Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Нарушение механизмов репарации повреждений ДНК в формировании химиочувствительности злокачественных новообразований

На правах рукописи

Рамазанов Булат Рашнтович

НАРУШЕНИЕ МЕХАНИЗМОВ РЕПАРАЦИИ ПОВРЕЖДЕНИЙ ДНК В ФОРМИРОВАНИИ ХИМИОЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЙ

14.03.03 — патологическая физиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 8 АВГ 2014

005552065

Казань-2014

005552065

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Казанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель: заведующий кафедрой патофизиологии при

ГБОУ ВПО Казанский ГМУ Минздрава России, д-р мед. наук, профессор Бойчук Сергей Васильевич

Официальные оппоненты: Артифексова Анна Алексеевна - д-р мед. наук,

профессор, заведующая кафедрой

патологической анатомии ГБОУ ВПО НижГМА Минздрава России.

Ризванов Альберт Анатольевич — д-р биол. наук, профессор кафедры генетики ФГАОУ ВПО Казанский (Приволжский) федеральный университет.

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное

учреждение высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Защита диссертации состоится «19» сентября 2014 г. в 12:00 часов на заседании диссертационного Совета Д 208.034.01 при ГБОУ ВПО Казанский ГМУ Минздрава России (420012, г. Казань, ул. Бутлерова, д. 49).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Казанского государственного медицинского университета (420012,

г. Казань, ул. Бутлерова, д. 49, корпус Б), www.kgmu.kcn.ru Автореферат разослан « ..#7. » 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук,

профессор Л.Д. Зубаирова

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы

Химио- и радиорезистентность злокачественных новообразований на проводимую терапию остается одной из наиболее актуальных проблем современной клинической и экспериментальной онкологии. Особое место в этой проблеме занимает не только изначально существующая резистентность опухолевых клеток, но также их способность приобретать устойчивость к противоопухолевым агентам в процессе лечения (В. А. Зинченко и соавт., 2005). Во многом, это обусловлено тем фактом, что опухолевые клетки способны «переживать» повреждения ДНК (т.е. генотоксический стресс), возникающие в результате воздействия химиопрепаратов и/или лучевой терапии (H.L. Tang et al., 2012). Это достигается в результате запуска в опухолевых клетках различных механизмов репарации поврежденных участков ДНК, в частности, за счет активации процессов гомологичной и негомологичной рекомбинации ДНК (A.J. Hartlerode et al., 2009; S.P. Jackson 2009; В. Pardo et al., 2009). Результатом этого является повышение выживаемости опухолевых клеток, что клинически проявляется неуклонным ростом опухолевой массы и клиническим прогрессированием заболевания, несмотря на проводимую химио- и радиотерапию. Осложняет положение и генетическая нестабильность опухолевых клеток, которые, имея высокий уровень спонтанных мутаций, легко подвергаются мутагенному воздействию химиопрепаратов и продуктов их метаболизма (С. Lengauer et al, 1998). Это в значительной мере усиливает гетерогенность опухолевой популяции, способствует генерации еще большего числа резистентных к химиотерапии опухолевых клеток, усиливает их способность к метастазированию и возникновению рецидивов на фоне продолжающейся химиотерапии (G.I. Solyanik et al., 2000).

В сложившейся ситуации продолжение проведения химио- и радиотерапии не только не способствует улучшению состояния больных

злокачественными новообразованиями, но и приводит к развитию побочных эффектов, обусловленных выраженными цитотоксическими свойствами большинства современных химиопрепаратов.

В настоящее время широкое распространение получил «персонализированный подход» терапии многих заболеваний, в том числе и злокачественных новообразований, который базируется на особенностях возникновения и патогенеза заболевания отдельно взятого организма или небольшой группы. Это позволяет подобрать наиболее эффективную терапию пациенту с конкретным новообразованием, основываясь на генетическом анализе опухоли и уровне экспрессии «особых» белков. Одним из перспективных направлений в обеспечении повышения эффективности нехирургических методов лечения онкологических больных является разработка методов оценки и повышения чувствительности опухолевых клеток к проводимой химиотерапии, которые базируются на использовании дефектов в системе репарации повреждений ДНК для достижения наиболее результативного противоопухолевого эффекта.

Установлено, что дефекты в системе гомологичной рекомбинации ДНК с одной стороны являются предрасполагающим фактором в возникновении злокачественных новообразований. С другой стороны, онкологические больные, имеющие таковые дефекты, являются наиболее восприимчивыми к воздействию определенных групп цитотоксических препаратов по причте существующих дефектов в системе репарации повреждений ДНК в опухолевых клетках, возникающих в результате проведения химиотерапии. Данный феномен нашел отражение в концепции «синтетической летальности», согласно которой наличие мутации в одном из двух «летальных» генов никак не отражается на жизнедеятельности клеток, однако мутации в обоих «летальных» генах приводят к гибели этих клеток (\¥.С. 1г. КаеНп, 2005). В соответствии с данной концепцией, химиопрепараты, разработанные по данному принципу, должны вызывать гибель исключительно раковых клеток, имеющие мутации в таковых «летальных генах».

