизни мышей-опухоленосителей и процесс метастазирования меланомы В16. Сравнить противоопухолевые эффекты местного и общего (относительно первичного очага опухолевого роста) вариантов ИРТ точек паранихия.

2. Изучить влияние на динамику опухолевого роста, продолжительность жизни мышей-опухоленосителей и процесс метастазирования ИРТ паранихиальных точек на модели карциномы легких Льюиса. Сравнить противоопухолевый эффект ИРТ с активностью циклофосфамида в терапевтической дозе, изучить возможность их комбинированного применения.

3. Исследовать роль опиоидного механизма в противоопухолевом действии иглорефлексотерапии паранихиальных точек, опосредованного

группой опиоидных рецепторов типов juS и /г, на модели карциномы легких Льюиса.

4. Изучить противоопухолевую активность Р-адамантилгликозида мурамилдипептида на моделях меланомы В16, лимфомы EL-4 и карциномы легких Льюиса. Изучить противоопухолевое действие комбинации циклофосфамида в субоптимальной дозе и р-адамантилгликозида мурамилдипептида.

5. Исследовать противоопухолевую активность фитосбора (Ярутка полевая, Дурнишник обыкновенный, Герань кровяно-красная) на модели карциномы легких Льюиса.

Научная новизна:

1.Впервые изучена на противоопухолевое действие группа паранихиальных ТА как изолированно, так и в комплексе с цитостатиком.

2.Впервые исследовано участие сегмента эндогенной опиоидной системы в механизме противоопухолевого действия ИРТ точек области паранихия.

3.Впервые показана амбивалентность рефлекторных влияний на опухолевый рост в зависимости от местного или общего ИРТ- воздействия относительно места перевивки опухоли.

4.Впервые изучена противоопухолевая активность нового производного МДП изолированно и в комплексе с цитостатиком.

5.Впервые изучена в эксперименте новая растительная композиция на наличие противоопухолевой активности.

Теоретическая и практическая значимость

Результатом исследования являются данные о противоопухолевой активности в модельных системах in vivo нового производного МДП, новой растительной композиции и группы точек акупунктуры.

Теоретическую ценность имеет доказательство того, что противоопухолевое действие ИРТ точек дистальных фаланг пальцев опосредовано механизмом, отличным от /и-.S- и к- лигандрецепторного взаимодействия эндогенной опиоидной системы (ЭОС). Теоретическое и потенциально прикладное значение работы заключается и в том, что впервые выявлена зависимость направления ИРТ воздействия на опухолевый процесс от локализации опухоли и типа проводимой ИРТ (общего или местного).

Доказано наличие противоопухолевой активности у изучаемой фитокомпозиции. Целесообразно проведение химического анализа компонентов сбора для выявления активных компонентов с противоопухолевой активностью.

Продемонстрирована способность Р-адамантилгликозида-МДП угнетать рост и метастазирование ряда экспериментальных опухолей, потенцировать противоопухолевые эффекты циклофосфамида, что с

s

учетом проводимых в настоящее время работ по созданию на базе этого вешества лекарственного средства приобретает и большую практическую ценность.

Основные положения, выносимые на защиту

Доказана способность к угнетению роста и метастазирования экспериментальных опухолей при помощи:

1. ß-адамантилгликозида-МДП как средства монотерапии и в комбинации с цитостатиком.

2. Общей иглорефлексотерапии паранихиальных точек.

3. Фитокомпозиции из Ярутки полевой, Дурнишника обыкновенного и Герани кровяно-красной.

Практическое внедренне полученных результатов: Материалы диссертационной работы внедрены в учебный процесс на кафедре: «Нелекарственные методы лечения и клиническая физиология» ФППО ММ А им. И.М.Сеченова

Апробация диссертации Основные положения диссертации были представлены на:

- Втором съезде иммунологов России (Россия, Сочи, 1999).

- Клинической конференции молодых ученых ФППО ММА им. И.М.Сеченова «Актуальные вопросы клинической медицины». Москва -2001 и 2002.

Апробация диссертации состоялась 26 сентября 2002 года на межкафедралыюй научно-методической конференции кафедры нелекарственных методов лечения и клинической физиологии и кафедры иммунологии и аллергологии ФППО ММА им. И.М. Сеченова. Диссертация рекомендована к защите.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 10 научных работ, из них четыре статьи и 6 тезисных работ.

Ст руктура и обьем диссертации Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы (2 главы), материалы и методы, результаты собственных исследований (3 главы), обсуждение, выводы, библиографический указатель литературы. Указатель литературы содержит 133 отечественных и 196 зарубежных источников.

Диссертация изложена на 115 страницах, иллюстрирована 13 рисунками и содержит 20 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Исследования проведены на базе НИИ Морфологии человека РАМН в лаборатории клеточной иммунопатологии и биотехнологии, на мышах инбредной линии C57BL/6 и гибридах первого поколения BDF) (DBA/2 х C57BL/6), (Центральный питомник экспериментальных животных,

отделение «Крюково»), Животных содержали в пластмассовых клетках на естественной диете. Всего проведено 7 серий экспериментов ш vivo. Каждая серия включала не менее 3-х независимых экспериментов. Опытные и контрольные группы включали не менее 8 - 10 мышей. Суммарное количество животных составило около 1600 мышей.

Р-адамантилгликозид-МДП (см. рис. 1) был синтезирован (Земляков А.Е., 2000) и предоставлен доктором химических наук, профессором кафедры органической химии Таврического национального университета им. В.И. Вернадского (г. Симферополь, Украина) Земляковым А.Е.. Для моделирования опухолевого процесса использовали линии трансформированных клеток различного гистогенеза: меланому В-16, Т-клеточную лимфому EL-4 и эпидермоидную карциному Льюиса. Суспензию опухолевых клеток (2 х 105 клеток на мышь) вводили подкожно в стопу 6-12 недельных самцов мышей C57BL/6 (меланома В16, лимфома EL-4) или в подмышечную область 6-12 недельных самцов мышей BDF| (карцинома Льюиса).

Рисунок 1._ Структура Р-адамантилгликозид-МДП

СН2ОН

Н/-О I

^нЧ

о о~х

\[Л

ОН —г

I/1

н

О NHCOCHj СНз

НзС-CH-C-NH-CH- c-nh-ch-c-nh2

II II III

о

о

СН2 О I

сн2

где X - адамантил

СООН

В условиях модели карциномы Льюиса проводили изучение эффекта только монотерапии Р-адамантилгликозид-МДП. Препарат вводили per os 1 раз в день в дозах 0,1 мг/кг, 1 мг/кг и 10 мг/кг с интервалом 48 часов в течение 10 дней. Лечение начинали через 48 часов после перевивки опухоли. В качестве растворителя для препарата использовали 0.9% раствор Na CI . Контрольным животным вводили физ. раствор по 0,5 мл/мышь в том же режиме per os. В условиях моделей лимфомы EL-4 и меланомы В16 первая группа экспериментальных животных получала циклофосфамид в дозе 25 мг/кг (V* от терапевтической) внутрибрюшинно и 100 мкл 0,9% раствора Na CI per os, вторая группа - Р-адамантилгликозид-МДП (1 мг/кг) пероралыю и 100 мкл физраствора внутрибрюшинно, третья - циклофосфамид (25 мг/кг) и Р-адамантилгликозид-МДП (1 мг/кг).

В контрольной группе животные получали по 100 мкл 0,9% раствора Na CI перорально и внутрибрюшинно. (3-адамантилгликозид-МДП и

циклофосфамид вводили 1 раз в 3 дня, начиная со вторых суток после инокуляции опухолевых клеток.

