Автореферат и диссертация по медицине (14.00.24) на тему:Морфофункциональная характеристика этанолокисляющих ферментов головного мозга при смертельном отравлении этанолом

На правах рукописи

КОЗЛОВА Татьяна Валерьевна

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЭТАНОЛОКИСЛЯЮЩИХ ФЕРМЕНТОВ ГОЛОВНОГО МОЗГА ПРИ СМЕРТЕЛЬНОМ ОТРАВЛЕНИИ ЭТАНОЛОМ

14.00.24 - судебная медицина

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2004 г.

Работа выполнена в танатологическом отделе Государственного учреждения Российский центр судебно-медицинской экспертизы Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию Российской Федерации

Научный руководитель:

Член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор Ю.И. Пиголкин

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Ю.Д. Гурочкин Кандидат медицинских наук, доцент Д.В. Сундуков

Ведущая организация:

Московский государственный медико-стоматологический университет Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита диссертации состоится «/¿у» 2004 г. В 7 7 часов на

заседании диссертационного совета Д 208.070.01 Государственного учреждения Российский центр судебно-медицинской экспертизы Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию Российской Федерации по адресу: 123242, г. Москва, ул. Садовая-Кудринская, дом 3, корп.2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного учреждения Российский центр судебно-медицинской экспертизы Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию Российской Федераций

Автореферат разослан «Ж» ¿шсЗ&л-

2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук, доцент

О.А. Панфиленко

%JQOS-lf

ВВЕДЕНИЕ (ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ)

Актуальность исследования. Проблема алкоголизма на протяжении многих веков была, остается и еще долго будет актуальной для человечества в социальном, медицинском плане, а также в аспекте сохранения здорового генофонда людей (Cagdir et al., 2003). Смертность населения России от несчастных случаев, травм и отравлений занимает одно из ведущих мест, опережая показатели смертельных исходов от онкологических заболеваний (Кушнирева О.Н. и соавт., 2002). Из отчетов о деятельности региональных бюро судебно-медицинской экспертизы РФ за 2002 год известно, что смертность от отравлений составила 27,5 %, причем ведущее место занимают случаи смертельных интоксикаций после приема этилового спирта - 55,2 %. Алкоголь способствует скоропостижной смерти от различных заболеваний, прежде всего, сердечно-сосудистой патологии (Морозов Ю.Е., 1998; Минеева Л. Д., 1999). Несчастные случаи в быту, на производстве, транспорте нередко связаны с алкогольным опьянением или его последствиями (Авходиев Г.И., Кузьмина О.В., 2002). Основная масса преступлений совершается в состоянии опьянения (Зороастров О.М., 2003). Длительное злоупотребление алкоголем приводит к заболеванию - хроническому алкоголизму (Билибин Д.П., Дворников В.Е., 1991). Приблизительно у 14 млн американцев - около 7,4 % взрослого населения - отмечены диагностические критерии алкоголизма (Dixit et al., 2000). В России число смертельных отравлений этиловым спиртом и его суррогатами остается практически одним из самых высоких в мире (Томилин В.В., Саломатин Е.М., 2001).

Немало исследований в области судебно-медицинской диагностики

алкогольной интоксикации выполнено в последние годы (Красильникова Л.Н. и

соавт., 1995; Наумов Э.С., Наумова Е.Ю., 1999; Пермяков А.В., Витер В.И.,

2000; Морозов Ю.Е., 2001). В то же время недостаточно изученными остаются

многие вопросы, касающиеся отравлении

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ }

БИБЛИОТЕКА { СЯе О*

этиловым спиртом, состояния этанолметаболизирующих ферментных систем и возможности их использования для дифференциальной диагностики причин смерти (Пиголкин Ю.И., 2003).

Согласно современным литературным данным головной мозг является одним из главных органов-мишеней для действия этанола (Пермяков А.В., Витер В.И., 2002; Пиголкин Ю.И. и соавт., 2003). Злоупотребление алкоголем ведет к прямому повреждению нервных клеток (Riihioja et al., 1999). Отмечено, что при алкоголизме выборочно выпадают нейроны в ядрах головного мозга (Baker et al., 1996; Harding et al., 1997). Окисление этанола с участием оксидоредуктаз - алкогольдегидрогеназы (АДГ) и ацетальдегиддегидрогеназы (АльДГ) - представляет собой основной путь метаболизма алкоголя в организме (J. Hashimoto et al., 1977; Т. Watabiki et al., 1989; P.A. Motavkin et al., 1990; S.M. Zimatkin et al., 1997). Степень их влияния также может быть определена в зависимости от медиаторной организации нервных центров (Арушанян Э.Б., 1977; Tabakoff et al., 1987). Наиболее чувствительными структурами для токсического действия экзогенного этанола являются моноаминергические нейроны, в результате чего их рассматривают как критические центры (Motavkin et al., 1990; Пиголкин Ю.И. и соавт., 2003).

Изменение поведения, эмоциональные расстройства и симптомы психопатологических состояний, характерные для алкоголизма, имеют прямую связь с нарушением нейромедиаторных систем (Сытинский И.А., 1980; Tabakoff et al., 2000).

Учитывая, что нейромедиаторная система нарушается при алкоголизме (Tabakoff et al., 1980; Weiss et al., 2002), данный факт позволяет предположить актуальность ее гистохимического изучения в приложении к алкогольной интоксикации.

Исходя из вышеизложенного, целью исследования явилось:

Выяснение закономерностей метаболизма этилового спирта по показателям активности этанолокисляющих ферментов в медиаторно-дифференцированных структурах головного мозга и возможности

использования указанных закономерностей для судебно-медицинской диагностики смертельных отравлений этанолом.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи исследования:

1. Провести эпидемиологический анализ судебно-медицинских заключений (актов) экспертиз (исследований) трупов на примере одного из регионов России с целью определения распространенности и условий смертельных отравлений этанолом.

