Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Получение моноклональных антител к легким цепям иммуноглобулинов человека и их использование в иммунодиагностике

2 9 ДПР ше

На правах рукописи

ГРЯЗЕВА Ирина Владимировна

ПОЛУЧЕНИЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ЛЕГКИМ ЦЕПЯМ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ ЧЕЛОВЕКА И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В ИММУНОДИАГНОСТИКЕ

14.00.36-АЛЛЕРГОЛОГИЯ И ИММУНОЛОГИЯ

АВТОР ЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ

1996

Работа выполнена в Центральном научно-исследовательском рент-гено-радиологическом институте Минздравмедпрома РФ.

Научный руководитель: кандидат медицинских наук В. Б. КЛИМОВИЧ

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор В. Б. ОКУЛОВ, кандидат биологических наук Л. С. КОСИЦКАЯ

Ведущее учреждение — Санкт-Петербургский научно-исследова гель-скин институт вакцин и сывороток Минздравмедпрома РФ.

Защита состоится 1996 г. в часов на заседании

Диссертационного совета Д.001.23.02 по защите диссертации на соискание ученой степени доктора наук при Научно-исследовательском институте экспериментальной медицины РАМН (197376, г. Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, 12).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Научно-исследовательского института экспериментальной медицины РАМП.

Автореферат разослан « » 1996 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор медицинских наук

Л. А. БУРОВА

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Легкие цепи иммуноглобулинов являются одним из основных структурных элементов, участвующих в формировании антиген-связывающего центра антител. В здоровом организме легкие цепи существуют в основном в составе молекул иммуноглобулинов, циркулирующих или находящихся в цитоплазме и на мембранах клеток В-лимфоцитарно-го ряда. Небольшое количество легких цепей находится в свободном виде.

При B-клеточных новообразованиях пролиферация злокачественного клона приводит к нарушению нормального соотношения В-лимфоцитов, несущих на своей мембране или в цитоплазме иммуноглобулины к- и Я-типа, и к соответствующему сдвигу в концентрации циркулирующих иммуноглобулинов. Дисбаланс в синтезе тяжелых и легких цепей, часто наблюдающийся при трансформации B-клеток, приводит также к появлению в крови повышенного количества свободных легких цепей (СЛЦ) одного типа (моно-клональных СЛЦ), экскреторные формы которых называются белками Бенс-Джонса (ББД). Выявление легких цепей в составе ассоциированных с клетками или циркулирующих иммуноглобулинов, а также моноклональных СЛЦ в сыворотке крови и в моче имеет важное значение для диагностики, классификации и контроля эффективности лечения B-клеточных новообразований.

В последние годы появились сообщения о диагностической значимости выявления СЛЦ в спиномозговой жидкости при рассеянном склерозе - хроническом заболевании центральной нервной системы, сопровождающемся интратекальным синтезом иммуноглобулинов (Rudick et al., 1986; Fagnart et al.,1988; Lolli, Amaducci, 1989; Sindic, Laterre, 1991).

Потребность в надежных методах диагностики перечисленных заболеваний определяет необходимость получения высокоспецифичных реагентов для выявления легких цепей, находящихся в составе иммуноглобулинов или в свободном виде. Наличие на легких цепях двух типов антигенных детерминант - постоянно экспрессированных. и скрытых, то есть маскирующихся в структуре молекул иммуноглобулинов и экспрессированных только на СЛЦ (Schiffer et al., 1973; Calvanico, 1984; Solomon, 1985) - определяет возможность дифференцированного иммунохимического выявления легких цепей, свободных и связанных с тяжелыми цепями. Получаемые с помощью гибридомной технологии моноклональные антитела (МКАТ) направлены против единичной антигенной детерминанты и гомогенны по химическому строению, что обеспечивает их преимущества в специфичности и стандартности в сравнении с поликлональными антисыворотками (Kohler, Milstein, 1975). Поэтому использование МКАТ при разработке методов определения СЛЦ в биологи-

ческих жидкостях, содержащих иммуноглобулины - сыворотке крови, моче и спиномозговой жидкости (СМЖ), позволяет значительно повысить специфичность и воспроизводимость диагностических тестов. При создании диагностических тест-систем в настоящее время наиболее широко используется иммуноферментный анализ (ИФА), обеспечивающий высокую чувствительность обнаружения и количественное измерение анализируемых соединений. В сочетании с МКАТ ИФА является одним из наиболее надежных и удобных иммунохимических методов диагности:-.;! многих заболеваний. Поэтому получение МКАТ к соединениям, ва::сным с клинической точки зрения, и создание на их основе диагностических иммуноферментных тест-систем является одной из актуальных задач прикладной иммунологии.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в получении МКАТ к легким цепям иммуноглобулинов человека и создании на их основе диагностических иммуноферментных тест-систем для выявления и типирования моноклональных иммуноглобулинов и количественного определения свободных к- и Х- цепей.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Получить МКАТ к легким цепям иммуноглобулинов человека к- и X-типа, распознающие эпитопы двух типов - постоянно экспрессированные и скрытые ( экспрессированные только на СЛЦ).

2. Исследовать возможность применения МКАТ против постоягю экспрессированных эпитопов к- и Я.-цепей для выявления и типироря."г~ моноклональных иммуноглобулинов в сыворотках больных В-неоплазиями с помощью ИФА.

3. Исследовать возможность использования МКАТ к разным эпитопам легких цепей для создания двухдетерминантных иммуноферментных методов количественного определения свободных к- и Л-цепей в различных биологических жидкостях.

4. Оценить пригодность созданных на основе МКАТ методов количественного определения СЛЦ для диагностики множественной миеломы.

