Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Поиск антагонистов пуриновых рецепторов среди конденсированных производных индола и изучение их фармакологических свойств

На правах рукописи

005053472

БУКАТИНА ТАТЬЯНА МИХАЙЛОВНА

ПОИСК АНТАГОНИСТОВ ПУРИНОВЫХ РЕЦЕПТОРОВ СРЕДИ КОНДЕНСИРОВАННЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ИНДОЛА И ИЗУЧЕНИЕ ИХ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ

14.03.06 Фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 8 ОКТ 2012

Волгоград 2012

005053472

Работа выполнена в ГБОУ ВПО «Волгоградский государствен^ медицинский университет» Министерства здравоохранения и социально развития РФ, ГБУ «Волгоградский медицинский научный центр»

Научный руководитель:

Академик РАМН, заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор

Спасов Александр Алексееви

Резников Константин Михайлович

доктор биологических наук

Бугаева Любовь Ивановна

Ведущая организация: ФГБУ НИИ Фармакологии им. В.В.Закусова РАМН Защита диссертации состоится «7» ноября 2012

.. ■ ----------- —^—■■"'■"I"1_■ - г. на заседании

Диссертационного Совета Д 208.008.02 ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития РФ (400131, г. Волгоград, пл. Павших Борцов, 1). С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития РФ

Автореферат разослан .....

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

Бабаева А.Р.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы.

Нарушения регуляции функциональной активности тромбоцитов, ведущие : увеличению тромбогенного потенциала крови, могут быть причиной ромбоэмболии сосудов головного мозга, легких, почек [Суслина З.А., Танашян /1.М., 2003; Deepak L., Topol В.Е., 2003; Кубатиев A.A., 2009]. Показано частие тромбоцитов в патогенезе столь распространённых в настоящее время аболеваний, сопровождающиеся диссеминированным внутрисосудистым вёртыванием крови [Leon С., 2004], а также атеросклероза [Rauch U. et al., 001; Панченко Е.П., 2005], ишемической болезни сердца [Levy J.H., Smith Р.К., 000; Steimle А.Е., Lange R.A., Hillis L.D., 2004; Лупанов В.П, 2005], иабетической ангиопатии [Балаболкин М.И., 2000; Bae S.H. et al., 2003; /latsuno H. et al., 2004].

К настоящему времени в клинической практике среди антиагрегантных редств широкое применение нашли препараты блокаторы P2Yi2 пуриновых ецепторов тромбоцитов — тиклопидин и клопидогрель [Грацианский H.A., 010]. Однако такие побочные явления как развитие гематологических сложнений, аллергические реакции, кровотечений различного генеза граничивают их назначение [Pereillo J., Maftouh M., 2002].

В настоящее время накоплен обширный фактический материал,

видетельствующий о том, что Р2Угтромбоцитарные рецепторы могут

редставлять собой перспективную мишень для создания группы

нтитромбоцитарных препаратов с новым механизмом антиагрегантного

;ействия [Зиганшин А.У., Зиганшина Л.Е., Бернсток Дж., 2002; Marcet В.,

Ъарре V. Delmas et. el, 2004; Morales-Ramos A.I., Mecom J.S., Kiesow T.J. et. el.,

008]. Это объясняется тем, что активация данного подкласса Р2Y-рецепторов

а мембране тромбоцитов приводит к инициации стадии их контактной

ктивации, при которой процесс агрегации обратим [Hechler В., Vigne P., Léon

Breittmayer J. P. et. el, 1998].

Химический класс индолов считается перспективным для разработки

емореологических препаратов - эффективных ингибиторов агрегации

ромбоцитов [Черников М.В. и др., 2006; Abbracchio М.Р., Burnstock G.,

ioeynaems J.-M. et. el., 2006; Baurand A., Gachet С., 2008]. Учитывая данный

>акт, представляется интересным поиск веществ, избирательно блокирующих

уриновые рецепторы тромбоцитов, в частности, Р2У[-рецепторы, среди новых

3

соединений ряда индола: N-[(l-R' -амино) карбонил-2-(1-112-1Н-индол-3-к винил]-113-амидов и 1-К1-амино-3-(3-К2-1Н-индол-1-ил)-2-пропанолс Настоящее исследование является составной частью научно-исследовательсю работы «Изучение рецепторной активности синтетических гетероцикличесм азотсодержащих соединений» (№ государственной регистрации 01200809579 входящей в план НИР ГБУ «Волгоградский медицинский научный центр» ] 2008-2010 гг., и работы «Поиск и изучение фармакологической активное: новых производных конденсированных гетероциклических систем» (. государственной регистрации 01200609440), входящей в план НЕ Волгоградского государственного медицинского университета на 2007-2012 г Тема утверждена на заседании Специализированного Совета университе: (протокол № 10 от 25.11.2009 г.).

Цель исследования. Поиск антагонистов Р2Угрецепторов сред производных ряда индола - \:-[(1-Я'-амино) карбонил-2-(1-112-1Н-индол-3-из винил]-113-амидов и 1 -Я'-амино-З-СЗ-К2-1Н-индол-1 -ил)-2-пропанолов -изучение антиагрегантных и антитромботических свойств наиболее активны веществ.

Для дос гижения указанной цели представляется необходимым решени следующих задач:

1. Изучить Р2Угантагонистическую активность новых веществ производны индола и вещества сравнения in vitro;

2. Провести анализ зависимости между химической структурой функциональной активностью исследованных соединений по отношению P2Yi - рецепторам тромбоцитов;

3. Исследовать острую токсичность соединений, проявляющих наибольшую активность, рассчитать их терапевтический индекс и выбрать наиболее эффективные вещества для доклинического изучения специфической фармакологической активности;

4. Изучить влияние наиболее эффективного вещества и препаратов сравнения на показатели сосудисто-тромбоцитарного и коатуляционного гемостаза;

5. Оценить влияние наиболее активного соединения на вязкостные параметры крови;

Исследовать антитромботические свойства наиболее активного соединения и препаратов сравнения на моделях экспериментального тромбоза сонной артерии крыс (индуцированного поверхностной аппликацией хлоридом железа (III), электрическим током), генерализованного АДФ-индуцированного тромбоза на мышах;

Провести оценку общетоксикологических свойств наиболее активного соединения.

