Автореферат и диссертация по медицине (14.00.03) на тему:Неклассическая форма дефицита фермента 21-гидроксилазы в женской популяции ненцев

На правах рукописи

АКСЁНОВА Наталья Викторовна

НЕКЛАССИЧЕСКАЯ ФОРМА ДЕФИЦИТА ФЕРМЕНТА 21 -Г ИДРО КС И Л АЗЫ В ЖЕНСКОЙ ПОПУЛЯЦИИ НЕНЦЕВ (МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА)

14.00.03 - эндокринология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Самара-2008

003163537

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Тюменская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель:

доктор медицинских наук,

профессор Суплотова Людмила Александровна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

Вербовой Андрей Феликсович Трусов Виктор Васильевич

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московская медицинская академия имени И М Сеченова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита состоится «20» февраля 2008 г в 14-00 часов на заседании диссертационного совета Д 208 085 05 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (443079, г Самара, ул К Маркса, 165 «Б»)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Автореферат разослан «/<^» января 2008 г

Ученый секретарь Диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор

Захарова Н О

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы

Одним из важных направлений в решении демографической проблемы в стране является сохранение репродуктивного здоровья женщины Эндокринные заболевания являются причиной бесплодия в 28,3% случаев, привычных выкидышей в 8-20% случаев [Е С Ляшко, 1985, Т В Боткина, 2001, В П Сметник, 2002] Воздействие экстремальных климатических условий Крайнего Севера приводит к напряжению механизмов адаптации и усугублению дисгормональных репродуктивных нарушений у женщин, проживающих в данном регионе [В С Корсак и др , 2000, 3 Д Губкина, 2006]

Около двух процентов населения Крайнего Севера составляют представители коренных малочисленных народностей Для большинства малочисленных этнических групп характерна высокая распространенность близкородственных браков, приводящая к накоплению генетических аномалий, что предрасполагает к репродуктивным нарушениям [И Н Гаврилова, 1997, В Ф Галыгинидр, 1998, В С Корсак и др 2002]

Одним из наследственных заболеваний, сопровождающихся репродуктивными потерями, является неклассическая форма врожденной дисфункции коры надпочечников (ВДКН), которая в 95% случаев обусловлена дефицитом фермента 21-гидроксилазы [И И Дедов, 2002, М И Балаболкин, 2002]

Клиническая картина заболевания характеризуется манифестацией в зрелом возрасте, как правило, на фоне стрессовых ситуаций, беременности, родов, и может проявиться нарушениями менструальной и репродуктивной функций, осложненным течением периода гестации, выкидышами и преждевременными родами [Е К Комаров, 1997, JI С Логутова, 1999, Р А Абдурахманова, 2000, Е С Ляшко, 2000, Т С Качалина, 2004, О Б Старкова, 2006, Н Ю Южакова, 2006]

Неклассическая форма ВДКН считается одним из наиболее распространенных наследственных заболеваний, частота которой имеет популяционные отличия Так, у евреев Ашкенази заболевание встречается с частотой 1 27, в Испании 1 53, в гетерогенной популяции Нью-Йорка 1 100, в Италии 1 333, среди белого европейского населения 1 1000, в общей популяции распространенность равна 0,3% (0,1—4%) Гетерозиготное носительство аутосомно-рецессивного дефекта 21-гидроксилазы встречается еще чаще - от 1 36 до 1 72 в популяции, а у евреев Ашкенази и эскимосов определяется практически сплошным [И И Дедов, 2002, М И Балаболкин,

2002, Р С Whit, 2000, Р W Speiser, 2001, L В Dam at al, 2002, В Ugele at al,

2003, F Gatelais, at al, 2004, К Homma at al, 2004, D P Merke at al, 2005] Предпосылки для высокой распространенности неклассической формы

ВДКН в популяции ненцев обусловлены малой метисацией, высокой частотой близкородственных браков, сохранением этнической однородности данной группы населения [В Ф Голыгин и др, 1998, Т В Гольцова и др , 2006] Одной из приоритетных задач здравоохранения на современном этапе является сохранение репродуктивного здоровья и увеличение численности коренных I

народностей, проживающих на территории России, что определяет актуальность исследования распространенности неклассического варианта врожденной ферментопатии в популяции ненцев как представителей одной из малочисленных народностей Севера Цель исследования:

Изучить распространенность неклассической формы врожденной дисфункции коры надпочечников и провести анализ частоты мутаций гена СУР21 при неклассической форме дефицита фермента 21-гидроксилазы в женской популяции ненцев Задачи исследования:

1 Изучить особенности клинической и лабораторной диагностики адреналовой гиперандрогении у ненок и русских женщин Крайнего Севера вне гестации

2 Изучить особенности клинической и лабораторной диагностики адреналовой гиперандрогении у ненок и русских женщин Крайнего Севера в периоде гестации

3 Оценить характер и частоту мутаций гена СУР21 при неклассической форме дефицита фермента 21 -гидроксилазы в популяции ненок

4 Изучить взаимосвязь генотипа неклассической формы дефицита фермента 21 -гидроксилазы с фенотипом в популяции ненок

5 Выявить распространенность неклассической формы дефицита фермента 21-гидроксилазы в группе с гиперандрогенией и в общей женской популяции ненцев

Научная новизна

Впервые установлено, что у ненок по сравнению с русскими женщинами в большинстве возрастных периодов отмечаются более низкие показатели адреналового андрогена дегидроэпиандростерон-сульфата (ДГЭА-С) Пик и снижение секреции ДГЭА-С происходят у ненок на десять лет раньше, чем у русских женщин

Впервые изучены клинические проявления неклассической формы дефицита фермента 21-гидроксилазы в женской популяции ненцев, рассчитана частота мутаций, вызывающих заболевание

Установлено, что характер мутаций при неклассической форме дефицита фермента 21-гидроксилазы в популяции ненцев отличается от европейской и русской и имеет сходство с японской популяцией

В женской популяции ненцев впервые выявлена конфигурация Я гена СУР21, изучена частота и ассоциация данной конфигурации гена с фенотипом

