Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Профилактика развития иммунодефицитного состояния при стрессе

£ г

министерство здравоохранения рсфср

второй московский ордена ленина государственный нелшшнсккн институт.

ны. Н.И.Пирогова.

на правах рукописи

КИРИЛИНА ЕЛЕНА АНАТОЛЬЕВНА

УДК 615.275.4.015.46:632.017.1.064:613.863

ПРОФИЛАКТИКА РАЗВИТИЯ ШЗ^УНОДЕФИШШЮГО СОСТОЯНИЯ ПРИ СТРЕССЕ.

14.00.36 - Аллергология и иммунология. 14.00.16 - Патологическая физиология.

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Носква, 1991 г.

Работа выполнена в да бора тории медка торов иммунное системы Института Иммунологии КЗ СССР и Института биоорганическоя химии им.М.М.Шемякина АЕ СССР. Заумные руководители:

доктор бнологических наук, профессор А.А.Михайлова.

доктор медицинских наук А.М.Василенко.

Официальные оппоненты:

доктор иедиокнских наук.профессор О.И-Зюош. доктор биологических наук.профессор И.Н.Доэморов Бедуная организация: Институт медихо-биологических проблем МЗ СССР

Завита лиссертации состоится "_"_1992 г. в _ часов на заседании Специализированного Ученого Совета К. 084.1406 2-го ЮЯГНИ им. Н.И.Пирогова по адресу: 117437.Носква. у*. Островитянова. 1.

С диссертацией мопно ознакомиться в библиотеке 2-го МОЛГНИ им. Н.И.Пирогова.

Автореферат разослан "_"_1992 г.

Ученья секретарь Специализированного Совета к.м.н..доцент

Т.Е.Кузнецова.

шшят

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОВ ЛЕЩ.

Данные ВОЗ свидетельствуют об увечен£^<зяг°сграненности и Iявлении новвд клинических фо^ч вторичных иммунод^яцитных состоя-ф (ИЛС). Одной из наиболее часто, встречающихся причин развития ЩС) являются стресс-вызванные нарушения реаквда гуморального и даточного иммунитета. Тяжелый стресс, может соп$?гво1даться резким шжением различных классов иммуноглобулинов в крови < Першин Б.Б.. J81).. Многочисленные наблюдения свидетельствуют о Нарушении соот-зиения хелперных и супрессорных субпопуляций Т-лимфоцитов с преоб-эданием последних ( Здоде? D-И., 1980, 19.а5, Ад^алонов и др.1985. ). кихается такхе Функциональная активность неспецифических иммунных еханиэмов ( Вогралик В-Г •. 1985). В ça^smiii указанных нарушения ринимают участие различные механизмы, обеспечивающие нейроэндок-инноиммунные взаимодействия в организме ( Корнева Е.А., 1985 ). сследованиями последних лет доказана значимая роль опиатергической истемы организма в развитии стресс-вызванных НДС (Корнева Е.А-, 989, Besedovsky н.о.et al,1985). Учитывая данные Ф.З. Неерсона 1981) и А.М.Василенко (i9Ç9i о том, что опиатергическая система редставляет собой естествен»^» стресс-лимитируюцую систему, можно редполагать,что стр^сс-в^аванные НДС являются общим звеном патоге-;еза инфекциодаьр;. аутоиммунных и аллергических заболеваний.Стресс-1НЗД4КНЫ« KSÇ осложняют течение различных соматических и психичес-:кх. заболевания, являются значимым этиологическим фактором развития нюкачественяьрс опухолей ( Зимин В.И.,1980, Martin Р., 1989).

Однако, несмотря на большое количество экспериментальных и кли-(ических исследования влияния стрессорных факторов на иммунную систему, ряд вопросов о механизмах развития стресс-вызванных ИДС остается отквдтыми. Кроме того,познание этих механизмов открывает новые эффективные способы профилактики и лечения стресс-вызванных ИДС.

В последние годы разработаны и успешно применяются в клинике иммуномодуляторы. созданные на основе естественных медиаторов им-кунной системы. В частности, хорошо зарекомендовал себя препарат "Миелопид" разработанный на основе регуляторньх пептидов костного

мозга по руководством академика~РтВгПетрова^—Одновременко-ксследу» ются возможноети безлекарственной терапии стресс-выэваыньк ИДС (Вогралик В.Г., 1985, Василенко А.П., 1989).

Из всего изложенного следует, что эффективная профилактика стресс-вызванных ИДС может существенно снизить заболеваемость насе-дения, предупредить развитие тяжелых хронических, неизлечимых в настоящее время болезней.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ- Цель работы состояла в изучении механизмов подавления гуморального иммунного ответа при стрессе ж i разработке патогенетически обоснованных подходов к профилактике стресс-вызванных ИДС. Достижение этой цели осуществлялось путем решения следующих задач:

1. Изучение влияния стресса-плавания на гуморальный нммунны! ответ мышея и разработка на этой основе адекватное экспериментальной модели стресс-вызванного ИДС.