Научная новизна.

Впервые было проведено исследование влияния новых веществ оизводных ряда индола - N-[(l-R1-aMHHo) карбонил-2-(1-112-Ш-индол-3-ил) нил]-113-амидов и 1-К'-амино-3-(3-112-1Н-индол-1-ил)-2-пропанолов - на рвый подтип пуриновых рецепторов мембраны тромбоцитов. Впервые была тановлена взаимосвязь между структурой новых соединений и их P2Yr тагонистической активностью. Установлено, что выраженность данного вида тивности у замещённых амидов ряда индола определяется строением «естителей, а так же их сочетанием у атома углерода в положении 7, а у иноспиртов ряда индола - радикалами в положении N9.

Впервые в ходе работы получены данные о влиянии соединения Sbt-119 сосудисто-тромбоцитарный и коагуляционный гемостаз (на вязкостные рактеристики крови, агрегацию, время кровотечения, коагулографические раметры) in vitro и in vivo. Показано, что вещество Sbt-119 проявляет титромботические свойства на моделях тромбоза сонной артерии крыс, иуцированного поверхностной аппликацией хлоридом железа (III), и екгрическим током, на модели генерализованного АДФ-индуцированного омбоза на мышах.

Научно-практическая значимость работы.

Результаты выявленных закономерностей между Р2У1-антагонистической тивностью производных индола и их химической структурой могут служить новой для направленного поиска веществ, обладающих данным видом тивности. Получены данные о наличии у соединения Sbt-119 тиагрегантной активности, и способности снижать вязкость крови в условиях vitro и in vivo. Вещество Sbt-119 обладает антитромбогенным действием на »делях экспериментальных тромбозов сонной артерии крыс, индуцированного 1верхностной аппликацией хлоридом железа (III) и электрическим током, а

так же на модели генерализованного АДФ-индуцированного тромбоза н мышах. Соединение Sbt-119 менее выражено влияет на время кровотечения п сравнению с клопидогрелем.

Реализация результатов исследования.

Выявленные закономерности между химической структурой и P2Yr антагонистической активностью конденсированных производных индол; учитываются при синтезе новых соединений в НИИ физической i органической химии Южного Федерального университета. Материалы работы применяются в ГБУ Волгоградском медицинском научном центре, на кафедре фармакологии и НИИ фармакологии Волгоградского государственного медицинского университета при проведении научных экспериментов. Результаты работы включены в лекционный материал кафедры фармакологии, фармацевтической химии, фармакологии и биофармации ФУВ Волгоградского государственного медицинского университета, кафедрах фармакологии Саратовского и Кубанского государственных медицинских университетов. Основные положения, выносимые на защиту

1. N-[(l-R' -амино) карбонил-2-( 1-R2- 1Н-индол-3-ил) винил]-113 - амиды ряда индола - перспективный класс соединений для поиска новых эффективных P2Y] - антагонистов.

2. Соединение Sbt-119 проявляет выраженную P2Y!-антагонистическую активность.

3. Соединение Sbt-119 оказывает антитромботическое действие в условиях целостного организма при моделировании тромбоцит-зависимых артериальных тромбозов на сонной артерии крыс (индуцированного поверхностной аппликацией хлоридом железа (III), электрическим током) и системного АДФ-индуцированного тромбоза на мышах.

Апробация работы.

Основные материалы диссертации докладывались и обсуждались на : И, П1 Всероссийских научно-практических семинарах для молодых учёных (Волгоград, 2010 г., 2011 г.); 68 - 70-й итоговых научных конференциях студентов и молодых ученых Волгоградского государственного медицинского университета (Волгоград, 2010 - 2012 гг.); III Евразийском конгрессе по медицинской физике и инженерии «Медицинская физика - 2010» (Москва 2010г.); II международной научно-практической конференции «Высокие

технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине» (Санкт-Петербург, 2011 г.); XVIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва 2011г.).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 13 работ (из них 4 статьи в ведущих рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ).

Объем и структура работы.

Диссертация изложена на 167 страницах машинописного текста, иллюстрирована 12 рисунками и 27 таблицами. Состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (главы 2 - 6), обсуждения результатов, выводов, списка литературы, включающего 46 отечественных и 111 зарубежных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Объектами исследования на наличие Р2Угантагонистической активности являлись вещества ряда индола - N-[(l-R' -амино) карбонил-2-(1-К2-1Н-индол-3-ил) винил]-113-амиды (12 соединений) и l-R'-амино-З- -индол-1-ил)-2-

пропанолы (3 соединения), синтезированные в научно-исследовательском институте физической и органической химии (НИИФОХ) Южного Федерального университета1. При проведении экспериментов использовались вещество сравнения антагонист Р2У1-рецепторов Basilen blue («Sigma», США), а также препараты сравнения, блокирующие тромбоцитарные Р2У12-рецепторы - тиклопидин (Тиклид, «Sanofi-syntelabo», Франция) и клопидогрель («Sanofi-syntelabo», Франция).

В работе были использованы следующие реактивы и материалы: натриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) («ICN», США), натрия хлорид (х.ч., «Мосреактив», Россия), изотонический раствор натрия хлорида (ЗАО «Рестерс», Россия), трис-(оксиметил)-аминометана гидрохлорид (х.ч., «Мосреактив», Россия) и кальция хлорид (ч.д.а, «Мосреактив», Россия), цитрат натрия (ч.д.а., Реахим, Россия), кислота соляная (х.ч., Россия), динатриевая соль аденозин-5-дифосфорной кислоты (АДФ) (Sigma, США и Reanal, Венгрия), адреналин гидрохлорид («Ренам», Россия), коллаген

'Выражаем благодарность к.х.н., научному сотруднику К.Ф. Суздалеву за любезно предоставленные субстанции веществ.

(«Ренам», Россия), наборы для определения показателей коагулограмм «Тромбо-тест» («Технология-стандарт», Россия), «Техпластин-тес («Технология-стандарт», Россия), «ТехФибриноген-тест» («Технологи стандарт», Россия), «АПТВ (АЧТВ)-тест» («Технология-стандарт», Россш хлорид железа (ч., «Мореактив», Россия), хлоралгидрат (Россия), формал! (Acros organics, США), цитрат натрия (Реахим, Россия).