5. Исследовать диагностическую значимость количественного определения свободных к- и Я.-цепей при рассеянном склерозе.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Получен ряд МКАТ, взаимодействующих с постоянно экспрессиро-ванными и скрытыми эпитопами к- и А.-цепей иммуноглобулинов человека.

2. Показана возможность применения МКАТ против постоянно экспрессированных эпитопов к- и А.-цепей для выявления и типирования

моноклональных иммуноглобулинов в сыворотках больных с В-клеточными новообразованиями с помощью методов иммуноферментного анализа.

3. На основе МКАТ к скрытым и постоянно экспрессированным эпи-топам легких цепей разработаны иммуноферментные методы количественного определения свободных к- и Х-цепей в сыворотке крови, моче, спино-мозговой жидкости.

4. Количественное определение свободных к- и Х-цепей в сыворотке крови и моче может использоваться для диагностики и мониторинга В-кле-точных новообразований.

5. Содержание СЛЦ к-типа в СМЖ является высокоинформативным показателем при дифференциальной диагностике рассеянного склероза.

Научная новизна работы:

1. Получены два семейства МКАТ против легких цепей иммуноглобулинов человека к- и Х-типа, распознающие постоянно экспрессированные и скрытые эпитопы.

2. На основе сочетанного применения МКАТ против 'скрытых и постоянно экспрессированных эпитопов разработаны иммуноферментные тест-системы для количественного определения свободных к- и Х-цепей в сыворотке крови, моче, СМЖ.

3. Тест-система для количественного определения свободных Х- цепей, не обладающая перекрестной реактивностью с иммуноглобулинами, предложена впервые и не имеет аналогов.

4. Впервые предложено использовать количественное определение свободных к- и Х-цепей для выявления и типирования моноклональных СЛЦ в сыворотке крови и моче больных множественной миеломой.

5. Впервые для выявления и определения типа легких цепей моноклональных иммуноглобулинов в сыворотках больных множественной миеломой предложено использовать иммуноферментные методы на основе МКАТ.

6. Выявлена высокая диагностическая значимость количественного определения свободных к-цепей при рассеянном склерозе.

Практическое значение исследования. Иммуноферментные методы количественного определения свободных к- и Х-цепей на основе полученных МКАТ являются простыми и высокочувствительными методами выявления ББД в моче и моноклональных СЛЦ в сыворотке больных В-лимфопролифе-ративными заболеваниями и могут использоваться для диагностики и оценки эффективности лечения этих заболеваний.

Методы ИФА с использованием полученных МКАТ против постоянно экспрессированных эпитопов легких цепей можно применять дня выявления и типирования моноклональных иммуноглобулинов в сыворотках больных

множественной миеломой и другими В-лимфопролиф'-'ративными заболеваниями.

Метод количественного определения свободных к-цепей в СМЖ можно использовать для дифференциальной диагностики рассеянного склероза, в том числе на ранних стадиях. Содержание свободных \-цепей может быть использовано в качестве дополнительного диагностического критерия при рассеянном склерозе.

Апробация работы. Материалы дисс'.уг^ции были доложены на Всесоюзных конференциях "Современные направления создания медицинских диагностикумов" (Москва, 1988, 1990), на Всесоюзной конференции "Актуальные вопросы в биохимической и иммунологической диагностике злокачественных новообразований" (Москва, 1989), на рабочем совещании невропатологов России в рамках научной конференции "Нейроиммунология на пороге XXI века" (Санкт-Петербург, 1993), 2nd International Congress ISNIM, Paestum (Salerno), Italy (1993), International conference "Biotechnology St.Petersburg'94" (Санкт-Петербург, 1994), а также на заседании проблемной комиссии по медицинской биотехнологии ЦНИРРИ (1996).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 печатных

работ.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 140 страницах машинописного текста, включая 18 таблиц и 18 рисунков. Работа состоит из введения, 4 глав, выводов и списка литературы. Список литературы содержит 166 отечественных и зарубежных публикаций.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве антигенов для иммунизации мышей, при отборе гибридом, продуцирующих МКАТ против легких цепей, и изучении свойств МКАТ использовали ББД к- и Я.-типов, поликлональный IgG человека, поликло-нальные легкие цепи, а также сыворотки больных множественной миеломой, содержащие моноклональные IgG, IgA или IgM, к препараты аффинно-очищенных поликлональных IgA, IgM и IgG разных подклассов. ББД выделяли из мочи больных множественной миеломой с помощью ультрафиль"1 рации и ионообменной хроматографии (Жатон Ж.-К. и др., 1981). Для типиро-вания выделенных белков использовали метод двойной радиальной иммуно-диффузии (Ouchterlony, 1965) с моноспецифическими антисыворотками про-

тив легких цепей к- и Х-типа производства ИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи (Москва). Поликлональный IgG выделяли из иммуноглобулинов донорской плазмы с помощью ионообменной хроматографии (Жатон Ж.-К. и др., 1981) . Поли-клональные легкие цепи получали фрагментированием IgG путем восстановления дисульфидных связей 2-меркаптоэтанолом (Брок Й., 1987) и разделения легких и тяжелых цепей с помощью гель-фильтрации на сефадексе G-75 (Pharmacia, Швеция). Сыворотки больных множественной миеломой, используемые при анализе специфичности МКАТ в качестве референс-препаратов, содержали моноклональные иммуноглобулины, изотип которых был определен в лаборатории гуморального иммунитета МНИИЭМ им.Г.Н.Габричевского (Москва). При изучении свойств МКАТ против легких цепей с помощью двухдетерминантных методов ИФА и типировании моноклональных иммуноглобулинов в сыворотках больных использовали МКАТ против IgGl, IgG3, IgG4, IgA и IgM человека, полученные в лаборатории гибридомной технологии ЦНИРРИ (Санкт-Петербург) (Krutetskaya et al., 1991; Klimovich et al., 1994), а также моноспецифическую антисыворотку против IgA человека производства НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи (Москва).

