Автореферат и диссертация по медицине (14.01.21) на тему:Прогностическая значимость маркеров системного воспаления при острых лейкозах

На правах рукописи

Плотникова Светлана Владимировна

ПРОГНОСТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ МАРКЕРОВ СИСТЕМНОГО ВОСПАЛЕНИЯ ПРИ ОСТРЫХ ЛЕЙКОЗАХ

14.01.21. - Гематология и переливание крови.

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

9 СЕН

Уфа 2015

005562025

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет» (ГБОУ ВПО БГМУ) Минздрава России

Научные руководители:

доктор медицинских наук , профессор

Сафуанова Гузяль Шагбановна

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор

Азнабаева Лилия Фаритовна

Официальные оппоненты:

Рукавицын Олег Анатольевич, доктор медицинских наук, профессор, начальник Гематологического центра федерального государственного казенного учреждения «Главный военный клинический госпиталь имени академика H.H. Бурденко», главный гематолог Министерства обороны РФ.

Моисеев Сергей Иванович, доктор медицинских наук, профессор, заведующий отделом радиационной медицины, гематологии и токсикологии федерального государственного бюджетного учреждения «Всероссийский Центр экстренной и радиационной медицины им. А.М.Никифорова» МЧС России

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства»

Защита состоится №. ^ в часов на заседании диссертационного совета Д 208.074.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии Федерального медико-биологического агентства» по адресу: 191024, г. Санкт-Петербург, ул. 2-я Советская, д. 16.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте ФГБУ РосНИИГТ ФМБД России Автореферат разослан <<££л ') 5 года

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор медицинских наук, доцент

Татьяна Валентиновна Глазанова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Острые лейкозы (ОЛ) занимают одно из первых мест в группе заболеваний системы крови как по частоте, так и по тяжести течения. По урону, наносимому обществу, гемобластозы в экономически развитых странах занимают второе место после рака легкого, поскольку среди новообразований являются наиболее частой причиной смерти в детском и молодом возрасте. В последние годы средняя заболеваемость гемобластозами в Российской Федерации неуклонно растет. Ежегодно регистрируются заболевших острым лимфобластным лейкозом 2700 человек, острым миелобластным лейкозом 1600 человек (Бондаренко И.А. и др., 2010 г.). Многие зарубежные и отечественные авторы уделяют пристальное внимание изучению данной патологии (Hoffman R., 2008 г., Савченко В.Г., Паровичникова E.H., 2006 г., Румянцев А.Г., 2011 г., Рукавицын O.A., 2015). Несмотря на достигнутые успехи в диагностике и лечении, позволившие считать OJI потенциально излечимым заболеванием, до сих пор остаются нерешенными многие вопросы диагностики, патогенеза острых лейкозов и их осложнений.

Согласно современным представлениям, искажения механизмов контроля пролиферации и дифференцировки клеток при OJI, а также проводимая цитостатическая терапия ослабляют защитные механизмы организма, способствуют развитию системного воспаления (Тарасова JI.H. и др., 2007 г., Антонов В.Г. и др., 2004 г.) и являются фактором риска для развития осложнений основного заболевания (Гусев Е.Ю., 2012 г.).

Степень разработанности темы исследования

Одним из грозных проявлений OJI является развитие синдрома инфекционных осложнений (ИО), который усугубляет течение заболевания и может быть причиной летального исхода (Рукавицын O.A., 2008 г.).

По данным некоторых авторов, в процессе развития злокачественного образования происходит нарушение взаимодействия опухолевых клеток и клеток иммунной системы, которое сопровождается вовлечением в системное воспаление цитокинов, проявляющееся дисбалансом продукции и регуляции этих биологически активных веществ (Хоробрых М.Н. и др., 2010 г.). Известно, что цитокины,

активируя функции иммунокомпетентиых клеток, усиливают резистентность организма к опухоли. Наиболее перспективными для изучения являются ИЛ-ip, ИЛ-6, ИЛ-8 и ФНО-а (Mantovani, Л., 2008 г.).

В последнее время большое внимание уделяется роли адгезивных молекул плазмы крови при различных заболеваниях (Hamai А., 2008 г., Lawson С., 2009 г.). Увеличение их концентрации в плазме связывают с выраженностью воспаления и поэтому их считают маркерами системного воспаления. ICAM-1- молекула межклеточной адгезии, позволяя лимфоцитам узнавать соответствующие участки поверхности эндотелиальных клеток, играет важную роль в межклеточных и клеточнотстромальных взаимодействиях (Arkin S., 1991 г., Frank P.G. и др., 2008 г.).

Таким образом, необходимость разработки принципиально новых подходов к ранней диагностике инфекционных осложнений у первичных больных ОЛ и их коррекции, обосновывает актуальность исследования иммунного реагирования у данных пациентов с позиции системного воспаления с изучением провоспалительных цитокинов (ИЛ-ip, ИЛ-6, ИЛ-8, ФНО-а), молекулы межклеточной адгезии sICAM-1 и функционального состояния клеток противоинфекционной защиты.

Цель исследования - выявление маркеров системного воспаления у больных острым лейкозом как факторов риска развития инфекционных осложнений

Задачи исследования:

1) Изучить заболеваемость острыми лейкозами в Республике Башкортостан за период с 2005 по 2013 годы.

2) Установить особенности течения острых лейкозов с позиции инфекционных осложнений.

3) У больных острыми лейкозами оценить особенности иммунного реагирования в зависимости от развития инфекционных осложнений путем изучения функциональных свойств фагоцитов (нейтрофилы и моноциты) в периферической крови и костном мозге (фагоцитарная и метаболическая способность, экспрессия мембранных рецепторов к иммуноглобулинам класса G -CD 16 и CD64).