Впервые определена распространенность неклассической формы дефицита фермента 21-гидроксилазы в группе женщин ненок, имеющих повышенные лабораторные показатели метаболитов адреналового стероидогенеза - ДГЭА-С и 17-гидроксипрогестерона (17-ОНП), и в общей женской популяции ненцев

Практическая значимость

Определен общий подход в диагностике неклассической формы дефицита фермента 21-гидроксилазы вне и в периоде гестации у женщин, проживающих

в разных климатогеографических регионах Западной Сибири, независимо от национальности и длительности проживания в условиях Крайнего Севера

Обнаружены этнические особенности секреции адреналового андрогена ДГЭА-С, требующие коррекции нормативных показателей данного метаболита для диагностики адреналовой гиперандрогении у ненок вне гестации

Выявлено, что неклассическая форма дефицита фермента 21-гидроксилазы у ненок обусловлена мутациями 12зр1, РЗОЬ, Р4538, (}318Х, те 1746 Клиническими проявлениями заболевания наиболее часто являются позднее начало менструальной функции, бесплодие, выкидыши Мутация Р105Ь является проявлением нормального полиморфизма гена СУР21

Обнаружено, что конфигурация Я гена СУР21 у ненок не ассоциирована с неклассической формой дефицита фермента 21 -гидроксилазы

Выявлена достаточно высокая частота неклассической формы дефицита фермента 21-гидроксилазы в женской популяции ненцев, что следует учитывать при проведении дифференциальной диагностики у женщин ненок с репродуктивными нарушениями

Основные положения, выносимые на защиту

1 Для диагностики адреналовой гиперандрогении у женщин, проживающих в условиях Крайнего Севера, возможно использование диагностических подходов, разработанных для женщин, проживающих в южных территориях Тюменской области Нормативные показатели метаболитов адреналового стероидогенеза ДГЭА-С и 17-ОНП одинаковы у русских женщин южных и северных регионов Западной Сибири, независимо от длительности проживания в условиях Крайнего Севера Нормативные показатели ДГЭА-С для ненок должны учитывать этнические особенности секреции данного метаболита, оценка уровней 17-ОНП не требует поправок на этническую принадлежность

2 Распространенность неклассической формы дефицита фермента 21 -гидроксилазы в женской популяции ненцев, определенная по данным молекулярно-генетического анализа, в группе с повышенными уровнями метаболитов адреналового стероидогенеза составляет 11,5%, в общей женской популяции ненцев равна 2%

Апробация материалов исследования

Материалы диссертации представлены на областной научно-практической конференции «Клиническая эндокринология достижения и перспективы» (Тюмень, 2004 г), на научно-практической конференции «Актуальные вопросы внутренних болезней» в рамках международного симпозиума «Медицина и охрана здоровья» (Тюмень, 2004 г), на терапевтическом форуме «Актуальные вопросы диагностики, лечения и профилактики наиболее распространенных заболеваний внутренних органов», в рамках которого совместно с соавторами принимали участие в конкурсе молодых ученых (Тюмень, 2005 г), на заседании Тюменского отделения «Научного общества специалистов клинической лабораторной диагностики» (Тюмень, 2005 г), на региональной научно-практической конференции «Детская и подростковая эндокринология перспективы и пути развития»

(Омск, 2005 г), на «Национальных Днях Лабораторной Медицины России» (Москва, 2005 г), на I съезде терапевтов Сибири и Дальнего Востока (Новосибирск, 2005г), региональной научно-практической конференции акушеров-гинекологов (Тюмень, 2006 г)

Внедрение результатов работы

Результаты работы внедрены в учебный процесс кафедры терапии с курсом эндокринологии ФПК и ППС, кафедры педиатрии ФПК и ППС ГОУ ВПО ТюмГМА, а также используются в работе практических врачей Центральной районной больницы г Тарко-Сале, Центральной городской больницы г Ноябрьска

Публикации

По теме диссертации опубликованы 7 печатных работ

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 130 страницах машинописного текста, состоит из обзора литературы, описания материалов и методов исследования, четырех глав собственных исследований, заключения, практических рекомендаций, библиографии Работа содержит 32 таблицы и 22 рисунка Список литературы включает 215 наименований, в том числе 83 отечественные и 132 зарубежные публикации

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы

Работа выполнена в ГОУ ВПО ТюмГМА Росздрава (ректор д м н, профессор Э А Кашуба), на базах лечебных учреждений района Крайнего Севера - Центральной районной больницы г Тарко-Сале (главный врач к м н И Г Пахомова), Центральной городской больницы г Ноябрьска (главный врач к м н В Н Афлетунов), многопрофильной клиники ТюмГМА (главный врач д м н , профессор Л А Суплотова), в лаборатории генетики ФГУ ЭНЦ Росмедтехнологий (директор член-корреспондент РАМН Г А Мельниченко), и является частью программы «Эпидемиология, скрининг, диагностика неклассических вариантов врожденной дисфункции коры надпочечников в женской популяции Западно-Сибирского региона»

Согласно поставленной цели исследования, в работе выделены два этапа На первом этапе проведен скрининг на неклассическую форму дефицита фермента 21-гидроксилазы среди женщин, проживающих в разных климатогеографических регионах Западной Сибири, и определена группа пациенток, имеющих повышенный риск наличия заболевания Второй этап посвящен молекулярно-генетической диагностике неклассической формы дефицита 21-гидроксилазы в сформированной на этапе скрининга группе ненок

В исследование включены ненки и русские женщины вне и в периоде гестации, т к беременность является провоцирующим фактором для манифестации неклассических форм ВДКН Вне гестации группы обследованных ненок и русских женщин сформированы методом случайной выборки, в периоде гестации группа ненок - методом сплошного скрининга,

группа русских женщин - методом случайных чисел Критерии включения ненки, русские женщины, принадлежность женщины к возрастным промежуткам от периода менархе (11-13 лет) и старше Критерии исключения другие национальности, наличие эндокринных заболеваний, прием гормональных препаратов, наличие хронической соматической патологии, возраст до 11 лет Исследование проводилось одномоментно, после получения письменного информированного согласия женщин Анализ течения беременности и родов проведен ретроспективно, по данным амбулаторных карт наблюдения беременных и историй ведения родов