Исследования были выполнены на 12 кроликах породы «Шиншилл* весом 3,5-4,0 кг, 236 белых неинбредных крысах обоего пола массой 250-300 и 248 белых неинбредных мышах обоего пола массой 20-32 г., содержащихся условиях вивария (температура 22-24°С, относительная влажность воздуха 41 50%) с естественным световым режимом, на стандартной диете (ГОСТ Р 5025! 92). Проведение экспериментов одобрено Региональным независимы этическим комитетом при Волгоградском научном центре РАМН Администрации Волгоградской области (протокол заседания № 108-2009 с 26.12.09) и выполнено в соответствии с принципами биоэтики, правилам лабораторной практики (GLP); соответствует этическим нормам, изложенным «Международных рекомендациях по проведению медико-биологически исследований с использованием животных» (1985) и в соответствии с приказо] МЗ РФ № 267 от 19.06.2003г. «Об утверждении правил лабораторно практики» и МЗ СССР №755 от 12.08. 1977.

Исследования in vitro и in vivo. В экспериментах in vitro соединени изучались в концентрациях 0,1; 1,0 и 10 мкМ. При выполнении исследовани" in vivo наиболее активное соединение Sbt-119 и препараты сравнени тиклопидин и клопидогрель вводились животным перорально за два часа д эксперимента в эквимолярных дозах, соответствующих среднеГ терапевтической дозе тиклопидина - 6,0; 11,63 и 7,32 мг/кг соответственно. Контрольные животные получали эквивалентный объем 0,9% раствор натрия хлорид.

P2Y¡-антагонистическую активность веществ изучали в экспериментах in vitro методом малоуглового светорассеяния [Сакаев М.Р. и соавт., 2000] на приборе «Ласка-1 К» (С.-Петербург, Россия).

С целью ранжирования соединений по степени выраженности их P2Yr антагонистической активности в концентрации 1 мкМ был выполнен кластерный анализ с использованием вероятностного метода гистограмм [Мандель И. Д., 1988].

Показателем эффективности веществ являлась концентрация, при оторой происходило ингибирование активации тромбоцитов на 20% (ЕС20), ассчитанная методом регрессионного анализа.

Влияние вещества Sbt-119 и препаратов сравнения - тиклопидина и лопидогреля - на агрегацию тромбоцитов in vitro и in vivo изучали по методу lorn G. (1962) в модификации Габбасова З.А. и др. (1989) на двухканальном азерном анализаторе агрегации тромбоцитов НПФ «Биола» 220LA (Россия). В ачестве индукторов агрегации использовали АДФ (Sigma, США) в конечной онцентрации 5 мкМ, адреналин - 10 мкМ, коллаген - 50 мг/кг. Забор крови в сследованиях in vivo осуществляли из брюшной артерии крыс под лоралгидратным (400 мг/кг) наркозом.

Оценку влияния соединения Sbt-119 и препаратов сравнения на язкостные характеристики крови проводили методом ротационной искозиметрии со свободно плавающим цилиндром-ротором [Доброволь-ский I.A., 1989] на анализаторе крови реологическом АКР-2 (Россия). In vitro сследовали вязкость крови (гематокрит 45%) на модели «повышенной язкости крови in vitro», вызванной прогреванием образцов в течении 1-го часа ри 42,5 °С [Плотников М.Б. и др., 1996] и взвеси стандартизированных тмытых эритроцитов, in vivo - кажущуюся вязкость цельной и вязкость тандартизировапной крови крыс, взятой из брюшной артерии животных. По езультатам динамики кажущейся вязкости цельной и стандартизированной рови, вязкости крови при моделировании синдрома гипертермии ассчитывали индекс агрегации (ИАЭ, у.е.) [Киричук В.Ф. и др., 2004].

Хронометрически, на гемокоагуломегре «SOLAR» (Белоруссия) с спользованием наборов реактивов производства («Технология-стандарт», 'оссия) были определены показатели коагулогралшы: тромбиновое, :ротромбиновое, активированное парциальное тромбопластиновое время и одержание фибриногена [Баркаган З.С., Момот А.П., 1999].

Антитромботическая и тромболитическая активности веществ зучались на образцах цельной крови крыс по методу D.A. Goroga (2009) на риборе «Global Thrombosis Test» (Montrose Diagnostics Ltd, Великобритания), {ля- усиления пуринового механизма активации тромбоцитов в пробирку [редварительно вносили 0,5 мл раствор, содержащего 5 мкМ АДФ.

Антитромботическую и тромболитическую активности веществ оценивали по времени наступления окклюзии (ОТ, сек.) и лизиса (LT,сек.).

На моделях артериальных тромбозов, индуцированных аптикацией 50% раствора хлорида железа (III) [Kurz K.D., 1990] и воздействием анодного электрического тока [Guglielmi G.. Vinuela F.. Sepetka I.. Macellari У.. 1991] на сонную артерию крыс оценивалась динамика снижения линейной скорости кровотока в области повреждённого сосуда на 50; 90; 95 и 99,9 %. Для исследования влияния соединений на время образования тромба использовали ультразвуковой компьютеризированный аппарат «Минимакс-Доплер-К» (Санкт-Петербург).

Модель генератзованного АДФ-индуцированного тромбоза на мышах была воспроизведена в соответствии с методикой Di Minno (1983). В качестве тромботического агента использовали раствор АДФ в дозе 300 мг/кг. При морфологическом исследовании легких мышей оценивали наличие признаков тромбообразования в стенке артериальных сосудов мышечного типа. Гистологические препараты документировали цифровой камерой Olympus (Japan, 4.0 мегапикселей) на базе микроскопа Micros (Austria) с использованием объектива хЮ, х40 и окуляра хЮ.2

Влияние соединения Sbt-119 и препаратов сравнения тиклопидина и клопидогреля на время кровотечения изучалось на мьппах [Liu Y., L Jennings N., М Dart А., Du X.-J., 2012]. Регистрировалось время остановки кровотечения из хвостовой вены животных.

Острую токсичность соединений изучали на мышах при внутрибрюшинном введении. Величину LD50 рассчитывали по методу Личфилда-Вилкоксона.

