Автореферат и диссертация по медицине (14.01.30) на тему:Пептидная регуляция нейродегенеративных процессов у молодых и старых крыс

На правах рукописи

АБРАМЧУК Вячеслав Анатольевич

ПЕПТИДНАЯ РЕГУЛЯЦИЯ НЕЙРОДЕГЕНЕРАТИВНЫХ ПРОЦЕССОВ У МОЛОДЫХ И СТАРЫХ КРЫС

14.01.30 - геронтология и гериатрия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

5 ДЕК 2013

Санкт-Петербург — 2013

005543098

005543098

Работа выполнена на кафедре анатомии и физиологии детей и подростков факультета естествознания Федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Южный федеральный университет» (г. Ростов-на-Дону)

Научный руководитель:

заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Рыжак Галина Анатольена Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Менджерицкий Александр Маркович

Официальные оппоненты:

Дьяконов Марк Михайлович, заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор, Санкт-Петербургский институт биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН (СПбИБГ СЗО РАМН), профессор-консультант отдела клинической геронтологии и гериатрии. Виноградова Ирина Анатольевна, доктор медицинских наук, профессор, государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Петрозаводский государственный университет», заведующей кафедрой фармакологии, организации и экономики фармации, микробиологии и гигиены.

Ведущая научная организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии им. И.П. Павлова Российской академии наук.

Защита диссертации состоится «16» декабря 2013г. в 13.00 часов на заседании Диссертационного Совета Д 601.001.01 в Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН по адресу: 197119, Санкт-Петербург, пр. Динамо, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН.

Автореферат разослан «15» ноября 2013 г.

Ученый секретарь

Диссертационного Совета,

доктор биологических наук, профессор

Козина Л.С.

Актуальность. Нейродегенеративные заболевания — одно из активно развивающихся направлений в медицине настоящего времени [Анисимов В.Н., 2003; Один В.И., 2011; Chen Р.Н., 2001]. Отклонения функционирования организма при нейродегенеративных процессах в мозге наблюдают при гипоксически-ишемическом поражении мозга на разных этапах онтогенеза, в том числе при старении [Дамулин И.В., 2001; Левин О.С., 2006; Журавин И.А. и др., 2007].

Патогенез нейродегенеративных заболеваний характеризуется существенным полиморфизмом за счет различных сочетаний пяти групп симптомов: экстрапирамидного, пирамидного, мозжечкового синдромов, вегетативной недостаточности и деменции. Гибель нейронов приводит к нарушению цитоархитектоники, функций спинного и головного мозга и неврологическим нарушениям [Захаров В.В., Яхно H.H., 2004].

Главным фактором, приводящим к развитию нейродегенерации, является гипоксия мозга, механизмы действия которой на уровне клеток мозга изучены достаточно хорошо: изменяется баланс нейромедиаторов и продуктов их обмена в структурах мозга [Самойлов М.О., 1999; Nyakas С. et al., 1996; Lipton P., 1999], нарушаются структурно-функциональные свойства клеточных мембран, что может приводить к гибели клеток [Mishra О.Р., Delivoria-Papadopoulos М., 1999]. В условиях гипоксии изменяется работа генетического аппарата клетки [Саго J., 2001; Rybnikova Е. et al., 2008], инициируется транскрипция специфических генов, ответственных за программируемую гибель клетки [Самойлов М.О. и др., 2005]. Патологические изменения в центральной нервной системе (ЦНС) зависят от длительности гипоксиче-ского воздействия и от этапа онтогенетического развития центральной нервной системы (ЦНС) [Журавин H.A., 2002].

Одним из возможных путей коррекции негативных последствий гипоксии является использование пептидных биорегуляторов. Это обусловлено, прежде всего, их полифункциональностью и способностью к запуску каскадных реакций. Геропротекторные свойства ряда пептидных препаратов продемонстрированы на экспериментальных моделях, а также в клинической практике [Анисимов В.Н. и др., 1993; Менджерицкий A.M. и др., 1996, 2003; Рыжак Г.А. и др., 2003, 2004; Линькова H.A. и др., 2011]. В последнее время наблюдается тенденция применения препаратов пептидной природы при различных заболеваниях, сопровождающихся нейродегенеративными процессами, в том числе, в детской неврологии [Громова O.A., 2007; Taylor D.L.et al., 1999]. Это связано с обнаруженными сходными механизмами развития патологического состояния мозга в процессе старения организма и на ранних этапах онтогенеза [Журавин И.А. и др., 2007; Болдырев A.A. и др., 2010]. Однако существует и ряд особенностей развития нейродегенеративных процессов на разных этапах онтогенеза. Так, известно, что гипоксически-ишемическая нейродегенерация с преобладанием апоптоза у взрослых особей обусловлена активацией каспазного каскада, а у новорожденных - активацией преимущественно каспазы-3. Регуляция апоптоза, в частности, системы каспазы-3 в головном мозге имеет характерные особенности в зависимости от функцио-

нального состояния мозга и стадии онтогенеза. Уровень каспазы-3 высок в мозге плодов в связи со значительными в этот период функциональными перестройками [Баннова A.B. и др., 2005; Гуляева Н.В., 2003]. Нужно также отметить, что в последнее время изменение каспазной активности при гипоксии/ишемии мозга рассматривают не только с точки зрения нейродегенера-ции, но и пластических процессов [Rossiter J.P. et al., 2002]. Также различно функциональное состояние нейромедиаторных систем, что определяет особенности высших интегративных функций мозга организма на разных этапах онтогенеза.

Целью данного исследования явилось изучение пептидной регуляции поведения и нейрохимических процессов в головном мозге старых крыс, перенесших окклюзию сонных артерий, и молодых крыс, перенесших прена-тальную гипоксию.

В связи с этим в задачи исследования входило:

1. Определить влияние пренатальной гемической и гипоксической гипоксии разной продолжительности на латентное обучение и поведение, изменение активности каспазы-3 и баланса моноаминов в мозге молодых крыс.

2. Оценить действие пинеалона на поведенческие и нейрохимические показатели молодых крыс, перенесших пренатальную гемическую и ги-поксическую гипоксию разной продолжительности.

3. Сравнить эффекты кортексина и пинеалона на поведение, обучаемость и нейрохимические показатели молодых крыс, подвергнутых гипоксической гипоксии, приходящейся на предплодный и плодный периоды.

4. Оценить эффекты окклюзии сонных артерий на поведенческие и нейрохимические показатели в головном мозге старых крыс.

5. Изучить эффекты пептидных препаратов (кортексина и пинеалона) на поведение, изменение активности каспазы-3 и баланс моноаминов в мозге старых интактных крыс, а также животных, подвергнутых окклюзии сонных артерий.

Научная новизна работы

Впервые показано, что введение пептидных препаратов (кортексина и пинеалона) старым крысам, перенесшим окклюзию сонных артерий, а также введение пинеалона молодым крысам в модели пренатального стресса способствует повышению выживаемости животных.

Впервые установлено, что при окклюзии сонных артерий введение коротких пептидов способствует изменению структуры поведения в сторону возрастания релаксированного бодрствования и снижения двигательной активности на фоне повышения содержания адренергических нейромедиаторов в мозге у старых крыс. Более высокий показатель выживаемости у старых крыс, перенесших окклюзию сонных артерий, выявлен в условиях предварительного введения пинеалона относительно животных, которым вводили кортексин. Нейрохимическим критерием высокой устойчивости к окклюзии сонных артерий у старых крыс является умеренное повышение активности каспазы-3 в мозге.

Впервые показано, что степень когнитивного дефицита у молодых крыс зависит от периода, в течение которого они были подвергнуты пренатальной гипоксической гипоксии. Наиболее негативное влияние на когнитивную функцию и выживаемость крыс оказывает гипоксическая гипоксия, приходящаяся на предплодный и плодный периоды. Введение пинеалона беременным самкам способствует активации питьевого поведения у 3-недельного потомства в отличие от крыс, перенесших пренатальную гипоксию и прена-тальное введение пептида; одновременно установлено возрастание времени поведенческого сна, повышение пищевого поведения и снижение груминга.

Впервые показано, что пренатальная гипоксия оказывает влияние на активность каспазы-3 в мозге молодых крыс: во всех моделях пренатального стресса у животных активность фермента была ниже контрольных значений за исключением группы животных, которым моделировали пренатальную гипоксическую гипоксию, приходящуюся на предплодный и плодный периоды. Введение пинеалона в течение всей беременности способствует снижению эффектов пренатального стресса преимущественно через изменение активации серотонин- и дофаминергической систем.

Практическая значимость работы Результаты исследования влияния пептидных препаратов (кортексина и пинеалона) на адаптивные реакции старых крыс при окклюзии сонных артерий демонстрируют их нейропротективный эффект. Показатель выживаемости в модели окклюзии сонных артерий выше у животных, получавших пи-неалон, относительно крыс, которым вводили кортексин, что свидетельствует о большей эффективности пинеалона при патологиях, связанных с нарушением мозгового кровообращения.

