Автореферат и диссертация по медицине (14.00.10) на тему:ПРИМЕНЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ ДНК-МИКРОЧИПОВ В ЭТИОЛОГИЧЕСКОЙ ВЕРИФИКАЦИИ ОСТРЫХ КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ПРИРОДЫ

ДИССЕРТАЦИЯ
ПРИМЕНЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ ДНК-МИКРОЧИПОВ В ЭТИОЛОГИЧЕСКОЙ ВЕРИФИКАЦИИ ОСТРЫХ КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ПРИРОДЫ - диссертация, тема по медицине
АВТОРЕФЕРАТ
ПРИМЕНЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ ДНК-МИКРОЧИПОВ В ЭТИОЛОГИЧЕСКОЙ ВЕРИФИКАЦИИ ОСТРЫХ КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ПРИРОДЫ - тема автореферата по медицине
Айвазян, Сона Робертовна Москва 2009 г.
Ученая степень
кандидата медицинских наук
ВАК РФ
14.00.10
 
 

Автореферат диссертации по медицине на тему ПРИМЕНЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ ДНК-МИКРОЧИПОВ В ЭТИОЛОГИЧЕСКОЙ ВЕРИФИКАЦИИ ОСТРЫХ КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ПРИРОДЫ

На правах рукописи

АЙВАЗЯН Сона Робертовна

ПРИМЕНЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ ДНК-МИКРОЧИПОВ В

ЭТИОЛОГИЧЕСКОЙ ВЕРИФИКАЦИИ ОСТРЫХ КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ПРИРОДЫ

14.00.10 - инфекционные болезни

? ^ ОиТ 2^-3

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва-2009

003479751

Работа выполнена в ГОУ ВПО Московской медицинской академии им.

И.М. Сеченова

Научные руководители:

Доктор медицинских наук, профессор Доктор медицинских наук, профессор Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Валерий Анатольевич Малов Игорь Петрович Белецкий

Анатолий Карпович Токмалаев

доктор медицинских наук Ведущее учреждение:

Татьяна Никифоровна Ермак

ГОУ ВПО Российский государственный медицинский университет.

Защита состоится « ъ / {

2009 г. в 13.00 часов на заседании Диссертационного совета Д.208.040.05 в Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова (119991, г. Москва, Трубецкая ул., д.8, строение 2)-

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНМБ ММА им. И.М. Сеченова (117998, г. Москва, Нахимовский проспект, дом 49).

Автореферат разослан «_»_

2009 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета: доктор медицинских наук, профессор

Елена Васильевна Волчкова

Актуальность исследования

Острые кишечные инфекции (ОКИ) продолжают занимать существенное место в структуре инфекционных заболеваний, уступая по распространенности лишь острым респираторным вирусным инфекциям. [Онищенко Г.Г. с соавт., 2004-2008J. Ежегодно в мире число заболевших ОКИ достигает в 3-5 млрд. человек, при этом 5-10 млн. больных умирают [Guerrant R.L. et al., 2001, Thielman N.M. et al., 2004]. Как в развивающихся, так и в индустриально развитых странах, несмотря на определенные успехи в диагностике и лечении, проблема ОКИ стоит достаточно остро [Подколзин А.Т. с соавт., 2007, М. de Wit, 2001, Parashar U.D., et al., 2003].

Значимость этой проблемы в патологии человека в настоящее время подтверждается также наблюдаемыми качественными изменениями в структуре и характере течения острых кишечных заболеваний [Michael J. Et al., 2006, de Wit et al, 2001, Wilhelmi I. et al, 2003]. Однако этиологическая диагностика их во многих случаях поздняя, большинство диарей остаются нерасшифрованными. В соответствии с официальной статистикой федерального Центра Госсанэпиднадзора РФ, в период с 2000 по 2004 год регистрировалось до 65-75% ОКИ с неустановленной этиологией. В 2006 г. заболеваемость ОКИ неустановленной этиологии составила 306,0 на 100 000 населения [Онищенко, Г.Г., 2008]. Поэтому современная этиологическая диагностика ОКИ характеризуется непрерывным совершенствованием уже существующих традиционных методов исследования и поисками новых, более эффективных направлений диагностики. Примером такого направления может служить молекулярная клиническая диагностика, и, в частности, методы, основанные на применении полимеразной цепной реакции (ПЦР) и различных ее модификаций. В отечественной литературе уже имеется ряд сообщений о преимуществе метода полимеразной цепной реакции в

этиологической расшифровке ОКИ [Подколзин А.Т. и соавт., 2003, Орлова К.А и соавт., 2003, Мазанкова JL Н. и соавт., 2004]. Особенно перспективными в диагностике ОКИ являются методы, основанные на мультиплексной ПЦР, когда появляется возможность единовременного выявления широкого спектра возбудителей, что существенно сокращает сроки этиологической верификации диагноза.

Одним из наиболее быстро развивающихся экспериментальных направлений современной биологии являются микрочипы, в частности, ДНК - чипы, позволяющие определять наличие в анализируемом материале большого количества разнообразных последовательностей ДНК [Мирзабеков А.Д. и соавг., 2003]. Тип ДНК-чипов, так называемые «чипы с низкой плотностью» (low density microarrays), достаточно широко применяются для обнаружения различных инфекционных агентов. Основным достоинством такого подхода является возможность быстрого и одновременного выявления множества потенциальных патогенов бактериальной и вирусной природы [Jaaskelainen A.J. et а1.,2006]. Таким образом, биологические микрочипы служат идеальной платформой для единовременного выявления широкого спектра возбудителей.

Цель работы - разработка и клиническое применение биологических ДНК - микрочипов в этиологической верификации острых кишечных инфекций бактериальной природы.

Задачи исследования:

1. Разработать и оптимизировать методику детекции генетического материала основных возбудителей острых кишечных инфекций бактериальной этиологии в копрофильтрате с применением биологических ДНК-микрочипов.

2. Дать сравнительную характеристику диагностической эффективности бактериологического и ПЦР методов исследования в этиологической расшифровке ОКИ бактериальной природы.

3. Изучить особенности клинического течения ОКИ у больных в зависимости от метода верификации диагноза.

4. Оценить диагностические возможности детекции бактериальных возбудителей ОКИ с использованием ДНК-микрочипов на клиническом материале в сопоставлении с результатами референтного ПЦР исследования.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Впервые разработана диагностическая ПЦР тест-система для детекции трех патогенных и двух условно-патогенных микроорганизмов -бактериальных возбудителей острых кишечных инфекций: Salmonella spp., Shigella spp. и Enteroinvasive Escherichia coli (IIIEC), Campylobacter jejuni, Klebsiella pnneumoniae, Proteus mirabilis.

Впервые разработана методика идентификации бактериальных возбудителей острых кишечных инфекций с использованием ДНК-микрочипов.

Клинически обосновано применение биологических микрочипов в диагностике острых кишечных инфекций путем применения метода на копрофильтрате больных острыми кишечными инфекциями различной этиологии.

Дана сравнительная характеристика метода диагностики ОКИ с использованием ДНК-микрочипов с бактериологическим и ПЦР методами

диагностики, описаны факторы, влияющие на результативность и информативность различных методов этиологической верификации ОКИ.

При использовании биологических ДНК-микрочипов описаны особенности клинического течения ОКИ при выявлении ассоциаций патогенных кишечных бактерий и условно-патогенных бактерий рода Klebsiella pneumoniae и Proteus mirabilis.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Предложен новый отечественный набор реактивов для диагностики острых кишечных инфекций бактериальной этиологии, который позволяет в течение 12-14 часов протестировать диагностический материал(копрофильтрат) на наличие пяти микроорганизмов - патогенных и условно-патогенных возбудителей ОКИ.

Разработанная мультиплексная ПЦР тест-система позволяет единовременно выявлять в исследуемом материале следующие микроорганизмы: Shigella spp.+ElEC, Salmonella spp., Campylobacter jejuni, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis и не уступает по чувствительности и специфичности применяемым в настоящее время в практике ПЦР тест-системам для идентификации аналогичных возбудителей.

Результаты клинического применения метода позволили показать возможность использования методики на материале, полученном от больных.

Сравнительно невысокая себестоимость, автоматизация и неинвазивность диагностического процесса являются несомненными преимуществами предлагаемого метода олигонуклеотидного биочипа для диагностики ОКИ бактериальной этиологии.

Применение разработанного нами метода может быть рекомендовано при необходимости быстрого и единовременного выявления широкого спектра возбудителей на большом клиническом материале, а также в комплексной диагностике ОКИ наряду с рутинными методами диагностики.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

Разработана диагностическая тест-система на основе мультиплексной ПЦР для единовременного выявления и идентификации ДНК патогенных и условно-патогенных возбудителей острых кишечных инфекций, а именно Shigella spp.+EIEC, Salmonella spp., Campylobacter jejuni, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, характеризующаяся высокой специфичностью и чувствительностью, не уступающей специфичности и чувствительности используемых в настоящее время тест-систем для идентификации аналогичных возбудителей.

Разработан биологический ДНК - микрочип для комплексной этиологической верификации ОКИ бактериальной природы.

Информативность бактериологического исследования в этиологической верификации ОКИ достоверно уменьшается при заборе материала после использования антибактериальных препаратов, тогда как информативность метода ПЦР после этиотропной терапии достоверно не меняется.

При использовании биологических микрочипов появляется возможность сократить сроки исследования по сравнению с рутинными методами диагностики, выявлять ассоциации микроорганизмов, характерные для острых кишечных инфекций, а также описать особеноости клинического течения при выявлении ассоциаций патогенных и условнопатогенных кишечных бактерий Shigella+Klebsiella, в отличие от моно-инфекцией Shigella.

ВНЕДРЕНИЕ В ПРАКТИКУ

Разработанная мультиплексная система для идентификации возбудителей ОКИ бактериальной природы с детекцией результатов с использованием биологических микрочипов «ММТест-ОКИ-ПЦР-Биочип» успешно прошла первый этап испытаний в диагностической лаборатории НИИ скорой помощи им. Н.В. Склифософского. Материалы работы включены в учебный курс кафедры инфекционных болезней ММА им. И.М. Сеченова и используются в учебном процессе при преподавании соответствующего раздела.

АПРОБАЦИЯ ДИССЕРТАЦИИ

Основные положения и результаты исследования были обуждены на VIII международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке; концепции болезней цивилизации» (Москва, РУДН, ноябрь, 2007); научно-исторической конференции, посвященной 300-летию со дня открытия ГКВГ им. H.H. Бурденко «Роль Московской гошпитали в становлении и развитии отечественного государственного больничного дела, медицинского образования и науки№ (Москва, 2007), на научно-практической конференции, посвященной 75-летию кафедры инфекционных болезней РМАПО (Москва, 2008), на научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы гастроэнтнрологии» (Василенковские чтения), посвященной памяти академика В.Х. Василенко (20 ноября, 2008г., Москва), а также на научно-практических конференциях кафедры инфекционных болезней и общебольничных конференциях 4 ГКБ. Диссертация апробирована на совместном заседании кафедры инфекционных болезней, лаборатории по изучению токсических и септических состояний ГОУ ВПО

ММА им. И.М. Сеченова и лаборатории генной инженерии ГОУ ВПО ММА им. И.М. Сеченова 13 июня 2009г.