2. Определение роли супрессорных клеток в подавлении гуморального иммунного ответа при действии стресса-плавания.

3. Оценка участия опиатергического механизма в развитии стресс-вызванного ИДС.

4. Исследование возможности использования препарата Миелопи, для профилактики стресс-вызванного ИДС.

ъ. Экспериментальное обоснование использования безлекарственно профилактики стресс-вызванного ИДС с помощью аурикул_ярно злехтропункгуры.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА.Предложена простая и надежная модель для лабо раторного изучения развития стресс-вызванного ИДС.Получены неиз вестные ранее данные о влиянии стресса-плавания в индуктивную Продуктивную фазы иммунного ответа на количество антителообразующи клеток в селезенке и лимфатических уздах. Экспериментально доказан участие неспецифических Т-супрессоров в развитии стресс-вызванног ИДС и определены временные параметры их содержания в селезенке лимфатических узлах.Впервые показаны иммунокорригирувдие свовсте

Ьгедопхда.надохсона и электростимудяции при их профилактическом кзздеяствих на развитие стресс-выэванных патологических состояния.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. Результаты проведенных исследования :лужат научным обоснованием целесообразности профилактического ис-юльзования Ниелопида.налоксона и электропунктуры при угрозе развития стресс-вызванного НДС. Определены сроки для профилактических гаъекций Миелопида и налоксона, а также параметры профилактической электропунктуры.

Основные положения, выносимые на зациту-

1. Разработана экспериментальная модель имнунодефицитного состояния, вызываемого стрессорным воздействием (плаванием).

2. Стресс-плавание вызывает подавление антителообразования в селезенке и лимфатических узлах.

3. Имкуносупрессия при стрессе связана с индукцией неспецифических Т-супрессоров.

4. Миелопид, налохсон, а также смесь этих препаратов препятствуют индукции неспецифических Т-супрессоров.

5. Препарат Миелопид обладает профилактическими и корригирующими свойствами при стресс-вызванньх ИДС. Профилактическим свойством обладает также АЭАП.

Настоящая работа выполнена в рамках Государственной научно-тех-(ическоя программы 0.69.07 раздела 01.05.Н "Разработать новые экс-[еримецтальные подходы к получению медиаторов иммунных реакций с (елью их использования для иимунокоррекции", номер гос.регистрации Г 01860086749.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Основные положения диссертации доложены и об-:уждены на конференции "Стресс и иммунитет" 1г. Ростов-на-Дону, .989), на V Всесоюзном симпозиуме "Взаимодействие нервной и иммун-юя систем" (г.Оренбург,1990), на Конгрессе Международного общества 1атофизиологов ( г.Москва, 1991), на Федерации Европейских иммуно-гогических обществ ( Финляндия, 1991) и на совместной научной конвенции лаборатории медиаторов иммунной системы и лаборатории кле-

- 4 - __________

точных взаимодействия ИБХ АН СССР (г.Москва, 1991>.

ПУБЛИКАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ. По теме диссертации опубликовано в научннх работ, в которых отражены основные результаты исследования.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация излохена на ill •страницах маюшописи, текст иллюстрирован 3 рисунками и 14 таблицами. Диссертация состоит из следующих разделов: Введение, Обзор литературы: Материалы и методы; Результаты исследования; Обсуждение результатов; Выводы. Список литературы включает в себя 179 источников. из которых 65 отечественных и 114 иностранных научных работ.

II. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Работа выполнена на 2000 мышах-гибридах Fl (СВАхС57В1/б>.самках. массой 18-22 грамма, полученных из питомника лабораторных животных АНН СССР "Столбовая". Для получения анти-igc сыворотки была использовано 3 кролике, для получения хомплемента - зоо морских свинок.

Стресс у мышея создавали в различные сроки до или после иммунизации, используя известную модель плавания, доминируояим фактором которой является тяжелая физическая нагрузка < Корнева Е.А., Яхинек Э.К., 1985, Садиков Ш.Б.. Ганефельд Т.Н.. 1985). Сеансы плавания проводили 1 раз в сутки в одно и то же время при постоянной температуре воды зоч. Каждыя сеанс длился 60 минут. Изучали различные схемы зтого вида стрессового воздействия. Иммунизации мышей проводили эритроцитами барана ( ЭБ ) в дозе 2x107/мыль внутрибргаинно.

Животные 1-ой группы подвергались такому воздействию на протяжении первых двух дней после иммунизации, второй группы - на з, •i-ые сутки, и третьей - в течение 4-х дней после введения антигена ( рис.1. группы 1.2,3 >. На 5-ые сутки определяли количество анти-телообразухдасх клеток (АОК) в селезенке этих животных.

Мышей четверток группы подвергали указанному виду стрессового воздействия на протяжении 2-х дней и после последнего сеанса hx им-

Риа.1. Схемы моделей, использованных длн иау-юппи

Группа

иммунизация ЭБ о дозе 2 х 107 внутрибрюшинно

плавание на 1 и сутки после иммунизации

на 5-ые сутки получение иммунных КС и определение количества АОК

2.