Согласно полученным результатам исследования влияния пренатальной гипоксии на выживаемость и баланс медиаторов в мозге молодых крыс были показаны различия в развитии нарушений в поведении и нейрохимическом статусе в зависимости от сроков стрессового воздействия. Доказано, что пи-неалон обладает нейропротекторным действием на мозговые структуры крыс, перенесших пренатальный стресс, способствуя преобладанию серото-нинергической системы, что сопровождается повышением уровня выживаемости и снижением нарушений в когнитивной и поведенческой сферах животных.

Результаты работы могут быть рекомендованы для внедрения в клиническую практику с целью назначения кортексина и пинеалона в неврологической практике пациентам старших возрастных групп с целью снижения повреждающего действия ишемических процессов на функциональную активность клеток головного мозга, а также пинеалона женщинам для снижения проявления осложнений гипоксии плода при неблагоприятном течении беременности.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Пренатальный стресс оказывает отставленные эффекты на нейроме-диаторный баланс и активность каспазы-3 в мозге, что отражается на когнитивной функции и поведении 3-недельных животных. Степень нарушения

изучаемых показателей зависит от сроков пренатального стресса. У 3-недельных животных, перенесших пренатальный стресс, приходящийся на предплодный и плодный периоды, нарушается структура поведения в сторону резкого повышения времени вертикальной и горизонтальной локомоторной активности; наблюдается значительный когнитивный дефицит на фоне повышения активности каспазы-3 и истощения медиаторного баланса в мозге.

2. Пинеалон снижает влияние пренатального стресса на структуру поведения и когнитивные функции молодых животных за счет изменения активации серотонин- и дофаминергической систем и понижения активности каспазы-3 в мозге крыс. В отличие от пинеалона пренатальное введение кортек-сина способствует снижению содержания дофамина у молодых животных, как подвергнутых, так и не подвергнутых пренатальному стрессу, что отражается на более низкой обучаемости молодых крыс, которым вводили кор-тексин, относительно крыс, которым вводили трипептид пинеалон.

3. У старых крыс введение пептидных препаратов перед окклюзией сонных артерий способствует изменению структуры поведения в сторону снижения общей активности и возрастания представленности релаксирован-ного бодрствования. При окклюзии сонных артерий введение пептидных препаратов способствует возрастанию содержания адренергических медиаторов: в коре больших полушарий - ДОФА и дофамина, в стволовых структурах - адреналина, а также норадреналина у животных, которым перед окклюзией сонных артерий вводили кортексин. В условиях окклюзии сонных артерий изменение активности каспазы-3 происходит только у крыс, которым вводили пинеалон.

4. Пептидные препараты способствуют повышению доли выживших животных разного возраста в разных моделях стресса (пренатальной гипоксии, окклюзии сонных артерий). Более выраженным нейропротективным эффектом в модели окклюзии сонных артерий у старых животных обладает пинеалон по сравнению с кортексином. Его действие на поведение и нейрохимические системы зависит от возраста животных.

Апробация работы

Основные результаты работы были доложены на научно-практической конференции с международным участием «Нейрохимические подходы к исследованию функционирования мозга» (Ростов-на-Дону, 2011); Всероссийской научной конференции «Модернизация науки и образования» (Ростов-на-Дону — Махачкала, 2011); IV Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» (Ростов-на-Дону, 2011); Конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, 2012).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 научных работ, в том числе 4 статьи в журналах, включенных в Перечень ВАК и рекомендованных для опубликования материалов диссертационных исследований, 6 тезисов докладов. Все результаты и положения диссертационного исследования полностью отражены в публикациях.

Структура работы. Диссертация изложена на 161 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, двух глав, содержащих изложение результатов собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы и приложения. Список литературы содержит 267 источников, из них 139 отечественных и 128 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 22 таблицами и 29 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование проведено на молодых (21-дневных) и старых (18-месячных) крысах. Все экспериментальные исследования на животных проводили в соответствии с требованиями Хельсинкской декларации Всемирной Медицинской Ассоциации (World Médical Association Déclaration of Helsinki) 1964 г. с изменениями от 1975, 1983, 1989, 2000, 2002, 2006, 2008 гг.

Первая часть экспериментальной работы выполнена на беременных беспородных самках крыс с массой тела 180-200 г с 21-22-дневным циклом гестации и их потомстве. В каждой группе было по 7 беременных самок. Эксперимент проведен на 21-суточных крысах (п=169), подвергнутых прена-тальному гипоксическому воздействию (гипоксическая гипоксия, ГГ; геми-ческая гипоксия, ГемГ) в разные сроки беременности. Когнитивную функцию оценивали в водном лабиринте Морриса. Животных делили на следующие группы (табл.1).

Таблица 1

Дизайн эксперимента на 21-дневных крысах _

Группы интактные кортексин пинеалон гемГ ГГ 1-10 ГГ 18-20 ГГ 13-20

1 +

2 +

3 +

4 + +

5 +

6 + +

7 +

8 + +

9 +

10 + +

11 +

12 + +

1 — контроль - молодые (21-дневные) интактные крысы, с 1 дня беременности самкам вводили физиологический раствор; 2 - молодые крысы, получавшие пинеалон в течение всего пренатального периода в дозе 10 мкг/кг. 3 - молодые крысы, которые в пренатальный период перенесли гемическую гипоксию (ГемГ), с 1 дня беременности самкам вводили физиологический раствор; 4 -крысы, получавшие пинеалон в течение всего пренатального периода в дозе 10 мкг/кг и перенесшие ГемГ; 5 — крысы, которые в пренатальный период перенесли гипоксическую гипоксию (ГГ) (с 1 по 10 сутки бере-

менности, зародышевый период, ГГ1-10), с 1 дня беременности самкам вводили физиологический раствор; 6 — крысы, которые в пренатальный период перенесли ГГ (с 1 по 10 сутки беременности, зародышевый период), получавшие пинеалон в течение всего пренатального периода в дозе 10 мкг/кг; 7 -крысы, которые в пренатальный период перенесли ГГ с 18 по 20 сутки беременности (плодный период, ГГ18-20), с 1 дня беременности самкам вводили физиологический раствор; 8 - крысы, которые в пренатальный период перенесли ГГ с 18 по 20 сутки беременности (плодный период), получавшие пинеалон в течение всего пренатального периода в дозе 10 мкг/кг; 9 - крысы, которые в пренатальный период перенесли ГГ (с 13 по 20 сутки беременности, предплодный и плодный периоды, ГГ 13-20), с 1 дня беременности самкам вводили физиологический раствор; 10 - крысы, которые в пренатальный период перенесли ГГ (с 13 по 20 сутки беременности, предплодный и плодный периоды), получавшие пинеалон в течение всего пренатального периода в дозе 10 мкг/кг. Поскольку в эксперименте было установлено, что наиболее выраженные эффекты на функциональные показатели молодых крыс оказывает ГГ 13-20, проводили сравнительное исследование эффектов кортексина на изучаемые показатели в данной модели стресса: 11 группа - молодые крысы, получавшие кортексин в течение всего пренатального периода в дозе 1 мг/кг; 12 группа - крысы, которые в пренатальный период перенесли ГГ 13-20, получавшие кортексин в течение всего пренатального периода в дозе 1 мг/кг.

Крыс выводили из опыта на 21-23-сутки после рождения. В коре больших полушарий (КБП) и стволовых структурах головного мозга (СС) определяли активность каспазы-3 и содержание моноаминов.

Вторая часть экспериментальной работы выполнена на 120 белых беспородных крысах-самцах в возрасте 18-ти месяцев (старые животные). Все подопытные старые животные были разделены на следующие группы: 1 — ложнооперированные (л/о) животные (п=20), которым в течение 5 дней вводили физиологический раствор в объеме 0,5 мл (контроль); 2 - старые животные (п=20), которым в течение 5 дней вводили в равном объеме физиологический раствор, затем обездвиживали введением тиопенталового наркоза и проводили перевязку правой сонной артерии на 24 часа и левой сонной артерии на 3 минуты с последующей 24-часовой реоксигенацией (окклюзия сонной артерии, ОСА); 3 - л/о животные (п=20), которым внутрибрюшинно вводили кортексин в дозе 1 мг/кг массы тела в 0,5 мл физиологического раствора в течение 5 дней перед операцией (кортексин); 4 - л/о животные (п=20), которым внутрибрюшинно вводили пинеалон в дозе 10 мкг/кг массы тела в 0,5 мл физиологического раствора в течение 5-и дней перед ОСА (пинеалон); 5 -животные (п=20), которым внутрибрюшинно вводили кортексин в дозе 1 мг/кг массы тела в 0,5 мл физиологического раствора в течение 5-и дней, затем проводили ОСА (кортексин + ОСА); 6 — животные (п=20), которым внутрибрюшинно вводили пинеалон в дозе 10 мкг/кг массы тела в 0,5 мл физиологического раствора в течение 5-и дней, затем проводили ОСА (пинеалон + ОСА). Через 23 часа после ОСА животных тестировали в «открытом поле».