ПУБЛИКАЦИИ

По теме диссертации опубликовано 9 научных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на _

страницах и состоит из введения, обзора литературы, 3 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, приложений. Библиография включает 209 отечественных и зарубежных источника. Полученные результаты иллюстрированы 18 таблицами и 23 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы

Исследования, запланированные в данной работе, проводились в период с 2006 по 2009 г.г. включительно. Клиническое обследование больных проводилось на базах кафедры инфекционных болезней ММА им. И.М. Сеченова (зав. кафедрой - член-корр. РАМН, профессор С.Г. Пак): в городской клинической больнице № 4 (глав, врач - С.К. Романов ), в отделении острых кишечных инфекций (зав. отделением - O.A. Фадеева) и на базе кафедры инфекционных болезней Национального института здравоохранения Республики Армения (НИЗ РА) (зав. кафедрой - к.м.н. А.В.Асоян), в клинической инфекционной больнице (КИБ) «Норк» Министерства Здравоохранения РА (глав, врач А.В.Асоян), в отделении №5

(зав. отделением доцент кафедры инфекционных болезней НИЗ РА, к.м.н. М.В. Шмавонян),

В течение данного периода методом случайной выборки обследовано 147 пациентов, госпитализированных в вышеуказанные стационары с клинической картиной ОКИ, из них 90 больных (61,2%) в ГКБ №4 и 57 пациентов (38,8%) в КИБ « Норк».

При оценке распределения больных по полу обнаружено, что женщины составили чуть более многочисленную группу - 83 человека (56,5%), чем пациенты мужского пола - 64 пациента (43,5%). Возраст обследованных больных варьировал в пределах от 14 до 86 лет, при этом наиболее многочисленную группу составили лица в возрасте от 20 до 40 лет. Основная масса больных поступала в стационар на 1-3 сутки от начала заболевания (87,6%). Сопутствующие заболевания выявлялись на основании анамнестических данных у 55 больных (37,4% от общего числа пациентов).

Определение степени тяжести ОКИ проводили согласно разработанным клинико-диагностическим критериям в зависимости от установленной нозологии [Бродов Л.Е., 1997, Лобзин Ю.В., 2001]. Лечение больных осуществлялось по стандартным методикам, включая проведение регидратационной, дезинтоксикационной и симптоматической терапии с обязательным назначением пероральных и парентеральных регидратационных растворов: «Регидрон», «Хлосоль», «Ацесоль». Пациентам с ОД, а также некоторым больным с гастроинтестинальной формой сальмонеллеза (ГИФС), назначалась также этиотропная терапия.

Группа контроля, состоящая из 20 человек, была представлена практически здоровыми лицами, сопоставимыми по полу и возрасту с обследованными пациентами, у которых в течение одного года не отмечалось симптомов каких-либо инфекционных заболеваний, в том числе симптомов

ОКИ. Рутинная лабораторная диагностика ОКИ на наличие патогенных микроорганизмов кишечной группы (Salmopnella spp., Shigella spp., энтеропатогенную кишечную палочку (ЭПКП) осуществлялась в условиях бактериологических лабораторий 4ГКБ и ИКБ «Норк».

Всем пациентам проводилось исследование фекалий методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) - исследование фекалий проводилось на наличие генетического материала наиболее часто выявляемых (в том числе и методом ПЦР) бактериальных возбудителей кишечных инфекций [Подколзин А.Т., 2004-2005, Ильина Н.Ю., 2006, Покровский В.И., 2003, Воробьев А.А. с соавт., 2000, Орлова К.А. с соавт., 2004, Eastwood К. et al., 2007, Leushner J. et al., 2000]. В эту группу были включены бактерии рода Salmonella, Shigella и Е1ЕС, Campylobacter. Фекалии всех больных были исследованы также на наличие генетического материала условно-патогенных бактерий родов Proteus и Klebsiella. Обследование проводилось в первые сутки пребывания в стационаре, но не позднее 5-го дня болезни.

Исследования методом ПЦР проводились на базе НИИ молекулярной медицины ММА им. И.М.Сеченова и ИТЕБ РАН. Амплификация полученных проб проводилась с использованием коммерческих наборов «АмплиСенс Salmonella sp.», «АмплиСенс Shigella sp., Е1ЕС», «АмплиСенс Yersinia enterocolitica» (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора), а также наборов для амплификации ДНК Campilobacter jejuni Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae, Giardia lamblia и Entamoeba histolitica «GenPak», Isogene, в соответствии с программами фирм-производителей, с использованием амплификатора «Терцию», ДНК-технологии, (Россия).

Детекция продуктов амплификации осуществлялась методом горизонтального электрофореза в 2% агарозном геле с окраской бромида этидием и последующей регистрацией результатов в ультрафиолетовом свете.

Нуклеотидные последовательности искомых фрагментов генов для создания системы выбирали из базы данных "GenBank" ("NCBI", США).

Разработанная система включает следующие пары праймеров:

Shigella spp, EIEC:

shi2 up 5' CCT CCT CGG ATT CCA TTG CCC AG (23 и.о.)

shi21 lo 5' GTC CAT CTT TGG GAC CAC TGT CGG (24 и.о.) Salmonella spp.:

sal4 up 5' CGA TGA CGC GGG АСА AGC CGT (21 и.о.) sal4 lo 5' GAC CTT AGG CGA CTT TTG AAC GCG С (25 и.о.) Campylobacter jejuni:

cam 11 up 5' GTG TTC CGG CTG TCA GCG CAG G (22 и.о.) cam 11 lo 5' CGC AAG GAA CGC CCG TCG TGG (21 и.о.) Proteus mirabilis:

prol up 5' GCG AGA CGC СТА TGA TCG CAT GAT (24 и.о.) prol lo 5' GAA ACC GGC GGT AAG GAT CTG AGC (24 и.о.; Klebsiella pneumoniae:

kle2 up 5' GCG AGA CGC СТА TGA TCG CAT GAT (24 и.о.) kle2 lo 5' GCG AGA CGC СТА TGA TCG CAT GAT (24 и.о.) маркер GUS для контроля выделения {Escherichia coli): pc up 5' AAG CCG GGC AAT TGC TGT GCC A (22 и.о.)

pc lo 5'GAC CGC АТС GAA ACG CAG CAC G (22 и.о.)

Реакция амплификация проводилась в объеме 20 мкл. на амплификаторе «Терцик», ДНК-технологии, (Россия) по программе, приведенной в табл.1.

Таблица 1. Программа амплификации разработанной тест-системы.

Шаг программы Температура, °С Время инкубации, сек. Количество циклов

1 95 120 1

2 95 20

3 62 20 42

4 72 30

5 72 180 1

Алгоритм регулирования — точный.

В реакции использовались праймеры, меченые по одной цепи с биотином. Олигонуклеотиды для иммобилизации на микрочипе синтезировали на автоматическом синтезаторе 394 DNA/RNA Synthesizer ("Applied Biosystems", США).

Состав гибридизационной смеси: 2х SSC, 0,1% SDS. Инкубация при +44°С в течение 60 мин.

Отмывка после гибридизации: 2*SSC 0,1% SDS - 1x5'

lxSSC 0,1%SDS -1x5' 0,5*SSC - 2x5'

Состав реакции конъюгации: l*SSC, 10 мг/мл БСА и конъюгат в разведении 200 раз (конечное разведение в смеси). Конъюгацию проводили 1 час при температуре +28°С

Отмывка после конъюгации: 1 х SSC -2x5'.

Визуализацию, регистрацию и интерпретацию результатов осуществляли с помощью аппаратно-программного комплекса для анализа флуоресценции биологических микрочипов чип-детектора «Флуоген-2», (ММТех, Россия) и компьютерной программы анализа изображений «Gene Inspector.exe»

Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью компьютерной программы «Epi Info 5,0». Достоверность различия средних проверяли с использованием метода дисперсионного анализа. Применимость используемого метода проверяли при помощи анализа размера групп и характера распределения, включая расчет коэффициента эксцентриситета. Разработку прогноза исхода осуществляли при помощи методов многомерного факторного анализа и многомерной линейной регрессии. Анализ клинической ценности проводили на основании расчета кривой соотношения чувствительность/специфичность (Герасимов А.Н., 2007).

Результаты исследования и их обсуждение

На основании анализа представленных в базе данных «GenBank» нуклеотидных последовательностей перечисленных возбудителей были составлены праймеры для амплификации наиболее консервативных участков генов Shigella spp.n ElЕС, Slamonella spp, Campylobacter jejuni, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis. После оптимизации условий амплификации для каждого возбудителя было отобрано по одной паре праймеров с

оптимальными характеристиками и было показано, что амплификация подобранных праймеров в смеси проходит успешно. ПЦР были использованы биотинилинированные праймеры, а детекция результатов гибридизации проводилась за счет образования комплекса ДНК с флуоресцентно-меченным стрептавидином (ФМС), прочно связывающегося с биотином.

Затем был сконструирован чип с иммобилизированными олигонуклеотидами, комплиментарными флюоресцентной цепи олигонуклеотидов пяти искомых возбудителей. Были подобраны оптимальные условия гибридизации, при которых каждый индивидуальный ПЦР фрагмент давал положительный сигнал на гибридизацию только со своим специфическим зондом.

Анализ с применением ДНК-микрочипов можно представить в виде последовательных этапов:

1 .Выделение ДНК из исследуемого материала;

2. Мультипраймерная ПЦР;

3. Гибридизация ПЦР - продуктов с нанесенными на стекло олигонуклеотидами;

4. Детекция результатов гибридизации продуктов ПЦР.

При комплексном ПЦР - исследовании больных генетический материал патогенных кишечных бактерий был выявлен у 80 пациентов, что позволило сократить число больных с неуточненной бактериологическим методом этиологией ОКИ с 98 (66,7%) до 67 человек (45,6%) (табл.1).

Таблица 1. Сравнительные результаты бактериологического и ПЦР -исследования клинического материала на бактериальные возбудители ОКИ

Верифицированный диагноз Метод исследования

Бактериоло гический п=147 ПЦР п=147 ПЦР и бактериологический п=147

абс. % абс. % абс. %

Сальмонелл ез 38 25,9 39 26,5 41 27,9

Острая дизентерия 11 7,5 26 17,7 26 17,7

Кампилобактериоз — — 14 9,5 14 9,5

Микст-инфекция 8Ьще11а+Сатру1оЬас1ег — — 1 0,7 1 0,7

■■ Итого верифицированных 49 33,3 80 54,4 82 55,8

При исследовании методом ПЦР генетический материал Yersinia enterocolitica, а также простейших Giardia lamblia и Entamoeba histolitica обнаружен не был.

