Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Патогенетически направленная фармакотерапия псориаза и атеросклероза аторвастатином с учетом общих молекулярных факторов

На правах рукописи

Саутип Максим Евгеньевич

ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИ НАПРАВЛЕННАЯ ФАРМАКОТЕРАПИЯ ПСОРИАЗА И АТЕРОСКЛЕРОЗА АТОРВАСТАТИНОМ С УЧЕТОМ ОБЩИХ МОЛЕКУЛЯРНЫХ ФАКТОРОВ

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 2 МАЙ 2014

Москва, 2014 г.

005548800

Работа выполнена в Учреждении Российской Академии наук - Центре теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор

Центр теоретических проблем физико-химической

фармакологии РАН

Пирузян Анастас Левопович

Консультант:

кандидат биологических наук,

Соболев Владимир Васильевич

Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН

Официальные оппоненты: Оковитый Сергей Владимирович

доктор медицинских наук, профессор, зав. кафедрой фармакологии и клинической фармакологии ГБОУ ВПО Санкт-Петербургской химико-фармацевтическая академия МЗ РФ

Омельяновкий Виталий Владимирович

доктор медицинских наук, профессор,

директор Центра оценки технологий здравоохранения Института прикладных экономических исследований Российской академии народного хозяйства государственной службы при Президенте Российской Федерации

Ведущая организация: Московский государственный медико-стоматологический упиверситет

Защита состоится /6 июня 2014 года в 12.00 часов на заседании Диссертационного совета Д 002.252.01 при Центре теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН по адресу. 119991. ул. Косыгина, 4. Москва.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Центра теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН.

Автореферат диссертации разослан 2014 года.

Ученый секретарь Диссертационного сове доктор медицинских наук

Николаева Ирина Сергеевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Псориаз - эритематозно-сквамозный дерматоз, мультифаюгорной природы с доминирующим значением генетических факторов в развитии. Характеризуется гиперпролиферацией эпидермальных клеток, нарушением кератинизации, воспалительной реакцией в дерме, изменением в различных органах и системах. Больные псориазом составляют 12-15% от всех пациентов, страдающих дерматологическими заболеваниями.

Несмотря на наличие множества теорий, касающихся возникновения, развития, прогрессирования данного заболевания, вопрос его лечения остается открытым. В настоящее время исследование патогенеза псориаза и разработка методов его лечения направлены на создание препаратов, предназначенных для коррекции молекулярных и генетических нарушений, возникающих при этом заболевании. Существующие сегодня схемы терапии направлены скорее на достижение ремиссии заболевания, чем па его полное излечение.

Данные различных исследований свидетельствуют о возможной связи псориаза и атеросклероза. В частности, появилось большое количество исследований, свидетельствующих о том, что псориаз может являться одним из предрасполагающих факторов развития атеросклероза (Сопга1ег-.1иапа1еу С., 2009)

Атеросклероз — это хроническое, прогрессирующее, воспалительное заболевание стенок сосудов мышечного и мышечно-эластического типов с длительным бессимптомным течением. В развитых странах атеросклероз является одной из основных причин смерти. По данным литературы, ведущая роль в развитии, как атеросклеротического поражения стенок сосудов (УЬЬу, е! а!., 2009), так и псориатического процесса, принадлежит воспалению (Оау111оу1с1, е1 а1„ 2010).

Для коррекции нарушений липидного обмена, являющихся одним из ключевых факторов развития атеросклеротического процесса, широко применяются препараты из группы статинов (М1уа1а, й а1., 2013; Шевченко А. О., 2003). Статины обладают противовоспалительной активностью и оказывают ингибирующее действие на продукцию ряда провоспалительных цитокинов (1^рага, е1 а1., 2010). В связи с этим большой интерес представляет возможность применения этой группы препаратов в терапии хронических воспалительных заболеваний.

Хронические воспалительные заболевания, к которым относятся и псориаз, и атеросклероз, хотя и различаются по патофизиологии, тем не менее, обладают важными общими чертами, такими как хронический характер и структурная перестройка пораженных органов и тканей. По данным многочисленных независимых исследований, области генетического сцепления псориаза и атеросклероза часто перекрываются.

Учитывая общие черты, присущие псориазу и атеросклерозу, представляется

целесообразным изучить молекулярно-генетические нарушения, лежащие в основе развития этих заболеваний.

Цель п задачи исследования. Целью настоящего исследования явилось обоснование эффективности фармакотерапии аторвастатином больных псориазом и больных атеросклерозом с применением общих молекулярных маркеров.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Изучить особенности течения псориаза в исследуемых группах больных.

2. Выявить с помощью биоинформационных методов сигнальные пути, общие для псориаза и атеросклероза, и определить уровень экспрессии и локализацию накопления белковых продуктов ключевых генов.

3. Изучить изменение клинического статуса больных псориазом и больных атеросклерозом на фоне применения аторвастатина.

4. Изучить изменение уровней 1Ь-17А и ММР-12 у больных псориазом и больных атеросклерозом на фоне лечения аторвастатином.

Научная новизна и практическая значимость работы.