Наиболее перспективным примером использования данной концепции в терапии злокачественных новообразований является монотерапия препаратами ингибиторами PARP (поли(АДФ-рибоза)-полимеразы) пациентов с мутациями генов BRCA-1 и BRCA-2. Данная группа имеет высокую чувствительность к ингибиторам PARP за счет подавлепия процессов гомологичной рекомбинации повреждений ДНК (Н.Е. Bryant et al., 2005; S. Burma et al., 2001).

Дальнейшие исследования показали, что дефекты в системе гомологичной рекомбинации встречаются гораздо чаще и обнаруживаются у больных злокачественными новообразованиями (Q. Wei et al., 2000).

Особое внимание следует уделить белкам-онкосупрессорам, которые участвуют в процессах гомологичной рекомбинации. Так, белок PML является одним из многофункциональных белков ядра, принимающим участие в транскрипции генов, противовирусном ответе, онкогенезе, клеточном старении, регуляции апоптоза и репарации ДНК (R. Bernardi et al., 2007).

Исследования, проведенные ранее, демонстрируют, что PML взаимодействует со многими факторам вовлеченными в репарацию двунитевых разрывов но механизму гомологичной рекомбинации, в том числе и RAD51 (S. Boichuk et al., 2011). Таким образом, изучение взаимосвязи вышеперечисленных белков и их роли в репарации ДНК, а также формировании химиочувствительности опухолевых клеток, является актуальным и перспективным направлением в фундаментальной онкологии. Цель исследования

Изучить роль белков PARP и PML в механизмах репарации повреждений ДНК в условиях генотоксического стресса, вызываемого химиопрепаратами. Задачи исследования:

1. Произвести нокдаун белков PML и PARP методом РНК-интерференции и оцепить жизнеспособность клеток на фоне «выключения» экспрессии вышеназванных белков.

2. Исследовать взаимосвязь между экспрессией белка PML и активностью поли(АДФ-рибоза)-полимераз (PARP) в физиологических условиях, а

также в условиях генотоксического стресса, вызываемого химиопрепаратами.

3. Охарактеризовать роль белков РМЬ и РАК.Р в репарации повреждений ДНК, а также жизнеспособность нормальных и опухолевых клеток в условиях генотоксического стресса.

4. Изучить способность белка РМЬ регулировать процессы клеточного старения в ответ на генотоксический стресс, индуцированный химиопрепаратами.

Научная новизна исследования:

В рамках проведенной диссертационной работы впервые получены данные о повышении активности поли(АДФ-рибоза)-полимераз (РАКР) в условиях генотоксического стресса и нокдауна белка РМЬ. Полученные данные о нарушениях процессов репарации некоторых типов повреждений ДНК, а именно, ее двунитевых разрывов, в условиях сочетанного нокдауна белков РАЯР и РМЬ, также получены впервые. Представленные в настоящей работе данные раскрывают новые молекулярные механизмы репарации двунитевых разрывов ДНК в опухолевых клетках и открывают перспективы для повышения чувствительности опухолевых клеток к воздействию генотоксических факторов, а именно, химиопрепаратов. Полученные данные дополняют современные представления о молекулярных механизмах феномена "синтетической летальности" и подтверждают координирующую роль белка РМЬ в репарации двунитевых разрывов ДНК по механизму гомологичной рекомбинации. В настоящее работе впервые была проведена комплексная оценка жизнеспособности нормальных и опухолевых клеток на фоне единичного и комбинированного нокдауна вышеназванных белков, как в физиологических условиях, так и на фоне генотоксического стресса, индуцированного химиопрепаратами. Получены новые данные, свидетельствующие о координирующей роли белка РМЬ в механизмах старения опухолевых клеток на фоне генотоксического стресса, вызываемого химиопрепаратами. Было также показано, что РМЬ-опосредованное развитие

данного процесса является исключительно специфичным для опухолевых клеток.

Теоретическая и практическая значимость

Результаты проведенного исследования позволяют углубить современные представления о роли белков PML и PARP в механизмах репарации повреждений ДНК. В работе показано, что белок PML является одним из ключевых для реализации механизма репарации двунитевых разрывов ДНК.

Экспериментальные данные свидетельствуют, что активность PARP в клетках с нокдауном белка PML повышается в условиях повреждения ДНК, вызванного генотоксическими агентами. Полученные результаты имеют большое научно-практическое значение как с точки зрения понимания молекулярных механизмов репарации повреждений ДНК, вызываемых химиопрепаратами, так и с точки зрения перспектив разработки новых стратегий терапии злокачественных новообразований (в частности, для использования химиопрепаратов - ингибиторов PARP).

Методика проведения сочетанного нокдауна белков PML и PARP-1 в дальнейшем может быть использована для изучения молекулярных механизмов «синтетической летальности» и сенсибилизации опухолевых клеток к химиопрепаратам.

Материалы диссертации могут быть использованы патофизиологами, биохимиками: а) в учебном процессе для преподавания раздела «Патогенез опухолевого роста», «Химия белков и нуклеиновых кислот»; б) в научной работе - для дальнейшего изучения механизмов репарации повреждений ДНК.

Методы исследования

В работе использовался ряд современных методов патофизиологии, биохимии и молекулярной биологии: культивирование клеточных линий, иммуноблоттинг, иммунофлуоресцентный метод, фотоколориметрический метод, методы световой и иммунофлюоресцентной микроскопии.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1. Белки РМЬ и РАКР-1 вовлечены в процессы репарации повреждений ДНК, а их «выключение» повышает чувствительность клеток к генотоксическим факторам, вызывающим двунитевые разрывы ДНК.