После выведения животных из опыта в мозге крыс определяли активность каспазы-3 и содержание моноаминов.

Модель двусторонней окклюзии сонных артерий. Ишемизация мозга достигалась перевязкой левой сонной артерии и через минуту - временной окклюзией (на 3 минуты) правой сонной артерии с последующей 24-часовой реоксигенацией.

Моделирование гемической и гипоксической гипоксии. ГемГ моделировали путем кровопотери (2% от массы тела животного) в первый и пятый дни беременности (зародышевый период). Взятие крови проводили прижизненно под воздействием местной анестезии (2 % раствор новокаина) из подключичной артерии. ГГ моделировали путем помещения беременных самок в приточно-вытяжную барокамеру при давлении 66,41 кПа (3500 м над уровнем моря) на 3 ч. Воздействие производили с 1 по 10 (зародышевый период), с 13 по 20 (предплодный и плодный периоды) и с 18 по 20 (плодный период) день беременности. В аналогичном режиме (помещение в приточно-вытяжную барокамеру при 66,41 кПа (3500 м над уровнем моря на 3 часа) проводили ГГ старым животным.

Тест на определение латентного обучения проводили в водном лабиринте Морриса [Morris R.G., 1984].

Метод «Открытого поля» [Буреш JI. и др., 1991]. Для количественной оценки меры представленности контролируемых поведенческих функций весь поведенческий континуум в естественном цикле "активность-покой" был разбит на 8 форм поведения: R1 - поведенческий сон, R2 - горизонтальная локомоторная активность, R3 - вертикальная локомоторная активность, R4 - питье воды, R5 - потребление пищи, R6 - разные виды мелкой двигательной активности (топтание на месте, вздрагивание, принюхивание, поворот головы, движение хвостом и т.д.), R7 - груминг, R8 - релаксированное бодрствование. Формы поведения фиксировали по 10 минут 3 раза в течение первой половины дня.

Биохимические методы исследования. Содержание норадреналина (НА), адреналина, дофамина (ДА) и серотонина (5-ОТ) определяли с помощью обращенно-фазного варианта высокоэффективной жидкостной хроматографии с УФ детектированием на установке Gold Nouveau 125/166 Basic Gradient HPLC System Beckman Coulter. Определение активности каспазы-3 проводили флуориметрическим методом в структурах головного мозга, описанным в работах [Яковлев A.A. и др., 2004; Bradford J.M., 1976]. Содержание белка определяли по методу Lowry et al. (1955).

Статистическую обработку результатов исследования осуществляли с использованием пакета программ Statistica for Windows 6.5. Различия между группами определяли с использованием параметрических (t-критерий Стью-дента) или непараметрических (критерий Манна-Уитни) методов анализа. Данные в таблицах и рисунках представлены в виде mean±S.E.M.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Влияние пептидных геропротекторов на поведенческие и нейрохимические показатели у молодых крыс, перенесших иренатальную гипоксию

Согласно полученным результатам исследования, наиболее высокий показатель мертворожденных крыс (20%) выявлен в группе крыс, подвергнутых пренатальной ГГ в течение предплодного и плодного периодов (с 13 по 20 сутки беременности). Показатель мертворожденных крыс в 5-й и 7-й группах составил в среднем 12%. Введение пинеалона с первого дня беременности способствовало снижению количества мертворожденных крыс, в том числе, в 6-й и 8-й группах все животные выживали, а в 10-й группе количество мертворожденных животных не превышало 6%. При анализе когнитивной функции в водном лабиринте Морриса показано, что к 3-му дню тестирования снижение времени поиска скрытой платформы происходило в контрольной группе, у животных 2-й группы (пинеалон), 4-й группы (ГемГ +пинеалон), 5-й группы (ГГ 1-10), 6-й группы (ГГ 1-10 + пинеалон), а также 8-й (ГГ 18-20 + пинеалон) и 10-й групп (ГГ13-20 + пинеалон) (табл. 2). Введение пинеалона в модели пренатальной ГГ 18-20 и ГГ 13-20 не приводило к снижению времени поиска скрытой платформы на 2-й день тестирования. На фоне наиболее высокого показателя смертности в 10-й группе крыс это может свидетельствовать о том, что ГГ 13-20 является тем патогенным фактором, который приводит к необратимым функциональным повреждениям головного мозга.

Введение пинеалона самкам с первого дня беременности способствовало улучшению показателя когнитивной функции у 21-дневных крыс. Время поиска скрытой платформы в группах животных, которые с первого дня пре-натального периода развития получали пинеалон, а далее в разные сроки беременности самок подверглись ГГ (4-я, 6-я, 8-я и 10 группы), было на 35-50% ниже, чем, соответственно, в 3-й, 5-й, 7-й и 9-й группах крыс.

Известно, что действие пинеалона основано на его способности стимулировать пролиферативную и функциональную активность основных клеточных элементов тканевой культуры, снижать уровень спонтанной гибели клеток, усиливать регенераторно-адаптационные процессы в пролифериру-ющих и дифференцирующихся клетках [Чалисова Н.И. и др., 2008]. В связи с этим у крыс, получавших в пренатальном периоде развития пинеалон, на фоне гипоксии в 3-недельном возрасте выявлено значительное улучшение латентного обучения относительно крыс, которые не получали препарат на фоне стрессового воздействия. Также установлено, что степень когнитивного дефицита у крыс зависит от периода, в течение которого они были подвергнуты пренатальной гипоксии. Наиболее негативное влияние на латентное обучение и выживаемость крыс оказывает ГГ 13-20. Поэтому при сравнении эффектов пинеалона и кортексина на исследуемые показатели у молодых крыс использовали модель ГГ 13-20.

Таблица 2

Результаты тестирования крыс в водном лабиринте Морриса при воздействии _пренатальной гипоксии и введении пинеалона (сек., М±ш)_

Сумма 1 день тестирования 2 день тестирования 3 день тестирования

4-х по-

пыток

1 группа - Контроль

(п=72) 38,50±4,1 21,31±2,1 18,72±1,73#

2 группа - пинеалон (п=8)

(п=32) 38,3±5,9 23,2±4,9 20,7±2,8#

3 группа - ГемГ+физ.р-р (п=18)

(п=72) 61,3±6,0 71,8±8,1 50,8±5,4

4 группа - ГемГ +Пинеалон (п=18)

(п=72) 32,0±3,0 21,1±1,9 22,0±2.4#

5 группа - ГГ 1-10 день беременности + физ. р-р (п=15)

(п=60) 98,0±12,3 80,3±10,8 56,7±6,2#

6 группа - ГГ 1-10 день беременности + пинеалон (п=15)

(п=60) 63,6±5,3 43,3±4,1 31,4±3,1#

7 группа - ГГ 18-20 день беременности + физ. р-р (п=26)

(п=104) 78,9±6,2 87,5±6,9 77,3±8,0

8 группа - ГГ 18-20 день беременности + нинеалон (п=29)

(п=116) 38,9±2,8 36,6±2,9 25,2±2,4#

9 группа - ГГ 13-20 день бер. 4 физ. р-р (п=7)

(п=28) 109,4±15,80 106,4±15,73 121,8±19,01

10 группа - ГГ 13-20 день беременности + пинеалон (п=15)

(п=60) 51,7±4,7 62,3±8,7 34,5±3,9#

11 группа - кортексин (п=8)

(п=32) 46,46±4,21 42,78±4,50 38,55±2,34

12 группа - ГГ 13-20 депь беременности + кортексин (п=15)

(п=60) 73,93±4,51 78,9±6,54 58,37±3,22

# - достоверное (р<0,05) снижение времени поиска платформы относительно 1-го дня тестирования.

Время поиска скрытой платформы животными 11 группы (введение кортексина) было выше контрольных значений на 1-й (на 21%; р<0,05), 2-й (на 100%; р<0,01) и 3-й день тестирования в лабиринте Морриса (на 106%; р<0,01). В 12 группе крыс (кортексин + ГГ13-20) время поиска скрытой платформы также значительно превышало контрольные значения: на 1-й на 92% (р<0,01), на 2-й - на 270% (р<0,01), на 3-й день - на 212% (р<0,01). Однако по сравнению с животными 9-й группы (ГГ 13-20) данный показатель у крыс в модели «кортексин + ГГ 13-20» был ниже. Тем не менее, по сравнению с животными 10-й группы (пинеалон + ГГ 13-20) у крыс 12-й группы время поиска платформы было достоверно выше. Следовательно, введение

пинеалона оказывает более выраженный эффект на повышение способности крыс к обучению, чем введение кортексина.

