Автореферат и диссертация по медицине (14.01.21) на тему:Особенности аллельного полиморфизма генов, ассоциированных с эндотелиальной дисфункцией, у больных с ранним дебютом венозного тромбоза

ДИССЕРТАЦИЯ
Особенности аллельного полиморфизма генов, ассоциированных с эндотелиальной дисфункцией, у больных с ранним дебютом венозного тромбоза - диссертация, тема по медицине
АВТОРЕФЕРАТ
Особенности аллельного полиморфизма генов, ассоциированных с эндотелиальной дисфункцией, у больных с ранним дебютом венозного тромбоза - тема автореферата по медицине
Полякова, Анастасия Павловна Санкт-Петербург 2014 г.
Ученая степень
кандидата медицинских наук
ВАК РФ
14.01.21
 
 

Автореферат диссертации по медицине на тему Особенности аллельного полиморфизма генов, ассоциированных с эндотелиальной дисфункцией, у больных с ранним дебютом венозного тромбоза

На правах рукописи

ПОЛЯКОВА Анастасия Павловна

ОСОБЕННОСТИ АЛЛЕЛЬНОГО ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОВ, АССОЦИИРОВАННЫХ С ЭНДОТЕЛИАЛЬНОЙ ДИСФУНКЦИЕЙ, У БОЛЬНЫХ С РАННИМ ДЕБЮТОМ ВЕНОЗНОГО ТРОМБОЗА

14.01.21 — гематология и переливание крови

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

0 3 АПР 2014

Санкт-Петербург - 2014

005546778

005546778

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении "Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии Федерального медико-биологического агентства" (ФГБУ РосНИИГТ ФМБА России), директор - доктор медицинских наук, профессор A.B. Чечеткин

Научные руководители:

доктор биологических наук Капустин Сергей Игоревич доктор медицинских наук Шмелева Вероника Михайловна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Калинина Наталья Михайловна, главный научный сотрудник отдела лабораторной диагностики ФГБУ "Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины им. A.M. Никифорова" МЧС России

доктор медицинских наук, профессор Сорока Владимир Васильевич, руководитель отдела неотложной сердечно-сосудистой хирургии государственного бюджетного учреждения "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт скорой помощи им. И.И. Джанелидзе"

Ведущая организация: Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева Минздрава России

Защита состоится «28» апреля 2014 г. в_часов

на заседании диссертационного Совета Д 208.074.01 при ФГБУ РосНИИГТ ФМБА России по адресу 191024, г. Санкт-Петербург, ул. 2-я Советская, д.16.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ РосНИИГТ ФМБА России.

Автореферат разослан «_»_

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

2014г.

Татьяна Валентиновна Глазанова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования

Тромбоэмболические заболевания являются ведущей причиной смертности и инвалидизации населения в России, странах Европы и США (Харченко В.И. и соавт., 2005; Heit J.A., 2005; Dowling N.F. et. al, 2003; Heit J.A., 2008). Частота возникновения венозного тромбоза (ВТ) и тромбоэмболических осложнений в общей популяции составляет 1-2 случая на тысячу населения ежегодно (Heit J.A. et. al, 2001; Naess I.A. et al, 2007). Важной чертой ВТ является многофакторный характер его этиопатогенеза (Lijfering W. M. et. al, 2010). В последние годы убедительно доказано, что наряду с классическими факторами риска (травмы, операции, беременность и пр.) (Knudson М.М. et. al, 2004; Paffrath T. et. al, 2010; Pottier P. et. al, 2009; Zoeller B. et. al, 2012; James A.H. et. al, 2009) значительную роль в увеличении вероятности возникновения данной патологии играет генетическая предрасположенность (Franco R.F., Reistma Р.Н., 2001; Капустин С.И. и соавт., 2003; Brouwer J.P. et. al, 2006).

В настоящее время все большее число авторов уделяют внимание функциональному состоянию эндотелия и его роли в патогенезе различных заболеваний, сопровождающихся поражением сосудистого русла (атеросклероз, артериальная гипертензия, сахарный диабет, артериальные тромбозы) (Davignon J., 2004; Contreras F. et. al, 2000; Corey Т.Е. et. al, 2010). Согласно классическим представлениям, поражение сосудистой стенки является обязательным звеном патогенеза тромбоза в артериальном русле, тогда как значение этого важнейшего компонента триады Вирхова для развития ВТ долгое время оставалось под вопросом. Однако результаты проведенных в последние годы ретро- и проспективных исследований свидетельствуют о наличии общих патогенетических механизмов при артериальном и венозном тромбозе, главным из которых признается "эндотелиальная дисфункция" (ЭД) (Jeijes-Sanchez С., 2005, Migliacci R. et. al, 2007). Термином "эндотелиальная дисфункция" сегодня обозначают нарушение целостности и/или функциональных свойств сосудистого эндотелия, сопровождающееся вазоконстрикцией и усиленной продукцией веществ, обладающих провоспалительными и протромботическими свойствами (Endermann D.H., 2004).

Молекулярные механизмы развития ЭД весьма разнообразны, что объясняется наличием значительного числа факторов, осуществляющих регуляцию физиологической активности эндотелия. К числу возможных причин развития ЭД относятся: снижение концентрации оксида азота (NO), гипергомоцистеинемия (ГГц), оксидативный стресс, нарушение регуляции процессов вазоконстрикции и вазодилатации вследствие дисбаланса ренин-ангиотензиновой системы (РАС), нарушения липидного обмена, активизация локального иммунного ответа, сопровождающаяся продукцией провоспалительных цитокинов и белков острой фазы воспаления. Многофакторный генез ЭД отражается наличием значительного числа биохимических маркеров, используемых для подтверждения данного

состояния, - снижение продукции N0 и активности его эндотелиальной синтазы (eNOS), повышение концентрации в плазме крови растворимого тромбомодулина (sTM), ангиотензина II (АТ II), фактора Виллебранда (vWF), ингибитора активатора плазминогена 1-го типа и многие другие (Петрищев

H.Н., 2007).

Степень разработанности темы. Несмотря на значительное число работ, посвященных изучению роли аллельных вариантов генов, кодирующих компоненты иммунной (Inge А.М., 2010), антиоксидантной (Levonen A.-L. et. al, 2008; Voetsch В. et. al, 2007), ренин-ангиотензиновой (Freitas A.I. et. al, 2008) и других систем организма в патогенезе артериального тромбоза, данные об их распространенности и ассоциации с маркерами ЭД при ВТ практически отсутствуют. В связи с этим, а также учитывая большое клиническое и социальное значение проблемы тромбоэмболических заболеваний, является актуальным установление особенностей аллельного полиморфизма генов, ассоциированных с ЭД, в группе больных с ранним дебютом ВТ.

Цель исследования

Установить роль аллельного полиморфизма генов, ассоциированных с эндотелиальной дисфункцией, в патогенезе венозного тромбоза у лиц молодого возраста.

Задачи исследования

I. Провести сравнительный анализ частот встречаемости аллелей и генотипов ряда генов, ассоциированных с ЭД, в группе больных молодого возраста с ВТ и у здоровых лиц, проживающих в Северо-Западном регионе Российской Федерации.

2. Провести анализ "ген-генных взаимодействий" в группе больных с ранним дебютом ВТ и установить особенности аллельного полиморфизма изучаемых генов у пациентов с классическими формами наследственной тромбофилии.

3. Выявить особенности распределения аллелей и генотипов изучаемых генов, характерные для пациентов с различными клиническими проявлениями ВТ.

4. Изучить особенности аллельного полиморфизма генов, ассоциированных с ЭД, в группе больных с ВТ в зависимости от тяжести течения заболевания.

5. На основании анализа ряда биохимических маркеров ЭД оценить функциональное состояние сосудистой стенки у больных с ВТ, а также фенотипическое проявление полиморфизма изучаемых генов.

Научная новизна

Впервые определены частоты встречаемости (ЧВ) аллельных вариантов ряда генов (TNF-a, IL-lp, IL-6, PONI, TM, EPCR), ассоциированных с ЭД, и их сочетаний у больных ВТ и в группе здоровых лиц Северо-Западного региона России. Выявлено статистически значимое увеличение доли лиц с вариантом

Ins/Ins гена ACE и снижение ЧВ аллеля TM 1418Т и генотипа 1418(Т/Т) гена ТМ в группе пациентов с ранним дебютом ВТ.

Проведен комплексный анализ и выявлена взаимосвязь между аллельным полиморфизмом генов, участвующих в регуляции функциональной активности эндотелия, и рядом биохимических маркеров ЭД (sTM, AT II, vWF, гомоцистеин - Гц, холестерин — Хс) в группе больных с ВТ.

Установлено, что ЭД является одним из важных патогенетических механизмов развития тромботического процесса в венозном русле и выявляется у 71,4% больных с ранним дебютом ВТ.

Показано, что основными предпосылками развития ЭД при ВТ являются аллельный полиморфизм генов, участвующих в регуляции функциональной активности эндотелия, и оксидативный стресс на фоне ГГц и/или дислипидемии. Носителями "неблагоприятных" генотипов, ассоциированных с ЭД, являются 99,5% пациентов с ВТ. При этом, в 62,8% случаев обнаруживается одновременное присутствие 3 и более таких генотипов.