Впервые рассмотрено влияние аторвастатина на изменение уровней интерлекина-17А (1Ь-17А) и матриксной металлопротеиназы-12 (ММР-12) в сыворотке крови больных псориазом и атеросклерозом. Показаны возможности лечения аторвастатином при сочетании псориатического и атеросклеротического процессов. Разработан алгоритм обследования больных псориазом на наличие атеросклеротического поражения стенок сосудов. Показана необходимость более тщательного обследования больных псориазом, на предмет выявления поражения сердечно-сосудистой системы. Выявлены общие для этих заболеваний гены-мишени. Полученные результаты могут быть использованы в практическом здравоохранении для оптимизации существующих схем терапии и ранней диагностики поражений сердечнососудистой системы у больных псориазом.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Аторвастатин эффективен в качестве препарата для лечения пациентов, страдающих псориатическим поражением кожных покровов и пациентов, страдающих атеросклеротическим поражением сосудов.

2. Интерлейкин Я,-17А и матриксные металлопротеиназы ММР-2,9,12, являются факторами, влияющими на развитие, как псориаза, так и атеросклероза.

3. Накопление белков 1Ь-17А и ММР-12 в коже больных псориазом и интиме стенок сосудов при атеросклерозе свидетельствует об их роли в развитии этих патологий.

4. Уровень экспрессии генов 1Ь-17А, ММР-12 в коже, пораженной псориатическим процессом, и интиме пораженных атеросклерозом сосудов, во много раз превышает данные показатели в непораженных участках.

Внедрение результатов исследования в практику

Результаты работы внедрены в практику ГКБ №14 им. В.Г.Короленко и филиала «Вешняковский» Московского научно-практического центра дерматовенерологии и косметологии ДЗ г. Москвы.

Апробация результатов работы. Материалы работы были доложены и обсуждены на: 17 Конгрессе Европейской академии дерматологии и венерологии (Париж, 2008), Всероссийской научно-практической конференции «Артериальная гипертония: новые аспекты патогенеза. Возрастные и тендерные особенности» (Иваново, 2008 г.), II Всероссийском научно-образовательном форуме «Кардиология 2009» (Москва, 2009 г), VI Съезде общества медицинских генетиков (Ростов-на-Дону, 2010 г.), Международной научной конференции «Генетика и биотехнология XXI века: проблемы, достижения, перспективы» (Минск, 2012 г.), II Международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы медицины» (Баку, 2013 г.).

Конкурсная поддержка работы. Диссертационная работа выполнена в Центре теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН. Часть экспериментальной работы проводилась на базе Лаборатории функциональной геномики Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН в соответствии с планами научно-исследовательских работ института в рамках Программы Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине», ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России» ГК 16.512.11.2049 и ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» ГК П1309.

Публикации. Основные результаты исследования по теме диссертации представлены в 14 печатных работах, в том числе в 7 статьях в журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией РФ для опубликования результатов кандидатских и докторских диссертаций.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 121 странице машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Включает 15 таблиц, 24 рисунка. Список цитируемых источников литературы включает 162 наименования.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ПО ГЛАВАМ

ГЛАВА 1. Обзор литературы

Обзор литературы состоит из пяти частей. В первой части обзора дана клиническая характеристика псориаза и атеросклероза, приведены данные, относительно их распространенности. Уделено внимание эпидемиологии и генетике заболеваний. Во второй части обзора обсуждаются медиаторы воспаления, связанные с патогенезом псориаза и атеросклероза, проводится анализ их взаимодействия при этих заболеваниях. В третьем разделе обзора литературы дана характеристика матриксных металлопротеиназ, их молекулярной структуры, описаны отдельные представители данной группы ферментов, представлены данные о взаимодействии матриксных металлопротеиназ с субстратами и их патофизиология, обсуждается значение матриксных металлопротеиназ в патогенезе псориаза и атеросклероза. В четвертой части проанализировано значение интерлейкинов в патогенезе псориаза и атеросклероза. Пятый раздел посвящен перспективам лечения псориаза и атеросклероза статинами.

ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования

Объект исследования и методы. Исходя из цели и задач исследования, обследовано 125 пациентов, страдающих псориатическим поражением кожных покровов и/или атеросклеротическим поражением стенок сосудов. В обследование включены 64 мужчины и 61 женщина в возрасте от 55 до 64 лет.

Согласно целям и задачам исследования было сформировано 4 группы пациентов.

В первую группу включено 31, а во вторую 32 пациента, страдающих псориатическим поражением кожных покровов. Всем пациентам производилось дуплексное сканирование артерий (сонных, плечевых, артерий нижних конечностей, почечных) для исключения серьезного атеросклеротического поражения.

Третью группу составили 32 человека, у которых по данным инструментального обследования были выявлены атеросклеротические поражения сосудов. Пациенты прошли контрольное дерматологическое обследование. Видимых проявлений псориаза или другой патологии кожи выявлено не было.

Для корректной оценки результатов измерений сформирована контрольная группа доноров из 30 человек без серьезной сопутствующей патологии (группа IV).

Пациенты, страдающие псориатическим поражением кожных покровов (группы I и П), получали базовую терапию согласно Московским городским стандартам оказания медицинской помощи населению, включающую применение дезинтаксикационных средств, витаминотерапию (парэнтеральное введение витаминов В1, В6, В12), местную терапию с использованием топических глюкокортикостероидов, кератолитических и смягчающих средств.