иммунизация 35 а доэо 2 х 107/мышь в/бр.

плавание на 3 и сутки после иммунизации

на 5-ые сутки получение иммунных КС и определение количества АОК

3.

иммунизация ЭБ а доэо 2 х 107/мышь о/бр.

плавание на 1,2,3 и 4 сутки после иммунизации

на 5-ыо сутки получение иммунных КС и определение количества АОК

ллааание а точонио 2-х суток ( по 60 минут в день)

иммунизация ЭБ 5 Я суспензией по 0,1 мл подкомно а подушечки 4-х конечностей

на 5-ыо сутки получение иммунных КЛУ и определение количестоа АОК

мунизировали 5% взвесью ОБ) по 0,1 мл в подушечки 4- х конечносте! ( рис.1, группа 4). На 5-ые сутки определяли количество АОК в лимфатических узлах эткх животных методом Ерне ( Jerne n.k., Nordin A A.,1963 ).

Для выявления участия неспецифических супрессоров в подавленга иммунного ответа при. стрессе клетки селезенки или лимфатических узлов стрессированных животных смешивали с иммунными клетками селезенки или лимфатических узлов. После зо-минутноя инкубации различных вариантов смесей этих клеток определяли количество АОК методов Ерне, а также в модификации для определения igG АОК (Dresser d.ví. , wortis н.н., 1965).

Изучение природы неспецифических супрессорных клеток, индуцированных в селезенке иди лимфатических узлах при стрессе - плавании, проводили с использованием анти-Т-супрессорной сыворотки, полученной в Институте эпидемиологии и микробиологии им. Г.И. Габричевского ( Краскина Н-А. и др. 1980).

Клетки, взятые от стрессированных (неиммунных) животных обрабатывали анти-Тсупрессорноя сывороткой в течение 45 минут при 37°С После инкубации клетки отмывали центрифугированием, доводили д< концентрации 1x1о?/мл и смешивали с равным объемом иммунных клето] лимфатических узлов. Далее проводили повторную инкубацию в теченш зо минут при 37°с и определяли количество АОК .

Влияние Миелопида и налоксона на индукцию Т-супрессоров пр> стрессе изучали в системе in vivo. За 20 минут до начала сеансо! плавания мышам вводили либо налоксок внутрибрюшинно в дозе 5 ' мкг, мышь, либо Миелопид в дозе юо мкг/мышь внутривенно, либо совместнс вводили оба препарата в тех же дозах и тем же способом. После этоп проводили сеансы плавания в течение 2-х дней. От этих животных по лучали клетки селезенки и лимфатических узлов. Иммунные клетки лимфатических узлов получали от мышей после повторной иммунизаци: эритроцитами барана ОБ) в подушечки 4-х конечностей на пике вто ричного иммунного ответа. Концентрацию всех клеток доводили до 1x1'

мл и смеиивали по 0,4 мл в различных комбинациях. После зо минут-гай инкубации при 37°С определяли количество Ige АОК.

Изучение действия Миелопида и надоксона на ухе индуцированные •упрессоры проводили в культуре in vitro. Налоксон в дозе 1мкг/мл, сибо Ниелопид в дозе 50 мхг/мл, либо оба препарата в тех же дозах юбавляли к смеси клеток селезенки или лимфатических узлов стресси-юванных животных и клеток иммунных лимфатических узлов. После зо смутной инкубации определяли количество АОК.

Для выявления профилактического и корригир-ющего действия Мие-гопида были использованы 2 варианта стресса-плавания. Первый состоит в нанесении стрессового воздействия в течение 2-х дней после шутрибртинной иммунизации ЭБ в дозе 2xio7 /мышь. Этим животным шугривенно вводили Миелопид в дозе Ю0 мкг/мьягь либо до , либо юсле стресса ( на пике иммунного ответа) ( рис.2, группы 1, 2 > На >-ые сутки после иммунизации определяли количество АОК в селезенке.

Второй вариант - стресс наносили в течение 2-х дней, затем жи-ютных иммунизировали 5% ЭБ по о,1 мл. подкожно в подупечки 4-х ко-!ечностей. Ниелопид в дозе loo мхг/ккпь вводили внутривенно либо 1еред началом, либо сразу после окончания действия стресса, либо на i-ые сутки иммунного ответа ( рис.2, группы 3,4,5 ). На 5 -ые сутки з лимфатических узлах этих мышей определяли количество АОК.

Метод аурикулярноя электроахупунктурь (АЭАП) осуществляли через нсупунктурные иглн, введенные в зоны обеих ушных раковин животных. :оответствуших аурикулярноя области козелка у человека. Для стиму-ияции использовали одиночные прямоугольные шгаульсн, генерируемые тпаратом Lasper-504 С, с частотой 3-5 Герц. Силу тока устанавливали на уровне порогового значения, вызывающего мшечные подергива-мя, но ниже порога боли. Длительность АЭАП составляла 20 минут. 1ЭАП проводили непосредственно перед каждым сеансом плавания.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы для обсчета по критерию Стьюдента на персональном компь-отере "Apple" ( CDA).