Обследовано 449 ненок, проживающих на территории Пуровского района ЯН АО (общая численность ненок на данной территории составляет 1303, в т ч женщин репродуктивного возраста - 940) 369 женщин вне гестации и 80 ненок в периоде гестации Русские женщины, включенные в исследование, проживали в разных климатогеографических регионах Тюменской области - на юге Тюменской области и на территории Крайнего Севера Обследовано 530 русских женщин 432 вне гестации и 98 в гестационном периоде С учетом этапов развития женского организма сформированы 8 возрастных групп - от периода менархе до сенильного периода Беременные женщины дополнительно распределены по триместрам

На этапе скрининга использовались клинические и гормональные методы При сборе жалоб и анамнеза оценивался характер менструальной функции (возраст начала менархе, продолжительность менструального цикла, возраст наступления менопаузы, нарушения менструальной функции), репродуктивные нарушения (бесплодие, выкидыши) При анализе течения периода гестации и родов изучались ассоциированные с гиперандрогенией осложнения угроза невынашивания беременности, истмико-цервикальная недостаточность, хроническая маточно-плацентарная недостаточность, преждевременные роды

При объективном осмотре определялись рост, вес, индекс массы тела (ИМТ), отношение окружности талии к окружности бедер (ОТ/ОБ), показатели систолического и диастолического артериального давления, тип телосложения (феминное, маскулинное), наличие андрогенной дермопатии (гирсутизм, акне)

Для лабораторных исследований в качестве патогенетического маркера неклассической формы дефицита фермента 21-гидроксилазы использованы уровни 17-гидроксипрогестерона, в качестве маркера адреналовой гиперандрогении - показатели дегидроэпиандростерон-сульфата Изучалась зависимость секреции анализируемых метаболитов адреналового стероидогенеза от возраста женщины, фазы менструального цикла, наступления менопаузы, беременности, а также наличие этнических особенностей секреции дегидроэпиандростерон-сульфата и 17-гидроксипрогестерона

Забор крови для гормонального исследования проводился натощак из локтевой вены с 8-00 до 10-00 ч Сыворотку получали после ретракции сгустка и последующего центрифугирования при 1500 об/мин в течение 15 минут До проведения исследования сыворотка замораживалась и хранилась при температуре -20°С не более четырех недель Гормональное исследование

проводилось в лаборатории Центральной районной больницы г Тарко-Сале Содержание в сыворотке крови ДГЭА-С и 17-ОНП определялось с использованием тест-систем «ИФА - ДГЭА-сульфат» («Алькор Био», Санкт-Петербург), «DRG 17a-OH-Progesteron Е 1 А-1292» (США) Для обработки результатов использовался иммуноферментный анализатор открытого типа ChemWell Combo Awarness Thechology (США) Оценка уровней ДГЭА-С и 17-ОНП проводилась согласно рекомендуемым производителями тест-систем нормативам Уровень ДГЭА-С и 17-ОНП в периоде гестации оценивался согласно референтным интервалам, разработанным Н Ю Южаковой (2006) в рамках исследования «Эпидемиология, скрининг, диагностика неклассических вариантов врожденной дисфункции коры надпочечников в женской популяции Западно-Сибирского региона»

В результате скрининга сформирована группа риска ненок по неклассической форме дефицита фермента 21-гидроксилазы с учетом следующих критериев включения уровень ДГЭА-С и/или 17-ОНП, превышающий нормативный показатель вне беременности, уровень ДГЭА-С и/или 17-ОНП, превышающий нормативный показатель в течение беременности, репродуктивные нарушения (нерегулярный менструальный цикл, бесплодие, выкидыши) Критерии исключения для формирования группы риска по неклассической форме дефицита 21-гидроксилазы бесплодие по причине воспалительных заболеваний органов малого таза (заболевания, передаваемые половым путем, трубный фактор), все формы эндометриоза, гиперпролактинемия, гипоталямо-гипофизарная дисфункция, нарушение функции щитовидной железы, ожирение любого генеза, наступление беременности вследствие стимуляции овуляции или экстракорпорального оплодотворения Методом случайных чисел из общего числа женщин, имеющих повышенный риск неклассической формы дефицита 21-гидроксилазы, сформирована группа ненок для молекулярно-генетического исследования, по результатам которого изучен характер мутаций, ассоциация с фенотипом, распространенность заболевания

Молекулярно-генетическое исследование проведено на базе лаборатории генетики ФГУ ЭНЦ Росмедтехнологий (зав лабораторией к м н С А Прокофьев) Определялись мутации гена CYP21, приводящие к аминокислотным заменам, характерным для неклассических форм дефицита фермента 21-гидроксилазы (V281L, P30L, P453S), для классических форм ВДКН (30kb del, I2spl, I172N, R339H, Q318X, msl746, R483P), а также мутация P105L

Геномная ДНК выделялась из лейкоцитов периферической крови с использованием стандартных методов (N Gemmel, S Akiyama, 1996) Селективно амплифицировали фрагменты гена CYP21, используя экзон-специфические праймеры, подобранные на основании анализа нуклеотидной последовательности генома человека Полученные в результате амплификации специфические фрагменты ДНК использованы для генотипирования методом аллельспецифической полимеразной цепной реакции (A Wedell, Н Luthman, 1993)

Статистический анализ проводился при помощи пакета стандартных статистических программ STATISTICA, версия 6 0, а также программ статистического анализа Microsoft Excel, версия 7 0 Показатели в зависимости от нормальности распределения исследуемых переменных представлены в виде медианы (Me), 2,5-97,5% (персентилей), [95% ДИ] или среднего значения признака (М) и среднего квадратического отклонения (s) Для определения нормальности распределения признака использован тест Шапиро - Уилка Для сравнения двух независимых выборок использовался критерий Манна - Уитни (показатель U) При сравнении более двух независимых выборок использовался тест Краскелла - Уоллиса (критерий Н) Анализ взаимосвязи количественных признаков проведен с помощью коэффициента ранговой корреляции Спирмена (коэффициент г) Анализ относительных показателей проведен с помощью критерия х2 (хи-квадрат) через составление таблиц сопряженности Критический уровень значимости (р) при проверке статистических гипотез принимался равным 0,05

