Автореферат и диссертация по медицине (14.01.21) на тему:Оптимизация технологических и организационных принципов создания общественного регистра пуповинной крови

ДИССЕРТАЦИЯ
Оптимизация технологических и организационных принципов создания общественного регистра пуповинной крови - диссертация, тема по медицине
АВТОРЕФЕРАТ
Оптимизация технологических и организационных принципов создания общественного регистра пуповинной крови - тема автореферата по медицине
Иволгин, Дмитрий Александрович Санкт-Петербург 2013 г.
Ученая степень
кандидата медицинских наук
ВАК РФ
14.01.21
 
 

Автореферат диссертации по медицине на тему Оптимизация технологических и организационных принципов создания общественного регистра пуповинной крови

На правах рукописи

005061492

иволгин

Дмитрий Александрович

ОПТИМИЗАЦИЯ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ И ОРГАНИЗАЦИОННЫХ ПРИНЦИПОВ СОЗДАНИЯ ОБЩЕСТВЕННОГО РЕГИСТРА ПУПОВИННОЙ КРОВИ

14.01.21 — гематология и переливание крови 14.02.03 - общественное здоровье и здравоохранение

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

13 ИЮН 2013

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2013

005061492

Работа выполнена в ФГБУ «Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии Федерального медико-биологического агентства»

Научный руководитель: Член-корреспондент РАМН, Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор

Евгений Алексеевич Селиванов

Заслуженный рационализатор РФ, доктор медицинских наук Александр Борисович Смолянинов

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Бубнова Людмила Николаевна, руководитель лаборатории иммуногематологии ФГБУ «Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии Федерального медико-биологического агентства»

доктор медицинских наук, профессор Орел Василий Иванович, заведующий кафедрой социальной педиатрии и организации здравоохранения ФП и ДПО ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Ведущая организация: Национальный медико-хирургический Центр им. Н.И.Пирогова Защита диссертации состоится «24» июня 2013_г. в_часов

на заседании диссертационного совета Д 208.074.01 при ФГБУ «Российский НИИ гематологии и трансфузиологии» ФМБА России по адресу: 191024, Санкт-Петербург; ул. 2-я Советская, д. 16.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института. Автореферат разослан «24» мая 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета ФГБУ «Российский НИИ гематологии и трансфузиологии» ФМБА России

доктор медицинских наук Т.В. Глазанова

Общая характеристика работы

Актуальность темы В настоящее время трансплантация гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) успешно применяется при лечении целого ряда заболеваний крови, как онкогематологических [А.Г. Румянцев, А.А. Масчан, 2003], так и неонкологических. Появляются сообщения об успешной трансплантации ГСК при заболеваниях других органов и систем [У. Liao et al., 2011, А.А. Новик, Р.А.Иванов, 2008].

Следует отметить преимущества получения и использования ГСК пуповинной крови (ГСК ПК) по сравнению с традиционно используемыми источниками- костным мозгом и периферической кровью:

1. Отсутствие воздействия на здоровье матери и ребенка (донора), простота процедуры забора ПК.

2. Возможность использования образцов ГСК ПК не полностью совместимых по HLA системе.

3. Значительно снижается риск передачи некоторых инфекций, передаваемых трансмиссивным путем.

4. Сокращение времени поиска необходимого HLA-типа трансплантата ПК.

5. Меньшая вероятность развития и тяжесть течения реакции «трансплантат-против-хозяина» [W. Arcese et al., 1998].

По данным Всемирной организации допоров костного мозга (BMDW), количество находящихся на хранении для общественного использования образцов ПК составляет 564 тысячи, а по данным Eurocord, на 2011 г. в мире выполнено более 8.500 трансплантаций ГСК ПК.

В России, по сообщению Российского межрегионального регистра трансплантации ГСК, в период с 2000 по 2006 г. было выполнено 272 аллогенные трансплантации ГСК или в среднем — около 20 на 10 млн. человек. Принимая во внимание, что потребность в аллогенных трансплантациях ГСК в России и европейских странах приблизительно одинакова, следует констатировать, что в России данный вид лечения применяется лишь каждому 30-му пациенту от всех нуждающихся.

Одним из основных недостатков использования ПК для трансплантации является ограниченное количество ГСК в образце [S. S. Grevval et al., 2003]. Так как исход трансплантации зависит, в том числе, и от количества трансплантируемых клеток, то существует необходимость максимального увеличения содержания клеток в трансплантируемом образце. Проводимые в банке ПК (БПК) мероприятия по повышению

эффективности выделения ядро содержащих клеток и их криоконсервирования являются важными мероприятиями по улучшению исходов трансплантации ГСК ПК.

Сейчас в практике банков пуповишюй крови (БПК) используются два способа выделения фракции ГСК ПК: центрифугирование с добавлением седиментирующих веществ [P. Rubinstein et al., 1995] и сепарация с использованием полуавтоматических и автоматических систем [P. Solves et al., 2009]. Опубликованные на сегодняшний день результаты исследований эффективности различных способов обработки ПК, в том числе и сравнительных, не дают однозначного ответа о преимуществе того или другого метода [V. Lapierre et al., 2007]. В связи с этим актуальной является задача выбора оптимального метода обработки ПК в зависимости от исходных показателей образца ПК. Кроме того, недостаточно изучены изменения характеристик выделенной из ПК ядросодержащей фракции (количество и жизнеспособность ГСК) после длительного крнохранения. В этой связи также актуальной представляется задача выбора оптимального метода не только для обработки, но и для размораживания и подготовки образца ПК к трансплантации.

В настоящее время в России единственным документом, регламентирующим деятельность банков пуповиннои крови (БПК) является Приказ МЗ РФ от 25 июля 2003 г. N 325 "О развитии клеточных технологий в Российской Федерации". Поскольку единого стандарта деятельности банков пуповиннои крови в России нет, то для создания хранилища образцов ПК с высоким содержанием ГСК каждый банк разрабатывает собственные алгоритмы и организационно-технологическое обеспечение, ориентируясь, в основном, на зарубежный опыт. Для обеспечения надлежащего качества хранилища необходима стандартизация всех процессов, происходящих в БПК по обработке, тестированию, криохранению и выдаче образцов ПК.

Учитывая нынешнее состояние данного вопроса, сравнительное исследование влияния двух использующихся на практике методов выделения ядросодержащей фракции из ПК на количество и жизнеспособность клеток, а также изменение этих показателей в процессе криоконсервирования представляется актуальным, направленным на разработку единого алгоритма деятельности банка пуповшшой крови.

Цель исследования Оптимизация технологических и организационных принципов выделения фракции лейкоцитов из пуповиннои крови и их подготовки к трансплантации.

Задачи исследования

1. Провести сравнительную оценку эффективности выделения фракции лейкоцитов пуповинной крови на клеточном сепараторе Sepax S100 (Biosafe) и при помощи метода двойного центрифугирования с 6% раствором гидроксиэтилкрахмала.

2. Провести сравнительную оценку эффективности криоконсервации фракции лейкоцитов пуповинной крови, выделенной на клеточном сепараторе 8срах 8100 (ВюзаГе) и методом двойного центрифугирования.

3. Провести сравнительную контролируемую оценку эффективности отмывания фракции лейкоцитов пуповинной крови от криопротектора при помощи клеточного сепаратора верах 8100 (ВюзаГе, Швейцария) н методом центрифугирования.

4. Научно обосновать организационно-технологические подходы к формированию общественного хранилища пуповинной крови.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Выделение фракции лейкоцитов пуповинной кровн на клеточном сепараторе верах в-100 (ВюваГе, Швейцария) в сравнении с методом двойного центрифугирования, позволяет получать большее количество лейкоцитов и обеспечивает лучшую их сохранность при криохранении.

2. Отмывание фракции лейкоцитов пуповинной крови от криопротектора при помощи клеточного сепаратора верах в-100 (ВюзаГе, Швейцария) по сравнению с методом центрифугирования, минимизирует потерю лейкоцитов.

3. Сохранность важных для трансплантации характеристик фракции лейкоцитов пуповинной крови, выделенной и подготовленной к трансплантации после криохранения с использованием клеточного сепаратора верах в-100 (ВккаГе, Швейцария) позволяет рекомендовать его использование как оптимальную технологию для общественных хранилищ пуповинной крови.

4. Разработанные оптимальные алгоритмы выделения, криоконсервации и подготовки к трансплантации лейкоцитов пуповинной крови позволяют увеличить трансплантационную дозу гемопоэтических стволовых клеток.