Акг,<£ Способы введения миелопида з системе /л гй*?

К МиеДолид 4- иммуииэаиия ЭБ ( до стресса)

2. Иммунизация ЭБ

етр«се плавами* 1,2 сутки

на Б-'е сутки получений КС и Определение кол—яа АОК

«тресс плевами» миелопид «о пике »О ма 5-е сутки «утки «О (но 4-* «утки) получение КС

и определена» АОК

3. Миелопид (до стресса)

стресс плавами« .иммунизации ЭБ =»«<>• получение на 5-9 2-ое суток еутхи КЛУ и опре»

деление количестве ■г- АОК

4. Стресс плавание 2-е суток

«о миелопид и

иммунизация 35

на 5-е сутки Получение КЛУ и определение количества АОК

I

а>

5. Стресс плавание 2-е суток

иммунизация ЭБ

миелопид нет пике ИО (но 4—в сутки)

на 5-в сутки получение КЛУ и определение количества АОК

2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

2.1. Влияние стресса-плавания на антителообразование в индуктивную и продуктивную фазы иммунного ответа.

Определение количества АОК в селезенках мышея, подвергавшихся твесогввму воздействию в различные сроки после иммунизации показа-а примерно оинаковое снижение иммунного ответа, в среднем на 50% о 5СОК трех группах ( табл.1, группы 2,3,4,).

У мышей четвертой группы также было обнаружено подавление анти-елообвазования в лимфатических узлах в среднем на 30% (табл.1, руппа 6).

Из полученных данных можно сделать вывод, что 60-минутные сеан-ы плавания, проводимые в разные сроки до или после иммунизации риводят к выраженному снижения иммунного ответа у мыяей п СВАхС57В1/б). При этом, снижение уровня антителообразования наблю-айось при нанесении стресса как в индуктивную, так и в продуктивно фазы иммунного ответа. Эффект проявляется в популяциях клеток 9Д93«нки и лимфатических узлов.

На ©сновании представленных результатов в дальнейших исследования использовались модели, в которых плавание животных проводилось течение 2-х дней до или после иммунизации.

2.2. Участие Г-лимфоцитов в реализации иммуносупрессии, индуцированной стрессом.

С целью выяснения возможных механизмов иммуносупрессии при тсесса изучали способность клеток селезенки стрессированных живот-ых подавлять антителообразование в популяциях иммунных клеток се-зэедки или лимфатических узлов нестрессированных животных. Тести-уемые клетки селезенки получали от мышей через 24 и 72 часа после кончания действия стресс-Фактора. Оказалось, что уже через 24 часа осле плавания в селезенке животных накапливаются супрессорные летки, способные подавлять антителообразование в популяции иммун-ых клеток селезенки на 16% ( табл.2, группаг). Супрессоры сохраня-

Т<2$а.£. Влияние стресса- плавания на антителообразованив в популяциях клеток селезенки и лимфатических узлов.

N N п/п Группо животных Число жиаотн. Среднее кол-во АОК на е»л»я$ту Коэффициент по ОТНОШвНИв к контролю Р

1. Контроль (селезенка) 22 6546,4 + 191,4 •

2. ЭБ + плавание 1,2 сутки после иммунизации 22 3013,8+350,3 0,46 <0,001

3. ЭБ + плавание 3,4 сутки после иммуниэаиии 24 3209,2 + 252,1 0,49 <0,001

4. ЭБ + плавание четверо суток после иммунизации 24 3401,2 +197,7 0,52 <0,001

. в Среднее кол-воА0К/10 ядросодер. клеток(М^т)

5. Контроль (лимфатич. узлы) 92 72.6+2,3

6. Плавание двое суток + ЭБ . 95 52,7 + 2,3 0,73 <0,001

ЭБ - эритроциты.барана

Табл.2 Снижение антителообразования в популяциях клеток селезенки и лимфатических узлов иммунных мышей под влиянием клеток селезенки, полученных от стрессированных животных

Сроки после стресса Исследуемые типы клеток Кол-оо экспер. Кол-во А0К/10 6 ялросод. клеток (Mim) Коэфф. изменения антитело-образования . Р

24 часа 1 Иммунные КС (контроль !) 2 Иммунные КС-«-КС стресс 3 Иммунные КС+КС интоктные 14 14 14 436,1 ± 5,6 370,2* 8.9 429,6 ± 11,5 0,84 0,99 <0,001 + >0,05

72 часе 4 Иммунные КС (контроль 2) 5 Иммунные КС+КС стресс 6 Иммунные КС+КС интактныа 6 6 6 481.9 ±20,1 385,7± 9,7 462,8 ± 11,£ 0,8 0,96 <0,001 >0.05

24 часа 7 Иммунные КЛУ (контроль 3) 8 Иммунные КЛУ+КС стресс 9 Иммунные КЛУ+КС интоктные 8 8 8 202,3 ± 9,1 139,0 ±4,5 189,5 ±4,6 0,69 0,94 +++ <0,001 >0,05

72 часа 10 Иммунные КЛУ (контроль 4) 11 Иммунные КЛУ+КС стресс 12 Иммунные КЛУ+КС интоктные 10 10 10: 119,9 ± 3,6 92,9 ± 4,8 137,8 ± 4,2 0,76 1,15 <0,001 >0,05

+ - р по отношению к контролю 1 +++ - р ПО отношению к контролю 3

++ - Р по отношению к контролю 2 ++++ _ Р по отношению к контролю 4

- 12--

ются в селезенке этик животных и через 72 часа после стресса (табл.2, группа 5). При этом уровень супрессии не изменялся.