Результаты исследования, их обсуждение

Наиболее частыми проявлениями избытка андрогенов в организме женщины являются андрогенная дермопатия, вирильное телосложение, нарушения менструальной и репродуктивной функций, осложненное течение периода гестации В исследовании проведено сравнение распространенности клинических маркеров гиперандрогении в группах ненок и русских женщин

Изучение характера менструальной функции в обследованных группах ненок и русских женщин выявило отсутствие статистически значимых отличий в возрасте начала менструальной функции (р=0,345) и продолжительности менструального цикла (р=0,108), а также более ранний возраст наступления менопаузы у ненок (табл 1)

Таблица 1

Показатели менструальной функции у ненок _и русских женщин (Mis) _

Группы Показатели —___ Ненки Русские Отличия (U, р)

Возраст начала менархе, лет 13,4±1,7 13,1±1,4 3416, 0,345

Продолжительность цикла, дни 27,2±3,3 28,4±3,3 3892, 0,108

Возраст менопаузы, лет 44,1±1,05 48,5±0,98 3683,0,010

Гиперандрогения часто сопровождается поздним началом менструальной функции В нашем исследовании начало менархе в возрасте старше 15 лет отмечалось у 11% ненок и 4,7% русских женщин (%2= 2,5, р=0,112)

В исследовании установлено, что у ненок по сравнению с русскими женщинами чаще обнаруживаются нарушения менструальной функции (17% и 10,5% соответственно ^2=1,6, р=0,201) и бесплодие (10% и 8,7% соответственно у?=0,2, р=0,661)

Изучение частоты андрогенассоциированных осложнений периода гестации выявило, что максимальное количество патологических изменений связано с угрозой невынашивания беременности в обеих группах У ненок данное осложнение регистрировалось реже - в 20% случаев беременности по сравнению с 48% у русских женщин (%2=8,19, р=0,008) Частота возникновения хронической маточно-плацентарной недостаточности составила 6% у ненок и 2% у русских женщин (х2=1,28, р=0,258) Завершилась беременность преждевременными родами у 6,7% ненок, и ни одна беременность в группе русских женщин (х2=3,44, р=0,063)

Объективное обследование показало, что все женщины имеют гиноидный морфотип без признаков маскулинизации Статистически значимыми являются более низкие значения роста (р=0,000) и веса у ненок (р=0,000) По массо-ростовым соотношениям, отношению окружности талии к окружности бедер статистически значимых отличий у ненок и русских женщин не обнаружено (табл 2)

Не обнаружено статистически значимых отличий в частоте патологического гирсутизма, диагностированного у 3% ненок и 4,7% русских женщин (%2=0,35, р=0,556)

Таблица 2

Антропометрические показатели у ненок и русских женщин _(Ме, 95 % ДИ)_

Показатели Ненки Русские Отличия (U, р)

Количество, чел 100 86 -

Рост, см 153 [142-164] 160 [155-170] 1196, 0,000

Вес, кг 55 [44-76] 60Г49-831 3142,0,000

ИМТ, кг/м"2 23,5 Г18-33,6] 23,6 [19,6-31,3] 4087, 0,552

ОТ/ОБ 0,80 Г0,73-0,89] 0,82[0,73-0,89] 3808, 0,177

По данным литературы, клиническая картина неклассической формы дефицита 21-гидроксилазы не имеет патогномоничных симптомов, поэтому позволяет лишь с некоторой долей вероятности сформировать группу риска по наличию врожденных нарушений стероидогенеза, требующей дальнейшего лабораторного обследования

Результаты исследования уровней ДГЭА-С в сыворотке крови у русских женщин, проживающих в разных климатогеографических регионах Западной Сибири, показали, что секреция данного андрогена зависит от возраста женщины (рис 1) Увеличение секреции ДГЭА-С начинается с периода полового созревания, максимальная концентрация ДГЭА-С определяется в активном репродуктивном периоде (18-29 лет), далее постепенно снижается, достигая минимальных значений в возрасте 70 лет и старше Статистически значимые отличия определяются практически во всех возрастных периодах,

кроме 50-69 лет, что согласуется с литературными данными об умеренном снижении секреции ДГЭА-С после 50 лет.

7 6

I 5

5 У.

V 4 <

(_ 3 ч

2 1 о

Тест Краскела-Уоллиса: Н (6)= 144,8092 р=0,000 р=0,001

р=0,01

р=0,01

Медиана | 25%-75% Мин-Макс

р=0,01

р=0,44

р=0,01

ВОЗРАСТ, лет

Рис. 1. Возрастная динамика секреции ДГЭА-С у русских женщин

Уровень ДГЭА-С в крови женщины не зависит от фазы менструального цикла, его наличия или отсутствия (табл. 3).

Таблица 3

Содержание ДГЭА-С (мкг/мл) в сыворотке крови, в зависимости от

Возраст, лет 13-19 20-29 30-39 40-49

Фолликулиновая фаза 1,85 [0,37-3,5] 2,45 [1,05-4,0] 1,6 [0,56-4,2] 1,4 [0,34-2,6]

Лютеиновая фаза 2,15 [0,84-4,8] 2,16 >2-4,7] 1,7 [0,33-4,0] 1,55 [0,41-2,97]

Менопауза — — 1,25 [0,45-1,91

Отличия между группами (Н; р) 1,0; 0,28 1,0; 0,42 1,0; 0,33 2,0; 0,31

Секреция ДГЭА-С у русских женщин, проживающих в южных регионах Тюменской области и в условиях Крайнего Севера, не имеет статистически значимых отличий в паритетных по возрасту группах (рис. 2).

