Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Окисление и фосфорилирование в митохондриях миокарда и скелетных мышц белых и серых крыс при холодовых воздействиях

министерство; здравоохранения армянской сср

ереванский ордена трудового красного- знамени государственный икдлцйнский институт

На правах рукоряс*

ПРЕОБРШИСКАЯ-Валентина Ковстанпвогаа

УДК 577.121.7:57.052:616-001.18

ОКИСЛЕНИЕ И ФОСФОРШСНРОВАНИЕ В МИТОХОНДРИЯХ МИОКАРДА И СКЕЯЕТЕЫХ МЫШЦ КВЛНХ И СЕРЫХ КРУС ОРЯ

хододовах воздействиях

14.00.15 - Йатодопгасхая фхзхояогхя

Автореферат диссврташя на соасхавх» ученой стопвнж кандидата бкадостгчвскхх наух

Ереван» 1990

Работа кшодвежа. в Институт* фаахологжж Схбжрского отдвимнжя АНН СССР.

Научные руководит&и:

. доктор бжологжчесзаг наук В Л} Даскня : доктор медицинских наук,

профессор М;И.Агеджаноа Научны® консультант -

кандидат медацинсхкгнаук Р.ГДачатрян

Офяцжадьнле оппоненты:

доктор МВД1ЩИ некие наук» ........

профоосор . ■ А»А.Енгябарян

кандидат биодогггескта наук Г.М."До>стгня

Ведущая организация - Ереванский. государственный институт усоввроенствоааняя врачей/г;Е5>ован/«

:.Защита диссертации состоится "Л/ 1990 г.

в & часов на заседании Спвцвалжзгроъаваото: совета.. Севанского государственного, ордена. Трудового Красного . Знамени медицинского института ИЗ Ари.ССР /адрвс:375025, г.Ереван, ух»Кяроваг- 2/.

- С дкооортагдеЛиокно оввадошгться г библиотеке . медицинского института;

• • Автореферат равоолан " ' ■ 1990 г.

Учена! секретарь .. .

аого совета хдд.; А.АЛа»арян

Актуальность темы. Закономерности биоэнергетического обеспечения устойчивости и адаптации человека и животных к неблагоприятным факторам среды, в частности, к низкой температуре, находятся на перекрестке интересов ряда биологических дисциплин, ■ В исследованиях по этой проблематике наши отражение разработки многих зарубежных лабораторий и крупных советских научных школ - биохимической биоэнергетики (С.А. Нейфах, Б.П.Скулачев, М.Н.Кондрашова, Е.М.Хватова и др.), патологической физиологии - в связи с проблемами гипотермии (Л.И.Мурский, Е.В.Майстрах, Ф.З.Меерсон, Н.Н.Тимофеев и др.) и экологической физиологии (А.Д.Слоним, Л.А.Исаакян, К.П.Иванов, М.А.Якименко, В.В.Хаскин и др.).

Широкое освоение районов Крайнего Севера, интенсификация экспедиционных работ в Арктике и Антарктике, акклиматизация домашних животных в условиях холодового климата, медицинское и Биотехническое применение низких температур - все это требует глубокого изучения физиологических и функционально-биохимических механизмов реакции организма на острое и хроническое действие холода.

Настоящая работа была выполнена как часть теш "Регуляция клеточного метаболизма при воздействиях низкой температуры на организм и клетки" Гос.регистрации 77026950) и входит в проблематику, относящуюся к междисциплинарной долгосрочной программе "Гомеостаз".

Постановка темы работы имела ряд предпосылок. Около 30 лет тому назад в работах В.П.Скулачвва и его сотрудников (Северин и др., 1960; Скулачев, Маслов, 1962; Скулачев, 1962) было показано, что одним из ванных механизмов химической терморегуляции у животных при повторном действии холода является изменение сопряженности окисления и фосфорилирования в мышечных митохондриях, обладающее выраженной термогенной функцией. Последующие эксперименты, из которых, кстати, не все содержали-., прямое подтверждение этого результата, проводились преимущественно на лабораторных животных.

В эффекторном ответе на действие низкой температуры участвуют не только скелетные мышцы, но и внутренние органы. Установлено, что у белых крыс в этих условиях изменяется КПД сердца (Алюхин, 1975, 1977), т.е. сердечная мышца, усиливая теплообразование, в этом отношении ведет себя подобно скелет-

ной. Уменьшение эффективности работы сердца в условиях длительного холодового воздействия вряд ли может быть полезно для организма. Но вместе с тем, этот факт представляется чрезвычайно важным, так как он, вероятно, имеет отношение к нарушению деятельности сердечно-сосудистой системы, наблюдаемой при адаптации к холоду как у экспериментальных животных, так и у человека (Ткаченко, 1979; Казначеев, 1980).

Известно, что реакция диких предков белых крыс - пасюков, живущих в суровых природных условиях, на действие низкой температуры отличается от реакции белых крыс и не связано с патологическими изменениями в организме ( Hart, Heroux,1963; Hart, 1971 ). В то же время вопрос об особенностях температурозависимых биоэнергетических функций у диких животных является одним из наименее разработанных аспектов проблемы.

Ранее было показано, что адаптация белых крыс к холоду сопровождается изменениями температурных коэффициентов окисления и фосфорилироваяия в мышечных митохондриях (Хаскин, Синдаровская, 1972).