Подобный результат был получен я при изучении влияния клето! селезенки стрессированных животных на популяцию иммунных клето! лимфатических узлов. Степень супрессии в данном случае была более .выраженной. Через -24 часа после стресса уровень снижения АОК пс сравнению с контролем составил 31%, а через 72 часа - 24% (табл.2, группы 8 и 11).Накопление супрессоров под влиянием стресса происходит также и в лимфатических узлах.

Во всех случаях в качестве контроле в культуры иммунных клето» селезенки или лимфатических узлов вносили клетки селезенки или лим-с этических узлов нормальных (жнтактных) животных, которые никак не влияли на иммунный ответ. Тахим образом, полученные данные позволяют сделать вывод, что при стрессе в селезенке и лимфатических узла> происходит накопление неспецифических супрессорных клеток, принимающих участие в развитии стресс-вызванного НДС.

Для определения типа клеток, вызывающих иммуносупрессию пр> стрессе, клетки селезенки иди лимфатических узлов стрессированнш мышей обрабатывали анти-Т-супрессорной сывороткой. После такой обработки их инкубировали с иммунными клетками лимфатических узлов ) затем определяли кол-во АОК в иммунной популяции. Оказалось, чте обработка анти-Т-супрессорной сыворотхой клеток селезенки или лимфатических узлов, подученных от стрессированных животных отменяв! их способность подавлять антителообразованив в иммунных клетка} лимфатических узлов (табл. 3, группа 3,5). Следов--ельно. в селезенке и лимфатических узлах под действием стресса-плавания индуцируются супрессорные клетки Г-ряда, т.е. Т -супрессоры.

2.3. Участие опиатергической системы в иммуносупрессии пру стрессе-плавании.

В зависимости от степени участия опиатергической системы различают опиатные (налоксонзависимые) и неопиатные (калоксоннезависи-мые) формы стресса. Определение формы стресса важно для адекватного

Табл.Ь. Отмена снижения антителообразования в популяции

иммунных К/1У пол влиянием КС и К/1У стрессированных мышей после их обработки анти-Т-супрессорной сывороткой

N Исследуемые типы меток Кол-во *кепвр. Кол-оо А0К/1С6 Яйрслйй. КЛАТМС (М±Л1) Когфф. иэмомв- Ю4Я ОМТИТвЛО- ебралсиания • Р

1 Иммунные КЛУ 8 202,3 - 9,1

2 Иммунмиэ КЛУ +КС с тросе 8 139,0 ±4,5 0,69 <0,001

3 Иммунные КЛУ +КС (сбраб. АС) 8 197,8+ 4,1 0,98 >0,05

4 Иммунные КЛУ + КЛУ стросс 8 155,0 + 4,4 0,76 <0,001

5 Иммунные КЛУ + КЛУ (обраб. АС) 8 193,3+5,4 0,9^ >0,05

АС - анти- Т -супрессррная сыворотка

--

выбора средств профилактики и коррекции стресс-вызванного ИДС-В связи с этим, было проведено изучение возможного участия опиатерги-ческоа системы в развитии имнуносупресски при избранной модели стресса .

Классическим приемом для определения участия апиатергичаской .системы в развитии тех или иных эффектов является использование веществ, специфически связывавшихся с опиатными рецепторами. В этой работе мы использовали антагонист опиатов - налоксоя и препарат Ми-елопид, характеризующийся иммуностимулирующим и анальгетическим действием, что возможно связано с тем, что в состав Миелопида входят опиоидные пептиды, специфически связывающиеся с опиатными рецепторами ( Петров Р.В. и др 1983 ).

За 20 минут до стрессорного воздействия животным вводили либо налоксон а дозе 5 мкг/мьпгь внутрибрюшинно, либо Миелопид в дозе юо мкг/ мышь внутривенно, либо оба препарата в тех же дозах и тем же способом.

Результаты этих экспериментов представлены на рис.3. Из рисунка видно, что хак и в предыдущих исследованиях стресс-плавание подавляет антителообразование на 30% . Профилактическое введение хивот-ным налохсона или Миелопида, а также этих препаратов совместно, отменяет эффект супрессии .

Эти результаты показывают, что стресс-плавание является опиат-ной формой стресса. Развивающуюся при-этом иммуносупрессию-дохно предупредить введением налохсона или Миелопида.