3.2

ч 2.8 £

а 2.4

•« 2,0

х

я

I '-6

— ¡,2 и

< 0,8

т

и

0,4

0,0

р=0,76 —Тарко-Сале Ноябрьск • Тюмень

р=0,87 р—0,41 р=0,22

30-39 40-49

ВОЗРАСТ, лет

Рис. 2. Возрастная динамика уровня ДГЭА-С в группах женщин, проживающих в различных климатогеографических регионах Западной Сибири

Анализ секреции 17-ОНП у всех русских женщин, проживающих в различных климатогеографических регионах Западной Сибири, выявил зависимость уровней данного метаболита от фазы менструального цикла - в лютеиновую фазу менструального цикла значения 17-ОНП выше, чем в фолликулиновую (р<0,05). С наступлением менопаузы секреция 17-ОНП снижается (р<0,05). Не выявлено зависимости уровня 17-ОНП от возраста (табл. 4).

Таблица 4

Содержание 17-ОНП (нг/мл) в сыворотке крови девочек и женщин

в различные возрастные периоды и фазы менструального цикла _______ (Ме; 2,5-97,5%) ___

Возраст, лет Фолликулиновая фаза Лютеиновая фаза Менопауза Отличия (Н; р)

14-17 1,18[0,97-1,821 1,62[0,7—3,2] - 1; 0,009

18-29 1,31 [0,76-2,18] 1,92[0,46-3,91 - 1; 0,002

30-39 0,96[0,56-2,741 1,44[0,33—2,85] - 1; 0,030

40-49 0,93[0,34-1,7] 1,32[0,41-2,971 0,67[0,41—0,93] 2; 0,001

50-59 - - 0,67[0,26-1,5] -

60-69 - - 0,69[0,38—1,76] -

70 и более - - 0,57[0,23—1,42] -

Отличия 3; 0,3 3; 0,13 3; 0,61

(Н;р)

Секреция 17-ОНП в паритетных по фазам менструального цикла группах женщин различных климатогеографических регионов Западной Сибири статистически значимых отличий не имеет (табл. 5).

Таблица 5

Содержание 17-ОНП (нг/мл) в сыворотке крови у женщин, проживающих в различных климатогеографических регионах _ Западной Сибири (Ме, 95% ДИ)__

Фаза цикла Юг Тюменской области г Ноябрьск (ЯНАО) г Тарко-Сале (ЯНАО) Отличия (Н,р)

Фолликулиновая 1,12 [1,04, 1,371 1,31 [0,86, 1,51 0,92[0,6, 1,42] 2, 0,06

Лютеиновая 1,69Г 1,45, 2,221 2,01[1,33, 2,41 1,67[1,41,2,181 2, 0,69

Менопауза 0,64[0,49, 0,731 0,68[0,36,0,871 0,73[0,45,0,98] 2, 0,61

В результате исследования секреции ДГЭА-С у ненок также выявлена зависимость уровней данного андрогена от возраста До 20 лет связь уровней ДГЭА-С и возраста имеет положительный характер (г=0,438, р=0,001), после 20 лет корреляционная связь между анализируемыми показателями меняется на отрицательную (г= -0,35, р=0,000) Общие тенденции секреции ДГЭА-С в виде периодов пика концентрации, снижения уровней ДГЭА-С, стабильной секреции и дальнейшего снижения уровня ДГЭА-С одинаковы для русских женщин и ненок Однако у ненок все изменения секреции ДГЭА-С происходят с опережением до 10 лет по сравнению с русскими женщинами

У ненок по сравнению с паритетными по возрасту группами русских женщин отмечаются более низкие показатели ДГЭА-С практически во всех возрастных промежутках, за исключением 13-16, 17-20 и 50-59 лет (рис 3)

ВОЗРАСТ, лет

Рис 3 Возрастная динамика уровней ДГЭА-С у ненок и русских женщин

Исследование уровней 17-ОНП у ненок выявило общие с русскими женщинами тенденции секреции данного метаболита зависимость уровней 17-ОНП от фазы менструального цикла, снижение секреции в менопаузе, отсутствие зависимости уровня 17-ОНП от возраста женщины (табл 6)

Таблица 6

Уровни 17-ОНП в сыворотке крови женщин в различные возрастные _периоды и фазы менструального цикла (Ме, 2,5-97,5%)_

Возраст, лет Фолликулииовая Лютеиновая Менопауза Отличия (Н;Р)

14-17 1,2 [0,1-2,0] 1,7[0,2-5,9] - 1; 0,025

18-29 1,1 Г0,1—1,8] 1,95 [0,3-4,9] - 1; 0,000

30-39 1,2[0,3-2,2] 1,6 [0,3-5,2] - 1; 0,000

40-49 1,0 [0,1-1,4] 1,4 [0,6-3,0] 0,7 [0,1-1,2] 2; 0,000

50-59 - - 0,5 [0,2-1,7] -

60-69 - - 0,3 [0,2-2,2] -

Отличия (Н; р) 3; 0,231 3; 0,758 2; 0,643 -

Статистически значимых отличий показателей 17-ОНП в паритетных по фазам менструального цикла группах ненок и русских женщин не выявлено (рис. 4).

_р=0,493

И

Фолликулииовая фаза Лютеиновая фаза Менопауза

□ Ненки В Русские

Рис. 4. Секреция 17-ОНП у ненок и русских женщин в зависимости от фазы менструального цикла и в менопаузе (Ме)

В исследовании определены общие закономерности секреции ДГЭА-С и 17-ОНП вне гестации у женщин, проживающих в различных регионах Западной Сибири, что позволяет использовать для диагностики неклассических вариантов ВДКН принципы, разработанные для женской популяции г. Тюмени. Этнические особенности секреции ДГЭА-С учтены при оценке показателей данного андрогена у ненок и формировании группы риска по неклассической форме ВДКН. Превышение референтных значений ДГЭА-С определено у 4% ненок. Для оценки показателей 17-ОНП у ненок использованы существующие нормативные значения, рекомендованные производителями тест-систем. Превышение нормативных значений 17-ОНП определено у 11% ненок.

Беременность сопровождается изменениями концентрации стероидов, что требует уточнения подходов в лабораторной диагностике неклассических вариантов ВДКН в этот период. В исследовании установлено, что во время гестации сохраняется зависимость уровней ДГЭА-С от возраста, что подтверждается наличием отрицательной корреляционной связи у ненок (г= -0,33; р=0,003) и русских женщин (г= -0,35; р=0,02). Выявлена отрицательная корреляционная связь между уровнем ДГЭА-С и сроком гестации у ненок (г= -0,404; р=0,000) и у русских женщин (г= -0,276; р=0,007).