При изучении поведения молодых крыс, подвергнутых введению пептидных препаратов и пренатальному стрессу, показано следующее. В модели ГемГ происходит возрастание времени И.1, Я5 и 117. У животных 5-й группы снижение ИЛ и Я5 происходит на фоне возрастания вертикальной и горизонтальной локомоторной активности, а также груминга. У крыс 7-й группы (ГГ 18-20) повышение времени Ш, локомоторной активности и 117 происходит одновременно со снижением представленности Я8. Наиболее значительные изменения в поведении наблюдали у животных 9-й группы (ГГ 13-20): выраженное повышение времени 112-3 сопровождалось снижением представленности остальных исследованных форм поведения. Время ориентировочного и пищевого поведения, а также Я7 у молодых животных 2-й группы, напротив, было ниже контроля. У 4-й группе крыс показано значительное возрастание времени Ш и Я7, тогда как представленность 112-3,115, Я6 и 118 снижена по сравнению с контролем.

У крыс 2-й группы (пренатальное введение пинеалона) выявлено возрастание представленности Ш и 118. У крыс 6-й группы (пинеалон + ГГ 1-10) в поведенческом континууме показано повышение времени Ш и 117, а также снижение 112-3, Я5 и 118 по сравнению с 1-й группой животных. У крыс 8-й группы (пинеалон + ГГ 18-20) на фоне увеличения представленности Ш, 1123 и 115, а также Я8 выявлено снижение времени Я7 по сравнению с контролем. В модели ГГ 13-20 + введение пинеалона в поведенческом континууме установлено повышение представленности II1 и Я7 одновременно со снижением времени Я5 и Я8 относительно контроля.

Для сравнения эффектов пептидных препаратов на поведение крыс в открытом поле изучены эффекты кортексина и ГГ 13-20. Установлено снижение времени Ш на 33% (р<0,05), времени 112-3 на 85% (р<0,05), а также 118 на 25% (р<0,05). Время 115 было выше на 91% (р<0,05), Я7 - на 231% (р<0,01). Увеличение времени, затрачиваемого на локомоторную активность, происходило на фоне возрастания количества вертикальных локомоций. При сравнении эффектов пептидных препаратов показано, что кортексин и пинеалон оказывают противоположное действие на Ю, И.5 и 118. Более выраженные эффекты на Я5 оказывает пинеалон, а на локомоторную активность (1123) - кортексин.

Далее представлены результаты исследования эффектов кортексина и гипоксической гипоксии (13-20 сутки пренатального развития) на поведение молодых животных. Относительно контроля установлено повышение времени Ю (на 64%; р<0,05), Я5 (на 117%; р<0,01), Я7 (на 49%; р<0,05) и 118 (на 377%; р<0,001). Одновременно происходило снижение времени 112-3 на 85% (р<0,05) (преимущественно за счет Я2),а также 116 на 44% (р<0,05).

При сравнении с 9-й группой у животных в модели «кортексин+ГГ13-20» в структуре поведения было повышено время Ш, Я5,116, Я7 и Я8 за счет значительного снижения времени 112-3.

В модели «ГГ 13-20» введение кортексина (12 группа), хоть и способствовало возрастанию времени Ш, но не столь значительно, как при введении пинеалона (10 группа). Кроме того, у крыс 12 группы время 115, 117 и Я8 было выше, а время 112-3 и 116 - ниже относительно животных 10-й группы. Таким образом, введение кортексина в модели «ГГ 13-20» относительно введения пинеалона изменяет структуру поведения в сторону повышения Я8, Я7 и 115 за счет снижения времени разных форм локомоторной активности и Ю. Тогда как пинеалон способствует более значительному повышению Я5.

Таблица 3

Активность каспазы-3 в структурах мозга крыс при воздействии пренаталь-ной гемической гипоксии и введении пинеалона (М±ш, % отличия от кон-

троля, степень достоверности отличий к контролю)

Группы/структуры мозга Кора больших полушарий Стволовые структуры

1 группа - контроль 2,56±0,12 3,53±0,37

2 группа - пинеалон 1,14±0,06# 1,73±0,12#

3 группа - ГемГ 1,64±0,09# 1,79±0,26#

4 группа - ГемГ +пинеалон 1,31±0,05# 1,26±0,12#

5 группа - ГГ 1-10 день бер. 2,97±0,20 2,86±0,25

6 группа - ГГ 1-10 день бер. + пинеалон 1,94±0,07 1,96±0,09#

7 группа - ГГ 18-20 день бер. 2,03±0,10# 2,65±0,12

8 группа - ГГ 18-20 день бер. + пинеалон 1,68±0,08 1,82±0,14#

9 группа - ГГ 13-20 день бер. 3,15±0,19# 4,40±0,16

10 группа - ГГ 13-20 день бер. + пинеалон 2,08±0,12# 2,55±0,14#

11 группа - кортексин 1,02±0,04# 1,07±0,05#

12 группа - ГГ 13-20 день бер. + кортексин 0,95±0,03# 0,89±0,04#

# - достоверное (р<0,05) изменение активности каспазы-3 относительно контроля.

При проведении сравнительного анализа эффектов пренатальной гипоксии и пептидных препаратов на активность каспазы-3 в мозге крыс и показатели когнитивной функции в лабиринте Морриса было установлено следующее. Известно, что ведущим механизмом, лежащим в основе нейропротек-торного действия адаптогенов пептидной природы, которые вводят до стрессового воздействия, является их прекондиционирующий эффект. При изучении эффектов пинеалона на активность каспазы-3 показано снижение активности данной протеазы в структурах мозга молодых крыс во 2-й группе, а также у животных в модели пренатальной гипоксии (табл. 3). В мозге крыс, перенесших ГемГ, выявлено достоверное понижение активности каспазы-3. В данной группе животных на 2-й день тестирования в лабиринте Морриса показано некоторое повышение времени поиска скрытой платформы, лишь к 3-у дню происходило снижение данного показателя. В то же время, на фоне введения пинеалона с 1-го дня беременности и последующей ГемГ у 21-дневных животных время поиска скрытой платформы было ниже уже на 1-й

день тестирования относительно крыс 3-й группы. Также у животных 4-й группы установлено более значительное понижение активности каспазы-3 (р<0,05) в структурах мозга относительно контроля, чем у крыс 3-й группы.

В модели «ГГ1-10» у крыс на 1-й день тестирования в лабиринте Морриса время поиска скрытой платформы было в 2,5 раза выше (р<0,001), чем в контроле (табл. 4). У этих же крыс 5-й группы активность каспазы-3 в мозге соответствовала контролю. Введение пинеалона самкам в течение всей беременности способствовало улучшению показателей когнитивной функции у 21-дневных крыс относительно 4-й группы, а также снижению активности исследуемой протеазы (р<0,05) в мозге по сравнению с контролем. Результаты исследования когнитивной функции и активности каспазы-3 в мозге крыс, которым моделировали ГГ 18-20 (7-8 группы), были сходными с таковыми у животных 3-4-й групп. Наиболее неблагоприятный прогноз в становлении когнитивной функции получен у крыс, перенесших ГГ 13-20. У них наблюдали наиболее высокое значение времени поиска скрытой платформы на 1-й день тестирования в лабиринте Морриса среди всех животных, подвергнутых ГГ в разные сроки пренатального развития. К 3-му дню тестирования у крыс 9-й группы данный показатель становился еще выше, то есть закрепления навыка поиска скрытой платформы не происходило. В мозге крыс выявлено возрастание активности каспазы-3 относительно контроля (табл. 3). В то же время, введение пинеалона в течение всего периода беременности снижало эффект ГГ 13-20 на показатель когнитивной функции 21-дневных крыс; активность каспазы-3 в мозге достоверно понижалась относительно контроля и, особенно, в 9-й группе животных.

При изучении эффектов кортексина на активность каспазы-3 с мозге 21-дневных крыс в модели «ГГ 13-20» показано снижение активности данной протеазы в КБП (на 60%; р<0,05) и СС (на 70%; р<0,05). Поскольку в настоящее время установлено, что каспаза-3 является эффекторной протеазой не только процесса апоптоза, но также влияет на пластические процессы, в том числе, на обучение, данный факт (снижение ее активности в мозге крыс 11 группы) является нейрохимическим критерием того, что пренатально введенный кортексин уменьшает способность к обучению у 21-дневных крыс. Еще меньшие значения активности каспазы-3 установлены в мозге животных 12-й группы: снижение активности данной протеазы относительно контроля составило 63% в КБП и 75% в СС.

При анализе эффектов пренатальной гипоксии и введения пинеалона на изменение содержания моноаминов в мозге крыс установлено следующее. У 3-недельного потомства самок, которым в течение всей беременности вводили пинеалон, выявлено снижение уровня А на 22% (р<0,05) и накопление ДА на 189% (р<0,001) в КБП, а в СС - повышение содержания ДА на 20% (р<0,05) и серотонина на 33% (р<0,05) относительно контроля.