Изучение общетоксикологических свойств проводили с использованием схемы многотестового наблюдения по С. Ирвину [Irwin S., 1964]. Вещество Sbt-119 вводили однократно внутрибрюшинно лабораторным мышам в возрастающих дозах. Наблюдение проводили в течение трех часов после введения соответствующей дозы соединения.

Статистическая обработка данных. Обработку экспериментальных

2 Выражаем благодарность заведующем}- кафедрой патологической анатомии ВолгГМУ д.м.н., доцент}- A.B. Смирнову за содействие в проведении исследования 10

данных проводили с помощью встроенных функций программы Excel из пакета Office ХР (Microsoft, США) (среднее арифметическое значение, стандартная ошибка средней арифметической), программ «Statistica 6.0» (StatSoft, США) и «Graph.Pad.Pnsm.5.0» (США) с применением ¿-критерия Манна-Уитни, дисперсионного анализа по Краскеллу-Уолису с постестом Данна, точного метода Фишера.

Результаты исследования и их обсуждение

В ходе проведённого исследования было установлено, что среди ряда индола - N-[( 1-R1 -амино) карбонил-2-( 1-R2-1Н -индол-3-ил) винил]-К3-амидов 1 из 12 соединений по выраженности Р2У1-блокирующей активности превосходило вещество сравнения Р2У1-блокатор Basilen blue на 15,5% (р<0,05). Три вещества проявили умеренную активность (24,9%), уступая Basilen blue в 1,3 - 1,6 раза (р>0,05). У остальных соединений P2Yi-антагонистический свойства были или слабо выраженные или отсутствовали.

Таблица 1

Распределение исследуемых веществ по степени их Р2У1-антагонистической

активности in vitro

Группа соединений Количество соединений (%)

Высоко активные Умеренно активные Низко активные Неактивные

Производные N-[(l-R' -амино) карбонил-2-(1-К2-1Н-индол-3-ил) bhhh.i]-R3 -амидов 8,5 24,9 41,7 24,9

Производные 1 -R1 -a\nmo-3-(3-R:-1Н-индол-1-ил)-2-пропанолы 0 66.6 33,4 0

В группе веществ производных 1-R -aMHHO-3-(3-R -1Н-индол-1-ил)-2-пропанолов 2 из 3 веществ статистически недостоверно в 1,04 - 1,2 раза уступали Basilen blue, и одно соединение было низкоактивным (табл. 1).

При анализе зависимости подавления Р2 У ¡-обусловленной активации

тромбоцитов изучаемых соединений от их химической структуры было

установлено, что для проявления данного вида биологической активности в

ряду замещённых амидов производных индола имело значение строение

заместителей, а так же их сочетание у атома углерода в положении 7. Так

наиболее высокую активность демонстрировали вещества, имеющие в

положении С7 морфолинопропиловый и 4-метифенильный заместители. В ряду

аминоспиртов производных индола активность веществ определялась

радикалами в положении №. При этом, наличие метил-(п-бутил)-аминового

11

заместителя или полная его замена на гетероциклический азотосодержаиц заместитель (N-азепин) приводило к увеличению Р2Угантагонистическ< активности веществ.

По результатам поиска среди производных индола были выявлены т{ наиболее перспективных для дальнейшего исследования соединения пс лабораторными шифрами Sbt-119, Sbt-815 и Sbt-820.

При изучении для данных веществ P2Y]-антагонистического эффекта ( концентрации было выявлено наиболее активное соединение - Sbt-119.

Таблица

Влияние соединений Sbt-119, Sbt-815, Sbt-820 и Basilen blue на Р2Угопосредованну активацию тромбоцитов ш vitro в диапазоне концентраций 10-0,1 мкМ (М±ш)

Соединение

Sbt-119

Sbt-815

Sbt-820

Basilen blue

Подавление активации тромбоцитов, Д%

Концентрация, мкМ

10

-27,8±2,17*'р j -24,5±0,24*'Р

-23,6±5,81*

-20,5±0,67*

-25.9±1,38*

-17,3±1Л6*

-23,0±1,12*

-21,6±1,01*

0,1

-12,8±1Д8

-11,3±1,98

-4,7±1,75

-9,9±2,32

1С20, М

5,8x10"

1,7x10"'

1,8x10

1,9* КГ

»Статистически значимые отличия относительно контрольного измерения (р<0,05; критерий Манн; Уитни); Статистически значимые отличия относительно вещества сравнения Basilen blue (р<0 0:" критерий Краскелла-Уолиса с постестом Данна)

Так, в концентрациях 10,0; 1,0 мкМ вещество Sbt-119 по степей ингибирования активации тромбоцитов достоверно на 20,8 и 13,4% превышал Basilen blue соответственно. В концентрации 0,1 мкМ Sbt-119 по сил проявления Р2Угантагонистического эффекта статистически незначимо в 1, раза было активнее вещества сравнения. В диапазоне 0,1 - 10,0 мкЛ соединение Sbt-119 в 1,13 - 1,17 и в 1,07 - 2,7 раза по уровню Р2У[ блокирующей активности превосходило соединения Sbt-815 и Sbt-82i соответственно (р>0,05).

По показателю 1С:о, рассчитанному на основании данных результатов, соединение Sbt-119 в 3,2 - 3,4 раза было активнее и вещества сравнения Basilei blue, и опытных соединений Sbt-820, Sbt-815 (табл. 2).

Исходя из полученных значений LD50, соединение Sbt-119 в 1,5 и 1,3 раза было менее токсичным, чем Sbt-820 и Sbt-815 соответственно. По широте терапевтического действия вещество Sbt-119 в среднем в 1,4 раза превосходило эти соединения. Поэтому для дальнейшего изучения 12

фармакологических эффектов среди соединений, проявивших P2Yr антагонистическую активность, было выбрано вещество Sbt-119:

К-[(1-морфолинопропил - амино) карбонил-2-(1-этил- lH-индол-З-ил) винил]-4-метилфенил - амид гидрохлорид

цЬсн,

При изучении влияния вещества Sbt-119 на агрегацию тромбоцитов в диапазоне концентраций 0,1-10,0 мкМ in vitro было установлено дозозависимое подавление процесса агрегации. С увеличением концентрации вещества его способность ингибировать агрегацию возрастала в среднем в 1,3 раза относительно контрольного измерения (р<0,05). В концентрации 0,1 мкМ данное соединение по выраженности антиагрегантного эффекта недостоверно в 3,1% превосходило тиклопидин (табл. 3).