Научная новизна Впервые проведены репрезентативные сравнительные исследования важных для трансплантации характеристик фракции лейкоцитов пуповинной крови до замораживания и криоконсервированных, выделенных на сепараторе верах 8100 (ВшваГе) или методом двойного центрифугирования. Установлено, что по ряду показателей (выход ОЯК, жизнеспособность) метод автоматической сепарации эффективнее метода двойного центрифугирования. Кроме того, образцы клеточного концентрата, полученного автоматическим способом, лучше переносят условия длительного криохранения. Проведено сравнительное контролируемое изучение эффективности отмывания фракции лейкоцитов пуповинной крови от криопротектора на клеточном сепараторе верах 8100 (ВюяаГе,

Швейцария) и с помощью центрифугирования. Выявлено, что использование автоматического метода отмывания ведет к наименьшим потерям ядросодержащих клеток.

По результатам исследований научно обоснованы организационно-технологические принципы формирования общественного хранилища пуповинной крови.

Практическая значимость работы Получены данные о важных для трансплантации характеристиках фракции лейкоцитов пуповинной крови, выделенной и подготовленной к трансплантации после криохранення с использованием клеточного сепаратора Sepax SI00 (Biosafe) и прн помощи метода двойного центрифугирования с 6% раствором гидроксиэтилкрахмала. Сравнительный анализ результатов исследования, позволяет рекомендовать использование клеточного сепаратора Sepax SI00 (Biosafe) для выделения лейкоцитов пуповинной крови и их отмывания от криопротектора, как оптимальную технологию для общественных хранилищ пуповинной крови. На основании сделанных выводов разработаны организационно-технологические принципы формирования общественного хранилища пуповинной крови, создающие основу для широкого применения клеточных технологий в медицине.

Внедрение в практику Результаты исследований внедрены и используются в научной, педагогической и лабораторной работе в Покровском банке стволовых клеток, НИЛ клеточных технологий СЗГМУ им. И.И. Мечникова.

Апробация работы._Материалы диссертации доложены на IV Симпозиуме, посвященном памяти P.M. Горбачевой «Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток» (Санкт-Петербург, 2010); на 2 Всемирном конгрессе по пуповинной крови (Марсель, 2010), на международном Симпозиуме «Общественный регистр доноров пуповинной крови. Использование стволовых клеток пуповинной крови при гематологических и негамотологических заболеваниях» (Санкт-Петербург, 2011), на Международной научно-практической конференции «Регенеративная терапия и клеточные технологии. Нано- и биотехнологии в современной медицине» (Санкт-Петербург, 2012).

Личное участие автора в получении результатов Автором с участием сотрудников лаборатории выделения и крнохранения стволовых клеток проведена работа по обработке, замораживанию всех образцов (личный вклад- 75%). Автором разработаны и предложены параметры оценки методик обработки ПК и её подготовки к трансплантации, метод криоконсервирования. Проведена статистическая обработка результатов исследований

Публикации По материалам диссертации опубликовано 39 печатных работ, из них 6 в научно-практических журналах, рекомендованных ВАК, получено 2 патента на изобретение по теме диссертационного исследования.

Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 146 страницах машинописи и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, двух глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и приложений. Список литературы содержит 340 источников, из которых 18 отечественных и 322 зарубежных. Диссертация иллюстрирована 25 таблицами и 20 рисунками.

Содержание работы Материалы и методы исследования Основу работы составил: ретроспективный количественный и качественный анализ образцов ПК (п = 2809), собранных в родовспомогающих учреждениях Санкт-Петербурга в период с 2009 по 2012 гг. обработанных и помещенных на длительное криохранение в рамках создания общественного хранилища ПК.

В зависимости от способа выделения стволовых клеток, образцы пуповинной крови были распределены на две группы:

I группа (п=1797) - метод двойного центрифугирования.

II группа (п=1012) - автоматическая сепарация с помощью системы «Sepax S100» («Biosafe», Швейцария).

Для криоконсервирования клеточного концентрата пуповинной крови использовалось замораживание в программируемом замораживателе Сгуо 560-16 (Planer, Великобритания) по специально разработанной программе. В качестве криопротектора использовался ДМСО/Декстран 40 (Pall, Великобритания) в конечной дозировке 10%.

Также, для оценки совместного влияния на качественные показатели хранящихся образцов клеточного концентрата методов обработки и подготовки к трансплантации был произведен количественный и качественный анализ размороженных образцов ПК (п = 85) из групп I и II. После криохранения в жидком азоте (срок хранения - 7,18±3,9 мес.) образцы каждой группы (п=55 и п=30, соответственно), были разморожены и подготовлены к трансплантации 3 различными способами

Группа «А» образцы ПК были разморожены и подготовлены к пересадке по методу Нью-Йоркского Центра крови — отмывание от криопротектора методом центрифугирования, Группа «В» образцы ПК были подготовлены к трансплантации путем отмывания криопротектора на автоматическом сепараторе «Sepax S100» («Biosafe», Швейцария) Группа «С» образцы ПК размораживались без отмывания от крипротектора Исследования образцов ПК осуществлялись по следующим показателям: до начата обработки — определение общего количества ядросодержащих клеток (ОЯК) при помощи гематологического анализатора Coulter АсТ diff 2 (Beckman Coulter, США)

после обработки и перед замораживанием — определение ОЯК и гематокрита при помощи гематологического анализатора, количество CD34+ клеток (на единицу объема и абсолютное) и жизнеспособность клеток - на проточном цитофлуориметре FC500 (Beckman Coulter. США) с программным обеспечением СХР с длиной волны лазерного излучения 488 нм, и набором реагентов Stem-Kit (Beckman Coulter, США)

после размораживания определяли ОЯК, количество CD34+ клеток (на единицу объема и абсолютное) и жизнеспособность клеток.

Кроме того, нами рассчитывались следующие показатели:

• выход ОЯК после обработки - в % от ОЯК до обработки,

• выход ОЯК, CD34+ клеток и жизнеспособности после размораживания - в % от ОЯК, количества CD34+ и жизнеспособности клеток после обработки.

Статистистические методы Статистическая обработка данных осуществлялась по параметрическим (нормальное распределение) и по непараметрическим (ненормальное распределение) статистическим методикам. Для определения нормальности распределения переменных проводился тест Колмогорова-Смирнова. Статистический анализ проводился с использованием t-критерия Стъюдента, с использованием U-критерия Манна-Уитни, значение р<0,05 было принято как статистически значимое. Также проводился корреляционный анализ данных с использованием пакета прикладных программ Microsoft Office Excel 2003 для Windows 2003 версия 1.0, SPSS для Windows 2007 версия 19. Для анализа влияния нескольких факторов на показатели в исследуемых группах использовался многофакторный непараметрический дисперсионный анализ с помощью программы PERMANOVA. Для оценки влияния на показатели каждого фактора в отдельности использовались методы анализа подобий ANOSIM. Также для оценки вклада каждого показателя сравниваемых групп в суммарное различие между выборками использовался пермутационный анализ подобий SIMPER с использованием программы PRIMER.

Результаты и обсуждение Исходные показатели клеточного концентрата пуповинной крови, обработанной методами двойного центрифугирования и автоматической сепарации Исходные данные образцов пуповинной крови, которые затем были обработаны методами двойного центрифугирования и автоматической сепарации, представлены в таблице 1. Кроме того, значения t-критерия, рассчитанные для объема ПК, количества ЯК/мл и ОЯК в образце ПК, позволяют говорить о том, что обе группы достоверно не различаются (0,66; 1,54 и 1,89, соответственно, р < 0.05).

Таблица 1

Исходные данные образцов пуповинной кропи в группах, обработанных с применением _^_ различных методов (Mini) _ _

№ Метод обработки ПК Объем Объем ЯК, хЮ" ОЯК, х10ь

Гр- образца, мл клеточного концентрата, мл клеток/мл клеток

1 Метод двойного центрифугирования (п= 1797) 111,82±0,82 22,22±0,07 11,42±0,08 1286,46±13,37

II Автомати чес кая

сепарация аппаратом Берах Б100 (п= 1012) 110,89±0,17 20,5±0,03 11,14±0,16 1235,84±23,16

[-критерий (р < 0,05) 0,66 1,54 1,89

Влияние метода выделения клеточного концентрата нз пуповиннон крови на качественные показатели клеточного концентрата перед криоконсервнрованнем

Результаты, полученные после обработки ПК с использованием метода двойного центрифугирования и автоматической системы «Верах 5100», представлены в таблице 2.