В модели ГемГ в КБП происходило накопление НА на 31% (р<0,05), ДА на 125% (р<0,01) и серотонина на 190% (р<0,001). В СС этой группы крыс выявлено увеличение содержания А на 51% (р<0,05), ДА на 52% (р<0,05) и снижение уровня серотонина на 46% (р<0,05) относительно кон-

троля. В СС 4-й группы животных обнаружено понижение содержания ДА на 32% (р<0,05) и серотонина на 32% (р<0,05) относительно 1-й группы. У крыс 5-й группы в КБП наблюдали повышение содержания А на 21% (р<0,05) и серотонина на 41% (р<0,05) и снижение уровня НА на 18% (р<0,05); в СС происходило понижение содержания А на 19% (р<0,05), ДА на 25% (р<0,05) и серотонина на 43% (р<0,05) относительно контроля. У крыс 6-й группы наблюдали снижение в КБП уровня А на 19% (р<0,05), возрастание содержания ДА на 16% (р<0,05) и серотонина на 52% (р<0,05); в СС животных 6-й группы также отмечено увеличение ДА на 22% (р<0,05) и серотонина на 29% (р<0,05) относительно контроля. У животных в модели ГГ 18-20 в КБП наблюдали повышение уровня ДА на 17% (р<0,05) и серотонина на 63% (р<0,05), а в СС - серотонина на 38% (р<0,05) относительно контроля. Следовательно, введение пинеалона снижало влияние ГГ 18-20 на содержание моноаминов в мозге крыс 8-й группы. У крыс 9-й группы в КБП наблюдали снижение НА на 15% (р<0,05), повышение А на 61% (р<0,05), ДА на 15% (р<0,05) и серотонина на 21% (р<0,05) относительно контроля. В СС происходило накопление серотонина на 28% (р<0,05) по сравнению с 1-й группой. У крыс 10-й группы (пинеалон + ГГ 13-20) наблюдали только повышение содержания серотонина в СС на 14% (р<0,05) относительно 1-й группы.

Важно отметить, что в группах крыс, которые были подвергнуты ГГ 18-20 и ГГ 13-20, наблюдали не столь значительные отклонения в содержании моноаминов в мозге, как в 3-й и 5-й группах, относительно контроля. А при введении пинеалона беременным самкам в течение всей беременности у потомства 8-й и 10-й групп уровень моноаминов в мозге соответствовал контролю.

В КБП крыс 11 группы (введение кортексина) выявлено достоверное понижение содержания А (на 29%; р<0,05) и ДА (на 36%; р<0,05) на фоне накопления серотонина (на 39%; р<0,05), тогда как в СС мозга установлено снижение уровней НА (на 51%; р<0,05) и ДА (на 56%; р<0,05) при накоплении А (на 57%; р<0,05) и серотонина (на 43%; р<0,05) относительно животных 1-й группы. У крыс 12-й группы (кортексин + ГГ 13-20) в КБП наблюдали возрастание содержания НА (на 26%; р<0,05) и серотонина (на 50%; р<0,05), в СС снижение уровней НА (на 68%; р<0,05) и ДА (на 65%; р<0,05) происходило одновременно с накоплением А (на 198%; р<0,01) и серотонина (на 47%; р<0,05). Можно предположить, что пренатальное введение кортексина может задерживать функциональное созревание ДАергической системы в мозге и НАергической системы в СС мозга у крыс, что, вероятно, отражается на обучаемости животных. Однако пренатально введенный кортексин снижает эффекты ГГ 13-20 на содержание А и ДА в КБП животных.

Приведенные данные эффектов пренатальной ГГ на обучение, поведение и нейрохимические показатели молодых крыс далее сравнивали с аналогичными показателями у старых животных в модели ОСА для доказательства наличия нейропротективных эффектов у исследуемых пептидных геропро-текторов. Связью между механизмами нарушения деятельности мозга у старых и молодых крыс в разных моделях ишемизации мозга является схожесть

нейродегенеративных процессов на разных этапах онтогенеза, в первую очередь, определяемых включением каспазного каскада в реализацию пластических процессов после стрессового воздействия.

Пептидная регуляция поведения и нейрохимических показателей старых крыс, перенесших окклюзию сонных артерий В качестве теста, отражающего степень повреждения регуляторной деятельности мозга, соответственно, нейродегенеративных процессов при окклюзии сонных артерий, проводили подсчет числа выживших старых животных (в процентах), получавших пептидные геропротекторные препараты, и животных, которым до операции вводили физиологический раствор (табл. 4).

Таблица 4

Выживаемость старых крыс, находящихся в условиях курсового профилактического введения пептидов перед моделированием окклюзии сонных арте-

рий

Группа животных Число выживших животных после ОСА (%)

Через 3 ч Через 12 ч Через 24 ч

ОСА (п=20) 70% 60% 40%

Кортексин +ОСА (п=20) 80% 80% 80%

Пинеалон +ОСА (п=20) 90% 90% 90%*

* - достоверные отличия (по критерию Фишера) по отношению к груп-

пе крыс, подвергнутых ОСА (р<0,05)

На фоне введения пинеалона число выживших животных спустя 3, 12 и 24 ч после ОСА составило 90%. В условиях премедикации кортексином данный показатель в исследуемые временные периоды после ОСА составил 80%. Согласно данным литературы, применение кортексина в постишемиче-ском периоде уменьшает число погибших крыс на 3 и 7 сутки после окклюзии сонных артерий [Лебедев A.A. и др., 2006]. Можно предположить, что пинеалон также способен повысить выживаемость животных в отдаленные сроки после ОСА. У выживших после ОСА старых крыс оценивали влияние операции и предварительного введения препаратов на поведенческие показатели. В группе животных, подвергнутых ОСА, наблюдали значительное снижение времени R5 (на 86%; р<0,05) и R6 (на 30%; р<0,05) относительно л/о крыс. При подсчете количества горизонтальных и вертикальных локомоций установлено, что у животных, подвергнутых ОСА, происходило снижение количества вертикальных стоек (на 70%; р<0,05) по сравнению с контролем (табл. 5).

Для оценки влияния пептидных препаратов, введенных перед ОСА, на поведение старых крыс исследовали их эффекты на поведение л/о животных. Нужно отметить, что характер поведенческих реакций у л/о животных был сходным с интактными животными. Введение кортексина л/о крысам способствовало снижению времени R7 (на 55%; р<0,05) относительно контроля. Еще более выраженное изменение времени на R7 выявлено при введении пинеалона л/о животным. Понижение времени R7 при введении пептида можно объяснить повышением стрессустойчивости животных. Известно, что именно

у грызунов груминг специфически активируется при действии стресса, и поэтому считается одним из его поведенческих маркеров [Celis М.Е., Torre Е., 1993].

При введении пинеалона выявлено увеличение времени R8 (+108%; р<0,05) у животных по сравнению с контролем, а также снижение R4-R5 (0,1<р<0,05). У животных, которым вводили пинеалон, время R5 было меньше на -54%, a R7 и R8 - выше, соответственно, на 37% и 119% (р<0,05) относительно животных, которым вводили кортексин. На другие формы поведения старых крыс введение препаратов повлияло сходным образом.

При введении кортексина перед ОСА происходило увеличение R1 у старых животных относительно контроля. Относительно 2-й группы животных (ОСА) у крыс, которым вводили кортексин, наблюдали снижение R2-3 по сравнению с контролем на 65% и относительно 2-й группы на 74% (р<0,05). Также у крыс 5-й группы (кортексин + ОСА) выявлено уменьшение количества вертикальных (на 68%; р<0,05) и горизонтальных локомоций (на 73%; р<0,05), R6 (на 60%; р<0,05) и R7 (на 86%; р<0,05). По сравнению со 2-й группой животных у крыс 5-й группы выявлено изменение времени R1 (+59%; р<0,05) и R7 (-80%; р<0,05). У крыс, которым вводили пинеалон перед ОСА, время на R1 также изменилось по сравнению с л/о животными (на +61%; р<0,05), как и в 5-й группе животных. Также возросло время R8 относительно контроля (на 126%; р<0,05). Время остальных форм поведения снизилось относительно 1-й группы. У крыс 6-й группы (пинеалон + ОСА) относительно животных 5-й группы (кортексин + ОСА) было угнетено пищевое (на 90%) и питьевое поведение (на 90%; р<0,05).

При анализе эффектов ОСА на медиаторный баланс показано, что в КБП старых крыс происходит понижение уровня НА (на 42%; р<0,05), так же как и в СС (на 22%; р<0,05), относительно контроля. Уровень А вырос в КБП (на 65%; р<0,05) и СС (на 154%; р<0,05). Поэтому происходило значительное снижение индекса НА/ДА на 65% (р<0,05) в КБП, а также соотношения ДО-ФА/ДА в СС мозга на 44% (р<0,05).