4) Провести у больных острыми лейкозами количественную оценку гуморальных маркеров системного воспаления - прововоспалительные цитокины (ИЛ-1Р, ИЛ-6, ИЛ-8, ФНО-а) и молекулы межклеточной адгезии 81СЛМ-1 в зависимости от инфекционных осложнений.

5) Выделить прогностические маркеры риска развития инфекционных осложнений при острых лейкозах с целью их ранней коррекции.

Научная новизна работы

Результаты исследования особенностей иммунного реагирования у первичных больных ОЛ с наличием и без ИО с определением состояния иммунной системы, маркеров системного воспаления (основные провоспалительные цитокины - ИЛ-1Р, ИЛ-6, ИЛ-8 и ФНО-а), молекул межклеточной адгезии 81САМ-1, а так же экспрессии рецепторов к ^О (С016 и С064) на клетках макрофагально-фагоцитарного звена существенно дополняют сведения о механизмах патогенеза ОЛ и позволяют прогнозировать риск развития инфекционных осложнений. Установлено, что острый лейкоз сопровождается активацией провоспалительных компонентов в виде повышения в крови уровня ФНО-а, ИЛ-6, 81САМ-1 и экспрессии СБ64 на иейтрофилах костного мозга без реакции со стороны основных провоспалительных цитокинов - ИЛ-1Р и ИЛ-8. Развитие синдрома инфекционных осложнений сопряжено с дисбалансом врожденного иммунитета и характеризуется вовлечением в системное воспаление провоспалительных цитокинов ФНО-а, ИЛ-6, молекулы межклеточной адгезии 81С А М-1 и сниженной способностью нейтрофилов к фагоцитозу, обусловленной недостаточностью мембранной экспрессии рецепторов к ^О - СО 16, в сочетании с ферментативной недостаточностью (МРО), более выраженной при ОМЛ. Представлена характеристика мембранной экспрессии рецепторов к ^О (СО 16 и С064) на клетках-эффекторах противоинфекционной защиты (нейтрофилы, моноциты) в костном мозге у больных острым лейкозом и показаны их особенности при развитии инфекционных осложнений (сниженное содержание С016+нейтрофилов и МРО+фагоцитов - нейтрофилы и моноциты). Впервые установлено, что у первичных больных острым лейкозом снижение количества С016+нейтрофилов в костном мозге менее 50% увеличивает риск развития инфекционных осложнений в 3,3 раза (патент РФ на изобретение

№2521372 (30.04. 2014 г.), а при сочетании со сниженным содержанием МРО+ нейтрофилов менее 30% повышается риск развития инфекционно-воспалительных заболеваний в 6,4 раза.

Теоретическая и практическая значимость работы

Результаты исследования и комплексная оценка изменений иммунной системы у больных ОЛ позволяют расширить понимание патогенеза развития осложнений инфекционного генеза и прогнозировать их появление на ранних сроках заболевания. Выделены маркеры системного воспаления при ОЛ (повышение уровня в крови ФНО-а, ИЛ-6, вГСАМ-!, отсутствие реакции со стороны ИЛ-1(3 и ИЛ-8). На основе данных, полученных в результате изучения рецепторов к ^С (СЭ16 и С064) на клетках макрофагально-фагоцитарного звена, разработаны диагностические критерии по выявлению в ранние сроки пациентов, находящихся в группе риска по развитию инфекционно-воспалительных заболеваний, что позволяет вовремя начать адекватную, комплексную терапию данной категории больных.

Методология и методы исследования

В работе использованы общенаучные (анализ данных, синтез) и частные научные методы (лабораторные методы исследования), методы математической статистики.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Острый лейкоз в Республике Башкортостан характеризуется ростом заболеваемости за счет преимущественно миелобластного варианта. Клинические особенности синдрома инфекционных осложнений сопряжены с опухолевым поражением клеток гранулоцитарного ростка (ОМЛ) и выраженностью нарушений элиминационных механизмов противоинфекционной защиты.

2. У первичных больных острым лейкозом отмечается дисбаланс иммуногематологических маркеров системного воспаления в виде активации провоспалительных (яГСАМ-!, ИЛ-6, ФНО-а) факторов, отсутствия реактивности со стороны цитокинов противоинфекционной направленности (ИЛ-10 и ИЛ-8) и сопряжено с нарушением функциональных свойств фагоцитов (экспрессия рецепторов к иммуноглобулинам в, поглотительная и ферментативная активность).

3. Раннее развитие инфекционных осложнений у первичных больных острым лейкозом способствует снижению выживаемости, сопряжено с нарушением способности клеток к фагоцитозу и обусловлено низким количеством в костном мозге CD 16+нейтрофилов (менее 50%). Наличие низкого содержания CD 16 Ьнейтрофилов в костном мозге повышает риск развития инфекционно-воспалительных заболеваний в 3,3 раза, а в сочетании с миелопероксидазной недостаточностью в клетках - в 6,4 раза, что необходимо учитывать при назначении адекватной сопроводительной терапии на более ранних этапах, еще до развития клинических проявлений инфекционных осложнений.

Внедрение результатов исследования в практику

Результаты исследования используются в учебном процессе на кафедре терапий и общей врачебной практики Института дополнительного профессионального образования государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Башкирский Государственный медицинский университет» Минздрава России (акт от 26 января 2015 г.), практической деятельности государственного бюджетного учреждения «Республиканская клиническая больница им. Г.Г. Куватова» (акт от 26 сентября 2014 г.), практической деятельности муниципального бюджетного учреждения «Городская клиническая больница № 13» г. Уфы (акт от 26 сентября 2014 г.)