Влияние иглорефлексотераппи на опухолевый рост, метастазирование и продолжительность жизни животных-опухоленосителей изучали на моделях меланомы В16 и карциномы легких Льюиса. Для изучения зависимости эффекта от места локализации опухоли меланому В16 перевивали в одной группе в стопу задней конечности с плантарной стороны; а в другой - в подмышечную область, В условиях модели карциномы Льюиса исследовали противоопухолевое действие ИРТ только при перевивке в подмышечную область. Влияние на рост карциномы Льюиса изучали в группе животных подвергавшихся монотерапии ИРТ и в группе мышей, получавшей дополнительно циклофосфамид в дозе 100 мг/кг. Для изучения механизма действия ИРТ ее сочетали с введением налоксона. Для иглорефлексотерапии использовали иглы диаметром 0,1 мм и длиной 1 мм. Использовали технику быстрого укола - воздействовали иглой до 1 секунды (Uom E.S. et al., 2001). ИРТ проводили ежедневно, начиная со второго дня эксперимента, в течение 6 дней, чередуя уколы в паранихиальные точки передних, в следующий день - задних лапок. Паранихиальные точки локализованы на 1 мм латеральнее угла ногтя, рядом с зоной роста. Эти точки соответствуют начальным точкам меридианов акупунктуры человека, группе т.н. «античных» точек - Чун. На верхней конечности использовали точки, соответствующие: Lu-1 ЦШаоШан), ЬИ(ШанЯн), НС-9(ЧжунЧун), ТН-1(ГуаньЧун) и SI-НШаоЦзе), кроме 1И-9(ШаоЧун) меридиана сердца. На задних конечностях укалывали: Liv-1 (ДаДунь), St-45(ЛиДуй), ОВ-44(ЦзуЦяоИнь), В1-67(ЧжиИнь), кроме Бр-ЦИньБай) меридиана селезенки-поджелудочной железы и К-1(ЮнЦюань) меридиана почек. В контрольной группе с перевивкой опухоли в стопу животные подвергались 10 уколам в области головы и корпуса. В контрольной группе с перевивкой з подмышечную впадину животные подвергались 10 уколам в область конечностей (по 5 с каждой стороны), ежедневно чередуя кисти и стопы, с дорзальной стороны. В контрольных группах укалывание проводилось в зоны, не содержащие аналогов точек акупунктуры корпоральных меридианов. В работе использовали циклофосфамид (Cytoxan) производства Bristol-Myers Squibb (США). Для изучения комбинированного действия с акупунктурой использовали циклофосфамид в терапевтической дозе (100 мг/кг). Циклофосфан вводили внутрибрюшинно в 1мл физиологического раствора два раза с интервалом 96 часов. Принимая во внимание тот факт, что налоксон блокирует /Лмго\ рецепторы в дозе 0.1-1 мг\кг, <У\дельта\ в дозе 2-4(5)мг\кг, лЛкаппа\ -10-12мг\кг (Александров В.А. с соавт., 1998), препарат вводили в дозе 10 мг/кг внутрибрюшинно ежедневно в течение 6 дней. В комбинированной группе с акупунктурой инъекцию производили за 10 мин. до начала

лечения. В качестве растворителя использовали 1 мл физиологического раствора.

Проводилась фитотерапия настоем из сбора растений. Растительное сырье предоставлено Главным военным клиническим госпиталем МО Украины. Фитокомплекс состоял из Дурнишника обыкновенного (Xanthium strumarium) - 0,34 г/кг, Герани кровяно-красной (Geranium sanguineum) - 0, 06 г/кг и Ярутки полевой (Thiaspi arvense) - 0,1 г/кг. В качестве референс-контроля использовали Аконит джунгарский (Aconitum soongaricum) - 0,1 мл/кг. Сбор трав изучали в трех дозах: 1, 1/10 и 1/100. Сухую смесь заливали кипятком выдерживали на водяной бане 20 минут, настаивали 2 часа, процеживали через марлю и отжимали сухой остаток. Настой вводили per os 3 раза в день по 5 мл в одно и то же время ( в 8, 14, 20 часов) ежедневно на протяжении 2-х недель. Спиртовую настойку аконита (10% на 40% спирту) изучали в двух дозах: 1 и в 1/10. Контрольным животным вводили дистиллированную воду по 5 мл в том же режиме.

Динамику роста меланомы В16 оценивали путем измерения объема опухолевого узла на 7-й, 14-й и 21-й дни после перевивки. Антиметастатический эффект проводимого лечения на модели меланомы В16 определяли визуально путем подсчета количества метастазов в легкие (Козлов A.M., 1997). Для подсчета метастазов мышей умерщвляли с помощью хлороформа на 28-й день эксперимента.

Эффективность терапии карциномы Льюиса оценивали по торможению роста первичной опухоли (%) по сравнению с контролем. Измерение объема опухоли производили на 7-й, 10-й, 13-й и 17-й дни эксперимента. Оценку антиметастатического действия осуществляли на 24 день эксперимента по изменению массы легких (Козлов A.M., 1997).

Динамику опухолевого роста Т-клеточной лимфомы EL-4 изучали путем измерения опухолевого узла на 7-й, 14-й и 21-й дни после перевивки.

На всех моделях оценивали показатель увеличения продолжительности жизни по отношению к контролю (Трещалина Е.М. и соавт., 2000).

Статистическая обработка полученных данных производилась при помощи статистической программы STATISTIC A for Windows 5.0 (StatSoft, Ink.) (Боровиков В.П. и др., 1995) Анализ результатов проводили в соответствии с методическими рекомендациями по статистической обработке фармакологических экспериментов, утвержденными Министерством здравоохранения РФ (Салимов P.M., 2000).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Изучение действия нглорефлексотераннн паранихнальных точек на опухолевый процесс на модели меланомы В-16

В первой серп» экспериментов изучали противоопухолевое действие иглорефлексотерапии (ИРТ) околоногтевых точек на модели мышиной меланомы В16 в зависимости от места перевивки опухоли. В первой группе экспериментальных животных трансплантацию опухоли производили подкожно в подошву задней левой лапки, во второй группе - в область подмышечной впадины. Для каждой группы с ИРТ была выбрана своя контрольная группа.

Табл.1. Противоопухолевое действие ИРТ пауанихиальных точен

на модели меланомы В-16

Группы экспериментальных животных Объем опухоли ТМ, на 28 день, ед., (%) УПЖ, сутки, (%)

7-й день, мм3(%) 14-й день, мм3(%) 21-й день, мм'(%)

Контроль 1 (перевивка в лапку) 167±22 385±23 1054±71 12,6±2,1 34,2±3,1

ИРТ (перевивка в лапку) 85±19* (49%) 363±35 (6%) 3320±154 * (+215%) 14,8±2,9 (+ 17%) 3 1,4±2,9 (-8%)

Контроль2(перевивка под мышку) 454±55 2290±269 9017±101 18±4,0 27,5±4,0

ИРТ(перевивка под ! мышку) 1 231±47* (49%) 1824±171 (21%) 7623*258 (16%) 14,3+4,9 (21%), 1л 36,0±3,3 * (31%)

Примечание:

% - изменение показателей по отношению к контролю ТМ - торможение метастазироваиия

УПЖ - увеличение продолжительности жизни ( «-» уменьшение)

- Стимуляция опухолевого роста, метастазироваиия * - Достоверность различия с контрольными значениями Р<0,05 А - Количество животных без метастазов

Отмечены различия в скорости опухолевого роста как между самими контрольными группами, так и в группах с иглорефлексотерапией по отношению к своему контролю (табл.1). Подмышечная локализация опухоли в контроле отличалась более быстрым ростом (454±55 мм3 на 7-й день), чем в контроле на стопе (167±22мм3 на 7-й день). Т.о., была выявлена зависимость скорости опухолевого роста от анатомического региона. По литературным данным, динамика роста опухоли зависит от анатомогистологической зоны перевивки (Козлов A.M., 1997). На 7-й день эксперимента, в 1-й и 2-й группах с ИРТ отмечалось достоверное (49%) торможение роста опухоли. Далее, в группе с подмышечной локализацией наметилось снижение эффекта до 21% , на 14-й день и до 16% на 21-й день эксперимента. В 1-й группе с локализацией опухоли на конечности первоначальное торможение опухолевого роста сменилось на стимуляцию пролиферации. Если до 14-го дня сохранялась тенденция к угнетению