Отмена налоксоном иди Миелопидом супрессии, вс зникающей в результате действия стресса-плавания, позволила предположить, что как налоксон, так и Миелопид способны, по-видимому, препятствовать индукции Т-супрессоров.

Для проверки этого предположения были проведены опыты по оценке супрессируюоего влияния клеток селезенки или лимфатических узла стрессированных животных, обработанных налоксоном или Миелопидом. Тестируемые клетки добавляли в культуру иммунных клеток лимфатичес-

ОТМСНА 3<тКТА СУПРЕССИИ ПРИ СТРЕССЕ-ПЛАВАНИИ НАЛОКСОНОМ И МИЕ7ЮПИД0М

КОЛ-ВО А0К/106 ЯДРОСОЯЕГР КЛЕТОК

¡00-

80-

60-

40-

20-

1 2 3 4 5

1. Контроль 2. Стресс 3. Налоксон + стросс 4. Миелопид + стресс 5. Мив/юпид + налоксон + стресс

- 16 -

хкх узлов я оценивали количество АОК.

Из ванных таблицы 4 видно, что клетки селезенки стрессированных животных, получавших надоксон ш Миелопид, либо оба препарата не оказывает подавлявшего влияния на иммунный ответ в иммунных лимфатических узлах ( табл.4, группы 3,4,5). Аналогичные результаты были получены и при изучении действия этих вецеств на индукции супрессо-ров в лимфатических уздах.

Таким образом, налоксон и Миелопид препятствуют- индукции Г-суп-рессоров. что может быть связано с конкуренцией этих опиатергичес-ких веяеетв за места специфического связывания на клетках -мишенях с эндогенными опиатами.

Для оценки возможности влияния препаратов на функциональную активность уже индуцированных Т-супрессороа. - были проведены эксперименты, в которых в смешанную культуру клеток иммунных лимфатичесхих уэжов и клеток селезенки от стрессированных животных вносили налох-сон в дозе 1 мкг/мл, либо Миелопид в дозе 50 мкг/мл, либо смесь этих препаратов и определяли количество АОК.

Оказалось, что налоксон, Миелопид, а также их смесь , способны лишь частично отменять стресс-индуцированную супрессию в иммунных лимфатичесхих узлах < табл.5, группы 3,4,5 ). Внесение их в клеточную культуру не доводило количество антителообразуюшкх клеток до нормы. Во всех случаях полученные в этих группах значения количества АОК были достоверно ниже контрольных .значений. ^

Те же закономерности были выявлены и при внесении надоксоиа иди Ниелопида в смешанные культуры клеток иммунных лимфатических узлов и лимфатических узлов от стрессированных животных.

Полученные результаты свидетельствуют, что в индукции 7-супрвс-соров при стрессе принимает участие опиатергическая система.

2.4. Профилактика и коррекция иммунодефицитного состояния пр! стрессе.

Результаты изучения механизмов развития стресс-вызванного ИДС изложенные выше, а также данные о снижении естественной продукии:

Табл.4

Влияние налоксона и Миелопида на индукцию супрессоров в селезенке

. стрессированных животных /л vivo

N N п/л Типы клеток, добавляемы • к популяции иммунных клеток Кол-во экспер. Кол-во А0К/10® пдросодвржащих клеток (М±т) Коэффициент изменения онтителооб— раэования Р

лимфатических узлов • ■ по отнош. к гр.1 по отнош. к гр.2 по отнош. к гр.1 по отнош. к гр.2

1. Контроль 10 373,5 + 7,4

2. КС стресс 10 246,7 + 6,8 0,66 <0,001

3. КС стресс (наяоксаи in vivo) 8 404,1 +10,8 1,08 1,64 <0,05 <0,001

4. КС стресс (МП In vivo) 6 412,5+11,4 1.1 1,67 <0,01 <0,001

5. КС стресс (налоксон+ МП in vivo) 6 352,5 +11,7 0,94 1,43 _ ^0,05 <0,001

Табл. 5

вшйнйэ- Миелопи^й » ctpecc

нолоксона на супрбссоры, «мдушфоакзнмы^ •плаванием в полуййции КС In vif го.

N N п/О tmaxmibtc, лвбвв-[ ияеШв * популяции иммунных «йвток Кол-во »кспер, Кол-во А0К/10* ядроеодвржоших клеток (MJ-m) Ко»ффииивмт иэ««-нвмия омтитв/l©Образования Р

Лимфатических узлов по отнош. к гр.1 по отнош. к гр.2 по отнош. К 1*рл ПО отнош. * tp'2

1. Контроль ш 373,5+7,4

2. ; КС стресс 10 246,7+6,8 0,66 <0,001

5. КС ctpacc + «алоксон in vitro то 321,3 + 15,3 0,86 1,3 <0,01 <O.OÛI

4. КС стресс + МП in vitro 10 340,1 +9,2 0,9 1,4 <0,01 <0,001

5. КС стресс + налоксон+ МП In vitro 10 297,4 +8,4 0,8 1,2 <0,001 <0,001

миелопептидов при стрессе (Василенко A.M., Захарова Л.А., 1985) дают основания предполагать, что использование Миелопида может быть патогенетически обоснованным способом профилактики и коррекции кн-мунодефицитов. развивающихся при стрессе.