Степень достоверности и апробация работы

Достоверность результатов исследования обеспечена обоснованностью исходных теоретических позиций, достаточным объемом исследования, использованием адекватных лабораторных методов, сертифицированных наборов реагентов и применением современной компьютерной программы для статистической обработки данных (Statistica 8.0 и IBM SPSS Statistics 22).

Результаты исследования представлены в материалах 10-й Республиканской конференции молодых ученых Республики Башкортостан «Медицинская наука -2011» (Уфа, 2011); в материалах 10-й конференции ученых Республики Башкортостан с международным участием «Научный прорыв - 2011» (Уфа, 2011); в материалах II Конгресса гематологов России (Москва, 2014); Российском научном форуме на Урале «Актуальные вопросы фундаментальной медицины»

(Екатеринбург, 2014); в материалах Республиканской научно-практической конференции «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии в клинической практике» (Ижевск, 2014). Апробация диссертации проведена на заседании проблемной комиссии «Внутренние болезни» ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Минздрава России (протокол № 19 от 07 октября 2014 г.).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 12 научных работ, в том числе 5 статей в научных журналах и изданиях, включеных в перечень российских рецензируемых научных журналов и изданий для опубликования основных научных результатов диссертаций. Получен патент РФ на изобретение №2521372 (30.04.2014г.)

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 143 страницах машинописного текста, иллюстрирована 14 таблицами, 26 рисунками. Состоит из введения, 3 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Список литературы содержит 241 источник: отечественных 118 и иностранных 123 автора.

Личное участие автора

Автором лично проведен научно-информационный поиск. Получение и интерпретация клинико-анамнестических данных, статистическая обработка и анализ полученных результатов, написание и оформление рукописи диссертации осуществлялись лично диссертантом.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Под наблюдением находилось 115 пациентов с острым лейкозом. Больные были разделены на следующие группы. Основную группу (69 человек) составили больные с впервые выявленным острым лейкозом. Среди обследованных больных мужчин было - 25 (36,2%), женщин - 44 (63,8%). Средний возраст больных на момент постановки диагноза составил 49,43±3,92 лет (диапазон от 16 лет до 74 лет).

Для анализа динамики некоторых исследуемых показателей изучены две группы больных: получивших один курс химиотерапии, п=25 (мужчин - 10 (40%), женщин - 15 (60%), средний возраст - 45,18±3,36 года), и пациенты, находящиеся в

ремиссии I, п=21 (мужчин - 9 (42,9%), женщин - 12 (57,1%), средний возраст -40,45±3,17 лет). Контрольную группу составили 30 практически здоровых людей, сопоставимых по полу (мужчин - 13 (43,3%), женщин - 17 (56,7%) и возрасту (средний возраст - 43,12±3,2 года). Здоровые и больные лица были включены в исследование с их информированного согласия в соответствии со статьей 31 кодекса РФ «Об охране здоровья граждан».

При постановке диагноза у первичных больных были выявлены следующие иммунофенотипические варианты острого миелобластного лейкоза (OMJI): МО - у 17 больных (31,48%), M1 - у 11 (20,37%), М2 - у 6 (11,11 %), МЗ - у 6 ( 11,11 %), М4 -у 14 (25,92%). Средний возраст больных с OMJÏ составил 53,29±2,44 года. Иммунофенотипические варианты острого лимфобластного лейкоза (OJIJI) исследуемых больных: B-клеточный у 12 больных (80%), Т-клеточный у 3 (20%). Средний возраст больных с OJIJI составил 45,73±4,96 лет.

Все функциональные и лабораторные исследования, а также наблюдение за больными проводились на базе ГБУЗ «Республиканская клиническая больница им. Г.Г. Куватова» и МБУЗ «Городская клиническая больница №13» г. Уфы.

Общий анализ крови исследовали на автоматическом гематологическом анализаторе UniCel Dxl 800 с использованием реагентов Beckman Coulter (США). Забор и морфологическое исследование костного мозга осуществляли по стандартной методике (Кассирский И.А., Алексеев Г.А., 1970 г.). Проводили исследование биохимических показателей крови, мазков из зева на флору с подбором антибиотикочувствительности. В программу исследования входили ЭКГ, рентгенография органов грудной клетки, УЗИ органов брюшной полости.

Для определения типа и стадии дифференцировки бластных клеток проводилось иммунофенотипирование методом проточной цитофлюориметрии при помощи проточного цитофлюориметра Cytomics FC 500, реактивы Beckman Coulter (США) с использованием трех индикаторных меток: фикоэритрин (Ре), флюоресцеин (F1TC) и фикоэритриниианин (Рс5). Использовались антитела к следующим кластерам дифференцировки: CD45, МРО, HLA-DR, CD14, CD64, CD13, CD33, CD4, CD2, CD34, CD117, CD19, CD10, CD20, CD3, CDla, CD5, CD7, CD8, Tdt. Гейтирование бластных клеток осуществлялось с учетом экспрессии

панлейкоцитарного антигена CD45. Моноциты и неитрофилы различали путем распределения основных популяций лейкоцитов по параметрам флюоресценции при окраске антителами к CD45 и CD 14 и в соответствии по структуре их и размеру согласно светорассеивания (боковое и прямое) (Пичугина Л.В., 2006 г.).