Было выявлено, что в группе больных с ПЦР - положительными исследованиями и отрицательными результатами бактериологического исследования достоверно чаще отмечались гастроэнтероколит и колит и характерная для них симптоматика (спазм сигмовидной кишки при пальпации, тенезмы, ложные позывы, примесь в стуле в виде крови и слизи), чем в группе больных, у которых ни одним из двух методов не было выявлено патогенного возбудителя.

Средняя продолжительность лихорадки и диареи, а также среднее содержание палочкоядерных лейкоцитов в крови в период разгара заболевания были достоверно выше у пациентов с положительными результатами ПЦР, не подтвержденными бактериологически, по сравнению с пациентами с неуточненной этиологией ОКИ при использовании обоих методов.

Как и в большинстве зарубежных и отечественных публикаций нами было установлено, что увеличение доли ОКИ уточненной бактериальной этиологии методом ПЦР по сравнению с рутинными методами лабораторной диагностики имеет место за счет увеличения доли выявляемого генетического материала Shigella spp. и EIEC и Campylobacter spp.

Была выявлена достаточно высокая сопоставимость результатов бактериологического и ПЦР исследования в диагностике сальмонеллезов (96,6%), в отличие от сопоставимости этих же двух методов исследования при острой дизентерии ОД (89,1%). Не исюпочепо, что такая дискордантность результатов при диагностике ОД связана действительно с более высокой аналитической чувствительностью метода ПЦР по сравнению с бактериологическим исследованием. Однако, как предполагают некоторые исследователи, группа с положительными результатами ПЦР может быть больше за счет больных с энтероинвазивным эшерихиозом, которые не выявляются бактериологически (микробиологическая диагностика EIEC, как правило, не входит в спектр рутинных задач бактериологических лабораторий) [Подколзин А.Т. с соавт., 2002]. При этом энтероинвазивные E.coli (EIEC) относятся к одной из наиболее таксономически близких к шигеллам rpynnt микроорганизмов и вызывают кишечные инфекции, протекающие с типичной для шигеллезов клинической картиной. [Lan R. Et al, 2001, Pupo G. et al, 1997, James P. et al. 1998]. Поэтому энтероинвазивные

эшерихиозы могут составлять значительную часть заболеваний, регистрируемых, как бактериологически не подтвержденная дизентерия.

Было проведено исследование информативности бактериологического и ПЦР методов диагностики в зависимости от сроков забора материала и выявлено, что средний срок забора материала выше в группе больных ОД, у которых диагноз подтвердился только методом ПЦР (р=0,04). Выявлено также, что информативность метода ПЦР в идентификации микроорганизмов рода Shigella, ELЕС одинакова при заборе материала до и после начала этиотропной терапии, тогда как информативность микробиологического метода достоверно снижается при заборе материала после этиотропной терапии. Кроме того, при анализе возрастной структуры больных того было получено, что средний возраст пациентов достоверно выше в группе больных ОД, у которых диагноз не подтвердился бактериологически, по сравнению с группой с микробиологически подтвержденной (р = 0,035). Мы выявили взаимосвязь между сроками забора материала и приемом этиотропной терапии - при поздних сроках забора материала увеличивалось число больных принимавших этиотропные препараты до забора материала (р<0,001). Также при анализе среднего возраста пациентов и получения этиотропной терапии на догоспитальном этапе было выявлено, что средний возраст пациентов достоверно выше в группе больных, получавших этиотропную терапию на догоспитальном этапе (р=0,019).

Таким образом, было получено, что основной фактор, влияющий на результативность бактериологического исследования при ОД - это прием этиотропных препаратов до забора материала.

При сопоставлении клинических симптомов ОКИ у больных при различных методах верификации диагноза было получено, что клиническое течение ОД, подтвержденной только методом ПЦР и ОД, подтвержденной обоими методами достоверно не отличается, что соответствует данным публикаций отечественных исследователей. Единственное выявленное

достоверное отличие- среднее систолическое и среднее диастолическое давление, которое оказалось достоверно выше в группе больных ОД, у которых диагноз подтвердился только методом ПЦР и это может объясняться и это может объясняться достоверно большим средним возрастом пациентов в этой группе больных.

При сравнении больных кампилобактериозом с больными ОД достоверных отличий не выявлено. По сравнению же с ПТИ неуточненной этиологии у больных кампилобактериозом достоверно чаще встречался такой симптом, как боли в животе, что, по мнению ряда авторов, является одним их характерных симптомов при гастроинтестинальной форме кампилобактериоза (р=0,007).

ДНК условно-патогенных кишечных бактерий было выявлено: у 17 пациентов (11,6%)- Klebsiella pneumoniae, у 4 пациентов (2,7%) - Proteus mirabilis. В 12 случаях Klebsiella pneumoniae была выявлена в виде ассоциаций с патогенньми бактериями - в 6 случаях у больных ОД, у 4 больных ГИФС и у 2 больных ГИФК. Однако достоверно более частого выявления Klebsiella pneumoniae, в ассоциациях с патогенными бактериями, чем в виде моно - форм получено не было.

Интересным оказался тот факт, что ассоциация Shigellas-Klebsiella достоверно чаще выявлялась в группе больных, у которых диагноз ОД был подтвержден только положительными результатами ПЦР исследований, при отрицательных бактериологических результатах, при этом достоверной связи этого факта с приемом этиотропных средств не было выявлено.

В ходе сравнительного анализа особенностей клинической картины моно - инфекций и микст-инфекций было получено, что средняя продолжительность диарейного синдрома была достоверна выше в группе больных с ассоциациями патогенных и условнопатогенных бактерий, чем в группе больных с моно-инфекциями Shigella (рис.2).

Рисунок 2. Средняя продолжительность диарейного синдрома у больных с Shigella и Shigella+Klebsiella.

В результате клинической апробации разработанной диагностической тест- системы основе мультиплексной ПЦР с детекцией результатов с помощью биологических микрочипов и сравнительной характеристики результатов с таковыми при комплексном ПЦР - исследовании больных с использованием существующих коммерческих тест - систем, принятых за референтные, было получено, что методы полностью сопоставимы в отношении диагностической чувствительности и специфичности Shigella spp., EIEC, Campylobacter jejunu, Proteus mirabilis. Сопоставимость результатов идентификации бактерий рода Salmonella составила 99,3 %, при этом диагностическая чувствительность составила?7,44 %, диагностическая специфичность 100%.

Сопоставимость результатов идентификации Klebsiella pneumoniae с использованием разработанной методики и референтных тест - систем оказались сопоставимыми на 98,0%, при этом диагностическая

чувствительность разработанной системы составила 100%, диагностическая специфичность - 98,0%.

При обследовании группы контроля с использованием референтных тест-систем и разработанной тест-системы с использованием биочипов генетический материал патогенных и условно-патогенных бактерий не был обнаружен.

Таким образом, полученные результаты комплексного ПЦР исследования с целью детекции патогенных и условно-патогенных бактерий выявили характерную этиологическую структуру ОКИ бактериальной природы, соответствующую современным представлениям. Примененные однофакторный и многофакторный анализы позволили выявить достоверные признаки, снижающие информативность бактериологического метода и не влияющие на информативность метода ПЦР, которые позволили прогнозировать результаты лабораторных исследований и получать информацию о достоверной предпочтительности метода исследования в каждом конкретном случае. Также были выявлены наиболее частые ассоциации патогенных и условно-патогенных кишечных бактерий, выявляемые у больных ОКИ методом ПЦР и с использованием биологических микрочипов, и некоторые характерные особенности клинического течения ассоциированных инфекций. Клиническая апробация разработанной мультиплексной тест системы с детекцией результатов с использованием биологических ДНК - микрочипов показала диагностическую специфичность и чувствительность, сопоставимую таковым референтных тест - систем.

ВЫВОДЫ:

1. Разработана диагностическая тест-система на основе ДНК-микрочипов для единовременного выявления и идентификации патогенных (Salmonella, Shigella и EIEC, Campylobacter) и условно-патогенных (Klebsiella, Proteus) возбудителей острых кишечных инфекций в копрофильтрате.

2.0птимизированы условия постановки мультиплексной ПЦР с оригинальными праймерами, позволяющими обеспечить чувствительность и специфичность, не уступающую чувствительности и специфичности используемых в настоящее время ПЦР-тест-систем для идентификации аналогичных возбудителей.

3. Использование метода ПЦР, так же, как и метода разработанного на основе мультиплексной ПЦР с использованием ДНК-микрочипа в клинических условиях позволяет повысить процент верификации этиологического диагноза ОКИ с 33,3% до 54,4%.

4. Использование разработанного ДНК-биочипа позволило установить в 9,6% случаев смешанную патологию: Shigella + Klebsiella в 4,1%, Salmonella +Klebsiella в 2,7% случаев, Campylobacter + Klebsiella в 1,4% случаев, а также единичные случаи ассоциированного выявления Salmonella + Proteus и Shigella + Campylobacter + Klebsiella.

5. Длительность диарейного синдрома в группе больных с микст-инфекцией Shigella+Klebsiella достоверно продолжительнее, чем у больных с моноинфекцией Shigella.

6. Информативность и результативность метода ПЦР, как и разработанного метода с использованием ДНК-микрочипов не изменяется при раннем применении антибактериальной терапии, в отличие от информативности и результативности рутинного бактериологического исследования.

7. В группе больных с ОД, подтвержденной только методом ПЦР достоверно чаще выявляются ассоциации с Klebsiella pneumoniae, чем в группе больных, у которых диагноз был подтвержден и бактериологическим методом.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Разработан новый отечественный набор - мультиплексная ПЦР тест-система с детекцией результатов с помощью ДНК-микрочипов для диагностики острых кишечных инфекций. Тест-система позволяет в течение 12-14 часов протестировать диагностический материал (копрофильтрат) на наличие пяти микроорганизмов - патогенных и условно-патогенных возбудителей ОКИ (Shigella spp. +Е1£С, Salmonella spp., Campylobacter jejuni, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis).Чувствительность и специфичность разработанной тест-системы не уступает применяемым в настоящее время в практике ПЦР тест-системам для идентификации аналогичных возбудителей.

Применение разработанного нами метода может быть рекомендовано при необходимости быстрого и единовременного выявления необходимого спектра возбудителей ОКИ на большом клиническом материале, а также в комплексной диагностике ОКИ наряду с рутинными методами диагностики.

Список печатных работ, опублиованпых по теме диссертации:

1. Красавина Э.Н., Пак С.Г., Белушкина Н.Н., Полуэктова В.Б., Мартынова Н.Н., Городнова Е.А., Айвазян С.Р., Дмитриева JI.H., Малов В.А. Апоптоз полиморфноядерных лейкоцитов периферической крови и его начальные проявления у больных при заболеваниях, вызванных энтеропатогенными бактериями. // Вопросы биологической медицинской и фармацевтической химии. -2006. - № 4. - С. 42-45.