2. Белок РМЬ регулирует процессы клеточного старения при генотоксическом стрессе, вызываемом химиопрепаратами.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены и обсуждены на: научно-практических конференциях молодых ученых Казанского государственного медицинского университета (Казань, 2012 г.), Всероссийской конференции «Здоровье в XXI веке» (Казань, 2012 г.), Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2013» (Москва, 2013 г.). Всероссийской конференции «Петровские чтения - 2014» (Санкт-Петербург, 2014 г.).

Личный вклад соискателя

При непосредственном участии автора была выбрана тема, составлена программа, определены этапы диссертационной работы, проведен анализ научной литературы по изучаемой проблеме. Автором выполнены экспериментальные исследования на всех этапах диссертационной работы. Автором проведена статистическая обработка, группировка, анализ результатов, интерпретированы полученные данные. Формулирование выводов, рекомендаций, положений, выносимых на защиту, происходило при непосредственном участии автора работы.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, 4 глав (обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований, обсуждение полученных результатов), выводов, практических рекомендаций, списка литературы, содержащего 264 источника, из которых 263 зарубежных авторов. Работа изложена на 124 страницах машинописного текста, иллюстрирована 2 таблицами и 23 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Работа выполнялись с использованием культур фибробластов человека линии BJ (фибробласты человека линии BJ (АТСС® CRL-2522™)), и опухолевой линии U-2 OS (АТСС® НТВ-96™). Клетки культивировали в С02-инкубаторе, который обеспечивал необходимую для культивирования концентрацию С02 -5%, температуру, равную +37° С и относительную влажность - 96%. В качестве питательной среды использовали полную культуральную среду (ПКС) на основе DMEM, имеющей следующий состав: 450 мл питательной среды DMEM (Панэко, Россия), L-глутаминовая кислота (Панэко, Россия) - 50 мг, эмбриональная телячья сыворотка (ЭТС) (РАА Laboratories, Россия) - 50 мл, 5 мл 100-кратного раствора пенициллин-стрептомицина, (Панэко, Россия), содержащего 5000 ЕД/мл пенициллина и 5000 ЕД/мл стрептомицина.

Пассирование клеток производили в стерильных условиях ламинарного бокса. Для диссоциации клеток от адгезионной поверхности после забора культуральной среды и однократного промывания раствором Дульбекко (Панэко, Россия) в культуральную чашку добавляли 1 мл раствора трипсина-ЭДТА 0,05% с солями Хенкса (Панэко, Россия) и инкубировали в течение 5 минут. Далее в чашку добавляли 5 мл питательной среды для ингибирования активности трипсина. Часть суспензии клеток переносили в новую культуральную чашку.

Нокдаун белков PML и PARP в клетках линий BJ и U-2 OS методом РНК-интерференции

Трансфекцию киРНК в клетки осуществляли с использованием набора для трансфекции Lipofectamine® RNAiMAX Reagent (Invitrogen, США) согласно протоколу производителя. Для приготовления растворов киРНК и реагента Lipofectamine RNAiMAX использовали отдельные пробирки Falcon (BD, США), общим объемом 5 мл. В первую пробирку наносили 3 мкл киРНК и добавляли 150 мкл среды Opti-MEM® Medium (Gibco, США). Во вторую пробирку вносили 9 мкл Lipofectamine® RNAiMAX Reagent (Invitrogen, США)

добавляли 150 мкл среды Opti-MEM® Medium. Обе пробирки инкубировали в течение 5 минут, затем содержимое пробирок смешивали между собой в соотношении 1:1. Для создания липосомных конструкций с киРНК, полученную смесь инкубировали в течение 25 минут при комнатной температуре. Для трансфекции использовали клеточные культуры, достигшие 60-80% конфлюэнтности, культивируемые в 6-луночном планшете. Далее 250 мкл готовой смеси наносили в лунку 6-луночного планшета. Длительность трансфекции составляла 24 часа.

Индукция повреждений ДНК (генотоксический стресс) в клетках линий BJ и U-2 OS с помощью химиопрепаратов

Для индукции повреждений ДНК использовались химиопрепараты доксорубицин, этопозид и гидроксимочевина (Sigma, США).

Конечные концентрации препаратов в питательной среде выбирались согласно данным литературы и составляли: для доксорубицина - 0,25 мкг/мл, для этопозида 0,04 мМоль/мл, для гидроксимочевины - 5 мМоль/мл. Для индукции повреждений ДНК клетки инкубировали с вышеуказанными препаратами в течение 1-72 часов. Продолжительность инкубации клеток с химиопрепаратами варьировала в зависимости от задач, поставленных в каждом конкретном случае.

Анализ экспрессии белков методом иммуноблоттинга (Вестерн блоттинг)

Электрофорез белков в ПААГ осуществляли в электрофоретической камере MINI-Protean TETRA (BioRad, США), оснащенной штатным источником питания PowerPac Basic (BioRad, США). Детекцию белков на мембране производили на приборе Fusion Solo 2М (Vilber Lourmat, Франция) с программным обеспечением FusionCaptAdvance Solo 4 16.08 (Vilber Lourmat, Франция).