Теоретическая и практическая значимость работы

Получены новые данные, которые способствуют расширению знаний о патогенезе ЭД у больных с ВТ и определению информативного комплекса методов молекулярной диагностики дисфункции эндотелия у этих пациентов с целью выявления группы риска развития тромбоэмболических осложнений и посттромботической болезни (ПТБ), а также разработки индивидуализированного подхода к лечению.

Молекулярно-генетическое обследование пациентов с ранним дебютом ВТ имеет практическое значение для составления индивидуального профиля риска и определения прогноза течения заболевания. Для стратификации риска развития тромбоэмболических осложнений у больных с тромбозом глубоких вен нижних конечностей (ТГВНК) целесообразно исследование аллельного полиморфизма генов IL-Iß, IL-6 и TNF-a. Для определения риска развития ПТБ рекомендуется молекулярно-генетическое тестирование «инсерционно-делеционного» диморфизма гена АСЕ, а рецидива ВТ - анализ полиморфизма генов АСЕ (Ins/Del) и IL-lß (-31Т/С).

Методология и методы исследования

В работе были использованы общенаучные (анализ данных, синтез) и частные научные методы (клинические, лабораторные, статистические).

На первом этапе исследования были определены ЧВ вариантов генов, ассоциированных с ЭД, у больных с ВТ и в группе контроля (КГ) и проанализирована взаимосвязь между особенностями распределения генотипов отдельных генов и риском развития ВТ. Далее для выявления наиболее тромбоопасных сочетаний вариантов различных генов был проведен анализ "ген-генных взаимодействий" в группе пациентов с ВТ, результаты которого были сопоставлены с аналогичными данными в здоровой популяции.

Возможность использования молекулярно-генетических характеристик пациента для прогнозирования течения ВТ была оценена на основании

сравнительного анализа особенностей полиморфизма изученных генов в различных клинических подгруппах больных. Кроме того, в группе больных с ВТ была выполнена оценка функционального состояния эндотелия сосудистой стенки путем исследования ряда биохимических показателей, являющихся маркерами или/и факторами риска ЭД, и проведен анализ их взаимосвязи с полиморфизмом изучаемых генов. Анализ ассоциативных связей выполнялся по единому плану.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Аллельный полиморфизм генов, ассоциированных с ЭД, играет значимую роль в патогенезе ВТ у лиц молодого возраста, в том числе, являющихся носителями мутаций в гене фактора V (G1691A, FV Leiden) или/и в гене протромбина (G20210A).

2. Молекулярно-генетические механизмы развития ЭД у больных с ВТ носят гетерогенный характер и оказывают влияние, как на риск возникновения тромбоза, так и на особенности его клинического течения.

3. Генетически обусловленная склонность к повышенной продукции провоспалительных цитокинов ассоциирована с риском развития тромбоэмболических осложнений у больных с ТГВНК.

4. Для группы пациентов с рецидивирующим течением ВТ и/или развившейся ПТБ характерно значимое увеличение частоты встречаемости генотипа Ins/Ins гена АСЕ.

Степень достоверности и апробация результатов диссертации

Достоверность и обоснованность результатов работы обеспечена комплексным анализом аллельного полиморфизма изучаемых генов, функционального состояния венозного эндотелия и анамнестических данных 207 больных с ВТ с использованием современных методов молекулярно-генетического, биохимического и иммуноферментного анализа, медицинской документации (истории болезни, выписные эпикризы, заключения о проведенных функциональных исследованиях), адекватных методов статистической обработки полученных данных. Апробация результатов диссертационной работы была выполнена 19 декабря 2013 года на межлабораторном заседании в Российском научно-исследовательском институте гематологии и трансфузиологии ФМБА. Положения диссертационной работы были представлены на Всероссийских научно-практических конференциях: «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии» (Москва, 2011, 2013 гг.), «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии» (Санкт-Петербург, 2011, 2012 гг.), «Беломорский симпозиум» (Архангельск, 2011 г.), «Актуальные вопросы сосудистой хирургии» (Санкт-Петербург, 2012 г.), «Фундаментальная наука и клиническая медицина — человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2012г.), «Молекулярные основы клинической медицины — возможное и реальное»

(Санкт-Петербург, 2012 г.), «Патология гемостаза - общеклиническая проблема» (Санкт-Петербург, 2013 г.), «Противоречия современной кардиологии. Спорные и нерешенные вопросы» (Самара, 2013 г.), международной научно-практической конференции «Свободные радикалы и антиоксиданты в химии, биологии и медицине» (Новосибирск, 2013 г.), международных конгрессах по тромбозу и гемостазу: XXIII (Киото, 2011 г.) и XXIV (Амстердам, 2013 г.) конгрессы Международного общества по тромбозу и гемостазу, 18-ом конгрессе Европейской ассоциации гематологов (Стокгольм, 2013 г).

Внедрение результатов исследования в практику

Результаты диссертационной работы используются при обследовании больных с ВТ, находящихся на стационарном или амбулаторном лечении в клиническом отделении "Хирургическая гематология", а также получающих консультативную помощь в ФГБУ РосНИИГТ ФМБА России.

Результаты диссертационной работы войдут в качестве фрагмента в Методические рекомендации "Генетические факторы риска венозного тромбоэмболизма у лиц молодого возраста".

Публикации результатов исследований

По материалам диссертации опубликовано 21 научная работа, из них 3 -в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации для публикации результатов диссертационных исследований.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 129 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа иллюстрирована 9 таблицами и 35 рисунками. Библиография включает 199 источников, из них 19 - отечественных и 180 - зарубежных авторов.

Личный вклад автора

Автором лично выполнено исследование аллельного полиморфизма изучаемых генов у пациентов с ВТ и в КГ, которое включало в себя выделение ДНК, постановку полимеразной цепной реакции (ПЦР), учет результатов генетического анализа; выполнен иммуноферментный анализ уровней тромбомодулина и ангиотензина II в плазме крови у обследованных лиц; произведен сбор анамнестических данных, регистрация, статистическая обработка, анализ полученных данных, обобщение результатов исследований и подготовка материалов к публикациям.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

В настоящее исследование вошли 207 пациентов (114 женщин и 93 мужчины) в возрасте от 18 до 53 лет (средний возраст группы - 35,0 ± 8,0 лет) с венозным тромбозом, проходивших в период с 2008 по 2013 год амбулаторное обследование или/и стационарное лечение в Российском научно-исследовательском институте гематологии и трансфузиологии ФМБА. Критериями включения в исследуемую группу было наличие в анамнезе ТГВНК и/или тромбоэмболии легочной артерии (ТЭЛА) с дебютом заболевания до 45 лет включительно. Лица моложе 18 лет, а также пациенты, имевшие в анамнезе эпизод(ы) артериального тромбоза, иные проявления артериальной патологии (ишемическая болезнь сердца, атеросклероз сосудов различной локализации, гипертоническая болезнь, цереброваскулярные заболевания), онкологические, онкогематологические и аутоиммунные заболевания, а также дефицит естественных антикоагулянтов были исключены из настоящего исследования. Данные объективного обследования пациентов были получены из историй болезни и выписных эпикризов. Анамнестические данные собирались на основании историй болезни, анкет и опросных листов пациентов. У 183 (88,4%) больных был диагностирован ТГВНК. Из них в 134 (64,7%) случаях клинико-инструментальное обследование не выявило признаков ТЭЛА (подгруппа "иТГВНК" - "изолированный ТГВНК"), а у 49 (23,7%) пациентов ТГВНК осложнился развитием ТЭЛА (подгруппа "ТГВНК+ТЭЛА"). У 24 (11,6%) индивидов, перенесших ТЭЛА, клинико-инструментальное обследование не выявило признаков ТГВНК (подгруппа "иТЭЛА" - "изолированная ТЭЛА"). В 21,9% случаев (40 человек) ТГВНК осложнился развитием ПТБ. У 58 (28,0%) человек наблюдались повторные эпизоды ВТ.

Контрольную группу составили 150 здоровых индивидов, соответствовавших по полу и возрасту обследованной группе пациентов и не имевших в анамнезе тромботических эпизодов.

В работе был исследован аллельный полиморфизм 11-ти генов, ассоциированных с ЭД:

1. Гены цитокинов (фактор некроза опухоли-а - TNF-a, интерлейкин-ip -IL-ip, интерлейкин-6 — IL-6);

2. Гены, участвующие в регуляции тонуса сосудов (ангиотензин-превращающий фермент - АСЕ, ангиотензиноген - AGT, рецептор ангиотензина II 1-го типа - AGTR1, эндотелиальная синтаза оксида азота -eNOS);

3. Гены, участвующие в регуляции липидного обмена и утилизации продуктов перекисного окисления липидов (апопротеин Е — ароЕ, параоксоназа - PONI);

4. Гены, ассоциированные с тромборезистентностью сосудистого эндотелия (тромбомодулин — ТМ, эндотелиальный рецептор протеина С — EPCR).