Для исследования эффектов пептидных геропротекторных препаратов, введенных крысам перед ОСА, была проведена серия экспериментов по изучению влияния кортексина и пинеалона на баланс нейромедиаторов в структурах мозга л/о животных. Под влиянием введения кортексина наблюдали повышение содержания ДОФА (на 13%; р<0,05) и ДА (на 43%; р<0,05) в КБП. В то же время, в СС отмечено снижение содержания ДА на 20% (р<0,05) относительно контроля. Соотношения НА/ДА и ДОФА/ДА снизились в КБП, соответственно, на 31% (р<0,05) и 21% (р<0,05), а в СС эти индексы увеличились, соответственно, на 39% (р<0,05) и 21% (р<0,05). Предположительно под влиянием кортексина усиливается стимуляция КБП подкорковыми структурами, медиатором нервных терминалей которых является ДА. Это, в свою очередь, может способствовать активации ГАМКергической системы в КБП, чем можно объяснить повышение времени R1 на фоне снижения R4-5, R6, R7 у животных относительно контроля. При введении пинеалона выявлено увеличение уровня А в КБП (на 27%; р<0,05) и в СС (на 43%;

р<0,05). Также в КБП установлено возрастание содержания ДА на 40% (р<0,05) относительно контроля. Поскольку с возрастом происходит снижение энергетического метаболизма во всем организме и в мозге, в частности, то возрастание содержания А в мозге старых крыс свидетельствует о повышении его энергообеспечения под влиянием пинеалона. На этом фоне повышение энергетического метаболизма в мозге приводит к наблюдаемому в поведенческом эксперименте снижению пищевого и питьевого поведения под влиянием пинеалона. Кроме того, кортексин и пинеалон оказывают седатив-ный эффект через активацию таламокортикальной системы, что способствует повышению Я8 и снижению двигательной активности (в основном 117) относительно контроля. Так, в КБП старых крыс под влиянием введения пинеалона выявлено снижение индекса ДОФА/ДА на 29% по сравнению с контролем. Вероятно, кортексин и пинеалон способствуют активации дофаминерги-ческой системы в КБП мозга старых ложнооперированных крыс. Однако кортексин реализует свои эффекты и через повышение активности этой системы в СС мозга, а пинеалон — через увеличение содержания А и, вероятно, увеличение энергетического метаболизма в мозге крыс. В КБП крыс 5-й группы (кортексин +ОСА) происходило изменение содержания ДОФА и ДА в сторону их накопления относительно контроля; в СС мозга выявлено увеличение уровня НА (на 15%; р<0,05) и А (на 57%; р<0,05) по сравнению с 1-й группой. Анализ результатов сравнения соотношений медиаторов показал, что в КБП животных 5-й группы происходило снижение индекса НА/ДА на 22% (р<0,05), а в СС выявлено возрастание данного соотношения на 21% (р<0,05) относительно л/о крыс. Следовательно, в мозге крыс, которым вводили кортексин перед ОСА, происходило изменение функциональной активности медиаторных систем в сторону активации НАергической в КБП, а ДАергической - в СС.

Предположительно, наблюдаемое в эксперименте достоверное (но не чрезмерное) повышение содержания НА в КБП крыс, которым вводили кортексин перед ОСА, может быть критерием эффективности действия препарата при стрессе, направленное на снижение интенсивности свободнорадикаль-ных процессов.

Таблица 5

Влияние окклюзии сонных артерий и пептидных биорегуляторов на представленность основных форм поведения ___ (с, М±т)____

Формы поведения/ Серии эксперимента Повед. сон 112-113 Я4 Я5 Я6 Я7 И8

Л/О, % от общего времени 1181,3±294,4 р<0,05 190,0±60,9 108,8±35,9 252,5±97, 1 838,0±39,5 р<0,05 654,0±3,6 375,0±57,5

ОСА, % от общего времени 1518±180 р<0,05 252,0±87,8 54,0±32,4 36,0±22,1 591,0±75,7 438,0±Ю5,0 711,0±288,6

Кортексин +л/о, % от общего времени 2017,5±499,5 р<0,05 112,5±37,5 48,8±38,9 45,0±28,7 727,5±269,8 292,5±140,8 356,3±141,3

Пинеалон + л/о, % от общего времени 1522,5±289,1 р<0,05 146,3±68,8 22,5±17,9 37,5±37,5 690,0±162,6 401,3±58,5 780,0±192,4 р<0,05

Кортексин +ОСА, % от общего времени 2412,0±109,5 р<0,05 66,0±18,7 51,0±29,9 75,0±75,0 330,0±99,6 90,0±28,5 576,0±192,4

Пинеалон + ОСА, % от общего времени 1902±200,4 р<0,05 67,5±17,6 5,0±5,0 7,5±7,5 495,0±99,7 287,5±82,6 835,0±160,2

р<0,05 - достоверные изменения показателей относительно контрольной группы

Нужно отметить, что у животных 5-й группы (кортексин + ОСА) по сравнению с л/о крысами, которым вводили данный препарат, выявлено возрастание уровня А в СС на 57% (р<0,05). При сравнении со 2-й группой крыс (ОСА) в 5-й группе животных происходило накопление НА (на 87%; р<0,05) и снижение содержания А (на 36%) в КБП. В СС крыс 5-й группы выявлены сходные изменения НА и А, а также отмечали накопление ДА (на 36%; р<0,05) относительно животных 2-й группы. Вероятно, при введении кортек-сина перед ОСА действие пептида направлено на сохранение энергетических ресурсов, что реализуется через эффекты на функциональное состояние ме-диаторных систем и поведенческие реакции. Это подтверждают данные литературы, согласно которым кортексин регулирует процессы перекисного окисления липидов в клетках головного мозга, снижает образование свободных радикалов, блокирует процессы свободнорадикального окисления. Данный препарат устраняет дисбаланс тормозных и возбуждающих аминокислот, обладает умеренным ГАМКергическим действием (Рыжак и др., 2003).

У животных 6-й группы (пинеалон + ОСА) выявлено накопление ДО-ФА и ДА в КБП, соответственно, на 22% (р<0,05) и 37% (р<0,05) относительно контроля. Тогда как в СС старых крыс 6-й группы установлено увеличение содержания А на 55% (р<0,05) по сравнению с контролем. При этом изменение соотношений медиаторов обнаружено только в КБП, где произошло снижение индекса НА/ДА на 27% (р<0,05). Относительно крыс 2-й группы (ОСА) у животных 6-й группы наблюдали накопление НА на 71% (р<0,05) и снижение уровня А на 37% (р<0,05) в КБП. У животных 6-й группы (пинеалон + ОСА) относительно л/о крыс, которым вводили пинеалон, установлены изменения только в КБП: содержание А было ниже на 18% (р<0,05), а ДОФА - выше на 24% (р<0,05). Но при этом содержание А у крыс 6-й группы в мозге соответствовало, а содержание ДОФА превышало контроль.

Предположительно, в основе этих изменений лежит активация процесса гидроксилирования тирозина при участии тирозингидроксилазы, продуктом реакции которой является дигидроксифенилаланин (ДОФА). Это происходит после того, как выделение катехоламинов сменяется уменьшением их концентрации в нервных терминалях, следовательно, уменьшения аллосте-рического ингибирования тирозингидроксилазы продуктом синтеза. Так, у крыс 6-й группы установлено возрастание индекса ДОФА/ДА на 26% (р=0,01) в КБП относительно животных 4-й группы (л/о + пинеалон). Относительно 5-й группы животных (кортексин + ОСА) у крыс 6-й группы (пинеалон + ОСА) выявлено накопление ДА в СС. Поэтому значения индексов НА/ДА и ДОФА/ДА у животных 5-й группы были достоверно выше, чем у крыс 6-й группы. Вероятно, с этим связано то, что общий уровень двигательной активности животных 6-й группы был выше относительно крыс 5-й группы.

С целью выявления нейрохимических механизмов, ответственных за адаптивные перестройки в структуре поведения животных под влиянием

предварительного введения препаратов перед ОСА изучали активность кас-

пазы-3 в структурах мозга старых крыс (табл. 6).

Таблица 6

Активность каспазы-3 (пмоль/мин/мг белка) в мозге старых крыс (М±ш)

Группа крыс / Структуры мозга Кора больших полушарий Стволовые структуры

1 группа (л/о) - контроль 0,82±0,11 1,03±0,14

2 группа (ОСА) 1,89±0,06* 1,87±0,31*

3 группа (кортексин) 0,63±0,08 1,16±0,21

4 группа (пинеалон) 1,18±0,12 1,31±0,13*

5 группа (кортексин + ОСА) 0,92±0,07 1,04±0,16

6 группа (пинеалон + ОСА) 0,99±0,11 1,42±0,38

* - достоверные отличия показателей относительно контроля (р<0,05).