Секреция ДГЭА-С у ненок и русских женщин в соответствующих триместрах беременности статистически значимых отличий не имеет (рис. 5).

Рис. 5. Уровни ДГЭА-С у ненок и русских женщин по триместрам беременности (Ме)

Секреция 17-ОНП в периоде гестации не зависит от возраста, что подтверждается отсутствием статистически значимых корреляционных взаимосвязей уровней данного метаболита и возраста у ненок (г= -0,03; р=0,729) и у русских женщин (г=0,229; р=0,823). Выявлено, что секреция 17-ОНП значительно увеличивается в третьем триместре беременности в обеих группах женщин (рис. 6).

ТРИМЕСТР БЕРЕМЕННОСТИ ТРИМЕСТР БЕРЕМЕННОСТИ

НЕНКИ РУССКИЕ

Рис. 6. Секреция 17-ОНП по триместрам беременности у ненок и русских женщин

Статистически значимых отличий в паритетных по триместрам беременности группах ненок и русских женщин не выявлено (рис 7)

р=0,85

р=0,63 м

р=0,2

• ненки

-И- русские

I 2 3

ТРИМЕСТР БЕРЕМЕННОСТИ

Рис 7 Уровни 17-ОНП у ненок и русских женщин по триместрам беременности

В результате исследования динамики секреции ДГЭА-С и 17-ОНП в периоде гестации не определено достоверных различий концентрации аналитов у ненок и русских женщин, что позволяет использовать для диагностики неклассических форм ВДКН у ненок в периоде гестации нормативы, разработанные для русских женщин

Проведенные клинические и лабораторные исследования позволили сформировать группу риска ненок по неклассическому варианту врожденной дисфункции коры надпочечников для молекулярно-генетического исследования

Впервые для диагностики неклассической формы недостаточности 21-гидроксилазы в женской популяции ненцев использован метод молекулярно-генетического анализа, позволяющего исключить ложноположительные случаи заболевания при повышенных уровнях промежуточных метаболитов стероидного биосинтеза вне и в периоде гестации Молекулярно-генетический анализ выявил 11 случаев одной из мутаций I2spl, P30L, P453S, P105L, Q318X, insl746, в том числе по одному случаю сочетания мутаций I2spl/P105L/Q318X/msl746 и P30L/P453S

В результате исследования у ненок не обнаружено ни одного случая наиболее часто встречающихся в европейской популяции мутаций 30kb del и V281L Молекулярно-генетическое исследование, проведенное в г Тюмени, показало, что аминокислотная замена валина на лейцин в 281 положении и обнаружение химерного гена 30kb del также являются наиболее частыми мутациями в группе русских женщин с неклассической формой дефицита фермента 21-гидроксилазы (С В Фомина, 2007) Отсутствие мутации V281L

описано в группе японских женщин с неклассической формой дефицита 21-гидроксилазы (W Holler at all, 1985)

Известно, что неклассическая форма ВДКН может быть обусловлена одной или чаще сочетанием двух мутаций разной степени тяжести, как правило, «умеренной» и «тяжелой» По результатам молекулярно-генетического исследования женщин с неклассической формой дефицита 21-гидроксилазы г Тюмени у двух женщин заболевание было обусловлено наличием одной мутации, у четырех женщин - сочетанием двух мутаций (С В Фомина, 2007) Молекулярно-генетический анализ в популяции ненок выявил у одной женщины с неклассической формой дефицита 21-гидроксилазы сочетание четырех мутаций, три из которых относятся к числу «тяжелых»

Спектр и частота обнаруженных мутаций представлена в табл 7

Таблица 7

Частота мутаций гена CYP21 в группе исследования

мутация всего, чел всего,%

I2spl 1 2,6%

P105L 5 13,2%

P30L/P453S 1 2,6%

I2spl/ Р105L/Q318X/ins 1746 1 2,6%

конфигурация R гена СYP21 7 18,4%

В нашем исследовании обнаружены следующие конфигурации гена - N. ОТ, ЫРЛ, РГ1, РБЯ Необычной для данного гена является конфигурация II, зафиксированная у 7 обследованных женщин - у четырех из группы с повышенными лабораторными показателями и трех из группы с нормальными уровнями исследуемых метаболитов и репродуктивными нарушениями

По данным молекулярно-генетического исследования, неклассическая форма недостаточности 21-гидроксилазы диагностирована у 1 женщины из числа пациенток с повышенными уровнями 17-ОНП вне гестации (табл 8)

Таблица 8

Взаимосвязь обнаружения мутаций, конфигураций гена СУР21

и уровней ДГЭА-С и 17-ОНП у женщин, обследованных вне гестации

№ пациентки мутация конфигурация гена ДГЭА-С, мкг/мл 17-ОНП, нмоль/мл

21 Не обнаружена R 5,3 6,06

10 Не обнаружена обычная 2,7 14,8

23 Не обнаружена обычная 4,3 29,1

28 Не обнаружена R 1,3 8,2

36 Не обнаружена обычная 0,5 8,8

20 P30L/P453S R 1,1 8,5

У остальных 4 пациенток, имеющих высокий базальный уровень 17-ОНП, рассматриваемый в качестве биохимического маркера диагностики

неклассической формы 21-гидроксилазной недостаточности, мутаций в кодирующей части гена обнаружено не было Возможно, причиной дефекта стероидного синтеза в данном случае являются мутации, не определяемые в нашем исследовании Конфигурация Я гена СУР21 в группе женщин с повышенной базальной концентрацией 17-ОНП в соотношении 2/3 встречается с обычной Различий по частоте встречаемости подобной конфигурации гена среди пациенток, как с нормальными, так и повышенными значениями 17-ОНП, не обнаружено (р>0,05)

В группе беременных женщин выявлено 2 случая аминокислотных замен, характерных для неклассической формы дефицита 21-гидроксилазы (табл 9)