Амплификацию изученных в работе вариабельных участков геномной ДНК осуществляли методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Детекция результатов амплификации для инсерционно-делеционного (I/D) полиморфизма в гене АСЕ выполнялась методом электрофореза 10 мкл ПЦР продукта в 7% полиакриламидном геле. Идентификацию аллельных вариантов, обусловленных однонуклеотидными заменами, осуществляли с помощью анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов ПЦР-продукта (метод ПЦР-ПДРФ).

Для выявления классических форм тромбофилии у пациентов был выполнен анализ активности антитромбина III, фактора VIII, компонентов системы протеина С, содержания антифосфолипидных антител (АФА) волчаночного типа. Оценка исследуемых показателей была выполнена на полуавтоматических коагулометрах COAG-A-MATE ХМ ("Organon Teknika", Голландия) и ACL-200 ("Instrumentation Laboratory", США). Истинного дефицита естественных антикоагулянтов среди обследованных пациентов выявлено не было. Лица с обнаруженными АФА (9 человек) были исключены из дальнейшего анализа в связи с высокой клинической значимостью указанных антител, как самостоятельного фактора риска развития тромбоза (Ginsberg J.S. et. al, 1995; Шостак H.A. и соавт., 2005; Денисова A.A. и соавт., 2009).

Оценка функционального состояния эндотелия путем определения содержания ряда маркеров ЭД (sTM, антиген vWF, Гц, Хс, AT II, малоновый диапьдегид — МДА) проводилась у 36 больных с различными клиническим проявлениями ВТ и 36 здоровых индивидов, соответствовавших по полу и возрасту группе исследования. Отбор образцов крови проводился спустя минимум 3 месяца после последнего тромботического эпизода. Перед сдачей крови на анализ все пациенты заполняли анкеты и подписывали информированное согласие на выполнение исследования.

Определение содержания антигена vWF (Ag vWF) в исследуемых образцах осуществлялось на полуавтоматическом анализаторе агрегации тромбоцитов SOLAR АР 2110 (SOLAR Technical Service, Украина). Исследование уровней AT II, TM и Гц проводилось методом иммуноферментного анализа с использованием коммерческих наборов реагентов. Исследование показателей липидного обмена было выполнено на автоматическом биохимическом анализаторе Sapfir-400 (Niigata Mechatronics, Япония). Определение МДА проводилось колориметрическим методом по реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой (Андреева Л.И. и соавт., 1988).

Статистическая обработка результатов проводилась с помощью компьютерных программ GraphPad Prism, версия 5 (GraphPad Software Inc., San Diego, USA) и SNPstats (http://bioinfo.iconcoloaia.net/snpstals/s1art.htm). Частоты встречаемости аллелей и генотипов определяли прямым подсчетом. Анализ «ген-генных взаимодействий» проводился на основании изучения ассоциативных связей между аллельными и генотипическими вариантами различных генов с помощью точного критерия Фишера с использованием

компьютерной программы для анализа генетических данных "GenePop", доступной в Интернете (http://genepop.cui1in.eclu.au.'"). Для оценки степени различий в частоте встречаемости аллелей, генотипов и их сочетаний между исследуемыми группами рассчитывали коэффициент "отношения шансов" (OR - odds ratio) с 95% доверительным интервалом (CI - confidence interval), а также /^-значение. Соответствие распределения генотипов в обследованных группах каноническому распределению Харди-Вайнберга оценивали с помощью программы GenAlEx, версия 6.501, доступной в Интернете (http:,''/biology.anu.edu.au/GenAlEx/Welcome.html). Оценка различий уровней биохимических маркеров эндотелиальной дисфункции между исследуемыми группами и их корреляции с наличием отдельных аллельных вариантов изучаемых генов выполнялась с помощью t-tests и one-way ANOVA в компьютерной программе GraphPad Prism, версия 5 (GraphPad Software Inc., San Diego, USA). Во всех случаях статистическая значимость различий принималась при значении р<0,05.

Основные результаты исследования

На первом этапе исследования были определены ЧВ вариантов генов, ассоциированных с ЭД, у больных с ВТ и в КГ и проанализирована взаимосвязь между характером распределения генотипов отдельных генов и риском развития ВТ. Результаты сравнительного анализа представлены в таблице 1. Характер распределения генотипов для всех исследованных генов, как в группе больных, так и в контроле, соответствовал каноническому распределению Харди-Вайнберга.

Таблица 1 - Распределение аллелей и генотипов исследуемых генов у пациентов с ВТ и в КГ.

Полиморфизм Аллель ЧВ аллеля ВТ КГ N=207 N= 150 Генотип * ЧВ генотипа, % ВТ КГ N=207 N= 150

АроЕ ell еЗ/е4 е2 еЗ е4 0,085 0,824 0,092 0,090 0,814 0,096 Е2/Е2 е2/ЕЗ еЗ/ЕЗ Е2/Е4 ЕЗ/Е4 е4/Е4 0,5 15,0 67,6 1,0 14,5 1,4 0,0 16,7 65,3 1.3 15.3 1.4

PONI GInl92Arg 192Gln 192 Arg 0,742 0,258 0,678 0,322 192 (Gln/Gln) 192 (Gin/Arg) 192 (Arg/Arg) 54,1 40,1 5,8' 46,7 41,3 12,0

eNOS -786 Т/С -786 Т -786 С 0,623 0,377 0,620 0,380 -786 (Т/Т) -786 (Т/С) -786 (С/С) 41,5 41,5 17,0 39,3 46,0 14,7

AGT 704 Т/С 704 Т 704 С 0,507 0,493 0,518 0,482 704 (Т/Т) 704 (Т/С) 704 (С/С) 25.1 51.2 23,7 28,7 46,7 24,6

Продолжение таблицы 1

Полиморфизм Аллель ЧВ аллеля ВТ КГ N=207 N= 150 Генотип ЧВ генотипа, % ВТ КГ N=207 N= 150

АСЕ 287 п.н. Ins/Del Ins Del 0,531 0,469 0,483 0,517 Ins/Ins Ins/Del Del/Del 30,4' 45,4 24,2 20,7 54,7 24,7

AGTR1 1166 А/С 1166 А 1166 С 0,763 0,237 0,743 0,257 1166 (А/А) 1166 (А/С) 1166 (С/С) 58,9 34,8 6,3 56,7 36,0 7,3

TNF-a -308 G/A -308 G -308 А 0,884 0,116 0,889 0,111 -308 (G/G) -308 (G/A) -308 (А/А) 11,.3 22,2 0,5 78,7 20,7 0,7

IL-6 -176 G/C -176 G -176 С 0,560 0,440 0,570 0,430 -176 (G/G) -176(G/C) -176 (С/С) 29,5 53,1 17,4 31.3 51.4 17,3

IL-lp -31 Т/С -31 Т -31 С 0,703 0,297 0,697 0,303 -31 (Т/Т) -31 (Т/С) -31 (С/С) 48,8 43,0 8,2 48,7 41,3 10,0

EPCR 6936 A/G 6936 А 6936 G 0,862 0,138 0,902 0,098 6936 (А/А) 6936 (A/G) 6936 (G/G) 73,4 25,6 1,0 81,3 18,0 0,7

ТМ 1418 С/Т 1418 С 1418 Т 0,829 0.1722 0,722 0,278 1418 (С/С) 1418 (С/Т) 1418 (Т/Т) 68,12 29,5 2,42 54,0 36,0 10,0

Примечание: * Жирным шрифтом выделены генотипы, являющиеся потенциальными факторами риска тромбоза; N - здесь и далее количество индивидов в группе; 1 р <0,05; 2 р <0,01.

В результате проведенного исследования было установлено, что носители варианта Ins/Ins гена АСЕ, ассоциированного с низким уровнем АПФ в крови, встречались среди больных с ВТ значительно чаше, чем в контрольной группе (30,4% против 20,7% соответственно, р=0,04) (рисунок 1).

54,7%

30,4%

Ins/Ins

Ins/Del

Del/Del

0 ВТ □ КГ

Рисунок 1 - Распределение генотипов АСЕ у больных с ВТ и в КГ.

Кроме того, в группе пациентов с ВТ отмечалось увеличение доли лиц с генотипом 1418(С/С) ТМ (68,1% против 54,0% в КГ, соответственно, pSO.OI) и снижение ЧВ аллеля ТМ 1418Т и генотипа 1418(Т/Т) ТМ по сравнению с КГ (рЭ0,01 в обоих случаях) (рисунок 2), что указывает на протективную роль аллеля 1418Т гена тромбомодулина в развитии ВТ у лиц молодого возраста.

68,4%

Я ВТ □ кг

Рисунок 2 - Распределение генотипов ТМ у больных с ВТ и в КГ.