Таблица 3

Влияние соединений Sbt-119 и препарата сравнения тиклопидина на степень подавления агрегации тромбоцитов плазмы ингактных кроликов, индуцированной АДФ (5 мкМ) in vitro (M±m)

Соединение Антпагрегантная активность, Д%

концентрация, мкМ

1» 1 0.1

Sbt-119 -64.2±2,8б* -52,0±6,30* І -39,1±4,59* і

тиклопидин L -70,7±8,53* -60,9±6,32* -37,9±11,09*

----------------------"иіпиі.шь.іьии Ixutiіри.іьниіи шмерения (p^v'-1: критерий

Краскелла-Уолиса с постестом Данна)

В условиях in vivo вещество Sbt-119 на 50,1% эффективнее тиклопидина ингибировало АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов (р<0,05). При воздействии индуктора коллагена соединение Sbt-119 статистически незначимо (на 0,6% и 2,0%) превосходило по степени антиагрегантной активности препараты сравнения тиклопидин и клопидогрель соответственно. Вещество Sbt-119 на 3,2% сильнее тиклопидина подавляло адреналин-индуцированную агрегацию, уступая при этом на 14,5% клопидогрелю (р>0,05) (табл. 4).

Таблица 4

Влияние соединения Sbt-119, тиклопидина и клопидогреля (в эквимоляльных дозах) при пероральном введении на АДФ-, коллаген- и адреналин - индуцированноую агрегацию тромбоцитов интактных крыс (М±ш)

Изучаемое вещество Антнагрегантная активность, А%

индукторы агрегации

АДФ (5мкМ) коллаген (50мкг/мл) адреналин (ЮмкМ)

Sbt-119 -72,8±8,27* * -99,7±0,16* -84,6±8,75*

тиклопидин -36,0±6,86т -99,1±1,05* -81,9±11,45*

клопидогрель -84,1±7.06* -97,1±2,92* -99,0±1,07*

*Статистически значимые отличия относительно контроля; 'Статистически значимые отличия относительно клопидогреля; Статистически значимые отличия относительно тиклопидин (р<0,05; критерий Краске.тла - Уолиса с постестом Данна)

Примечание: дозы соединений эквимоляльны дозе тиклопидина 6 мг/кг

При исследовании веществ, оказывающих антитромботические свойства, рекомендуются тесты, дающие интегральное представление о возможных изменениях коагулогического потенциала крови, как зависящих, так и не зависящих от влияния на функциональную активность тромбоцитов, а именно: тромбиновое время, протромбиновое время, активированное частичное тромбопластиновое время, уровень фибриногена [Баркаган З.С.,Момот А.П., 1999]. При однократном введении соединения Sbt-119 и препаратов сравнения не было получено статистически значимых изменений показателей тромбинового и протромбинового времени. Наблюдаемое изменение АПТВ в группах животных, получавших как Sbt-119, тиклопидин и клопидогрель не превышали норму - 25 - 38с. Содержание фибриногена уменьшалось по сравнению с контролем в среднем на 12,0% для Sbt-119 и клопидогреля, а в пробах, содержащие тиклопидин - на 6,4% (данные статистически недостоверны).

Одним из серьёзных побочных эффектов, существующих на данный момент для антиагрегантных средств, является их способность увеличивать риск развития кровотечений [Gao Z.-G., Hechler В., Besada Р. et el., 2008]. При исследовании влияния вещества Sbt-119 на длительность кровотечения было установлено, что данное вещество, так же как и препараты сравнения клопидогрель и ацетилсалициловая кислота в 3,6; 5,8 и 5,0 раз достоверно относительно контроля увеличивали время кровотечения у мышей соответственно.

Рис.1. Влияние соединения Sbl-119 и препаратов сравнения тиклопидина, клопидогреля и ацетилсалициловой кислоты на длительность времени кровотечения мышей Обозначения: по оси абсцисс - группа животных; *Статистически значимые отличия относительно контрольной группы животных (р<0,05; критерий Краскелла - Уолиса с постестом Данна). Примечание: дозы соединений эквимоляльны дозе тиклопидина (6 мг/кг)

Тиклопидин так же превосходил контрольные значения, но достоверных отличий у данной группы животных не наблюдалось. Sbt-119 по отношению к клопидогрелю и ацетилсалициловой кислоты сокращал время кровотечения в среднем в 1,3 - 1,8 раза. Однако полученные данные были статистически недостоверны (рис. 1).

Одним из необходимых этапов исследования веществ, влияющих на систему гемостаза в целом, в том числе и на его сосудисто-тромбоцитарный и коагуляционный его компоненты, является оценка вязкостных свойств крови [Добровольский H.A. и др., 1998]. Соединение Sbt-119 оказывало стабилизирующее действие на вязкость образцов цельной и

стандартизированной (гематокрит 45%) крови в условиях in vitro и in vivo, превосходя препараты сравнения тиклопидин и клопидогрель при средних и низких скоростях сдвига. Так, in vitro вещество Sbt-119 по способности снижать вязкость при скорости сдвига 50с"1 в 1,4 и 1,5 раза превосходило тиклопидин и клопидогрель соответственно, при 30 с"1, 10 с"1 Sbt-119 - только клопидогреля в 1,7; 1,6 раза (р<0,05). В условиях in vivo вещество Sbt-119 достоверно было активнее тиклопидина и клопидогреля на скорости сдвига 30 с"1 на 3,0 и 11,0% соответственно. Sbt-119 и препараты сравнения тиклопидин и клопидогрель на вязкость взвеси отмытых эритроцитов in vitro не влияли. Поэтому можно предположить, что вещество Sbt-119, так же как тиклопидин и клопидогрель, оказывают действие на плазменный компонент вязкости крови.

Опираясь на полученные результаты, в дальнейшем было проведено исследование антитромботических и тромболитических свойств соединения 8ЬМ19 и препаратов сравнения тиклопидина и клопидогреля в условиях целостного организма.

На модели артериального тромбоза, индуцированного электрическим током, соединения БЫ-119 и препараты сравнения тиклопидин и клопидогрель увеличивали время до полной окклюзии сонной артерии.