роста меланомы (торможение 7%), то к 21-му дню размеры опухоли превышали в три раза контрольные значения. Схожие тенденции наблюдались и по другим показателям, характеризующим опухолевый процесс (метастазирование, продолжительность жизни). В контрольных группах отмечалось более интенсивное метастазирование в легкие при подмышечной локализации опухоли и меньшая средняя продолжительность жизни. В группе с ИРТ при подмышечной локализации опухоли выявлена выраженная тенденция к угнетению метастазирования (21%) и достоверное увеличение средней продолжительности жизни на 31 % (р<0,05). В группе с дистальной локализацией опухоли ИРТ вызывала тенденцию к стимуляции метастазирования (17%) и уменьшению средней продолжительности жизни (8%). Установленное различие в динамике роста на поздних стадиях, по-видимому, связано с местным стимулирующим воздействием ИРТ на опухоль, расположенную на стопе. Действительно, из литературы известно, что усиление рефлекторных воздействий из места локализации опухоли приводит к ускорению ее роста (Терещенко И.П., 1950), нанесение добавочных неканцерогенных нервных раздражений усиливает и ускоряет развитие первичных и метастатических опухолей (Крышталь О.А. 1980; Соловьев А.А. 1938; Терещенко И.П. 1950). По-видимому, выполнение акупунктуры паранихиальных точек вблизи опухолевого очага может играть роль подобного «местного раздражителя» и ускорять рост опухоли. Т.о., ИРТ паранихиальных точек в «местном» варианте на начальной стадии тормозит рост опухоли, но стимулирует в дальнейшем, а в «общем» варианте приводит к достоверному угнетению опухолевого роста, торможению метастазирования и увеличению продолжительности жизни животных-опухоленосителей.

2. Исследование роли эндогенной опноидноой системы (ЭОС) в механизме противопухолевого действия нглорефлексотсрапии паранихиальных точек

В следующей серии экспериментов была поставлена задача исследовать противоопухолевое действие ИРТ паранихиальных точек при перевивке опухоли в подмышечную впадину на другой опухолевой модели, а также возможное участие ЭОС как мессенджера рефлекторного сигнала. Была выбрана стандартная модель - карцинома легких Льюис. Это высокометастазирующая неиммуногенная опухоль с высоким пролиферативным потенциалом (Трещалина Е.М.с соавт., 2000).

Нервная система является главным субстратом и посредником действия ИРТ на гомеостатические показатели организма. Это действие реализуется различными неспецифическими биохимическими системами нервной ткани, как нейротрансмиттерными /адрен-, холинэргической (Kwon Y.et al., 2000); серотонинэргической (Не L. et al., 1990), (Ma-Q.P. et al., 1992), (Takagi J. et al., 1998); ГАМК-эргическую (Chakrabarti S. et al., 1989) и т.д./, так и нейропептидными /опиодной (Gao М. et al., 1997),

и

(Zhang Y.W. et al., 2000), холецистокинина (Zhou, Y. et al., 2001), нейротензина (Liu, W. et al.., 1990) и другими системами. Считается доказанным, что стресслимитируюхцее действие ИРТ обусловлено координацией механизмов, модулирующих одновременно нейронные антиноцицептивные, иммунологические и эндокринные реакции (Василенко A.M., 1997). На данный момент наиболее изучено влияние рефлексотерапии на эндогенную опиоидную систему (Александров В.А. с соавт., 1998; Бакман A.M. с соавт., 1995]. Показана взаимосвязь между акупунктурной аналгезией и экспрессией ppENKmRNA в перитонеальных макрофагах мышей (Цо'гоев А. С. с соавт., 2000) По данным Wu В. [1995], противоопухолевые эффекты акупунктуры точек РС-6, LI-4, ST-36, RN-4 сопровождалились улучшением ряда иммунологических показателей, что корелировало с увеличением содержания Р-эндорфина в плазме крови. Участие опиоидов в регуляции иммунного ответа в настоящее время не вызывает сомнений. Опиоиды влияют на показатели клеточного и гуморального иммунитета, активность фагоцитов и NK-клеток (Зозуля А.А., Пшеничкин С.Ф., 1990; Sharp В.М. et al., 1998). Иммуномодулирующие эффекты опиоидов осуществляются либо в результате непосредственного взаимодействия с гетерогенной популяцией опиоидных рецепторов (ОР) иммунокомпетентных клеток (Зозуля А.А. с соавт., 1982; Falke N.E. et al., 1985; Gaveriaux С. et al., 1995) и, прежде всего, с рецепторами <5- и /i-типа, либо через ОР ЦНС или активацию гипоталамо-гипофизарно-иадпочечниковой системы (Зозуля А.А. с соавт., 1993; Sharp В.М. et al., 1998). Показано, что иммунные клетки экспрессируют ОР всех основных типов (Chuang L.F. et al., 1994; Gaveriaux et al., 1995; Madden J.J. et al., 1998). Опиоидные лиганды, в частности, мет-энкефалин, способны угнетать опухолевый рост (Murgo A.J. et al., 1985) и метастазирование, в том числе, за счет непосредственного воздействия на ОР опухолевых клеток (Zagon I.S., 1987). Все эти данные побудили нас исследовать возможную роль опиоидного механизма в противоопухолевом действии акупунктуры паранихиальных точек. С этой целью за 10 минут до лечения ИРТ внутрибрюшинно вводили налоксон -неселективный блокатор ОР. Доза препарата составила 10 мг/кг. В этой дозе препарат способен блокировать три типа опиоидных рецепторов (//-, S-, к- ОР) во всех трех компартментах ЭОС. Исследование проводилось на модели карциномы легких Льюиса в 4-х группах: контрольная, монотерапия налоксоном, монотерапия акупунктурой, сочетание введения налоксона и акупунктуры. В комбинированной группе за 10 минут до проведения ИРТ вводилось 10 мг/кг налоксона внутрибрюшинно.

Из таблицы 2 мы видим, что на 7-й день эксперимента в группе с комбинацией • ИРТ и налоксона произошло достоверное угнетение опухолевого роста на 46% (р<0,05). Это действие стало более выраженным на 10-й (62%, р<0,05) и 13-й дни (60%, р<0,05). Более того, налоксон сам вызвал угнетение роста опухоли, хотя и менее выраженное (53% на 10-й день, 52% на 13-й день, р<0,05). В группе с монотерапией ИРТ также

наблюдалось угнетение опухолевого роста (51% на 10-й день эксперимента, р<0,05). Т. о., неселективный блокатор ОР налоксон не препятствовал реализации противоопухолевого действия ИРТ паранихиальных точек. Напротив, налоксон проявлял тенденцию к усилению противооухолевого действия ИРТ (на 9% на 10-й день и на 8% на 13 день эксперимента р >0,05 )

Результат этого эксперимента в первом приближении показал, что противоопухолевое действие ИРТ паранихиальных точек связано с механизмом, отличным от лиганд-рецепторного взаимодействия с //-, 3-, кОР эндогенной опиоидной системы.