С целью поиска генотипических сочетаний, ассоциированных с риском развития ВТ у лиц моложе 45 лет, был выполнен анализ "межгенных взаимодействий" изучаемых генов в общей группе больных. В ходе этого анализа проводилось изучение ассоциативных связей между аллельными вариантами различных генов и выявление неслучайных генотипических сочетаний, ЧВ которых в исследуемой группе имели отклонения от произведения ЧВ входящих в их состав генотипов. С помощью компьютерной программы для анализа генетических данных "ОепеРор" в исследуемой группе были выявлены пары изученных генов с максимально значимым (р<0,2) коэффициентом неравновесного сцепления определенных аллельных вариантов. Затем, для каждой пары генов, с помощью точного критерия Фишера, были определены сочетания генотипов, для которых уровень статистической значимости ассоциативной связи между входящими в их состав генетическими вариантами соответствовал р<0,05. При отсутствии в составе "межгенной комбинации" генетического варианта с "основным эффектом", ЧВ которого в исследуемой группе пациентов имела статистически значимое отклонение от таковой в контроле, для оценки роли этого сочетания в развитии ВТ было использовано сравнение его ЧВ у больных и в КГ. При сравнении ЧВ выявленных в группе больных с ВТ неслучайных генотипических сочетаний с аналогичными значениями в КГ статистически значимых различий выявлено не было, что может быть связано с наличием в общей популяции аналогичных ассоциативных связей.

Для оценки возможного влияния полиморфизма генов, ассоциированных с ЭД, на риск возникновения ВТ в раннем возрасте у лиц, являющихся

носителями «классических» детерминант наследственной тромбофилии -мутаций в генах факторов II и V, был проведен анализ распределения генотипов "нейтрального ДНК-полиморфизма" в обследуемой группе пациентов в зависимости от наличия указанных генетических маркеров. Доли больных с ВТ, являющихся носителями мутации G1691A в гене фактора V (FV Gl691А Leiden) или G20210A в гене протромбина (FII G20210A), составили 19,3% и 9,7%, соответственно. У 4 (1,4%) пациентов Лейденская мутация была выявлена в гомозиготной форме, в 4 (1,9%) случаях обнаруживалось одновременное гетерозиготное носительство указанных генетических вариантов.

Как показали результаты проведенного анализа, для группы больных с ВТ, являющихся носителями мутации в гене фактора V, было характерным почти 2-кратное увеличение ЧВ гомозигот по аллелю eNOS -786С, по сравнению с группой пациентов, имеющих мутацию G20210A в гене протромбина (27,5% против 15,0%, р=0,3), и лицами без обозначенных генетических маркеров наследственной тромбофилии (27,5% против 14,6%, р=0,06). При этом носители генотипа -786(Т/С) гена eNOS встречались среди обладателей варианта FV Leiden почти в 2 раза реже, чем в группе больных без генетических маркеров НТ (25,0% против 45,7% соответственно, р=0,02) (рисунок 3). На значимость эффекта полиморфизма гена eNOS на риск возникновения ВТ в молодом возрасте у носителей Лейденской мутации может также указывать отклонение распределения генотипов eNOS в этой группе от канонического распределения Харди-Вайнберга (р=0,002).

-786 (Т/Т) -786 (Т/С) -786 (С/С) В FV(+) □ FII(-)/FV(-)

Рисунок 3 - Распределение генотипов eNOS у носителей мутации FV Leiden.

В группе больных с ВТ была выявлена положительная ассоциативная связь между наличием мутации FII G20210A и генотипом Ins/Ins гена АСЕ (р=0,02). Среди пациентов с ВТ, являющихся носителями мутации в гене протромбина, было отмечено существенное преобладание лиц с аллелем АСЕ Ins (90,0%) и гомозигот по этому аллелю (55,0%) по сравнению с больными, не имеющими генетических детерминант наследственной тромбофилии (р=0,02 в обоих случаях). В то же время, ЧВ гомозигот по «делеционному» аллелю гена АСЕ, характеризующихся повышенным уровнем продукции АПФ, в группе

пациентов с вариантом И1 С20210А была существенно ниже (10,0% против 23,8% в группе П1(-)/ГУ(-), р=0,3) (рисунок 4). 55,0%

■»«■ ■ ■ - i-n»^™' ' и—f—-

FII(+) FV(+) FII(-)/FV(->

Ш Ins/Ins H Ins/Del □ Del/Del

Подписи: FII - мутация в гене фактора II (FII 20210 G/A), FV - мутация в гене фактора V (FV 1691 G/A, FV Leiden).

Рисунок 4 — Распределение генотипов гена АСЕ у больных с ВТ в зависимости от наличия генетических детерминант наследственной тромбофилии.

Для установления возможного влияния аллельного полиморфизма генов, ассоциированных с ЭД, на особенности клинических проявлений ВТ был проведен сравнительный анализ распределения аллелей и генотипов изучаемых генов в различных подгруппах больных, выделенных в зависимости от локализации и характера течения тромботического процесса. В результате проведенного исследования у пациентов с иТГВНК так же, как и в общей группе больных с ВТ, была отмечена протективная роль варианта 1418Т/Т гена ТМ в развитии тромботического процесса. Частота встречаемости аллеля ТМ 1418Т и гомозигот по этому аллелю в исследуемой группе составила 17,2% и 3,0% против 28,0% и 10,0% в КГ (р=0,01 и р=0,03, соответственно).

В группе "ТГВНК+ТЭЛА" наблюдалось статистически значимое увеличение ЧВ гомозигот по аллелю IL-lß -31Т (63,3% против 43,3%; OR=2,3; 95%С1: 1,2-4,4; р=0,02) и уменьшение доли гетерозиготных носителей указанного аллеля по сравнению с больными с "изолированным ТГВНК" (26,5% против 50,7%; OR=0,4; 95%С1: 0,2-0,7; р<0,01) (рисунок 5).

Кроме того, для пациентов с ТГВНК, осложненным развитием ТЭЛА, было характерно некоторое увеличение ЧВ "редких" аллелей генов IL-6 и TNF-а (51,0% против 42,5% и 15,3% против 10,8%, соответственно), хотя эти различия не были статистически значимы. Гомозиготные носители аллеля IL-6 -174С встречались в этой группе больных в 2 раза чаще, чем среди пациентов с изолированным поражением сосудов венозного русла нижних конечностей (26,5% против 14,2%; р=0,08). Стоит также отметить, что единственный больной, являющийся носителем генотипа —308(А/А) гена TNF-a, имел в анамнезе эпизод ТГВНК, осложненный развитием ТЭЛА.

63,3%

-31(Т/Т) -31 ('Г/С) -31(С/С) НТГВНК+ТЭЛА □иТГВНК

Рисунок 5 - Распределение генотипов IL-ip у больных с "изолированным ТГВНК" и с ТГВНК, осложненным ТЭЛА.

У пациентов с иТЭЛА отмечалось снижение ЧВ "делеционного" (Del) аллеля гена АСЕ по сравнению с больными, страдающими изолированным ТГВНК (35,4% против 50,0%, р=0,08), и представителями КГ (35,4% против 51,7%, р=0,04). Генотип АСЕ Del/Del также встречался среди лиц с иТЭЛА гораздо реже, чем в указанных группах сравнения, хотя эти различия и не были статистически значимыми (12,5% против 27,6% в группе "иТГВНК", р=0,1 и 12,5% против 24,7% в КГ, р=0,3). В то же время, ЧВ гомозигот по аллелю АСЕ Ins в этой подгруппе была в 1,5 раза выше, чем у больных с изолированным поражением глубоких вен нижних конечностей и в 2 раза выше, чем у здоровых лиц (41,7% против 27,6%, р=0,2 и 41,7% против 20,7%, р=0,04 соответственно). Кроме того, для пациентов с "изолированной ТЭЛА" было характерно снижение ЧВ аллеля ТМ 1418Т по сравнению с больными из группы "иТГВНК" и лицами КГ (10,4% против 17,2%, р=0,3 и 10,4% против 28,0%, рЕ0,01, соответственно). В исследуемой группе не было выявлено ни одного гомозиготного носителя данного варианта гена ТМ. Напротив, ЧВ генотипа 1418 С/С гена ТМ в группе "иТЭЛА" была несколько выше, чем у пациентов с изолированным поражением вен нижних конечностей (79,2% против 68,7%, р=0,3) и существенно превышала таковую у представителей КГ (79,2% против 54,0%, р=0,03).

Как для больных с рецидивирующим течением ВТ, так и для пациентов с развившейся после тромботического эпизода ПТБ было характерно статистически значимое снижение доли носителей аллеля АСЕ Del (36,2% против 51,0% у больных с единственным эпизодом ВТ в анамнезе, pS0,01 и 37,5% против 51,4% у больных без ПТБ, р=0,03) и гомозигот по этому аллелю (13,8% против 28,2%, р=0,03, и 10,0% против 30,0%, р=0,01, соответственно) (рисунок 6). Кроме того, в подгруппе пациентов с рецидивирующим течением ВТ частота встречаемости генотипа -31 (С/С) гена IL-ip была почти в 3 раза выше, чем у лиц с единственным тромботическим эпизодом в анамнезе (15,5% против 5,4%, р= 0,02).

Del/Del

■ ПТБ (+) ИПТБ(-) □ Рецидив ВТ (+) И Рецидив ВТ (-)

Рисунок 6 - Частота встречаемости генотипа Del/Del гена АСЕ у больных с осложненным течением ВТ.