Рис. 2. Влияние соединен™ БЫ-119 и препаратов сравнения тиклопидина и клопидогреля на динамику скорости кровотока каротидной артерии крыс (модель артериального

тромбоза. индуцированного электрическим током) Примечание: дозы соединений эквимоляльны дозе тиклопидина 6 мг/кг.

Соединение БЫ-119 относительно контроля статистически значимо в 1,6 раза превосходило значения времени наступления окклюзии. Сравнивания полученные данные об антитромботической активности соединения БЫ-119 с тиклопидином и клопидогрелем было выявлено, что опытное соединение по эффективности достоверно превосходило тиклопидин в среднем в 1,6 раза и уступало клопидогрелю в 1,7 раза. При этом, среди препаратов сравнения только клопидогрель приводил к увеличению времени снижения скорости течения крови в повреждённой области сосуда в 3,4 - 3,8 раза (р<0,05).

Показатели влияния тиклопидина на изменение скорости кровотока не значительно в 1,2 - 1,5 раза превосходили показатель контроля (Рис. 2). Таким образом, согласно результатам действия вещества БЫ-119 и препаратов сравнения тиклопидина, клопидогреля на динамику скорости кровотока и влияния на время развития тромбоза в области повреждённого сосуда при моделировании тромбозов, индуцированных электрическим током соединения можно расположить следующим образом: клопидогрель > БЫ-119 > тиклопидин.

Время, мин

На модели артериального тромбоза, индуцированного хлоридом железа, вещество Sbt-119 достоверно увеличивало время развития окклюзии в повреждённой области сосуда в 1,8 - 2,6 раза относительно контроля. Сравнительный анализ результатов динамики изменения скорости кровотока между группами животных, получавших опытное соединение и тиклопидин, было установлено, что Sbt-119 по степени выраженности антитромботического эффекта статистически значимо превосходило препарат сравнения тиклопидин в среднем на 18,4% .

Рис. 3. Влияние соединения Sbl-119 и препаратов сравнения тиклопидина и клопидогреля на динамику скорости кровотока каротидной артерии крыс (модель артериального тромбоза, индуцированного аппликацией хлорида железа (III)) Примечание: дозы соединений эквимоляльны дозе тиклопидина 6 мг/кг.

Так же вещество Sbt-119 на данной модели артериального тромбоза по степени выраженности антитромботической активности статистически незначимо на 5,8 - 6,7% увеличивало время тромбообразования относительно препарата сравнения клопидогреля (рис. 3).

Таким образом, исследованные соединения по степени выраженности антитромботического эффекта на данной модели артериального тромбоза можно расположить следующим образом: клопидогрель = Sbt-119 > тиклопидин.

Модель генерализованного АДФ-индуцированного тромбоза позволяет оценить влияние соединений на процесс глобальной внутрисосудистой агрегации тромбоцитов, приводящей к множественному тромбозу паренхиматозных органов и сопровождающуюся нарушениями дыхательной функции легких и выраженными двигательными нарушениями вплоть до паралича задних конечностей и гибели животного [Ulrich J.H., 2012].

Соединение Sbt-119 и препараты сравнения тиклопидин и клопидогрель

повышали выживаемость животных, при этом вещество БЫ-119 было эффективнее в 1,2-1,3 клопидогреля и тиклопидина соответственно, что свидетельствовало о наличии выраженных антитромботических свойств у данного соединения. То есть, согласно результатам выживаемости животных по эффективности подавления процесса системного тромбообразования на данной экспериментальной модели исследованные соединения можно расположить следующим образом: БЫ-119 > клопидогрель > тиклопидин. Результаты гистологического исследования показали, что в лёгких контрольной группы животных отмечалось выраженное полнокровие и сладжирование эритроцитов в просветах артериол межальвеолярных перегородок. В просвете альвеол диапедезные кровоизлияния.

I -

Щ-

КШй®"*!'

. - с

•„і.

*ГЧ "

»гЯІЛ

5 Г' ; ,

Рис. 4. Гистологические срезы лёгкого контрольной группы животных и групп,

получавших БЫ-119.

препараты сравнения

тиклопидин и клопидогрель Обозначения: А - контроль (окраска гематоксилин и эозином): Б —тиклопидин (окраска по Маллори) ; В -клопидогрель (окраска по Маллори); Г - соединение БЫ-119 (окраска гематоксилин и эозином).

В кровеносных сосудах среднего калибра определялись пристеночные смешанные тромбы. В более мелких кровеносных сосудах - облитурирующие эритроцитарные тромбы (рис. 4А). При гистологическом исследования микропрепаратов легочной ткани опытного вещества и клопидогреля были обнаружены единичные пристеночные тромбы (рис. 4В, 4Г) признаки нарушения внутриорганной гемодинамики, а в микропрепаратах тиклопидина - множественные пристеночные и обтурирующие тромбы (эритроцитарные и смешанные), массивные кровоизлияния и деструктивные изменения стенки альвеол с микроинфарктами (рис. 4 Б).

При исследовании антитромботической и тромболитической активности вещества 8Ы-119 и препаратов сравнения методом О.А. воге^а было

установлено, что соединение Sbt-119 по антитромботическому эффекту превосходило препарат сравнения тиклопидин на 48,0% (р<0,05) и клопидогрель на 12,4% (р>0,05). По времени лизиса тромбинового сгустка достоверных отличий между группами, получавшими соединение Sbt-119, тиклопидин и клопидогрель не наблюдалось.

При изучении нейротоксических свойств соединения Sbt-119 после его однократного внутрибрюшинного введения было установлено что, опытное вещество во всех исследуемых дозах практически не влияло на эмоциональное поведение животных, нервно-мышечную возбудимость, не вызывало развитие таких побочных вегетативных эффектов таких как птоз и экзофтальм. Начиная с дозы 150 мг/кг, наблюдались обратимые единичные признаки нарушения двигательной координации и поведенческих реакций. В максимально вводимых дозах соединения Sbt-119 (200 и 220 мг/кг) у животных регистрировались симптомы нейротоксического эффекта опытного вещества на дыхательный, терморегуляторный, болевой центры, а так же на нейродвигительную проводимость, что подтверждалось урежением дыхания, снижением ректальной температуры и болевой чувствительности, признаками угнетения мышечной координации и реактивности, а так же снижением рефлексов.