Таблица 2

Показатели пуповиннон крови, обработанной с использованием метода двойного центрифугирования н автоматической системы «Sepax S¡00», (медиана и размах)

№ Гр. Метод обработки ПК ЯК, х 10й кл/мл ОЯК, х106кл Выход ЯК от исходного количества (%) CD34+ хЮ6 кл/мл ОК CD34+, х106кл Жизнеспо собность (%) Гемато крит

I Двойное центрифуги рование(п= 1797) 39,2** 860,0* 73,04** 0,09 ** 1,95 98,6** 41,7

2,5293,1 50,02000,0 47,3-98,2 0,0020,31 0,05-6,65 96,6-100,0 7,3065,8

II Автоматиче екая сепарация аппаратом Sepax SI00 (n= 1012) 43,35** 905,33* 81,88** 0,11** 2,1 99,23** 30,9

12,595,0 247,11950,0 65,1-97,6 0,0050,375 0,09-7,5 96,6-100,0 12,656,4

Примечание: * - различия достоверны при сравнении группы I и группы II (р<0,05)

**- различия достоверны при сравнении группы I и группы II (р<0,001) В таблице 2 показано, что медиана значений ряда показателей в группе II (автоматическая сепарация) превышает значения в группе I (метод двойного центрифугирования). При сравнении обеих групп с использованием критерия Манна-Уитни

было выявлено достоверное различие для показателя «ОЯК» (р< 0,05), и для остальных показателей (р < 0,001). Для показателя «ОК С034+ клеток» превышение медианы значений в группе автоматической сепарации было статистически недостоверным. Полученные данные позволяют говорить о том, что на этапе выделения фракции ЯК из ПК метод автоматической сепарации 5ерах 8100 эффективнее метода двойного центрифугирования.

Исходные показатели размороженных образцов клеточного концентрата В таблице 3. приведены показатели 85 размороженных образцов лейкоцитарного концентрата ПК. При сравнении показателей образцов ПК из двух групп обработки пуповинной кроки видно, что, за исключением показателя «жизнеспособность», остальные показатели статистически не различаются.

Таблица 3

Показатели клеточного концентрата пуповинной крови при размораживании, (медиана

и размах)

№ Гр Метод обработки ПК ЯК, хЮ6 клеток/мл ОЯК, х 10" клеток Выход ЯК от исходного количества (%) С034+ х10б клеток/мл ОК С034+, хЮ6 клеток Жизнеспос обность (%)

1 Двойное центрифуги рование (п=55) 44,3 1045,21 78,16 0,13 2,7 98,0*

(21,2886,54) (474,0121859,58) (64,694,99) (0,028-0,39) (0,628,04) (91,0-99,76)

II Автоматиче екая сепарация аппаратом верах Б100 (п=30) 51,72 1034,3 80,82 0,145 3,0 99,35*

(18,1101,06) (361,762126,52) (72,991,28) (0,001-0,35) (0,0756,52) (95,1-99,88)

и-критерий Манна-Уитни 806,0 696,0 636,0 758,0 774,0 477,0

Р (двухстор.) 0,861 0,236 0,082 0,538 0,639 0,001

Примечание: *- различия достоверны при сравнении группы I и группы II (р=0,001)

Результаты при размораживании образцов ПК и подготовки к трансплантации различными методами При сравнении показателей образцов ПК из групп, фракция ЯК ПК в которых выделялась различными методами, без учета способа размораживания были получены данные, представленные в табл.4. Из этих данных видно, что без учета способа отмывания от криопротектора, показатели группы II — медиана выхода ЯК и С034+ клеток, достоверно превышают показатели группы I, схожие результаты были получены при сравнении качественных показателей размороженных и подготовленных к трансплантации различными методами образцов клеточного концентрата ПК (таблицы 5, 6, 7).

Показатели лейкоцитарного концентрата пуповніїїіоґі крови при размораживании без

учета способа отмывания от криопротектора, (медиана и размах)

Гр. Метод ЯК, ОКЖ, Выход СР34+ ОК Выход Жизнесп

обработки х106 х106 ЯК от х10б CD34+, CD34+ особност

ПК клеток/ клеток да, (%) клеток/мл хЮ6 клеток ь, (%)

мл клеток

I Двойное 37,8 858,0 82,1* 0,1 2,25 85,27* 82,7*

центрифу

гирование (14,32- (406,2- (63,77- (67,4- (55,6-

(п=55) 70,5) 1531) 91,32) (0,2- 0,32) (0,58- 7,6) 98,7) 98,82)

II Автомати

ческая 38,5 977,5 91,7* 0,115 2,27 91,34* 89,3*

сепарация (13,7- (343,25- (81,9- (0,001- (71,7- (78,7-

(п=30) 78,2) 1919,6) 99,6) 0,26) (0,02- 5,7) 110,9) 98,47)

Р <0,001 0,018 <0,001

Примечание: * - различия достоверны при сравнении группы I и группы II (р<0,001)

Таким образом, если не учитывать способ отмывания от криопротектора, метод автоматической сепарации также эффективнее метода двойного центрифугирования:

Таблица 5

Опенка показателей лейкоцитарного концентрата пуповинной крови при размораживании и отмывке методом центрифугирования, (меднана н размах)

№ Метод ЯК,х10" ОЯК, Выход CD34+ ОК Выход Жизнеспо

Гр. обработки клеток/м хЮ6 ЯК от хЮ6 CD34+, CD34+ собность,

ПК л клеток ДЗ, (%) клеток/м хЮ6 клеток (%)

л клеток

I Двойное

центрифуг 29,35 718,0 77,8* 0,095 2.21 86.26 81,1*

ирование (16,3- (335,4- (74,2- (67,7- (66,27-

(п=10) 44,7) 1102,2) 80,7) (0,06- 0,3) (1,4- 7,45) 98,0) 91,9)

II Автоматнч

еская 31,2 717,6 91,14* 0,12 2,34 89,59 90,0*

сепарация (16,6- (334,8- (83,1- (0,001- (0,02- (82,9- (85,1-

(п=11) 67,6) 1089,1) 100,5) 0,27) 7,81) 99,6) 95,93)

Примечание: * - различия достоверны при сравнении группы I и группы II (р-0,05)

Оценка показателен лейкоцитарного концентрата пуиовинной крови при размораживании и отмывке на аппарате автоматической сепарации верах 8100, __ _(медиана и размах) ___

№ Гр. Метод обработки ПК ЯК, хЮ" клеток/м л ояк, хЮ6 клеток Выход ЯК от ДЗ, (%) С034+ х10й клеток/мл ОК С034+, х10б клеток Выход СП34+ клеток Жизнеспо собность, (%)

I Двойное центрифуг ирование (п=9) 30,6 699,0 77,5* 0,106 2,8 88,3 88,91

(23,353,6) (612,01173,2) (74,481,2) (0,070,14) (1,4-3,2) (84,790,5) (85,289,1)

II Автоматич еская сепарация (п=5) 38,8 970,0 90,97* 0,11 2,2 90,9 86,4

(24,064,1) (600,01282,3) (88,696,6) (0,0010,13) (0,18- 2,7) (71,996,8) (78,596,96)

Примечание: * - различия достоверны при сравнении группы I и группы II (р=0,05)

Таблица 7

Оценка показателей лейкоцитарного концентрата пуповиннои крови при размораживании без отмывания от криопротекгора, (медиана и размах)

№ ГР. Метод обработки ПК ЯК, хЮ'' клеток/м л ОЯК, хЮ6 клеток Выход ЯК от ДЗ (%) С034+ хЮ6 клеток/мл ОК С034+, хЮ6 клеток Выход СЭ34+ клеток Жизнеспо собность, (%)

I Двойное центрифуг ирование (п=40) 41,35 909,0 85,2* 0,11 2,3 84,9 80,66*

(13,673,7) (408,51527,4) (66,291,5) (0,0140,32) (0,4-6,3) (65,898,7) (55,0798,82)

II Автоматич еская сепарация (п=10) 45,9 1022,0 93,8* 0,13 2,97 95,3 89,54*

(14,675,3) (365,01850,5) (88,595,4) (0,040,29) (0,8- 5,3) (63,3113,1) (87,592,0)

Примечание: * - различия достоверны при сравнении группы I и группы II (р=0,05)

Медиана выхода ядросодержащих клеток в группе II достоверно превышала таковую в группе I при размораживании и отмывке клеточного концентрата всеми способами. Вероятно, это связано с тем, что клеточный концентрат, полученный в результате автоматической сепарации, лучше переносит условия замораживания и длительного криохранения. При отмывании размороженных образцов клеточного концентрата от криопротекгора методом центрифугирования, а также при размораживании без отмывания медиана жизнеспособности в группе II также достоверно превышала таковую в группе I. Это может быть связано с тем, что метод отмывания при помощи центрифуги, связанный с большим количеством манипуляций, является для клеток более травматичным по сравнению с отмыванием при помощи клеточного сепаратора или с методом размораживания без отмывания. Однако так как жизнеспособность в исходных данных групп сравнения достоверно различалась (см. таб. 3), то учитывать эти данные при сравнении групп нельзя.