Оценивая суммарный вклад генетического фактора - полиморфизма генов, ассоциированных с ЭД, в развитие ВТ у лиц молодого возраста, нами было установлено, что носителями "неблагоприятных" генотипов изучаемых генов являются 99,5% пациентов. Кроме того, у большинства больных с ВТ наблюдается сочетание нескольких "неблагоприятных" аллельных вариантов. В частности, в 62,8% случаев обнаруживается одновременное присутствие 3 и более таких генотипов (рисунок 7).

И 3 маркера □ более 3 маркеров

Рисунок 7 — Частота встречаемости "неблагоприятных" генотипов генов, ассоциированных с ЭД, и их сочетаний у больных с ВТ.

Значительным разделом нашего исследования была оценка функционального состояния эндотелия сосудистой стенки у больных с ВТ путем исследования ряда биохимических показателей, которые либо являются маркерами ЭД (бТМ, А§ у\\ПР), либо оказывают повреждающее воздействие на сосудистую стенку (Гц, Хс, МДА, АТ II) и характеризуют выраженность ЭД. Также был проведен анализ взаимосвязи некоторых из этих показателей с особенностями полиморфизма изучаемых генов. В результате проведенного исследования ЭД была выявлена у 71% обследованных пациентов. При этом в

45,1% случаев обнаруживалось увеличение уровней высокоспецифичных маркеров ЭД - антигенов фактора Виллебранда и тромбомодулина (Nadar S. et. al, 2004; Петрищев H.H.; 2007, Головина О.Г., 2004). Повышенные уровни ТМ наблюдались у 11,8% больных с ВТ, а у 33,3% пациентов было выявлено повышенное содержание Ag vWF.

Известно, что высокие уровни антигена vWF и его активности не только указывают на наличие повреждения эндотелия, но и повышают риск развития как артериальных, так и венозных тромбозов (Martinelli I., 2005; Головина О.Г., 2004). Функциональная роль растворимой формы ТМ до сих пор однозначно не определена. Ряд авторов рассматривает sTM в качестве одного из наиболее специфичных маркеров ЭД (Blann A. D., 1997; Nadar S. et. al, 2004; Петрищев H.H., 2007). В то же время, некоторые исследователи считают, что повышение уровня sTM свидетельствует об усилении антикоагулянтной активности плазмы и может, с одной стороны, играть защитную роль в развитии ВТ (Anastasious G. et. al, 2011, Navarro S. et. al, 2013), а с другой - быть предиктором кровотечений (Jansson J.-H. et. al, 1997). Для оценки влияния аллельного полиморфизма гена ТМ на его уровень в плазме крови был выполнен анализ содержания sTM у пациентов с различными генотипами гена ТМ, который показал, что носители аллеля ТМ 1418Т имеют более высокие показатели sTM, чем больные с генотипом 1418 (С/С) ТМ (рисунок 8). При этом средний уровень sTM в группе больных был несколько ниже, чем у здоровых лиц. Выявленное ранее статистически значимое снижение ЧВ аллеля ТМ 1418Т и генотипа 1418(Т/Т) у пациентов с ВТ по сравнению с КГ позволяет объяснить снижение sTM в обследованной группе пациентов.

Подписи: На оси абцисс отмечены генотипы и аллели гена ТМ. ТМ - эТМ. Рисунок 8 - Зависимость уровня вТМ от полиморфизма гена ТМ (1418С/Т).

Проведенный в данной работе анализ показал, что наибольшее значение в патогенезе ЭД у больных с ВТ имеют аллельный полиморфизм изученных

генов, а также оксидативный стресс, обусловленный, главным образом, дислипидемией или/и гипергомоцистеинемией (ГГц).

Гиперхолестеринемия (ГХс) была выявлена более чем у половины (55,6%) обследованных больных и обусловлена повышенным содержанием липопротеинов низкой плотности (ЛПНП), которые наиболее подвержены перекисному окислению (Steinberg D., 1997). Доля лиц с уровнем ЛПНП выше референтного значения 3,0 ммоль/л в обследуемой группе составила 65,4%. Индекс атерогенности в группе больных с ВТ варьировал от 0,9 до 7,9. Доля лиц с индексом атерогенности более 3,0 в обследуемой группе составила 38,5%. Известно, что механизм патологического воздействия холестерина ЛПНП на сосудистую стенку заключается в ее повреждении липидными радикалами -продуктами перекисного окисления липидов (D. Steinberg, 1997). Для оценки оксидантно-антиоксидантного статуса пациентов в нашей работе в качестве показателя оксидативного стресса использовался МДА - вторичный продукт перекисного окисления липидов. В результате, оксидативный стресс был выявлен у 44,4% больных с ВТ. При этом, повышенные уровни МДА наблюдались у 8 (53,3%) индивидов с ГХс. Биологические эффекты МДА до сих пор остаются до конца не изученными. Однако известно, что он вызывает повреждение ДНК, оказывая цитотоксичное и мутагенное воздействие на клетки (Marnett L.J., 1999), а также способствует активации лимфоцитов, усиливая воспалительный ответ (Raghavan S. et. al, 2012).

Гипергомоцистеинемия, которая выявлялась у 37,0% больных с ВТ, также вносит значимый вклад в развитие оксидативного стресса (Faraci F.M., 2004). Повышенные уровни МДА были выявлены у 50% больных с ГГц. Кроме того, у 6 человек (22,2%) было выявлено сочетание ГХс и ГГц. Содержание МДА у этих индивидов определялось на уровне 13,3 мкмоль/л. У лиц с «нормальными» уровнями Хс и Гц (8 человек, 29,6%) средняя концентрация МДА в плазме крови составила 12,6 мкмоль/л. Таким образом, сочетание ГХс и ГГц ассоциировано с усилением оксидативного стресса у больных с ВТ.

При изучении зависимости уровня Гц от генотипа MTHFR было установлено, что доля лиц с генотипом 677(Т/Т) MTHFR, ассоциированным с более высокими, по сравнению с носителями аллеля MTHFR 677С, уровнями исследуемого вещества, в группе больных с выявленной ГГц была почти в 2 раза выше, чем у пациентов с «нормальными» значениями Гц (30,0% против 17,6%).

Исследование уровня AT II в плазме крови, который также рассматривается в качестве одного из маркеров ЭД (Петрищев Н. Н., 2007), выявило некоторое его снижение в группе пациентов с ВТ по сравнению с КГ, хотя это различие и не было статистически значимым (0,17±0,03 нг/мл против 0,27±0,04 нг/мл, р=0,07). Таким образом, вопреки ранее высказанному предположению о том, что данный показатель может отражать степень выраженности ЭД, полученные результаты не позволяют сделать подобное заключение. Вероятно, наблюдаемое явление связано с особенностями распределения аллельных вариантов генов РАС у больных с ВТ, так как анализ

зависимости уровня AT II в плазме крови от полиморфизма указанных генов выявил тенденцию к повышению содержания исследуемого вещества у носителей «редких» аллелей. Так, при изучении распределения аллелей и генотипов генов РАС было установлено, что в общей группе пациентов с ВТ значительно чаше, чем в контроле выявлялись носители варианта Ins/Ins гена АСЕ (30,4% против 20,7%, р=0,04).

Учитывая тот факт, что фенотипическое проявление и протромботический потенциал рассмотренных в работе генетических вариантов может существенно модифицироваться экзогенными факторами, к числу которых относятся ГГц, ГХс и оксидативный стресс, представляется актуальным дальнейшее изучение влияния аллельного полиморфизма генов, ассоциированных с ЭД, на риск развития ВТ, как в комплексе с другими известными факторами риска, так и в аспекте "ген-генных" взаимодействий.

Таким образом, результаты проведенного исследования доказывают, что ЭД является важным патогенетическим механизмом тромботического процесса в венозном русле. Значимую роль в ее развитии играет полиморфизм генов компонентов ренин-ангиотензиновой (АСЕ) и системы протеина С (ТМ). Отдельные аллельные варианты обозначенных генов, а также генов некоторых цитокинов ассоциированы не только с риском развития ВТ у лиц молодого возраста, но и с особенностями клинического проявления тромботического процесса, а также прогнозом его течения.

ВЫВОДЫ

1. Распределение аллельных вариантов генов, ассоциированных с эндотелиальной дисфункцией, имеет ряд характерных особенностей у больных с ранним дебютом венозного тромбоза: статистически значимое увеличение доли лиц с вариантом Ins/Ins гена АСЕ и снижение частоты встречаемости аллеля ТМ 1418Т и генотипа 1418(Т/Т) гена ТМ.

2. У носителей мутаций в генах факторов II и V с ранним дебютом ВТ выявлено снижение частоты встречаемости "неблагоприятных" вариантов генов, участвующих в регуляции тонуса сосудов (eNOS, AGT, АСЕ).

3. Генотип 1418(Т/Т) гена ТМ играет протективную роль в развитии ТГВНК у лиц молодого возраста.

4. Аллельный полиморфизм генов провоспалительных цитокинов (IL-lß и IL-6), обуславливающий их гиперпродукцию, ассоциирован с развитием тромбоэмболических осложнений у больных с ТГВНК.

5. Для пациентов с рецидивом ВТ и/или посттромботической болезнью характерна повышенная частота встречаемости генотипа Ins/Ins АСЕ. Наличие варианта -31 (С/С) гена IL-lß предрасполагает к развитию повторного эпизода тромбоза.