Представлялось важным проверить этот факт в митохондриях миокарда белых крыс, а также в митохондриях серых крыс, тем более, что в работе предусмотрено изучение гипотермиче-ских состояний, при, которых окислительные системы тканей функционируют в условиях пониженной температуры.

Учитывая все вышеизложенное, быта поставлена цель провести параллельно исследование миокарда и скелетных мышц у белых и серых крыс и проанализировать функциональные сдвиги в митохондриях этих тканей, происходящие при воздействиях холода ¿V? о-Сдо и -сп Ъс£<со.

Для решения этой цели были поставлены следующие конкретные задачи:

■ I. Изучить влияние субстрата окисления и температуры инкубации на скорости окисления и фосфорилирования в митохондриях скелетных мышц и миокарда у интактных белых крыс в термонейтральных условиях.

2. Определить сдвиги по изучаемым параметрам энергетики митохондрий миокарда и скелетных мышц при гипотермии и ' при восстановлении нормальной температуры тела.

3. Выявить изменения в митохондриальной системе окисления и фосфорилирования при адаптации к холоду. Сравнять

эти изменения в миокарде и скелетных мышцах.

4. Оценить влияние адаптации к холоду на характер сдвигов в энергетике митохондрий миокарда и скелетных мышц при кратковременных 'холодовых воздействиях.

5. Исследовать температурную зависимость окисления и фосфорилирования в митохондриях миокарда и скелетных мышц

у животных, подвергнутых острым и хроническим Холодовым воздействиям.

6. Изучить эволюционно закрепленные особенности энергетики митохондрий у серой крысы и сравнить их со сдвигами, происходящими в результате индивидуальной адаптации к холоду.

Научная новизна результатов. В данной работе впервые проводилось параллельное исследование митохондриальной системы окисления и фосфорилирования как в миокарде, так и в скелетных мышцах у белых крыс, подвергнутых действию холода. Это дало возможность оценить тканевую специфичность этой системы и особенности ее ответа на это воздействие в этих тканях. Было показано, что в результате адаптации к холоду мощность окисления и фосфорилирования в митохондриях миокарда возрастает, однако, дополнительный сильный холо-довый стресс приводит к угнетению этих процессов, что предлагается рассматривать как предпосшпсу для патологических сдвигов в сердечно-сосудистой системе в результате неблагоприятного влияния длительного охлаждения.

Впервые с применением полярографической техники изучались особенности митохондриальной системы окисления и фосфорилирования у диких предков крыс - пасюков, живущих в природных условиях. Было показано, что митохондрии серых крыс отличаются большей мощностью окисления и фосфорилирования и большей стабильностью этих процессов при действии низкой температуры in vivo. Вместе с тем, их отличает иной характер температурной зависимости.

В митохондриях миокарда белых крыс при холодовых воздействиях как острых, так и хронических происходит переключение на преимущественное окисление сукцината. У серых крыс в этих же условиях отдается предпочтение глутамату.

Положения, выносимые на защиту.

1. В основе ответа организма на низкотемпературные воздействия лежат перестройки в системе окисления и фосфо-рилирования митохондрий - изменения скоростей дыхания и фо-сфорилирования, изменения дыхательного контроля и коэффициента фосфорилирования, изменения в температурной зависимости этих процессов, переключения в субстратах окисления.

2. Характер сдвигов в энергетике митохондрий при кратковременном глубоком охлавдении определяется фоном предварительной температурной адаптации - сдвиги приобретают противоположную направленность после адаптации белых крыс и практически отсутствуют у серых.

3. Дополнительный холодовый стресс, акклимированных к холоду белых крыс, приводит к угнетению окисления и фосфорилирования в митохондриях миокарда, что является выражением патологических сдвигов, происходящих в результате неблагоприятного влияния длительного охлаждения организма в ходе экспериментальной адаптации.

4. Острое охлаждение серых крыс не сопровождается напряжением митохондриальных функций, а ответ на него определя-вт$$уттт механизмами, связанными с температурной компенсацией на тканевом уровне, являющимися энергетически более выгодными.

Теоретическое и практическое значение. Результатами исследования обоснован общий вывод о том, что так называемое рерморегуляционное разобщение окисления и фосфорилирования в митохондриях скелетных мышц не является универсальным, свойственным всем экологическим формам гемойотермных животных механизмом интенсификации термогенеза при действии холода. Это вызывает необходимость дополнить фундаментальные представления о механизмах терморегуляции и холодо-вой адаптации сведениями о вариантах энергетической стратегии, возникающих в ходе эволюции. Методические подходы, осуществленные в работе, в частности, сочетание температурных воздействий in vivo и in vitro позволяют выявить некоторые замаскированные особенности терморегуляторной компетентности митохондрий. Результаты исследования могут быть использованы при трактовке проявлений холодовой патологии и адаптации к холоду.

Апробация материалов диссертации. Материалы диссертации были доложены и.обсувдены на I и П Всесоюзных конференциях "Важнейшие теоретические и практические проблемы терморегуляции", Новосибирск, 1982 г. и Минск, 1986 г.; на X Всесоюзном симпозиуме "Биологические проблемы Севера", Магадан, 1983 г. и на 1У Всесоюзной конференции "Адаптация, человека к климато-географическим условиям и первичная профилактика", Новосибирск, 1986 г.