В целом, полученные данные об изменении показателей клеточного концентрата, размороженного и подготовленного к трансплантации различными способами, свидетельствуют о преимуществе выделения клеточного концентрата из пуповинной крови автоматическим способом по сравнению с центрифугированием.

Сравнительная оценка и анализ полученных результатов Для оценки влияния способа подготовки размороженных образцов к трансплантации на конечные показатели клеточного концентрата, мы сравнили показатели концентратов ЯК ПК, размороженных различными способами (таблица 8), не принимая во внимание метод выделения лейкоцитарного концентрата. По полученным результатам можно сделать вывод о том, что концентрация ЯК ПК в миллилитре и общее количество ЯК в группе С (размораживание без отмывания от криопротектора) достоверно превышает таковые в группе А (отмывание методом центрифугирования), что, при недостоверном превышении показателя выхода ЯК, может свидетельствовать о более высоком качестве образца ІІК, подготовленного к трансплантации методом размораживания без отмывания от криопротектора.

Таблица 8

Показатели лейкоцитарного концентрата пуповинной крови при размораживании и отмывании от криопротектора различными методами без учета способа выделения __клеточного концентрата из ПК, (медиана и размах)__

Г Метод ЯК.хЮ1' ОЯК, Выход СЭ34+ ок Выход Жизнеспо Выход

р- отмывани клеток/м хЮ6 ЯК от хЮ6 С034+, С034+ собность жизнеспо

я от л клеток Д3,(%) клеток/м хЮ6 клеток (%) собности

криопроте л клеток (%)

ктора

Л Центрифу 29,9* 717,6 83,8 0,1 2,25 89,2 86,43 87,57

в (п=21) (13,546,8) (326,91528,1) (64,9101,0) (0,0010,3) (0,038,3) (77,5101,8) (67,4795,93) (75,898,83)

При помощи 38,5 872,0 88,6 0,11 2,2 90,1 88,41 * 89,6

с Берах БІОО (п=14) Без (23,373,5) (6001469,0) (67,497,7) (0- 0,14) (0,022,9) (72,998,1) (75,296,96) (76,0797,35)

отмывани я (п=50) 42,1* 955,5 86,9 0,11 2,4 87,8 83,75* 86,88

(14,175,1) (403,91703,25) (72,195,2) (0,020.3) (0,526,6) (64,6107,2) (56,198,82) (65,0101,8)

Р 0,013 0,041 0,042

Примечание: * - различия достоверны при сравнении групп А, В и С (р<0,05) Кроме того, жизнеспособность клеток в группе В (отмывание автоматическим методом) достоверно превышает жизнеспособность в группе С, но так как это различие могло быть обусловлено достоверным различием данного показателя в исходных данных, то говорить о явном преимуществе одного способа размораживания клеточного концентрата над другим в данном случае нельзя.

Все полученные на этом этапе данные не позволяют однозначно ответить на вопрос, что же влияет на показатели размороженного клеточного концентрата - метод обработки или метод отмывания от криопротектора. Кроме того, неясна целостная картина взаимодействия различных методов выделения клеточного концентрата из пуповинной крови, способов подготовки к трансплантации и их влияние на показатели размороженного клеточного концентрата. Для ответа на эти вопросы на втором этапе все полученные данные были проанализированы с использованием анализа подобий ANOSIM, который позволяет оценить влияние отдельных факторов, то есть в данном случае способа обработки и способа размораживания, на показатели размороженного концентрата. В результате данного анализа было определено, что показатели размороженных образцов в группах 1 и II значимо различаются (Global R = 0.107, количество перестановок- 999. р=0,012). С помощью пермутационного анализа подобий «SIMPER» оценивался «вклад» каждого показателя сравниваемых групп в суммарное различие. Было показано, что наибольший вклад в различия исследуемых групп внесли следующие показатели: выход CD34+ (24,3%), жизнеспособность (17,82%) и выход ядросодержащих клеток (15.97%), причем медианы этих показателей в группе 11 достоверно превышали таковые в группе 1 ( р=0,018, р<0,001, р<0,001, соответственно) (Рис. la, lb, 1с.).

■5. "Г

1

Ь)

Прстоиол

С)

Рис. 1 Диаграммы типа «box-plot» зависимости показателей от метода выделения ядросодержащих клеток пуповинной крови по а) выходу общего количества CD34+ клеток, Ь) жизнеспособности клеток, с) по общему количеству ядроеодержащих клеток

Также мы провели анализ ANOS1M для трех различных способов подготовки лейкоконцентрата ПК к трансплантации: отмывание с помощью центрифугирования, отмывание с помощью автоматической системы "Sepax S-100'" и размораживание без отмывания. Показатели размороженных образцов ПК достоверно не различались (Global R = 0,037. количество перестановок- 999. р = 0,249). Таким образом, можно сделать вывод о том, что метод выделения лейкоцитарного концентрата ПК в отличие от метода размораживания, влияет на показатели размороженного образца.

Однако, метод ANOSTM позволяет оценить влияние этих двух факторов (метод обработки, метод размораживания) лишь независимо друг от друга. Для того, чтобы оценить взаимодействие процессов выделения ЯК ПК, процессов размораживания и подготовки образцов 1IK для трансплантации и их влияние на качественные показатели концентрата после его размораживания. использовался многофакторный непараметрический дисперсионный анализ (PERMANOVA). Результаты анализа представлены в таблице 9.

Таблица 9

Результаты иермутационного дисперсионного анализа (РКК\1Л\ОУЛ) данных по

влиянию методов выделения и размораживания на качественные показатели __концентрата после его размораживания___

Источник Степень свободы Сумма квадратов Средний квадрат F-критерий Р (perm) Р(МС)

Метод выделения 1 13.6371 13,6371 2,5101 0.043 0.073

Метод размораживания 7,2885 3,6442 0,6708 0.679 0.664

Метод выделения и метод размораживания 2 27,8335 13.9167 2.5616 0.019 0.027

Всего: 29 179.1488

Примечание: жирным шрифтом выделены значения р<0,05.

Полученные данные позволяют говорить о достоверном влиянии на параметры образца клеточного концентрата ПК после размораживания не только фактора «протокол обработки», но также о совместном влиянии на показатели клеточного концентрата факторов «протокол обработки» и «протокол размораживания».

После проведения предыдущего анализа было определено, что фактор «размораживание» самостоятельно не влияет на показатели в исследуемых группах, поэтому для ответа на вопрос о причине совместного влияния факторов «протокол обработки» и «протокол размораживания» было проведено исследование PERMANOVA - pairwise comparison (парное сравнение) в подгруппах по методу размораживания исследуемых групп (таблица 10).

Таблица 10

Результаты пермутацноиного дисперсионного анализа подгрупп в группе I (двойное

центрифугирование)

Группы t Pperm PMC

А, В 0,565 0.904 0.727

А, С 1.397 0.118 0.166

В, С 1.9616 0.049 0.042

В группе 1 достоверные отличия наблюдались между подгруппами В и С (размораживание и автоматическая отмывание от криопротектора и размораживание без отмывания).Для этих групп нами также был проведен анализ SIMPER для того, чтобы определить, какие именно параметры в данных подгруппах различаются сильнее всего. Наибольший вклад в суммарные различия внесли следующие параметры: выход ЯК (18,42%), выход CD34+ клеток (18,02%), жизнеспособность (15,87%), причем медианы показателей в подгруппе В превышали показатели в подгруппе С. В группе II методы размораживания не отличались (таблица 11).

Таблица 11

Результаты пермутационного дисперсионного анализа подгрупп в группе II

(автоматическая сепарация)

Группы t Pperm PMC

А, В 1.0885 0.479 0.326

А, С 1.3446 0.105 0.17

в, С 1.1409 0.214 0.273

Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что при размораживании и подготовке к трансплантации клеточного концентрата, полученного с помощью автоматического клеточного сепаратора, можно использовать любой из традиционно

применяемых способов размораживания без ухудшения качественных показателей концентрата.

Совместное влияние факторов «метод выделения ядросодержащей фракции» и «метод размораживания клеточного концентрата» обеспечивается за счет различий в выходе ядросодержащих клеток, СШ4+ клеток и жизнеспособности в подгруппах В и С группы II.

В результате, динамика изменений основных показателей качества образцов ПК в процессе обработки и размораживания выглядит следующим образом (таблица 12):

Таблица 12

Динамика общего количество ядросодержащих клеток в лейкоконцснграте пуповинной крови до замораживания и после размораживания в зависимости от метода обработки,

х 106

Метод обработки ПК До обработки После обработки После размораживания Выход от исходного

Группа I. Метод двойного центрифугирования 1286,46 1045,21 858.0 66,7

Группа II. Автоматическая сепарация аппаратом Эерах в 100 1235,84 1034,3 977,5 79,1

Рис.2 Сравнительный анализ динамики изменения общего количества ядросодержащих клеток пуповинной крови при различных методах ее обработки.

