Автореферат и диссертация по медицине (14.01.01) на тему:Полиморфизм генов ферментов детоксикации, антиоксидантной защиты и репарации ДНК в генезе невынашивания беременности

На правах рукописи

Морозова Ксения Владимировна

ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ ФЕРМЕНТОВ ДЕТОКСИКАЦИИ, АНТИОКСИДАНТНОЙ ЗАЩИТЫ И РЕПАРАЦИИ ДНК В ГЕНЕЗЕ НЕВЫНАШИВАНИЯ БЕРЕМЕННОСТИ

14.01.01 — акушерство и гинекология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

3 ПАР 2015

005559696

Москва-2015

005559696

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения России

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Макаров Олег Васильевич

доктор биологических наук Сальникова Любовь Ефимовна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Волкова Елена Вячеславовна

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, первое акушерское отделение патологии беременных, ведущий научный сотрудник

доктор медицинских наук Мурашко Андрей Владимирович

Государственное бюджетное учреждение здравоохранения высшего профессионального образования «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, кафедра акушерства и гинекологии №1 лечебного факультета, профессор кафедры

Ведущая организация:

Государственное бюджетное учреждение здравоохранения Московской области "Московский областной научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии"

Защита диссертации состоится «_»_2015года в 14.00 часов на

заседании диссертационного совета Д 208.072.12 при ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И.Пирогова по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И.Пирогова и на сайте http://rsmu.ru по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1

Автореферат разослан «..........»............................2015года

Ученый секретарь Диссертационного совета

доктор медицинских наук,

профессор Хашукоева Асият Зульчифовна

Список сокращений

НБ - невынашивание беременности

АФК- активные формы кислорода

ПОЛ - перекисное окисление липидов

ХГЧ - хорионический гонадотропин человека

АФС - антифосфолипидный синдром

HLA - Human leycocyte antigens

ГП - генный полиморфизм

CP - свободные радикалы

СОД - супероксиддисмутаза

КОМТ - катехол-О-метилтрансфераза

ГП 4 - глутатион пероксидаза 4

NRF2 - ген транскрипционного фактора

SOD2 - ген супероксиддисмутазы 2

CAT- ген каталазы

GCLC - ген глутатионцистеинлигазы

GPX 4 - ген глутатион пероксидазы 4

CYP1A1 - ген цитохром Р 450

СОМТ- ген катехол-о-метилтрансферазы

OGGI- ген 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазы

SNPs-single nucleotide polymorphism - однонуклеотидный полиморфизм

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Невынашивание беременности является одной из наиболее актуальных проблем здравоохранения и современного акушерства, частота которой составляет от 10% до 25%, причем в I триместре она достигает 50% (Макаров О.В., Волкова Е.В., 2014; Сидельникова В.М., 2012; Legendre G et all, 2014).

Известно множество причин, приводящих к ранним репродуктивным потерям (Доброхотова Ю.Э., 2011; Торчинов А. М. и соавторы, 2013; Gallot V. et all, 2014; Mathur N. et all, 2013).

Многочисленные исследования антиоксидантной системы показали, что нарушения в данной системе могут лежать в основе практически всех мультифакториальных заболеваний (Майкова Е.В. и соавторы, 2012; Charniot J.C. et all, 2011; Feng Y. et all, 2013). За функционирование антиоксидантной системы в организме человека отвечают определенные гены, кодирующие активность ферментов антиоксидантной защиты (Milonski J. et all, 2014). Ферменты антиоксидантной системы в структуре своих генов имеют функционально неравноценные аллели (Золотухин П.В., 2010; Сальникова Л.Е., 2011).

В генезе ранних репродуктивных потерь система редокс-гомеостаза, главным компонентом которой является сеть ферментов антиоксидантной защиты, также играет немаловажную роль (Мурашко А.В., 2010; Хашукоева А.З. и соавторы, 2009; Gharesi-Fard В. et all, 2013).

Активные формы кислорода, вырабатываемые в ходе ферментативных реакций в тканях организма, находясь в физиологических концентрациях, регулируют важнейшие биологические процессы в клетках, но как только концентрация активных форм кислорода начинает превышать физиологический уровень, их действие может приводить к активации разрушающих процессов, сопровождающихся структурными повреждениями молекулы ДНК и возникновением генных мутаций (Кулинский В.И.,и соавторы 2014; Gurses D Md. et all, 2014).