Образцы сыворотки крови, мочи и СМЖ получали от больных, проходивших обследование и лечение в НИИ онкологии им.проф.Н.Н.Петрова, больнице N 31 (Санкт-Петербург), клиниках нервных болезней СПбГМУ им.И.П.Павлова и Военно-медицинской академии им.С.М.Кирова (Санкт-Петербург).

Гибридомы, продуцирующие МКАТ против легких цепей, получали путем слияния клеток селезенки от иммунизированных ББД мышей линии SJL/J с клетками мышиной миеломной линии 6.5.3.А (Климович В.Б. и др., 1986). Слияние клеток проводили по методике Galfre (Galfre et al., 1977) с модификациями. Селекцию гибридных клеток проводили в культуральной среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин. Выявление положительных клонов гибридных клеток осуществляли с помощью непрямого метода ИФА. В качестве антигенов при скрининге гибридом использовали поликлональные легкие цепи, ББД, не применявшиеся для иммунизации мышей, а также поликлональный IgG. Культивирование гибридомных клеток in vitro осуществляли в-96-, 24- и 12-луночных планшетах (Nunc, Дания) при 37°С в атмосфере 7,5% СО2. Для культивирования in vivo суспензию гибридомных клеток вводили внутрибрюшинно мышам гибридам Fi(SJL/JxBALB/c), получившим за 7 дней до прививки инъекцию 0,5 мл пристана (Sigma, США). Асцитическую жидкость собирали через 10-20 дней после инъекции клеток и выделяли МКАТ осаждением сульфатом аммония, риваноловым методом или с помощью аффинной хроматографии.

Изотип МКАТ определяли в культуральной жидкости двумя способами: с помощью иммуноферментного метода, используя комплект антител против тяжелых цепей иммуноглобулинов мыши (Calbiochem, США), и с помощью аффинной хроматографии на белок-А-сефарозе (Sarvas et al., 1983).

Конъюгаты МКАТ с пероксидазой получали перйодатным методом (Nakane, Kawaoi, 1974).

Исследование специфичности МКАТ проводили с помощью прямого, непрямого, конкурентного и двухдетерминантного методов твердофазного ИФА( Егоров A.M. и др., 1991; Кэтти Д., Райкундалиа Ч., 1991).

Электрофорез ББД проводили в 12,5%-ном полиакриламидном геле в присутствии 0,1% додецилсульфата натрия (Laemmli, 1970) в невосстанавли-вающих и восстанавливающих условиях. Иммуноблотгинг ББД к- и Х-типа осуществляли путем электропереноса белков из геля на нитроцеллюлозную мембрану (Towbin et al., 1979) с последующим специфическим выявлением полос к- и Я.-цепей с помощью МКАТ, меченных пероксидазой.

Аффинность МКАТ определяли по ранее описанному иммунофер-ментному методу (Friquet et al., 1985).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Получение моноклональных антител к легким цепям

иммуноглобулинов человека и изучение их свойств

В результате трех последовательно проведенных опытов по гибридизации и предварительного отбора клонов гибридных клеток, обладающих наилучшими ростовыми характеристиками и являющихся наиболее активными продуцентами антител, было получено 10 гибридомных штаммов, синтезирующих МКАТ против к-цепей и 12 - против А.-цепей.

По способности взаимодействовать с интактными иммуноглобулинами и со свободными легкими цепями все МКАТ делились на две группы: антитела первой группы взаимодействовали как со свободными легкими цепями, так и с целостными молекулами иммуноглобулинов, то есть, распознавали постоянно экспрессированные эпитопы легких цепей, а антитела второй группы взаимодействовали только со свободными легкими цепями и, следовательно, распознавали скрытые эпитопы легких цепей. Из 10 МКАТ против к-цепей с постоянно экспрессированными эпитопами взаимодействовали 4 антитела, а 6 антител - со скрытыми эпитопами. Среди МКАТ против*

Л-цепей 8 антител взаимодействовали с постоянно экспрессированными и 4 антитела - со скрытыми эпитопами.

Для группировки МКАТ в зависимости от распознаваемых ими эпи-топов использовали конкурентный ИФА. При определении конкуренции между немечеными и мечеными антителами было выявлено несколько групп взаимного ингибирования связывания, объединяющие антитела к одному или двум пространственно сближенным эпитопам. Среди анти-к-МКАТ таких групп оказалось три: две из них объединяли МКАТ, распознающие скрытые эпитопы, и одна - постоянно экспрессированные эпитопы. Среди анти-Я-МКАТ было две группы, распознающие скрытые эпитопы, и три - постоянно экспрессированные.

При анализе специфичности МКАТ, проводимом с целью выбора антител, пригодных к использованию в диагностических иммуноферментных тест-системах, необходимо было отобрать антитела, распознающие наиболее консервативные эпитопы легких цепей. При этом антитела против постоянно экспрессированных эпитопов должны были сохранять свои антиген-связы-вающие свойства при присоединении ферментной метки и взаимодействовать с легкими цепями в составе иммуноглобулинов независимо от их класса и подкласса, а антитела против скрытых эпитопов должны сохранять свои антиген-связывающие свойства при их адсорбции на твердой фазе, поскольку в двухдетерминантных методах ИФА они предназначены для использования в качестве иммобилизованных антител.