При анализе динамики изменения общего количества ядросодержащих клеток ПК хорошо заметна эффективность метода автоматической сепарации (Группа II) по сравнению с методом двойного центрифугирования проявляющаяся в сохранении большего количества ЯК после размораживания (Рис.2).

Таким образом, проведенный сравнительный анализ методов обработки ПК для ее помещения в ОРДПК показал, что по основным показателям клеточного концентрата, определяемым после его размораживания, а именно, количеству ядросодержащих клеток.

количеству СБ 34+ клеток и жизнеспособности метод автоматической сепарации аппаратом 8ерах 8100 является эффективнее традиционно используемого метода двойного центрифугирования.

Организационно-технологические подходы к заготовке пуповшшой крови для общественного регистра пуповинной крови. Также в процессе исследования нами разрабатывался алгоритм деятельности банка пуповинной крови, позволяющий обрабатывать и помещать на длительное криохранение образцы клеточного концентрата, которые впоследствии могут использоваться для трансплантации с высокой эффективностью. В качестве критериев эффективности клинического применения образцов пуповинной крови нами использовались рекомендации Еигосогс! и С1ВМТЯ (Центр по международным исследованиям трансплантации крови и костного мозга): минимальная доза ядросодержащих клеток до замораживания- 2,5 х 107/кг массы тела пациента, после размораживания, минимум 2,0-2,5 х107/кг, минимальное количество С034+ клеток- 1,2-1,7 х 105/кг массы тела пациента.

Кроме того, в качестве показателя эффективности банка пуповинной крови принимался такое параметр, как доля находящихся в банке пуповинной крови образцов, которые по содержанию ЯК (исходя из рекомендаций Еигосогс!) могли бы быть трансплантированы пациентам с массой тела 50 килограммов.

Первым мероприятием по увеличению в хранилище количества образцов с высоким содержанием ядросодержащих и СБ34+ клеток стало определение критериев включения для образцов пуповинной крови, поступающих в БПК, таких, как объем образца и количество ядросодержащих клеток. Проводилось сравнение эффективности банка пуповинной крови при применении критерия включения для последующей обработки и хранения образца ПК ОЯК более 600 х 106и увеличении ОЯК до 1500 х 106. При подсчете доли образцов, пригодных для успешной трансплантации пациенту с массой тела > 50 кг (из расчета 2,5 х 107/кг массы тела пациента [Е. С1исктап й а1., 2004], в общем количестве хранящихся, выяснилось, что такая доля образцах ПК до изменения критерия включения- ОЯК составила 26,6%, а после изменения - 48,6% (Рис.3).

Таким образом, ужесточение критериев включения, и, в первую очередь, такого как общее количество ядросодержащих клеток, для поступающей в банк ПК можно считать одним из мероприятий по улучшению исходов трансплантации ПК. После принятия решения об обработке образца пуповинной крови необходимо определить способ выделения клеточного концентрата. В соответствие с полученными данными автоматическая сепарация эффективнее метода двойного центрифугирования, однако, при одновременном поступлении

большого количества образцов пуповииной крови выделение клеточного концентрата только с помощью автоматического сепаратора существенно увеличит время обработки.

■ С декабря □ До декабря

ю о

£ во

ю о

0

20 30 40 50 60 70 80 90 100 Масса тепа (кг)

Рис.3 Данные Покровского банка стволовых клеток за 2010 и 2011 г. по количеству образцов (%) в Общественном регистре доноров пуновинной крови, пригодных для трансплантации пациентам с различной массой тела

Для определения зависимости выхода ЯК от исходных показателей образцов ПК был

проведен корреляционный анализ. Так. было определено, что при обработке ПК с помощью автоматического сепаратора Яерах 8100 выход ЯК имел обратную корреляцию с исходным объемом ПК (г= -0,157, р=0,01) при слабой положительной корреляции с исходным объемом ПК при обработке методом двойного центрифугирования (г = 0, 086, р=(),01) (Рис. 4а, 4Ь).

Выход ЯК Сепакс

Выход ЯКДвойкое центрифугирование

а) Ъ)

Рис. 4 Зависимость выхода ЯК от исходного объема ПК при выделении клеточного концентрата а) методом автоматической сепарации, Ь) методом двойного центрифугирования

В соответствии с полученными данными нами был предложен следующий алгоритм обработки ПК (Рис. 5.).:

Примечаиия: ^^ма^- наиболее предпочтительно

-----* наименее предпочтительно

Рис 5. Примерные алгоритмы полного цикла обработки пуиовинной крови и её подготовки к транплантации

На основании данного алгоритма для обеспечения качества образцов пуповинной крови, помещаемой на длительное хранение, была проведена формализация повседневной деятельности банка пуповинной крови по заготовке пуповинной крови для использования лечебными учреждениями. Для этого на основе отечественных (Приказ МЗСР РФ от 25 июля 2003 г. N 325 "О развитии клеточных технологий в Российской Федерации") и зарубежных Рекомендаций нами были разработаны инструкции по всем этапам деятельности банка пуповинной крови, стандартные операционные процедуры и протоколы (Прил. 1-11). Это, наряду с предложенным нами алгоритмом, позволит в дальнейшем организовать повседневную деятельность банка пуповинной крови, направленную на заготовку образцов пуповинной крови с высоким содержанием ядросодержащих и С034+ клеток.

Выводы

1. Выделение лейкоцитов пуповинной крови на клеточном сепараторе верах в-100 (ВюзаГс, Швейцария) в сравнении с методом двойного центрифугирования, более эффективно и обеспечивает лучшую сохранность лейкоцитов при криохранении так как позволяет получить большее количество ядросодержащих клеток после выделения и после размораживания и обеспечивает больший выход ядросодержащих и СБ 34+ клеток от исходных данных.

2. Применение метода автоматического отмывания размороженной фракции лейкоцитов пуповинной крови от криопротектора с помощью клеточного сепаратора 8 ер ах 8-100 (ВюзаГе, Швейцария) более эффективно по сравнению с методом центрифугирования, так как позволяет получить образец пуповинной крови с наименьшей потерей лейкоцитов.

3. Применение клеточного сепаратора верах 8-100 (ВюяаГе. Швейцария) при выделении фракции ядросодержащих клеток из пуповинной крови и при подготовке размороженного клеточного концентрата к трансплантации обеспечивает наименьшие потери ядросодержащих и СО 34+ клеток по сравнению с методом центрифугирования и может считаться оптимальным для банков пуповинной крови для аллогенного применения.

4. Разработанные оптимальные методические и организационные принципы формирования общественного регистра пуповинной крови позволяют повысить эффективность работы банка стволовых клеток пуповинной крови.

Практические рекомендации

1. Рекомендуется использование автоматической системы клеточной сепарации верах 8100 (Вюза1ё, Швейцария) для выделения лейкоцитарной фракции пуповинной крови и для её отмывания от криопротектора.

2. Рекомендуется применение организационных и методических принципов формирования общественного регистра пуповинной крови разработанных на основе использования автоматической системы клеточной сепарации верах 8-100 (БюваГе. Швейцария).

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи:

1. Смолянинов, А.Б. Современные проблемы криоконсервации биоматериала-стволовых клеток пуповинной крови и клеток репродуктивной системы / А.Б. Смолянинов, Д.А. IIволшп // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. -2010. - Т. V, № 3. -С.116-119.

2. Новикова, П.Ю. Длина теломер хромосом в клетках пуповинной крови как дополнительный критерий качества образца для трансплантации / О.В.Супильникова,

С.Ю.Новикова, А.С. Хрупина, Н.В.Смирнова, В.М.Михельсон, О.Г.Хурцилава, А.Б.Смолянинов, Д.А. Иволгин // Цитология. -2010. - Т. 52, № 12. -С.1045-1048.

3. Иволгин, Д.А. Размораживание и отмывка стволовых клеток пуповинной крови-спорные моменты и собственный опыт / Д.А. Иволгин, Е.А. Селиванов, А.Б.Смолянинов, К.В. Коровина, А.С. Хрупина // www.medline.ru. - 2011.- Т. 12

4. Смолягошов, А.Б. Современная стратегия регенеративной терапии и безопасность применения аллогенных стволовых клеток пуповинной крови при нейродегенеративных заболеваниях / А.Б. Смолянинов, О.Г. Хурцилава, В.В. Тыренко, А.В. Новицкий, Д.А. Иволгин // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. - 2011.- Т. VI, № 4. - С. 14-20.