Помимо эндогенных свободных радикалов, существенный вклад в функционирование клеток организма вносит воздействие окружающей среды, в том, ксенобиотиков (Pragyan P. et all, 2014). В процессе метаболизма ксенобиотиков происходит накопление промежуточных веществ, обладающих токсическими, мутагенными и канцерогенными свойствами (Козлова Н.М.,2009). В норме элиминация ксенобиотиков осуществляется благодаря системе ферментативных реакций детоксикации, являющихся также генетически детерминированными. При наличии структурных вариаций генов, обуславливающих синтез ферментов со сниженной активностью, организм оказывается ослабленным перед постоянной атакой чужеродных экзогенных соединений (МериноваН.И., и соавторы,2012).

Известно, что в организме человека все внутриклеточные взаимодействия осуществляются благодаря нейромедиаторам, выполняющим роль переносчиков импульсов от нервной системы к органам, имеющим в клетках специфические рецепторы (Feng Y. et all, 2013; Lee Y.H. et all, 2014). Изменения структуры генов, отвечающих за выработку ферментов, неодинаково влияют на процессы метаболизма катехоламинов, что может сопровождаться различными негативными последствиями для организма, включающими, как предполагается, и нарушения нормального течения беременности (Nikolac Perkovic М. et all, 2013).

Научные исследования последних десятилетий доказали, что процессы перекисного окисления лнпидов и воздействие на организм ксенобиотиков оказывают мутагенное влияние на структурную основу молекулы ДНК, являющейся носителем генетической информации всего организма (Corral R. et all, 2013; Srivastava A. et all, 2009). В случае неполноценной активности ферментов репарации ДНК нарастает концентрация дефектов, что приводит к формированию мутаций, которые получают свое фенотипическое проявление в развитии патологии различных органов и систем (Баранов B.C., 2012).

В связи с этим, важное значение имеет комплексное молекулярно-генетическое исследование генов, кодирующих комплекс ферментов

описанных выше защитных систем организма для выявления функциональных полиморфных вариантов и определения активности соответствующих ферментов в зависимости от вариабельности аллелей. Такое исследование позволит оценить влияние полиморфных вариантов исследованных генов на формирование предрасположенности к невынашиванию первой половины беременности.

Цель исследования: Определить влияние полиморфных вариантов генов ферментов антиоксидантной системы, системы обмена катехоламинов и системы эксцизионной репарации ДНК на невынашивание беременности с целью профилактики потерь последующих беременностей.

Задачи исследования:

1. Провести комплексное обследование пациенток с невынашиванием беременности.

2. Провести генотипирование с целью определения частоты встречаемости функциональных полиморфных вариантов генов: NRF2, CAT, SOD2, GPX4, GCLC, CYP1A1, СОМТ, OGG1 у пациенток с невынашиванием беременности и у женщин с физиологически протекающей беременностью.

3. Установить степень риска возникновения НБ у женщин — носителей аллелей генов, ассоциированных с невынашиванием.

4. В случае выявления ассоциации полиморфного варианта исследуемых генов с риском невынашивания беременности определить влияние генотипа на активность соответствующего фермента.

5. В случае выявления ассоциации полиморфных вариантов исследуемых генов с риском невынашивания беременности провести анализ взаимосвязи генотипов с развитием соматической патологии, негативно влияющей на течение беременности.

Научная новизна

Впервые установлено, что полиморфизм генов NRF2, CAT, SOD2, GPX4, GCLC, CYP1A1 не ассоциирован с невынашиванием беременности. Впервые выявлена ассоциация между носительством аллеля A rs 4680 гена СОМГ и аллеля G rsl052133 гена OGG1 и невынашиванием беременности. Установлено, что носительство вышеуказанных аллелей повышает риск НБ в 1,62 и в 1,72 раза. Показано значение снижения активности фермента катехол-О-метилтрансферазы у женщин с невынашиванием беременности. Предлагаемые генетические предикторы невынашивания беременности аллель A rs 4680 гена СОМГ и аллель G rsl052133 гена OGG1 позволят расширить возможности диагностики риска репродуктивных потерь на этапе предгравидарной подготовки.

Практическая значимость

На основании проведенных исследований установлено, что носительство аллеля A rs 4680 гена СОМГ и аллеля G rsl052133 гена OGG1 является фактором риска НБ. Генотипирование женщин с невынашиванием беременности может быть рекомендовано, при исключении других причин НБ, как способ формирования групп риска, что может являться обоснованием для проведения антиоксидантной и седативной терапии, как в качестве предгравидарной подготовки, так и в сроке гестации до 20 недель. Носителям аллеля A rs 4680 гена СОМГ и аллеля G rsl052133 гена OGG1 показано проведение дообследования на предмет своевременной профилактики развития анемии во время беременности.