Исследование иммунограмм включало: 1) количественное определение Т-(CD3+CD19-) и B-лимфоцитов (CD3-CD19+) методом иммунофенотипирования с использованием проточной цитофлюориметрии (проточный цитофлюориметр Cytomics FC 500 и реактивы Beckman Coulter, США)

2) исследование фагоцитарного звена иммунитета: - определение фагоцитарной активности и фагоцитарного числа (Шишкин В.Л., Сперанский В.В., Загидуллин Ш.З., 1987 г.);

- определение функции нейтрофилов в тесте восстановления нитросинего тетразолия (Нагаев Б.С., 1983 г.);

3) исследование гуморального звена иммунитета: - количественное определение иммуноглобулинов классов А, М, G в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа (тест-системы ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирская область);

- определение циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) методом осаждения в 3,75% растворе полиэтиленгликоля (мол. м. 6000 Da) (Гудина Р.В., 1988 г.);

- определение комплементарной активности сыворотки крови по 50% гемолизу эритроцитов барана (Меньшиков В.В., 1987 г.);

4) исследование цитокинов: - определение в сыворотке крови концентрации провоспалительных (ИЛ-lß, ИЛ-6, ИЛ-8, ФНО-а) цитокинов с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (тест-системы ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирская область) и молекул межклеточной адгезии sICAM-1 (eBioscience, Австрия, Bender MedSystems ВСМ), согласно инструкции фирмы изготовителя.

Все методы унифицированы и стандартизированы.

Статистическая обработка полученных данных проводилась с помощью параметрических и непараметрических методов анализа с использованием стандартной программы «Microsoft Office Excel 2003» и пакетов статистических программ «Statistica 8.0» и IBM SPSS Statistics 22.

Вычислялись среднее значение М, среднее квадратичное отклонение а, ошибка среднего значения т. Результаты представлены в виде М±ш, достоверность различий определялась с помощью формулы t-критерия Стьюдента. В случае малочисленных выборок для надежности различия проверялись с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни (U-критерий). Оценка наличия и силы корреляционных связей между величинами осуществлялась с помощью коэффициента линейной корреляции Пирсона (г). Достоверность различий частоты проявления альтернатив (больше или меньше заданного порога) в разных группах рассчитывали с использованием критерия согласия Пирсона х2 с поправкой Йетса на непрерывность. Анализ выживаемости проводили методом Каплана-Мейера. Оценивали общую выживаемость и функцию риска (Халафян A.A., 2008 г.).

Результаты собственных исследований и их обсуждение

Анализ заболеваемости OJI в Республике Башкортостан за период с 2005 по 2013 гг. показал волнообразный рост заболеваемости с 1,64 до 1,91 на 100 тыс. взрослого населения преимущественно за счет ОМЛ (с 1,01 до 1,52 на 100 тыс.). ОЛЛ характеризовался тенденцией к снижению исследуемого показателя.

По результатам патологоанатомических исследований РКБ им. Г.Г. Куватова за период с 2009 по 2013 год у 73% умерших больных ОЛ на вскрытии обнаружены различные инфекционные осложнения (пневмонии, парапроктиты, энтериты).

Клиническая картина больных ОЛ характеризовалась гиперпластическим, анемическим, геморрагическим и интоксикационным синдромами.

Так лейкоцитоз наблюдался у 38 из 69 больных (55,07%) - среднее содержание лейкоцитов составило 31,21±5,26*109/л (в группе контроля - 5,5±0,6*109/л, р<0,001), лейкопения была у 21 больного (30,43%) - среднее содержание лейкоцитов составило 1,3±1,2*109/л (р<0,01). Количество лейкоцитов не зависело от вида и варианта острого лейкоза и не имело связи с развитием инфекционных осложнений.

Анемический синдром при поступлении отмечался практически у всех пациентов: у 66 (95,65%) больных уровень гемоглобина составил от 26 г/л до 111 г/л (средний показатель 78,49±2,73 г/л), у 65 (94,2%) больных отмечалась эритропения от 1,24*10|2/л до 3,56*1012/л (средний показатель 2,66±0,1 *10,2/л).

Тромбоцитопения отмечалась у 64 больных (92,75%), среднее содержание тромбоцитов было 68,97±8,09*10% (в группе контроля - 280,0±9,7*109/л, р<0,001). Отмечалось увеличение показателей СОЭ до 49,44±2,92 мм/ч (в группе контроля -8,4±1,6 мм/ч, р<0,001).

Анализ выявляемое™ ИО среди больных ОЛ показал, что признаки системного воспаления наблюдались у 37 (53,6 %) из 69 первичных пациентов. У 19-ти больных (51,4%) отмечались инфекционно-воспалительные заболевания: острый тонзиллит 5 (13,5%), паратонзиллярный абсцесс - 1 (2,7%), пневмония - 3 (8,1%), герпетические проявления - 3 (8,1%), бронхит - 2 (5,4%), стоматит - 2 (5,4%), фурункулез - 2 (5,4%), карбункул в сочетании с острым тонзиллитом - 1 (2,7%), острый парапроктит - 1 (2,7%). У 18-ти пациентов (48,6%) была выявлена системная воспалительная реакция (СВР) в виде фебрильной нейтропении (50%) и

изолированной температурной реакции (50%) от 37°С до 39°С (средний показатель 38,1±0,15°С).

Признаки системного воспаления отмечались при всех видах ОЛ и составляли 33-78%. В зависимости от варианта ОЛ были выявлены следующие особенности. Для лимфобластных лейкозов более характерным было наличие СВР. Тогда как при миелоидных лейкозах, наряду с СВР, отмечалось наличие инфекционно-воспалительных заболеваний преимущественно бактериальной природы (наиболее часто при МО и М4 вариантах ОМЛ) (рис. 1).

100%

□ без инфекционных осложнений

ЕЭ системная воспалительная реакция

□ инфекционно-воспалительные заболевания

МО М1

М2 МЗ М4 В-ОЛЛ Т-ОЛЛ

Рисунок 1. Частота встречаемости инфекционных осложнений при различных видах и вариантах острого лейкоза.