2. Установить нормальное распределение активности этанолокисляющих ферментов в медиаторно-дифференцированных отделах головного мозга.

3. Изучить активность алкоголь- и ацетальдегиддегидрогеназы в моноаминергических ядрах головного мозга при смертельном отравлении этиловым спиртом, а также у лиц, страдавших хронической алкогольной интоксикацией и умерших трезвыми от последствий алкогольной болезни.

4. Определить возможность использования результатов настоящего исследования в качестве дополнительных критериев для судебно-медицинской диагностики смерти от отравления этанолом и алкогольной болезни.

Новизна исследования. На основании данных Приморского областного бюро судебно-медицинской экспертизы впервые проведен анализ случаев смертельного отравления этанолом по г. Владивостоку за последние 5 лет (1999-2003 гг.), в котором отражена тенденция к увеличению распространения алкоголизма. Проведено определение окисляющих этанол ферментов в медиаторно-дифференцированных нервных центрах на практическом судебно-медицинском материале. Установлены закономерности распределения и изменения гистохимической активности алкогольдегидрогеназы и ацетальдегиддегидрогеназы в структурных отделах головного мозга при смерти от различных причин. На основании полученных данных предложены дополнительные судебно-медицинские критерии диагностики острой и

хронической алкогольной интоксикации с учетом индивидуальной толерантности к этиловому спирту.

Практическая значимость. Использование дополнительных объективных критериев поражения головного мозга, предложенных в диссертации, позволяет повысить точность судебно-медицинской и патологоанатомической диагностики острой и хронической алкогольной интоксикации, а также провести их дифференциальную диагностику.

Положения, выносимые на защиту:

1. Судебно-медицинская смертность от острого отравления этанолом в г. Владивостоке увеличивается. Наиболее часто смертельный исход наблюдается у мужчин трудоспособного возраста, не имеющих работы и определенного места жительства, в весенне-летний период года, вечернее и ночное время суток, праздничные и выходные дни, ранний период фазы элиминации экзогенного этилового спирта.

2. Разные по своей нейромедиаторной организации (серотонинергические (ядра срединного шва), дофамин ергические (компактное ядро черной субстанции), норадренергические (нейроны голубого пятна) и ГАМКергические (клетки Пуркинье мозжечка)) структуры головного мозга характеризуются дифференцированной активностью алкогольдегидрогеназы и ацетальдегиддегидрогеназы.

3. Для смертельного отравления этиловым спиртом характерен комплекс признаков в виде изменения активности этанолокисляющих ферментов головного мозга (индукция алкогольдегидрогеназы и ингибирование ацетальдегиддегидрогеназы).

4. У лиц с хронической алкогольной интоксикацией, умерших трезвыми от осложнений алкогольной болезни, наблюдается снижение активности метаболизирующих этанол ферментов.

5. Гистохимическая характеристика активности этанол окисляющих ферментов в медиаторно-дифференцированных отделах головного мозга может служить дополнительным критерием судебно-медицинской диагностики смертельной алкогольной интоксикации, а также быть использована для дифференциальной диагностики различных форм алкогольной болезни.

Апробация работы. Материалы работы доложены на Ш Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (январь 2004 г.), на заседании танатологического отдела РЦ СМЭ МЗ РФ (апрель 2004), на научной конференции РЦ СМЭ МЗ РФ (сентябрь 2004).

Внедрение результатов исследования. Результаты исследования внедрены в практику посредством публикаций и тематических докладов, материалы диссертации внедрены в работу танатологического отдела Российского центра судебно-медицинской экспертизы и в учебный процесс кафедры судебной медицины ММА им. И.М. Сеченова.

Структура диссертации. Работа включает введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследований, результаты собственного исследования, обсуждение результатов и выводы. Список литературы включает 246 источников, из них 143 на русском языке и 103 - на иностранных. Текст изложен на 153 страницах, содержит 16 таблиц, иллюстрирован 21 микрофотографиями и 20 диаграммами. В конце работы помещено развернутое приложение показателей активности этанолокисляющих ферментов, полученных в результате исследования (5 стр.).

Публикации. По теме работы опубликовано 5 статей, из них 2 - в центральной печати.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

С целью определения эпидемиологической распространенности и условий смертельных отравлений этанолом был проведен анализ 13394 актов судебно-медицинского исследования трупов, актов судебно-химического и судебно-гистологического исследования, а также заключений экспертов Приморского бюро судебно-медицинской экспертизы ДЗ г. Владивостока, за период 1999-2003 гг. Всего за это время зарегистрировано 817 наблюдений.

Проведено комплексное изучение алкогольных интоксикаций, основой которого явилось исследование этанолокисляющих ферментов (алкогольдегидрогеназа (АДГ) и ацетальдегиддегидрогеназа (АльДГ)) в головном мозге. Работа выполнена на практическом судебно-медицинском материале танатологических отделений № 2, № 4 и № 11 бюро судебно-медицинской экспертизы Департамента здравоохранения г. Москвы. Всего было исследовано 85 трупов в возрасте от 17 до 55 лет, из которых мужчин -69% и женщин - 31%. Возрастная группа от 17 до 25 лет встречалась в 12,9 % случаев, от 26 до 40 лет - в 36,5 %, от 41 до 55 лет - в 50,6 %.

Исследованный материал представлен образцами ткани головного мозга 35 трупов лиц, умерших от острого отравления этанолом (ООЭ). Контролем служили образцы головного мозга 25 трупов лиц, погибших от острой кровопотери при несовместимой с жизнью механической травмой (МТ), кроме черепно-мозговой. Образцы ткани головного мозга 25 трупов больных хроническим алкоголизмом (ХА) с выраженной клинической манифистацией поражения внутренних органов (алкогольный цирроз печени, алкогольная кардиомиопатия, алкогольная энцефалопатия, геморрагический панкреонекроз) составили группу сравнения. В контрольной группе наблюдений и в группе сравнения согласно результатам газожидкостной хроматографии (ГЖХ) в крови и/или моче трупа этанол не был выявлен. Такая группировка материала дала возможность, с одной стороны, изучить нейрогистохимические изменения у лиц, злоупотреблявших этанолом и погибших на высоте острой алкогольной интоксикации (смертельное отравление); с другой стороны, выявить

гистохимические изменения головного мозга, обусловленные хроническим воздействием этанола, в отсутствие влияния острой тяжелой алкогольной интоксикации.