5. Иволгин, Д.А. Современные способы криоконсервации стволовых клеток пуповинной крови для общественного регистра доноров / Д.А. Иволгин, А.Б. Смолянинов, Ш.М.Багаутдинов, К.В. Коровина, К.В. Шунькина, А.В.Смирнова // Вестник МАХ. - 2012,- № 1,- С.36-39.

6. Иволгин, Д.А. Выделение и подготовка стволовых клеток пуповинной крови к трансплантации / Д.А. Иволгин. А.Б. Смолянинов, О.Г. Хурцилава, Е.А. Селиванов, К.В. Коровина, А.С. Хрупина // Вестник СЗГМУ им. И.И.Мечникова.- 2012.- Том 4, №2,- С.7-15.

Тезисы:

1. Ivolgin, D. Effectiveness of hematopoietic progenitor cell separation with the help of the Sepax SI00 cell separator / D. Ivolgin, A. Smolyaninov, S. Adylov, E.Kotelevskaya // Cellular Therapy and Transplantation. - 2009. - Vol.2, № 5. - P. 111.

2. Иволгин, Д.А. Высокотехнологичное выделение гемопоэтических стволовых клеток с помощью клеточного сепаратора Sepax S100 / Д.А. Иволгин, А.Б. Смолянинов, Ш.Ф. Адылов, А.Л. Иванов, А.А. Айзенштадт // Донозология-2009. Проблемы здорового образа жизни. - СПб., 2009. - С.386.

3. Смолянинов, А.Б. Покровский банк стволовых клеток и регистр доноров пуповинной крови в Северо-Западном регионе РФ / А.Б. Смолянинов, Б.В. Афанасьев, Д.А. Иволгин, И.И. Масленикова, Е.А. Котелевская, О.В.Супильникова, Ш.Ф. Адылов // Научно-практическая конференции, посвященная 150-летию СПБ ГУЗ «Городская Покровская больница». — СПб., 2009. — С.28-29.

4. Иволгин, Д.А. Обработка и криоконсервирование пуповинной крови / Д.А. Иволгин, А.Б. Смолянинов, К.В. Коровина, Ю.Ф. Бакараева, И.Н. Цымбалюк // Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии. IV Всероссийский симпозиум с международным участием. — СПб., 2010. - С.66-67.

5. Ivolgin, D. Processing and cryopreservation of 708 units of human umbilical cord blood / D. Ivolgin, A. Smolyaninov, K. Korovina, E. Kotelevskaya, O. Supilnicova // The 1-st International Congress on Controver-sies in cryopreservation of stem cell, reproductive cells, tissue & organs. - Valencia, Spain. - 2010. - № 45. - P.A12.

6. Иволгин, Д.А. Особенности криоконсервации стволовых клеток пуповинной крови для трансплантации / Д.А. Иволгин, К.В. Коровина, И.Н. Цымбалюк, Ю.Ф. Бакараева, А.Б. Смолянинов // Материалы V Всероссийского съезда трансплантологов. Вестник трансплантологии и искусственных органов,- 2010.- Том XII.- С. 62-63.

7. Иволгин, Д.А. Использование автоматической системы Sepax S100 для выделения гемопоэтических стволовых клеток из пуповинной крови для последующей трансплантации / Д.А. Иволгин, Е.А. Селиванов, А.Б. Смолянинов, Ш.Ф. Адылов // Материалы V Всероссийского съезда трансплантологов. Вестник трансплантологии и искусственных органов,- 2010.- Том XII.- С. 285-286.

8. Ivolgin, D. Umbilical cord blood processing: quality evolution in course of inclusion criteria optimization /D. Ivolgin, K. Korovina, K. Shunkina, A. Smolyaninov // Cellular Therapy and Transplantation. 5th Raisa Gorbacheva Memorial Meeting on Hematopoietic Stem Cell Transplantation. - 2011. - Vol. 3, No. 12. - № 83.

9. Ivolgin, D. Does the cord blood processing method affect the cord blood unit quality after thawing: improving cord blood banking procedures / D. Ivolgin, K. Korovina, K. Shunkina, A. Smolyaninov, A. Khrupina // World Cord Blood Congress III.- Rome, Italy.- 2011.-Р.166,- A.33.

10. Хурцилава, О.Г. Организация работы общественного регистра доноров пуповшшой крови и инновационные подходы для улучшения исходов трансплантации гематопоэтических стволовых клеток в педиатрии / О.Г. Хурцилава, А.Б. Смолянинов, Ф.П. Ромашок, Ш.Ф. Адылов, О.В. Тюмина, Д.А. Пволгин, Н.Д. Саймурадова// Современные проблемы педиатрии: материалы конференции / Под ред.Ф.П. Ромашока, И.Ю. Мельниковой. - СПб.: Астерион, 2011. - С. 3-24.

11. Пволгин, Д.А. Обработка пуповшшой крови- эволюция качества в процессе оптимизации критериев включения / Д.А. Иволгин, К.В. Коровина, С.А. Смирнова, К.В. Шунькина, Ш.Ф. Адылов, А.Б. Смолянинов // Донозология-2011. Здоровый образ жизни и вредные для здоровья факторы. Материалы седьмой международной научной конференции- СПб., 2011. - С. 281.

12. Пволгин, Д.А. Оценка качества обработки пуповинной крови после размораживания / Д.А. Иволгин, К.В. Коровина, A.B. Смирнова, И.Н. Цымбалюк, A.C. Хрупииа, А.Б. Смолянинов // Донозология-2011. Здоровый образ жизни и вредные для здоровья факторы. Материалы седьмой международной научной конференции- СПб., 2011. - С. 282.

13. Пволгин, Д.А. Метод подготовки образца пуповинной крови к трансплантации / Ш.М.Багаутдинов, А.Б. Смолянинов, Д.А. Иволгин, А.В.Смирнова // Усовершенствование способов и аппаратуры, применяемых в учебном процессе, медико-биологических исследованиях и клинической практике. Сборник изобретений и рационализаторских предложений / Воен.-мед. акад.- СПб., 2012.- Выпуск 43.- С. 21-22.

14. Пволгин, Д.А. Метод обработки пуповинной крови и качество образца после размораживания / Ш.М.Багаутдинов, А.Б. Смолянинов, Д.А. Иволгин, A.B. Смирнова. К.В. Коровина // Усовершенствование способов и аппаратуры, применяемых в учебном процессе, медико-биологических исследованиях и клинической практике. Сборник изобретений и рационализаторских предложений / Воен.-мед. акад.- СПб., 2012,- Выпуск 43,- С. 84-85.

15. Пволгин, Д.А. Методики обработки пуповинной крови в процессе оптимизации критериев включения / Ш.М.Багаутдинов, А.Б. Смолянинов, Д.А. Иволгин, A.B. Смирнова, Цымбалюк И.Н. // Усовершенствование способов и аппаратуры, применяемых в учебном процессе, медико-биологических исследованиях и клинической практике. Сборник изобретений и рационализаторских предложений / Воен.-мед. акад.- СПб., 2012,- Выпуск 43,- С. 85-86.

Патенты:

1. Пат. №2412716 РФ, МПК si А316К 35/14 А61К 35/44 А61Р 35/00 C12N 15/08. Способ выделения из пуповинной крови лейкоцитарного концентрата, содержащего стволовые клетки / A.A. Анзенштадт, Е.Д. Котелевская, Ш.Ф. Адылов, A.A. Логачев, A.C. Хрупина, О.В. Супильникова, Д.А. Иволгии, А.Б. Смолянинов: ООО «Покровский банк стволовых клеток»,- 2009137166/15; заявл. 07.10.2009; опубл. 27.02.2011, Бюл. № 6,- 3 с.

2. Пат. № 2416197 РФ, МПК м A01N 1/02 А61К 35/14 А61К 35/44. Способ криоконсервации ГСК ПК / А.Б. Смолянинов, К.В. Коровина, Е.А. Котелевская, A.A. Айзенштадт, Ш.Ф. Адылов, Ю.Ф. Бакараева, Е.С. Мартынова, Д.А. Иволгии; ООО «Покровский банк стволовых клеток».- 2009146082/21; заявл. 11.12.2009; опубл. 20.04.2011, Бюл. № 11,-4 с.

Подписано в печать 15.05.2013г. Формат 60x84/16 П.л. 1,43 Уч.-изд.л 1,43. Тир. ЮОэкз. Отпечатано в типографии ООО «Турусел» 197376, Санкт-Петербург, ул. Профессора Попова д.38. toroussel@mail.ru Зак. № 13463 от 15.05.2013г.