Пациенты из группы II и группы III в качестве терапевтического лечения получали ингибитор ГМК-КоА-редуктазы (статин) - аторвастатин. В рамках нашего исследования пациенты принимали данный препарат в дозировке от 5 мг до 20 мг 1 раз сутки в зависимости от индивидуальной восприимчивости к терапии под контролем биохимического анализа крови, проводимого I раз в 2 недели. Проверяли влияние препарата на уровень общего холестерина крови, ЛПНП. Побочные явления (токсическое влияние на клетки печени и мышечную ткань) определяли по уровню ACT, АЛТ и КФК, соответственно.

Сопутствующие заболевания, верифицированные у пациентов на момент исследования, находились вне стадии обострения, в связи с чем, не могли оказывать значительного влияния на результаты проспективного исследования.

Методы исследования:

На первом этапе исследований пациенты прошли комплексное обследование, включающее описание жалоб, анамнеза, оценку общего анализа крови, общего анализа мочи, биохимических показателей крови пациентов, определение индекса PASI.

С целью идентификации маркеров воспалительного процесса для оценки эффективности лечения аторвастатином проведено биоинформационное исследование.

При проведении биоинформационных исследований, анализа генных взаимодействий, основанных на данных литературы, использована база данных PubMed (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez/). В качестве инструмента обработки табличных данных применяли программу Pathway Studio ® и реферативную базу данных ResNet ® компании Ariadne Genomics (США).

Определяли уровни экспрессии генов IL-17A и ММР-12. Для подтверждения правильности выбора исследуемых генов на данном этапе в исследование были также включены ММР-2 и ММР-9, участвующие, по данным литературы в атеросклеротическом процессе.

При помощи метода иммуногистохимии определяли локализацию накопления белков IL-17А и ММР-12, как продуктов генов со значительно измененной экспрессией. Для анализа использовали первичные поликлональные антитела кролика против белка IL-17A и ММР-12 (Abeam). Продукты иммунохимической реакции визуализировали, используя флуоресцентный микроскоп Zeiss Axio Imaging (Zeiss, Германия), Dl-камеру Axio Cam HRm.

Биоптаты для иммуногистохимического исследования и анализа уровня экспрессии исследуемых генов получали из псориатических бляшек у больных Psoriasis vulgaris, а также из непораженных участков их кожи. Взятие биоматериала проводилось в Городской клинической больнице № 14 им. В.Г.Короленко. Материал получали под местной анестезией с помощью дерматологического пробойника (4 мм). Биоптаты из непораженных участков кожи брали на

расстоянии не менее чем 3 см от границ ближайших очагов поражения.

Для определения локализации накопления белков и анализа уровня экспрессии генов, принимающих, по данным литературы, участие в атеросклеротическом процессе, использовали материал, полученный в ходе хирургических вмешательств у пациентов, страдающих стенозом артерий, возникшим как осложнение атеросклероза (группа III). Биоматериал получали от пациентов отделения сосудистой хирургии КБ № 83 ФМБА России и 1 кардиологического отделения ФКУ «Медицинский учебно-научный клинический центр имени П.В. Мандрыка» МО РФ.

Для получения образцов РНК из биоптатов, кожи и сосудов использовали набор реагентов и протокол RNeasy Mini Kit®. (Qiagen, Германия). Для очистки от примесей ДНК, полученные препараты РНК обрабатывали ДНКазой (Qiagen., Германия) в контролируемых условиях.

ПЦР в режиме реального времени проводили в 96-луночных оптических плашках с использованием меченых флюоресцентных олигонуклеотидных проб («ДНК-Синтез», Россия). Экспериментальную работу по изучению экспрессии генов осуществляли на базе лаборатории функциональной геномики Института общей генетики РАН.

Проведенные исследования одобрены Локальным комитетом по этике при Институте общей генетики РАН и соответствовали принципам, изложенным в Хельсинкской декларации (1977 г.).

Для статистической обработки результатов использовали программы Microsoft Excel, Statistica 5.0. Обработку результатов проводили методами вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента. Достоверными считались различия при р<0,05. На рисунках и в таблицах приведены среднеарифметические значения показателей, в качестве разброса экспериментальных данных указаны среднеквадратичные отклонения. Для статической обработки результатов реакции ПЦР в реальном времени использовали следующие параметры: эффективность праймеров не менее 95%; коэффициент корреляции не менее 0,99; наклон кривой -3,4+0,2. Обработку результатов ПЦР проводили методом 2"4ЛСГ, который показывает, во сколько раз изменяется экспрессия гена в пораженном образце по сравнению с непораженным (Livak К и Schmittgen Т., 2001).

В рамках исследования иммунного статуса определяли уровень IL-17A и ММР-12 в сыворотке периферической крови. Измерение проводили до лечения и по окончании курса проводимой терапии. Уровни IL-17A и ММР-12 исследовали методом ИФА. Использовали образцы сывороток крови, полученные от пациентов всех четырех групп. Концентрацию субстратов определяли спектрофотометрически при длине волны 450 нм с использованием универсального иммунохимического анализатора Флюорофот (ООО СКБ «Пробанаучприбор» Россия).

ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение

Обследование пациентов включало: общий анализ крови, общий анализ мочи, биохимический анализ крови и оценку индекса PASI для всех групп пациентов. В данном исследовании параметры анализа крови и мочи сравнивали со значениями "нормы", т.е. общепринятыми т.н. референсными значениями, полученными для большой группы практически здоровых лиц.