Таблица 9

Взаимосвязь обнаружения мутации, конфигурации гена СУР21 и уровней ДГЭА-С и 17-ОНП у ненок, обследованных во время

беременности

№ пациентки мутация конфигурация гена ДГЭА-С, мкг/мл 17-ОНП, нг/мл

11 Не обнаружена обычная 1,8 более 20

9 Р105Ь обычная 1,3 12,3

15 Не обнаружена обычная 0,4 16,4

3 Не обнаружена обычная 0,8 более 20

5 12вр1 обычная 2,4 более 20

26 Не обнаружена обычная 1,7 более 20

2 Не обнаружена обычная зд 7,1

14 Не обнаружена обычная 4,7 более 20

1 Не обнаружена обычная 2,3 более 20

8 Р105Ь обычная 6,4 2,9

17 Не обнаружена Я 0,7 более 20

18 Не обнаружена обычная 0,8 14,2

6 12зр1/Р 10517(^31 вХ/тв 1746 обычная 0,5 более 20

13 Не обнаружена обычная 0,1 более 20

16 Не обнаружена обычная 0,5 более 20

4 Р105Ь обычная 1,6 более 20

24 Не обнаружена обычная 4,5 3,4

25 Не обнаружена обычная 1,1 более 20

У остальных 86,7% женщин повышение концентрации 17-ОНП во время беременности, вероятно, является не проявлением заболевания, а следствием изменяющегося при беременности стероидогенеза

По результатам молекулярно-генетического исследования в группе женщин с репродуктивными нарушениями и нормальными уровнями ДГЭА-С и 17-ОНП не выявлено ни одного случая неклассической формы дефицита фермента 21-гидроксилазы У трех женщин данной группы обнаружена конфигурация Я и у одной мутация Р105Ь гена СУР21 (табл 10)

Таблица 10

Взаимосвязь характера мутации, конфигурации гена СУР21 и уровней ДГЭА-С и 17-ОНП в группе женщин с репродуктивными

№ пациентки мутация конфигурация гена ДГЭА-С, мкг/мл 17-ОНП, нмоль/мл

27 Не обнаружена обычная 2,6 5,5

33 Не обнаружена обычная 3,0 3,6

38 Не обнаружена обычная 3,8 5,5

22 Не обнаружена Я 3,7 3,6

37 Не обнаружена обычная 2,3 3,9

31 Не обнаружена обычная 0,8 6,06

12 Не обнаружена Я 1,1 4,2

35 Не обнаружена обычная 3,9 4,5

29 Не обнаружена обычная 1,0 3,6

34 Не обнаружена обычная 1,3 3,9

7 Р105Ь Я 0,9 3,6

30 Не обнаружена обычная 2,2 2,1

Замена пролина на лейцин в 105 положении рассматривается в исследовании как проявление полиморфизма гена СУР21, определенного также в популяции русских женщин г Тюмени Данная мутация не ассоциирована с повышенными уровнями ДГЭА-С (г=0,135, р=0,321) и 17-ОНП (г=0,079, р=0,138), с какими-либо репродуктивными нарушениями и осложнениями гестационного периода

Конфигурация Я гена СУР21 не ассоциирована с повышенными показателями метаболитов адреналового стероидогенеза ДГЭА-С (г=0,167, р=0,341) и 17-ОНП (г=0,312, р=0,134) Не выявлено корреляционных связей данной конфигурации гена с носительством определяемых в рамках исследования мутаций (г=0,210, р=0,084) Конфигурация Л гена СУР21 не ассоциирована с нарушениями в репродуктивной сфере и формированием андрогензависимых осложнений гестационного периода не выявлено статистически значимых взаимосвязей данной конфигурации гена с бесплодием (г=0,135, р=0,091), выкидышами (г=0,231, р=0,114), мертворождениями (г=0,245, р=0,084), преждевременными родами (г=0,312, р=0,204), угрозой невынашивания беременности (г=0,045, р=0,346) Ассоциированным с конфигурацией Я гена СУР21 является позднее начало менструальной функции (г=0,394, р=0,025)

Носительство мутаций, характерных для неклассической формы дефицита 21-гидроксилазы, в настоящем исследовании у ненок ассоциируется с поздним началом менструальной функции (г=0,557, р=0,000), бесплодием (г=0,367, р=0,023) и выкидышами (г=0,725, р=0,000)

Не выявлено зависимости между выраженностью репродуктивных нарушений и количеством мутаций гена СУР21 у женщин с подтвержденной

молекулярно-генетическим исследованием неклассической формой дефицита 21-гидроксилазы У пациентки с заболеванием, обусловленным сочетанием двух мутаций (Р30Ь/Р4538), отмечалось позднее начало менархе, выкидыш и бесплодие Фенотипическим проявлением сочетания четырех мутаций (12зр1/Р 105Ь/<3318Х/1ПЗ1746) был выкидыш

Результаты проведенного молекулярно-генетического исследования позволяют говорить о большей вероятности диагностики неклассической формы дефицита 21-гидроксилазы у ненок, имеющих уровень 17-ОНП вне гестации выше 6,0 нмоль/мл, в периоде гестации выше 12 нг/мл Вероятность наличия неклассической формы дефицита фермента 21-гидроксилазы у ненок, имеющих уровни 17-ОНП выше указанных показателей вне гестации, составила 20%, в периоде гестации - 13,3%

Рассматривая результаты молекулярно-генетического анализа в качестве стандарта диагностики врожденной ферментопатии, в исследовании определена распространенность заболевания, составившая 11,5% в группе женщин с повышенными уровнями метаболитов адреналового стероидогенеза и равная 2% в общей популяции ненок Полученные данные подтверждают предположение о высокой распространенности неклассической формы дефицита фермента 21-гидроксилазы в малочисленной, относительно замкнутой популяции ненцев вследствие накопления мутаций гена СУР21, и свидетельствуют о значимой роли дефицита 21-гидроксилазы в структуре репродуктивных нарушений в данной популяции