Анализ результатов лабораторных исследований мазков из зева на флору показал отсутствие связи выявленной флоры с наличием ИО. В целом, OJI сопровождался активацией в ротоглотке больных грамм-положительной флоры, представленной кокками родом Streptococcus (40%) и Staphylococcus (10%).

Была проанализирована выживаемость больных OJI в зависимости от развития ИО (метод Каплана-Мейера). Установлено, что у больных без ИО срок выживаемости составлял 328,1±62,7 дней, тогда как у пациентов с OJI при развитии инфекционного процесса продолжительность жизни от начала заболевания была значительно короче и составила 74,14±22,17 дней (р<0,001) (рис.2).

Рисунок 2. Общая выживаемость у больных острым лейкозом в зависимости от наличия или отсутствия инфекционных осложнений.

Оценка показателей иммунограммы у больных с ОЛ выявила особенности, более выраженные при наличии ИО (рис. 3).

Для всех больных ОЛ было характерно снижение комплементарной активности сыворотки крови (49,05±2,98 ед. СН50, в контрольной группе - 71,5±2,7 ед. СН50, р<0,001) и количества зрелых нейтрофилов (1,18±0,09*109/л, в контрольной группе 2,99±0,14*109/л, р<0,001).

Развитие ИО сопровождалось активацией антительной защиты (^А и с р<0,05) и ферментативной активности фагоцитов (НСТ-тест спонтанный) на фоне сниженной способности нейтрофилов к фагоцитозу.

Общая выживаемость

Гру|

Рисунок 3. Особенности иммунного реагирования у больных острым лейкозом в зависимости от инфекционных осложнений.

Снижение функциональной активности зрелых фагоцитов у первичных больных ОЛ отмечалось только при развитии ИО - фагоцитарный индекс (ФИ) составил 44,30±3,92%, р<0,001 (без ИО - 52,92±6,77%, в группе контроля -65,20±2,30%). При этом, выявлено увеличение ^А до 3,57±0,39 г/л, р<0,001 (без ИО -2,19±0,22 г/л, контрольная группа - 1,70±0,20 г/л) и до18,93±1,38 г/л, р<0,05 (без ИО - 14,54±1,52 г/л, контрольная группа - 14,60±1,30 г/л) и повышение показателя спонтанного НСТ-тсста до 17,0±2,0% (в группе контроля - 12,53±0,58%, р<0,05).

Было установлено, что снижение фагоцитарной способности нейтрофилов (44,33±4,03 %, р<0,01) было характерно преимущественно для больных с ОМЛ, тогда как, при ОЛЛ способность клеток к фагоцитозу оставалась сохранной (62,8± 10,20%, р>0,05).

После проведения курса химиотерапии у больных ОЛ сохранялось сниженная функциональная активность фагоцитов (ФИ - 53,30±3,9%, р<0,01) и повышенное содержание ^А (2,28±0,28 г/л, р<0,01). У пациентов, находящихся в ремиссии, показатели иммунограммы нормализовались и не отличались от данных контрольной группы.

Учитывая способность антител стимулировать фагоцитарную активность нейтрофилов через рецепторы к иммуноглобулинам, была проведена оценка экспрессии рецепторов к на нейтрофилах и моноцитах костного мозга.

Оценивали экспрессию Рсу-рецепторов - низкоаффинного СБ 16 (РсуШ) и высокоаффинного СБ64 (Рсу1). Одновременно исследовали экспрессию НЬА-О]* и внутриклеточное содержание миелопероксидазы (МРО).

В качестве группы сравнения выступали пациенты (п=10) без ОЛ с различными инфекционными проявлениями (лихорадка (100%), тонзиллит (20%), бронхит (20%), пиелонефрит (10%), лимфоаденопатии (50%)), которым проводили дифференциальную диагностику с гемобластозами. У больных отмечался лейкоцитоз (13,21±2,40* 109/л, р<0,01), анемический синдром (гемоглобин 109,79±4,73 г/л; в группе контроля - 132,0±3,2 г/л, р<0,001; эритроциты 3,81±0,22*10'2/л; в группе контроля - 4,6±0,03*10'2/л, р<0,01). Для исключения гематологических заболеваний пациентам проводилось морфологическое исследование и иммунофенотипирование клеток костного мозга.

При анализе показателей нейтрофилов в костном мозге было выявлено снижение количества СЭ16+ и МРО+клеток, особенно при наличии ИО (рис. 4).

120

□ группа сравнения

ЕЗ без инфекционных осложнений

а системная

воспалительная реакция □ инфекционно-воспалительные заболевания

Рисунок 4. СО 16+, НЬА-ОК+, МРО+ и СЭ64+ нейтрофилы костного мозга у больных острым лейкозом в зависимости от наличия инфекционных осложнений.

Так, у больных ОЛ без признаков инфекционной патологии количество СБ 16+нейтрофилов составляло 55,72±6.98%, при наличии СВР - 47,03±10,91%,

тогда как при инфекционно-воспалительных заболеваниях СЭ16+клетки составили всего 24,36±7,43% (р<0,001) (в группе сравнения - 74,21±5,43%).

Установлена сильная прямая корреляционная связь между количеством СБ16+нейтрофилов в костном мозге и фагоцитарной активностью клеток периферической крови (г=0,81).

В то же время, при ОЛ отмечалось увеличение нейтрофилов, несущих на своей поверхности СВ64+ (активированные нейтрофилы). Увеличение показателя не зависело от наличия ИО: так в группе больных ОЛ без ИО показатель составлял 49,96±8,06%, а развитие ИО сопровождалось незначительным увеличением до 55,37± 10,02%, в группе сравнения - 24,37±9,72%, р<0,05.