Табп.2. Противоопухолевое действие ИРТ паранихиальных точек

Группа Доза (мг/кг) Дни лечения ТРО, (% к контролю) УПЖ (% к контролю)

Дни после перевивки опухоли

7 10 13 17

ИРТ - 2-7 4 51* 42 34 9

Налоксон 10 2-7 31 53* 52* 35 6

Налоксон + ИРТ 10 2-7 46 62* 60* 35 2

Примечание:

- Индивидуальные вариации размеров опухоли и продолжительности жизни мышей-опухоленосителей не превышали 15%. * - ТРО (торможение роста опухоли) по сравнению с нелеченным контролем статистически достоверно, р < 0,05; УПЖ—увеличение продолжительности жизни 3. Противоопухолевая активность комбинации ИРТ и циклофосфана Большинство из известных химиопрепаратов обладают малой широтой терапевтического действия. Поэтому представляет интерес, как возможность потенциирования эффекта химиопрепарата, так и уменьшения его токсичности путем комбинирования с методами восстановительной медицины. С целью изучения возможности потенциирования эффекта цитостатика проводили ИРТ паранихиальных точек на фоне циклофосфамида в терапевтической дозе. Циклофосфан (100 мг/кг) вводили внутрибрюшинно два раза с интервалом 96 часов. Терапия циклофосфамидом (табл. 3) в терапевтической дозе приводила к стойкому угнетению опухолевого роста (95-99%, р<0,05). Монотерапия ИРТ вызывала кратковременное торможение опухолевого роста (51% на 10-е сутки, р<0,05). Комбинация ИРТ с циклофосфаном оказывала стойкое противоопухолевое действие (91-99%, р<0,05).

При использовании комбинации мы не можем судить по показателю ТРО о потенциировании действия цитостатика, ввиду того, что отмечались предельные значения (99%). По крайней мере, ИРТ не снижала эффекта цитостатика. ИРТ проявляла антиметастатическое действие (ТМ 30%, р<0,05) равное антиметастатическому действию циклофосфана (ТМ 29 %, р<0,05).

Табл.3. Противоопухолевое действие комбинации ИРТ и циклофосфана па модели карциномы Льюиса. ___,___

Группа Доза (мг/кг) Дни лечения ТРО, (% к контролю) УПЖ (% к контролю) ТМ (% к контролю)

Дни после перевивки опухоли

7 10 13 17

ИРТ - 2-7 4 51* 42 34 9 30*

Циклофосфан 100 2,6 95* 98* 99* 96* 58* 29

Циклоф. + ИРТ 100 2,6 2-7 91* 99* 99* 97* 55*л 42*

Примечание:

- Индивидуальные вариации показателей не превышали 15% * - торможение роста опухоли (ТРО), торможение метастазированш (ТМ) или увеличение продолжительности жизни (УПЖ) по сравнению с нелеченным контролем статистически достоверно, р < 0,05 л - излечение 1 мыши из 8 (приведены данные одного из трех независимых экспериментов).

Кроме того, по данному критерию стало очевидным, что акупунктура усиливает терапевтическое действие высокоэффективного цитостатика, вызывая излечение одной мыши из 8 и увеличивает его антиметастатическое действие (ТМ = 29 и 42% соответственно, р<0,05). По критерию увеличения продолжительности жизни существенной разницы между комбинацией и монотерапией цитостатиком не отмечалось (55% и 58% соответственно, р<0,05). Монотерапия акупунктурой вызвала 9% тенденцию к увеличению продолжительности жизни.

4. Экспериментальная фитотерапия карциномы легких Лыоиса

Экспериментальными и клиническими наблюдениями убедительно доказана перспективность использования средств растительного происхождения как метода восстановительной медицины в терапии онкологических заболеваний. Особый интерес вызывают препараты, повышающие естественную противоопухолевую резистентность, препятствующие развитию метастазов и рецидивов опухолей, снижающие токсические проявления химиотерапии. Подавляющее большинство работ

посвящено поиску среди лекарственных растений цитостатических компонентов и сравнению их с цитостатиками (Семенов A.A., 1979).

Нашими коллегами (М.П.Бойчак с соавт., 2000) из Главного военного клинического госпиталя МО Украины проводилась фитотерапия в группе из 40 больных с опухолями различной локализации, получавших курсовую радиотерапию. Этим больным в лечебный фитокомплекс включали Ярутку полевую, Дурнишник обыкновенный, Герань кровянокрасную, Аконит джунгарский. Авторы отмечали, что в контрольной группе общие лучевые реакции составили 20%, а в исследуемой группе побочные реакции отсутствовали и отмечалось увеличение периода безрецидивного течения (наблюдение в течение 1,5-2 лет). Учитывая эти положительные предварительные данные, представляло интерес оценить противоопухолевую активность данных растений на стандартных экспериментальных моделях.

Табл.4. Противоопухолевая активность растительного сбора в виде настоя (ярутка полевая, дурнишник обыкновенный, герань кровянокуасная) и аконита джунгарского на карииноме Льюиса._

Препара т Торможение роста опухоли, (% к контролю) УПЖ (% к контролю) Гибел ь от токси чност и (n/n)

Дни после перевивки опухоли

7 10 14 17

сбор 1 56 60 36 17 5 0/8

сбор 1/10 43 46 29 13 16 0/8

сбор 1/100 54 65* 32 19 13 0/8

Аконит 1 51 57 38 20 6 0/8

Аконит 1/10 24 33 14 +9 3 0/8

Примечание:

- Индивидуальные вариации размеров опухоли и продолжительности

жизни мышей-опухоленосителей не превышали 15% «+» стимуляция опухолевого роста

* - торможение роста опухоли (ТРО) по сравнению с нелеченным контролем статистически достоверно, р<0,05

- дозы растений: ярутка - I г/кг, дурнишник - 340 мг/кг. герань - 60 мг/кг. Аконит джунгарский -0,1 мл/кг ( 10 % настойка корневища на 40% спирте)

Основная масса растений с противоопухолевой активностью характеризуется низкой токсичностью, мягким действием, и трудно ожидать, что они могут составить конкуренцию существующим синтетическим цитостатикам и лучевой терапии (Пашинский В.Г. и др., 1983). Поэтому методически правильно проводить оценку эффективности фитосбора не только относительно известного химиопрепарата, но относительно какого-либо известного растения с максимальной активностью против опухолей различного гистогенеза. Аконит джунгарский по своему составу близок акониту байкальскому, настойка из которого (10% на 40% спирту) прошла стадию доклинических испытаний (Пашинский В.Г. с соавт., 1994; Боровская Т.Г. с соавт., 1993). Аконит считается одним из самых эффективных противораковых фитосредстз, он сильно ядовит и состоит в перечне растений, разрешенных к использованию только в качестве растительного сырья. В нашем исследовании ему отводилась роль референс-контроля как фитопрепарату с доказанной противоопухолевой активностью. Результаты исследований показали, что растительный сбор оказывает кратковременное противоопухолевое действие при отсутствии зависимости эффекта от дозы (табл.4).Отмечалось торможение роста первичного опухолевого узла на 60 - 65 % (р <0,05) и увеличение продолжительности жизни на 16% (р>0,05) в дозе настоя 1/10. Настойка аконита оказала несколько меньшее действие ( ТРО = 57%. УПЖ = 6%, р>0,05), которое, тем не менее, было дозозависимым: в дозе 1/10 эффект был ниже в 2 раза. Таким образом, комплекс из 3-х исследуемых растений по активности несколько превышал действие монотерапии аконитом. Ни в одной из исследуемых групп не отмечалось гибели животных от токсичности.