2. Айвазян С.Р., Малов ВА., Дмитриева Л.Н., Асоян A.B., Мхитарян A.JI., Белецкий И.П. Эффективность метода ПЦР в верификации острых кишечных инфекций // Научные труды VIII международного конгресса "Здоровье и образование в XXI веке; концепции болезней цивилизации" -2007-РУДН, Москва, с. 100

3. Айвазян С.Р., Пономарев C.B., Малов В.А., Асоян A.B., Красавина Э.Н., Атоян Л.Ф., Белецкий И.П. Диагностические возможности полимеразной цепной реакции в верификации острых кишечных инфекций // Тезисы научно-исторической конференции, посвященной 300-летию со дня открытия ГКВГ им. Н.Н.Бурденко «Роль Московской гошпитали в становлении и развитии отечественного гасударственного больничного дела, медицинского образования и науки» - 2007- Москва, с. 33.

4. Красавина Э.Н., Пономарев C.B., Шабалина О.Ю., Дмитриева Л.Н., Кондрашика Е.В., Малов В.А., Айвазян С.Р. Взаимосвязь лейкоцитарного индекса интоксикации с начальными проявлениями апоптоза полиморфно-ядерных лейкоцитов у больных острыми кишечными инфекциями в динамике заболеавния И Тезисы научно-исторической конференции, посвященной 300-летию со дня открытия ГКВГ им. Н.Н.Бурденко «Роль Московской гошпитали в становлении и развитии отечественного гасударственного больничного дела, медицинского образования и науки» -2007- Москва- с. 99.

5. Айвазян С.Р., Малов В.А., Дмитриева Л.Н., Шмавонян М.В., Атоян Л.Ф. Эффективность метода ПЦР в верификации сальмонеллеза и шигеллеза по сравнению с рутинными методами диагностики. // Тезисы научно-практической конференции, посвященной 75- летию кафедры инфекционных болезней РМАПО. -2008.-Москва.-с.125

6. Айвазян С.Р., Грановский И.Э., Белецкий И.П., Малов ВА. Сравнительная характеристика методов диагностики острых инфекционных диарейных заболеваний (ОИДЗ) бактериальной природы. // Материалы российской научно- практической конференции «Инфекционный болезни: современные проблемы диагностики и лечения» - 2008- Санкт - Петербург, с.6

7. Пономарев С.В., Малов В.А., Айвазян С.Р., Белая О.Ф., Кубенский Е.Н. Инфекция Clostridium difficile в практике многопрофильного стационара. // Тезисы всероссийской научно - практической конференции с международным участием «Современные алгоритмы диагностики и стандарты лечения в клинической медицине»- 2008- Москва-с. 249-250

8. Малов В .А., Горобченко А.Н., Айвазян С.Р., Городнова Е.А. Реактивный артрит после острых инфекционных диарейных заболеваний: этиопатогенетические и клинические аспекты проблемы. // Терапевтический архив.-2008,- Том 80.- №11.- с. 81-85

9. Айвазян С.Р., Грановский И.Э., Филиппова В.В., Воронцова Н.И., Малов В.А., Белецкий И.П. Современная лабораторная диагностика острых кишечных инфекций. // Молекулярная медицина. - 2009.-№3.- с.3-8

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АДД артериальное давление диастолическое

АДС артериальное давление систолическое

ВКА внутренний контроль амплификации

ГИФК гастроинтестинальная форма кампилобактериоза

ГИФС гастроинтестинальная форма сальмонеллёза

ГЭ гастроэнтеритический вариант

мкМ микромоль

мМ милимоль

ОД острая дизентерия

ОКИ острые кишечные инфекции

ПТИ НЭ пищевые токсикоинфекции неуточненной этиологии

ПЦР полимеразная цепная реакция

пл. пара нуклеотидов

УПЭ условно-патогенные энтеробактерии

ФМС флюоресцентно меченный стрептавидин

ЭДТА этилендиаминтетраацетат

ЭПКП энтеропатогенные кишечные палочки

А аденин

G гуанин

С цитозин

Т тимин

Е\ЕС энтероинвазивная Escherichia coli

Подписано в печать:

01.10.2009

Заказ № 2633 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

 
 

Оглавление диссертации Айвазян, Сона Робертовна :: 2009 :: Москва

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ.4

ВВЕДЕНИЕ.6

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.13

1.1. СОВРЕМЕННАЯ ЭТИОЛОГИЧЕСКАЯ И

ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА . ОКИ

БАКТЕРИАЛЬНОЙ ПРИРОДЫ .13

1.2. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ЭТИОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ОКИ.20

1.3. БИОЛОГИЧЕСКИЕ МИКРОЧИПЫ: ОСНОВНЫЕ СВЕДЕНИЯ, ПРИНЦИП РАБОТЫ, ПРИМЕНЕНИЕ В

ПРАКТИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНЕ.33

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.41

ГЛАВА 3. КЛИНИКО-ЛАБОРАТОРНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА

БОЛЬНЫХ ОКИ.51

ГЛАВА 4. КЛИНИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ПЦР В ВЫЯВЛЕНИИ ПАТОГЕННЫХ И УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫХ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ

ОКИ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ПРИРОДЫ.71

4.1 Общая сравнительная характеристика бактериологического и ПЦР исследований в выявлении бактериальных возбудителей

ОКИ.71

4.2. Клиническая оценка ПЦР исследования в диагностике гастроинтестинальной формы сальмонеллеза (ГИФС).77

4.3. Клиническая оценка ПЦР исследования в диагностике острой дизентерии (ОД).79

4.4. Клинико-лабораторная характеристика больных с уточненным методом ПЦР кампилобактериозом.83

4.3. Клинико-лабораторная характеристика больных с выявленными методом ПЦР условно-патогенными кишечными бактериями.89

ГЛАВА 5. ХАРАКТЕРИСТИКА ДНК - МИКРОЧИПОВ ДЛЯ

ИДЕНТИФИКАЦИИ БАКТЕРИЙ КИШЕЧНОЙ ГРУППЫ.92

5.1. Разработка мультипраймерной ПЦР - системы для идентификации патогенных и условно патогенных кишечных бактерий.92

5.2. Оптимизация условий гибридизации.98

5.2. Клиническая апробация тест-системы с использованием биологических микрочипов в этиологической верификации

ОКИ.101

 
 

Введение диссертации по теме "Инфекционные болезни", Айвазян, Сона Робертовна, автореферат

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

Острые кишечные инфекции (ОКИ) остаются одними из самых актуальных инфекционных заболеваний в связи с повсеместной распространенностью и развитием у части больных состояний, представляющих непосредственную угрозу жизни [92, 94, 194, 203]. Не только в развивающихся, но и в индустриально развитых странах, несмотря на определенные успехи в диагностике и лечении, проблема ОКИ стоит достаточно остро [3, 42, 52, 71, 106, 127, 203]. Веским аргументом, подтверждающим значимость этой проблемы в патологии человека, являются наблюдаемые в настоящее время качественные изменения в структуре и характере течения острых кишечных заболеваний [106, 156, 202]. Спектр часто выявляемых при ОКИ патогенных кишечных микроорганизмов заметно расширился как за счет вирусных, так и бактериальных возбудителей. Во многих странах наряду с сальмонеллами, шигеллами, ротавирусами все чаще этиологическим фактором являются энтерогеморрагические штаммы Escherichia coli, Campylobacter jejuni, возросла этиологическая роль условнопатогенной микрофлоры, в частности, бактерий рода Proteus, Klebsiella и др. в развитии ОКИ [87, 97, 109, 116, 118, 120, 166]. Подобные эволюционные изменения в структуре ОКИ требуют совершенствования их лабораторной диагностики с использованием более новых и высокочувствительных диагностических методов. Кроме того, необходимо отметить, что лабораторная диагностика возбудителей является весьма важным аспектом не только эпидемиологического мониторинга, но и прогноза течения и вероятности проявления отдаленных последствий ОКИ иммунодефицитного, аллергического и аутоиммунного характера [135, 209]. В широкой практике отечественных медицинских учреждений возможности идентификации возбудителей ОКИ весьма ограничены. В соответствии с официальной статистикой федерального Центра Госсанэпиднадзора РФ, в период с 2000 по 2004 год регистрировалось до 65-75% ОКИ с неустановленной этиологией. В 2006 г. заболеваемость ОКИ неустановленной этиологии составила 306,0 на 100 000 населения [42].

Однако по данным большинства зарубежных публикаций эффективность этиологической верификации ОКИ намного более высокая [103, 106, 124, 128, 166]. Исходя из приведенных данных, можно прийти к заключению, что существующие в настоящее время рутинные методы диагностики ОКИ в России продолжают нуждаться в совершенствовании.

В последние десятилетия в диагностике инфекционных болезней, как и в других областях медицины все более широко применяется метод полимеразной цепной- реакции (ПЦР). В отечественной литературе уже имеется ряд сообщений о преимуществе метода полимеразной цепной реакции в этиологической расшифровке ОКИ, в частности, вирусных диарей [18, 43, 50, 51]. Особенно перспективными в диагностике ОКИ являются методы, основанные на мультиплексной ПЦР, когда появляется возможность единовременного выявления широкого спектра возбудителей, что существенно сокращает сроки этиологической верификации диагноза. Такие характерные особенности ОКИ, как однотипная клиническая картина заболевания, развитие вспышек с вовлечением большого количества больных приводят к необходимости более широкого использования подобных методов в диагностике ОКИ.

Одним из наиболее быстро развивающихся экспериментальных направлений современной биологии являются биологические микрочипы [34, 35, 38]. Биологические ДНК - чипы предназначены для быстрого секвенирования, то есть определения нуклеотидной последовательности дезоксирибонуклеиновой кислоты в исследуемой пробе, в основе которого лежит принцип гибридизации ее с флюоресцентным олигонуклеотидом. Тип ДНК-микрочипов, так называемые «чипы с низкой плотностью» (low density microarrays), достаточно широко применяются для обнаружения различных инфекционных агентов. Основным достоинством такого подхода является возможность быстрого и одновременного выявления, множества потенциальных патогенов бактериальной и вирусной природы [137]. У нас в стране известны биочипы, выпускаемые ИМБ РАН для диагностики туберкулеза, сибирской язвы и вируса иммунодефицита - HIV [10, 157, 175].

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью диссертационной работы явилась, разработка и клиническое применение биологических ДНК - микрочипов в этиологической верификации острых кишечных инфекций бактериальной природы.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Разработать и оптимизировать методику детекции генетического материала; основных возбудителей острых кишечных инфекций бактериальной этиологии в копрофильтрате с применением: биологических ДНК-микрочипов.

2. Дать сравнительную характеристику диагностической: эффективности бактериологического и ПЦР методов исследования: в. этиологической расшифровке ОКИ бактериальной:природы.

3. Изучить особенности клинического течения ОКИ у больных в зависимости от метода верификации диагноза.

4. Оценить диагностические возможности детекции бактериальных возбудителей ОКИ с использованием ДНК-микрочипов: на клиническом материале в сопоставлении с результатами- референтного ПЦР исследования.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Впервые разработана диагностическая ПЦР тест-система для детекции трех патогенных и двух условно-патогенных микроорганизмов бактериальных возбудителей острых кишечных инфекций: Salmonella spp.,

Shigella spp. и Enteroinvasive Escherichia coli (ElEC), Campylobacter jejuni, Klebsiella pnneumoniae, Proteus mirabilis.