У всех больных ОЛ отмечалось сниженное содержание МРО+нейтрофилов. У пациентов без ИО показатель составил 42,71 ±9,21% (р<0,001), при наличии СВР -69,06±11,23% (р<0,05), тогда как при инфекционно-воспалительных заболеваниях -всего 22,06±11,52% (р<0,001) (в группе сравнения - 96,1 ±1,94%).

Было установлено, что именно у больных ОМЛ выявлялась недостаточность количества СЭ16+ (34,29±5,41%, р<0,001) и МРО+нейтрофилов (43,02±7,34%, р<0,001) в костном мозге. Наиболее низкие значения СО 16+ нейтрофилов отмечались при ОМЛ-МО, М1, МЗ и М4 вариантах, МРО+клеток - при ОМЛ-МО, М1 и М4 вариантах. Достоверное компенсаторное увеличение количества СБ64+ нейтрофилов (активированные) отмечалось только при ОМЛ-М2.

Было показано, что выявление в костном мозге больных ОЛ низкого содержания СБ 16+ нейтрофилов (менее 50%) является неблагоприятным маркером развития воспалительного процесса и повышает риск развития ИО более чем в 3,3 раза: в группе больных с ннфекционно-воспалительными заболеваниями низкое содержание отмечалось в 92,3% случаев наблюдения по сравнению с 28% случаев у больных без ИО (у2 =П,69, р=0,0014, Ш1=3,29 (1,65-4,11)) [патент РФ на изобретение №2521372 (30.04. 2014 г.].

При сочетании сниженной экспрессии СЭ16 и низкой миелопероксидазной активности риск развития инфекционно-воспалительных заболеваний увеличивался в 6,4 раза по сравнению с пациентами с сохранными значениями экспрессии СБ 16 и МРО (%2=8,75, р=0,004, ЯЯ=6,43 (1,64-39,73)).

Установлена неблагоприятная прогностическая значимость выявления низкого содержания С016+нейтрофилов в костном мозге (менее 50%) в отношении выживаемости у больных ОЛ без ИО. Отмечено, что у пациентов с низким содержанием СО 16+ нейтрофилов срок выживаемости составил 101,43±84,08 дней, при содержании СО 16+ клеток более 50% - 367,6±89,31 дней (р<0,05).

Общая иыживасмость

Функция риска

Соок (дни)

зооао «осо «зс.оо еоооо юоояо члооо

Спок (дни)

Рисунок 5. Общая выживаемость и функция риска у больных острым лейкозом без инфекционных осложнений в зависимости от количества СО 16+ нейтрофилов в костном мозге (более или менее 50%).

Таким образом, у первичных больных ОЛ при наличии инфекционно-воспалительных заболеваний продолжительность жизни значительно укорачивалась и была сопряжена со снижением количества С016+нейтрофилов в костном мозге. У пациентов без ИО выживаемость была значительно выше, однако тоже зависела от содержания СБ 16+ нейтрофилов в костном мозге. При уменьшении СО 16+нейтрофилов менее 50% общая выживаемость также снижалась в результате развития у 100% данных больных тяжелых, труднокупируемых инфекционных осложнений на 5-7 день химиотерапии, в то время как у пациентов с содержанием СБ 16+нейтрофилов более 50% инфекционные осложнения развивались в 62% случаев на 12-15 день химиотерапии и успешно купировались на фоне антибактериальных препаратов.

Наряду с нарушением функциональных свойств нейтрофилов у больных ОЛ, были выявлены особенности и в моноцитарном звене. Обнаружено снижение количества МРО+ моноцитов в костном мозге до 23,3+6,04% (в группе сравнения -73,18± 15,27%, р<0,05), более выраженное у больных с инфекционно-воспалительными заболеваниями (8,26+6,58%, р<0,01) (рис. 6).

____< ] □ группа сравнения

о без инфекционных \ осложнений

□ системная воспалительная ! реакция

□ инфекционно-воспалительные заболевания !

С016

МРО

С064

Рисунок 6. СБ 16+, НЬА-Ши, МРО+ и СЭ64+ моноциты костного мозга у больных острым лейкозом в зависимости от инфекционных осложнений.

Была проанализирована динамика содержания в крови молекулы межклеточной адгезии 81САМ-1 и основных провоспалительных цитокинов (ИЛ-10, ИЛ-8, ИЛ-6 и ФНО-а), активно участвующих в противоинфекционной защите (таблица 1).

Таблица 1. Уровень маркеров воспаления в сыворотке крови у первичных больных острым лейкозом в зависимости от инфекционных осложнений.

Цитокины Контрольная группа (п=30) Больные острым лейкозом

Без инфекционных осложнений (п=32) С системной воспалительной реакцией (п=18) С инфекционно-воспалительными заболеваниями (п=19)

ИЛ-1Р, пг/мл 3,6±1,01 5,17+1,68 2,36+0,79 8,32+6,34

ИЛ-6,пг/мл 4,7±0,84 50,51+18,17* 37,43+15,8* 67,62+46,18

ИЛ-8,пг/мл 121,79+18,29 206,28+92,23 270,19+127,29 241,4+148,68

ФНО-а, пг/мл 1,2+0,13 11,73+3,06*** 11,43+3,37*** 10,31+2,52***

вГСАМ-!, нг/мл 439,85+24,17 520,93+30,61* 640,47+58,7** 579,86+58,18*

группы - *р<0,05 ;* *р<0,01; * * *р<0,001.