Положения, выносимые на защиту:

1. Полиморфные варианты генов N№2, САТ, БСЮ2, СРХ4, вСЬС, СУР1А1 не являются фактором риска НБ.

2. Неблагоприятным для нормального течения беременности является наличие аллеля А ге 4680 гена СОМТ и аллеля в гз1052133 гена ОБа как в гомозиготном, так и в гетерозиготном состоянии.

3. У женщин с аллелем А гэ 4680 гена СОМТ и аллелем в гэ 1052133 гена СЮ01, вероятность невынашивания беременности увеличивается в 1,61 и в 1,72 раза соответственно по сравнению с женщинами, имеющими альтернативные аллели.

4. Снижение активности фермента катехол-О-метилтрансферазы ассоциировано с невынашиванием беременности.

Внедрение результатов исследования

Результаты проведенной работы внедрены в практику гинекологических отделений ГБУЗ «Городская клиническая больница №4» Департамента здравоохранения города Москвы и ГБУЗ «Городская клиническая больница №40» Департамента здравоохранения г. Москвы, а также используются в педагогическом процессе на лекциях и занятиях для студентов, ординаторов и аспирантов кафедры акушерства и гинекологии ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Апробация диссертации

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на научно-практической конференции коллектива сотрудников кафедры акушерства и гинекологии №1 лечебного факультета ГБОУ ВПО РНИМУ им Н.И. Пирогова Министерства здравоохранения Российской Федерации и врачей ГБУЗ ГКБ №4, Родильного дома №10 18 июня 2014 года, протокол № 7.

Личное участие автора

Автором лично проведена работа по клинико-инструментальному обследованию тематических пациенток, анализу клинико-лабораторных данных. Проведен сбор, а также статистическая обработка данных и анализ результатов исследования.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 3 научные работы, в том числе 2 в изданиях, рецензируемых ВАК Минобрнауки РФ.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 140 страницах печатного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, клинической характеристики обследованных групп пациенток, описания полученных результатов, заключения, выводов и списка использованной литературы, содержащего 84 отечественных и 82 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 3 таблицами и 21 рисунком.

Материалы и методы исследования

Сбор клинического материала для исследования проводился на клинических базах кафедры акушерства и гинекологии №1 лечебного факультета РНИМУ им. Н.И. Пирогова (заведующий кафедрой - д.м.н., профессор, заслуженный врач России О.В. Макаров).

Материалы диссертационной работы получены в результате комплексного клинико-лабораторного обследования 274 женщин. Основную группу составила 151 пациентка с 2 и более потерями беременности в анамнезе на сроке более 7 недель. Критериями исключения из группы являлись случаи тяжелых аномалий кариотипа (анэмбриония), а также беременности, наступившие в результате ЭКО. Всем пациенткам, включенным в основную группу, было проведено кариотипирование абортусов, с целью исключения грубых аномалий кариотипа, как причины потери беременности.

Для контрольной группы было отобрано 123 женщины с 2 и более беременностями в анамнезе, протекавшими без угрозы прерывания и закончившимися своевременными самопроизвольными родами. Из группы исключались пациентки с кровяными выделениями во время беременности, а также с эпизодами репродуктивных потерь в анамнезе.

Пациенткам обеих групп было выполнено клинико-лабораторное обследование согласно современным медико-экономическим стандартам.

Проведено генотипирование пациенток с целью выявления полиморфизма следующих генов: генов антиоксидантной системы CAT, GPX4, GCLC, SOD2, NRF2, системы детоксикации ксенобиотиков гена CYPJA1, гена, отвечающего за обмен катехоламинов СОМТ, гена репарации ДНК OGG1.

Специальные генетические методы исследования выполняли на базе Учреждения Российской Академии Наук Института общей генетики им Н.И.Вавилова, лаборатории экологической генетики (заведующий лабораторией - д.б.н. Рубанович A.B.) [Таблица №1].

В ходе исследования выделяли ДНК из образцов крови с использованием наборов реактивов Diatom DNA Prep 200 (Isogene Lab.Ltd, страна производитель Россия). Постановку реакции осуществляли согласно методу, заявленному производителем.

Для проведения ПЦР реакции использовали лиофилизированные готовые наборы Master Mix (Фирма Изоген). Постановку реакции осуществляли согласно протоколу, заявленному производителем.

Определение активности катехол-о-метилтрансферазы

Определение активности фермента катехол-о-метилтрансферазы осуществляли согласно методике, описанной Zurcher.G.(1982).

Таблица 1.