6. Эндотелиальная дисфункция является важным патогенетическим механизмом тромботического процесса в венозном русле и выявляется у 71,4% больных с ранним дебютом ВТ. Носителями "неблагоприятных" генотипов, ассоциированных с эндотелиальной дисфункцией, являются 99,5% пациентов с

ВТ. В 62,8% случаев обнаруживается одновременное присутствие 3 и более таких генотипов.

Практические рекомендации и перспективы дальнейших исследований

1. У лиц с ранним дебютом ВТ, наряду с обследованием на наличие классических форм наследственной тромбофилии, в спектр выполняемых молекулярно-генетических исследований целесообразно включать анализ полиморфизма генов, ассоциированных с ЭД.

2. Наличие у пациента с ВТ генотипов -31 (С/С) гена IL-Iß, Ins/Ins гена ACE или/и "редких" аллелей генов IL-6 и TNF-a указывает на повышенный риск развития тромбоэмболических осложнений, ПТБ и/или рецидива заболевания, что должно учитываться при проведении вторичной профилактики.

3. При наличии генетической предрасположенности к нарушениям липидного обмена у больных с ранним дебютом ВТ показан регулярный анализ показателей липидного спектра, с целью выявления дислипидемии и ее своевременной коррекции.

Дальнейшее изучение молекулярно-генетических механизмов развития ЭД у больных с ВТ позволит расширить представления о патогенезе данного заболевания, что будет способствовать разработке новых эффективных методов профилактики и лечения тромбоэмболических осложнений.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Публикации в журналах, рекомендованных ВАК

1. Полякова А. П. Молекулярные механизмы эндотелиальной дисфункции при венозном тромбоэмболизме: современные представления и перспективы дальнейшего изучения (Обзор литературы) / Полякова А. П., Блинов М. Н., Каргин В. Д., Капустин С. И. // Российский биомедицинский журнал Medline.ru. -2011.-Т. 12.-С. 1250-1268.

2. Полякова А. П. Особенности полиморфизма генов регуляции сосудистого тонуса у больных с ранним дебютом венозного тромбоэмболизма/ А.П. Полякова, В.М. Шмелева, В.Е. Солдатенков, М.Н. Блинов, В.Д. Каргин, Л.П. Папаян, С.И. Капустин// Тромбоз, гемостаз и реология. - 2013. - Т. 54, №2. - С. 71-78.

3. Полякова А. П. Роль полиморфизма генов провоспалительных цитокинов в развитии венозного тромбоэмболизма у лиц молодого возраста / Полякова А.П., Шмелева В.М., Блинов М.Н, Солдатенков В.Е., Каргин В.Д., Папаян Л.П., Капустин С.И.// Медицинская иммунология. - 2014. - Т. 16, №2. — С. (55- 16Ц.

Публикации в прочих журналах

4. Шмелева В. М. Роль гипергомоцистеинемии в развитии тромбоэмболических осложнений / Шмелева В. М., Капустин С. И., Блинов М.

Н., Полякова А. П., Салтыкова Н. Б., Папаян JI. П. // Медицина экстремальных ситуаций. - 2012. - Т. 39, №1. - С. 106-117.

Материалы конференций

5. Полякова А. П. Особенности аллельного полиморфизма генов иммунного ответа у больных с венозным тромбозом. / А. П. Полякова, Н. Б. Салтыкова, В. Д. Каргин, Н. А. Воробьева, В. М. Шмелева, С. И. Капустин // материалы V Всероссийской Конференции «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии» (с международным участием), г. Москва. -

2011.-С. 416-417.

6. Полякова А.П. Полиморфизм -308 G/A в гене фактора некроза опухоли -альфа и риск венозного тромбоэмболизма у женщин / А. П. Полякова, Н. Б. Салтыкова, Ю. С. Дрижун, В. Д. Каргин, В. М. Шмелева, JI. П Папаян, М. Н. Блинов, С. И. Капустин // Вестник гематологии. - 2011. - Т. VII, №2. - С.61-62.

7. Polyakova A. Proinflammatory cytokines gene polymorphism and susceptibility to venous thromboembolism in the population of the North-Western region of Russia / Polyakova A., Drizhun Y., Blinov M., Saltykova N., Shmeleva V., Kapustin S. // J.Thromb. Haemost. - 2011. - Vol. 9, suppl. 2. - abstr P-TU-243.

8. Капустин С. И. Полиморфизм Ser219Gly эндотелиального рецептора протеина С и предрасположенность к венозному тромбозу / Капустин С. И., Полякова А. П., Шмелева В. М., Дрижун Ю. С., Салтыкова Н. Б., Каргин В. Д., Блинов М. Н., Папаян Л. П.// Беломорский симпозиум IV. Сборник докладов и тезисов, г. Архангельск — 2011. — С. 20-21.

9. Полякова А. П. Полиморфизм гена АроЕ как возможный фактор риска рецидивирующего течения венозного тромбоза / Полякова А. П., Солдатенков

B. Е., Шмелева В. М., Каргин В. Д., Капустин С. И. // Ангиология и сосудистая хирургия, 2012. (23-я (XXVII) Международная конференция «Актуальные вопросы сосудистой хирургии», 29 июня - 1 июля 2012г, г. Санкт-Петербург). -

2012. - Т. 18, № 2 (приложение).

10. Полякова А. П. Особенности аллельного полиморфизма генов ренин-ангиотензиновой системы у больных с венозным тромбозом / Полякова А. П., Кустова Е. В. // Материалы XV Юбилейной всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей (с международным участием) "Фундаментальная наука и клиническая медицина — человек и его здоровье", Санкт-Петербург. -2012. - С.230-231.

11. Полякова А. П. Полиморфизм гена параоксоназы и риск венозного тромбоэмболизма / Полякова А. П., Дрижун Ю. С., Кустова Е. В., Шмелева В. М., Каргин В. Д., Блинов М. Н., Капустин С. И. // Сборник тезисов II Российского конгресса с международным участием «Молекулярные основы клинической медицины — возможное и реальное», Санкт-Петербург. - 2012. —

C. 178-179.

12. Полякова А. П. Особенности аллельного полиморфизма С1418Т гена тромбомодулина у больных с венозным тромбозом / Полякова А. П., Дрижун

Ю. С., Салтыкова Н. Б., Кобилянская В. А., Капустин С. И. // Вестник гематологии. - 2012. - Т. VIII, № 4. - С. 63-63.

13. Полякова А. П. Полиморфизм -786Т/С гена эндотелиальной синтазы оксида азота как фактор риска рецидивирующего течения венозного тромбоза/ Полякова А. П., Салтыкова Н. Б., Дрижун Ю. С., Кустова Е. В., Шмелева В. М., Блинов М. Н., Каргин В. Д., Капустин С. И. // Гематология и трансфузиология. -2012.-Т. 57, №3,-С. 72.

14. Полякова А. П. Роль генов регуляции сосудистого тонуса в патогенезе венозного тромбоза у носителей мутаций в генах факторов II и V молодого возраста / Полякова А. П., Шмелева В. М., Блинов М. Н., Каргин В. Д., Папаян JI. П., Капустин С. И. // Материалы 6 Всероссийской конференции «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии» (с международным участием), г. Москва. - 2013. — С. 330-332.

15. Polyakova A.Vascular tone regulating genes polymorphism can modulate the risk of early-onset venous thromboembolism in individuals with inherited thrombophilia / Polyakova A., Shmeleva V. M., Soldatenkov V. E., Blinov M. N., Kargin V. D., Kapustin S. I. // J.Thromb. Haemost. - 2013. - Vol. 11, suppl. 2. -abstr PB 2.69-5.

16. Polyakova A. P. Polymorphism of vascular tone regulating genes and the risk of venous thromboembolism in individuals with inherited thrombophilia / Polyakova A. P., Shmeleva V. M., Soldatenkov V. E., Blinov M. N., Kargin V. D., Kapustin S. I. // Hematologica. Abstract book. - 2013. - Vol. 98, suppl. 1. - abstr EHA18ABSSUB-3888.

17. Капустин С. И. Влияние полиморфизма генов регуляции сосудистого тонуса на риск венозного тромбоэмболизма у лиц молодого возраста / Капустин С. И., Полякова А. П., Дрижун Ю. С., Морозова Т. В., Каргин В. Д., Папаян JI. П. // Вестник гематологии. - 2013. - Т. IX, №4. - С. 20.

18. Кобилянская В. А. Частота встречаемости антифосфолипидных антител волчаночного типа у пациентов молодого возраста с тромбозом глубоких вен и тромбоэмболией легочной артерии / Кобилянская В. А., Полякова А. П., Морозова Т. В., Капустин С. И. // Вестник гематологии. - 2013. - Т. IX, №4. -С. 23-24.

19. Полякова А. П. Особенности аллельного полиморфизма генов провоспалительных цитокинов у лиц с ранним дебютом венозного тромбоэмболизма / Полякова А. П., Шмелева В. М., Сидорова Ж. Ю., Каргин В. Д., Капустин С. И. // Вестник гематологии. - 2013. - Т. IX, №4. - С. 26-27.