В результате проведенного исследования были выбраны два МКАТ против постоянно экспрессированных эпитопов легких цепей - 4С7(анти-к) и 2G9 (анти-Я), которые взаимодействовали со всеми имеющимися образцами ББД соответствующего типа и легкими цепями в составе молекул иммуноглобулинов независимо от класса и подкласса тяжелых цепей. Процедура конъюгирования антител с пероксидазой не изменяла их антиген-связываю-щих свойств. Конъюгаты этих антител использовали также в опытах по изучению специфичности МКАТ против скрытых эпитопов и подбору оптимальных сочетаний антител для выявления свободных к- и Я.-цепей. Сочетание МКАТ 4CI1 против скрытого эпитопа к-цепей, иммобилизованного на твердой фазе, с конъюгатом антитела 4G7 было наиболее оптимальным при выявлении ББД (табл. 1), а также свободных к-цепей, содержащихся в нормальной сыворотке и моче (рис.1).

Аналогичным образом для выявления свободных Х-цепей было выбрано сочетание иммобилизованного МКАТ 3D12 против скрытого эпитопа с меченым антителом 2G9 против постоянно экспрессированного эпитопа Л-це-зей.

Таблица 1

Взаимодействие МКАТ против свободной к-цепи, иммобилизованных на твердой фазе, с ББД к-типа (значения оптической плотности при 450 нм). В качестве выявляющего антитела использовали анти- к-МКАТ 407, конъюгированное с пероксидазой.

Коды МКАТ ББД к-типа

НИК ГЕР ВАЙ ПЛИ ЕРМ КУЦ СПИ ЛАС

4С11 2,0 1,8 2,0 1,4 0,7 1,7 1,1 1,4

1СЗ 1,5 1,2 0,7 1,1 0,15 0,7 1,6 0,7

11Е11 2,0 1,4 2,0 1,0 0,9 0,5 2,0 1,1

ЗСб 1,7 2,0 0,4 0,15 0,15 0,1 2,0 0,9

4С5 0,8 1,8 0,25 0 0,15 0,1 0 0,3

4Н4 1,5 1,3 1,0 1,0 0,2 1,0 1.4 0,8

А Б

Рис.1. Сравнение антиген-связывающей активности иммобилизованных

МКАТ против скрытых эпитопов к-цепей при выявлении свободных к-цепей в нормальной сыворотке (А) и моче (Б). На твердой фазе иммобилизованы МКАТ 4С11, 1СЗ, 4Н4, 1Е11,4С5 и ЗС6. В качестве выявляющего антитела использован конъюгат МКАТ 407 с пероксидазой.

По оси абсцисс - разведения (^3) сыворотки (А) и мочи (Б).

По оси ординат - оптическая плотность при длине волны 450 нм

Проведенный анализ специфичности полученных МКАТ позволил выбрать антитела против постоянно экспрессированных эпитопов к- и Х-цепей, пригодные для типирования моноклональных иммуноглобулинов в сыворотках больных, и наиболее оптимальные сочетания МКАТ против скрытых и постоянно экспрессированных эпитопов, позволяющие выявлять свободные к -и Х-цепи с помощью двухдетерминантных методов ИФА.

Для 4 антител ( 4С11, 407, 3012 и Ю9 ) была исследована конформа-ционная зависимость распознаваемых ими эпитопов. Иммуноблоттинг после разделения очищенных ББД с помощью электрофореза в полиакриламидном геле при невосстанавливающих и восстанавливающих условиях показал, что МКАТ взаимодействуют как с мономерами, так и с димерами легких цепей, а также, что эпитопы, распознаваемые данными антителами сохраняют свою структуру при восстановлении внутрицепочечных дисульфидных связей, то есть являются конформационно независимыми.

Результаты измерения констант аффинности МКАТ с помощью имму-ноферментного метода выявили достаточно высокую аффинность антител, причем антитела 4С11 и ЗЭ12, распознающие скрытые эпитопы к- и Х-цепей и предназначенные для использования их в качестве иммобилизованных антител в двухдетерминантных методах, имеют более высокие константы аффинности (7,1x10-8 М-1

и 1,43x10"'" М-', соответственно), чем антитела 4С7 и 2С9, распознающие постоянно экспрессированные эпитопы и предназначенные для использования в этих методах в качестве выявляющих антител (0,96x10"? М"' и 1,96x1М-', соответственно). Это способствует образованию прочных иммунных комплексов на твердой фазе и вследствие этого высокой чувствительности методов определения свободных к- и Х-цепей.

Использование моноклональных антител для выявления и типирования моноклональных иммуноглобулинов в сыворотках больных множественной миеломой.

МКАТ против постоянно экспрессированного эпитопа к-цепей (407) и Х-цепей (209) были использованы для определения типа моноклональных иммуноглобулинов, содержащихся в сыворотках больных множественной миеломой, с помощью двух методов ИФА: прямого и двухдетерминантного. Класс и подкласс моноклональных иммуноглобулинов определяли с помощью МКАТ и антисывороток против тяжелых цепей. Примеры определения типа легкой цепи в моноклональных иммуноглобулинах с помощью прямого метода ИФА представлены в таблице 2.

Таблица 2

Определение типа легкой цепи в составе миеломкого иммуноглобулина с помощью МКАТ 4й7 (анти-к) и МКАТ 209 (анти-А), конъюгированных с пероксидазой.