Впервые разработана методика идентификации бактериальных возбудителей острых кишечных инфекций с использованием ДНК-микрочипов.

Клинически обосновано применение биологических микрочипов в диагностике острых кишечных инфекций путем применения метода на копрофильтрате больных острыми кишечными инфекциями различной этиологии.

Дана сравнительная характеристика метода диагностики ОКИ с использованием ДНК-микрочипов с бактериологическим и ПЦР методами диагностики, описаны факторы, влияющие на результативность и информативность различных методов этиологической верификации ОКИ.

При использовании биологических ДНК-микрочипов описаны особенности клинического течения ОКИ при выявлении ассоциаций патогенных кишечных бактерий и условно-патогенных бактерий рода Klebsiella pneumoniae и Proteus mirabilis.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Предложен новый отечественный набор реактивов для диагностики острых кишечных инфекций бактериальной этиологии, который позволяет в течение 12-14 часов протестировать диагностический материал (копрофильтрат) на наличие пяти микроорганизмов - патогенных и условно-патогенных возбудителей ОКИ.

Разработанная мультиплексная ПЦР тест-система позволяет единовременно выявлять в исследуемом материале следующие микроорганизмы: Shigella spp.+ElEC, Salmonella spp., Campylobacter jejuni, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis и не уступает по чувствительности и специфичности применяемым в настоящее время в практике ПЦР тест-системам для идентификации аналогичных возбудителей.

Результаты клинического применения метода позволили показать возможность использования методики на материале, полученном от больных.

Сравнительно невысокая себестоимость, автоматизация и неинвазивность диагностического процесса являются несомненными преимуществами предлагаемого метода олигонуклеотидного биочипа для диагностики ОКИ бактериальной этиологии.

Применение разработанного нами метода может быть рекомендовано при необходимости быстрого и единовременного выявления широкого спектра возбудителей на большом клиническом материале, а также в комплексной диагностике ОКИ наряду с рутинными методами диагностики.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

Разработана диагностическая тест-система на основе мультиплексной ПНР для единовременного выявления и идентификации ДНК патогенных и условно-патогенных возбудителей острых кишечных инфекций, а именно Shigella spp.+EIEC, Salmonella spp., Campylobacter jejuni, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, характеризующаяся высокой специфичностью и чувствительностью, не уступающей специфичности и чувствительности используемых в настоящее время тест-систем для идентификации аналогичных возбудителей.

Разработан биологический ДНК - микрочип для комплексной этиологической верификации ОКИ бактериальной природы.

Информативность бактериологического исследования в этиологической верификации ОКИ достоверно уменьшается при заборе материала после использования антибактериальных препаратов, тогда как информативность метода ПНР после этиотропной терапии достоверно не меняется.

При использовании биологических микрочипов появляется возможность сократить сроки исследования по сравнению с рутинными методами диагностики, выявлять ассоциации микроорганизмов, характерные для острых кишечных инфекций, а также описать особеноости клинического течения при выявлении ассоциаций патогенных и условнопатогенных кишечных бактерий Shigella+Klebsiella, в отличие от моно-инфекцией Shigella.

ВНЕДРЕНИЕ В ПРАКТИКУ

Разработанная мультиплексная система для идентификации возбудителей ОКИ бактериальной природы с детекцией результатов с использованием биологических ДНК-микрочипов «ММТест-ОКИ-ПЦР-Биочип» успешно прошла первый этап испытаний в диагностической лаборатории НИИ скорой помощи им. Н.В. Склифософского. Материалы работы включены в учебный курс кафедры инфекционных болезней ММА им. И.М. Сеченова и используются в учебном процессе при преподавании соответствующего раздела.

АПРОБАЦИЯ ДИССЕРТАЦИИ

Основные положения и результаты исследования были обуждены на VIII международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке; концепции болезней цивилизации» (Москва, РУДН, ноябрь, 2007); научно-исторической конференции, посвященной 300-летию со дня открытия ГКВГ им. Н.Н. Бурденко «Роль Московской гошпитали в становлении и развитии отечественного государственного больничного дела, медицинского образования и науки№ (Москва, 2007), на научно-практической конференции, посвященной 75-летию кафедры инфекционных болезней РМАПО (Москва, 2008), на научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы гастроэнтерологии» (Василенковские чтения), посвященной памяти академика В.Х. Василенко (20 ноября, 2008г., Москва), а также на научно-практических конференциях кафедры инфекционных болезней и общебольничных конференциях 4 ГКБ. Диссертация апробирована на совместном заседании кафедры инфекционных болезней, лаборатории по изучению токсических и септических состояний ГОУ ВПО ММА им. И.М. Сеченова и лаборатории генной инженерии ГОУ ВПО ММА им. И.М. Сеченова 13 июня 2009г.

ПУБЛИКАЦИИ

По теме диссертации опубликовано 9 научных работ.

 
 

Заключение диссертационного исследования на тему "ПРИМЕНЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ ДНК-МИКРОЧИПОВ В ЭТИОЛОГИЧЕСКОЙ ВЕРИФИКАЦИИ ОСТРЫХ КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ПРИРОДЫ"

ВЫВОДЫ

1. Разработана диагностическая тест-система на основе ДНК-микрочипов для единовременного выявления и идентификации патогенных {Salmonella, Shigella и EIEC, Campylobacter) и условно-патогенных {Klebsiella, Proteus) возбудителей острых кишечных инфекций в копрофильтрате. 2.Оптимизированы условия постановки мультиплексной ПЦР с оригинальными праймерами, позволяющими обеспечить чувствительность и специфичность, не уступающую чувствительности и специфичности используемых в настоящее время ПЦР-тест-систем для идентификации аналогичных возбудителей.

3. Использование метода ПЦР, также, как и метода разработанного на основе мультиплексной ПЦР с использованием ДНК-микрочипа в клинических условиях позволяет повысить процент верификации этиологического диагноза ОКИ с 33,3% до 54,4%.

4. Использование разработанного ДНК-биочипа позволило установить в 9,6% случаев смешанную патологию: Shigella + Klebsiella в 4,1%, Salmonella -^Klebsiella в 2,7% случаев, Campylobacter + Klebsiella в 1,4% случаев, а также единичные случаи ассоциированного выявления Salmonella + Proteus и Shigella + Campylobacter + Klebsiella.

5. Длительность диарейного синдрома в группе больных с микст-инфекцией ShigellasKlebsiella достоверно продолжительнее, чем у больных с моноинфекцией Shigella.

6. Информативность и результативность метода ПЦР, как и разработанного метода с использованием ДНК-микрочипов не изменяется при раннем применении антибактериальной терапии, в отличие от информативности и результативности рутинного бактериологического исследования.

7. В группе больных с ОД, подтвержденной только методом ПЦР достоверно чаще выявляются ассоциации с Klebsiella pneumoniae, чем в группе больных, у которых диагноз был подтвержден и бактериологическим методом.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Разработан новый отечественный набор - мультиплексная ПЦР тест-система с детекцией результатов с помощью ДНК-микрочипов для диагностики острых кишечных инфекций. Тест-система позволяет в течение 12-14 часов протестировать диагностический материал (копрофильтрат) на наличие пяти микроорганизмов — патогенных и условно-патогенных возбудителей ОКИ {Shigella spp. +ELEC, Salmonella spp., Campylobacter jejuni, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis). Чувствительность и специфичность разработанной тест-системы не уступает применяемым в настоящее время в практике ПЦР тест-системам для идентификации аналогичных возбудителей.

Применение разработанного нами метода может быть рекомендовано при необходимости быстрого и единовременного выявления необходимого спектра возбудителей ОКИ на большом клиническом материале, а также в комплексной диагностике ОКИ наряду с рутинными методами диагностики.

 
 

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2009 года, Айвазян, Сона Робертовна

1. Алиева Е.В., Афанасьев Е.Н., Тюменцева И.С. Новое в диагностике кампилобактериоза и листериоза. // Вестник Российской военно-медицинской академии. - СПб. - 2006. — Приложение 1(15). — С.221

2. Барский В., Колчинский А., Лысов Ю., Мирзабеков А. Биологические микрочипы, содержащие иммобилизованные в гидрогеле нуклеиновые кислоты, белки и другие соединения: свойства и приложения в геномике //Мол. биол.- 2002. Т. 36. - С.563-584.

3. Бондаренко В. М. Факторы патогенности бактерий и их роль в развитии инфекционного процесса. // Журн. микробиол.- 1999. №5.-С.34-39

4. Бондаренко В. М. «Острова» патогенности бактерий. // Журн. микробиол,- 2001,- №4. С.67-74

5. Бондаренко В. М. Дисбактериоз кишечника как клинико-лабораторный синдром: современное состояние проблемы // В. М. Бондаренко, Т. В. Мацулевич. — М.: ГОЭТАР-Медиа,- 2006. С.304

6. Бродов Л.Е., Ющук Н.Д., Малеев В.В. Диагностика и лечение острых кишечных инфекций. // Эпидемиология и инфекционные болезни. — 1997.- №4. С.4-6.

7. Воробьев А.А., Сичинский Л.А., Дратвин С.А. Возможности лабораторной диагностики инфекций, вызванных бактериями рода Campylobacter. // Журнал микробиологии и эпидемиологии.- 2000.-№1.- С.95-103

8. Герасимов А.Н. Медицинская статистика: Учебное пособие. М.: ООО «Медицинское информационное агенство». - 2007.- 480 с.

9. Ю.Грядунов Д., Михайлович В., Носков А., Лапа С., Соболев А., Паньков С., Рубина А., Заседателев А., Мирзабеков А. // Обнаружение Bacillus Anthracis методом мультиплексной ПЦР на олигонуклеотидных биочипах. Докл. Акад. Наук. 2001.- Т. 381. - №2.- С.265.

10. П.Гюлазян Н.М., Белая О.Ф., Малов В.А., Пак С.Г. Клинические и диагностические особенности смешанных острых кишечных инфекций //Международный Евро-Азиатский конгресс по инфекционным болезням. Витебск, Беларусь.- 5-6 июня.- 2008.- С. 130.

11. Екимов А.Н., Шипулин Г.А., Бочкарев Е.Г., Рюмин Д.В. Новейшие технологии в генодиагностике: полимеразная цепная реакция в реальном времени (Real- time PCR). //Вестник последипломного медицинского образования. -2001.- №3.- С.4-8

12. Жеребцова Н.Ю., Валишин Д. А., Мавзютов А.Р. Перспектива генетической оценки потенциальной патогенности условно-патогенных энтеробактерий, выделенных при острых кишечных инфекциях. // Клиническая лабораторная диагностика. 2006. - №9. - С.50-51.