Структура и объем работы. Диссертация изложена, на /2/ стр. машинописного текста, содержит б рисунков и 19 таблиц. Список литературы включает г ее источников, в том числе $3 иностранных.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В соответствии с поставленными задачами животных вод-вергали экспериментальным Холодовым воздействиям разной продолжительности и силы. Применялось острое, кратковременное охлаждение. Исследовалась терморегуляторная реакция, включающаяся при разогревании после охлавдения. Изучалось влияние длительного воздействия умеренного холода, т.н. "хо~ лодовой акклимации" (Якименко, 1984). Такие воздействия, как видно из обзора литературы, использовались при изучении механизмов холодового термогенеза. В данной работе определялись особенности реакции изолированных энергетических систем миокарда и скелетных мышц, что позволяло выявить видовые и тканевые особенности энергетического метаболизма и их изменения в ответ на холод.

Большая часть экспериментов выполнена на 200 белых крысах, самцах, весом 180-220 г. Белая крыса была выбрана как объект с наиболее изученными механизмами,терморегуляции. Характеристика терморегуляции и температурной адаптации белой крысы дана в обзоре литературы. В части экспериментов использовали их диких предков - серых крыс (30 особей). Особешюсти терморегуляции пасюков также были изучены (Щца-нова, 1980). Целью использования серых крыс в эксперименте было сравнение энергетического метаболизма в тканях этих двух разновидностей одного вида, реакция которых на охлаждение различается. Как было установлено, действие холода на серых крыс не связано с патологическими сдвигами, наблюдаемыми у белых.

Все животные до эксперимента содержались в условиях теплого вивария на стандартной диете.

Для исследования длительного влияния воздействия умеренного холода часть животных отсаживали в специальные помещения с температурой воздуха +4°С. Животные находились там от 30 до 40 дней, после чего использовались как адаптированные к холоду.

В целях исследования влияния кратковременного, но острого холодового воздействия на энергетику митохондрий, часть животных,как интактннх, так и прошедших длительную адаптацию к холоду, охлавдали в холодильных камерах при -20°С, куда они высаживались в тёсных клеточках, ограничивающих движение. Когда температура тела падала до 22-25°С, их использовали в эксперименте. Эта температура тела соответствовала состоянию умеренной гипотермии (Осташков, 1979; Тимофеев, 1982). При этой температуре потребление кислорода организмом после первоначального повышения приближается к исходным величинам, а затем резко снижается при переходе в глубокую гипотермию (Ковалевский, 1982). В специальной серии экспериментов животным давали разогреваться до температуры 35-36°С, после чего декапитировали. Изменения температуры тела контролировали термодатчиком. В каждой из групп исследовались митохондрии миокарда и скелетных мышц. С целью определения температурной зависимости окисления и фо-сфорилирования в препаратах митохондрий тестирование велось одновременно в 2-х ячейках при 25 и 15°С.

В процессе эксперимента животных интактных или после холодовых воздействий декапитировали, быстро извлекали сердце, вырезали мышцы задних конечностей и погружали,в холодный раствор хлористого калия (0,18 М). Все дальнейшие процедуры выполнялись-в специальной камере с температурой воздуха 0-2° на тканях, охлажденных до 2-4°С.

После измельчения тканей, их гомогенизировали в стеклянном, гомогенизаторе со стеклянным пестиком с небольшим количеством среды ввделения. Состав среды ввделения в молях (М): Сахароза - 0,1, KCl - 0,18, ТЕИС - ОД, ЭДТА --0,001,М^12 - 0,005, АТФ - 0,001, бычий сывороточный альбумин (БСА) - 0,5$. Мышечную ткань гомогенизировали в течение 2-3 мин, сердечную - одной минуты. Скорость вращения гомогенизатора с механическим приводом около 300 оборотов

в минуту. Затем гомогенаты разбавляли холодной средой выделения до конечного соотношения среда:ткань - 10:1.

Митохондрий выделяли общепринятым методом дифференциального центрифугирования .Первое центрифугирование выполняли на рефрекераторной центрифуге К-23 при 2000 об/мин (800s) в течение 10 минут. Осадок, состоящий из клеток и ядер, отбрасывали. Митохондрии из супернатантов осавдали на рефрекераторной центрифуге К-24 при 15000 об/мин (12000£)в течение 15 минут. Образовавшуюся надосадочную жидкость сливали, а осадок митохондрий ополаскивали сверху средой выделения, а затем с помощью шприца с полиэтиленовым кончиком переносили в минпробирки. Рабочая суспензия митохондрий сохранялась на льду до использования.

Для определения энергетического состояния выделенных митохондрий использовали полярографический метод регистрации скорости поглощения кислорода митохондриями при окислении ими сукцината или глутамата в разных метаболических состояниях по Чансу ( Chance,Williams,1955 ). Выделенные митохондрии сразу же использовали для тестирования. Уменьшение концентрации кислорода в полярографических ячейках, в которых при непрерывном помешивании инкубировались митохондрии, определяли вращающимися платиновыми электродами (открытыми). Электроды соединялись со входом полярографа ЛП-7, снабженного регистрирующим потенциометром. Полярографические ячейки плотно закрывались тефлоновыми крышками с вмонтированными в них электродами. В качестве референтного электрода использовали большой каломельный электрод, соединенный с ячейкой агаровым мостиком. При регистрации поляро-граммы на измеряющий электрод подавалось напряжение 0,65 в. Использовали такой состав среды инкубации: маннитол - 0,ЗМ, ТРЙС - 0.0IM, KCI - 0,1М, КН2Р04 - 0,DIM, сукцинат (натриевая соль янтарной кислоты) - 0.006М или глутамат (глутами-новая кислота) - 0.0012М. Все растворы готовились в'день опыта, с четким контролем кислотности среды при данной температуре (РН - 7,4). ДЦФ фирмы " Reanai" готовили на среде инкубации без субстратов и вводили в дозе 200 наномолей, в объеме 10-20 мкл микропипеткой по несколько раз в течение одного теста.