Сыворотки Изотип Выявление МКАТ 4в7 Выязление МКАТ 209

мон^* Оптическая плотность Оптическая плотность

при разведениях при разведениях

сыворотки сыворотки

10-4 10-5 ю-6 10-4 10-5 ю-6

БЕР 1,086 1,076 0,115 0,131 0,036 0,025

ФИЛ ' 1,064 0,720 0,042 0,100 0,026 0^026

ЛАС 1§03-к 1,300 1,060 0,135 0,130 0,031 0,030

СИН 0,800 0,550 0,080 0,110 0,028 0,028

АБЕ ^-к 0,987 0,815 0,125 0,208 0,048 0,040

НОМ ^М-к 1,292 1,203 0,191 0,499 0,068 0,052

ТРО 0,048 0,014 0,004 1,700 1,434 0,381

КУЗ дог-х. 0,027 0,002 0,000 ¡,941 1,413 0,080

КЛИ ДОЗ-А 0,136 0,020 0,007 1,781 0,996 0,047

АНД 0,095 0,035 0,006 1,602 0,737 0,049

МАК 1ёА-А. 0,091 0,023 0,009 2,000 0,349 0,089

ГРИ ^М-А 0,670 0,040 0,014 1,299 0,244 0,057

сыворотка - 0,609 0,046 0,005 0,484 0,036 0,015

доноров

Примечание: * - моноклональный иммуноглобулин.

Сравнение значений оптической плотности в пробах с сыворотками больных и сывороткой доноров позволяет легко обнаружить преобладание иммуноглобулинов, содержащих легкую цепь одного типа. Значения оптической плотности проб сывороток, содержащих моноклональный иммуноглобулин, превышали значения оптической плотности в пробах с контрольной сывороткой в 1,5-40 раз. При этом подавляющее большинство сывороток больных множественной миеломой имело более низкие по сравнению с контрольной сывороткой значения оптической плотности при выявлении легких цепей с помощью конъюгата МКАТ к альтернативному типу легких

цепей. Результаты анализа в большинстве случаев можно было оценивать визуально.

Результаты типирования моноклональных иммуноглобулинов, полученные в прямом.методе ИФА, в некоторых случаях ( при небольшом содержании моноклональных иммуноглобулинов в сыворотке) требовали подтверждения с помощью двухдетерминантного метода ИФА. Использовали два варианта анализа. В первом варианте использовали иммобилизованные МКАТ против тяжелых цепей иммуноглобулинов, а в качестве выявляющих антител МКАТ против к- и Л- цепей, меченные пероксидазой. Во втором варианте в качестве иммобилизованных антител использовали МКАТ против к- и Я-цепей, а в качестве выявляющих - МКАТ против тяжелых цепей. Сыворотки анализировали в разведениях от 1/3000 до 1/200000. Результат выражали в виде кратности повышения или снижения иммуноглобулинов данного класса, содержащих легкие цепи одного типа, в исследуемой сыворотке по сравнению с содержанием иммуноглобулинов того же класса и типа в контрольной сыворотке. При наличии моноклонального иммуноглобулина в сыворотке уровень иммуноглобулинов, содержащих легкие цепи одного типа, был повышен в 10-240 раз. Одновременно наблюдалось снижение иммуноглобулинов того же класса, содержащих легкие цепи альтернативного типа. Примеры выявления моноклональных иммуноглобулинов к-типа с помощью первого варианта представлены на рисунке 2.

Всего за период с 1989 по 1994 год было исследовано 170 сывороток больных с предположительным диагнозом множественной миеломы, лимфо-мы или макроглобулинемии Вальденстрема. Сыворотки, содержащие моно-клональные иммуноглобулины разных классов и подклассов, распределились следующим образом: IgGl - 39 сывороток, IgG2 - 5 ,IgG3 - 4, IgG4 - 8, IgA - 26, IgM - 7, igD - 1. По типу легкой цепи распределение сывороток было следующим: 57% сывороток содержали к-иммуноглобулины, 43% - /.-иммуноглобулины.

Предлагаемые способы типирования моноклональцых иммуноглобулинов являются менее трудоемкими и требуют значительно меньших количеств сыворотки и реагентов, чем обычно используемый в клинических лабораториях метод типирования с помощью иммуноэлектрофореза с антисыворотками к тяжелым и легким цепям иммуноглобулинов.Кроме того, некоторые миеломные иммуноглобулины связываются с антителами без образования видимого преципитата ( Чернохвостова Е.В., Герман Г.П., 1984 ).

А

123456789 10

Б

Рис.2. Выявление моноклональных иммуноглобулинов к-типа в сыворотках больных множественной миеломой с помощью двухдетерминантного метода ИФА с использованием меченых МКАТ против легких цепей.

Представлены кривые титрования сывороток, содержащих ^Ок (А), IgAк (Б) и ^Мк (В) (кривые I и2) и пула нормальных сывороток (кривые 3 и 4).

На твердой фазе иммобилизованы МКАТ против ^О (А), (Б) и 1бМ (В).

Кривые 1 и 3 демонстрируют выявление иммуноглобулинов с помощью конъюгата МКАТ 4й7 (анти-к), а кривые 2 и 4 - с помощью конъюгата МКАТ Ю9 (анти-А).

По оси абсцисс - разведения сывороток (1оёз х ЮЗ)

По оси ординат - оптическая плотность при длине волны 450 нм

9 10

Разработка двухдетерминантных иммуноферментных методов •

количественного определения свободных к- и 1-иепей

При создании двухдетерминантных иммуноферментных методов определения СЛЦ были использованы сочетания двух антител, одно из которых, направленное к скрытому эпитопу и иммобилизованное на твердой фазе, служит для специфического улавливания СЛЦ, а другое - против постоянно экспрессированного эпитопа, меченное пероксидазой, выявляет присоединившуюся легкую цепь. Для определения к-цепей использовали МКАТ 4СМ (иммобилизованное на твердой фазе) и 4G7 (меченное пероксидазой), для определения Л-цепей - сочетание иммобилизованного антитела 3D12 с меченым антителом 2G9. В качестве стандартов использовали ББД ( по 4 образца для каждого типа легкой цепи). Образцы содержали как мономеры, так и димеры легких цепей. Определение свободных к-цепей было оптимальным в диапазоне концентраций от 10 до 1000 нг/мл, а Х.-цепей - 2 - 200 нг/мл. (рис.3).