Анализ липидного профиля сыворотки крови, пациентов, страдающих псориатическим поражением кожных покровов (группа I), показал уровень общего холестерина 7,4+0,3 ммоль/л, триглицеридов 2,8+0,1 ммоль/л, ЛПВП 0,5+0,2 ммоль/л. В группе II - 7,5+0.3 ммоль/л, 2,9+0,1 ммоль/л, 0,7+0,2 ммоль/л, соответственно. Результаты исследования подтверждают данные литературы об изменении липидного профиля у больных псориазом.

У пациентов с тяжелым атеросклеротическим поражением стенок артерий (группа III) уровень общего холестерина (7,9±0,3 ммоль/л) и триглицеридов (3,4+0,1 ммоль/л) превысил, а уровень ЛПВП (0,4+0,1 ммоль/л) был ниже референсного значения.

Полученные результаты не противоречат выводам ранее опубликованных исследований, показывающим нарушение липидного обмена при атеросклерозе.

При обследовании условно здоровых доноров (группа IV) отклонений в значениях показателей липидного профиля выявлено не было, не обнаружено также визуальных элементов, свидетельствующих о поражении кожных покровов.

Учитывая описанную раннее воспалительную природу заболеваний, а так же возможную патогенетическую связь псориатического поражения кожных покровов и атеросклеротического поражения стенок сосудов, следующим этапом наших исследований стал поиск маркеров для оценки влияния аторвастатина на течение воспалительного процесса при этих заболеваниях.

Для определения общих закономерностей патогенеза при псориазе и атеросклерозе проведено биоинформативное исследование с использованием программы Pathway Studio ® и реферативной базы данных ResNet ® компании Ariadne Genomics (США).

Сравнительный анализ молекулярно-генетических процессов при псориазе и при атеросклерозе выявил их изменение при данных заболеваниях. В результате определены общие сигнальные механизмы патогенеза этих двух заболеваний.

Выбранные сигнальные и регуляторные механизмы, с наибольшим представительством генов, связанных с данными заболеваниями, использовали для построения общего пути активации Т-клеток при псориазе и атеросклерозе, для чего в используемых сигнальных путях определяли гены с наибольшим количеством связей.

На рисунке 1 приведены условные обозначения, используемые на картах сетевых взаимодействий генов.

• PromoterBinding DirectReguiation

■ Expression

• Binding

• ProtModification FunctionalAssociation

Рисунок 1. Легенда обозначений объектов и взаимодействий между ними.

Определены наиболее вероятные регуляторные факторы этого пути и установлены регулируемые ими гены. Полученные данные свидетельствуют о принадлежности интерлейкина-17А (IL-17A) к наиболее релевантным регуляторным факторам (рисунок 2)

Анализ сигнального пути, идущего от IL-17A, выявил две группы генов, сегрегация которых прошла по принципу регуляции общим транскрипционным фактором. Одну часть генов регулировал транскрипционный комплекс АР-1 (JUN и FOS семейства), другую - NF-kB.

В группу, регулируемую NF-kB. включены гены, которые либо уже были связаны с обоими заболеваниями, либо являлись их хорошо известными биомаркерами (например, S100A7, псориазин - для псориаза и CCL2 - для атеросклероза).

Наибольший интерес представляет группа генов матриксных металлопротеиназ (ММР), которые не считаются специфическими маркерами атеросклероза или псориаза, но их участие в патогенезе этих заболеваний уже установлено. При атеросклерозе матриксные металлопротеиназы воздействуют на коллагеновые волокна фиброзного слоя атеросклеротической бляшки, приводя к его размягчению и разрыву.

При псориазе матриксные металлопротеиназы принимают участие в ремоделировании дермы, что приводит к серьёзным гистопатологическим изменениям кожи.

Таким образом, принимая во внимание, что и атеросклероз, и псориаз являются иммуноопосредованными воспалительными заболеваниями, при которых повышается содержание провоспалительных цитокинов в очаге поражения, изучение роли матриксных металлопротеиназ в качестве общих факторов риска развития этих заболеваний, имеет важное значение.

Результаты проведенного анализа подтвердили наше мнение о важной роли гена IL-17A и матриксных металлопротеиназ (.ММР-1, ММР-2, ММР-9 и ММР-12) в патогенезе псориаза и атеросклероза, а так же о возможной связи этих заболеваний на данном уровне.

Ceil Process Functional Class Disease Regulation

-i: --i i |; -i:; -:TT

Рисунок 2. Комбинированная карта экспрессионных мишеней сигнального пути IL-I7A.

Исходя из цели настоящего исследования, следующим шагом нашей работы стал анализ уровня экспрессии идентифицированных биоинформационным путем генов, участвующих в процессе возникновения и развития как псориатического поражения кожных покровов, так и атеросклеротического поражения сосудов. На следующем этапе исследований проводили определение уровней экспрессии генов IL-I7A, ММР-12. а также ММР-2, ММР-9 в пораженных и визуально непораженных участках ткани. Подобное сравнение позволило максимально исключить влияние побочных факторов на чистоту эксперимента и. ранее, было использовано в ряде работ зарубежных авторов (Sonkoly Е.. 2007. Yao Y.. 2008).

Материалом для исследования послужили биоптаты кожи, полученные у больных псориазом и биоптаты сосудов, полученные у больных атеросклерозом.