20. Капустин С. И. Полиморфизм гена каталазы и риск развития венозных тромбозов у жителей северо-западного региона России / Капустин С. И., Полякова А. П., Алексанян JI. Р., Кустова Е. В., Рыбакова JI. П., Блинов М. Н., Солдатенков В. Е., Салтыкова Н. Б., Каргин В. Д. // Материалы Международной научно-практической конференции «Свободные радикалы и антиоксиданты в химии, биологии и медицине», г. Новосибирск. - 2013. - С. 115-116.

21. Полякова А. П. Полиморфизм генов противовоспалительных цитокинов и риск развития тромбоэмболии легочной артерии у лиц молодого возраста//

Полякова А. П., Шмелева В. М., Морозова Т. В., Каргин В. Д., Папаян Л. П., Капустин С. И Тезисы Всероссийской конференции «Противоречия современной кардиологии. Спорные и нерешенные вопросы» г. Самара. - 2013. -С. 95

Подписано в печать 14.03.14 Формат 60х84'/16 Цифровая Печ. л. 1.25 Тираж 100_Заказ 08/03_печать_

Типография «Фалкон Принт» (197101, г. Санкт-Петербург, ул. Большая Пушкарская, д. 54, офис 2)

 
 

Текст научной работы по медицине, диссертация 2014 года, Полякова, Анастасия Павловна

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии Федерального

медико-биологического агентства»

04^1 45751 7 на пРавахрукописи

Полякова Анастасия Павловна

ОСОБЕННОСТИ АЛЛЕЛЬНОГО ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОВ, АССОЦИИРОВАННЫХ С ЭНДОТЕЛИАЛЬНОЙ ДИСФУНКЦИЕЙ, У БОЛЬНЫХ С РАННИМ ДЕБЮТОМ

ВЕНОЗНОГО ТРОМБОЗА

14.01.21 - гематология и переливание крови

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители:

Капустин Сергей Игоревич, доктор биологических наук Шмелева Вероника Михайловна, доктор медицинских наук

Санкт-Петербург

2014г.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ...........................................4

ВВЕДЕНИЕ...................................................................................................................8

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.................................................................................15

1.1. Современные представления об этиопатогенезе венозного тромбоза..............15

1.2. Эндотелиальная дисфункция и ее роль в патогенезе тромбозов.....................16

1.2.1. Методы оценки функциональной активности эндотелия...................................17

1.2.2. Возможные механизмы развития эндотелиальной дисфункции...........................19

1.2.3. Гипергомоцистеинемия и полиморфизм генов обмена метионина и фолатов.......19

1.2.4. Оксидативный стресс......................................................................................20

1.2.4.1. Дисбаланс оксидантной и антиоксидантной систем.........................................20

1.2.4.2. Нарушение липидного обмена и полиморфизм генов регуляции липидного обмена. 22

1.2.5. Нарушение регуляции процессов вазоконстрикции и вазодшатации....................26

1.2.6. Гиперактивация локального иммунного ответа.................................................30

1.2.7. Снижение тромборезистентности эндотелия сосудистой стенки....................33

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.............................................39

2.1. Характеристика обследованных групп...................... ......................................39

2.2. Материал исследования.............................. ...................................................41

2.3. Методы исследования................................ .....................................................42

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ................................................................48

3.1. Распределение аллелей и генотипов генов, ассоциированных с эндотелиальной дисфункцией, у больных с венозным тромбозом........................................................48

3.2. Анализ "ген-генных взаимодействий" в группе больных с венозным тромбозом

.......................................................................................................................50

3.3. Особенности полиморфизма генов, ассоциированных с эндотелиальной дисфункцией, у пациентов с различными клиническими проявлениями венозного

тромбоза.....................................................................................................................57

3.3.1. Распределение аллелей и генотипов у пациентов с изолированным ТГВНК.. ...59

3.3.2. Распределение аллелей и генотипов в группе пациентов с ТГВНК, осложненным

ТЭЛА .......................................................................................................................60

3.3.3. Распределение аллелей и генотипов у пациентов с "изолированной " ТЭЛА.....61

3.4. Распределение аллелей и генотипов изучаемых генов у пациентов с рецидивирующим течением венозного тромбоза........................................................64

3.5. Распределение аллелей и генотипов изучаемых генов у пациентов с ВТ, осложнившимся развитием посттромботической болезни..........................................67

3.6. Оценка функционального состояния эндотелия у больных с венозным тромбозом..................................................................................................................72

3.7. Анализ взаимосвязи аллельного полиморфизма изученных генов и

биохимических маркеров эндотелиальной дисфункции.............................................81

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ...................................................................88

ВЫВОДЫ..................................................................................................................105

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ........................................................................106

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...........................................................................................107

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

АПФ Ангиотензин-превращающий фермент

АТII Ангиотензин II

АФА Антифосфолипидные антитела

ВТ Венозный тромбоз

ГГц Гипергомоцистеинемия

Гц Гомоцистеин

* иТГВНК Изолированный тромбоз глубоких вен нижних конечностей

иТЭЛА Изолированная тромбоэмболия легочной артерии

КГ Контрольная группа

ЛПНП Липопротеиды низкой плотности

ЛПОНП Липопротеиды очень низкой плотности

МДА Малоновый диальдегид

НАДН" Восстановленная форма никотинамиддинуклеотида

НАДО . Никотинамиддинуклеотид фосфат

НТ Наследственная тромбофилия

ПАГ Полиакриламидный гель

ПТБ Посттромботическая болезнь

ПЦР Полимеразная цепная реакция

ПЦР-ПДРФ Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов ПЦР

РАС Ренин-ангиотензиновая система

ТГ Триглицериды

тгвнк Тромбоз глубоких вен нижних конечностей

ТЭЛА Тромбоэмболия легочной артерии

Хс Холестерин

чв 5 Частота встречаемости

эд Эндотелиальная дисфункция

ЭДТА Этилендиаминтетрауксусная кислота

АСЕ Ген ангиотензин-превращающего фермента

Ag vWF • Антиген Фактора Виллебранда

AGT Ген ангиотензиногена

AGTR Рецептор ангиотензина II

AGTR1 Ген рецептора ангиотензина II 1 -го типа

APC Активированный протеин С

apo E Аполипопротеин Е

ApoE Ген аполипопротеина Е

CI Доверительный интервал

eNOS Эндотелиальная синтаза оксида азота

EPCR Эндотелиальный рецептор протеина С

FII Фактор II (Протромбин)

FV Фактор V

FV Leiden Мутация в гене фактора V Leiden

FVa Активированная форма фактора V

GSH Глутатион

GSSG Глутатион дисульфид

н2о2- Пероксид-анион

HOC1 Гипохлорная кислота

ICAM-1 (sICAM) Внутриклеточная молекула адгезии 1

IL-lß Интерлейкин-1 бета

IL-4 Интерлейкин-4

1Ь-6 Интерлейкин-6

1Ь-8 Интерлейкин-8

1Ь-13 Интерлейкин-13

¡N08 Индуцибельная синтаза оксида азота

Ш Килодальтон

ММР Матриксная металлопротеиназа

МТНРЯ Метилентетрагидрофолат редуктаза

ИРкВ Ядерный фактор каппа-В

пШБ Ядерная синтаза оксида азота

N0 Оксид азота

02- Супероксид-анион

ОН" Гидрокси-анион

ОШО" Пероксинитрит

оя Отношение шансов

РАМ Ингибитор активатора плазминогена 1 -го типа

Р0Ы1 Ген парооксоназы 1-го типа

РС Протеин С

РАЯ-1 Протеазой активируемый рецептор 1

бЕРСЯ Растворимая форма рецептора протеина С

Додецилсульфат натрия

бТМ Растворимая форма тромбомодулина

ТР Тканевой фактор

ТЫБа Фактор некроза опухоли альфа

ТМ Тромбомодулин

1-РА Тканевой активатор плазминогена

УСАМ-1 (эУСАМ) Сосудистая клеточная молекула адгезии 1 Фактор Виллебранда

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования

Тромбоэмболические заболевания являются ведущей причиной смертности и инвалидизации населения в России, странах Европы и США [14; 15; 60; 86; 87]. Частота возникновения венозного 'тромбоза (ВТ) и тромбоэмболических осложнений в общей популяции составляет 1-2 случая на тысячу населения ежегодно [88; 133; 192]. Важной чертой ВТ является многофакторный характер его этиопатогенеза [117]. В последние годы убедительно доказано, что наряду с классическими факторами риска (травмы, операции, беременность и пр.) [43; 88; 98; 105; -107; 116; 144; 149; 199] значительную роль в увеличении вероятности возникновения данной патологии играет генетическая предрасположенность [7; 39; 70; 163].