13. Ивашкин В.Т., Шептулин А.А., Баранская Е.К., Секачева М.И. Рекомендации по обследованию и лечению больных с синдромом острой диареи. // Методическое пособие для врачей.- Москва.- 2002.-С.17

14. Игнатюк Т.Е., Голутвин И.А., Насикан Н.С., Иванова О.Е., Еремеева Т.П. Применение атомно-силовой микроскопии для детекции кишечных вирусов. // Вопросы вирусологии.- №6. -2003.- С.66-69

15. Ильина Е.Н. Актуальные аспекты типирования микробов и вирусов. // Материалы V Всероссийской научно практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней»,- Москва.- 2004.- Том 2.-С.32-33

16. Клинико-лабораторная диагностика инфекционных болезней. // Руководство для врачей.- СПб.: Фолиант.- 2001.- С. 273-276.

17. Колупаев В.Е. Преимущества метода ПЦР в реальном времени (Real Time PCR). //Сборник тезисов IV Всероссийской научно-практической конференции ««Генодиагностика инфекционных болезней» Москва.-2002.-С. 182-185

18. Кэрри Б. Мюллис. Необычная история о том, как родилась полимеразная цепная реакция. //В мире науки (Scientific American) Июнь № 6.-1990- Ст.Петербург.- 2006

19. Лобзин Ю. В. Дисбактериоз кишечника (клиника, диагностика, лечение): руководство для врачей / Ю. В. Лобзин, В. Г. Макарова, Е. Р. Корвякова, С. М. Захаренко. — СПб.: ООО «Издательство ФОЛИАНТ».- 2006.- 256с.

20. Лучшев В.И., Шахмарданов М.З., Корнилова И.И. и соавт. Шигеллёз Флекснера (клиника, диагностика, лечение). // Методические рекомендации.- Москва.- 2000.-22с.

21. Мавзютов А.Р., Фиалкина С.В., Бондаренко В.М. «Острова» патогенности условно-патогенных энтеробактерий //Журн. микробиол.-2002.- №6.- С.5-9.

22. Малов В. А. Горобченко А. Н., Дмитриева Л. Н. Острые инфекционные диарейные заболевания: вопросы терапии // Лечащий врач.- 2007.- №5.-С.67-72.

23. Медицинские лабораторные технологии // под ред. А.И. Карпищенко.-СПб.: Интермедика.- 2002,- Т.2.- 600 с.

24. Милютина Л.Н., Гурьева О. В., Рожнова С. Ш. Эволюция лекарственной резистентности Salmonella enteritidis, выделенных от детей. //Эпидемиол. и инфекц. Болезни.- 2008.- № 2.- С.44-47.

25. Мирзабеков А.Д. Биочипы в биологии и медицине. //Вестник Российской Академии наук. 2003.- Т.73.- №5.- С.412

26. Мирзабеков А.Д. с соавт.- 2004.- Патент РФ № 2175972.

27. Михайлович В.М., Наседкина Т.В., Рубина А.Ю., Чечеткин В.Р., Прокопенко Д.В. Заседателев А.С. Биочипы для медицинской диагностики. // Лабораторная диагностика России 2007/2008: Справочник. С-Пб.:Человек.- 2007.- с.43-46

28. Молекулярная клиническая диагностика. //Методы: пер. с англ. под ред. С. Херрингтона и<Дж. Макги. -М.: Мир.- 1999.-558с.

29. Пак С.Г. Инфекционные болезни: взгляд через призму времени (Актовая речь). М.: Издание ГОУ ВПО ММА им. И.М. Сеченова.-2005. -44 с.

30. Пак С.Г., Пальцев М.А., Турьянов М.Х. Сальмонеллёз. М.: Медицина.- 1986.- 304 с.

31. Пальцев М.А. Фундаментальные науки и развитие молекулярной медицины. // Молекулярная медицина.- 2003.- №1.- С.4-11

32. Письмо департамента Государственного Санитарно-Эпидемиологического Надзора от 16 апреля 2004 г. N 1100/1067-04-113 «О мерах по совершенствованию эпиднадзора за кампилобактериозами».

33. Письмо Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав ■ потребителей и благополучия человека от 18 июня 2008 года № 01/63558-32 "Об улучшении эпидемиологического надзора за сальмонеллезами в Российской Федерации".

34. Подколзин А.Т., Мухина А.А. Шипулин Г.А., Кузьмина В. Н. и соавт. Изучение этиологии острых кишечных инфекций у детей, госпитализированных в инфекционные отделения стационаров Москвы. // Инфекционные болезни.- 2004.- Том 2.- № 4.- С. 85-91.

35. Подколзин А.Т., Мухина А.А., Шипулин Г.А., Малеев В.В. Калицивирусная инфекция. //Инфекционные болезни,- 2004.- Т.2.- №2.-С.64-73

36. Подколзин А. Т., Фенске Е.Б., Абрамычева Н.Ю., Шипулин Г.А. и др. Сезонность и возрастная структура заболеваемости острымикишечными инфекциями на территории РФ //Терапевтический архив. -2007. -№11. -С. 10-16

37. Поздеев O.K. Медицинская микробиология. // Под редакцией В.М. Покровского. -2 изд., испр,- М.: ГОЭТАР-МЕД.-2004.- 768 с.

38. Поздеев O.K., Федоров Р.В. Энтеробактерии: руководство для врачей. // М.: ГЭОТАР -Медиа- 2007.- 720 с.

39. Покровский В.И., Онищенко Г.Г., Черкасский Б.Л. Эволюция инфекционных болезней в России в XX веке. //М.: Медицина.- 2003.-664с.

40. Покровский В.И., Ющук Н.Д. Бактериальная дизентерия. М.: ' Медицина.- 1994.- 256 с.

41. Сапронов Г., Трякина И. Энтеровирусные инфекции. //Мед. газ. 2007. -№ 49. - С. 8-9.

42. Северин Е.С., Пальцев М.А. История и современное состояние молекулярной диагностики. //Молекулярная медицина.- 2006.- №4.-С.13-25

43. Сергевнин В.И. Этиологическая структура и экологическая классификация острых кишечных инфекций // Эпидемиология* и инфекционные болезни. 1997. - № 6. - С.8-9.

44. Сидоренко С.В. Микроорганизмы семейства Enterobacteriaceae: клиническое значение и этиотропная терапия. Consilium Medicum.-2004.- Том.6.- №1.-С.78-80

45. Туркадзе К.А. Значение определения генов инвазивности, шигоподобных и энтеротоксинов методом ПЦР для клиники идиагностики острой дизентерии. //Автореф., дисс. канд. мед. н. М.-2003.

46. Шляпникова Е.А., Шляпников Ю.М., Грановский И.Э., Афанасьева, Г.В., Гаврюшкин А.В., Белецкий И.П. Биологические микрочипы в медицине. Лабораторная диагностика России 2007/2008: Ежегодный справочник. //СпБ.: Человек.-2007,- С.43-46

47. Шувалова Е.П. Ошибки в диагностике инфекционных болезней: Монография. Изд. 4-е, перераб., доп. //М.: Медицина.- 2001.- С.27.

48. Шувалова Е.П., Беляева Т.В., Осипова Г.И. Клиника, диагностика и терапия дизентерии. //Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии.-1997.- № 5.- С.60-66.

49. Эллиот В. Биохимия и молекулярная биология. Пер. с англ. // М.:

50. МАИК «Наука/Интерпериодика».- 2002.- 446с. 69.Эпидемиологический надзор и профилактика энтеровирусной (неполно) инфекции. Методические Указания МУ 3.1.1.2363-08. -Москва.- 2008.

51. Ющук Н.Д., Бродов Л.Е. Острые инфекционные диарейные заболевания. // Мед. Газета.- 2000.- №31

52. Ющук Н.Д., Маев И.В., Гуревич К.Г., Бродов Л.Е. Современные принципы лечения диареи. //Тер. архив. 2002. - № 2. - С.73-78.

53. Ющук Н.Д., Шестакова И.В. Проблемы лабораторной диагностики иерсиниозов и пути их решения. // Журн. микробиол.-2007.- № 3.- С. 61 -66.

54. Abu-Elyazeed R., Wierzba T.F., Frenk R.W. Epidemiology of Shigella-associated diarrhea in rural Egiptian Children. //Am. J. Trop. Med. Hyg.-71(3).- 2004.- P. 367-372

55. Adekunle O.C., Coker A.O., Kolawole D.O. Incidence, isolation and characterization of Campylobacter species in Osogbo, Nigeria. // Biology and Medicine.-2009.- Vol. 1 (l).-P. 24-27.

56. Alizadeh A.A., Eisen M.B., Davis RE, Ma C, Lossos IS. Distinct types of diffuse large B-cell lymphoma identified by gene expression profiling. //Nature .-2000.- 403.- P.503-511

57. Alios В. M. Campylobacter jejuni infections: update on emerging issues and trends. //Clin. Infect. Dis. -2001,- Vol.32.-No.8.-P.1201-6

58. Altekruse S.F., Stern N.J., Fields P.I., Swerdlow D.L. Campylobacter jejuni— An emerging foodborne pathogen. //Emerging Infectious Diseases.-1999.-Vol.5-No.l.-P.28-35

59. Ansaruzzaman M., Bhuiyan N.A., Begum Y.A., Characterization of enterotoxigenic Escherichia coli from diarrhoeal patients in Bangladesh' using phenotyping and genetic profiling. //Journal of Medical Microbiology.- 2007.-Vol.56.-P.217-222

60. Aranda K.R., Fagundes-Neto U., Scaletsky I.C. Evaluation of multiplex PCRs for diagnosis of infection with diarreagenic Escherichia coli and Shigella spp. // J Clin Microbiol.- 2004.- Dec.- Vol.42.-No.l2.-P.5849-53

61. Archacki S., Wang Q. // Expression profiling of cardiovascular disease. Hum Genomics.- 2004.-Vol.l.- No.5.- P. 355-370.

62. Arnheim N., Erlich H. Polymerase chain reaction strategy // Annu. Rev. Biochem.- 1992.-Vol. 61.-P. 131-156

63. Barsky Ya., Grammatin A., Ivanov A., Kreindlin E., Kotova E., Barskii V., Mirzabekov A. // Wide-field luminescence microscopes for analyzing biological microchips. J. Opt. Technol. -1998. -V.65. -No.ll.- P. 938.

64. Bavykin S.G., Akowski J.P., Zakhariev V.M., Barsky V.E., Mirzahekov A.D. Microbial identification: A portable system for sample preparation and oligonucleotide microarray hybridization // Appl. & Environ. Microbiology. 1997.- Vol. 67.- P. 922-928.

65. Berg R.D. The indigenous gastrointestinal microflora. //Biochem. Pharmacol.-1996.- Jun 15,- Vol. 47.-No.-12.- P.2294-2297.

66. Blanchard A.P., Kaiser R.J., Hood L.E. High density oligonucleotide arrays. // Biosensors & Bioelectronics.- 1996.-No.l l.-P. 687-690.