Таким образом, проведенное исследование позволило установить, что изученные вещества, относящиеся к классу производных индола, а именно к N-[(l-R'-амино) карбонил-2-( 1-R2- 1Н-индол-3 -ил) нннил]-Я3-амидам и 1-R1-амино-3-(3^2-1Н-индол-1-ил)-2-пропанолам, проявляют P2Yr

антагонистическую активность различной степени выраженности. При этом, было установлено, что выраженность данного вида активности в ряду замещённых амидов производных индола определяется строением заместителей, а так же их сочетанием у атома углерода в положении 7, а у аминоспиртов ряда индола - радикалами в положении N9. Так наиболее высокую активность демонстрируют вещества, имеющие в положении С7 морфолинопропиловый и 4-метифенильный заместители. Наличие метил-(п-бутил)-аминового заместителя или полная его замена на гетероциклический азотосодержащий заместитель в положении приводит к увеличению P2Yr антагонистической активности.

На основании вышеизложенного выявлены три наиболее активных соединений Sbt-119, Sbt-815 и Sbt-820. Однако только вещество Sbt-119, обладающее более высоким Р2 Y i-антагонистическим эффектом, низкой токсичностью и по широте терапевтического действия превосходящее Sbt-815 и Sbt-820, отобрано для дальнейшего углубленного фармакологического исследования.

При изучении влияния соединения Sbt-119 на сосудисто-тромбоцитарный и коагуляционный звеньев гемостаза установлено, что данное вещество проявляет антиагрегантную активность как in vitro, так и in vivo. При этом по ингибированию агрегации тромбоцитов in vitro соединение Sbt-119 активнее препарата сравнения тиклопидин в концентрации 0,1 мкМ в 1,03 раза. В условиях in vivo вещество Sbt-119 значимо превосходит только тиклопидин (на 50,1%) по подавлению АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов.

Вещество Sbt-119 по сравнению с препаратами сравнения (клопидогрелем и ацетилсалициловой кислотой) менее выраженно увеличивает время кровотечения в исследования влияния данных веществ на показатель длительности кровотечения из хвостовой вены мышей. Это позволяет предполагать о способности опытного вещества снижать риск кровотечений.

Соединение Sbt-119 снижает вязкость образцов цельной и стандартизированной (гематокрит 45%) крови в условиях in vitro и in vivo, превосходя препараты сравнения тиклопидин и клопидогрель при средних и низких скоростях сдвига. При этом, на вязкость взвеси эритроцитов вещество Sbt-119 не влияет, что указывает о действии на плазменный компонент вязкости крови.

При исследованиях антитромботической активности в условиях целостного организма соединение Sbt-119 достоверно превосходит тиклопидин на моделях артериальных тромбозов, индуцированного хлоридом железа (в среднем на 16,7%) и электрическим током (1,5 - 2,5 раза), а так же и при моделировании тромбоза механическим методом («Global Thrombosis Test») (на 48,0%). Кроме того, соединение Sbt-119 в 1,2; 1,3 раза клопидогреля и тиклопидина соответственно уменьшает смертность мышей при системном АДФ-индуцированном тромбозе.

Учитывая выраженную антиагрегантную и антитромботическую эффективность вещества Sbt-119 как в условиях in vitro, так и in vivo, можно

считать перспективным дальнейшее изучение у данного соединения

фармакологических и токсикологических свойств.

ВЫВОДЫ

1. В результате проведенного скрининга 15 соединений среди замещённых амидов и аминоспиртов ряда индола: N-[(1-RJ -амино) карбонил-2-(1-112-1Н-индол-3-ил) винил]-113-амидов и 1-К'-амино-3-(3-112-1Н-индол-1-ил)-2-пропанолов было обнаружено 6 (40,0 %) веществ антагонистов P2Y, рецепторов, из которых 1 соединение превосходило вещество сравнения, P2Yr антагонист, Basilen blue по степени выраженности данного вида активности.

2. P2Yi-блокирующая активность у замещённых амидов ряда индола определяется строением заместителей, а так же их сочетанием у атома углерода в положении 7. Наиболее высокую активность демонстрируют вещества, имеющие в положении С7 морфолинопропиловый с 4-метифенильным заместителем. У аминоспиртов ряда индола активность веществ определяется радикалами в положении N9. Наличие метил-(п-бутил)-аминового заместителя или полная его замена на гетероциклический азотосодержащий заместитель (N-азепин) приводит к увеличению данного вида биологического действия.

3. Соединение Sbt-119 по влиянию на P2Yi-рецепторы тромбоцитов, превосходит в 3,0 раза по показателю 1С20 вещество сравнения Basilen blue. Соединение Sbt-119 проявляет выраженную антиагрегантную активность. По ингибированию АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов соединение Sbt-119 превосходит препарат сравнения тиклопидин в 2,0 раза. Вещество Sbt-119 и препараты сравнения тиклопидин, клопидогрель в одинаковой степени подавляют адреналин- и коллаген-индуцированной агрегацию тромбоцитов.

4. Вещество Sbt-119 снижает вязкость крови в условиях in vivo, а так же при моделировании экспериментальной патологии in vitro, сопровождающейся развитием синдрома «повышенной вязкости крови и не влияет на показатели вязкости эритроцитов.

5. На модели артериального тромбоза, индуцированного аппликацией хлоридом железа (III) сонной артерии крыс, активность соединения Sbt-119 превосходит препарат сравнения тиклопидин в 1,3 раза. На модели артериального тромбоза сонной артерии крыс, индуцированного электрическим током, соединение Sbt-119 по выраженности антитромботических свойств в 2,5 раза эффективнее тиклопидина.

6. Вещество Sbt-119 увеличивают выживаемость животных на модели генерализованного АДФ-индуцированного тромбоза, при этом его антитромботическая активность превышает таковую у тиклопидина и клопидогреля 1,3 и 1,2 раза соответственно. При этом, результаты гистологического исследования микропрепаратов срезов легочной ткани показали, что соединение Sbt-119 резко снижает количество пристеночных тромбов с сохранением следовых признаков нарушения внутриорганной гемодинамики по сравнению с тиклопидином.