Результаты опытов были представлены в виде полярограш, соответствующая обработка которых позволяла определить сле-

дующие параметры окислительного фосфорилироваиия, определяющие функциональное состояние митохондрий: скорости окисления в 0-ом, 3-ем и 4-ом метаболических состояниях по Чансу (V 0, v3, v4), скорость фосфорилироваиия ( На основании этих параметров рассчитывали коэффициент фосфорилирования (АДФ/0), дыхательный контроль по Ларди (ДКЛ) и по Чансу (ДР^), а также температурный коэффициент (Q jg), как отношение скоростей окисления и■фосфорилирования при 25°С к соответствующим величинам при 15°С.

Результаты, полученные при обработке полярограмм были сведены в таблицы и обработаны статистически на электронно-вычислительной машине БЗ-18М с получением средних величин и средней квадратичной ошибки измерения. Достоверность различий результатов эксперимента для разных групп определялась с помощью критерия Стьвдента и выражалась величиной уровня, значимости (Р).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В таблице I и 2 представлены скорости окисления и фосфорилирования в митохондриях миокарда и скелетных мышц интакт-ных белых крыс.

Скорость потребления кислорода митохондриями во всех метаболических состояниях и скорость образования макроэргов в значительной мере зависят от природы окисляемого субстрата и температуры инкубации. При температуре 25°in vitro все регистрируемые значения скорости дыхания и фосфорилирования выше, чем при 15°, сукцинат окисляется быстрее, чем глутамат, особенно в состояниях 0-ом и 4-ом; в третьем метаболическом состоянии это различие выражено меньше.

Влияние острых и хронических холодовых воздействий на окисление и фосфорилирование в митохондриях скелетных мышц белых крыс

1-я серия экспериментов по изучению взаимосвязи холодовых воздействий на организм и энергетики митохондрий была выполнена в традиционном стиле исследования терморегуляторной функции митохондрий в скелетных мышцах и ее"изменения после адаптации к холоду.

Митохондрии были выделены из мышц интенсивно дрожащего животного в момент восстановления температуры тела после глубокого кратковременного охлаждения.

Действие субстрата окисления и температуры на скорости окисления и фосфорилирования в митохондриях скелетных мышц интактных белых крыс

Скорости Г Субстрат-с^кцинат ! Субст^ат-гл^тамат

I ! 25° ! 15° 1 I \ 25° ! 15°

7Ф 41,5+1,9 81,4+5,2 42,7+2,6 150,9+9,5 23,7+0,8 46,3+2,5 20,2+1,7 91,9+4,8 20,5+1,0 14,1+1,0 52,0^3,1 30,2+2,2 16,7+1,2 10,6+1,0 140,5+6,9 85,3+6,7

Примечание: у0, - скорости потребления кислоро-

да митохондриями в разных метаболических состояниях (0-ом, 3-ем, 4-ом) в нанограмматомах кислорода на миллиграмм белка в минуту (нга02Ллг.мин); Уф - скорость фосфорилирования в наномолях АДФ на миллиграмм белка в минуту (нмолей/мм«мин).

Таблица 2

Влияние субстрата окисления и температуры на скорости окисления и фосфорилирования в митохондриях миокарда интактных белых крыс

Скорости

Субстрат-с^кцинат

Субстрат-глутамат

25

15°

грат-гл

25

15°

47,4+4,4 87,4+9,8 53,0+5,4 151,7+14,6

34,0+3,4 19,5+1,9

54,2+5,1 35,6+1,3

30,9+2,6 14;7+1,0

93,2+8,9 93,8+5,2

12,9+1,14 22,5+1,9 8,1+1,0 62,4+5,6

Примечание: обозначения те не, что и в табл. I.

Уф

а». по'.'.

о г

Ог ЮО:.

50..

гй

-I'

-I- -г-

\tHlH. 1*1 ■

•3-1

■

-н

г

гЬ 4-1

■3-

г —{- 1 1

> I -1-* 1*.

тт

-1-1-1-г

-1-Г —I-г

Ч-

Ьиш

-1—I—•

0) б) 6) ё)

Рис.1. Скорости окисления ( У0> Уд, У^) и фосфорилирования ( Тф) в митохондриях скелетных мышц белых крыс: а) контрольных, б) разогретых после гипотермии, в) акклимирован-ных к холоду, г) акклимированных разогретых после гипотермии. Субстраты окисления: - сукцинат; --- глутамат;

•-достоверность различий с "контролем", Р4.0,01.

Интенсивная дрожь - главный источник теплообразования у неакклимированных белых крыс, требует усиленного притока молекул АТФ. Выделенные в этот момент митохондрии обладают повышенной фосфорилирующей способностью. Скорость фосфорилирования на 41$ выше, чем у контрольных животных. Одновременно наблюдается и ускорение дыхания в 3-ем метаболическом состоянии (на 40$) (Рис.1, а, б). Это свидетельствует о том, что в митохондриях скелетных мышц неакклимированных белых крыс ослабления сопряженности процессов окисления и фосфорилирования не происходит. Более того, наблюдается усиление дыхательного контроля по Ларди на 31$ и по Чансу - на 28$, что говорит об усилении энергетической регуляции в митохондриях.