У всех пациентов OJI, вне зависимости от ИО, показано повышение уровня sICAM-1 и ФНО-а. Повышение уровня ИЛ-6 наблюдалось у больных без ИО и у пациентов с СВР. При наличии инфекционно-воспалительных заболеваний концентрация ИЛ-6 имела тенденцию к увеличению. Отсутствовало ожидаемое для инфекционно-воспалительной патологии повышение уровней ИЛ-ф и ИЛ-8 (р>0,05). После проведения первого курса химиотерапии сохранялись повышенные значения ИЛ-6 (50,53±12,19 пг/мл, р<0,01), ФНО-а (5,32±0,96 пг/мл, р<0,001) и sICAM-1 (526,41 ±23,15 нг/мл, р<0,05). Ремиссия сопровождалась нормализацией уровней ИЛ-6 (5,17±2,11 пг/мл) и sICAM-l(459±41,16 нг/мл), однако оставалось повышенное содержание ФНО-а (7,61±1,44 пг/мл, р<0,001).

При проведении корреляционного анализа установлено, что способность к фагоцитозу нейтрофилов крови у больных ОЛ сопряжена с факторами активации иммунной системы. Первую группу составляют провоспалительные цитокины (ИЛ-1Р, г=0,4; ИЛ-8, г=0,44; ИЛ-6, г=0,77; ФНО-а, г=0,69) и sICAM-1 (г=0,77). Вторую группу-опсонины (ЦИК, г=0,38 и комплементарная активность, г=0,65) и экспрессия рецепторов к IgG (CD 16, г=0,81 и CD64, г=0,32).

Полученные результаты позволяют представить патогенез ИО при ОЛ с позиции иммунологических маркеров системного воспаления. Показано, что при ОЛ отмечаются как признаки активации (увеличение ФНО-а, sICAM-1, экспрессия CD64 на нейтрофилах), так и недостаточности иммунной системы (отсутствие повышения ИЛ-ф и ИЛ-8; снижение комплементарной активности и миелопероксидазной недостаточности моноцитов). При развитии ИО наблюдается компенсаторное повышение IgA и IgG, однако выявляется выраженное снижение фагоцитарной активности нейтрофилов, обусловленное уменьшением экспрессии CD 16 на нейтрофилах уже на уровне костного мозга. Развитие инфекционно-воспалительных осложнений у больных ОЛ сопровождается выраженной миелопероксидазной недостаточностью не только моноцитов, но и нейтрофилов (рис. 7).

-|ФНО-а (противоопухолевый иммунитет) -Т 51САМ-1

- Отсутствие реакции со стороны ИЛ-1 р и ИЛ-8

-¿Комплементарной активности

-|МРО фагоцитов (моноциты) костного мозга

ТИЛ-6

сохранность фагоцитарной активности нейтрофилов

| фагоцитарной активности

Сохранная экспрессия СР16 на нейтро-филах костного мозга

Т С064 на нейтро-филах костного мозга

¿СБ 16

и! мро

нейтрофилов

Рисунок 7. Особенности иммунного реагирования у больных острым лейкозом в зависимости от наличия и характера инфекционных осложнений.

Таким образом, результаты исследования позволяют заключить, что в нарушении иммунологических защитных механизмов у первичных больных с ОЛ важную роль играют функциональное состояние и рецепторный аппарат фагоцитов (экспрессия рецепторов к иммуноглобулинам класса С) уже на уровне костного мозга, нарушение цитокиновой регуляции и межклеточных взаимодействий, что во многом определяет тяжесть и исход патологического процесса. Раннее развитие ИО, сопряженое с низким уровнем СБ 16+ нейтрофилов в костном мозге (менее 50%) и особенно в сочетании с миелопероксидазной недостаточность (менее 30%), не только усугубляет течение болезни, но и существенно снижает выживаемость первичных пациентов с острым лейкозом, что необходимо учитывать при назначении адекватной сопроводительной терапии.

ВЫВОДЫ

1. Анализ заболеваемости острым лейкозом в республике Башкортостан показал рост острого лейкоза с 1,64 до 1,91 на 100 тыс. взрослого населения за счет острого миелобластного лейкоза (с 1,01 до 1,52 на 100 тыс.) и отсутствие прироста заболеваемости острого лимфобластного лейкоза.

2. Инфекционные осложнения выявляются у 53% больных острым лейкозом в первично-активной фазе заболевания и являются одной из основных причин смерти больных. Острый миелобластный лейкоз (особенно МО и М4 варианты) сопровождался преимущественно инфекционно-воспалительными заболеваниями (31,48%), а острый лимфобластный лейкоз - системной воспалительной реакцией (40%) без инфекционных заболеваний.

3. Одной из причин увеличения инфекционных осложнений у больных острым миелобластным лейкозом является дисфункция нейтрофилов, проявляющаяся снижением фагоцитарной функции клеток (р<0,001, обусловленной недостаточностью экспрессии рецепторов к иммуноглобулинам класса С (СО 16) (р<0,001) на фоне снижения комплементарной активности (р<0,001).

4. У больных острым миелобластным лейкозом в первично-активную фазу заболевания при развитии системной воспалительной реакции и инфекционных осложнений имеет место дисбаланс цитокинового ответа, проявляющийся как

активацией одних провоспалительных белков (х1САМ-1 (р<0,01), ФНО-а (р<0,001)), так и отсутствием реактивности со стороны других маркеров (ИЛ-1р, ИЛ-8 и ИЛ-6), который нивелируется в период ремиссии.