7. Исследование общетоксикологических свойств соединения Sbt-119 показало, что, начиная с восемнадцатикратного увеличения терапевтической дозы, угнетаются мышечная координация и реактивность, снижаются рефлексы, ректальная температура и болевая чувствительность, урежается частота дыхания.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Митина Т.М., Яковлев Д.С., Спасов. A.A., Суздалев. К.Ф. Антитромботическая и антиагрегантная активности нового P2Yi-aiiTaroiincTa - соединения Sbt-119 ex и in vivo / Т.М. Митнна, Д.С. Яковлев, A.A. Спасов, К.Ф. Суздалев. // Вестник ВолгГМУ. - 2011.

- № 4. - С. 19 - 21.

2. Анисимова В.А., Толпыгин U.E., Спасов A.A., Яковлев Д.С., Митина Т.М. и др. Синтез и фармакологическая активность 10-алкиламиноэтнл-2,3,4,10-тетрагндропнримидино[1,2,- а]бензонмидазолов / В.А. Анисимова, И.Е. Толпыгин, A.A. Спасов, Д.С. Яковлев, Т.М. Митина и др. // Химико-фармацевтический журнал. - 2012.

- Т. 46. - № 6. - С. 54-59.

3. Анисимова В.А., Спасов A.A., Косолапов В.А., Толпыгин И.Е., Яковлев Д.С., Митина Т.М. и др. Синтез и фармакологи активность хлоридов 3 - (N,N -дизамещённых) ацетамндов - 1- N - 2- аминобензимидазолия / В.А. Анисимова, И.Е. Толпыгин, A.A. Спасов, В.А. Косолапов, Д.С. Яковлев, Т.М. Митина и др. // Химико-фармацевтический журнал. - 2012. - Т. 46. - № 8. - С. 52 - 58.

4. Спасов A.A., Яковлев Д.С., Букатина Т.М. P2Vi-peueiiTopbi и их влияние на процессы агрегации тромбоцитов / Спасов A.A., Яковлев Д.С., Букатина Т.М. //Регионарное кровообращение и микроцеркуляцня. - 2012. - Т. 43. - № 3.

5. Митина Т.М., Стуковина А.Ю. Антиагрегантная активность соединения 119 на модели артериального тромбоза, индуцированного хлоридом железа (III) / Т.М. Митина, А.Ю. Стуковина // Материалы II Всероссийского научно-практического семинара для молодых учёных « Методологические аспекты экспериментальной и клинической фармакологии». Приложение Вестник ВолГМУ. Под ред. акад. РАМН В.И. Петрова. - Волгоград: Изд-во ВолГМУ. - 2010. - С. 102-103.

6. Митина Т.М., Стуковина А.Ю. Влияние новых антиагрегантных соединений производных индола на длительность кровотечения / Т.М. Митина, А.Ю. Стуковина // Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины: Материалы 68-й открытой научно-практической конференции молодых ученых и студентов с международным участием посвященной 75-летию ВолГМУ. Под ред. акад. РАМН В.И. Петрова. - Волгоград: Изд-во ВолГМУ. - 2010. - С. 182 - 183.

7. Митина Т.М., Стуковина А.Ю., Кучсрявснко А.Ф., Суздалев К.Ф. Изучение влияния нового производного индола на функциональную активность тромбоцитов / Т.М. Митина, А.Ю. Стуковина, Кучсрявснко А.Ф., К.Ф. Суздалев // III Евразийский конгресс по' медицинской физике и инженерии «Медицинская физика-2010»: Сборник материалов конгресса. - М. 2010. - Т. № 3. - С. 379 - 381.

8. Митина Т.М., Яковлев Д.С. Изучение P2Yr антагонистических свойств новых производных индола / Т.М. Митина, Д.С. Яковлев // II международная научно-практическая конференция «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине». Сборник статей под редакцией Кудинова А.П., Крылова Б.В. -Санкт-Петербург: Из-во Политехнического университета. - 2011. - Т. 3. - С. 26 - 30

9. Митина Т.М., Яковлев Д.С. Влияние соединения 119 на агрегационную активность тромбоцитов ex vivo / Т.М. Митина, Д.С. Яковлев // Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины: Материалы 69-й открытой научно-практической конференции молодых ученых и студентов с международным участием. Под ред. акад. РАМН В.И. Петрова. - Волгоград: Изд-во ВолГМУ. - 2011.

10. Митина Т.М., Яковлев Д.С., Суздалев К.Ф. Антитромботическая активность соединения 119 - антагониста P2Y1 рецепторов / Т.М. Митина, Д.С. Яковлев, К.Ф. Суздалев // XVIII Российский национальный конгресс «Человек и лекарство»: Сборник материалов конгресса - М. - 2011. - С. 461 - 462.

П.Митина Т.М., Яковлев Д.С., Анисимова В.А., Толпыгин В.А. Изучение P2Y, -антагонистической активности новых хлорид-3-(1Ч,1Ч-дизамещенных) ацегамидов -1-R-2-аминобензимидазолия / Т.М. Митина, Д.С. Яковлев, В.А. Анисимова, В.А. Толпыгин // Материалы II Всероссийского научно-практического семинара для молодых учёных « Методологические аспекты экспериментальной и клинической фармакологии». Приложение Вестник ВолГМУ. Под ред. акад. РАМН В.И. Петрова. - Волгоград: Изд-во ВолГМУ - 2011 -С. 14-15.

12. Букатина Т. М„ Яковлев Д. С., Спасов. А. А., Суздалев. К. Ф. Антитромботическая и тромболитическая активность соединения Sbt-119 на модели in vitro (Gorog Trombosis Test) / T. M. Букатина, Д. С. Яковлев, А. А. Спасов, К. Ф. Суздалев. II Волгоградский научно-медицинский журнал. -2012. 2.-С 12-14.

13. Митина Т.М., Яковлев Д.С., Суздалев. К.Ф. Антитромботическая активность соединения Sbt -119 на модели артериального тромбоза / Т.М. Митина, Д.С. Яковлев, К.Ф. Суздалев. // Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины: Материаты 70-й открытой научно-практической конференции молодых ученых и студентов с международным участием. Под ред. акад. РАМН В.И. Петрова. - Волгоград Изд-во ВолГМУ. - 2012. - С. 325- 326.

Отпечатано в ООО «Экспресс-печать» 400005, г. Волгоград, ул. Пражская, 12 Тираж 130 экз.