67. Blanton LH, Adams SM, Beard RS, et al. Molecular and epidemiologic trends of caliciviruses associated with outbreaks of acute gastroenteritis in the United States, 2000-2004. //J. Infect. Dis.- 2006.-Vol.193.-No3.- P.413-421.

68. Bosch A. Human enteric viruses in the water environment: a minireview. //Internal Microbiol.- 1998,- Vol.l.-P. 191-196

69. Bounnanh P., Sithivong N. et al. Pathogenesity of Shigella in healthy carriers: a study in Vientiane, Lao People's Democratic Republic. //Jpn. J. Infect. Dis.-2005.- Vol.58.- P. 232-234

70. CDC. FoodNet Surveillance Report for 2004 (Final Report). P.7-15

71. CDC. Turtle-associated salmonellosis in humans—United States, 20062007. MMWR Morb Mortal Wkly Rep.- 2007.-Vol.56.-No.26.-P.649-652.

72. Centers for Disease Control and Prevention. Diagnosis and Management of Foodborne Illnesses: a Primer for Physicians. // MMWR -2001.-Vol.50.-No. RR-2.- P.4

73. Cho S.-H., Kim J.-H., Kim J.-C. Surveillance of Bacterial Pathogens Associated with Acute Diarrheal Disease in the Republic of Korea During One Year, 2003. // The Journal of Microbiology.-2006.- Vol.44.-No.3.-P:327-335.

74. Choudary P.V., Molnar M., Evans S.J. et al. Altered cortical glutamatergic and GABAergic signal transmission with glial involvement in depression. //Proc Natl Acad Sci USA.- 2005.-Vol.102.- No.43.- P. 15653-58.

75. Clarke S.C. Diarrhoeagenic Escherichia coli: an emerging problem? Diagn. Micrbiol.Infect. Dis.-2001.-Vol.41- P.93-98

76. Clarke P.A., te Poele R., Wooster R., Workman P. //Gene expression microarray analysis in cancer biology, pharmacology and drug development: progress and potential. Biochem. Pharmacol.- 2001.- Vol. 62.- No. 10.- P. 1311

77. Coker A.O., Isokpehi R.D., Thomas B.N., Amisu K.O. et al. Human campylobacteriosis in developing countries Synopsis- Statistical Data Included. //Emerging Infectious Diseases.-2002.-Vol.8.-No.3.- P.237-243

78. Cornells G.R. Yersinia enterocolitica, a very sophisticated pathogen in our everyday life. // Resent Advances in the Pathogen, of Gastrointestinal Bacterial. Infect./ Eds. P. Rampal, P. Boquet / Paris.- John Libbey Eurotext-1998.- P. 97-109

79. Departement of Preventive Medicine and Field Epidemiology Training Program . Salmonella Food Poisoning Outbreak in Riyadh, Saudi Arabia 2001. //Saudi Epidemiology Bullet~n.- 2002.-Vol. 9.- No 1.

80. Diniz-Santos D.R., Santana J.S., Barretto J. R. et al. Epidemiological and microbiological aspects of acute bacterial diarrhea in children from Salvador, Bahia, Brazil.- The Brazilian Journal of Infectious Diseases.- 2005.-Vol.9.-No. 1.- P.77-83

81. Doane F.W., Electron microscopy for detection of gastroenteritis viruses. In A.Z. Kapikian (ed.).Viral infection of the gastrointestinal tract, 2nd ed. Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y.-1994.-P. 101-130

82. Dolin R. Noroviruses- challenges to control. //The New England Journal ofMedecine.-2007.-Vol.357.- Noll.- P.1072-1073

83. Eastwood K., Schuster H., Gascoyne-Binzi D. Comparison of realtime PCR and direct culture for the detection of Campylobacter spp. from human faecal samples. // 17th European Congress of Clinical ICC. 2007.-Germany.- 31 Mar - 04 Apr.

84. Eisen, M. В. & Brown, Р. О. DNA arrays for analysis of gene expression.//Methods Enzymol.- 1999.-Vol.303.-P. 179-205

85. Ekins R.P. An overview of present and future ultrasensitive nonisotopic immunoassay development. // Clin. Biochem. Revs.- -1987.-Vol.8.-P. 12-22.

86. Elnifro E.M., Ashshi A.M., Cooper R.J., Klapper P.E. Multiplex PCR: optimization and application in diagnostic virology. // Clin Microbiol Rev-2000.-Vol. 13.- No.4.- P.559-570

87. Falk P.G., Hooper L.V., Midtvedt Т., Gordon J.I. Creating and maintaining the gastrointestinal ecosystem: what we know and need to know from gnotobiology // Microbiol. Molec. Biol. Rev.- 1998.-Vol.62.-No.4-P.l 157-1170.

88. Favre-Bonte S., Darfeuille-Michaud A., Forestier C. Aggregative adherence of Klebsiella pneumoniae to human intestine-407 cells. // Infect, and Immun.- 1995.-Vol.63 .-No.4.-P. 1318-1328

89. Fernandez-Delgado M., Contreras M., Carcia-Amado M. et al. Occurrence of Proteus mirabilis associated with two species of Venezuelan oysters. //Rev. Inst. Med. trop. S. Paulo.-2007.- Vol.49.-No.6.- P. 355-359

90. Fong T.T., Lipp E.K. Enteric Viruses of humans and animals in aquatic environments: health risks, detection, and potential water quality assessment tools. // Microbilolgy and Molecular Biology Reviews.-2005.-Vol.69.- No.2.- P.357-371.

91. Friedman C.R., Neimann J., Wegener H.C., Tauxe R.V Campylobacter.il in: I. Nachamkin, M.J. Blaser (Eds.), ASM Press, Washington DC.- 2000.- P. 121-138.

92. Galanis E. Campylobacter and bacterial gastroenteritis. //CMAJ-JAMC.-2007.- Vol.177.- No.6.- P.570-571

93. Garcia L.S., Garcia J.P. Detection of Giardia lamblia antigens in human fecal specimens by a solid-phase qualitative immunochromatographic assay. IIJ. Clin. Microbiol. -2006.-Vol.44.- P. 4587-4588

94. Gerhold D.L., Jensen R.V., Gullans S.R. Better therapeutics through microarrays. //Nature Genetics.- 2002.- Vol. 32.- Supplement.- P. 547.

95. Gerold D., Rushmore Т., Caskey C.T. DNA chips: promising toys have become powerful tools // Trends. Biochem. Sci.- 1999.- Vol. 24.- P. 168-173.

96. Gill C.J., Joseph L., Gorbach S. L. and Hamer D. H. Diagnostic accuracy of stool assays for inflammatory bacterial gastroenteritis in developed and resource-poor countries.// Clin. Infectious Diseas.- 2003.-Vol. 37.- P.365-75

97. Golub T. R. et al. Molecular classification of cancer: class discovery and class prediction by gene expression monitoring. Science .-1999.-Vol.286.-P:531-537.

98. Gonzalez SF, Krug MJ, Nielsen ME, Santos Y, Call DR: Simultaneous detection of marine fish pathogens by using multiplex PCR and a DNA microarray. //J Clin Microbiol.- 2004.-Vol.42.-No.4.- P.1414-1419

99. Guerrant R.L., Gilder T.V., Steiner T.S., Thielman N.M., Slutsker L. et al. Practice guidelines for the management of infectious diarrhea.// Clin. Infect. Dis.- 2001.- Vol.32.-P.331-50

100. Guerrant R.L., M. Kosek A.A. Lima B. Lomtz and H.L. Guyatt. Updating the DALYs for diarrhoeal disease. Trends Parasitol.- 2002.-Vol.18.-P. 191-193.

101. Guschin D., Mobarry В., Proudnikov D. et al. Oligonucleotide microchips as genosensors for determinative and environmental studies in microbiology // Applied and Environmental Microbiology.- 1997.- Vol. 63.- P. 2397-2402.

102. Haque R. Human intestinal parasites. // Journal of Health, Population and Nutrition. -2007.-Vol. 25.- No. 4,- P.387-391

103. Haque R., Huston Ch. D., M.D. et al. Amebiasis. //The New England Journal of Medecine.-2007.-Vol.348.- No.16.- P. 1565-1573

104. Haque R, Roy S., Siddique A., Mondal U., Rahman S.M., Mondal D. et al. Multiplex real-time PCR assay for detection of Entamoeba histolytica,

105. Giardia intestinalis, and Cryptospordium spp. // Am J Trop Med Hyg -2007.-Vol.76.-P.713-717.

106. Hauser M.A., Li Y.J., Xu H., Noureddine M.A., Shao Y.S. et al. Expression profiling of substantia nigra in Parkinson disease, progressive supranuclear palsy, and frontotemporal dementia with parkinsonism. Arch Neurol.- 2005.- Vol.62.-No.6.-P. 917-921.

107. Higuchi R. Kinetic PCR analysis: Real time monitoring of DNA amplification reactions. // Biotechnology. - 1993.- No.l 1.- P. 1026-1030

108. Hill Gaston J.S., Lillicrap M. Arthritis associated with enteric infection. //Best Practice & Research Clinical Rheumatology.- 2003. -Vol. 17.-No. 2.-P. 219-239

109. Jaaskelainen A.J., Piiparinen H., Lappalainen M., Koskiniemi M., Vaheri A. // Multiplex-PCR and oligonucleotide microarray for detection of eight different herpesviruses from clinical specimens. //J Clin Virol.- 2006.-Vol.37.-No.2.- P.83-90.

110. James P. Nataro and James B. Kaper. Diarrheagenic Escherichia coli. //Clin. Microbiol. Rev.- 1998.-Vol.ll.- P.142-201.

111. Kartalija M, Sande MA. Diarrhea and AIDS in the era of highly active antiretroviral therapy. //Clin Infect Dis.- 1999.- Vol.28.-P.701-7.

112. Khrapko K., Lysov Yu., Khorlin A. et al. An oligonucleotide hybridization approach to DNA sequencing // FEBS Letters.- 1989.- Vol. 256.-P. 118-122.

113. Kongmuang U., Luk J.M., Lindberg A.A. Comparisom of three stool-processing methods for detection of Salmonella serogroups В, C2, and D by PCR. //-J. Clin. Microbiol.- 1994.- Vol. 32.- P.3072-3074.

114. Kosek M, Bern С, Guerrant RL. The global burden of diarrhoeal disease, as estimated from studies published between 1992 and 2000. //Bull World Health Organ 2003.-Vol.8l.-No3.- P. 197-204

115. Kovats RS, Edwards SJ, Charron D. Climate variability and Campylobacter infection: an international study. //Int J Biometeorol.- 2005.-Vol.49.-No.4.-P.207-14.

116. LaGier M.J., Joseph L.A., Passaretti T.V., Musser K.A., Cirino N.M. A real-time multiplexed PCR assay for rapid detection and differentiation of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli. И Mol Cel Probes.- 2004.-Vol.l8.-No.4.- P.275-82

117. Lan R., Lumb В., Ryan D. at al. Molecular evolution of large virulence plasmid in Shigella colones and Enteroinvasive Escherichia coli. II Infect. Immun. 2001.-Vol.69.- P.6303-6309.