Так, показаны выраженные региональные особенности активации каспазы-3 в головном мозге крыс в модели ишемии мозга в условиях предварительного введения пептидных препаратов. Через сутки после ОСА происходило значительное повышение активности фермента как в КБП (на 131%, р<0,001), так и в СС (на 82%; р<0,05). Известно, что субстратом для каспазы-3 служит множество белков цитоскелета (ламинин, в-актин, фодрин, пресе-нилин), ферменты репарации ДНК и регуляторы клеточного цикла (РАЛР, рШэ), протеинкиназы (МЕКК 1, БАК, РАК 2) - так называемые «субстраты смерти» (ТакаЬаэЫ К. й а1., 2006). Однако каспаза-3 содержит 1ШО-последовательность (аргинин-глицин-аспартат) вблизи активного центра фермента. В молекуле прокаспазы-3 эта последовательность вовлечена во внутримолекулярное взаимодействие, придающее молекуле профермента такую конформацию, при которой протеазная активность не может проявиться [Си1уаеуа 1Ч.У. е! а1., 2003]. Стоит заметить, что инициация апоптоза происходит не только в случае появления около клетки специальных веществ, но иногда и, наоборот, при снижении (отсутствии) химических соединений, препятствующих апоптозу [Семенов В.Н., Пасечник И.Н., 2004]. В зависимости от условий и вида клеток один и тот же сигнал может быть как про-, так и антиапоптическим [Белушкина Н.Н., Северин С.Е., 2001].

Введение кортексина не способствовало изменению активности каспа-зы-3 у л/о старых животных. Введение пинеалона вызывало повышение кас-пазной активности в КБП и СС мозга старых животных на 34% и 27%, соответственно. Недавние работы расширили представления о роли каспазы-3 в адаптационных реакциях в ЦНС. Каспаза-3 является наиболее представленной цистеиновой протеазой в мозге и играет ключевую роль в синаптической пластичности благодаря участию в регуляции ряда сигнальных систем мозга, отвечающих за установление межнейронных связей, что важно для реализации адаптивных реакций на процесс старения.

В условиях предварительного введения кортексина перед ОСА наблюдали снижение активности каспазы-3 в мозге до уровня контроля в КБП. Введение пинеалона способствует снижению активности фермента в мозге

относительно группы животных с ОСА. Однако в СС активность фермента выше, чем у л/о животных. Но поскольку введение пинеалона способствовало значительному увеличению выживаемости животных и сохранению целостности поведенческих реакций у старых крыс после ОСА, можно предполагать, что умеренная активация каспазы-3 в стволовых структурах мозга является отражением пластических перестроек, направленных на повышение адаптационных реакций организма в ответ на стрессорное воздействие.

При введении пептидов также изменялось поведение животных. Так, на фоне введения кортексина л/о старым крысам наблюдали снижение представленности 117; в условиях введения пинеалона обнаружено повышение 118, снижение 117 и мотивационного поведения. У крыс, которым перед ОСА вводили кортексин, произошло повышение времени Ю. При введении пинеалона перед ОСА у старых животных на фоне повышения II1 наблюдали снижение И2-3,114-5 и Кб. Такие перестройки в поведении животных можно характеризовать как адаптационные при ОСА. Однако эффекты пинеалона были более выражены по сравнению с кортексином.

У крыс, перенесших ОСА, введение пептидных биорегуляторов способствовало возрастанию содержания адренергических медиаторов: в КБП -ДОФА и ДА, в СС - А, а также НА у животных, которым перед ОСА вводили кортексин. Поскольку в настоящее время доказано, что адаптивные перестройки на уровне поведения также связаны с изменением протеолитической активности мозга, в частности, активности каспазы-3 [Кудряшова И.В. и др., 2007], также исследовали эффекты введения пептидов на активность данного фермента. Показано, что при введении пинеалона активность каспазы-3 была умеренно повышена как у ложнооперированных, так и крыс при ОСА. В мозге крыс, находящихся в условиях введения кортексина (л/о и подвергнутых ОСА), изменения активности каспазы-3 относительно контроля не происходило. Таким образом, можно предполагать, что эффекты пинеалона на адаптивные перестройки в мозге при стрессе могут носить пролонгированный характер.

Результаты проведенного исследования свидетельствуют о том, что применение пептидных геропротекторов пинеалона и кортексина животным разного возраста в условиях гипоксии позволяет затормозить развитие нейродегенеративных процессов в структурах головного мозга, вызванных ишемизацией. Полученные в экспериментальных моделях на животных данные о механизмах нейропротекторного действия кортексина и пинеалона могут быть положены в основу применения пептидных геропротекторов для профилактики и лечения возраст-ассоциированной патологии, обусловленной ишемическими процессами в головном мозге людей пожилого и старческого возраса.

ВЫВОДЫ

1. У животных, перенесших пренатальную гипоксию, снижена способность к обучению, особенно в модели гипоксической гипоксии в предплодном и плодном периодах. В модели введения пинеалона и моделирования гипоксической гипоксии на 13-20 сутки пренатального периода у молодых

крыс способность к латентному обучению повышается, но остается ниже контроля. Введение пинеалона в модели гипоксической гипоксии в зародышевый или предплодный периоды способствует восстановлению у 3-недельных крыс способности к латентному обучению до уровня нормы.

2. Пренатальный стресс, приходящийся на зародышевый или предплодный период, способствует нарушению структуры поведения у 3-недельных животных: изменяется время, затрачиваемое на поведенческий сон, пищевое поведение, груминг, двигательная активность. У 3-недельного потомства, перенесшего гипоксическую гипоксию на 13-20 сутки пренатального развития, значительно возрастает горизонтальная и вертикальная локомоторная активность за счет снижения времени других форм поведения. У крыс, которым пренатально вводили пинеалон и моделировали пренатальный стресс, возрастает время поведенческого сна, пищевого поведения и релаксированного бодрствования.

3. У крыс, перенесших гипоксическую гипоксию на 13-20 сутки пренатального развития, активность каспазы-3 в мозге выше, происходит повышение уровня адреналина в коре больших полушарий, а в условиях введения пинеалона и моделирования пренатальной гипоксии ниже относительно нормы. Введение пинеалона в течение всей беременности снижает эффекты пренатального стресса на медиаторный баланс: наиболее выражены эффекты пептида в моделях гипоксии, приходящейся на 18-20 и 13-20 сутки пренатального развития. В отличие от пинеалона пренатально введенный кортексин способствует повышению времени пищевого поведения и снижению времени поведенческого сна, понижению активности каспазы-3 и снижению уровня обучаемости в лабиринте Морриса у 21-дневных крыс.

4. При введении кортексина ложнооперированным старым крысам происходит снижение представленности груминга, а в условиях введения пинеалона - повышение релаксированного бодрствования, снижение груминга и мотивационного поведения. У старых животных при введении кортексина перед окклюзией сонных артерий повышается время поведенческого сна, при введении пинеалона перед окклюзией сонных артерий на фоне повышения поведенческого сна снижается ориентировочное, мотивацион-ное поведение и двигательная активность.

5. У старых крыс, перенесших окклюзию сонных артерий, введение пептидов способствует возрастанию содержания адренергических медиаторов: в коре больших полушарий - ДОФА и дофамина, в стволовых структурах -адреналина, а также норадреналина у животных, которым перед окклюзией сонных артерий вводили кортексин. При введении пинеалона активность каспазы-3 умеренно повышена у ложнооперированных животных и крыс в модели окклюзии сонных артерий. В мозге крыс, находящихся в условиях введения кортексина (ложнооперированных и подвергнутых окклюзии сонных артерий) изменения активности каспазы-3 относительно контрольной группы животных не происходит.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в журналах, включенных в Перечень ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации

1. Влияние кортексина и пинеалона на содержание моноаминов в мозге крыс/

A.M. Менджерицкий, Г.В. Карантыш, В.А. Абрамчук, Г.А. Рыжак, C.B. Демьяненко // Известия высших учебных заведений. Северо-Кавказский регион. Естественные науки, 2012. - № 4. - С. 65-69.

2.Влияние короткого пептида на нейродегенеративные процессы у крыс, перенесших пренатальную гипоксию / А. М. Менджерицкий, Г. В. Карантыш,

B. А. Абрамчук, Г. А. Рыжак // Нейрохимия, 2012. - Т. 29. - № 3. - С. 229234.

3.Влияние пептидных геропротекторов на навигационное научение и систему каспазы-3 в структурах мозга животных разного возраста /

A.М.Менджерицкий, Г.В. Карантыш, Г.А. Рыжак, В.А. Абрамчук // Успехи геронтологии. - 2013. - Т. 26, № 2. - С. 252-258.

4.Пептидная регуляция поведения и медиаторного баланса у старых крыс в условиях окклюзии сонных артерий / Г.В. Карантыш, В.А. Абрамчук, Г.А. Рыжак, A.M. Менджерицкий // Фундаментальные исследования. - 2013. — №6.-С. 1406-1410.

Тезисы докладов

5.Влияние коротких пептидов на поведение и латентное обучение крыс, перенесших пренатальную гипоксию/ A.M. Менджерицкий, Г.В. Карантыш,

B.А. Абрамчук, Г.А. Рыжак // Восьмой международный междисциплинарный конгресс «Нейронаука для медицины и психологии». - Судак, 2013. - С. 73.

6.Влияние коротких пептидов на содержание моноаминов в мозге крыс, перенесших пренатальную гипоксическую гипоксию / В.А. Абрамчук, A.M. Менджерицкий, Г.А. Рыжак, Г.В. Карантыш, C.B. Демьяненко // Восьмой международный междисциплинарный конгресс «Нейронаука для медицины и психологии». - Судак, 2013. - С.74.