Анализ уровня экспрессии генов IL-17A. ММР-2, ММР-9 и ММР-12 в пораженной псориазом коже проведен методом полимеразной цепной реакции в реальном времени. Выявлено значительное повышение уровней экспрессии генов IL-I7A (в 54.4 раза), ММР-9 (в 2.6 раза) и ММР-12 (в 12.5 раза). Экспрессия ММР-2. напротив, оказалась сниженной в

псориатических бляшках, по сравнению с участками визуально непораженной кожи пациентов (рисунок 3).

100 2.3- 10

а* § р

г

0.1 -

и.-¡'А ММР-2 ММР-9 ММР-12

Рисунок 3. Содержание мРНК генов И-17А, ММР-2. ММР-9 и ММР-12 в пораженной и непораженной псориазом коже

*за единицу принят уровень экспрессии в визуально непораженных участках (р < 0,05).

Не выявлено существенных отличий экспрессии исследуемых генов в группах I и II, что подтверждает их исходную однородность.

В ходе хирургических операций, проводимых у пациентов, страдающих тяжелым атеросклеротическим поражением артерий, получены две серии образцов: образцы первой серии взяты из пораженного участка: образцы второй серии - визуально нормального участка ткани. Выявлены значимые изменения экспрессии генов ММР-2, 9, 12 и Я.-/7А в пораженном участке сосуда по сравнению с визуально нормальным участком.

Так уровень экспрессии гена /¿-/7/4. в данной группе, увеличен в среднем в 32,9 раза, а ММР-12 - в 63,5 раза (рисунок 4). Повышенная экспрессия гена 1Ь-17А, в пораженных атеросклерозом сосудах по сравнению с визуально непораженными, подтверждает активное участие семейства 1Ь-17 в развитии воспалительных заболеваний. 1Ь-17 относят к провоспалительным цитокинам в связи с его способностью повышать экспрессию многих медиаторов воспаления (1Ь-1(5, 1Ь-6, 11.-12, 1Ь-10, ТЫР-а), в особенности тех из них, которые вовлечены в пролиферацию, созревание и хемотаксис нейтрофилов. Многие исследователи ассоциируют повышенный уровень 1Ь-17 с некоторыми хроническими воспалительными заболеваниями, в том числе, псориазом и атеросклерозом (Ка)рага. е! а!.. 2010).

1000

П

а г

4, с*

5 Ч

I в И а

100

10

IЙШ

П-17А

ММР-2

ММР-9

ММР-12

Рисунок 4. Содержание мРНК генов 1Ь-17А, ММР-2, ММР-9 и ММР-12 в биоптатах пораженных атеросклерозом сосудах по сравнению с визуально непораженными. *за единицу принят уровень экспрессии в визуально непораженных участках (р < 0.05)

Сравнительный анализ полученных данных выявил разнонаправленность в экспрессии ММР-2 в зависимости от типа патологического процесса (рисунок 5).

с 1000 -

| || _1 .1 ||

I 1

1

|

Я 0.1

0,-1'А ММР-2 ММР-9 ММР-12

■ Псориаз ■ Атеросклероз

Рисунок 5. Сравнение уровней экспрессии генов 11^-17А, ММР-2, ММР-9 и ММР-12 при псориазе и атеросклерозе.

*за единицу принят уровень экспрессии в визуально непораженных участках (р < 0.05)

Экспрессия 1Ь-17А и ММР-12, как в псориатических, так и в атеросклеротических бляшках, была увеличена более чем в 10 раз. что подтверждает правильность выбора данных генов в качестве общих генов-кандидатов псориаза и атеросклероза.

Полученные результаты исследований, свидетельствующие об изменении экспрессии

генов в зоне патологического процесса, подтверждены на белковом уровне.

Образцы кожи пациентов, страдающих псориазом, и образцы стенок сосудов, полученные у пациентов, страдающих атеросклерозом, исследованы методом иммуногистохимии (рисунок 6). В работе использовали первичные антитела кролика (Abeam) к продуктам экспрессии. Определяемая визуально флюоресценция указывает на области накопления продуктов экспрессии. На основании полученных данных установлена локализация накопления белковых продуктов генов 1L-17A, MMP-I2.

В псориатических бляшках обнаружено значительное количество ММР-12. Накопление белка ММР-12 происходит преимущественно в базальном слое эпидермиса. В визуально неповрежденной коже у пациентов с псориазом содержание ММР-12 значительно ниже, чем в псориатических бляшках, и накопление происходит по всей толщине эпидермиса.

Накопление белкового продукта гена IL-17Л в псориатических бляшках происходило равномерно по всей толщине эпидермиса. В визуально неповрежденных участках кожи интенсивность наблюдаемого свечения была значительно ниже.

В результате проведенного иммуногистохимического исследования выявлено распределение продуктов экспрессии гена в стенке сосудов. Повышенное накопление продуктов генов отмечено в интиме сосудов. Различие в ширине области свечения объясняется состоянием ткани. Интима сосуда, исследованная при изучении гена ММР-12 (рисунок 6), повреждена в меньшей степени. Входящие в нее эндотелий, подэндотелиальный слой и внутренняя эластическая мембрана располагаются компактно. В то же время при изучении локализации накопления продуктов гена IL-17A представлен разрушенный в большей степени внутренний слой сосудистой стенки, определяются пустоты между волокнами, составляющими внутреннюю эластическую мембрану. Наибольшее их накопление отмечается в интиме сосуда, что подтверждается реакцией иммунофлюоресценции и свечением зеленого цвета, максимальная интенсивность которого определяется в области внутреннего слоя сосуда.