Для оценки точности методов определения свободных к и Х-цепей использовали тест на выявление добавленных в биологическую жидкость (сыворотку или мочу) точно измеренных количеств очищенных ББД к- или X-типа. Выявляемость добавленных ББД составляла от 100 до 110%, что считается удовлетворительным для клинических лабораторных методов (Меньшиков В.В., 1987).

Перекрестную реактивность с легкими цепями, входящими в состав иммуноглобулина, измеряли с помощью раствора IgG в концентрации 1 мг/мл, очищенного методом ДЭАЭ-хроматографии. В этом растворе было выявлено 13 нг/мл свободных к-цепей и 9 нг/мл свободных Х-цепей, и, следовательно, перекрестная реактивность составляла 0,0013% и 0,0009%, соответственно. Такие незначительные количества выявленных СЛЦ говорят, скорее всего, о примеси СЛЦ в препарате IgG. Эти показатели перекрестной реактивности являются наилучшими для всех описанных в литературе методов определения СЛЦ как с поликлональными ( Robinson et al., 1982; Brouwer et al., 1985), так и с моноклональными антителами ( Axiak et al., 1987; Ling et al., 1983; Арсеньева Е.Л. 1989 ). Особенно большой проблемой оставалось до сих пор наличие перекрестной реактивности с иммуноглобулинами в методах определения свободных Х.-цепей ( Robinson et al., 1982; Fagftart et al., 1988; Lolli, Amaducci, 1989 ), поскольку методов на основе МКАТ не существует, а использование поликлональных антисывороток не позволяет достичь высокой специфичности анализа.

А

Б

Рис.3. Калибровочные кривые для определения свободных к-цепей (А) и Я-цепей (Б) с помощью двухдетерминантного метода ИФА. По оси абсцисс- концентрация ББД к- или Х- типа в нг/мл. По оси ординат- оптическая плотность при длине волны 450 нм.

Количественное определение СЛЦ иммуноглобулинов в сыворотке

и моче здоровых лиц и больных множественной миеломой

Для определения нормального уровня СЛЦ в сыворотке крови и моче были исследованы 40 образцов сыворотки и 10 образцов мочи от здоровых лиц в возрасте от 20 до 60 лет. В сыворотке крови концентрация свободных к-цепей составляла в среднем 8,7 мкг/мл, а концентрация свободных Я-цепей -0,85 мкг/мл. В моче нормальный уровень свободных к-цепей составлял в среднем 7,2 мкг/мл, а уровень свободных Я-цепей - 0,014 мкг/мл. Уровни свободных к-цепей в нормальной сыворотке и моче, определенные с помощью разработанного двухдетерминантного метода ИФА, близки к ранее опубликованным данным, полученным с помощью других методов, использующих как поликлональные антисыворотки ( Solling, 1975; Robinson et а!., 1982; Brouwer et al., 1985 ), так и моноклональные антитела ( Axiak et al., 1987). Значения для уровней свободных Я-цепей в сыворотке и моче в основном ниже значений, полученных с помощью других методов ( Hemmingsen, 1975; Solling, 1975; Robinson et al, 1982; Tutt et al., 1983; Brouwer et al., 1985). Эти отличия могут быть обусловлены перекрестной реактивностью используемых в этих методах антисывороток с целостными иммуноглобулинами.

В задачи данного исследования входило изучение возможности применения разработанных методов количественного определения СЛЦ в диагностике множественной миеломы. Как известно, при B-клеточных новообразованиях диагностическое значение имеет выявление моноклональных СЛЦ в сыворотке крови и моче. При количественном анализе на присутствие моноклональных СЛЦ может указывать изменение нормального соотношения концентраций свободных к- и Я-цепей. Содержание СЛЦ было определено в сыворотке и моче 55 больных множественной миеломой Сыворотки содержали моноклональные иммуноглобулины, изотип которых был определен с помощью ИФА. Данные по содержанию СЛЦ в сыворотке и моче больных множественной миеломой, представлены в таблицах 3 и 4.

Данные таблицы 3 свидетельствуют о присутствии в большинстве сывороток больных моноклональных СЛЦ, так как в сыворотках было повышено содержание СЛЦ одного типа, идентичного типу легкой цепи монокло-нального иммуноглобулина, и снижено содержание СЛЦ альтернативного типа, вследствие чего значительно изменялось нормальное соотношение СЛЦ двух типов. В моче больных также наблюдалось повышение содержания СЛЦ одного типа, идентичного типу легкой цепи моноклонального иммуноглобулина сыворотки ( табл.4 ). Интервал значений для уровня суточной экскреции

СЛЦ одного типа составлял от нескольких миллиграммов до нескольких граммов.

Таблица 3

Содержание свободных легких цепе."! 1;..,му по глобулинов в сыворотках больных множественной миеломой (ММ).

Образцы Тип Ь- цепи мон1д! Свободные к-цепи (мкг/мл) Свободные А-цеп,( (М'КГ/МЛ) Отношение к!Х Отношение Х/к

ММ (п=36) к 318 (2,33-4900)2 0,29 (0,004-1) 1942 (21-15300) "

ММ (п=19) X 2,9 (0,25-7,0) 46 (0,04-7-.-,'; 150 (0,02-2800)

нормальные сыворотки (п=40) 8,7 (4,2-14) 0,85 (0,3-2,2) 10 (4-21) 0,13 (0,03-0,3)

Таблица 4

Содержание свободных легких цепей иммуноглобулинов в моче и уровни их суточной экскреции у больных множественной миеломой (ММ).