Таким образом, полученные факты подтверждают сущаство-

Коэффициент фосфорилирования (АДФ/0) в митохондриях скелетных мышц белых крыс при холодовых воздействиях {п = 7 * Ю)

Т°С инкубации

Норма

Гипотермия

Разогрев

25

Контроль 1,85+0,06 1,63+0,07* 1,87+0,14 Адаптация 1,76+0,08 2,05+0,031,72+0,04««

15

Контроль 1,91+0,08 1,66+0,04* 1,64+0,13* Адаптация 1,78+0,05 2,14+0,14«» 1,52+0,04 1*

Примечание: • - достоверность различий с "нормой", •• - с "гипотермией",••• - с "адаптацией", Р<0,05-0,005

вание предпосылок для получения дополнительного количества АТФ, необходимого для сократительного термогенеза, который считается главным у неадаптированных к холоду белых крыс.

Адаптация к холоду не привела к явным сдвигам в энергетике мышечных митохондрий. Скорости окисления и фосфорилирования, дыхательный контроль, коэффициент фосфорилирования практически не отличались от соответствующих значений до адаптации, когда тестировали митохондрии, выделенные из скелетных мышц белых крыс, находящихся в условиях температурного комфорта (РисЛ, а, в). Но применение острого глубокого, но кратковременного охлаждения позволило выявить эти различия, наиболее отчетливо проявившимися, во время терморе-гуляторной реакции.

Адаптация к холоду, как видно из литературного обзора,

меняет структуру мышечного термогенеза (Якименко, 1984)..

Замещение сократительного термогенезалпшволит к_тому, что

несократительным дрожь редуцируется, а теплообразование усиливается за счет

"свободного окисления" (Хоскин, 1975, 1976, 1984). В отличие от существенного усиления мощности окисления и фосфорилирования, наблюдаемого при терморегуляторной реакции в мышечных митохондриях неакклимированных белых крыс, после адаптации к холоду подобные сдвиги отсутствуют (Рис.1, в,г).

Характерно, что при восстановлении температуры тела, развитие терморегуляторной реакции связано с ослаблением сопряженности в шшечных митохондриях при выходе из гипотермии только у адаптированных белых крыс (Таблица .3), У неадаптированных наблвдаются противоположные сдвиги. Полученная данные подтверждают известные представления о терморе-туляторной роли митохондрий в скелетных мышцах белых крыс.

Эти эксперименты, выполненные на мышечных митохондриях, уточняя картину сдвигов в митохондриальной системе окисления и фосфоршшрования при терморегуляции, явились в какой-то степени базовыми экспериментами,"точкой отсчета", целью которых <бяяо подробно проанализировать сдвиги, сравнить их с общепринятыми в настоящее время представлениями о терморе1уляторной роли митохондрий и в той ке постановке эксперимента, с этих же позиций оценить сдвиги, происходящие на этом .фоне а миокарде.

Влияние острых и хронических холодовых воздействий на окисление и с^осфорилирозание в миокарде

Интенсивная работа сердца в условиях общего охлаадения связана со значительным ускорением окислительного метаболизма, который является ведущим в энергетике миокарда.

Скорости окисления и дюсфорилирования в митохондриях миокарда интактных белых крыс приведены в таблице 2. Сравнение с соответствующими значениями в скелетных мышцах выявило значительное преобладание рукцинатяого компонента в дыхании, что также согласуется с представлением об аэробной ориентации метаболизма з миокарде.

Пели з мышечных штохоццриях глубокое охладдение до состояния гипотермии не вызвало каких-либо существенных вдвигав б энергетике штохоцдрий, а изменения были связаны только с терморет^ляторным напряжением,- то в миокарде такое шладдение приводило к активации процессов окисления и 1$ос$оршшрования в штохоцдриях {Тис.2). Этот факт не противоречат логике, так как экспериментальное охлаадение жи-зотшлю осуществлялось довольно быстро — у неакклимнрован-них белых 5фыс температура тела опускалась до 22-25°С, работа сердца при этой температур® еще не была угнетена.

Как следет из литературных данных, аналогичную реакцию ва таков же острое шлшщешге выявили в митохондриях

другого внутреннего органа - печени (Ковалевский и др., 1981; Кулинский и др., 1981). По мнению авторов ускорение дыхания связано со стимулирующим окислительные ферменты влиянием катехоламинов, содержание которых в крови при общем охлаждении повышалось, а при температуре тела 25°, оно было даже выше, чем до охлаждения (Тимофеев, 1983). Не исключено, что и в миокарде активация катехоламинами сукцинат-й глутаматдегидрогеназ является одной из основных причин усиления митохондриального дыхания при остром охлаадении. Тем более, что увеличение активности этих ферментов в миокарде при действии холода отмечалось -некоторыми исследователя® и ранее (Хватова, Семенова, 1976; Утно и др., 1980).

Полученные факты указывают на органную дифференциацию симпатического контроля, а так ке свидетельствуют о том, что каких-либо нарушений митохондриальных функций при кратковременной острой гипотермии не происходит.