Профилактические и корригирующие эффекты Миелопида оценивали по его влиянию на изменения количества АОК в лимфатических узлах/ В соответствии с задачами исследования Миелопид вводили внутривенно а дозе 100 мкг/мшь либо до (профилактика), либо после сразу после стрессового воздействия, либо на пике иммунного ответа (коррекция). На 5-ые сутки после иммунизации определяли количество АОК в лимфатических узлах. Схема иммунизации и методика определения АОК не отличались от описанных ранее.

Данные представлены в таблице 6. Если Миелопид вводился животным до стрессового воздействия, наблюдалось полное предотвращение супрессии ( табл.6, группа 3). При этом, количество АОК в этой группе было достоверно выше контроля. Полученный Факт свидетельствует о ярко выраженных профилактических свойствах этого препарата.

В случае введения Миелопида непосредственно после плавания или на пике ИО (табл.6, группа 4,5) также наблюдалась отмена супрессии, хотя и менее выраженная. Следовательно, Миелопид обладает как профилактическим , так и терапевтическим (корригирующим) действием.

Аналогичные результаты были получены при использовании другого варианта стресса ( плавание животных после иммунизации ) и определении антителообраэуюших клеток в селезенке стрессированных мышея.

Из литературы известно, что имиуносупрессия при стрессе может быть связана с нарушением выработки миелопептидов клетками костного мозга, которое имеет место при гипоксическом стрессе (Сарыбаева Д.В., 1991). Восполнение недостатка миелопептидов при введении Миелопида в организм животного предотврашает супрессирующее действие стресса на иммунную систему.

2.5. Профилактическое действие АЭАП.

Результаты успешного применения АЭАП для усиления иммунного

& Профилактика и коррекции миелопилом снижения иммунного ответа в популяции клеток лимфатических узлов при о1рессе-плс!вавии.

N N л/п Группы животных I Кол-во живо*. . Среднее по группам К4/Р"В0 А0К/106 яд.-роеодврж». *й-ок (М±т) Коэффициент цчэмв-1-нвния онгифелооб— роэовонмв Г *

ПО ОТИОШ. к гр.Т по отнощ. к гр.2 ^ п. пщ -I л ... ль- отнош.

Т. Контроль 92 72,6 * 2,3

2. Плал 2-ов СуЩк + ЭБ 95 52,7 * 2,3 0Г7$ <0,001

3., Миелопид (до стресса) + плав. 2-ое суток + ЭБ 77 93,1 ± 4,2 ■ > 1,28 1,77 <0,001 <0,001

4. Плов. 2-вв сут0"<ч миелолил (леоед иммуниэацивй)+ЭБ 36 69,8 ± 3»7 0,96 .1,32 >0,05 <0,001

5. Плав» 2-ое сутокЧ ЭБ + миелопид (на пике ИО) 39 74,2 £ 3,9 1,02 1,41 >0,05 <0,001

гвета при развитии инфекционных и вирусных заболевания (Sin У.м., t all, 1983), для лечения тимус-зависимых ИДС и связанных с ними аболеваний (Вогралих В.Г. и др., 1987), а таете сведения о стресс-имитируюцем действии АЭАП (Меерсон Ф.З.. 1981) позволили предполо-ить , что этот метод может оказаться эффективным для профилактики нормализации нарушений гуморального иммунитета при действии тресса-плавания.

Для проведения АЭАП животных Фиксировали на препаровальных стоиках, что представляет собой кратковременный иммобилизационныя тресс. Это обстоятельство потребовало проведения дополнительных онтрольных экспериментов, в которых животных фиксировали на 20 ми-ут без проведения АЭАП. Оказалось, что это воздействие не влияет з иммунный ответ.

После сеансов АЭАП мшей подвергали стрессу-плаванио в течение -х дней ( по i часу в день), затем иммунизировали и на 5-ые сутки гоеаеляди количество АОК в лимфатических узлах. Результаты этих сепериментов представлены в таблице 7.

Как следует из приведенных данных, проведение сеансов' АЗАП пол-jctbio предотвращает развитие супрессии при стрессе (табл.7, группа Следовательно, АЭАП является не менее эффективным методом про-(лахтики стресс-индуцированной иммуносупрессии по сравнению с ис->льэованными фармакологическими препаратами.

АЭАЦ представляет собой комбинацию аурикулярной электроакупунк-Фн и транскраниальной электростимуляции. Известно, что оба вида >эдеиствия приводят к активации опиатергической системы организма, гот механизм, по-видимому, и является основой профилактического >йствия АЭАП.

Полученные результаты в совокупности с ранее опубликованными 1нными позволяют сделать заключение о целесообразности использова-1Я препарата Ниелопид и метода АЭАП для профилактики иммуносупрес-ганого эффекта опиоидных Форм стресса.