Специальные методы исследования

Вид исследования (ПЦР-реакция) Количество исследований

гб 6721961 (0617Т) гена N№2 196

ге 17880664 (Т21С) гена САТ 188

я я ге 713041 (С44Т) гена СРХ4 176

<я а о ге 4880 (Т47С) гена БСЮ2 196

П. К с гб 17883901 (С129Т) гена вСЬС 196

я н о гэ 1048943 (А4889С) гена СУР1А1 174

и ге 4646903 (Т3801С) гена СУР1А1 196

ге 4680 (в1947А) гена СОМТ 174

гэ 1052133 (С977в) гена Овв! 190

Определение активности фермента СОМТ 274

Кариотипирование 151

Всего 2113

Статистическая обработка данных

Для статистической обработки полученных результатов использовали программу «8ТАТ18Т1СА у.7.0».

Клиническая характеристика групп По результатам проведенного анализа установлено, что группы пациенток были практически однородны по антропометрическим показателям, профессиональному и социальному статусам. Для исключения конфаунд-факторов в исследование были включены пациентки идентичной национальности (славянской), проживающие в одной географической зоне и общем климатическом поясе, преимущественно на территории города Москвы и Московской области. У пациенток основной группы достоверно чаще наблюдались такие вредные привычки, как табакокурение - 23,84% пациенток основной группы, %2=5,7; р=0,022 и употребление алкоголя - у 17,21 % (п =26) пациенток основной группы, тогда как в контрольной на потребление алкоголя указало всего 3 пациентки, что составило 2,43%, %2 =15,65; р=0,0001.

Очевидной является патогенетическая связь высокого уровня стресса с формированием не только соматических заболеваний, но и патологического течения беременности, что подтверждается результатами нашего исследования. Среди пациенток основной группы 62,9 % (п=95) указали на высокий уровень тревожности, что было достоверно чаще, чем у пациенток контрольной группы 36,58% (п=45) соответственно, х2 =18,80; р=0,001.Так, пациентки основной группы значительно чаще отмечали у себя признаки хронического стресса по сравнению с женщинами контрольной группы, проживающими в более благоприятных психоэмоциональных условиях.

На течение беременности прямое влияние оказывает общее соматическое здоровье матери. Связь пониженного уровня здоровья с неблагоприятным течением беременности имела место и в нашем исследовании. По результатам сравнений в группе пациенток с невынашиванием чаще наблюдались такие мультифакториальные патологии, как нарушение жирового обмена - 39,07 % обследованных пациенток основной группы, в контрольной группе этот показатель оказался значительно ниже и составил 19,51% (п= 24), %2=12,5; р=0,0005. Артериальная гипертензия выявлена в основной группе в 22,51 % (п=34) наблюдениях, в контрольной группе данная патология выявлена всего у 5 пациенток - 4,06 %, что было достоверно ниже %2 18,9; р=,0001. Анемия во время беременности выявлена в основной группе в 47,01 % (п=71), а в контрольной группе у 28,45% (п=35) пациенток, х2 9,85; р=0,001.

Среди заболеваний желудочно-кишечного тракта чаще встречался хронический гастрит - в основной группе он выявлен у 43,70 % (п=66) пациенток, тогда как в контрольной - 21,13% (п=26) всех наблюдений, %2 15,48; р=0,0001. У пациенток основной группы чаще наблюдалась дискинезия желчевыводящих путей -13,90 % (п= 21), в контрольной группе эта патология наблюдалась достоверно реже, у двух пациенток, и составила 1,62% : х2 15,6; р=0,0001. Заболевания поджелудочной железы также встречались чаще у женщин основной группы -11,25% (п=17), в контрольной

группе выявлены в 1,62% (п=2) , что также оказалось достоверно: х2 9,7; р=0,0001. Рассматривая изолированно экстрагенитальную патологию, нам не удалось установить ведущей причины повторяющихся эпизодов потери беременности у пациенток основной группы.