Для подтверждения судебно-медицинского диагноза проводили анализ катамнестических, секционных данных, с обязательным учетом гистологического, судебно-химического и биохимического лабораторных исследований. Катамнестические сведения получали, используя представленные для производства экспертизы трупа документы (постановления, направления, медицинские карты, акты приема трупа).

Концентрацию этилового спирта, характеризующую наличие и степень алкогольной интоксикации на момент наступления смерти, определяли методом газожидкостной хроматографии в крови и моче трупа.

Исследуемая группа наблюдений изучалась с учетом фаз алкогольной интоксикации: случаи, в которых смерть наступила в фазу резорбции (количество алкоголя в крови преобладало над его содержанием в моче); случаи, в которых смерть наступила в фазу элиминации (концентрация этанола в моче больше, чем в крови). При смерти от отравления этанолом фаза резорбции имела место в 12-ти наблюдениях (34%), фаза элиминации - в 23-х случаях (66%).

Нами была изучена ферментативная активность АДГ и АльДГ в нейронах голубого пятна (locus coeruleus), компактном ядре черной субстанции (substantia nigra compacta), бледном ядре срединного шва (nucleus raphe pallidus) и клетках Пуркинье мозжечка (Purkinje' cellulae cerebelli). Основанием для выбора указанных отделов головного мозга явились различия медиаторной организации этих центров (норадренергическая - в голубом пятне, дофаминергическая - в компактной части черной субстанции, серотонинергическая - в ядре шва, ГАМКергическая - в клетках Пуркинье мозжечка). Исследование активности этанолокисляющих ферментов проведено в указанных отделах головного мозга в периоде до 24 часов после смерти при условии хранения трупов в холодильной камере при температуре 3-5°С.

Во время аутопсии охлажденным мозговым ножом изымали кусочки головного мозга размером 1,0x1,5x0,7 см. Для изучения клеток Пуркинье мозжечка забирали образец из середины левой верхней полулунной дольки мозжечка. В левой половине ромбовидной ямки, непосредственно над мозговыми полосками IV желудочка, вырезали кусочки соответственно области голубого пятна. Из центральных отделов продолговатого мозга, на границе с мостом, получали образцы для исследования ядер срединного шва. Из левой ножки мозга выделяли область компактного ядра черной субстанции. Для приготовления криостатных срезов кусочки мозга размещали на полоске фильтровальной бумаги и в биксе с сухим льдом доставляли в гистохимическую лабораторию, где помещали в предварительно охлажденную камеру криостата.

С помощью нейрогистохимических методов в группах наблюдений выясняли различия распределения активности АДГ и АльДГ в указанных структурных отделах головного мозга.

Гистохимическое выявление активности АДГ (алкоголь: оксиредуктаза, КФ 1.1.1.1) проводили по методу П.А. Мотавкина и соавт. (1988). Срезы головного мозга инкубировали в присутствии экзогенных веществ: основного субстрата этанола, кофермента

никотинамидадениндинуклеотидфосфата (НАД) и специфического красителя нитросинего тетразолия (НСТ). Активность АДГ устанавливали по скоплению выпавшего осадка формазана, гранулы которого имеют синий цвет. Схематически гистохимическая реакция по определению ферментативной активности АДГ может быть представлена следующим образом: этиловый спирт ацетальдегид формазан

Активность АльДГ (ацетальдегид: в

изучаемых структурах головного мозга определяли по методу Зиматкина СМ. и соавт. (1985). Образцы мозга помещали в камеру криостата, где при температуре -20° С из них с использованием антироллерной пластины готовили срезы толщиной 15 мкм. Инкубацию проводили в термостате в течение 30

минут при температуре 37°С, для чего в кювету со срезами головного мозга добавляли раствор следующего состава: Na - пирофосфатный буфер, рН 7,4 -50 мМ; НАД - 5 мМ; амитал - 2 мМ; пиразол - 0,1 мМ; хлористый магний - 5 мМ; нитротетразолиевый синий 0,025%; поливинилпирролидон 4%; ацетальдегид - 50 мМ. Гистохимическая активность АльДГ определяется по интенсивности темно-синего цвета выпавшего осадка формазана.

Для некоторых случаев был применен метод одновременного определения активности АДГ и АльДГ в одном препарате (Т. Watabiki с соавт., 1989). Локализация и активность каждого из ферментов устанавливалась соответственно по плотности образующегося осадка: формазана и ферроцианида при последовательной инкубации криостатных срезов с нитротетразолиевым синим и феррицианидом в присутствии субстратов, НАД и металла (Си2+). Одновременное гистохимическое определение АДГ и АлъДГ с нитросиним тетразолием и феррицианидом меди проводили в два этапа. На первом этапе, в процессе инкубации этанола в присутствии НАД, феназинметасульфата и нитросинего тетразолия образуется металл-формазановый комплекс (синего цвета), хелатированный ионом меди. Он характеризует активность АДГ. На втором этапе определяется активность АльДГ по плотности осадка ферроцианида меди (коричневого цвета), образующегося при инкубации срезов с ацетальдегидом, сульфатом меди, цитратом натрия, НАД и феррицианидом.

Исследование гистопрепаратов проводили с помощью микроскопа CETI (Бельгия). Топографию ядер головного мозга уточняли с помощью гистологических препаратов, окрашенных по Нисслю.