В настоящее время все большее число авторов уделяют внимание функциональному состоянию эндотелия и его роли в патогенезе различных заболеваний, сопровождающихся поражением сосудистого русла (атеросклероз, артериальная гипертензия, сахарный диабет, артериальные тромбозы) [49; 54; 169] Согласно классическим представлениям, поражение сосудистой стенки является обязательным звеном патогенеза тромбоза в артериальном русле, тогда как значение этого важнейшего компонента триады Вирхова для развития ВТ долгое время оставалось под вопросом. Однако результаты проведенных в последние годы ретро- и проспективных исследований свидетельствуют о наличии общих патогенетических механизмов при артериальном и венозном тромбозе, главным из которых признается «эндотелиальная дисфункция» (ЭД) [100; 129]. Термином «эндотелиальная дисфункция» обозначают нарушение целостности и/или функциональных свойств сосудистого эндотелия, сопровождающееся вазоконстрикцией и усиленной выработкой веществ, обладающих провоспалительными и протромботическими свойствами [65].

Молекулярные механизмы развития ЭД весьма разнообразны, что объясняется наличием значительного числа факторов, осуществляющих

регуляцию физиологической активности эндотелия. К числу возможных причин развития ЭД относятся: снижение концентрации оксида азота (N0), гипергомоцистеинемия (ГГц), оксидативный стресс, нарушение регуляции процессов вазоконстрикции и вазодилатации вследствие дисбаланса ренин-ангиотензиновой системы (РАС), нарушения липидного обмена, активизация локального иммунного ответа, сопровождающаяся продукцией провоспалительных цитокинов и белков острой фазы воспаления. Многофакторный генез ЭД отражается наличием значительного числа биохимических маркеров, используемых для подтверждения данного состояния, -снижение продукции N0 и активности его эндотелиальной синтазы (еЖ)8), повышение концентрации в плазме крови растворимого тромбомодулина (бТМ), ангиотензина II (АТ II), ингибитора активатора плазминогена (РА1-1), фактора Виллебранда (у\\Ф) и многие другие [12].

Степень разработанности темы. Несмотря на значительное число работ, посвященных изучению роли аллельных вариантов генов, кодирующих компоненты иммунной [138], ренин-ангиотензиновой [72], антиоксидантной [111; 182; 183] и других систем организма, в патогенезе артериального тромбоза, данные об их распространенности и ассоциации с маркерами ЭД при венозном тромбозе практически отсутствуют.

В связи с этим, а также учитывая большое клиническое и социальное значение проблемы тромбоэмболических заболеваний, является актуальным установление особенностей аллельного полиморфизма генов, ассоциированных с ЭД, в группе больных с ВТ.

Цель исследования

Установить роль аллельного полиморфизма генов, ассоциированных с эндотелиальной дисфункцией, в патогенезе венозного тромбоза у лиц молодого возраста.

Задачи исследования

1. Провести сравнительный анализ частот встречаемости аллелей и генотипов ряда генов, ассоциированных с ЭД, в группе больных молодого возраста с ВТ и у здоровых лиц, проживающих в Северо-Западном регионе Российской Федерации.

2. Провести анализ "ген-генных взаимодействий" в группе больных с ранним дебютом ВТ и установить особенности аллельного полиморфизма изучаемых генов у пациентов с классическими формами наследственной тромбофилии (НТ).

3. Выявить особенности распределения аллелей и генотипов изучаемых генов, характерные для пациентов с различными клиническими проявлениями ВТ.

4. Изучить особенности аллельного полиморфизма генов, ассоциированных с ЭД, в группе больных с ВТ в зависимости от тяжести течения заболевания.

5. На основании анализа ряда биохимических маркеров ЭД оценить функциональное состояние сосудистой стенки у больных с ВТ, а также фенотипическое проявление полиморфизма изучаемых генов.

Научная новизна

Впервые определены частоты встречаемости аллельных вариантов ряда генов (TNF-a, IL-lß, IL-6, PONI, TM, EPCR), ассоциированных с ЭД, и их сочетаний у больных ВТ и в группе здоровых лиц Северо-Западного региона России. Выявлено статистически значимое увеличение доли лиц с вариантом Ins/Ins гена АСЕ и снижение частоты встречаемости (ЧВ) аллеля ТМ 1418Т и генотипа 1418(Т/Т) гена ТМ в группе пациентов с ранним дебютом ВТ.

Проведен комплексный анализ и выявлена взаимосвязь между аллельным полиморфизмом генов, участвующих в регуляции функциональной активности эндотелия, и рядом биохимических маркеров ЭД (тромбомодулин, ангиотензин II, фактор Виллебранда, гомоцистеин, холестерин) в группе больных с ВТ.

Установлено, что эндотелиальная дисфункция является одним из важных патогенетических механизмов развития тромботического процесса в венозном русле и выявляется у 71,4% больных с ранним дебютом ВТ.

Показано, что основными предпосылками развития ЭД при венозном тромбозе являются аллельный полиморфизм генов, участвующих в регуляции функциональной активности эндотелия, и оксидативный стресс на фоне гипергомоцистеинемии и/или дислипидемии. Носителями "неблагоприятных" генотипов, ассоциированных с ЭД являются 99,5% пациентов с ВТ. При этом, в 62,8% случаев обнаруживается одновременное присутствие 3 и более таких генотипов.

Теоретическая и практическая значимость

Получены новые данные, которые способствуют расширению знаний о патогенезе ЭД у больных с венозным тромбозом и определению информативного комплекса методов молекулярной диагностики дисфункции эндотелия у этих пациентов с целью выявления группы риска развития тромбоэмболических осложнений и посттромботической болезни (ПТБ), а также разработки индивидуализированного подхода к лечению.

Молекулярно-генетическое обследование пациентов с ранним дебютом ВТ имеет практическое значение для составления индивидуального профиля риска и определения прогноза течения заболевания. Для стратификации риска развития тромбоэмболических осложнений у больных с ТГВНК целесообразно исследование аллельного полиморфизма генов IL-ip, IL-6 и TNF-a. Для определения риска развития ПТБ рекомендуется молекулярно-генетическое тестирование «инсерционно-делеционного» диморфизма гена АСЕ, а рецидива ВТ - анализ полиморфизма генов АСЕ (Ins/Del) и IL-lf3 (-31Т/С).

Методология и методы исследования

В работе были использованы общенаучные (анализ данных, синтез) и частные научные методы (клинические, лабораторные, статистические).

На первом этапе исследования были определены ЧВ вариантов генов, ассоциированных с ЭД, у больных с ВТ и в группе контроля и проанализирована взаимосвязь между особенностями распределения генотипов отдельных генов и риском развития ВТ. Далее для выявления наиболее тромбоопасных сочетаний вариантов различных генов был проведен анализ "ген-генных взаимодействий" в группе пациентов с ВТ, результаты которого были сопоставлены с аналогичными данными в здоровой популяции.

Возможность использования молекулярно-генетических характеристик пациента для прогнозирования течения ВТ была оценена на основании сравнительного анализа особенностей полиморфизма изученных генов в различных клинических подгруппах больных. Кроме того, в группе больных с ВТ была выполнена оценка функционального состояния эндотелия сосудистой стенки путем исследования ряда биохимических показателей, являющихся маркерами ЭД, и проведен анализ их взаимосвязи с полиморфизмом изучаемых генов. Анализ ассоциативных связей выполнялся по единому плану.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Аллельный полиморфизм генов, ассоциированных с ЭД играет значимую роль в патогенезе ВТ у лиц молодого возраста, в том числе, являющихся носителями мутаций в гене фактора V (Gl 691 А, FV Leiden) и гене протромбина (G20210A).

2. Молекулярно-генетические механизмы развития ЭД у больных с ВТ носят гетерогенный характер и оказывают влияние, как на риск возникновения тромбоза, так и на особенности его клинического течения.

3. Генетически обусловленная склонность к повышенной продукции провоспалительных цитокинов ассоциирована с риском развития тромбоэмболических осложнений у больных с ТГВНК.

4. Для группы пациентов с рецидивирующим течением ВТ и/или развившейся посттромботической болезнью характерно значимое увеличение частоты встречаемости генотипа Ins/Ins гена АСЕ.

Степень достоверности и апробация результатов диссертации

Достоверность и обоснованность результатов работы обеспечена комплексным анализом аллельного полиморфизма изучаемых генов, функционального состояния венозного эндотелия и анамнестических данных 207 больных с ВТ с использованием современных методов молекулярно-генетического, биохимического и иммуноферментного анализа, медицинской документации (истории болезни, выписные эпикризы, заключения о проведенных функциональных исследованиях), адекватных методов статистической обработки полученных данных. Апробация результатов диссертационной работы была выполнена 19 декабря 2013 года на межлабораторном заседании в Российском научно-исследовательском институте гематологии и трансфузиологии ФМБА. Положения диссертационной работы были представлены на Всероссийских научно-практических конференциях: «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии» (Москва, 2011, 2013 гг.), «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии» (Санкт-Петербург, 2011, 2012 гг.), «Беломорский симпозиум» (Архангельск, 2011 г.), «Актуальные вопросы сосудистой хирургии» (Санкт-Петербург, 2012 г.), «Фундаментальная наука и клиническая медицина - человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2012г.), «Молекулярные основы клинической медицины - возможное и реальное» (Санкт-Петербург, 2012 г.), «Патология гемостаза - общеклиническая проблема» (Санкт-Петербург, 2013 г.), «Противоречия современной кар