Немаловажную роль в характеристике здоровья организма играет персистенция очагов хронической инфекции экстрагенитальной локализации. В нашем исследовании наиболее часто среди хронических заболеваний ЛОР органов был выявлен хронический тонзиллит. У пациенток основной группы он встречался достоверно чаще: в 41,05% (п=62) наблюдений, в контрольной группе - у 26,01% (п =32)пациенток: х2 6,8; р=0,009. Количество пациенток с хроническим бронхитом также было различным при сравнении двух групп. У женщин основной группы эта патология выявлена в 9,27% (п=14) наблюдений, в контрольной группе хроническим бронхитом страдали всего 3 пациентки (2,43%). Коэффициент достоверности составил х2 5,1; р=0,01. Это может быть связано с тем, что в основной группе было большее количество курящих женщин. Среди заболеваний мочеполовой системы в основной группе чаще встречался хронический цистит - у 38,41 % (п=58) женщин основной группы, по сравнению с пациентками контрольной группы, где хроническое воспаление мочевого пузыря выявлено в 10,56% (п=13) наблюдений, установлена высокая достоверная разница между группами: %2 27; р=0,0002. Следует отметить, что все диагностированные воспалительные заболевания у обследованных нами пациенток находились в стадии стойкой ремиссии и являлись результатом перенесенных в анамнезе острых состояний. Таким образом, воспалительные заболевания экстрагенитальной локализации в стадии ремиссии, являлись не более чем фоновыми и не могли изолированно от других причин вызвать тяжелые осложнения беременности, а особенно приводить к невынашиванию.

Среди основополагающих характеристик репродуктивного здоровья женщины следует выделить уровень фертильности. В основной группе среднее количество беременностей составило 3,48±0,27, тогда как в

контрольной группе оно составило 2,71±0,1 с достоверной разницей: £=4,05;р=0,000067. Количество беременностей, закончившихся родами, также отличалось между группами, в основной группе - 0,80±0,06, в контрольной -2,23±0,06, 1=15, 44;р=0,0000001. Статистически большее число беременностей в основной группе связано с наличием в анамнезе у пациенток не только самопроизвольных выкидышей, но и абортов-0,55+0,09, при этом число родов оказалось намного ниже. Напротив, контрольная группа была сформирована из здоровых женщин с меньшим числом абортов - 0,45±0,08, при большом количестве самопроизвольных нормальных родов и исключением эпизодов невынашивания.

При анализе гинекологической патологии у обследованных пациенток миома матки в основной группы выявлена в большем проценте - 22,51 % (п= 34), чем в контрольной группе 7,31 % (п=9), %211,8; р=0,0006. Количество пациенток с аденомиозом в основной группе значительно превышало таковое в контрольной группе и составило 21,19 % (п=32) и 4,06% (п=5) соответственно, при проверке критерия значимости были выявлены достоверные различия: х2 17,2; р=0,0001. Такая патология молочных желез, как мастопатия и фиброаденома, также выявлена у пациенток обеих групп, в основной группе - 19,86 % (п=30), в контрольной группе заболевания молочных желез встречались достоверно реже - у 8,94% (п=11) обследованных женщин: х2 6,3; р=0,01. В нашем исследовании у пациенток основной группы хронический цервицит был выявлен в 4 раза чаще, чем в контрольной группе: в 22,51% (п=34) и 5,69% (п=7) наблюдений соответственно, X215; р=0,0001.

Хронические воспалительные заболевания придатков матки у пациенток основной группы наблюдались достоверно чаще - у 29,13 % (п=44), чем в контрольной группе - 17,88 % (п=22), х2 4,69; р=0,03. Больший процент данных заболеваний в основной группе может объясняться неоднократными случаями потери беременности у этих пациенток, сопровождающимися инструментальными внутриматочными

вмешательствами, что само по себе является фоном для развития латентного воспалительного процесса.

Терапия, направленная на пролонгирование беременности, значительно чаще назначалась пациенткам основной группы, что было связано с отягощенным течением беременности. Препараты из класса гестагенов в составе терапии, направленной на пролонгирование беременности, были назначены большинству пациенток в основной группе, их количество соответствовало 56,94% (п=88), в контрольной - 14,63% (п=18) наблюдений, X2 51,5; р=0,000001. В группах обследованных нами женщин отличалась частота приема препаратов, содержащих магний. В основной группе подавляющее большинство пациенток - 74,17 % (п=112) во время беременности принимали препараты магния, в контрольной группе также достаточно часто выявлено употребление этих препаратов - 55,28 % (п=55), X2 10,7; р=0,001. Витамин Е во время беременности принимали 92,71 % (п= 140) женщин основной группы, в контрольной группе также большинство пациенток указали на прием этого препарата 78,15% (п=93), х212; р=0,0006.

Наибольшая разница между исследованными группами установлена в приеме антиагрегантов. В основной группе эти препараты принимали 68, 87% (п=104) беременных пациенток, тогда как в контрольной группе на прием антиагрегантов во время беременности указали всего 2 женщины, что соответствовало 1,62%, достоверная разница составила: х2 129,2; р=0,0000001.