Учитывая результаты собственных биоинформационных исследований и современные представления о роли 1L-17A и ММР-12 в патогенезе атеросклероза и псориаза, принято решение об исследовании данных белков в качестве маркеров для оценки эффективности лечения псориаза с применением аторвастатина.

В результате проведенных исследований установлено, что уровень IL-17A в сыворотке крови больных, как псориазом, так и атеросклерозом, до начала лечения достоверно не отличался от контрольных значений. При этом уровень ММР-12 достоверно отличается от контрольной группы лишь в группе больных атеросклерозом. Сравнение показателей

П.-17Л

Визуально неизмененная ткань

ММР-12

Рисунок 6. Визуализация белковых продуктов генов в неизмененных участках кожи и пораженной псориатическим процессом коже с применением метода иммуногистохимии. Визуализация белковых продуктов генов в неизмененных участках артериальной стенки и пораженном атеросклерозом сосуде с применением метода иммуногистохимии.

проводилось между группой больных псориазом или атеросклерозом и группой условно здоровых доноров.

Ранее получены данные Уе 8. (2000) о связи повышения уровня ММР-12 при атеросклерозе с полиморфизмом гена ММР-12 и восприимчивостью к сердечно-сосудистым заболеваниям, атеросклерозу артерий, инфаркту миокарда, аневризме аорты. Активация ММР-12 наступает при изменении соотношения в системе протеазы-антипротеазы, влияющего на течение и прогрессирование атеросклероза.

После проведения необходимых обследований пациентам подбиралась индивидуальная терапевтическая доза аторвастатина под контролем биохимического анализа крови.

Через 3 месяца после начала применения аторвастатина в группах пациентов, страдающих псориазом, и пациентов с атеросклеротическим поражением артерий, проведено контрольное обследование для оценки клинической эффективности лечения.

Показатели липидного обмена у больных псориазом приблизились к референсным значениям (рисунок 7). Уровень общего холестерина, уменьшился до 6,1+0,2 ммоль/л; уровень триглицеридов до 2.14+0.2 ммоль/л; значение холестерина ЛПВП увеличилось до 0,85+0.1 ммоль/л.

<5 4 § 3

ЛПВП

Трцгшщерцды

' До лечения ■ После лечения в Референсные значенхи

Индекс атерогенносш

Рисунок 7. Динамика изменения основных показателей липидного обмена у пациентов, страдающих псориатическим поражением кожи, при лечении аторвастатином

- различие с референсными значениями достоверно при значении р < 0.05

У пациентов, страдающих атеросклеротическим поражением сосудов, значения основных показателей липидного обмена через 3 месяца после начала терапии аторвастатином. приблизились к референсным значениям, принятым в качестве условных целевых значений при измерениях на данной модели прибора для данного метода. Уровень общего холестерина, исходно составлявший 7,9+0.3 ммоль/л. уменьшился до 6,3+0.3 ммоль/л; уровень

•григлицеридов от 3,4+0,1 ммоль/л до 2,6+0,2 ммоль/л; значение холестерина ЛПВП, исходно составлявшее 0,4+0, ] ммоль/л, увеличилось до 0,7+0,2 ммоль/л. (рисунок 8).

Рисунок 8. Динамика основных показателей липидного обмена у пациентов, страдающих атеросклеротическим поражением сосудов при лечении аторвастатином

- различие с референсными значениями достоверно, р < 0.05

Курс лечения оказал положительное влияние на клиническую картину заболеваний и привел к улучшению состояния здоровья пациентов в группах II и III.

Проведенные клинические, инструментальные и лабораторные исследования не выявили токсических и других нежелательных эффектов при применении аторвастатина.

Согласно результатам контрольного дерматологического обследования лечение больных псориазом в группе II (применялась комбинация комплексной терапии и аторвастатина) привело не только к стабилизации, но и к определенной регрессии псориатического процесса. У больных, прошедших курс лечения, не наблюдалось свежих папулезных высыпаний, а также шелушения уже имевшихся до начала применения аторвастатина псориатических бляшек, т.е. можно было сделать вывод о достижении стационарной стадии заболевания. Достижение подобного эффекта в группе пациентов, проходящих лечение на основании стандартной комплексной терапии (группа I) в данные сроки отмечено не было.

Общая оценка состояния больных псориазом в группе II свидетельствовала о статистически достоверном снижении индекса PASI на 38.6% (среднее значение PASI в группе пациентов составило до лечения 15,8+1,2, через 3 месяца после начала терапии - 9,7+1,3*) (рисунок 9). В группе I. у пациентов которой аторвастатин не применялся, столь динамического изменения отмечено не было. В группах III и IV какие-либо признаки изменений со стороны кожных покровов выявлены не были.

9

Общий Тршттцерпды ЛПВП холестернн

Индекс атерогенносш

■ До лечения ■ После лечения ■ Референсные значения

3 16 I

i I

Исходно Через3 месяца

■ Группа I ■ Группа II * Группа III ■ Группа IV Рисунок 9. Динамика индекса PASI обследованных пациентов

* - различия до и через 3 месяца после начала терапии достоверны при значении р<0,05

Динамика показателей ММР-12 в сыворотке крови пациентов до и через 3 месяца после начала терапии отражена на рисунке 10.