Величину активности ферментов оценивали в баллах от 0 до 5-ти: 0 баллов - отсутствие активности; 1 балл - очень низкая активность; 2 балла - низкая активность; 3 балла — средняя активность; 4 балла - сильная активность; 5 баллов - очень сильная активность. Рассчитывали средний показатель значения активности ферментов на основании ее определения не менее, чем в 20 участках исследуемого объекта. Полученные данные проанализированы путем

статистической обработки с 95-% уровнем надежности, определением средней арифметической М, средней ошибки средней арифметической т, средней ошибки относительных величин тр и коэффициента достоверности разности t (Стьюдента). Для вычисления использован персональный компьютер Pentium IV с пакетом программ SPSS 10.5 (SPSS Inc.) и Microsoft Excel-97.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Результаты эпидемиологического исследования по г. Владивостоку. В

структуре работы танатологического отделения г. Владивостока смертельные случаи алкогольной интоксикации не занимали лидирующих позиций, но, тем не менее, представляли собой настораживающе увеличивающиеся данные, и составили на 1999 год - 5,8 %, на 2000 год - 5,9 %, на 2001 год - 6,0%, на 2002 год - 6,3 % и на 2003 год - 6,4 % (табл. 1).

Таблица 1

ГОДОВАЯ ДИНАМИКА СМЕРТЕЛЬНЫХ ОТРАВЛЕНИЙ ЭТИЛОВЫМ СПИРТОМ ПО Г. ВЛАДИВОСТОКУ

год

1999

2000

2001

2002

2003

ВСЕГО

число

НАБЛЮДЕНИЙ

139

150

157

164

207

817

В 1999 г. средний возраст погибших составил 47 лет, мода данного распределения находилась на цифре в 40 лет. В 2000 г. - 50 лет, мода - 45 лет. В 2001 г. медиана и мода наблюдений совпали и составили 49 лет. В 2002 г. средний возраст составил 51 год, мода располагалась на отметке в 47 лет. В 2003 г. средний показатель возраста - 49 лет, мода - 42 года. В 1999 г. в структуре смертельных отравлений этиловым спиртом мужчины составили 105 (75,5%) наблюдений, в 2000 г. - 114 (75,8%), в 2001 г. - 123 (78,2%), в 2002 г. -131 (79,9%) и в 2003 г. - 175 (84,5%) наблюдений.

За период с 1999 по 2003 гг. примерно в 20,5 % случаев острых отравлений этанолом смерть наступила в стадии резорбции, в 45,5 % - в ранний период стадии элиминации и в 34 % случаев - в конце стадии элиминации.

В подавляющем большинстве наблюдений (87 %) смерть при отравлении этиловым спиртом наступала в вечернее (18-24 часа) и ночное (0-6 часов) время, преимущественно в выходные (31 %) и праздничные (30 %) дни. Среди умерших преобладали лица с рабочими профессиями (46 %) и служащие (23 %), не имели работы - 35 % и постоянного места жительства - 55 %. Только в 14 % случаев у умерших было установлено среднее специальное и высшее образование. В весенне-летний период зарегистрирована большая частота наступления смерти от отравления этанолом (61%), чем зимой (14%) и осенью (25%).

Морфологические изменения в головном мозге при смерти от острой кровопотери. Изучены образцы ткани головного мозга 25 трупов лиц, погибших от механической травмы (кроме черепно-мозговой). Непосредственной причиной смерти явилась острая кровопотеря в результате повреждения магистральных сосудов. В данную группу вошли мужчины и женщины в возрасте от 17 до 55 лет. При изучении статистических карт было установлено, что в 28 % случаев смерть наступила в возрасте 17-25 лет, в 38 % - в возрасте 26-40 лет и в возрасте 41-55 лет - также в 38 % наблюдений. Мужчины преобладали над женщинами - 76 %.

Данная группа изучена как контрольная по отношению к остальным наблюдениям и объединяет случаи быстрой смерти при отсутствии признаков алкогольной интоксикации согласно результатам комплексного исследования. При секционном исследовании в контрольной группе наблюдений выявляли признаки общего малокровия. Макро- и микроскопически признаков алкогольной интоксикации не выявлено. Гистологически в препаратах головного мозга, окрашенных по гематоксилину и эозину и по Нисслю, были зарегистрированы полнокровие или умеренное кровенаполнение мелких вен и венул, стаз крови в капиллярах, дистония и спазм артериол, множественные

периваскулярные кровоизлияния, стенки сосудов местами пропитаны плазмой, периваскулярный и перицеллюлярный отек, дистрофические изменения нервных клеток.

Ферментативная активность в данной группе наблюдений распределялась дифференцированно (Табл.2-3).

Таблица 2

АКТИВНОСТЬ АДГ В ГОЛОВНОМ МОЗГЕ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ПРИЧИНЫ СМЕРТИ (М±т)

ОБЪЕКТЫ НЕЙРОГИСТОХИМИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ ГРУППЫ НАБЛЮДЕНИЙ

МТ соэс ХАИ

Нейроны голубого пятна 3,8±0,04 4,8+0,05 2,2+0,02

Бледное ядро шва 3,2+0,03 4,7+0,04 2,9+0,04

Компактное ядро черной Субстанции 4,0±0,03 5,0±0,05 2,5+0,03

Клетки Пуркинье мозжечка 4,3+0,05 4,7+0,04 2,8+0,03

Таблица 3

АКТИВНОСТЬ АЛЬДГ В ГОЛОВНОМ МОЗГЕ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ПРИЧИНЫ СМЕРТИ (М±т)

ОБЪЕКТЫ НЕЙРОГИСТОХИМИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ ГРУППЫ НАБЛЮДЕНИЙ

МТ СОЭС ХАИ

Нейроны голубого пятна 1,9+0,02 1,1+0,02 1,0+0,02

Бледное ядро шва 2,8+0,03 2,3+0,03 2,7+0,03

Компактное ядро черной субстанции 2,010,02 1,2+0,02 1,3+0,02

Клетки Пуркинье мозжечка 3,0+0,03 1,4+0,02 2,9+0,03

Средняя величина гистохимически определяемой активности АДГ была установлена в нейронах бледного ядра срединного шва (3,2±0,03). Во всех остальных изучаемых структурах головного мозга активность АДГ была высокой. Интенсивность гистохимической реакции на АДГ в бледном ядре

14

срединного шва в данной группе наблюдений была условно принята за эталон средней величины активности АДГ (3,0 балла). В клетках Пуркинье мозжечка, компактном ядре черной субстанции и голубом пятне активность данного фермента была выше на 25%, 19% и 14% соответственно по сравнению с интенсивностью гистохимической реакции на АДГ в бледном ядре шва.