»актические рекомендации. Рекомендуется использовать в качестве

Профилактический эффект аурикулярной эЛек+роакуИункТуры (АЭАП) при- имияуносупрессивном действии плавательного «урдоса (ПС).

^ N п/п У¿нови* эксперимента Кол-чао животн. Къд-во ДОК/10* ядросод«рмощих клеток (М*т) Н«НИЯ ОНТИТвЛОйб- разовамия ?

по отнош. к гр.1 по оттш. к гр.2 па отмош. к гр.1 ПО -<М>ИОШ.

Т• К^нтроль-бвз ПС 71 85,5+3,2

г. ПС за ЛЙОЙ суток да иммунизации 70 08,2 ±2,4 0,79 <0,001

3. АЗАЙ+Ш за двое суток до иммунизации 71 1 ■ 100,4 + 4,5 1.17 1,47 . * <0,001 <0,001 П'1

профилактического и корригирующего средства препарат Миелопид. а также АЭАП при вторичных иммунодефицитных состояниях, и, в частности, при стресс-выэванннх НДС..

ВЫВОДЫ.

1. Разработана экспериментальная модель иммунодефицитного состояния, вызываемого дозированным плаванием мышей в воде с температурой 30°С . Этот вид стрессового воздействия приводит к супрессии гуморального иммунного ответа, выражающейся в. снижении количества АОК в периферических лимфоидных органах подопытных животных в среднем на 30-50%.

2. Супрессия иммунного ответа в разработанной модели происходит при воздействии стресса ках в индуктивную, так и в продуктивную фазы иммунного ответа. Снижение антителообраэования наиболее выражено в селеэенхе (около 48%) по сравнению с лимфатическими узлами ( в среднем 28% ).

3. Одним из механизмов подавления иммунного ответа при стрессе -плавании является индукция неспецифических Т-супрессоров. Появление Т-супрессоров в селезенке и лимфатических узлах регистрируется уже через 24 часа после нанесения стрессорного воздействия- Т-супрессоры сохраняются в лимфоидиых органах по меньшей мере в течение 72-х часов-

4. Введение антагониста опиатов - налоксона за 20 минут до стресс» предотвращает снижение количества антителообразуюцих клеток и индукцию неспецифических Т-супрессоров, что указывает на участие опиатергической системы в развитии стресс-икдуцированного иммунодефицита.

5. Препарат Ниелопид оказывает корригирующее действие на иммунный ответ, подавленный стрессом-плаванием. Введение Миелопнда стрессированным животным на пике иммунного ответа восстанавливает антителообраэовакие до нормального уровня.

6. Показана возможность профилактики стресс-индуцированной иммуносупрессии как медикаментозными, так и немедикаментозными

средствами- Введение животным Миелопкда. налоксона, а также проведение сеансов аурикулярной злектростимулшии перед стрессом отменяют иммуносупрессюо, индуцированную стрессом.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Кирилина Е-А., Захарова Л.А.. Василенко A.M., Михайлова А.А. Влияние Миелопида на ранние проявления иммуносулрессивного действия стресса.- Я. Иммунология, 1989, N а, стр. 41-43.

2. Василенко A.M.. Кирилина Е.А., Сарыбаева Д.В. Профилактика * коррекция стресс-вызванного иммунодефицитного состояния методом аурикулярной электростимуляции.- S. Патологическая физиология и эксперт*, терапия, 1989, N 3, стр. 21-24.

3. Кирилина Е.А. Влияние Миелопида на ранние проявления иммуносулрессивного действия стресса.- Тезисы коНф. "Стресс и иммунитет", г- Ростов-на-Дону, 1989, стр.21.

4. Михайлова А.А., Захарова Л.А.. Кирилина Е.А., Сарыбаева Д.В Механизмы снижения иммунного ответа и его коррекция Миелопидом. Тезисы конф." Стресс и иммунитет г.Ростов-на-Дону. 1989, стр.31

5. Кирилина Е.А.. Захарова Л.А., Михайлова А.А., Василенко А.М Т-супрессорныя и опиатергичесхий механизмы снижения иммунного отве та при стрессе.- Ж. Иммунология, 1990, N з, стр. 68-70.

6. Кирилина Е.А. Профилактический эффект миелопептидов при им мунодефиците, развивающемся под действием стресса-плавания.- Тезис докл. v Всесоюзи.симп. "Взаимодействие■нервной и иммунной систем" Оренбург, 1990, стр. 97.

7. Zakharova L.A., Vasilenko A.M., VanovsKy O.G., Kirilir Е.А., Fonina L.A. Modelling action of nyelopeptides i 8tre98-induced decrease of the response and pain sensitivity, Coristit.Cong. Society to Pathophysiol., Moscow, 1991, p. 1.93.

8. Zakharova L.A., Kirilina E.A., Sarybaeva D.V.. Yanovsl O.G., Vasilenko A.M. Concominant stre^s-liBiting and hypoalges. effects bone-narrow iimiunoregulatory nediators (myelopeptides) European Feder. of Immunol. Societies, Finland, 1991, p. 34 .