Все работы на приборе производили согласно руководству по эксплуатации гель документирующей системы Fusion Solo 2М.

Исследование экспрессии белков методом иммунофлуоресцентной микроскопии

Клетки культивировали на покровных стеклах, предварительно обработанных поли-Ь-лизином. После инкубирования с киРНК клетки фиксировали раствором параформальдегида с последующей пермеабнлизацией раствором тритона Х-100 (Хеликон, Россия) и последующим блокированием в течение 30 минут. После этого производили последовательно инкубацию с первичными и вторичными антителами. Ядра окрашивали с помощью ядерного красителя DAPI (Roche). Визуализацию проводили на флуоресцентном микроскопе Olympus ВХ-63 (Olympus) и программы CellSensDimension.

Исследование накопления ß-гатактозпдазы в клетках с помощью окраски реагентом X-gal

Клетки фиксировали 0.25% раствором глутарового альдегида с последующим внесением реакционной смеси, содержащий X-gal реагент (Amresco) и инкубированием в термостате при 37°С в течение 12 часов.. Для продолжительного хранения образцов раствор красителя замещали 70% раствором глицерола (Хеликон, Россия). Количество окрашенных клеток подсчитывали на световом микроскопе Motic A31 (Германия).

Оценка жизнеспособности клеток с помощью MTS-теста

Для культивирования клеток проведения теста использовали 96-луночные планшеты (Costar, КНР). Для этого клетки, достигшие 100% конфлюэнтности, пассировали в лунки 96-луночного планшета. В две лунки планшета добавляли ПКС без клеток, данные пробы использовались в качестве отрицательного контроля. В остальные лунки добавляли по 100 мкл суспензии клеток в количестве 5х103 в ПКС на основе DMEM. При достижении монослоя клеток 70% в лунки добавляли химиопрепараты, либо производили трансфекцию.

По истечении 48 часов после воздействия препаратов в каждую лупку планшета добавляли по 10 мкл смеси раствором MTS/PMS (в соотношении 1:20). Через 1 час выполняли снятие результатов на планшетном фотометре Multiscan FC (Thermo Scientific, США) с использованием светофильтра 490 нм.

Результаты получали в единицах оптической плотности с помощью программного обеспечения Skanlt Software 3.0 for Multiskan FC (Thermo Scientific, США). Статистический анализ результатов проводили в программном обеспечении Excel 2010 (Microsoft, США).

Статистическая обработка полученных результатов

Статистическая обработка полученных результатов выполнялась с использованием программного обеспечения Excel 2010 (Microsoft, США). Статистическая достоверность разницы результатов определялась применением t-критерия Стьюдента.

Результаты собственных исследований и их обсуждение

На первом этапе исследования был проведен нокдаун белков PARP-1 и PML короткими интерферирующими РНК (киРНК). Результаты трансфекции показали, что нокдаун белков PML и PARP -1 приводил к значительному снижению уровня экспрессии продуктов генов PML и PARP-1 в исследуемых культурах клеток, а именно культурах фибробластов человека линии BJ, а также остеосаркомы человека U-2 OS. Также был выполнен сочетанный нокдаун белков PML и PARP-1 в линии фибробластов BJ.

В частности, результаты иммуноблоттинга продемонстрировали, что данная процедура приводит к одновременному подавлению экспрессии вышеназванных белков в вышеописанных клеточных культурах (Рисунок 1).

Клетки, перенесшие трансфекцию к вышеназванным белкам, как по отдельности, так и при сочетанном нокдауне, сохраняли жизнеспособность при культивировании. Это было подтверждено методом световой микроскопии и результатами MTS-теста, основанного на колориметрическом определении активности ферментов - дегидрогеназ, сопоставимой с количеством жизнеспособных клеток в контрольной группе при проведении анализа химиочувствительности клеток к различным классам химиопрепаратов.

Следует отметить, что трансфекция киРНК против белка PML вызывала стойкое снижение экспрессии большинства известных изоформ белка, в том числе изоформы PML II. Результаты иммунофлюоресцентного окрашивания

фибробластов, подвергшихся нокдауну белка РМЬ с помощью соответствующих киРНК, подтвердили отсутствие ядерных телец по сравнению с контролем. Таким образом, полученные данные позволяют говорить о том, что изоформа РМЬ II, которая, в силу особенности строения, является структурной единицей ядерных телец (РМЬ ЫВв), может принимать активное участие в формировании данных ядерных образований, основным структурным компонентом которых является белок РМЬ.

+ — — киРНК (контроль) - - + киРНК РМЬ _ + + киРНК РАШМ

РАЯР-1

РМЬ Актин

Рисунок 1 - Подтверждение сочетанного нокдауна белков РМЬ и РА1*Р-1.

Вестерн-блотинг анализ экспрессии белков РМЬ, РАШМ, а также актина в клеточных лизатах фибробластах человека линии BJ ТЕИТ через 48 часов после трансфекции контрольной киРНК или киРНК против белка РАШМ, а также сочетанная трансфекция киРНК против белка РАШМ и киРНК против белка РМЬ.