Нейроны голубого пятна и компактного ядра черной субстанции отличались низкой энзиматической активностью АльДГ: 1,9±0,02 балла и 2,0±0,02 балла соответственно. В клетках Пуркинье мозжечка и бледном ядре шва гистохимически установлена средняя активность АльДГ. Выраженность гистохимической реакции на АльДГ в клетках бледного ядра срединного шва продолговатого мозга в данной группе наблюдений была принята за условную норму средней величины активности, равную 3,0 балла.

При сравнении между собой структурно-функциональных отделов головного мозга выявлено, что активность АльДГ в мозжечке превосходит другие отделы: бледное ядро шва в 1,1 раз, компактное ядро черной субстанции в 1,4 раза, нейроны голубого пятна в 1,6 раз.

Изменения головного мозга при смертельном отравлении этиловым спиртом (СОЭС). Изучены 35 случаев СОЭС. Исследуемую группу составили мужчины (66%) и женщины (34%) в возрасте от 17 до 55 лет: 17-25 лет - 5,7 %, 26-40 лет - 37,1 % и 41-55 лет - 57,2 %. Судебно-медицинская диагностика проводилась с учетом комплексного исследования катамнестических, секционных и лабораторных (гистологических, судебно-химических, биохимических) данных. В каждом изученном случае выполнялось исследование крови и мочи общепринятым ГЖХ методом. Экспертная оценка результатов судебно-химического исследования биологических объектов от трупов на наличие и концентрацию этилового спирта производилась в соответствии с методическими указаниями Минздрава СССР «О судебно-медицинской диагностике смертельных отравлений этиловым алкоголем и допускаемых при этом ошибках» от 3 июля 1974 года, где указано, что концентрация алкоголя в крови от 3,0 до 5,0 %о, соответствует тяжелому

отравлению, при котором может наступить смерть, а алкоголемия, превышающая 5,0 %о, должна расцениваться как смертельное отравление.

В данной группе наблюдений концентрация экзогенного этанола в крови превышала 3,0 %о. С учетом степени и фазы алкогольной интоксикации были выделены две подгруппы наблюдений: 1) случаи, в которых смерть наступила в фазу резорбции этанола - 21 наблюдение (58%); 2) случаи, в которых смерть наступила в фазу элиминации этанола - 14 наблюдений (42%).

Специфические патоморфологические изменения в органах и тканях при отравлении этанолом отсутствовали. При секционном исследовании отмечалось резкое полнокровие внутренних органов, общий венозный застой. Наблюдались гиперемия и отек головного мозга, мозговых оболочек, иногда - кровоизлияния в веществе мозга и его оболочках. Часто ощущался запах алкоголя от внутренних органов. В легких, желудке, поджелудочной желез нередко находили кровоизлияния. В большинстве случаев в сердце отмечали расширение полостей и переполнение кровью правой его половины.

В ткани головного мозга гистологически выявлено поражение сосудов микроциркуляторного русла: дистония, парез капилляров и венул, отек и деструкция эндотелия, стазы, сладжи, периваскулярные кровоизлияния, повышение проницаемости в сосудах, плазматическое пропитывание их стенок и набухание базальных мембран. Обнаружены признаки периваскулярного и перицеллюлярного отека. Нейроны были набухшие и нередко ишемические, отмечался лизис их ядер, нейронофагия, были видны «клетки-тени».

Непосредственной причиной смерти в большинстве случаев явилась острая сердечная недостаточность, возникшая, как правило, в результате алкогольной (мозговой) комы.

При СОЭС активность этанолокисляющих ферментов определялась во всех изучаемых отделах головного мозга.

В фазе резорбции этанола отмечалось увеличение энзиматической активности АДГ в нейронах всех представленных структур при сравнении с показателями контрольной группы наблюдений (Табл.2).

При смертельном уровне алкоголемии в нейронах голубого пятна, компактном ядре черной субстанции и клетках Пуркинье мозжечка средние показатели активности АДГ были выше на 22%, 19% и 10% соответственно по сравнению с контрольной группой, однако эти различия не были статистически достоверны (Р>0,05). При смерти от отравления этанолом активность АДГ в бледном ядре срединного шва возрастала в 1,5 раза (Р<0,05). Данные различия активности АДГ оказались статистически значимыми.

В фазе элиминации этанола в группе СОЭС средние показатели активности АДГ в изученных отделах головного мозга были несколько выше (Р>0,05), чем в контрольной группе наблюдений, и составили: в области голубого пятна 4,7±0,05 балла, в области бледного ядра шва 4,4+0,04 балла, в клетках Пуркинье мозжечка 4,6±0,04 балла и в области компактного ядра черной субстанции 4,9±0,05 балла. В результате дифференцированность АДГ между изученными структурными отделами головного мозга оказалась сниженной.

Таким образом, при смерти от отравления этанолом, в фазе резорбции показатели активности "АДГ были несколько более высокими по сравнению с аналогичными в фазе элиминации (Р>0,05).

По сравнению с контрольной группой наблюдений энзиматическая активность АльДГ при смертельном отравлении этанолом в фазе его резорбции была снижена во всех медиаторно-дифференцированных отделах головного мозга (Табл.3).