7.Влияние пептидных препаратов на поведение крыс, перенесших окклюзию сонных артерий / A.M. Менджерицкий, Г.В. Карантыш, В.А. Абрамчук, Г.А. Рыжак // Сб. матер. V Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» (г. Ростов-на-Дону, 3-5 октября 2013 г.). - С. 82-83.

8.Менджерицкий, A.M. Влияние пептидных препаратов на латентное обучение крыс разного возраста в модели гипоксической и гипобарической гипоксии / A.M. Менджерицкий, Г.В. Карантыш, В.А. Абрамчук // Сб. матер, научно-практической конф. с международным участием «Нейрохимические подходы к исследованию функционирования мозга», Ростов-на-Дону. - 2011. -С. 17.

9.Менджерицкий, A.M. Влияние пинеалона на активность каспазы-3 в мозге и поведение крысят, перенесших пренатальную гипоксию / A.M. Менджерицкий, Г.В. Карантыш, В.А. Абрамчук // Всероссийская научная конф. «Модернизация науки и образования». - Ростов-на-Дону — Махачкала, 2011. -С. 60-65.

Ю.Модуляция нейрохимических систем коротким пептидом при гипоксиче-ском воздействии у крыс / В.А.Абрамчук, A.M. Менджерицкий, Г.В. Каран-тыш, Г.А. Рыжак // Сб. матер, научно-практической конф. с международным участием «Нейрохимические подходы к исследованию функционирования мозга», Ростов-на-Дону. - 28-30 сентября 2011. - С. 45.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ГАМК - гаммааминомаслянная кислота ГГ - гипоксмическая гипоксия ГемГ - гемическая гипоксия ДА - дофамин

КБП — кора больших полушарий головного мозга

л/о - ложнооперированные крысы

НА - норадреналин

ОСА - окклюзия сонных артерий

СС - стволовые структуры

R1 - поведенческий сон

R2 - горизонтальная локомоторная активность

R3 - вертикальная локомоторная активность

R4 - питье воды

R5 - потребление пищи

R6 -мелкая двигательная активность

R7 - груминг

R8 - релаксированное бодрствование

АБРАМЧУК Вячеслав Анатольевич ПЕПТИДНАЯ РЕГУЛЯЦИЯ НЕЙРОДЕГЕНЕРА-ТИВНЫХ ПРОЦЕССОВ У МОЛОДЫХ И СТАРЫХ КРЫС //Автореф. дисс.... канд. мед. наук:

14.01.30.-СПб., 2013.-25 с._

Подписано в печать «25» октября 2013. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Печ. л. 1,0.

_Тираж 100 экз. Заказ 120._

Отпечатано с готового оригинал-макета. ЗАО «Принт-Экспресс» 197101, С.-Петербург, ул. Большая Монетная, 5 лит. А.

СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Анисгшов В.Н., Хавинсон В.Х., Морозов В.Г. Роль пептидов эпифиза в регуляции гомеоетаза: двадцатилетний опыт исследования // Успехи современной биологии, 1993. - Т. 113. — Вып. 6. - С. 752-762.; Анисимов В.Н. Молекулярные и физиологические механизмы старения. -СПб: Наука, 2003. - 247 е.; Баннова А.В., Меныианов П.Н., Ильиных Ф А. и др. Уровень мРНК белков апоптоза - Вах и Bcl-XL в стволе и коре головного мозга крыс в онтогенезе // Бюлл. эксп биол. мед., 2005. - Т. 139. - № 6. - С. 669-671; Болдырев А.А., Булыгина Е.Р., Степанова М.С. Карнозин защищает мозг в условиях окислительного стресса, создаваемого в период пренатального развития // Журнал акушерства и женских болезней, 2010. - № 4. - С. 81-89.; Громова О.А. Нейротрофическая система мозга: нейропептиды, макро- и микроэлементы, нейротрофические препараты. // Оригинальные исследования, 2007. - Вып. 2. - № 12. - С. 57-63.; Гуляева Н.В. Неапоптотические функции каспазы-3 нервной ткани // Биохимия, 2003. - № 68. - С. 1459 -1470.; Дамулин И.В. Терапевтические возможности при болезни Альцгеймера и сосудистой деменции //Русский медицинский журнал. - М., 2001. - №7-8. - С. 310-313; Журавин И.А. Формирование центральных механизмов регуляции двигательных функций млекопитающих в зависимости от условий эмбрионального развития. //Журн. эволюц. биохимии и физиологии, 2002. - Вып. 38. - № 5. - С. 478—484.; Журавин И.А., Дубровская Н.М., Кочкина Е.Г. и др. Исследование действия гипоксии на развитие функций мозга и метаболизм амилоидного пептида с целью разработки средств ранней диагностики и профилактики болезни Альцгеймера // Журнал «Технологии живых систем», 2007. - №5-6. - С. 115-124.; Захаров В.В., Яхно Н.Н. Синдром умеренных когнитивных расстройств в пожилом возрасте: диагностика и лечение //Русский медицинский журнал, 2004. - № 10. - С. 573-576.; Линькова Н.С., Полякова В.О., Кветной ИМ и др. Особенности эпифизарно-тимических взаимоотношений при старении. // Успехи геронтологии, 2011. - Т. 24. - № 1. - С. 38-42.; Левин О.С. Дисциркуляторная энцефалопатия: современные представления о механизмах развития и лечения - М., 2006 - 24 е.; Менджерицкий A.M., Лысенко А.В., Ускова Н.И. к др. Исследование механизма противосудорожного эффекта дельта-сон индуцирующего пептида в условиях повышенного давления кислорода // Физиол. журн. им. И.М. Сеченова. 1996. - Т. 82, № 1. - С.59-63.; Менджерицкий А.М, Лысенко А.В. Нейропептиды и управление поведением организма в экстремальных условиях // Успехи функциональной нейрохимии. - СПб.: Изд-во СПб. ун-та., 2003. - С. 115 - 127.; Один В.И. Кризис геронтологии: к вопросу о первичном здоровье в XX веке. // Успехи геронтологии, 2011. - Т. 24. -№ 1. - С. 11-23.; Рыжак Г.А., Коновалов С.С. Геропротекгоры в профилактике возрастной патологии. — СПб.: «Прайм-ЕВРОЗНАК», 2004. - 160 е.; Рыжак Г. А., Малинин В. В., Платонова Т. Н. Кортексин и регуляция функций головного мозга. - СПб.: Фолиант, 2003. - 208 е.; Самойлов М.О. Мозг и адаптация: молекулярно-клеточные механизмы. - СПб.: Ин-т физиологии им И.П. Павлова РАН, 1999. -272 е.; Самойлов М.О., Рыбникова Е.А., Семенов Д.Г. и др. Нейрохимические механизмы толерантности мозга к гипоксии // Материалы конф. «Нейрохимия: фундаментальные и прикладные аспекты».- Москва, 2005. - С. 191.; Яковлев А.А., Перегуд Д.И., Павлова Т.В. Эффекты острого введения пентилентетразола и пентилентетразолового киндлинга: окислительный стресс и активность NO-синтазы в мозге // Нейрохимия, 2004. - Т. 21.- № 1. - С. 58- 67.; Bradford J.M. A rapid and sensitive method for the quantization of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding// Anal. Biochem., 1976. - Vol. 72. - P. 248- 254.; Caro J. Hypoxia regulation of gene transcription // High Alt. Med. Biol., 2001. - Vol. 2. - P. 145-154.; Chen P.H. Reactive oxygen radicals in signaling and damage in the ischemic brain // J. Cereb. Blood. Flow Metab., 2001. - Vol. 21. - № 1. - P. 2 - 14; Upton P. Ischemic cell death in brain neurons.// Physiol. Rev., 1999. - Vol.79. - P.1431-1568.; Mishra O.P., Delivoria-Papadopoulos M. Cellular mechanisms of hypoxic injury in the developing brain // Brain Res. Bull., 1999. - Vol. 48. - P. 233-238.; Nyakas C., Buwalda В., Luiten P.G.M. Hypoxia and brain development // Progress in Neurobiology, 1996. - Vol. 49. - P. 1-51.; Rossiter J. P., Anderson L. L„ Yang F„ Cole G. M. Caspase-3 activation and caspase-like proteolytic activity in human perinatal hypoxic-ischemic brain injury. // Acta Neuropathol., 2002. - Vol. 103. - P. 66-73.; Rybnikova E„ Gluschenko Т., Tulkova E. et al. Preconditioning induces prolonged expression of transcription factors pCREB and NF-kappaB in the neocortex of rats before and following severe hypobaric hypoxia // Journal of Neurochemistry, 2008,-Vol. 106. - P. 1450-1458.; Taylor D.L., Edwards A.D., Mehmet H. (1999) Oxidative metabolism, apoptosis and perinatal brain injury. // Brain Pathol., 1999. - Vol. 9. - P. 93-117.