118. Lapa S., Mikheev M., Shchelkunov S., Mikhailovich V., Sobolev A., Blinov et al. Species-level identification of orthopoxviruses with an oligonucleotide microchip. //J. Clin. Microbiol.- 2002.- Vol. 40. No.3. P. 753.

119. Leushner J., Kelly M. Detection of pathogenic enteric bacteria in stool by multiplex PCR. // Qiagennews. 2000.- No.4.- P.21

120. Liu R., Wang X., Chen G.Y., Dalerba P. et al. //The prognostic role of a gene signature from tumorigenic breast-cancer cells. N Engl J Med.- 2007.-Vol.356.- No.3.-P.217-226.

121. Lockhart D.J., Winzeler E.A. Genomics: gene expression and DNA arrays. //Nature. -2000. -Vol. 405(6788). P. 827.

122. Louie M., Louie L., Simor A. E. The role of DNA amplification technology in the diagnosis of infectious diseases. // CMAJ (Canadian Medical Association Journal)- 2000.- Vol. 163.-No.3.-P. 301-309

123. Mahadevappa M., Janet A. Warrington. Microarrays- optimizacion and application to cancer discovery. // QIAGEN news. — 2000.- № 4.-P:3-6

124. Mandell G.L., Bennett J.E, Dolin R. Douglas and Bennett's principles and practice of infectious diseases. 6th edn. Pennsylvania: Elsevier, Churchill Livingstone, 2005.-2006.-Vol. 17.- No. 1.-P. 11-17

125. Marshall, M. M., Naumovitz, Y. Ortega, C. R. Sterling. Waterborne protozoan pathogens. Clin. Microbiol. Rev. -1997-. Vol.l0.-P.67-85

126. Michael J., Sharon L. New Gram-negative enteropathogens: fact or fancy? //Rev. Med. Microb.-2006.-Vol.l7.-No.l.-P.27-37

127. Moor J.E., Corcoran D., Dooley J.S.G. et al. Campylobacter. Vet. Res. -2005.-Vol.36.- P. 351-382

128. Nachamkin I. Chronic effects of Campylobacter infection.// Microbes and Infection.-Vol. 4.-2002.-P. 399^103

129. Nanni L., Romualdi C., Maseri A., Lanfranchi G. Differential gene expression profiling in genetic and multifactorial cardiovascular diseases. //J Mol Cell Cardiol.- 2006.-Vol.41.-No.6.- P. 934-48.

130. Ng C.T., Gilchrist C.A., Lane A., Roy S., Haque R., Houpt E.R. Multiplex real-time PCR assay using Scorpion probes and DNA capture for genotype-specific detection of Giardia lamblia on fecal samples. //J Clin Microbiol.- 2005.- Vol.43.-P. 1256-60

131. Oberhelman RA, Taylor DN. Campylobacter infections in developing countries. In: Nachamkin I, Blaser MJ, editors. Campylobacter, 2nd edition.Washington: American Society for Microbiology.-2000.- P.139-53.

132. Ochs M.F., Godvin A.K. // Microarrays in cancer: research and applications. BioTechniques. -Vol. 34.- Supplement. -P. 17-21.

133. Okamoto Т., Suzuki Т., Yamamoto N. // Microarray fabrication with covalent attachment of DNA using Bubble Jet technology. Nature Biotechnology. -2000. -V.18. No4.- P.438.

134. Pachiadakis I., Karavassilis V., Vasdeki A. at al. Direct detection of Salmonella spp. in faecal specimens by real-time PCR assay. // 16th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, France. 2006,-April 1-4

135. Parashar U.D., Bresee J.S., Gentsh J.R., Glass R.I. Rotavirus. //Emergihg Infect. Dis.-1998.-Vol.4.-No. 4.- P.561-570

136. Pemov A., Modi H., Chandler D.P., Bavykin S. DNA analysis with multiplex microarray-enhanced PCR. Nucleic Acids Res. 2005.-Vol. 33.-No.2.- P. 1-9

137. Peterson MC. Clinical aspects of Campylobacter jejuni infections in adults. //Wes J Med.- 1994.-Vol.l61.-P.148-52.

138. Person S., Olsen K.E.P. Multiplex PCR for identification of Campylobacter coli and Campylobacter jenini from pure culture and directly on stool samples. Journal of Medical Microbiology.-2005.-Vol.54.- P. 10431047

139. Preliminary FoodNet data on the incidence of foodborne illnesses ~ selected sites, United States, 2002. //MMWR Morb Mortal Wkly Rep .-2003.-52.-P.340-343.

140. Public Health Labortory Services (PHLS). Gastrointestinal infections. PHLS. //1998 Annual review of communicable diseases. London: PHLS publications.- 2000.- P. 79-88.

141. Pupo G.M., Karaolis D.K., Lan R., et al. Evolutionary relationships among pathogenic and nonpathogenic Escherichia coli strains inferred from multilocus enzyme electrophoresis and mdh sequence studies. // Infect. Immun.- 1997- Vol.65.- P.2685-2692

142. Quackenbush J. // Microarray analysis and tumor classification. N. Eng. J. Med.-2006. -V. 354.- №23.- P. 2463.

143. Roy S., Kabir M., Mondal D., Ali I.K., Petri W.A., Jr., Haque R. Real-time-PCR assay for diagnosis of Entamoeba histolytica infection. //J Clin Micrbiol.- 2005.- Vol.43.-P.2168-72.

144. Sair A.I., D'Souza D.H., Jaykus L.A. Human Enteric Viruses as Causes of Foodborne Disease. //Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety.-2002.-Vol.l.- P.73-89

145. Samal S.K., Khunitia H.K., Nanda P.K. et al. Incidence of bacterial Enteropathogens among hospitalized diarrhea patients from Orissa, India. // Jpn. J. Infect. Dis.-2008.-Vol.61.- P.350-355

146. Selvapandiyan A, Stabler K, Ansari NA et al. A novel semi-quantitative fluorescence-based multiplex PCR assay for rapid simultaneous detection of bacterial and parasitic pathogens from blood. //J Mol Diagn.- 2005.-Vol.7.No.2.- P.268-275

147. Sen K, Asher D.M Multiplex PCR for detection of Enterobacteriaceae in blood. //Transfusion.- 2001.-Vol.41.-No. 11.-P. 13 56-1364

148. Slonim D.K. // From patterns to pathways: gene expression data analysis comes of age. Nature Genetics. -2002.-Vol. 32. -Supplement.- P. 502.

149. Sopwith W., Birtles A., Matthews M., Fox A. Campylobacter jejuni Multilocus Sequence Types in Humans, Northwest England, 2003-2004.-Emerging Infectious Diseases.-2006.-Vol.l2.-No.l0.-P.1500-1507

150. Spencer K.L., Soave R., Acosta A., Gellin B. et al. Cryptosporidiosis in HIV-infected Persons: Prevalence in a New York City Population. // International Journal of Infectious Diseases.- 1997.-Vol. l.-No. 4.-217-221

151. Stears R.L., Martinsky Т., Schena M. // Trends in microarray analysis. Nature Medicine. -2003. -Vol. 9. No.l.- P. 140.

152. Stoughton R.B. // Applications of DNA microarrays in biology. Annu. Rev. Biochem.-2005. -Vol. 74.- P. 53.

153. Takahashi M., Koga M., Yokoyama K., Yuki N. Epidemiology of Campylobacter jejuni isolated from patients with Guillain-Barre' and Fisher syndromes in Japan // Journ. of Clin. Microb.- 2005.-Vol.43.-No.l.- P.335-339

154. Tam С. С., Rodrigues L. С. and O'Brien S. J. Guillain-Barre' syndrome associated with Campylobacter jejuni infection in England, 20002001. // Clinical Infectious Diseases. -2003.- Vol.37.-P.307-10

155. Tauxe R.V. Emerging foodborne pathogens. //Int. J. Food Microbiol.-2002.-Vol.78.- P.31-41.

156. The Campylobacter sentinel surveillance scheme collaborators. Ciprofloxacin resistance in Campylobacter jejuni: case-case analysis as a tool for elucidating risks at home and abroad. // J. Antimicrob. Chemother. 2002.-Vol. 50.-P.561-568.

157. The Increasing Incidence of Human Campylobacteriosis. Report and Proceedings of a WHO Consultation of Experts Copenhagen, Denmark, 21-251. November 2000; 135

158. Thielman N.M., Guerrant R.L. Clinical practice. Acute infectiousdiarrhea. //N Engl J Med.- 2004.-Vol. 350.-P.38-47

159. Tillib S., Strizhkov В., Mirzabekov A. Integration of multiple PCR amplification and DNA mutation analyses by using oligonucleotide microchip //Analyt. Biochem.- 2001.-Vol. 292.-P. 155-160.

160. Timofeev E., Mirzabekov A. //Immobilization of DNA in polyacrylamide gel for the manifacture of DNA and DNA-oligonucleotide microchips and protein microchips. //Anal.Biochem.- 1998.-2Vol.59.- P. 3441.

161. Tomioka K., Peredelchuk M., Zhu Xian. Arena R. //A Multiplex Polymerase chain reaction microarray assay to detect bioterror pathogens in blood. // JMD Journal of molecular diagnostics.- 2005.-Vol. 7.- No. 4.-P.486-494

162. Tzipori S, Widmer G. A hundred-year retrospective on cryptosporidiosis. //Trends Parazitol. -2008.- Vol.24.-No4.- P. 184-9

163. Voetsch AC, Van Gilder TJ, Angulo FJ, et al. Food-Net estimate of the burden of illness caused by nontyphoidal Salmonella infections in the United States. //Clin Infect Dis.- 2004.- Vol.38.-Suppl 3.-P.S127-S134.

164. Wilhelmi, I., E. Roman, and A. Sanchez-Fauquier. Viruses causing gastroenteritis. //Clin. Microbiol. Infect.- 2003.-Vol. 9.-P.247-262

165. World Health Statistics 2008. Geneva, World Health Organization, 2008.

166. Worley J., Bechtol K., Penn S., Roach D., Hanzel D., Trounstine M., Barker D. A system approach to fabricating and analyzing DNA microarrays. //In: MicroarrayBiochip Technology (ed. Schena M.). Eaton Publ., Natick, MA.- 2000.- P.65-86.

167. Yates J. Traveler's diarrhea. //American Family Physician.-2005.-Vol.71 .-No. 11 .-P.2095-2100

168. Yauk C.L., Williams A., Boucher S., Berndt L.M. et al. Novel design and controls for focused DNA microarrays: applications in quality assurance/control and normalization for the Health Canada ToxArray. BMC Genomics.- 2006.-Vol. 7.- P.266.

169. Yolken R.H., Lennette D.A., Smith T.F., Waner J.L. Algorithms for detection and identification of viruses. In: Murray P.R., Baron E.J., Pfaller M.A., Tenover F.C., Yolken R.H., editors. //Manual of clinical microbiology. 7thed.-1999.- P.843-846