В бледном ядре срединного шва при смертельной алкоголемии величина активности АльДГ была снижена (Р>0,05) на 17 % по сравнению с контрольной группой. В нейронах черной субстанции, голубого пятна и коры мозжечка снижение средних показателей активности АльДГ относительно

контрольной группы составило 38%, 41 % и 55% соответственно, что оказалось статистически достоверно (Р<0,05).

Если в контрольной группе наблюдений дифференцированность активности АльДГ была обусловлена, в основном, за счет средних показателей в клетках Пуркинье мозжечка и бледном ядре срединного шва, то в группе СОЭС различия были связаны с очень низкой активностью фермента в области голубого пятна, компактного ядра черной субстанции и клетках Пуркинье мозжечка.

Фаза элиминации этанола характеризовалась низкой активностью АльДГ в бледном ядре срединного шва и очень низкой ферментативной активностью в клетках Пуркинье мозжечка, компактном ядре черной субстанции и нейронах голубого пятна.

Средние величины активности АльДГ в фазе элиминации этанола составили: в области голубого пятна 1,1+0,02 балла, в области бледного ядра шва 2,1+0,03 балла, в клетках Пуркинье мозжечка 1,4+0,02 балла и в области компактного ядра черной субстанции 1,2+0,05 балла. Таким образом, в фазе элиминации, кроме общего снижения активности фермента, было зарегистрировано уменьшение его дифференцированности в структурных отделах головного мозга.

Нейрогистохимические изменения при хронической алкогольной интоксикации. На практическом судебно-медицинском материале проведено изучение 25 случаев смерти от хронической алкогольной интоксикации (ХАИ), которые составили группу сравнения. При смерти от ХАИ было обнаружено значительное поражение внутренних органов (алкогольная кардиомиопатия, портальный цирроз печени, хроническая алкогольная энцефалопатия, геморрагический панкреонекроз, индуративный панкреатит) с характерными осложнениями, которые и привели к смерти (острая сердечная недостаточность, кровоизлияния в вещество и оболочки головного мозга нетравматического генеза, массивная кровопотеря при варикозном расширении вен пищевода, печеночная энцефалопатия на фоне цирроза печени, панкреатогенный отек

мозга). Данную группу наблюдений составили мужчины (68%) и женщины (32%) в возрасте от 17 до 55 лет. Диагноз устанавливался комплексно с учетом катамнестических, секционных и лабораторных (судебно-химических, патогистологических, биохимических) данных. В биообъектах данной группы наблюдений согласно данным ГЖХ этанол отсутствовал.

При секционном и гистологическом исследовании в патоморфологической картине алкогольной кардиомиопатии преобладали явления кардиомегалии, диффузного кардиосклероза, неравномерной гипертрофии и атрофии кардиомиоцитов с выраженным стромальным липоматозом миокарда. Атеросклеротические изменения в сосудах нерезкие. При алкогольном циррозе печени последняя была уменьшена в размерах, плотная, мелкобугристая, на разрезе зернистая, зеленовато-желтого цвета; морфологически наблюдали признаки хронического воспаления с разрастанием соединительной ткани и нарушением гистоархитектоники органа, жировой дистрофии гепатоцитов, нередко с их некрозом. При смерти от геморрагического панкреонекроза на первый план наряду с патологией других органов выступают изменения поджелудочной железы, связанные с повышенной проницаемостью стенок сосудов с последующим отеком, образованием очаговых кровоизлияний и некрозом паренхимы и стромы железы с дистрофическими изменениями клеток паренхимы.

Микроскопически в головном мозге наблюдали периваскулярные кровоизлияния, бурую пигментацию и пролиферацию эндотелия капилляров, гиперхроматоз и сморщивание нейронов, их выпадение преимущественно вокруг сосудов, реакцию глии, чаще в виде разрастания астроцитов.

При хронической алкогольной интоксикации гистохимически было установлено, что энзиматическая активность АДГ имела место во всех изученных структурах.

В нейронах голубого пятна и компактном ядре черной субстанции выявлена низкая активность АДГ, в остальных структурах головного мозга отмечена средняя величина активности данного фермента.

По сравнению с контрольной группой наблюдений (МТ) при ХАИ активность АДГ была сниженной во всех изученных отделах мозга. В клетках Пуркинье мозжечка, компактном ядре черной субстанции и нейронах голубого пятна эти изменения были статистически достоверными (Р<0,05). При сопоставлении показателей групп исследования (СОЭС) и сравнения (ХАИ), в последней так же отмечено снижение величины активности АДГ во всех структурных отделах головного мозга (Р<0,05) (Табл.2).

Средние величины энзиматической активности АльДГ в головном мозге представлены в таблице 3. При ХАИ в нейронах голубого пятна установлена очень низкая активность АльДГ, причем относительно группы МТ она снижена на 45% (Р<0,05), а относительно группы СОЭС - на 6% (Р>0,05). В бледном ядре срединного шва и клетках Пуркинье мозжечка энзиматическая активность АльДГ при ХАИ практически не отличалась от таковой в контрольной группе наблюдений. Величина активности данного фермента в компактном ядре черной субстанции оказалась сниженной в группе ХАИ по сравнению с контрольной группой наблюдений в 1,6 раза (Р<0,05), а разница активности АльДГ между группами СОЭС и ХАИ была незначительная. Описанные изменения обусловили повышение дифференцированности активности АльДГ в изученных структурах головного мозга.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ Обсуждение результатов эпидемиологического исследования. В

работе, проведенной на основании изучения актов (заключений) судебно-медицинского и судебно-химического исследований (экспертиз), проанализирована частота встречаемости и условия смертельного исхода при отравлении этиловым спиртом в г. Владивостоке за период с 1999 по 2003 гг.