5. Экспериментальная иммунотерапия карциномы Льюиса

Повое производное МДП - р-адамантилгликозид-МДП содержит в своей структуре адамантановую группировку, идентичную кристаллической матрице алмаза. Ранее показано, что амфифильные

Табл.5. Противоопухолевая активность ({-адамантипгликозид-МДП

ни перевиваемой эпидермоидной карциноме Лыонса

Препарат Доза (мг/кг) х / интервал (час) х число введений Торможение роста опухоли (%)

Дни после перевивки опухоли

7 10 14 17

МДП 0,1/48 х 10 47 52* 42 17

МДП 1/48 х 10 34 31 15 + 10

МДП 10/48 х 10 33 39 16 20

Примечание:

- ТРО% МДП по сравнению с нелеченным контролем статистически достоверно, р<0,05,

- знак ••+ " - означает стимуляцию роста опухолей

Р-гликозиды МДП хорошо проникают через клеточные мембраны и в сравнении с немодифицированным МДП, его гидро- или липофильными аналогами более активны в оношении иммунокомпетентых клеток (Калюжин О.В. 1994, 1996). В модельных тест-системах in vitro продемонстрирована способность р-гептилгликозидов МДП стимулировать продукцию макрофагами интерлейкина-1 и фактора некроза опухоли, усиливать активность аллоспецифических цитотоксических Т-лимфоцитов и естественных киллеров, активировать пролиферацию Т- и В-лимфоцитов (КалюжинО.В., 2000). Учитывая способность производных МДП усиливать противоопухолевую иммуноактивность естественных киллеров, для эксперимента была выбрана карцинома легких Льюиса. Эта опухоль характеризуется низкой экспрессией рецепторов главного комплекса гистосовместимости и в силу этого является мишенью именно для неспецифического звена иммунитета. В модельной системе с использованием эпидермоидной карциномы мы исследовали эффект только моноиммунотерапиРи Р-адамантилгликозид-МДП без цитостатиков.

Рисунок 2. Влияние Р-адамаптилгликозид-МДП на продолжительность жизни мышей-носителей карциномы Льюиса

32,5+3,3

Цифрами по оси абсцисс обозначены группы животных: 1 - контроль. 2 -/3-адамантшгликозид-МДП (0,1 мг/кг), 3 -0-адамантилгликозид-МДП (1 мг/кг), 4 — /3-адамантилгликозид-МДП (10 мг/кг).

* - Достоверностьразличия с контролем (р<0,05).

Тестируемый дериват МДП во всех используемых дозах (0,1; 1 и 10 мкг/мл) при нероральном применении с интервалом 48 часов вызывал тенденцию к угнетению роста подкожного узла карциномы, особенно в первые две недели после инокуляции опухоли (табл.5). Однако из-за больших индивидуальных вариаций различия с контролем были достоверны (р<0,05) только в группе мышей, получавших препарат в дозе 0,1 мг/кг, на 10-й день эксперимента (52%). Не было выявлено существенного антиметастатического действия В-адамантилгликозид-МДП. Отмечена лишь статистически не значимая тенденция (22%) к угнетению метастазировання в группе мышей, получавших препарат в дозе 1 мг/кг. Что касается влияния на продолжительность жизни мышей-опухоленосителей, то было отмечено достоверное продление жизни а группе мышей, получавших препарат в дозе 0,1 мг/кг. Мурамилпептид в дозе 1 мг/кг не оказывал существенного влияния на этот показатель, а в дозе 10 мг/кг вызвал недостоверную тенденцию к уменьшению продолжительности жизни (рис.2).

5. Экспериментальная иммунотерапия лнмфомы EL-4

Для изучения активности р-адамантилгликозид-МДП в отношении неоплазм из лимфоидной ткани использовали модель Т-клеточной лнмфомы EL-4. Лимфома EL-4 представляла интерес с тон точки зрения, что некоторые цитокины, включая ИЛ-1 и ИЛ-2, продукция которых усиливается мурамилпептидами, a priori могут стимулировать рост трасформнрованных "Г-клеток. Возникал вопрос, каким будет конечный результат действия исследуемого деривата МДП на рост опухоли in vivo и продолжительность жизни мышей-носителей Т-клеточной лимфомы. Монотерапия с использованием Р-адамантилгликозид-МДП (1 мг/кг per os 1 раз в 3 дня) приводила к угнетению роста подкожного узла лимфомы EL-4 (табл.б). Наиболее выраженным этот эффект был через 7 суток после инокуляции опухоли (51%), на 14-й и 21-й дни он снижался до 34% и 18% соответственно. Обращает на себя внимание, что иммупомодулятор

Табл. 6 Противоопухолевое действие комбинации адамантил-МДП и циклофосфамида на модели лимфомы EL-4__

Группы экспериментальных животных размеры первичного опухолевого узла (mmj), (п=10).

на 7-й день | на 14-й день эксперимента эксперимента на 21-й день эксперимента

Контроль 129+23 299+41 494+38

Циклофосфамид (25 мг/кг) 59±20 (54%*) 175±29 (41%*) 351+47 (29%*)

Р-адамантилгл.-МДП(1 мг/кг) 63±15 (51%*) 198±43 (34%*) 405+34(18%*)

Циклофосфамид + 57±14 (56%*) 150+28 (50%*) 207±43 (58%*)

Р-адамантилгл.-МДП

Примечание:

* - торможение роста опухоли по сравнению с нелеченным контролем статистически достоверно, р<0,05

оказывал угнетающее действие на рост лимфомы, сопоставимое с эффектом циклофосфамида, особенно на начальных этапах развития опухоли (7-й день). В дальнейшем питостатик подавлял опухолевый рост эффективнее, чем производное МДП, хотя статистически значимых различий их действия не выявлено. В данной модельной системе in vivo сходным было и влияние В-адамантилгликозид-МДП и циклофосфамида на продолжительность жизни мышей-опухоленосителей: увеличение средней продолжительности жизни на 30% и 34% соответственно (рис.3).

Рисунок 3. Влияние /?-адамантилгликозид-МДП и циклофосфана на продолжительность жизни мышей-носителей лимфомы EL4

58+7

Цифрами по оси абсцисс обозначены группы экспериментальных животных: животных: 1 ~ контроль, 2 - циклофосфамид (25 мг/кг), 3 - /?-адамантилгликозид-МДП (1 мг/кг), 4 — циклофосфамид + /?-адамантшгл икоз ид-МДП - Достоверность различия с контрольными значениями Р<0.05

Наибольшее противоопухолевое действие было продемонстрировано при сочетанном использовании цитостатика и иммуномодулятора: достоверное

угнетение опухолевого роста на 50-58% (табл.6) и увеличение продолжительности жизни на 72% (рис.3). Результаты настоящего исследования продемонстрировали высокую эффективность В-адамантил гликозид-МДП in vivo как средства монотерапии и как компонента комплексного лечения.

Экспериментальная иммунотерапия меланомы В-16

Пероральное применение В-адамантилгликозид-МДП по 1 мг/кг 1 раз в 3 дня вызывало снижение скорости роста подкожного узла меланомы В-16. Так же, как и в модельной системе с использованием лимфомы EL-4, противоопухолевое действие было больше выражено на 7-й день после инокуляции опухоли (55%) (табл.7), а через 14 и 21 суток от начала эксперимента эффект по угнетению опухолевого роста несколько снижался (соответственно 32 и 15%).

Табл. 7. Противоопухолевое действие комбинации В-адамантилгликозид-МДП и ииклофосфамида на модели меланомы В16

Группы животных Торможение Роста Опухоли (мм3), (п=10). Количество макрометастазов на 28-й день эксперимента, (п=10).

7-й день эксперимента на 14-й день эксперимента на 21-й день эксперимента

Контроль 164±25 387+53 875+79 15,2+3,4

Циклофосфамид (25 мг/кг) 89±23*(46%) 247±38*(36%) 541±64*(38%) 8.9±3,9(40%)

Р-адамантилгл.-МДП -МДП (1 мг/кг) 73±20*(55%) 263±25*(32%) 742±75(15%) 10,1 ±2.8(33%)

Циклофосфамид\ Р-адамантилгл.- МДП 70+17*(57%) 196±47*(49%) 390±47+(55%) 3,4+2,2*(80%)

Примечание:

*- Достоверность различия с контрольными значениями Р<0,05: % - торможение роста опухоли или торможение метастазирования но отношению к контролю.