Выводы

1 Секреция адреналовых андрогенов ДГЭА-С и 17-ОНП у русских женщин, проживающих на юге Тюменской области и в условиях Крайнего Севера, не имеет статистически значимых отличий (р>0,05), независимо от длительности проживания в условиях Крайнего Севера Секреция ДГЭА-С в женской популяции ненцев имеет возрастные особенности, а также характеризуется статистически значимыми более низкими по сравнению с русскими женщинами уровнями данного андрогена в большинстве возрастных групп (р<0,05)

2 В периоде гестации секреция метаболитов адреналового стероидогенеза ДГЭА-С и 17-ОНП у ненок и русских женщин не имеет статистически значимых отличий (р>0,05) Секреция ДГЭА-С зависит от возраста и срока гестации, уровень 17-ОНП определяется сроком гестации и не зависит от возраста

3 Для неклассической формы дефицита фермента 21-гидроксилазы в женской популяции ненцев характерны мутации гена СУР21 12зр1, РЗОЬ, Р4538, 0»318Х, тз1746 Мутация Р105Ь встречается с частотой 13,2% и рассматривается как вариант нормального полиморфизма гена СУР21

4 Характер мутаций при неклассической форме дефицита 21-гидроксилазы в женской популяции ненцев имеет этнические особенности - отсутствие наиболее распространенных в европейских и русской популяциях мутаций У281Ь и ЗОкЬёе!

5 Ассоциированными с неклассической формой дефицита фермента 21-гидроксилазы в женской популяции ненцев являются позднее начало менструального цикла, выкидыши и бесплодие Конфигурация Я гена СУР21 не ассоциируется с репродуктивными нарушениями и носительством определяемых в рамках исследования мутаций, характерных для неклассической формы дефицита фермента 21-гидроксилазы

6 Распространенность неклассической формы дефицита 21-гидроксилазы, подтвержденная молекулярно-генетическим методом, в женской популяции ненцев составляет в группе с гиперандрогенией 11,5%, в общей женской популяции ненцев - 2%

Практические рекомендации

1 Оценка показателей ДГЭА-С и 17-ОНП для формирования группы риска по неклассической форме дефицита фермента 21-гидроксилазы у русских женщин, имеющих различный стаж проживания в условиях Крайнего Севера, может основываться на нормативах, разработанных для русских женщин других климатогеографических регионов

2 Диагностика адреналовой гиперандрогении в женской популяции ненцев должна проводиться на основании нормативов, учитывающих этнические особенности секреции ДГЭА-С При оценке показателей 17-ОНП возможно использование нормативных показателей, разработанных для русских женщин

3 Формирование группы риска по неклассической форме дефицита фермента 21-гидроксилазы у ненок и русских женщин Крайнего Севера в периоде гестации может основываться на общих подходах и нормативных значениях ДГЭА-С и 17-ОНП, разработанных для русских женщин других климатогеографических регионов

4 При проведении дифференциальной диагностики для выявления причин репродуктивных нарушений в женской популяции ненцев следует учитывать, что женщины с поздним началом менструальной функции, бесплодием и выкидышами в анамнезе, имеющие повышенный базальный уровень 17-ОНП, являются группой риска по неклассической форме дефицита фермента 21-гидроксилазы Для постановки диагноза женщинам группы риска рекомендовано проведение молекулярно-генетического исследования

5 При проведении молекулярно-генетического исследования у женщин ненок следует учитывать, что неклассическая форма дефицита фермента 21-гидроксилазы наиболее часто обусловлена мутациями 12зр1, РЗОЬ, Р4533, (2318Х, шя 1746 Обнаружение конфигурации Я гена СУР21 не является подтверждением наличия у женщины неклассической формы дефицита фермента 21-гидроксилазы

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Возрастная динамика дегидроэпиандростерон-сульфата в женской популяции г Тюмень / Л А Суплотова, Е Б Храмова, О Б Макарова, Н Ю Южакова, О Б Старкова, Н В Аксенова // Материалы IV Терапевтического форума «Актуальные вопросы диагностики, лечения и профилактики наиболее распространенных заболеваний внутренних органов», Тюмень, 2005, с 71

2 Возрастная динамика уровней дегидроэпиандростерон-сульфата и 17-гидроксипрогестерона у девочек и женщин, проживающих на территории Западной Сибири /НЮ Южакова, Е Б Храмова, О Б Макарова, С Н Суплотов, О Б Старкова, Н В Аксенова // «Клиническая и лабораторная диагностика», № 10, 2005, с 66

3 Возрастные особенности содержания дегидроэпиандростерон-сульфата в сыворотке крови женщин, проживающих на территории Западной Сибири / Л А Суплотова, Е Б Храмова, Н Ю Южакова, О Б Макарова, Н В Аксенова Е А Баглык // «Медицинская наука и образование Урала», 2006, № 1, с 72-75

4 Клинико-биохимическая диагностика гиперандрогении надпочечникового генеза в женской популяции / Л А Суплотова, Е Б Храмова, Н Ю Южакова, С В Фомина, Н В Аксенова // «Медицинская наука и образование Урала», 2006, № 4, с 86-90

5 Некоторые особенности гиперандрогении надпочечникового генеза в популяции женщин ненок / Л А Суплотова, Н В Аксенова, Е Б Храмова, А А Романов // «Медицинская наука и образование Урала», 2007, № 3, с 62-64

6 Секреция маркеров адреналовой гиперандрогении в периоде гестации у женщин ненок / Е Б Храмова, Н В Аксенова, Л А Суплотова // «Медицинская наука и образование Урала», 2007, № 3, с 77-79

7 Спектр мутаций гена СУР21 при дефиците фермента 21-гидроксилазы у отдельных представительниц коренного и пришлого населения Западной Сибири / Е Б Храмова, Л А Суплотова, Н В Аксенова, С В Фомина // Сборник материалов конгресса «Человек и лекарство Урал - 2007», Тюмень, 2007, с 29-31

Изготовлено в МУП «Дом печати «Северная вахта» 629807, ЯНАО, гНоябрьск, промзона, панель 1а Тел /факс (3496) 35-46-22

Подписано в печать 15 01 2008 Бумага «SvetoCopy» Формат 21x29,7 Печ л 6,0 Гарнитура Times New Roman Печать электрография Заказ 30 "Шраж 100