Данные современной литературы свидетельствуют о том, что роль белка РМЬ в процессах репарации ДНК во многом может быть обусловлена сохранностью и функционированием ядерных телец РМЬ N6$ (8. ВоюЬик Й аЬ, 2011; О. ЭсПате й а1., 2004; в. ОеИапе е1 а1., 2006). Следовательно, вполне логичным выглядит предположение о том, что в условиях нокдауна белка РМЬ, сопровождающегося дезинтеграцией ядерных телец, происходят нарушения процессов поддержания генетической стабильности, что, в свою очередь, способно повлиять на чувствительность клеток к воздействию генотоксических факторов, в том числе, химиопрепаратов и ионизирующего излучения.

Таким образом, в клетках с нормально функционирующей системой контроля генетической стабильности на фоне дезинтеграции ядерных телец в результате нокдауна белка РМЬ происходят глубокие нарушения процессов

репарации повреждений ДНК, и, в частности, двунитевых разрывов. Приоритетная роль белка РМЬ в процессах гомологичной рекомбинации ДНК в условиях ее согласуется с результатами изучения активности поли(АДФ-рибоза)- полимераз (PARP) в условиях нокдауна белка РМЬ. Поли(АДФ-рибоза)- полимераза-1 является одним из ключевых ферментов, задействованных в репарации повреждений ДНК происходящих до репликации в S-фазе (J. Yelamos et al., 2011).

В настоящем исследовании было обнаружено повышение активности PARP в условиях нокдауна белка РМЬ в фибробластах даже при отсутствии воздействия химиопрепаратов (Рисунок 2).

+ + - Доксорубицин

- - - - + + - - j идроксимочевнна

- --+ + Этопозпд

+ - + + - + кнРНК PML

+ - + - + - + - • кнРНК (контроль)

ПАР

рАТМ 51981 АТМ

уН2АХ 112 АХ Актин

Рисунок 2 - Определение активности РАКР в условиях генотоксического стресса и нокдауна белка РМЬ. Уровень экспрессии поли(АДФ)-рибозы (ПАР), общей и фосфорилированных форм АТМ-киназы и гистона 2А, а также актина в фибробластах человека линии В.Т. Через 24 ч после трансфекции контрольной киРНК или киРНК против РМЬ фибробласты бьши инкубированы с химиопрепаратами (доксорубицином, этопозидом и гидроксимочевиной).

Это может свидетельствовать о развитии компенсаторных механизмов,

препятствующих образованию разрывов ДНК в процессе её репликации, что

является достаточно жизнеугрожающим в условиях функциональной

i

недостаточности процессов гомологичной рекомбинации ДНК. Кроме того, результаты иммуноблотинга также показали значительное увеличение количества ПАР-полимеров в условиях одновременного нокдауна белка PML и генотоксического стресса, индуцированного доксорубицином, гидроксимочевиной и этопозидом (Рисунок 2).

Таким образом, результаты проведенного эксперимента также свидетельствуют о гиперактивации PARP в условиях генотоксического стресса в условиях «дефицита» белка PML.

Кроме того, было выявлено, что в фибробластах человека линии BJ, подвергнутых генотоксическому воздействию химиопрепаратов (доксорубицин, этопозид, гидроксимочевина), происходила активация процессов репарации ДНК, о чём свидетельствует повышение уровня экспрессии фосфорилированной формы АТМ-киназы (рАТМ Ser] 981) — одной из ключевых протеинкиназ, участвующих в привлечении, активации и фосфорилировании гистона ШАХ (у Н2АХ) - маркера двунитевых разрывов ДНК (Рисунок 2).

Полученные результаты коррелируют с данными современной зарубежной литературы, свидетельствующими о тесной взаимосвязи между активностью PARP и процессами гомологичной рекомбинации ДНК (S. Boichuk et al., 2011; Н Е. Bryant et al., 2006; К. Sugimura et al., 2008).

В частности, эта зависимость находит отражение в концепции «синтетической летальности». Согласно данной концепции, в условиях неэффективности процесса гомологичной рекомбинации по причине мутаций генов BRCA1/2 жизнеспособность клеток определяется, прежде всего, состоянием функциональной активности PARP (D.C. Hegan et al., 2010; Helleday, 2011; G. Tinoco et al., 2013).

Анализ литературных данных последних лет свидетельствует, что поли(АДФ-рибоза) полимеразы участвуют в репарации различного рода повреждений ДНК, а также устраняют дефекты ДНК, возникающие в процессе её репликации (S.L. Allinson, 2003; S.F. El-Khamisy, 2003; М. Masson et al.,

1998; О. Mortusewicz et al., 2007; S. Okano et al., 2003; C.E. Strom et al., 2011; L. Wei et al., 2013). Такие повреждения в условиях несостоятельности системы репарации ДНК по механизму гомологичной рекомбинации являются чрезвычайно серьезной угрозой. Это во многом связано с активностью репликации ДНК в S-фазе клеточного цикла и трансформацией этих повреждений в двунитевые разрывы ДНК (F. Cortes-Ledesma et al., 2006). Поэтому инактивация PARP многократно повышает количество двунитевых разрывов, которые будут образовываться в результате процессов репликации ДНК (N. Saleh-Gohari et al., 2005). Двунитевые разрывы для восстановления требуют эффективного механизма гомологичной рекомбинации. Поэтому в клетках с несостоятельностью гомологичной рекомбинации, это может привести к накоплению критического уровня повреждений ДНК, несовместимых с жизнеспособностью клеток (Н.Е. Bryant et al., 2005).