Интересно, что на начальном этапе опухолевого процесса торможение роста меланомы иммуномодулятором было выражено даже сильнее, чем действие ииклофосфамида (25 мг/кг 1 раз в 3 дня), хотя статистически это различие было не достоверно. Что касается влияния В-адамангилгликозид-МДП на процесс метастазирования меланомы в легкие, то обнаружно значительное (33%) снижение числа макроскопических метастазов по сравнению с контролем на 28-й день эксперимента. Циклофосфамид подавлял метастазирование на 40%, тогда как сочетанное применение препаратов давало максимальный эффект (80%) (табл.7). Комбинированное применение В-адамантил гликозид-МДП и цитостатика вызывало наибольшее угнетение

опухолевого роста, а также продлевало жизнь мышей-опухоленосителей более, чем в 2 раза (табл.7; рис.4). Монотерапия цитостатиком или иммуномодулятором увеличивало среднюю продолжительность жизни на 45 или 43% соответственно (рис.4).

Рисунок 4. Влияние [¡-адамантил-МДП и циклофосфана на продолжительность жизни мышей-носителей меланомы В16

_65+8_

(+110%'Г

Цифрами по оси абсцисс обозначены группы экспериментальных животных: 1 - контроль, 2 — циклофосфамид (25 мг/кг), 3-/3-адамантилгликозид-МДП (1 мг/кг), 4 - циклофосфамид + ¡1-адамантшгликозид-МДП. - Достоверность различия с контрольными значениями (р<0,05).

Т.о., обнаружена способность 13-адамантилгликозид-МДП при пероральном применении угнетать опухолевый рост и метастазирование меланомы В-16, увеличивать продолжительность жизни мышей-опухоленосителей, а также потенциировать противопухолевые эффекты | циклофосфамида.

Результаты работы доказывают наличие противоопухолевого эффекта у предложенных методик восстановительной медицины

(иглорефлексотерапии паранихиальных точек, фитотерапии оригинальной растительной композицией и иммунотерапии адамантильным производным МДП). Все эти методики как средства монотерапии проявили примерно равное противоопухолевое действие на модели карциномы легких Льюиса. Это действие, в отличие от эффекта циклофосфамида в терапевтической дозе было менее продолжительным.

Клетки дачной опухоли характеризуются крайне низкой экспрессией молекул главного комплекса гистосовместимости и в силу этого являются практически «невидимыми» для специфического звена иммунитета. Поэтому, с учетом литературных данных, можно постулировать способность трех изучавшихся методик восстановительной медицины стимулировать естественные звенья противоопухолевой резистентности. Важной находкой явилась способность ИРТ подавлять метастазирование карциномы, по силе равная активности циклофосфамида - одного из наиболее сильных (в эксперименте) антиметастатических агентов. Комбинирование ИРТ с циклофосфамидом приводило к потенциированию эффекта. В то же время, на модели меланомы В16 было доказано, что выполнение ИРТ вблизи очага опухоли провоцирует ускорение ее роста. В литературе имеются данные о снижении токсического действия противоопухолевых химиотерапевтических средств под влиянием мурамилпептидов. Поэтому мы предполагаем, что существенное усиление (3-адамантилгликозид-МДП терапевтических эффектов циклофосфамида в мышиных моделях меланомы и лимфомы обусловлено не только стимуляцией звеньев противоопухолевого ответа, но и снижением токсического влияния этого цитостатика на организм опухоленосителя, в том числе на системы кроветворения и иммуногенеза.

В целом, результаты работы являются предпосылкой к апробации предложенных методов восстановительной медицины в клинике, у больных после развернутых мультиорганных операций, после завершения курсов лучевой или химиотерапии, с химиорезистентными формами опухолей, а также в терминальной стадии для улучшения качества жизни.

ВЫВОДЫ:

1. Пглорефлексотераиия параннхиальных точек передних и задних конечностей угнетает рост первичного узла и метастазов мышиной меланомы В16, перевитой в подмышечную область, и достоверно увеличивает продолжительность жизни мышей-опухоленосителей на 31%. Пглорефлексотераиия параннхиальных точек при перевивке меланомы В16 в стопу на начальной стадии приводит к угнетению роста меланомы (49%), а в дальнейшем, наоборот, стимулирует пролиферацию опухолевых клеток, проявляет тенденцию к усилению метастазирования.

2. Иглорефлексотерапия параннхиальных точек угнетает рост первичного узла карциномы легких Лыоиса (в подмышечной впадине) на 51% и на 30% метастазирование опухоли в легкие, что сопоставимо с действием циклофосфамида в дозе 100-мг/кг. Комбинированное применение данного вида иглорефлексотерапии потенциирует антиметастатическое действие циклофосфамида.

3. Неселективный блокатор опиоидных рецепторов налоксон не препятствует развитию противоопухолевых эффектов

иглорефлексотерапии на модели карциномы Льюиса. Более того, налоксон в дозе 10 мг/кг проявляет противоопухолевую активность и потенциирует

эффект акупунктуры - это говорит о том, что на данной модели противоопухолевое действие ИРТ не связано с механизмом /х&к -лигандрецепторного взаимодействия эндогенной опиоидной системы.

.4. ß-адамантилгликозид мурамилдипептид тормозит опухолевый рост карциномы Льюиса на 52%, увеличивает среднюю продолжительность жизни животных-носителей меланомы В-16 на 39% и лимфомы EL-4 на 30%, а также угнетает на 33% процесс метастазирования на модели меланомы В-16. Данный иммуномодулятор при комбинированной терапии с циклофосфамидом в дозе 25 мг/кг потенциирует противоопухолевые эффекты последнего, в условиях моделей лимфомы EL-4 и меланомы В16.

5. Фитотерапия мышей с карциномой Льюиса per os настоем из Ярутки полевой (Thiaspi arvense), Дурнишника обыкновенного (Xanthium strumarium), Герани кровяно-красной (Geranium sanguineum) тормозит на 65% рост первичного опухолевого узла и проявляет тенденцию к увеличению продолжительности жизни животных-опухоленосителей.

Список печатных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Кузовлев Ф.Н., Калюжин О.В. Экспериментальная иглорефлексотерапия опухолей.//Russian Journal of Immunology. - 1999. -Vol. 4 (Suppl. 1).-. P. 278.

2. Калюжин O.B., Нелюбов M.B., Кузовлев Ф.Н., Калюжина М.И., Земляков А.Е., Шкалев М.В., Мулик Е.Л., Караулов A.B.. Амфифильный дериват мурамилдипептида в терапии мышиной лимфом ы EL-4. // Вопросы биологической медицинской и фармацевтической химии. - 2001. -№ 1.-С. 45-46.

3. Кузовлев Ф.Н., Калюжин О.В. Влияние акупунктуры на рост и метастазирование меланомы В-16 и продолжительность жизни животных опухоленосителей. // Материалы 2-й конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины». - Москва .-2001. -Т.1. - С 426- 427.

4. Калюжин О.В., Мулик Е.Л., Калюжин В.В., Кузовлев Ф.Н., Шкалев М.В., Абидов A.M.. Профилактика и лечение септических поражений почек глимуридом. // Материалы научной конференции, посвященной 30-летию кафедры инфекционных болезней КБГУ «Актуальные вопросы инфекционной патологии». - Нальчик. - 2001. - С. 31-32.

5. Кузовлев Ф.Н., Калюжин О.В. Акупунктура стимулирует противоопухолевый иммунитет мышей. // Анналы ФПНиНПК,- Москва. -1999.-Т1.-С.61.

6. Калюжин О.В., Нелюбов М.В., Кузовлев Ф.Н., Калюжина Е.В., Шкалев М.В. Влияние конфигурации гликозидной связи и структуры агликона гликозилированного мурамилдипептида на его способность стимулировать продукцию интерлейкина -1 и фактора некроза опухолей макрофагами. // Бюллютень экспериментальной биологии медицины. 2002. -Т. 134.- №9.-С326-328.