Образцы Тип Ь- цепи мон1д' Свободные к-цепи (мкг/мл) мг/24 час Свободные А,-цепи (мкг/мл) мг/24 час

ММ (п=40) к 1032 1396 (2,4-8000)2 (4,6-12000) < 0,002 <0,002

ММ (ч=18) X 8,8 13 (2,4-21,6) (2,2-60,5) 786 799 (0,02-10500) (0,05-10500)

нормальная моча (п=10) 7,2 9,3 (3-16) (2,6-15) 0,014 0,025 (0,003-0,04) (0,015-0,04)

Примечания: 1 2

- моноклональный иммуноглобулин сыворотки

- среднее значение и разброс значений (в скобках).

Из 55 больных множественной миеломой 85% имели повышенное содержание СЛЦ одного типа, идентичного типу легкой цепи моноклонального иммуноглобулина: основная часть больных (52%) имела повышенное содержание СЛЦ и в сыворотке, и в моче, 27% больных - только в моче, и 6% -только в сыворотке. Таким образом, содержание СЛЦ одного типа было повышенным в моче у 79% scex обследованных больных. Эта частота Бенс-Джонс-протеинурии соответствует данным, приведенным в литературе, согласно которым частота Бенс-Джонс- протеинурии у больных множественной миеломой достигает 60-80% ( Solomon, 1976; Solomon, 1982; Sinclair et al., 1986; Андреева H.E., 1981 ). У 6% больных в сыворотке обнаружены повышенные значения СЛЦ того же типа, что и в моноклональном иммуноглобулине, но при этом в моче был нормальный уровень СЛЦ, что может отражать сохранение нормальной функции почек на данной стадии заболевания ( Mogensen, 1977; McLeod, 1583; Hamblin, 1986 ),

Количественное определение СЛЦ иммуноглобулинов у больных

рассеянным склерозом и другими неврологическими заболеваниями.

Для выяснения диагностической значимости количественного определения СЛЦ при рассеянном склерозе ( PC ) были исследованы образцы СМЖ и сыворотки крови от 78 больных PC с различными фазами и типами течения заболевания и 54 человек с другими неврологическими заболеваниями: опухоли головного и спинного мозга, спиноцеребеллярные атаксии, воспалительные процессы в ЦНС, невоспалительные заболевания ЦНС (группа сравнения). Контрольную группу составили 20 человек с нормальным содержанием в СМЖ клеток и белка (¡3 лиц, вошедших в эту группу, на момент обследования были практически здоровыми).

Содержание СЛЦ иммуноглобулинов в сыворотке больных PC и другими неврологическими заболеваниями достоверно не отличалось от соответствующих показателей в контрольной группе. В СМЖ у больных PC содержание СЛЦ было достоверно повышенным по сравнению с контрольной группой (табл.5). У больных с другими неврологическими заболеваниями средние значения содержания СЛЦ достоверно не отличались от группы контроля.

При проведении частотного анализа показатели считали повышенными, если они выходили за пределы максимальных значений в контрольной группе (Fagnart et al., 1988). Содержание свободных к-цепей в СМЖ было повышенным у 85% больных PC, а содержание А.-цепей - 45% , причем только в сочетании с повышенным содержанием к-цепей.У больных с другими невро-

логическими заболеваниями повышенное содержание свободных к-цепей в СМЖ выявлено у 8%, повышенное содержание свободных Л-цепей у - 6%, но наибольшие значения содержания СЛЦ у этих больных были ниже средних значений у больных РС (см.табл.5).

Таблица 5

Содержание СЛЦ в СМЖ (мкг/мл) и частота его повышения у больных РС и другими неврологическими заболеваниями (группа сравнения).

Тип СЛЦ Параметры Группа РС Группа сравнения Контрольная группа

Содержание в СМЖ 0,009-3,8 (0,76) 0,018-0,12 ' (0,037) 0-0,083 (0,036)*

Частота повышения 85% 8% -

X Содержание в СМЖ 0,001 - 0,068 (0,0076) 0,004- 0,01 (0,002) 0 - 0,003 (0,001)

Частота повышения 45% 6% -

Примечание: * - разброс значений и среднее значение (в скобках)

Для подсчета индексов к- и А.-цепей, являющихся показателями интра-текального синтеза легких цепей ( Fagnart е1 а1., 1988 ), дополнительно определяли содержание альбумина в СМЖ и сыворотке. Индексы вычисляли по формуле:

СЛЦ-к(Л)цсж I СЛЦ-к (Х)сыв

_ (Fagnartetal., 1988 )

альбцсж / альбсыв

Среднее значение индекса к-цепей у больных РС было достоверно выше, чем в контрольной группе - 20,19 и 1,13, соответственно. Частота повышенного индекса к-цепей у больных РС составляла 90%. Среднее значение индекса л-цспей у больных РС также достоверно отличалось от этого показателя в группе контроля - 2,31 и 0,34, соответственно, и было повышенным у 46% больных РС. У всех больных с другими неврологическими заболеваниями индексы к- и А.-цепей были в пределах нормы. Таким образом, использование индексов к- и А.-цепей повышает диагностическую специфичность анализа.

19

В ЫВОДЫ

1. Получены два семейства МКАТ против к -и Я -цепей иммуноглобулинов человека, распознающие эпитопы двух типов: эпитопы, экспрес-сированные постоянно как на целостных молекулах иммуноглобулинов, так и на свободных легких цепях, и эпитопы, экспрессированные только на свободных легких цепях.