Результаты проведенного генотипирования

Хорошо известно, что необходимым условием для поддержания на физиологическом уровне концентрации катехоламинов является выработка данного фермента с нормальной активностью (Патрушев Л.И., 2012).

Резко возрастающая под воздействием стресса концентрация вырабатываемых катехоламинов может крайне негативно влиять на организм беременной женщины, особенно при недостаточности процессов их обмена и элиминации (Feng Y. et.all, 2013).

Ранее было показано, что носительство вариантных аллелей rs 4680 гена СОМТ сопряжено с выработкой фермента с разным уровнем активности (Lin G.et.all,2013). Так, наличие аплеля G в гомозиготном состоянии сопровождается секрецией активного фермента катехол-о-метилтрансферазы, тогда как в гетерозиготном состоянии (генотип G/A) активность фермента снижается вдвое, а гомозиготность по аллелю А коррелирует с 3-4 кратным снижением активности катехол-о-метилтрансферазы (Feng Y. et.all, 2013).

По результатам проведенного нами генотипирования статистически достоверные данные получены при сравнении пациенток с невынашивнием беременности на сроке более 10 недель с группой контроля. Здесь наблюдалось значительное превалирование дикого аллеля G в гомозиготом состоянии у здоровых пациенток (%2= 10,31, р=0,0013), что говорит о протективной роли данного аллеля G.

60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%

СОМТ G/G СОМТ С/А СОМТ А/А

Рис.1. Распределение генотипов rs 4680 (A1947G) гена СОМТ у пациенток при потере беременности на сроке более 10 недель.

Примечание: - *различия статистически достоверны, р< 0,05 при сравнении основной и контрольной групп

С целью выяснения характера проявления наследуемого признака нами был проведен аддитивный тест Кохрана-Армитажа. По результатам наибольший эффект получен для доминантной модели наследования аллеля А, из чего следует что оба генотипа А/А и G/A являются рисковыми по развитию невынашивания беременности у данных пациенток (х2=5,47, р=0,02). Также нами установлено, что у пациенток-носителей аллеля А

имеется повышенный шанс потери беременности в первой половине гестации (OR=l,61, р=0,02, 95% df= 1,06-2,43) (Рис.1).

По результатам проведенного исследования установлено, что у носителей минорного генотипа А/А наблюдалась самая низкая активность фермента 226,52±79,18 мкмоль /мг; у женщин с гетерозиготным генотипом активность фермента была достоверно выше и составила 335,88 ± 82,74 мкмоль /мг; а у носителей генотипа G/G активность фермента была самой высокой 564,67± 156,77 мкмоль /мг (Рис.2).

СОМТА/А СОМТА/С СОМТ в/в

Рис.2. Средняя активность катехол-О-метилтрансферазы у женщин основной и контрольной групп в зависимости от генотипа гв 4680 (А1947С) гена СОМТ.

Примечание: - *различия статистически достоверны, р< 0,05 при сравнении основной и контрольной групп

Таким образом, установлена статистически достоверная ассоциация носительства аллеля А гя 4680 гена СОМТ со снижением активности фермента катехол-о-метилтрансферазы и невынашиванием беременности у обследованных нами пациенток.

Один из механизмов, описанных ранее, связан с прямым воздействием катехоламинов на рецепторы миометрия и стенку маточных сосудов, приводящих к повышению тонуса матки и нарушению маточно-

плацентарного кровотока, что, как известно, сопровождается недостаточной трофикой и создает условия для прерывания беременности (Cavalieri Е. Et all, 2008). Метаболизм эстрогенов включает процессы гидроксилирования, приводящие к образованию катехолэстрогенов, семихинонов и хинонов. Катехолэстрогены обладают высокой эстрогенной активностью и являются основой для образования хинонов, несущих мощное прямое мутагенное и генотоксическое воздействие на ДНК (Lee YH. et all, 2014). Процессы инактивации катехолэстрогенов протекают при обязательном участии катехол-о-метилтрансферазы, однако катехоламины сами по себе угнетают активность СОМТ, что влечет за собой недостаточную инактивацию 4-гидроксиэстрогенов, характеризуемых высокой генотоксичностью. Таким образом, генетически опосредованная недостаточная эффективность фермента СОМТ, может приводить к каскаду цепных реакций, активирующих процессы генотоксического повреждения ДНК.

Мы предполагаем, что этот механизм может реализоваться на всех этапах гестации от момента имплантации и эмбриогенеза.

100% *____ж______

80% ^^В

so% - ■ ■ ■

40% ^^Н_^^В

■ ■L

ПО/. -------- ----------------------------

I А/А +G/A IG/G

Миома матки

Аденомиоз

Рис.3. Распределение частоты встречаемости эстрогензависимых заболеваний в зависимости от генотипа гэ 4680 гена СОМТ.