ьь!

Псориаз (группа I) Псорпа-s (группа II) Атеросклероз (группа Ш) ■ Долеченпя ■ После леченпя »Кон1рольнаягрутта(грлтта IV)

Рисунок 10. Динамика уровня ММР-12 в сыворотке крови пациентов, страдающих псориатическим поражением кожных покровов, и пациентов с атеросклеротическим поражением сосудов

* - различия между группами I. II, III и контрольной группой IV достоверны при значении р<0.05

Следует отметить, что через 3 месяца после начала терапии ни в одной из групп пациентов не отмечено статистически достоверного изменения уровней IL-17A и ММР-12 в сыворотке крови. Полученные результаты могут свидетельствовать о том. что их концентрация в сыворотке крови слишком вариабильна и не отражает реального состояния локального воспалительного процесса. Отличие уровня ММР-12 как до, так и через 3 месяца после начала

терапии от референспых значений контрольной группы не противоречит данным об участии матриксных металлопротеиназ в атеросклеротическом процессе. ММР, непосредственно, участвует в разрушении экстрацеллюлярного матрикса стенок сосудов. Повышение уровня ММР-12 у пациентов, страдающих атеросклерозом, при отсутствии изменений у пациентов, страдающих псориатическим поражением кожных покровов, может указывать на то, что ключевое значение имеет расстояние от зоны повреждения до точки получения биологического материала. Наши измерения проводились в сыворотке крови, а ее состав быстрее реагирует на изменения в стенках сосудов, чем на изменения, происходящие в коже. При этом в ходе лечения не наблюдается быстрого, статистически значимого изменения концентрации ММР-12 в сыворотке крови. Полученные данные могут свидетельствовать о том, что, несмотря противовоспалительное действие препаратов группы статинов, развитие их системной противовоспалительной активности требует несколько более длительного времени, чем изменение показателей липидного обмена в крови.

ВЫВОДЫ

1. При обследовании пациентов старших возрастных групп, страдающих псориатическим поражением кожных покровов, и пациентов с тяжелым атероскперотическим поражением стенок артерий, выявлены сходные признаки текущего воспалительного процесса и изменение липидного профиля сыворотки крови (повышение уровня общего холестерина до 7,4+0,3 ммоль/л и 7,9+0,3 ммоль/л, триглицеридов до 2,8+0,1 ммоль/л и 3,4+0,1 ммоль/л, снижение уровня ЛПВП до 0,5±0,2 ммоль/л и 0,4±0,1 ммоль/л, соответственно).

2. Сравнительный анализ уровней экспрессии генов Пи-17А, ММР-2, ММР-9, ММР-12 выявил значительное увеличение уровня экспрессии 1Ь-17 и ММР-12 как при псориазе (в 54,5 и 12,5 раз), так и при атеросклеротическом поражении стенок сосудов (в 32,9 и 63,6 раза соответственно), что свидетельствует об их ключевой роли в обеих патологиях.

3. Методом иммуногистохимии определены участки локализации белков 1Ь-17А, ММР-12 в эпидермисе больных псориазом и интиме больных атеросклерозом, что подтверждает их роль в развитии этих патологий.

4. В ходе лечения достигнуто улучшение показателей липидного обмена как у больных, страдающих псориатическим поражением кожных покровов (ХС 6,1+0,2 ммоль/л; ТРГ 2,14+0,2 ммоль/л; ЛПВП 0,85+0,1 ммоль/л), так и у пациентов с атеросклеротическим поражением стенок артерий (ХС 6,3±0,3 ммоль/л; ТРГ 2,6+0,2 ммоль/л; ЛПВП 0,7+0,2 ммоль/л).

5. Курс лечения больных псориазом с применением аторвастатина, помогает достичь более ранней стабилизации и регрессии псориатического процесса (снижение индекса РА51 на 38,6%), по сравнению с группой больных псориазом, в которой аторвастатин не применялся. На

фоне лечения аторваетатином не выявлено статистически достоверного изменения уровней 1Ь-17А и ММР-12 в сыворотке крови пациентов, страдающих псориатическим поражением кожи и атеросклеротическим поражением стенок сосудов.

Практические рекомендации

1. Полученные результаты свидетельствуют о необходимости тщательного обследования больных псориазом для выявления поражения сердечно-сосудистой системы, а так же для предупреждения данной патологии.

2. В случае выявления у больных псориазом сопутствующей патологии со стороны сердечно-сосудистой системы в качестве предпочтительной фармакотерапии рекомендуется использование препарата аторвастатин.

3. Рекомендована следующая схема, дополняющая клиническое обследование больных с псориатическим поражением кожных покровов:

Больные псориазом

I

Диагностика нарушений липидного обмена

Подбор индивидуальной дозы аторвастатина для коррекции показателей липидного обмена

Стандартная комплексная терапия псориаза + аторвастатин

Стандартная комплексная терапия псориаза

Обязательный плановый контроль показателей липидного обмена.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Piruzian Е., Sobolev V., Sarkisova М., Soboleva A., Sautin М. Comparative analysis of expression of the AP-1 transcription factor's genes in psoriatic and atherosclerotic plaques // 17th Congress of the European academy of dermatology and venereology "Understanding new developments for better care". Paris, 17-21 September, 2008. - P. 1412.