2. Среди полученных МКАТ отобраны реагенты, распознающие наиболее консервативные антигенные детерминанты легких цепей и сохраняющие антиген-связывающую активность после иммобилизации на твердой фазе или присоединения ферментной метки.

3. МКАТ против постоянно экспрессированных эпитопов легких цепей могут использоваться для выявления иммуноглобулинов, а также для типиро-вания их сыворотках больных множественной миеломой с помощью иммуно-ферментных методов.

4. На основе сочетанного применения МКАТ против скрытых и постоянно экспрессированных эпитопов легких цепей разработаны двух-детерминантные иммуноферментные методы количественного определения свободных к- и Я-цепей в сыворотке, моче и спиномозговой жидкости.

5. Повышенное содержание свободных легких цепей одного типа и снижение уровня свободных легких цепей альтернативного типа, указывающее на моноклональную природу заболевания, обнаружено в сыворотке 58% и в моче 79% больных множественной миеломой.

6. В спиномозговой жидкости больных рассеянным склерозом повышенное содержание свободных к-цепей выявлено у 85% больных. У 45% больных одновременно было повышено и содержание свободных Я-цепей. Изолированного повышения содержания свободных Я-цепей не обнаружено. Частота увеличения концентрации свободных легких цепей при других неврологических заболеваниях не превышала 8%.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Климович В.Б., Грязева И.В., Самойлович М.П. и др. Диагностические тест-системы на основе моноклональных анти-иммуноглобулиновых реагентов. //Тез.докл.Всссоюзн. конф. '"Современные направления создания медицинских диагностикумов."- М., 1988.-.С.7.

2. Климович В.Б., Грязева И.В., Желудов В.И. и др. Моноклональные антитела против иммуноглобулинов человека в диагностике В-лимфо-

цитарных неоплазий. //Тез.докл.Всесоюзн.конф."Актуальные вопросы в биохимической и иммунологической диагностике злокачественных новообразований."- М., 1989.-С.39-40.

3. Klimovich V.B., Gryazeva I.V., PastiKova S.F. Monoclonal antibody-based serum Bence-Jones proteins detection. //J. of Tumor Marker Oncology.- 1990, V.5.-N.3.- P.241. '

4. Грязева И.В., Климович В.Б., Желудос В.И. и др. Тест-система на основе моноклональных антител для свободных легких цепей иммуноглобулинов человека. //Тез.докл.ьоесоюзн. конф. "Современные направления создания медицинских диагностикумов."-М., 1990.-С. 17.

5. Климович В.Б., Грязева И.В., Желудов В.И. и др. Моноклональные антитела против легких цепей иммуноглобулинов человека. II Моноклональные антитела в медицине и биотехнологии./Сб.трудов НИИВС им.И.И.Мечникова. - М., 1990,- С.46-56.

6. Бисага Г.Н., Грязева И.В., Климоы;ч В.Б. Диагностическая информативность определения свободных легки;; цепей иммуноглобулинов при рассеянном склерозе.//Нейроиммунология на пороге XXI века: Матер, рабочего совещания.-С.-Пб.-1993.-С. 10-13.

7. Totolian N.A., Gryazeva I.V., Klimovich V.B. et al. Free immunoglobulin light chains'in cerebrospinal fluid (CSF) of patients with multiple sclerosis (MS) and other non-infectious neurological diseases (NIND).// 2nd International Congress ISNIM.- Paestum (Salerno), Italy.- 1993,- P.342.

8. Totolian N.A., Gryazeva I.V., Klimovich V.B., Freidlin I.S. The immunological tests in differentiation between multiple sclerosis (MS) and other neurological diseases. //Allergy (Europ.J.of Allergy and Clin.Immunol.).-1993.-V.48.-N.16 (suppl.)-P.57.

9.Тотолян H.A., Грязева И.В., Климович В.Б., Тотолян А.А. Интра-текальный синтез свободных легких цепей иммуноглобулинов и его связь с другими иммунными нарушениями у больных рассеянным склерозом. // Иммунология,- 1994.-N. 1.- С.54-57.

10. Грязева И.В., Климович В.Б., Пашкова С.Ф. Моноклональные антитела к легким цепям иммуноглобулинов человека и их применение в иммуноанализе.// Иммунология.- 1994.- N.3.- С.31-37.

11.Тотолян Н.А., Грязева И.В., Климович В.Б., Скоромец А.А. Содержание свободных легких цепей иммуноглобулинов в ликворе и значение его определения для дифференциальной диагностики рассеянного склероза.// Журнал невропатологии и психиатрии им С.С.Корсакова.- Т.94.- С.49-53.

12.Klimovich V.B., Gryazeva I.V., Totolian N.A., BisagaG.N. Monoclonal antibody-based assays for free light chains of human immunoglobulins and its

diagnostic applications. // International conference «Biotechnology St. Peterburg'94». — 1994.— P. 52—53.

13. Климович В. Б., Грязева И. В., Самойлович М. П. и др. Выявление парапротеинов с помощью моноклональных антител (МКАТ) // Актуальные вопросы гематологии: Тез. докл. всеармейской научн. конф. 26—27 октября 1995 г.— СПб, 1995, —С. 70—71.

14. Климович В. Б., Грязева И. В., Самойлович М. П. и др. Выявление свободных легких цепей (СЛЦ) и белков Бенс-Джонса с помощью иммуноферментных тест-систем // Актуальные вопросы гематологии: Тез. докл. всеармейской научи, конф. 26—27 октября 1995 г. —СПб, 1995, — С. 69—70.

Отпечатано с оригинал-макета. Формат бумаги 60x84'/is- Печ. л. 1,25. Тираж 100 экз. Заказ 284.

ГППП-3. 191104, Санкт-Петербург, Лптепныи пр.. 55