Примечание: - ^различия статистически достоверны, р< 0,05 при сравнении основной и контрольной групп

Возникающая в таких условиях генотоксическая нагрузка, вероятно, вносит немалый вклад в прерывание беременности. Данная гипотеза подтверждается большей предрасположенностью пациенток с

невынашиванием беременности в нашем исследовании при наличии аллеля А rs 4680 гена СОМТ к таким эстрогенозависимым заболеваниям, как миома матки, аденомиоз и фиброзно-кистозная мастопатия (Рис.3).

В ходе нашего исследования мы выявили взаимосвязь риска развития анемии во время беременности с носительством аллелей rs 4680 гена СОМТ. Установлено, что у носителей аллеля А (генотип G/A и А/А) шанс возникновения анемии в 1,93 раза выше, по сравнению с аллелем G, (OR=l,93, р=0,02, 95% df= 1,34-2,8) (Рис. 4).

Рис.4. Распределение генотипов ге 4680 (А1947С) гена СОМТ у пациенток с анемией во время беременности.

Примечание: - ^различия статистически достоверны, р< 0,05 при сравнении основной и контрольной групп

Полученный результат может объясняться возможным снижением уровня эритропоэза у данных пациенток в связи с наличием у них гиперэстрогении, что также подтверждено нашим исследованием.

Принимая во внимание тот факт, что и катехолэстрогены, и множество других эндогенных и экзогенных метаболитов оказывают мощное генотоксическое влияние на молекулу ДНК, крайне важным механизмом поддержания ее нормальной структуры являются восстановительные процессы репарации. Одним из основных звеньев является система эксцизионной репарации, гены которой и являются предметом нашего исследования.

Под контролем гена OGG1 происходит синтез фермента 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазы, обеспечивающего вырезание окисленных оснований из молекулы ДНК, однако у вариантных аллелей гена может иметь место ослабление ферментативной активности, а, следовательно, и уменьшение эффективности процессов репарации с накоплением структурных повреждений. Давно известно, что особенно в ранние сроки беременности, в период эмбрио- и органогенеза процессы мутагенеза приобретают особенную значимость.

По результатам проведенного нами генотипирования на предмет распределения аллелей rs 1052133 гена OGG1 установлено, что неблагоприятный аллель G в гомозиготном состоянии, по данным ранее проведенных исследований ассоциированный с выработкой менее активного фермента 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазы (Maga G. et all, 2007) в основной группе наших пациенток наблюдался значительно чаще: х2 =5,09, р=0,02.

Наибольший эффект получен для доминантной модели наследования минорного аллеля G, на основании чего можно утверждать, что и гомозиготный генотип G/G и гетерозиготный C/G являются рисковым по невынашиванию беременности: х2=4,29, р=0,03 (Рис.5). Аллель G в 1,61 раза повышает риск потери беременности в первой половине гестации (OR=l,62, р=0,04, 95%, df= 0,38-0,99). Также в ходе нашего исследования мы выявили ассоциацию носительства минорного аллеля G с риском развития анемии во время беременности, (OR=l,65, р=0,04, 95%, df= 0,38 - 0,96) (Рис.5).

Полученные результаты свидетельствуют о наличии множества опосредованных механизмов, способных нарушить нормальное течение гестации, и дальнейшее их изучение позволит в большой степени снизить их пагубное проявление. Возможность практического применения полученных нами результатов, заключается в формировании группы повышенного риска невынашивания беременности.

40%

70%

60%

50%

30%

20%

10%

0%

Т7

■ Контрольная группа

■ Основная группа

овас/с

Овв1С/в

Овв1 в/в

Рис.5 Распределение генотипов «1052133 (С977С) гена Овв! у пациенток основной и контрольной групп.

Примечание: - ^различия статистически достоверны, р< 0,05 при сравнении основной и контрольной групп

Известно, что многие эндогенные процессы в организме протекают с образованием АФК и свободных радикалов, в норме инактивируемых ферментами антиоксидантнй системы (Зенков Н.К., 2009).