Следовательно, опухолевые клетки, имеющие генетические дефекты в системе гомологичной рекомбинации будут зависимыми от функционального состояния PARP и подвержены гибели при несостоятельности резервного «спасательного» (то есть PARP-опосредованного) пути репарации повреждений ДНК.

Обнаруженный в настоящем исследовании феномен повышенной активности PARP в условиях генотоксического стресса и нокдауна белка PML, является прямым доказательством участия белка PML в процессах репарации двунитевых разрывов ДНК и подтверждает полученные ранее данные о важной роли белка PML в процессах гомологичной рекомбинации. В ранее проведенных работах было продемонстрировано, что белок PML принимает активное участие в осуществлении репарации двунитевых разрывов ДНК по механизму гомологичной рекомбинации (S. Boichuk et al., 2011). Данный факт был подтвержден с использованием конструкций DR-GFP в клеточных линиях U-2 OS. В данных клетках ген, экспрессирующий зеленый флуоресцентный белок (от англ. green fluorescent protein, GFP) был сконструирован таким образом, что индукция повреждений с последующей репарацией двунитевых

разрвов ДНК по механизму гомологичной рекомбинации приводила к индукции его экспрессии. Таким образом, было продемонстрировано, что клетки, с нокдауном белка PML оказались неспособными для активации репараций ДНК по механизму гомологичной рекомбинации. Этот результат был подкреплен литературными данными, свидетельствующими о колокализации белка PML с многочисленными ядерными факторами, участвующими в репарации повреждений ДНК (например, Rad51, ATM, компонентами MRN-комплекса - Mrell и Nbsl и др.) (S. Boichuk et al., 2010, 2011; R. Carbone et al., 2002).

Подтверждением справедливости данной гипотезы явились результаты настоящего исследования, которые продемонстрировали несостоятельность процессов репарации повреждений ДНК, а именно двунитевых разрывов ДНК, в фибробластах человека в условиях сочетанного нокдауна белков PML и PARP-1.

Генотоксический стресс был индуцирован химиопрепаратом доксорубицином. Наличие повреждений ДНК оценивали по уровню экспрессии фосфорилированной формы гистона Н2АХ в положении серии-139 (уН2АХ), который служит маркером повреждения ДНК в клетках (Е.Р. Rogakou et al., 1998).

Было установлено, что регистрируемая экспрессия фосфорилированной формы гистона Н2АХ (уН2АХ) происходила после 5-часовой экспозиции химиопрепаратом доксорубицином (Рисунок 3).

YII2AX Актин

К 1

Рисунок 3 - Появление фосфорилированной формы гистона Н2АХ (уН2АХ) в зависимости от времени экспозиции доксорубицином. Уровень экспрессии фосфорилированной формы гистона Н2АХ (уН2АХ), а также уровень экспрессии актина в клеточной линии фибробластов человека ВТ Цифрами указано время экспозиции доксорубицином (в часах), буквой «К» обозначен контроль.

Поэтому данный интервал времени был принят в качестве отправной точки для индукции повреждений ДНК и для оценки системы репарации в обеих исследуемых клеточных линиях.

Далее была произведена серия экспериментов для оценки эффективности репарации повреждений ДНК в фибробластах человека после 5-часовой экспозиции химиопрепаратом доксорубицином.

Полученные результаты указывают на то, что в фибробластах через 48 часов после 5-часовой экспозиции доксорубицином начинается стойкое снижение уровня Н2АХ, а после 72 часов уровень ШАХ достигает фоновых значений. В то же время, в образцах с постоянной экспозицией доксорубицина всегда отмечалась высокая экспрессия фосфорилированной формы гистона 2А. (Рисунок 4).

уН2АХ Актин

К 12 24 48 72 96 48 * 72 * 96*

Рисунок 4 - Эффективность репарации ДИК в клеточной линии фибробластов человека В.! при 5 часовой и постоянной экспозиции доксорубицина. Уровень экспрессии фосфорилированной формы гистона Н2АХ (уН2АХ), а также уровень экспрессии актина. Цифрами указано время после 5 часовой экспозиции доксорубицином (в часах), буквой «к» обозначен контроль, звездочкой (*) обозначены образцы с постоянной экспозицией доксорубицина.

В то же время, в клетках с сочетанным нокдауном белков РМЬ и РАЯР-1, которые подвергались 5-часовой экспозиции доксорубицином, уровень фосфорилированной формы гистона Н2АХ (уН2АХ) не снижался, а наоборот увеличивался (Рисунок 5).

Полученные результаты свидетельствуют, что образовавшиеся в результате воздействия доксорубицина двунитевые разрывы ДНК (оцениваемые по уровню экспрессии фосфорилированной формы гистона 2А -уН2АХ) не подвергаются репарации в условиях нокдауна белков РМЬ и РАКР-1. Это обусловлено тем, что сочетанный нокдаун обоих белков предотвращает

активацию «резервного пути» для восстановления повреждений ДНК, что приводит к накоплению нерепарированных повреждений. В то время как трансфекция киРНК против белка РАЯР-1 продемонстрировала, что единичный нокдаун белка РАЯР-1, не вызывает накопление уН2АХ. В данном случае, ввиду активности белка РМЬ, следовательно, эффективно функционирующего механизма гомологичной рекомбинации повреждения, оставшиеся без репарации из-за недостаточности РАИР, восстанавливались в 8-фазе клеточного цикла, по механизму гомологичной рекомбинации.