В интерпретации полученных данных необходимо отметить, что в г. Владивостоке отмечается тенденция к увеличению распространения алкоголизма среди населения. И это явление имеет достоверную негативную тенденцию - за последние 5 лет зарегистрировано увеличение частоты

смертельных отравлений этиловым спиртом в 1,1 раза, что можно объяснить нестабильностью политической и экономической ситуации в России (Наумов Э.С., Наумова Е.Ю., 1999).

Смертность, связанная с алкогольной интоксикацией, преобладает среди трудоспособного населения - 47-51 год, причем наблюдается достоверное снижение возраста умерших от смертельных отравлений, основанное на сравнении медианы и моды их возраста (на 5 лет). Данная тенденция является особенно неблагоприятной в социальном плане (Зороастров О.М., 2003).

Достаточно подробно освещено преобладание мужского населения над женским в структуре смертности вследствие отравления этанолом (Коковихин А.В., 2002; Мамедов В.К., 2004). Аналогичная ситуация характерна и для г. Владивостока: острая алкогольная интоксикация чаще сопровождает смерть мужчин (79 %), чем женщин. Коковихин А.В. (2002) выдвинул предположение о наличии влияния комплекса физиологических, психологических и социальных факторов, присущих полу, на уровень алкоголизации и крайней ее формы - случаев отравления этанолом. Однако, до конца этот вопрос в литературе не освещен.

Смерть при отравлении этиловым спиртом, как правило, наступала в вечернее или ночное время, чаще в праздничные и выходные дни. Имелись сезонные отличия количества смертельных исходов в сочетании с острой алкогольной интоксикацией: весной и летом они возникали чаще, чем осенью и зимой. Одним, но не полностью определяющим фактором изменений динамики смертности, является дисбаланс серотонина, дофамина, мелатонина со сходным ритмом сезонной и суточной активности этих нейромедиаторов (Блум Ф. и соавт., 1988). Однако, нельзя исключить роль многих других факторов, таких как экономические, социальные, бытовые.

Среди умерших от отравления этанолом преобладали лица рабочих профессий и служащие. В структуре смертности от отравления этиловым спиртом заслуживает отдельного внимания доля лиц без определенного места жительства и работы. Это может быть связано с тем, что у лиц, длительно

употребляющих этанол, наблюдается психическая и физическая деградация (Коковихин А.В., 2002).

Данные литературы свидетельствуют о важности учета фаз токсикодинамики этилового спирта (Карпищенко А.И., 1998; М1уашае М. й аИ, 1998). Общее количество исследований, при которых смерть наступила в фазу резорбции, составило 20,5 %, в ранний период элиминации - 45,5 %, в конце фазы элиминации - 34 %. Витер В.И. и Толстолуцкий В.Ю. (1995) представляют в этой связи, что причина очевидного несоответствия, с одной стороны момента воздействия повреждающего фактора, каковым является максимум концентрации алкоголя в крови, и с другой стороны запаздывания метаболических и структурных повреждений в организме, свидетельствует о том, что токсическое действие вызывает не сам этанол, а его метаболиты.

Обсуждение результатов нейрогистохимического исследования.

Корреляционный анализ активности специфических оксидоредуктаз (АДГ и АльДГ), осуществляющих каталитическое окисление алкоголя в организме человека, определяемых гистохимическими методами в веществе головного мозга трупов, позволил выделить закономерные изменения.

В контрольной группе наблюдений наиболее высокая энзиматическая активность АДГ была установлена в клетках Пуркинье мозжечка, а наиболее низкая - в бледном ядре срединного шва. Изучение распределения АльДГ показало, что максимальная энзиматическая активность определяется в клетках Пуркинье мозжечка, а минимальная - в нейронах голубого пятна и компактной части черной субстанции.

Оказалось, что при быстро наступившей смерти от механической травмы в отсутствии экзогенной ажоголемии существенные различия энзиматической активности оксидоредуктаз в медиаторно-дифференцированных нейронных структурах головного мозга связаны с низкой активностью АльДГ в компактном ядре черной субстанции и нейронах голубого пятна, высокой активностью АДГ и средней активностью АльДГ в клетках Пуркинье мозжечка.

Полученные нами данные свидетельствуют о существовании метаболической активности этанолокисляющих ферментов с одной стороны, и о дифференцированном распределении АДГ и АльДГ в структурно-функциональных отделах головного мозга - с другой. Высокая активность ферментов в клетках Пуркинье мозжечка служила косвенным показателем функциональной значимости данного отдела головного мозга. Кроме этого, дифференцированное распределение этанолокисляющих ферментов в головном мозге указывает на наличие в нем этанолзависимых, повышенно чувствительных структур, которые в условиях алкогольных эксцессов могут служить "мишенями" для токсического действия экзогенного этанола (Пиголкин Ю.И. и соавт., 2003). Полученные нами результаты исследования свидетельствуют о низкой активности АльДГ и высокой - АДГ в моноаминергических нейронах, что согласуется с имеющимися в литературе данными о соотношении величин энзиматической активности этанолоокисляющих ферментов (Pietruszko et al., 1984; Hafer et al., 1987; Коновко О.О., 1989; Морозов Ю.Е., 2002), и с представлениями о том, что изученные структуры головного мозга в условиях алкогольной интоксикации могут иметь решающее значение в формировании зависимости к этанолу (Ortiz et al., 1995; Preisig et al., 2001).

Дифференцированно распределенные в структурно-функциональных зонах головного мозга системы АДГ и АльДГ изменяют свою активность под действием этанола.

Установлено статистически достоверное возрастание активности АДГ в нейронах бледного ядра срединного шва. Величина активности АДГ при смертельном отравлении этанолом в фазу резорбции составила 4,7±0,04 балла, что на 31 % больше, чем в контрольной группе наблюдений (3,2±0,03 балла). В нейронах голубого пятна, компактном ядре черной субстанции и клетках Пуркинье мозжечка отмечалось увеличение активности АДГ, однако эти различия оказались статистически недостоверными (Р>0,05). За счет индукции

активности АДГ дифференцированность ее между структурными отделами головного мозга была сниженной.