При разогревании сердечная деятельность усиливается, а в митохондриях, выделенных из миокарда разогревающихся животных, можно наблюдать еще большее увеличение сукцииатной составляющей дыхания, что свидетельствует о напряжении в митохопдриальной системе окисления и фосфорилированкя (Рис. 2, в).

В условиях длительного хронического холодового воздействия нагрузка на сердечно-сосудистую систему остается значительной. Многие исследователи отмечают, что в результате такого воздействия, возрастает ее мощность, но одновременно развивается гипертрофия миокарда и уменьшение КПП мышечного сокращения (Ллюхин, 1975). Подобные изменения рассматривают как одну из причин возрастания сердечно-сосудистой патологии на Севере (Ткачешсо, 1979; Казначеев, 1980).

Аккламация к холоду л условиях нашего эксперимента приводит к ускорению окисления, и фосфорилирования, главным образом, при дыхании на сукцинате. Прирост окисления составляет 70 и 40$ в 0-ом и 3-ем метаболических состояниях, а прирост скорости фосфорилирования - 50$ (Рис.2, г).

Усиление дыхания митохондрий миокарда при адаптации к холоду хорошо согласуется с данными об активации тканевого дыхания в этих же условиях, полученных на сердечных"го-могенатах и срезах (Щеглова и др., 1969; Исаакян, 1972; Исаакян и др., 1973). Активацию митохондриального дыхания

можно объяснить усилением синтеза белков, приводящих к увеличению концентрации дыхательных ферментов при адаптации к холоду (Кигачева, Мохова, 1978), а ускорение фосфорилиро-вания - увеличением активности переносчика адениннуклеоти-дов, установленное в печеночных митохондриях.

В митохондриях миокарда после адаптации к холоду значительно возрастает сукцинатная составляющая дыхания. Неко -торые исследователи рассматривают переход клетки на преимущественное окисление янтарной кислоты под действием неблагоприятных факторов как физиологический приспособительный механизм (Кондрашова, 1976; Бобков, 1984). Но вместе с тем, это и свидетельство "напряженности" в митохондриальной системе окисления и фосфорилирования, так как в покое клетка пита-

ется преимущественно (Ковдрашова, 1976).

"подтеканием" НАД-зависимых субстратов

<00-■

йУф т [Ь

-ь -1 -1 1 1

* * 1 1

1*1 -I-

1 I I

-Г-

0:

ко.

гЬ

4-

.. о. 1- ь -I

1 1 —г

а)

г * "i

К-

п-1-1--г

ю

Ыии

е)

г)

Рис.2. Скорости окисления и фосфорилирования ( ч0, Уд, у4, Уф) в митохондриях миокарда белых крыс: а) контрольных, б) гипотермических, в) разогревающихся после гипотермии, г) адаптированных к холоду. ' - достоверность различий с контролем, Р^О.СЯ.

I—I

В ответ на острое охлаздение скорости окисления и фосфорилирования в митохондриях миокарда белых крыс не только не увеличиваются, как это наблюдалось до акклимации, но, напротив, снижаются, а последующее разогревание еще больше углубляет это падение (Рис.3). В системе окисления глутамата наблюдается ослабление дыхательного контроля (Р<0,01).

При разогревании адаптированных к холоду белых крыс скорости окисления и фосфорилирования в митохондриях-миокар-да существенно ниже, чем это наблвдалось до адаптации (Табл.4;.

Таблица 4.

Влияние адаптации к холоду на скорости окисления и фосфорилирования в митохондриях миокарда разогревающихся белых крыс р1 =7-10)

! Контроль ! Адаптация

То 66,7 + 4,0 53,4 + 1,8*

V 3 120,0 + 8,8 91,6 + 4,9*

У4 73,7 + 7,3 55,4 + 3,0 *

7Ф 203,0 + 19,7 148,5 + 7,5*

Обозначения те же, что и в табл. I. • - достоверность различий, Р<0,05 - 0,01.

Пониженный энергетический уровень в митохондриях миокарда "разогретых" белых крыс после адаптации к холоду и более низкий дыхательный контроль могут свидетельствовать о перенапряжении энергопроизводящих структур (Клейменов и др., 1976), что является, вероятно, предпосылкой для патологических сдвигов в миокарде. Исследованиями Толейкиса (1984, 1988) было установлено, что подобные сдвиги характерны для ишемизированного миокарда.

Особенности митохондриальной системы окисления и и фосфорилирования у серой крысы

Известно, что действие холода на серых (диких) крыс не связано с патологическими изменениями в организме. Термо-регуляторные реакции у этих животных, как было показано, отличаются от таковых у белой крысы (Юданова, 1980). Поскольку терморегуляторная роль митохондрий была продемонстрирована, главным образом, на лабораторных белых крысах, одной

и;, задач настоящего исследования бшю изучить эваяюционно закрепленные особенности митохондриальной системы окисления и фосфорилирования у их диких предков и сравнить их со сдвигами, происходящими в результате индивидуальной адаптации к холоду.

Рис.3. Изменение (Д в $) скоростей окисления ( ч ,

и фосфорилирования ( в митохондриях миокарда аккли-мированных белых крыс при гипотермии (О ) и при разогревании после нее (). Достоверность различий с нормо-термным состоянием: - - Р<0,01;..'- Р<0,001 при п=7-Ю

В ходе экспериментов было установлено, что скорости окисления субстратов в 0-ом и 4-ом метаболических состояниях митохондриями, ввделенными из скелетных мышц интактных серых крыс, достоверно не отличаются от таковых у белых, однако в 3-ем метаболическом состоянии скорость выше (на 25$ ~ при окислении сукцината и на 58$ - при окислении глу-тамата, что объясняется более высоким дыхательным контролем (Табл.5).