Z3

7. Кузовлев Ф.Н., Магрилова Е.С., Зилов В.Г. Влияние акупунктуры на метастазирование опухолей в эксперименте. // Материалы научно-практической конференции, посвященной 55-летию сотрудничества ММА им. И.М. Сеченова и здравоохранения Тульской области. Москва. -Тула-2002,-С. 138- 140.

8. Кузовлев Ф.Н., Кузовлева Е.С., Калюжин О.В. Преодоление «взрыва» метастазирования при помощи акупунктуры после резекции первичного очага опухоли в эксперименте. // Материалы 3-й конференции молодых ученых ФППО ММА им. И.М.Сеченова « Актуальные вопросы клинической медицины»,- Москва -2002.-С. 82—86.

9. Кузовлев Ф.Н., Кузовлева Е.С., Калюжин О.В. Влияние конфигурации гликозидной связи, структуры агликона и физикохимических свойств молекулы гликозидов мурамнлдипептида на их биологическую активность. // Материалы 3-й конференции молодых ученых ФППО ММА им. И.М.Сеченова « Актуальные вопросы клинической медицины». -Москва -2002.- С. 72 - 78.

10. Кузовлев Ф.Н., Собецкий В.В., Калюжин О.В. Изучение влияния лекарственных растений на опухолевый рост в эксперименте. // Материалы клинической конференции молодых ученых ФППО ММА им. И.М.Сеченова «Актуальные вопросы клинической медицины». - Москва — 2001.- С.140-144.

Актуальность проблемы

Борьба со злокачественными новообразованиями является одной из наиболее актуальных проблем в медицине и биологии и затрагивает многие аспекты социальной жизни общества. В мире ежегодно заболевает злокачественными новообразованиями 6 млн. человек. Среди причин смерти людей в большинстве промышленно развитых стран данная нозологическая группа занимает 2 - 3-е место (Parkin et al., 1984; Muir, 1986). Оперативное вмешательство играет ведущую роль в спектре лечебных мероприятий. Апробированными методами являются адъювантная и неоадъювантная химио- и лучевая терапия. Онкологические больные, перенесшие операцию, после завершения циклов курсов лучевой или химиотерапии, с химиорезистентными формами опухолей, а также больные в терминальной стадии с болевым синдромом нуждаются в применении методов восстановительной медицины. При этом, в зависимости от стадии заболевания, основной целью восстановительной медицины является профилактика рецидива и прогрессирования заболевания или улучшение качества жизни.

В настоящее время методы восстановительной медицины, в частности, иглорефлексотерапия (ИРТ) и фитотерапия, находят все более широкое клиническое применение. Многие онкологические больные, не удовлетворенные возможностями традиционных методов лечения, обращаются за помощью к специалистам комплементарной терапии. В США, Западной Европе, Австралии количество онкологических больных, прибегающих к методам комплементарной медицины, колеблется между 1416%, доля ИРТ среди этих методов составляет около 62% (Coss R.A., 1999; Hardell L. et al., 1998). Накопленные факты свидетельствуют о том, что эффекты ИРТ опосредованы нервной, а через нее эндокринной и иммунной системами организма (А.М.Василенко, 1997). Учитывая, что при воздействии канцерогенных факторов на организм наиболее рано нарушаются именно информационные и регуляторные механизмы нервной системы (Сиротин Б.З., 1968), применение методов рефлексотерапии в онкологии представляется вполне обоснованным. Тем не менее, анализ возможности использования ИРТ при неопластических заболеваниях в свете актуальных проблем онкологии (Козлов A.M., 1997) выявил ряд нерешенных вопросов:

- Возможно ли с помощью ИРТ подавлять канцерогенез в индуктивной фазе и, напротив, может ли акупунктура быть индуктором опухолевого роста?

- Каково влияние различных вариантов ИРТ на динамику роста опухолей различной локализации и гистогенеза?

- Может ли ИРТ быть средством профилактики метастазирования после выполнения радикальной операции?

- Возможно ли повышение эффективности лучевой и химиотерапии, уменьшение побочных эффектов при комбинировании их с ИРТ?

Исследования по экспериментальной электро- и иглорефлексотерапии опухолей апеллируют к очень незначительному числу из общего перечня активных точек и рефлексогенных зон. В литературе мы не встретили работ с использованием классических точек акупунктуры (ТА), локализованных сбоку от ногтевой зоны роста (паранихий). Между тем, данная группа ТА отличается наличием высокого потенциала биологической активности (Нгуен Ван Нги, 1992). Кроме того, на грызунах данная группа ТА анатомически наиболее доступна и представляет интерес для изучения на моделях перевиваемых опухолей.

Применение лекарственных растений в терапии онкологических заболеваний имеет давнюю историю. Народной медициной для этой цели рекомендуется не один десяток растений (Балицкий К.П., Воронцова А.Л., 1976). Для онкологии растения представляют двоякий интерес: как сырье для получения новых химиопрепаратов и в качестве самостоятельных средств восстановительной медицины. В литературе широко представлены экспериментальные данные о возможности подавления опухолевого роста фитопрепаратами. К настоящему времени цитостатическая активность выявлена практически у всех групп химических соединений, входящих в состав растений: кумаринов, лигнинов, флавоноидов, протеинов, полисахаридов, серосодержащих соединений и др. (Lutomski J. et al., 1983; Шленкевич M.A. с соавт., 1993). Стадию доклинического изучения прошли соединения всех перечисленных групп. Тестирование экстрактов из растительного сырья на наличие противопухолевой активности является первым этапом отбора и углубленного изучения для дальнейшего выделения активного индивидуального вещества для доклинического изучения.

Предварительные результаты клинических исследований свидетельствуют, что Герань кровянокрасная (Geranium sanguineum), Ярутка полевая {Thiaspi arvense) и Дурнишник обыкновенный (.Xanthium strumarium) способны подавлять опухолевый рост и уменьшать побочное действие лучевой терапии (Бойчак М.П., Собецкий В.В., Цветкова В.В., 2000). Эти сведения нуждаются в проверке наличия противоопухолевой активности у данных растений в эксперименте.

За прошедшие десять - пятнадцать лет широкое распространение и развитие получила иммунотерапия опухолей. Известны примеры успешного лечения злокачественных новообразований, основанные на стимуляции естественных иммунных реакций. Большое внимание уделяется препаратам бактериального происхождения. Уже примерно 25 лет в мире ведутся интенсивные исследования и поиски производных N-ацетилмурамил-Ь-аланил-О-изоглутамина (мурамилдипептида, МДП) - компонента пептидогликана группы А клеточной стенки ряда бактерий. Аналоги МДП присутствуют в организме животных и человека в малых количествах, являясь факторами сна, витаминами, обезболивающими и нейротропными медиаторами, иммуномодуляторами. Основная область применения этих веществ - это модуляция иммунных реакций, в частности, стимуляция противоопухолевого и противоинфекционного иммунного ответа.

МДП является весьма эффективным модулятором иммунных реакций, но из-за высокой токсичности и быстрого выведения из организма он не получил клинического применения. На данный момент ведется активный поиск новых, более эффективных и менее токсичных синтетических аналогов МДП (Kalyuzhin O.V. et al., 1996). Перспективным веществом этой группы является (3-адамантилгликозид-МДП. Его фармакокинетические и иммунотропные свойства изучены достаточно хорошо, что позволяет предположить возможность комплексного применения р-адамантилгликозид-МДП в онкологической практике. Поэтому возникла необходимость в экспериментальных исследованиях.