 
 

Текст научной работы по медицине, диссертация 2013 года, Иволгин, Дмитрий Александрович

РОССИЙСКИЙ НИИ ГЕМАТОЛОГИИ И ТРАНСФУЗИОЛОГИИ ФМБА

РФ

На правах рукописи

04201360763

иволгин

ДМИТРИЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ

ОПТИМИЗАЦИЯ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ И ОРГАНИЗАЦИОННЫХ ПРИНЦИПОВ СОЗДАНИЯ ОБЩЕСТВЕННОГО РЕГИСТРА

ПУПОВИИНОЙ КРОВИ

14.01.21 - гематология и переливание крови 14.02.03 - общественное здоровье и здравоохранение

Диссертация

па соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Научные руководители:

член-корреспондент РАМН доктор медицинских наук профессор

Е.А.Селиванов

Заслуженный рационализатор РФ доктор медицинских наук А.Б. Смолянинов

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

ВВЕДЕНИЕ 6

ГЛАВА 1 СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ПРОБЛЕМЫ СБОРА, ХРАНЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ПУПОВИННОЙ КРОВИ (обзор литературы) 12

1.1 История использования пуповинной крови как источника стволовых клеток 12

1.2 Преимущества и недостатки пуповинной крови как источника гемопоэтических стволовых клеток 15

1.3 Пути решения проблемных аспектов применения пуповинной крови на уровне банка пуповинной крови 23

1.3.1 Увеличение количества клеток при сборе пуповинной крови 24

1.3.2 Увеличение количества трансплантируемых клеток после обработки и криоконсервирования 25 1.3.2.1 Выделение концентрата клеток 25

1.3.3 Криоконсервация и подготовка пуповинной крови к трансплантации 29

1.4 Организационные аспекты деятельности банка пуповинной

крови 31

ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 36

2.1 Материалы исследований 36

2.2 Обработка, криоконсервирование и размораживание пуповинной крови 45

2.2.1 Подготовка образца пуповинной крови для обработки

и закладки на хранение 45

2.2.2 Обработка пуповинной крови методом двойного центрифугирования 46

2.2.3 Выделение стволовых клеток пуповинной крови

с использованием автоматической системы «8ерах 8100» 48

2.2.4 Программное замораживание лейкоконцентрата образца пуповинной крови 51

2.2.5 Размораживание и отмывание лейкоконцентрата пуповинной крови от криопротектора различными способами 53

2.3 Лабораторные методы исследования 56

2.4 Статистические методы 60 ГЛАВА 3 ВЛИЯНИЕ МЕТОДА ВЫДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАТА ЯДРОСОДЕРЖАЩИХ КЛЕТОК ИЗ ПУПОВИННОЙ КРОВИ НА КАЧЕСТВЕННЫЕ ПОКАЗАТЕЛИ КЛЕТОЧНОГО КОНЦЕНТРАТА ПУПОВИННОЙ КРОВИ ПОСЛЕ РАЗМОРАЖИВАНИЯ 62

3.1 Исходные показатели клеточного концентрата пуповинной крови, обработанной методами двойного центрифугирования и автоматической сепарации 62

3.2 Влияние метода выделения клеточного концентрата из пуповинной крови на качественные показатели клеточного концентрата перед криоконсервированием 63

3.3 Исходные показатели размороженных образцов клеточного концентрата 64

3.3.1 Результаты измерения гематокрита 65

3.3.2 Результаты измерения количества КОЕ 66

3.3.3 Результаты при размораживании образцов ПК и подготовки к трансплантации различными методами 67

3.4 Сравнительная оценка и анализ полученных результатов 70 ГЛАВА 4 ОРГАНИЗАЦИОННО-МЕТОДИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ К ЗАГОТОВКЕ ПУПОВИННОЙ КРОВИ ДЛЯ ОБЩЕСТВЕННОГО ХРАНИЛИЩА ПУПОВИННОЙ КРОВИ 78 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 89 ВЫВОДЫ, ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 95 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 96 ПРИЛОЖЕНИЯ 128

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ

БЛВ - безлейкемическая выживаемость БСВ - бессобытийная выживаемость БПК - банк пуповинной крови БФЕ-Э - бурст формирующие единицы ВЭБ - вирус Эпштейн-Барр

Г-КСФ - гранулоцитарный колониестимулирующий фактор

ГМ-КСФ - гранулоцитарный макрофагальный колониестимулирующий фактор

ГПК - гемопоэтические прогениторные клетки

ГСК - гемопоэтические стволовые клетки

ГЭК - гидроксиэтилкрахмал

ДМСО - диметилсульфоксид

ДППIV - дипептидилпептидаза IV

ДТПК - двойная трансплантация пуповинной крови

ИДЛ - инфузия донорских лимфоцитов

ИЛ-3 - интерлейкин 3

КМ - костный мозг

КОЕ - колониеобразующие единицы

КОЕ-ГМ - колониеобразующие единицы- гранулоцитов, моноцитов КОЕ-ГЭММ колониеобразующие единицы гранулоцитов, эритроцитов, моноцитов, мегакариоцитов

МАРК - миелоаблативный режим кондиционирования

МГСК - мобилизованные гемопоэтические стволовые клетки

М-КСФ - макрофагальный колониестимулирующий фактор

МНК - мононуклеарные клетки

МСК — мезенхимальные стволовые клетки

НМАРК- немиелоаблативный режим кондиционирования

НК- нуклеиновая кислота

НТКМ - неродственная трансплантация костного мозга ОЛ - острый лейкоз

OJIJI - острый лимфоидный лейкоз

ОРДПК - общественный регистр доноров пуповинной крови ОР - относительный риск

ОЯК - общее количество ядросодержащих клеток оРТПХ - острая реакция трансплантат - против - хозяина ПерК - периферическая кровь ПК - пуповинная кровь

РКСИ - режим кондиционирования сниженной интенсивности

РТПЛ - реакция трансплантат - против - лейкоза

РТПХ - реакция трансплантат - против - хозяина

СК - стволовые клетки

СРД - совместимый родственный донор

СНРД - совместимый неродственный донор

СФ - стромальный фактор

TAC - трансплантат-ассоциированная смертность

ТГСК - трансплантация гемопоэтических стволовых клеток

ТКМ - трансплантация костного мозга

ТПК - трансплантация пуповинной крови

ТФР-pi - трансформирующий фактор роста-(31

ТЦ - трансплантационный центр

ТЭПА - тетраэтиленпентамин

ФИММ-1а - фактор ингибирования миграции макрофагов-1а хРТПХ - хроническая реакция трансплантат - против - хозяина ЦТЛ - цитотоксические лимфоциты ЦМВ - цитомегаловирус ЯК - ядросодержащие клетки

HLA - human leukocyte associated antigen - человеческий лейкоцитарный антиген

ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы

В настоящее время трансплантация гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) успешно применяется при лечении целого ряда заболеваний крови, как онкологических [12], так и неонкологических [74]. Появляются сообщения об успешной трансплантации ГСК при заболеваниях других органов и систем [8, 14,157,204,331] .

Следует отметить преимущества получения и использования ГСК пуповинной крови (ПК) по сравнению с традиционно используемыми источниками - костным мозгом и периферической кровью[10, 68]:

1. Отсутствие воздействия на здоровье матери и ребенка (донора), простота процедуры забора ПК.

2. Возможность использования образцов ГСК ПК не полностью совместимых по HLA системе.

3. В связи с возможностью заготовки большого количества образцов ПК увеличивается вероятность нахождения редких HLA-типов трансплантатов ПК [259, 260].

4. Значительно снижается риск передачи некоторых инфекций, передаваемых трансмиссивным путем.

5. Сокращение времени поиска необходимого HLA-типа трансплантата ПК.

6. Меньшая вероятность развития и тяжесть течения РТПХ [29, 317].

По данным Всемирной организации доноров костного мозга (BMDW),

количество находящихся на хранении для общественного использования образцов ПК составляет 554 тысячи [158], а по данным Eurocord, на 2011 г. в мире выполнено более 8.500 трансплантаций ГСК ПК [136].

В России, по сообщению Российского межрегионального регистра трансплантации ГСК, в период с 2000 по 2006 г. было выполнено 272 аллогенные трансплантации ГСК или в среднем - около 20 на 10 млн. человек [15]. Принимая во внимание, что потребность в аллогенных трансплантациях

ГСК в России и европейских странах приблизительно одинакова, следует констатировать, что в России данный вид лечения применяется лишь каждому 30-му пациенту от всех нуждающихся [И].

Одним из основных недостатков использования ПК для трансплантации является ограниченное количество ГСК в образце [130, 141]. Так как исход трансплантации зависит, в том числе, и от количества трансплантируемых клеток [134], то существует необходимость максимального увеличения содержания клеток в трансплантируемом образце. Проводимые в банке ПК мероприятия по повышению эффективности выделения ядросодержащих клеток и их криоконсервирования являются важными мероприятиями по улучшению исходов трансплантации ГСК ПК [47, 51].