Обращает внимание еще один факт - величина дыхательного контроля в митохондриях серых крыс, в отличие от белых, оказывается неодинаковой при разных температурах инкубации - при 15°С ниже, чем при 25°. Эта особенность регуляции ми-тохондриального окисления может быть связана с различной температурной зависимостью (0 этого процесса в разных 4 метаболических состояниях. Подобные различия отсутствовали в митохондриях интактных белых крыс.

В мышечных митохондриях серых крыс коэффициент фосфорилирования был несколько ниже, чем у белых крыс (на 15-17$). Вместе с тем," у серых крыс была выявлена более высокая температурная зависимость фосфорилирования (С} уд Уф) и фосфо-рилирующего окисления ((} чем у белых; причем она

оказалось выше в 1,5 раза, чем температурная зависимость нефосфорилирующего окисления (0 V 0 и 0 V ф) (Табл.6).

Таблица 5.

Скорости окисления и фосфорилирования в митохондриях скелетных мышц и миокарда нормотермных серых крыс (Т° - 25°С)

Скорости ! Скелетные мышцы ! Миокард

; сукцинат ; } (п =5) глутамат (И =8) ; сукцинат \ (п =5) } глутамат } (и =5)

т0 37,8+2,0 16,9+1,8 63,2+5,6 14,8+0,8

тз 100,2+5,0 62,0+5,2 126,7+12,2 40,8+4,8

т4 43,3+2,3 19,2+1,3 70,0+5,9 20,0+0,7

ТсЬ 181,4+9,4 150,8+11,4 197,2+9,3 99,2+9,2

Обозначения те же, что и в таблице I.

Таблица 6.

Температурная зависимость ((} окисления и фосфорилирования в митохондриях скелетных мышц белых и серых крыс

Субстрат-сукцинат Субстрат-глутамат

белая крыса ( п =10) серая крыса ( п= 8) белая крыса ( £=10) серая" крыса-( п= 8)

4 10 Ч Ю

ч Ю У4

9 10 уф

1,77+0,10 1,68+0,10

1,79+0,12 2,02+0,15

2,21+0,18 1,72+0,11

1,64+0,06 2,42+0,20'

1,52+0,13 2,16+0,20

1,78+0,13 2,52+0,21

1,66+0,16 1,88+0,12

1,70+0,10 2,67+0,20

♦ - Различия с белой крысой достоверны, Р<0,01

Таким образом, и сниженный коэффициент фосфорилирования, и более высокая температурная зависимость фосфорилирования дают основание думать о существовании потенциальных предпосылок для терморегуляторного разобще-

ния в митохондриях скелетных мышц серых крыс уже в термонейтральных условиях.

В миокарде серых крыс скорости'окисления м фосфорилиро-

вания выше, чем у белых крыс до адаптации (Табл.5, 2). Однако, после адаптации эта разница практически исчезала. В то же время особенности регуляции окисления и фосфорилиро-вания, выявленные в мышечных митохондриях серых крыс, обнаруживаются и в митохондриях миокарда - это и более низкий коэффициент фосфорилирования (АДФ/О), и высокая температурная зависимость «1 10) фосфорилирования и фо сфори л ирующе г о окисления и, связанное с этим, ослабление дыхательного контроля (да) при понижении температуры среды инкубации.

Характерно, что подобные признаки появляются и у белых крыс, но только во время терморегуляторной реа1<^?Итемпера-турная зависимость окисления в 0-ом и 4-ом метаболических состояниях при этом заметно ослабляется (в 4-ом - на 37%, Р< 0,001), а дыхательный контроль приобретает зависимость от температуры ¿-'лг.

Как было показано ранее, после акклиматизации к холоду в миокарде белых крыс в 2 раза возрастала сукцинатная составляющая дыхания. У серых крыс доля сукцината в митохонд-риальном дыхании и фосфорилирования так же высока в 3-ем метаболическом состоянии, но в 0-ом и 4-ом - несколько ниже. Если связывать переход на преимущественное окисление сукцината с "напряжением" митохондриальной системы окисления и фосфорилирования, то можно сказать, что у серых крыс оно менее выражено, чем у акклимированных к холоду белых. Поэтому дополнительный холодовый стресс последних приводил к перенапряжению в энергопроизводящих структурах миокарда, тогда как у серых крыс при этом наблюдается отчетливый сдвиг в предпочитаемых субстратах окисления к глутамату. Это представляется весьма существенным фактом, так как хорошо известна роль глутаминовой кислоты в улучшении кардиоваскуляр-ных функций (Писаренко и др., 1984, 1985; Ковалев и др., 1985), а экзогенная глутаминовая кислота используется для коррекции ишешнизированного миокарда.

Характерно, что у серых крыс при терморегуляторном напряжении не удалось зарегистрировать существенных сдвигов по изучаемым параметрам энергетики митохондрий ни в миокарде, ни в скелетных мышцах. Этот факт сопоставим с более низким уровнем химической терморегуляции, выявленным ранее (Панова, 1980).