Для подтверждения выявленного феномена была проведена оценка жизнеспособности клеток с сочетанным нокдауном белков РМЬ и РАЛР -1 при помощи МТ8-теста.

у 112 АХ Актин

Рисунок 5 — Эффективность репарации ДНК в клеточной линии фибробластов человека В.1 при 5 часовой экспозиции доксорубицина в клетках группы контроля и с сочетанным нокдауном белков РМЬ и РАЫР-1. Уровень экспрессии фосфорилированной формы гисгона Н2АХ (уН2АХ), а также уровень экспрессии актина в клеточной линии фибробластов человека ВЛ. Цифрами указано время после 5 часовой экспозиции доксорубицином (в часах), буквой «к» обозначен контроль, звездочкой (*)обозначены образцы с сочетанным нокдауном белков РМЬ и РАШ* -1.

Данные, полученные при МТ8-тесте, свидетельствуют, что клетки с сочетанным нокдауном действительно более чувствительны к генотоксическим агентам.

В связи с вышеизложенным, представляло интерес изучение описанных выше процессов в клетках, имеющих признаки генетической нестабильности, а именно, опухолевых. В качестве объекта для изучения данного феномена были выбраны клетки остеосаркомы человека линии 11-2 ОБ, которые, как известно, являются чувствительными к некоторым химиопрепаратам, в частности,

К 48 71 96 К -18* 72* 96*

доксорубицину. В отличие от фибробластов человека, и-2 ОБ представляет собой опухолевую клеточную линию и характеризуются низкой степенью дифференцировки, нарушением регуляции апоптоза, беспрепятственным продвижением по клеточному циклу и нестабильностью генома (О. НапаЬап е1 а1., 2000).

Нокдаун белка РМЬ с помощью соответствующей киРНК в данной клеточной линии приводил к аналогичному эффекту, а именно исчезновению уровня экспрессии вышеописанных изоформ белка РМЬ, участвующих в формировании ядерных телец, что послужило основанием для проведения экспериментов по изучению в данных опухолевых клетках процессов эффективности процессов репарации повреждений ДНК, вызываемых химиопрепаратами, в частности, доксорубицином.

После экспозиции доксорубицином в клетках опухолевой линии 11-2 08, в отличие от фибробластов, не происходило снижение уровня уН2АХ, а постепенное накопление с максимальными значениями к концу эксперимента (Рисунок 6).

уН2АХ Актин

К Д 12 24 48 72 96

Рисунок 6 - Эффективность репарации ДНК в опухолевой линии 11-2 ОБ.

Уровень экспрессии фосфорилированной формы гистона Н2АХ (уН2АХ), а также уровень экспрессии актина. Цифрами указано время после 5 часовой экспозиции доксорубицином (в часах), буквой «К» обозначен контроль, буквой «Д» обозначен образец с экспозицией доксорубицина в течение всего эксперимента.

Такое накопление повреждений ДНК происходит при стресс-индуциро ванном феномене клеточного старения, который также характеризуется изменением морфологии клеток, которые приобретают округлые формы и увеличиваются в размерах.

При помощи световой микроскопии было установлено, что клетки опухолевой линии U-2 OS действительно изменили морфологию и увеличились в размерах. Последующая окраска по X-gal продемонстрировала, что данные клетки накапливают в цитоплазме бета-галактозидазу, что является одним из достоверных маркеров клеточного старения (J. Campisi 1997, 2001; G.P. Dimri et al., 1995).

Для перехода клеток в состояние стресс-индуцированного старения ключевое значение имеет экспрессия ими функционально активных белков р53 и Rb. По данным результатов исследований зарубежных авторов и базы данных АТСС в опухолевой линии U-2 OS данные белки сохранны (O.J. Hellwinkel et al., 2005).

Было продемонстрировано, что, нокдаун белка PML предотвращал переход клеток U-2 OS в состояние клеточного старения после генотоксического стресса. Это может быть связано, с ролью данного белка в запуске сигнальных механизмов клеточного старения.

Полученные нами данные коррелируют с данными литературы. Например, ранее было показано, что одна из изоформ белка PML — PML IV способна инициировать преждевременное старение, что свидетельствует о функциональных различиях между этими изоформами (О. Bischof et al., 2002).

Это является свидетельством в пользу роли белка PML в качестве белка-онкосупрессора с многофакторным ингибированием злокачественного перерождения. Полученные нами данные подтверждают важную роль концепции «синтетической летальности» в формировании химиочувствительности злокачественных новообразований. Результаты настоящего исследования дополняют указанную концепцию. Клетки с дефицитом PARP становятся чувствительными к действию химиопрепаратов, если имеют сочетанный дефицит белка PML. Важно отметить, что при нокдауне белка PML опухолевые клетки теряют способность к репарации двунитевых разрывов ДНК. В данном случае нарушаются сразу оба механизма восстановления целостности нити ДНК - гомологичная рекомбинация и

негомологичное связывание концов ДНК. Таким образом, появление двунитевых разрывов ДНК в данном случае будет являться летальным.