2. Соболев В.В., Саутин М.Е., Пирузян Э.С.. Компоненты транскрипционного фактора АР-1 как гены-кандидаты процесса развития атеросклероза//Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Артериальная гипертония: новые аспекты патогенеза. Возрастные и тендерные особенности». (М.: «Экономика и информатика», 2008. - 200с.) Иваново, 4-5 декабря 2008 г. - С. 195-197.

3. Соболев В.В., Саутин М.Е., Саркисова М.К., Пирузян Э.С. Транскрипционный фактор АР-1, как ген-регулятор экспрессии гена 1Ь-18//Материалы XI Всероссийского научно-образовательного форума «Кардиология 2009». Москва, 21-23 января 2009 г. - С. 271-272.

4. Piruzian E.S., Sobolev V.V., Abdeev R.M., Zolotarenko A.D., Nikolaev A.A., Sarkisova M.K., Sautin M.E., Ishkin A.A., Piruzyan An.L., Ilyina S.A., Korsunskaya I.M.,. Rahimova O.Y,. Bruskin S.A. Study of molecular mechanisms involved in the pathogenesis of immune-mediated inflammatory diseases, using psoriasis as amodel//Acta Naturae. 2009,- Oct;l(3). - P. 125-135.

5. Соболев В. В., Золотаренко А. Д., Соболева А. Г., Саутин М. Е., Ильина С. А., Саркисова М. К., Голухова Е. 3., Елкин А. М., Брускин С. А., Абдеев P.M.. Экспрессия гена FOSL1 при псориазе и атеросклерозе//Генетика, 2010,- Т.46,- № 1. - С. 104—110.

6. Саутпи М.Е., Соболев В.В., Пирузян Э.С. Изменения экспрессии ММР-9 под влиянием генов АР-1 транскрипционного фактора// Медицинская генетика. Материалы VI Съезда общества медицинских генетиков. Ростов-на-Дону, 14-18 мая 2010 г.- С. 160.

7. Голухова Е.З., Пирузян Э.С., Соболев В.В., Саркисова М.К., Саутнн М.Е. Анализ экспрессии генов транскрипционного комплекса АР-1 при атеросклерозе//Материалы конференции «Нейросонология и церебральная гемодинамика. Актуальные вопросы ангионеврологии.». Москва, 29 ноября 2010 г.- С.55.

8. Соболев В.В., Стародубцева Н.Л., Пирузян A.JI., Миннибаев М. Т., Саутин М.Е., Туманов В.П., Брускин С.А. Сравнительное исследование экспрессии генов ATF-3 и ATF-4 в пораженных атеросклеротическим процессом сосудах и в коже при псориатическом процессе//Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2011. - Т. 151. - № 6. - С. 659663.

9. Саутин М. Е., Соболев В. В., Пирузян Э. С. АР-1 транскрипционный комплекс. Связь иммунной системы и атеросклероза//Российский иммунологический журнал, 2012,- Т. 6(14).- №3(1).-С.133-134.

10. Соболев В.В., Саутпн М. Е„ Брускин С.А. Экспрессия генов ММР-2 и ММР-12 при псориазе и атеросклерозе //Материалы международной научной конференции «Генетика и биотехнология XXI века: проблемы, достижения, перспективы» Минск, 2012 8-11 октября -С.216

11. Саутнн М. Е., Соболева А.Г., Золотаренко А.Д., Пирузян Э.С., Корсунская И.М., Орехов П.Ю., Чупин А.В., Брускин С.А., Соболев В.В. Экспрессия матриксных металлопротеиназ при псориазе и атеросклерозе.// Российский журнал кожных и венерических болезней, 2013. - №1. - С. 27-30

12. Соболев В.В., Соболева А.Г., Золотаренко А.Д., Саутпн М.Е., Николаев А.А., Миннибаев М.Т., Потекаев Н.Н., Корсунская И.М., Брускин С.А. Экспрессия генов матриксных металлопротеиназ в коже больных псориазом/УЭкспериментальная и клиническая дерматокосметология, 2013. - № 1. - С. 56-59.

13. Sautin М., Soboleva A., Zolotarenko A., Korsynkaia I., Orexov P., Chupin A., Bruskin C., Sobolev V., Lavrov A., Sakania L. Expression of genes for metalloproteinases MMP-2 and MMP-9 in patients with psoriasis and atherosclerosis//II International Scientific-Practical Conference "Medicine pressing questions". Baku. Azerbaijan, 20-21 April, 2013. C. 38-39

14. Соболев B.B., Саутпн M.E., Свитич O.A., Лавров А.А., Корсунская И.М. Экспрессия гена ММР-12 при псориазе и атеросклерозе//Современные проблемы дерматовенерологии, иммунологии и врачебной косметологии, 2014,- № 30.- С. 35-43.

Получен патент на изобретение:

1. Саркисова М.К. Соболев В.В., Саутнн М.Е. «Способ получения биопсийного материала из сосудов, пораженных атеросклерозом» Патент по заявке 2008150282/14 (065994) от 19 декабря 2008 г.

Подписано в печать 04.05.2014г.

Усл.п.л. - 1.0 Заказ № 20633 Тираж: 100 экз.

Копицентр «ЧЕРТЕЖ.ру» ИНН 7701723201 107023, Москва, ул.Б.Семеновская 11, стр.12 (495)542-7389 www.chertez.ru