В свете поставленных вопросов особенно актуальна оценка эффективности вышеперечисленных методов восстановительной медицины и иммунологии на опухолевый рост in vivo, на моделях, рекомендованных Минздравом РФ для доклинического исследования противоопухолевой активности фармакологических веществ (Трещалина Е.М. с соавт., 2000). Цель работы: исследовать противоопухолевые эффекты на моделях неопластических заболеваний in vivo: фитотерапии настоем из компонентов Ярутки полевой (Thiaspi arvense), Дурнишника обыкновенного (Xanthium strumarium), Герани кровяно-красной (Geranium sanguineum), иммунотерапии (3-адамантилгликозидом мурамилдипептида, иглорефлексотерапии паранихиальных точек. Задачи исследования:

1. Изучить влияние иглорефлексотерапии паранихиальных точек на динамику опухолевого роста, продолжительность жизни мышей-опухоленосителей и процесс метастазирования меланомы В16. Сравнить на противоопухолевую активность местного и общего (относительно первичного очага опухолевого роста) вариантов ИРТ точек паранихия.

2. Изучить влияние на динамику опухолевого роста, продолжительность жизни мышей-опухоленосителей и процесс метастазирования ИРТ паранихиальных точек на модели карциномы легких

Льюиса. Сравнить противоопухолевый эффект ИРТ с активностью циклофосфамида в терапевтической дозе, изучить возможность их комбинированного применения.

3. Исследовать роль опиоидного механизма в противоопухолевом действии иглорефлексотерапии паранихиальных точек, опосредованного группой опиоидных рецепторов типов ¡л-, 8 - и кь на модели карциномы легких Льюиса.

4. Изучить противоопухолевую активность (3-адамантилгликозида мурамилдипептида на моделях меланомы В16, лимфомы EL-4 и карциномы легких Льюиса. Изучить противоопухолевое действие комбинации циклофосфамида в субоптимальной дозе и (3-адамантилгликозида мурамилдипептида.

5. Исследовать противоопухолевую активность фитосбора: Ярутка полевая (Thiaspi arvense), Дурнишник обыкновенный (Xanthium strumarium), Герань кровяно-красная {Geranium sanguineum) на модели карциномы легких Льюиса.

Научная новизна:

1. Впервые изучена на противоопухолевую активность группа паранихиальных ТА как изолированно, так и в комплексе с цитостатиком.

2. Впервые исследовано участие ¡л-, 8- и лгрецепторного сегмента эндогенной опиоидной системы в механизме противоопухолевого действия ИРТ точек области паранихия.

3. Впервые показана амбивалентность рефлекторных влияний на опухолевый рост в зависимости от местного или общего ИРТ- воздействия относительно места перевивки опухоли.

4. Впервые изучена противоопухолевая активность нового производного МДП изолированно и в комплексе с цитостатиком.

5. Впервые изучена в эксперименте новая растительная композиция на наличие противоопухолевой активности.

Теоретическая и практическая значимость

Результатом исследования являются данные о противоопухолевой активности в модельных системах in vivo нового производного МДП, новой растительной композиции и группы точек акупунктуры.

Теоретическую ценность имеет доказательство того, что противоопухолевое действие ИРТ точек дистальных фаланг пальцев опосредовано механизмом, отличным от ¡л-, 5- и к- лигандрецепторного взаимодействия ЭОС. Было показано, что результат ИРТ воздействия на опухолевый процесс зависит от локализации опухоли и типа проводимой ИРТ (общего или местного). Данные о наличии способности угнетать метастазирование и потенциировать антиметастатическое действие циклофосфана создают предпосылку для коррекции перечня показаний и противопоказаний ИРТ при неопластических заболеваниях.

Доказано наличие противоопухолевой активности у изучаемой фитокомпозиции, что говорит о целесообразности проведения химического анализа для выявления активных компонентов.

Продемонстрирована способность (3-адамантилгликозида-МДП угнетать рост и метастазирование ряда экспериментальных опухолей, потенциировать противоопухолевые эффекты циклофосфамида, что с учетом проводимых в настоящее время работ по созданию на базе этого вещества лекарственного средства приобретает и большую практическую ценность. Основные положения, выносимые на защиту

Доказана способность к угнетению роста и метастазирования экспериментальных опухолей при помощи:

1. Р-адамантилгликозида-МДП как средства монотерапии и в комбинации с цитостатиком.

2. Общей иглорефлексотерапии паранихиальных точек.

3. Фитокомпозиции из Ярутки полевой, Дурнишника обыкновенного и Герани кровяно-красной.

Практическое внедрение полученных результатов

Материалы диссертационной работы внедрены в учебный процесс на кафедре нелекарственных методов лечения и клинической физиологии ФППО ММА им. И.М.Сеченова. Апробация диссертации

Основные положения диссертации были представлены на:

Втором съезде иммунологов России (Россия, Сочи, 1999). Клинической конференции молодых ученых ФППО ММА им. И.М.Сеченова «Актуальные вопросы клинической медицины». М. - 2001.

Клинической конференции молодых ученых ФППО ММА им. И.М.Сеченова «Актуальные вопросы клинической медицины». М. - 2002.

Апробация диссертации состоялась 26 сентября 2002 года на межкафедральной научно-методической конференции кафедры нелекарственных методов лечения и клинической физиологии, кафедры иммунологии и аллергологии ФППО ММА им. И.М. Сеченова.

Диссертация рекомендована к защите. Публикации

По материалам диссертации опубликовано десять научных работ, из них четыре статьи и шесть тезисных работ. Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы (2 главы), материалы и методы, результаты собственных исследований (3 главы), обсуждение, выводы, библиографический указатель литературы. Указатель литературы содержит 133 отечественных и 196 зарубежных источников. Диссертация изложена на 149 странице, иллюстрирована 13 рисунками и содержит 20 таблиц. Вклад автора и соавторов в проведенные исследования

ВЫВОДЫ:

1. Иглор ефлексотерапия паранихиальных точек передних и задних конечностей угнетает рост первичного узла и метастазов мышиной меланомы В16, перевитой в подмышечную область, и достоверно увеличивает продолжительность жизни мышей-опухоленосителей на 31%. Иглорефлексотерапия паранихиальных точек при перевивке меланомы В16 в стопу на начальной стадии приводит к угнетению роста меланомы на 49%, а в дальнейшем, наоборот, стимулирует пролиферацию опухолевых клеток, что приводит к усилению метастазирования.

2. Иглорефлексотерапия паранихиальных точек угнетает рост первичного узла карциномы легких Льюиса (в подмышечной впадине) на 51% и на 30% метастазирование опухоли в легкие, что сопоставимо с действием циклофосфамида в дозе 100 мг/кг. Комбинированное применение данного вида иглорефлексотерапии потенциирует антиметастатическое действие циклофосфамида.

3. Неселективный блокатор опиоидных рецепторов налоксон не препятствует проявлению противоопухолевых эффектов иглорефлексотерапии на модели карциномы Льюиса. Более того, налоксон в дозе 10 мг/кг проявляет противоопухолевую активность и потенциирует эффект акупунктуры - это говорит о том, что на данной модели противоопухолевое действие ИРТ не связано с механизмом ¡л, 8, к -лигандрецепторного взаимодействия эндогенной опиоидной системы.

4. (3-адамантилгликозид мурамилдипептид тормозит опухолевый рост карциномы Льюиса на 52%, увеличивает среднюю продолжительность жизни животных-носителей меланомы В-16 на 39% и лимфомы ЕЬ-4 на 30%, а также угнетает на 33% процесс метастазирования на модели меланомы В-16. Данный иммуномодулятор при комбинированной терапии с циклофосфамидом в дозе 25 мг/кг потенциирует противоопухолевые эффекты последнего, на моделях лимфомы ЕЬ-4 и меланомы В16.

5. Фитотерапия мышей с карциномой Льюиса per os настоем из Ярутки полевой (Thiaspi arvense), Дурнишника обыкновенного {Xanthium strumarium), Герани кровяно-красной {Geranium sanguineum) тормозит на 65% рост первичного опухолевого узла и проявляет тенденцию к увеличению продолжительности жизни животных-опухоленосителей.