Полученные результаты позволяют рассматривать опухолевые клетки со сниженной экспрессией белка РМЬ как потенциально чувствительные к ингибиторам РАЯР, что в перспективе будет способствовать разработке новых стратегий терапии злокачественных новообразований.

Выводы

1. Нокдаун белка РМЬ не влияет на жизнеспособность нормальных и опухолевых клеток, но приводит к изменению характера их ответа на генотоксических стресс, индуцированный химиопрепаратами. На фоне нокдауна белка РМЬ у фибробластов наблюдается замедление процессов репарации повреждений двунитевых разрывов ДНК, в то время как в опухолевых клетках происходит ослабление процессов клеточного старения.

2. В нормальных и опухолевых клетках в условиях нокдауна белка РМЬ и генотоксического стресса, вызванного различными группами химиопрепаратов, происходит повышение активности поли (АДФ-рибоза)-полимераз (РАЛР), что свидетельствует о запуске компенсаторных механизмов на фоне ослабления РМЬ-опосредованных процессов репарации повреждений ДНК.

3. Комбинированный нокдаун белков РМЬ и РАЯР-1 также не оказывает влияния на жизнеспособность нормальных и опухолевых клеток, но существенным образом повышает их чувствительность к агентам, вызывающим двунитевые разрывы ДНК, ослабляя механизмы репарации повреждений ДНК, а именно двунитевых разрывов.

4. Белок РМЬ принимает активное участие в механизмах клеточного старения опухолевых клеток, являющегося одной из форм их специфического ответа на повреждения ДНК, вызываемого химиопрепаратами.

Практические рекомендации

1.Опухолевые клетки со сниженной экспрессией белка PML являются чувствительными к действию химиопрепаратов - ингибиторов PARP. 2. Для изучения экспрессии фосфорилированной формы гистона ШАХ (уН2АХ) как маркера двунитевых разрывов ДНК высокоинформативным является метод иммуноблотинга.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Рамазанов Б.Р. Потенциальная роль белка PML в репарации повреждений ДНК и химио- и радиорезистентности злокачественных новообразований / Б.Р. Рамазанов, C.B. Бойчук, И.Г. Мустафин // IV-я Российская научно-практическая конференция «Здоровье человека в XXI веке». Сборник научных статей. - Казань,2012. - С. 797-802.

2. Рамазанов Б.Р. Повышение активности поли(АДФ-рибоза)-полимераз в условиях нокдауна белка PML / Б.Р. Рамазанов, C.B. Бойчук // 87-я Всероссийская научно-практическая конференция студентов и молодых ученых, освященная 155-летию со дня рождения JI.O. Даршкевича. Сборник тезисов. - Казань,2008. - С. 200-201.

3.Рамазанов Б.Р. Роль белка PML в механизмах репарации повреждений ДНК, вызванных химиопрепаратами и ионизирующим излучением / Рамазанов Б.Р. // Материалы Международного молодежного научного форума «Ломоносов-2013» [Электронный ресурс] - М.: Макс Пресс. - 2013. - 1 электрон, опт. диск (DVD-ROM).

4.Бойчук C.B. Повышение активности поли(АДФ-рибоза)-полимераз в условиях нокдауна белка PML - новые перспективы терапии злокачественных новообразований / C.B. Бойчук Б.Р. Рамазанов, И.Г. Мустафин, О. Джоерап // Казанский медицинский журнал. - 2013. - Т.94, №1. - С. 75-79.

5.Зыкова С.С. 3-гндрокси-1,5-диарил-4-пивалоил-2,5-дигидро-2-пирролоны нарушают процессы митоза п индуцируют гибель опухолевых клеток in vitro / С.С. Зыкова, C.B. Бойчук, Б.Р. Рамазанов п др. // Цитология. - 2014. - Т. 56, №6. - С. 439-442.

6.Бойчук C.B. Нарушения системы репарации ДНК - роль в онкогенезе и терапии злокачественных новообразований / C.B. Бойчук, Б.Р. Рамазанов // Казанский медицинский журнал. - 2014. - Т.94, №3. -С.307-314.

7.Бойчук C.B. Роль белка PML в репарации повреждений ДНК, вызванных химиопрепаратами и ионизирующим излучением / C.B. Бойчук, Б.Р. Рамазанов // Тезисы 10-й конференции по фундаментальной онкологии «Петровские чтения - 2014». - Санкт-Петербург, 2014. - С.14.

Список сокращений

DMEM — среда Игла, модифицированная по Дульбекко (англ. Dulbecco's

modified Eagle's medium ) GFP - зеленый флуоресцентный белок (от англ. green fluorescent protein, GFP)

PARP - поли(АДФ-рибоза) полимераза (от англ. poly(ADP-ribose) polymerase)

ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота

мкг — микрограмм

мл — миллилитр

мМоль — миллимоль

нм - нанометр

ПААГ — полиактиламидный гель

ПАР - поли(АДФ-рибоза)

ПКС - полная культуральная среда

ЭДТА - Этилендиаминтетрауксусная кислота

ЭТС - эмбриональная телячья сыворотка

Подписано в печать 15.07.14. Формат 60x84/16. Бумага офсетная. Печать ризографическая. Усл. печ. 1 Тираж 100 экз. Заказ 1/7.

Отпечатано в типографии «Цвет в цифре» (ИП Егоров Д.И.) 420054, г. Казань, ул. Тракторная, 3.