5. Такие морфофункциональные изменения гранулоцитарного ростка гемопоэза у больных острым миелобластным лейкозом как снижение СИ 16+ нейтрофилов (менее 50%), снижение миелопероксидазы в клетках более чем на 70% являются неблагоприятными прогностическими факторами развития инфекционных осложнений и снижения общей выживаемости больных.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. : С целью раннего прогнозирования инфекционных осложнений у первичных

больных острым лейкозом необходимо одновременно с иммунофенотипированием бластных клеток оценивать в костном мозге количество СБ 16+ и МРО+ нейтрофилов.

2. У пациентов с острым лейкозом в первично-активную фазу с низким содержанием СП16+нейтрофилов (менее 50%) в костном мозге, особенно в сочетании с миелопероксидазной недостаточностью (менее 30%), имеется высокий риск раннего развития инфекционной патологии, в связи с чем данной группе больных рекомендована ранняя профилактика инфекционных осложнений.

Перспективы дальнейшей разработки темы диссертационного исследования включают в себя следующее научно-исследовательское направление, имеющее важное практическое значение: разработка методов коррекции раннего развития инфекционных осложнений у первичных больных острым лейкозом с учетом выявленных факторов риска.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Эпидемиологические показатели и клинико-гематологическая характеристика острого миелобластного лейкоза в республике Башкортостан. Э.О. Новикова, Г.Р. Рафикова, С.В. Плотникова, Г.Ш. Сафуанова / Здоровье семьи - XXI век. Материалы XIV Международной научной конференции. - Италия, Римини, 2010. - С. 313-314.

2. Плотникова, С.В. Исторические аспекты изучения гемобластозов и оказания гематологической помощи в Республике Башкортостан / С.В. Плотникова, Г.Ш. Сафуанова, В.И. Никуличева // Здравоохранение и социальное развитие Башкортостана. Выездное заседание Совета Республики по вопросам развития системы здравоохранения. - Уфа, 2010. - С. 228-231.

3. Клинико-гематологическая и иммунофенотипическая характеристика больных острым лейкозом в Республике Башкортостан / С.В. Плотникова, Г.Ш. Сафуанова, Л.Ф. Азнабаева, М.И. Хабибуллина, Э.А. Бахтнярова // Материалы 10-й юбилейной Республиканской конференции молодых ученых Республики Башкортостан «Медицинская наука-2011» - Уфа, 2011. - стр. 164167.

4. Плотникова, С.В. Частота встречаемости инфекционных осложнений у больных острым лейкозом в Республике Башкортостан / С.В. Плотникова, Г.Ш. Сафуанова // Сборник научных трудов 10-й юбилейной конференции ученых Республики Башкортостан с международным участием «Научный прорыв-2011» - Уфа, 2011. - С. 161-162.

5. Плотникова, С.В. Цитокииы и молекулы межклеточной адгезии как маркеры системного воспалеиия при острых лейкозах / С.В. Плотникова, Г.Ш. Сафуанова // Медицинский вестннк Башкортостана. - Уфа, 2011. - Т.6, № 6.- С. 136-141.

6. Плотникова, С.В. Характеристики фагоцитирующих клеток у больных острым лейкозом с инфекционным снндромом / С.В. Плотникова, Л.Ф. Азнабаева, Г.Ш. Сафуанова П Медицинская иммунология. - СПб., 2013. - Т. 15, № 4. - С.369-374.

7. Плотникова, С.В. Особенности иммунного реагирования у больных острыми лейкозами с синдромом инфекционных осложнений / С.В. Плотникова, Л.Ф. Азнабаева, Г.Ш. Сафуанова // Справочник врача общей практики. - М., 2014. - №12. - С. 17-22.

8. Азнабаева, Л.Ф. Предикторы системного воспаления у больных острым лейкозом / Л.Ф. Азнабаева, С.В. Плотникова, Г.Ш. Сафуанова // Российский иммунологический журнал. - СПб., 2014. - Т. 8(17), №3. - С. 499-502.

9. Плотникова, С.В. Иммунологические показатели у больных острым лейкозом / С.В. Плотникова, Г.Ш. Сафуанова, Л.Ф. Азнабаева // Гематология и трансфузиология // Материалы II Конгресса гематологов России. - СПб., 2014. - Т. 59, №1. - С. 112.

10. Плотникова, С.В. Особенности макрофагалыю-фагоцитарного звена у больных острым лейкозом / С.В. Плотникова, Г.Ш. Сафуанова, Л.Ф. Азнабаева II Гематология и трансфузиология // Материалы II Конгресса гематологов России. - СПб., 2014. - Т. 59, №1. - С. 112.

11. Плотникова, С.В. Иммунные нарушения и синдром инфекционных осложнений в клинике острых лейкозов / С.В. Плотникова, Г.Ш. Сафуанова, Л.Ф. Азнабаева // Консилиум. Материалы Республиканской научно-практической конференции «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии в клинической практике». - Ижевск, 2014. - № 1. - С. 14-15.

12. Азнабаева, Л.Ф. Предикторы воспаления (sICAM-1 и провоспалительные цитокины) у больных острым лейкозом / Л.Ф. Азнабаева, С.В. Плотникова, Г.Ш. Сафуанова // Цитокины и воспаление.-2015.-Т. 14, № 1,-С. 38-42.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ОЛ - острые лейкозы ИО - инфекционные осложнения

ОЛЛ - острый лимфобластный лейкоз СВР - системная воспалительная реакция

ОМЛ - острый миелобластный лейкоз МРО - миелопероксидаза

Ig - иммуноглобулины ИЛ - иитерлейкнн ФНО - фактор некроза опухоли ICAM-I - (intercellular adhesion molecule-1) CD - (англ. Clasterof differentiation ) кластеры дифференцировки