Из наших данных явствует, что митохондриальная система

окисления и фосфорилирования в тканях серых крыс уже в тер-монойтралышх условиях обладает особенностями, которые, несомненно, свидетельствуют о потенциальной способности этих клеточных структур к эффективному теплообразованию. Полученные нами данные и литературные сведения позволяют предположить, что именно эти особенности, определяемые интимными свойствами белковых структур, участвующих в процессах окисления и фосфорилирования, обеспечивают относительную стабильность этих комплексов при охлаждении серых крыс и, как следствие, большую устойчивость к холоду.

По мнению Шварца (1980) и Меерсона (1981) увеличение мощности системы митохондрий являются всеобщим признаком адаптации животных к экстремальным воздействиям. Ими же утверждается, что в основе адаптационного процесса лежит достижение . максимальной экономии ресурсов организма.

В данной работе бала выявлена большая мощность митохон-дриальной системы окисления и фосфорилирования у диких крыс, по сравнению с белыми и увеличение этой мощности у последних в ходе индивидуальной адаптации к холоду.

Вместе с тем, так же было установлено, что развитие защитных механизмов дополнительного теплообразования у1 белых крыс связано со значительным напряжением митохондриальных функций. Поэтому при очень сильных холодовых воздействиях может происходить перенапряжение и срыв этих механизмов и, как следствие, развитие патологии. В то же время у серых крыс ответ на низкотемпературные воздействия достигается без напряжения митохондриальных 'функций, но за счет уже существующих эволюци'онно-закрепленных морфофункциональных особенностей регуляции окисления и фосфорилирования, что является энергетически более выгодным.

вн во да

1. Воздействия низких температур на организм приводят к сдвигам в энергетике митохондрий. Эти сдвиги неодинаковы в миокарде и в скелетных мышцах и зависят "от силы и продолжительности холодового фактора.

2. В митохондриях миокарда белых крыс ответ на холодо-вое воздействие как острое, так и хроническое, связан со значительным напряжением системы окисления и фосфорилирования в митохондриях, а дополнительный- холодовый стресс после

адаптации к холоду приводят к угнетению этой системы, что является предпосылкой для патологических сдвигов.

3. Митохондрии миокарда серых крыс, по сравнению с белыми, отличает большая мощность окисления и фосфорилирова-ния и большая стабильность этих процессов при экспериментальных холодовых воздействиях in vivo параллельно с большей чувствительностью к температуре in vitro.

4. В скелетных мышцах белых крыс скорости окисления и фосфорилирования в митохондриях возрастают при терморогуля-торном выходе из состояния гипотермии. Адаптация к холоду устраняет этот эффект и приводит к уменьшению роли фосфори-лирующего окисления и фосфорилирования и ослаблению дыхательного контроля. У серых крыс терморегуляторных сдвигов в митохондриях скелетных мышц не обнаружено.

5. В митохондриях миокарда белых крыс, в отличие от скелетных мышц, особую роль при действии холодового фактора как кратковременного, так и длительного, играет предпочтительное использование сукцината в качестве субстрата дыхания. В митохондриях серых крыс в тех же условиях происходит сдвиг субстратного предпочтения в пользу глутамата.

6. Температурная зависимость (Q jg) дыхания в митохондриях белых крыс ослабляется при выходе животных из состояния гипотермии, а предварительная адаптация к холоду устраняет этот эффект. У серой крысы Q jq фосфорнлирование выше, чем у белых крыс, a Q jq дыхания зависит от метаболического состояния митохондрий.

7. Особенности температурной компенсации и субстратных условий на тканевом уровне следует связывать с отсутствием напряженности в штохондриадьной системе окисления и фосфорилирования у серых крыс и, как следствие, их лучшую устойчивость при холодовых воздействиях.

Научные результаты диссертационной работы В.К.Преображенской отражены в 6 публикациях:

1. Изучение особенностей терморегуляции у крыс, кроликов и леммингов при ускоренной адаптации к холоду // Материалы Ш Всесоюзн.конф. по "Морфо-физиологические и биохимические механизмы адаптации животных к факторам среды", Краснодар, 1972. - с. 189.

2. Температурная зависимость окисления и фосфорилирования в митохондриях скелетных мышц и миокарда крыс, адапти-

л практические проблемы терморегуляции", Новое«5ирск, г. - с. 67. •

3. Окисление и фосфорилировакие в митохондриях мйокар-и скелетных мышц у животных разной экологической специа-ации // Тез.докл. Х-го Всесогозн.симп. "Биологические блемы Севера", Магадан, 1983. - с. 404.

4. Влияние темпор^туры in vivo и m vitre на оки-i.iie и фосфорилпрованио в митохондриях миокарда Оолых

с // Билл.экспериментальной биологии и медицины. - Л 8.->7. - 1984. - с. 173-175.

5. Некоторые энергетические параметры митохондрий мио->да и скелетных мышц у белых крыс при разной температуре ta // П-я Всесоюзн.конф. "Важнейшие теоретические и прак-госкио проблемы торморогуляции", Минск, 1986. - с. 244.

6. Влияние адаптации к холоду на окисление в мигоховд-IX миокарда белых крыс // 1У-я Всесоюзн.конф. "Адаптация ювека к климатогеографическиы условиям и первичная прскри-^тика", Новосибирск, 1986. - с. 84.

тз 312. Тираж 100 экз. Пец.л I югри^я СО АМН СССР. Новосибирск Д990.

i. ' -, щ

t'Cv. i. г_

ï?: к

л";

(. - -;

Í.