При неэффективности защитных функций в организме происходит накопление генотоксикантов, воздействующих на все органы и системы, что особенно актуально во время беременности (Золотухин П. В., 201 Ог; Майкова Е.В. и соавторы, 2012). Чужеродные вещества, попадающие в организм из загрязненной окружающей среды, именуются ксенобиотиками. Для их нейтрализации также активно функционирует система детоксикации, благодаря слаженному взаимодействию ряда ферментов. Так же как и от антиоксидантной системы, от системы детоксикации зависит поддержание нормального гомеостаза организма, что становится невозможным в условиях недостаточно эффективной защитной функции (По М.Т. й аП, 2014). Учитывая генетическую детерменированность данных процессов, связь изменений в структуре генов с предрасположенностью к различным заболеваниям, а также отсутствие данных об изучении их в контексте невынашивания беременности, нам представлялось интересным проследить

влияние носительства аллелей полиморфных вариантов генов NRF2, CAT, SOD2, GPX4, GCLC и CYP1A1 на риск невынашивания беременности.

На основании результатов изучения выбранных нами однонуклеотидных полиморфных вариантов генов ферментов антиоксидантной системы и системы детоксикации ксенобиотиков мы пришли к выводу, что наличие рассмотренных однонуклеотидных замен rs 6721961 гена NRF2, rs 17880664 гена CAT, rs 4880 гена SOD2, rs 713041 гена GPX4, rsl7883901 гена GCLC и rsl048943 и rs4646903 гена CYP1A1 не ассоциировано с риском потери беременности в первые 20 недель гестации.

Выводы

1. Риск невынашивания I половины беременности при наличии аллеля A rs 4680 гена СОМТ у женщин в 1,61 раза выше, чем при наличии альтернативного аллеля G rs 4680 гена СОМТ в сроке более 10 недель гестации.

2. Риск невынашивания I половины беременности при наличии аллеля G rsl052133 гена OGG1 на течение беременности у женщин в 1,72 раза выше, чем при наличии альтернативного аллеля С rsl052133 гена OGG1 вне зависимости от срока гестации.

3. Полиморфные варианты генов NRF2, CAT, SOD2, GPX4, GCLC, CYP1A1 не являются фактором риска НБ.

4. Средняя активность фермента катехол-О-метилтрансферазы у женщин с НБ на 25% ниже, чем у женщин, не имеющих репродуктивных потерь.

5. Средняя активность фермента катехол-О-метилтрансферазы отличается у носителей различных генотипов соответствующего гена; она минимальна у носителей генотипа А/А rs 4680 гена СОМТ, имеет промежуточное значение у носителей генотипа G/A и максимальна - у носителей генотипа G/G.

6. Аллель A rs 4680 гена СОМТ ассоциирован не только с риском невынашивания беременности, но и с развитием анемии, миомы матки, фиброзно-кистозной мастопатии и аденомиоза.

Практические рекомендации

1. У женщин с НБ в анамнезе необходимо включить в комплексное обследование генотипирование для выявления наличия неблагоприятных аллелей Г81052133 гена ОСа и ге 4680 гена СОМТ с целью прогнозирования возможного риска НБ.

2. У женщин, имеющих аллель А гэ 4680 гена СОМТ, особенно в гомозиготном состоянии, показано профилактическое назначение седативных препаратов с целью снижения выработки естественных катехоламинов.

3. Носителям аллеля А гэ 4680 гена СОМТ и аллеля О гэ 1052133 гена ОСС1 показано проведение дообследования на предмет своевременной профилактики развития анемии во время беременности.

4. С целью предгравидарной подготовки и во время беременности женщинам, имеющим аллель в гэ 1052133 гена ОСС1, проводить курсы антиоксидантной терапии для снижения генотоксического эффекта.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Морозова, К.В. Гены оксндатнвного ответа как предикторы привычного невынашивания беременности /М.Б. Хаджиева, К.В.Морозова К.В./ /Материалы V Всероссийского с международным участием медико-биологического Конгресса молодых учёных «Симбиоз-Россия 2012».-2012,- С. 182-184.

2. Морозова К.В. Роль полиморфизма генов ферментов системы обмена катехоламинов и эксцизионной репарации ДНК в генезе невынашивания беременности /О.В.Макаров, Н.Н.Луценко, К.В.Морозова // Вестник Российского Государственного медицинского университета.- 2014.-№1- С.31-36.

3. Morozova K.V. Association of oxidative stress-related genes with idiopathic recurrent miscarriage/ Lutcenko N.N., Salnikova L.E. et all// Free Radical Research. - 201448(5):534-41

Подписано в печать 12.12.2014 г. Формат А5 Бумага офсетная. Печать цифровая. Тираж 20 Экз. Заказ № 1512-2-15 Типография ООО "Ай-клуб" (Печатный салон МДМ) 119146, г. Москва, Комсомольский пр-кт, д.28 Тел. 8-495-782-88-39