Сейчас в практике БПК широко используются два основных способа выделения фракции ГСК ПК - центрифугирование с добавлением седиментирующих веществ [280], сепарация с использованием полуавтоматических [297] и автоматических систем [306]. Опубликованные на сегодняшний день результаты исследований эффективности различных способов обработки ПК, в том числе и сравнительных, не дают однозначного ответа о преимуществе того или другого метода [192, 296]. В связи с этим актуальной является задача выбора оптимального метода обработки ПК, в зависимости от исходных показателей образца ПК.

Кроме того, недостаточно изучены изменения характеристик выделенной из ПК ядросодержащей фракции (количество и жизнеспособность ГСК) после длительного криохранения [7]. В этой связи также актуальной представляется задача выбора оптимального метода не только для обработки, но и для размораживания и подготовки образца ПК к трансплантации.

В настоящее время в России единственным документом, регламентирующим деятельность банков пуповинной крови (БПК) является Приказ МЗ РФ от 25 июля 2003 г. N 325 "О развитии клеточных технологий в Российской Федерации". Поскольку единого стандарта деятельности банков пуповинной крови в России нет, то для создания хранилища образцов ПК с

высоким содержанием ГСК каждый банк разрабатывает собственные алгоритмы и организационно-технологическое обеспечение, ориентируясь, в основном, на зарубежный опыт [165]. Для обеспечения надлежащего качества хранилища необходима стандартизация всех процессов, происходящих в БПК по обработке, тестированию, криохранению и выдаче образцов ПК.

Учитывая нынешнее состояние данного вопроса, сравнительное исследование влияния двух использующихся на практике методов выделения ядросодержащей фракции из ПК на количество и жизнеспособность клеток, а также изменение этих показателей в процессе криоконсервирования представляется актуальным, направленным на улучшение организации обработки и хранения ПК.

Цели и задачи исследования

Целью исследования является оптимизация технологических и организационных принципов выделения фракции лейкоцитов из пуповинной крови и их подготовки к трансплантации.

Для достижения цели исследования были поставлены следующие задачи:

1. Провести сравнительную оценку эффективности выделения лейкоцитарной фракции пуповинной крови на клеточном сепараторе Берах 8100 (ВюзаГе) и при помощи метода двойного центрифугирования с 6% раствором гидроксиэтилкрахмала.

2. Исследовать влияние криоконсервации фракции лейкоцитов пуповинной крови, выделенной на клеточном сепараторе 8ерах Б100 (Вюза!^) и методом двойного центрифугирования на итоговые характеристики размороженного лейкоцитарного концентрата.

3. Провести сравнительную контролируемую оценку эффективности отмывания фракции лейкоцитов пуповинной крови от криопротектора при помощи клеточного сепаратора 8ерах 8100 (Вю8а1"е, Швейцария) и методом центрифугирования.

4. Научно обосновать организационно-технологические подходы к формированию общественного хранилища пуповинной крови.

Научная новизна

На большом фактическом материале проведены репрезентативные сравнительные исследования важных для трансплантации характеристик фракции лейкоцитов пуповинной крови, выделенной на сепараторе 8ерах 8100 (Biosafe) и методом двойного центрифугирования. Установлено, что по ряду показателей (выход ОЯК, жизнеспособность) метод автоматической сепарации эффективнее метода двойного центрифугирования.

Впервые проведены репрезентативные сравнительные исследования важных для трансплантации характеристик криоконсервированной фракции лейкоцитов пуповинной крови, выделенной на сепараторе 8ерах 8100 (Вюза£е) и методом двойного центрифугирования. Показано, что образцы клеточного концентрата, полученного автоматическим способом, лучше переносят условия длительного криохранения.

Впервые осуществлено сравнительное контролируемое изучение эффективности отмывания фракции лейкоцитов пуповинной крови от криопротектора с помощью клеточного сепаратора 8ерах 8100 (Biosafe, Швейцария) и методом центрифугирования. Выявлено, что использование автоматического метода отмывания ведет к наименьшим потерям ядросодержащих клеток.

Научно обоснованы организационно-технологические принципы формирования общественного хранилища пуповинной крови.

Практическая значимость работы

Сравнительный анализ динамики важных для трансплантации характеристик фракции лейкоцитов пуповинной крови, выделенной, криоконсервированной и подготовленной к трансплантации с использованием клеточного сепаратора 8ерах 8100 (ВюБаГе) и при помощи метода двойного

центрифугирования, позволяет рекомендовать использование клеточного сепаратора Берах Б100 (Вюза5е) как оптимальную технологию для общественных хранилищ пуповинной крови.

На основании полученных результатов разработаны организационно-технологические принципы формирования общественного хранилища пуповинной крови, создающие основу для широкого применения клеточных технологий в медицине.

Положения, выносимые на защиту

1. Выделение фракции лейкоцитов пуповинной крови на клеточном сепараторе 8ерах 8-100 (Biosafe, Швейцария) в сравнении с методом двойного центрифугирования, позволяет получать большее количество лейкоцитов и обеспечивает лучшую их сохранность при криохранении.

2. Отмывание фракции лейкоцитов пуповинной крови от криопротектора при помощи клеточного сепаратора 8ерах 8-100 (Biosafe, Швейцария) по сравнению с методом центрифугирования, минимизирует потерю лейкоцитов.

3. Сохранность важных для трансплантации характеристик фракции лейкоцитов пуповинной крови, выделенной, криоконсервированной и подготовленной к трансплантации с использованием клеточного сепаратора 8ерах 8-100 (ВюБа£е, Швейцария) позволяет рекомендовать его использование как оптимальную технологию для общественных хранилищ пуповинной крови.

4. Разработанные оптимальные алгоритмы выделения, криоконсервации и подготовки к трансплантации лейкоцитов пуповинной крови позволяют увеличить трансплантационную дозу гемопоэтических стволовых клеток.

Апробация и реализация результатов работы

Результаты исследования и основные положения работы доложены и обсуждены на IV Симпозиуме, посвященном памяти P.M. Горбачевой

«Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток» (Санкт-Петербург, 2010); на седьмой Международной конференции по биоинформатике регуляции генома и биологии систем (Новосибирск, 2010), на 2 Всемирном конгрессе по пуповинной крови (Марсель, 2010), на международном Симпозиуме «Общественный регистр доноров пуповинной крови. Использование стволовых клеток пуповинной крови при гематологических и негематологических заболеваниях» (Санкт-Петербург, 2011), на Международной научно-практической конференции «Регенеративная терапия и клеточные технологии. Нано- и биотехнологии в современной медицине» (Санкт-Петербург, 2012).

Результаты исследований внедрены и используются в научной, педагогической и лабораторной работе в Покровском банке стволовых клеток, НИЛ клеточных технологий СЗГМУ им. И.И. Мечникова.

По материалам диссертации опубликовано 39 печатных работ, получено 2 патента на изобретение по теме диссертационного исследования.

Объем и структура диссертации

Работа выполнена в Покровском банке стволовых клеток под руководством члена-корреспондента РАМН, доктора медицинских наук профессора Е.А. Селиванова и заслуженного рационализатора РФ, доктора медицинских наук, профессора А.Б. Смолянинова.

Диссертация изложена на 146 страницах машинописи и состоит из введения, четырех глав, заключения, выводов, практических рекомендаций и приложений. В работе использовано 18 отечественных и 322 иностранных источника. Диссертация содержит 25 таблиц и 20 рисунков.

ГЛАВА 1 СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ПРОБЛЕМЫ СБОРА, ХРАНЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ПУПОВИННОЙ КРОВИ

1Л История использования пуповинной крови как источника стволовых клеток

Считавшаяся когда-то биологическим отходом, пуповинная кровь относительно недавно была определена как источник гемопоэтических стволовых клеток для трансплантации. Первые исследования обеспечили начальную поддержку наличию гемопоэтических прогениторных клеток (ГПК) в ПК [29, 147, 177, 320]. В одном из этих исследований было сделано предположение о том, что ПК «может использоваться как источник гемопоэтических стволовых клеток для восстановления функции костного мозга у человека». 1177]. Проведенные впоследствии эксперименты установили, что определенные клетки ПК способны к мультилинейной гемопоэтической дифференцировке [201, 239]. В результате более крупных клинических исследований, подтвердивших in vitro функциональность после криоконсервирования, было показано, что количество прогениторных клеток во фракции низкой плотности (<1.077 г/мл) после выделения на Фиколле попадает в величины, достаточные для успешного приживления клеток в костном мозге [63]. Как подтверждение этого, в октябре 1988 состоялась первая трансплантация ПК [126, 135]| После этого пе