Энзиматическая активность АльДГ одновременно снижалась во всех изученных отделах головного мозга в исследуемой группе по сравнению с контрольной, причем в нейронах черной субстанции, голубого пятна и коры мозжечка снижение активности фермента составило 38 %, 41 % и 55 % соответственно, что явилось статистически значимым (Р<0,05). Очень низкая активность фермента в 3-х перечисленных медиаторных структурах головного мозга обусловила дифференцированность активности АльДГ при смертельном отравлении этанолом.

Фаза элиминации экзогенного этанола, как и фаза его резорбции, характеризовалась одновременным увеличением активности АДГ и снижением величины активности АльДГ во всех изученных структурах головного мозга. Различия (Р>0,05) этих показателей могут служить критериями для судебно-медицинской диагностики смертельных отравлений этиловым спиртом с учетом индивидуальной толерантности к этанолу.

В головном мозге трупов лиц, смерть которых наступила от хронической алкогольной интоксикации, было установлено ингибирование активности АДГ во всех отделах головного мозга относительно контрольной (МТ) и исследуемой (ООЭС) групп наблюдений (Р<0,05) (Диаграмма 1).

В нейронах голубого пятна и компактном ядре черной субстанции показатели активности АльДГ при ХАИ (1,0±0,02 и 1,3±0,02 соответственно) оказались достоверно сниженными по сравнению с контрольной группой наблюдений (1,9±0,02 и 2,0±0,02 соответственно) и практически не отличались от аналогичных показателей в группе СОЭС (1,1±0,02 и 1,2±0,02 соответственно). При сравнении показателей группы ХАИ и контрольной группы наблюдения, разница активности АльДГ в бледном ядре срединного шва и клетках Пуркинье мозжечка была незначительной, а относительно исследуемой группы (СОЭС) - отмечалась индукция данного фермента на 15 % (Р>0,05) и 53 % (Р<0,05) соответственно (Диаграмма 2).

Диаграмма 1. Изменение активности АДГ в зависимости от причины смерти.

Диаграмма 2. Изменение активности АльДГ в зависимости от причины смерти.

Таким образом, при хронической алкогольной интоксикации наблюдается снижение активности АДГ во всех изученных структурах головного мозга относительно контрольной и исследуемой групп наблюдения, достоверное ингибирование активности АльДГ в нейронах голубого пятна и компактном ядре черной субстанции при сравнении с показателями контрольной группы наблюдений и достоверная индукция активности АльДГ в клетках Пуркинье мозжечка относительно таковой в исследуемой группе (СОЭС), причиной чего можно считать накопление этанола и ацетальдегида (Морозов Ю.Е. и соавт., 2001; Шишкина Е.Ю. и соавт., 2002). Данные показатели могут быть использованы в судебно-медицинской практике как диагностические маркеры хронической алкогольной интоксикации.

Определение активности этанолокисляющих ферментов в топохимических отделах мозга позволило выработать дифференциальные критерии для судебно-медицинской диагностики смертельных отравлений этиловым спиртом и различных форм алкогольной болезни (Табл. 4-6).

Полученные нами результаты согласуются с современными представлениями о токсическом действии этанола (Морозов Ю.Е., 2000; Пиголкин Ю.И., 2002), которые свидетельствуют о том, что нейроны с низкой активностью этанолокисляющих ферментов обладают повышенной чувствительностью к нейротоксическому эффекту алкоголя.

Таблица 4

ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНО-ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ПРИЗНАКИ СМЕРТЕЛЬНОГО ОТРАВЛЕНИЯ ЭТИЛОВЫМ СПИРТОМ (М+о)

Объекты Этанол- СОЭС МТ

нейрогистохимического окисляющие

исследования ферменты

Нейроны голубого АДГ 4,5-5,0 балла 3,6-4,0 балла

пятна АльДГ 1,0-1,2 балла 1,8-2,0 балла

Бледное ядро шва АДГ 4,5-4,9 балла 3,1-3,4 балла

АльДГ 2,1-2,5 балла 2,7-3,0 балла

Компактное ядро АДГ 4,7-5,0 балла 3,8-4,2 балла

черной субстанции АльДГ 1,0-1,2 балла 1,9-2,1 балла

Клетки Пуркинье АДГ 4,5-4,9 балла 4,1-4,5 балла

мозжечка АльДГ 1,3-1,5 балла 2,9-3,2 балла

Таблица 5

ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНО-ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ПРИЗНАКИ ХРОНИЧЕСКОЙ АЛКОГОЛЬНОЙ ИНТОКСИКАЦИИ (М+о)

Объекты Этанол- ХАИ МТ

нейрогистохимического окисляюшие

исследования ферменты

Нейроны голубого АДГ 2,0-2,4 балла 3,6-4,0 балла

пятна АльДГ 0,9-1,1 балла 1,8-2,0 балла

Бледное ядро шва АДГ- 2,7-3,1 балла 3,1-3,4 балла

Аль ДГ -

Компактное ядро АДГ 2,3-2,7 балла 3,8-4,2 балла

черной субстанции АльДГ 1,2-1,4 балла 1,9-2,1 балла

Клетки Пуркинье АДГ 2,6-3,0 балла 4,1-4,5 балла

мозжечка АльДГ - -

(примечание к таблице 5: «-»- данные недостоверны)

Таблица 6

ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНО-ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ПРИЗНАКИ ОСТРОЙ И ХРОНИЧЕСКОЙ АЛКОГОЛЬНОЙ ИНТОКСИКАЦИИ (М+о)

Объекты Этанол- соэс ХАИ

нейрогистохимического окисляющие

исследования ферменты

Нейроны голубого АДГ 4,5-5,0 балла 2,0-2,4 балла

пятна АльДГ - -

Бледное ядро шва АДГ 4,5-4,9 балла 2,7-3,1 балла

АльДГ 2,1-2,5 балла 2,6-2,9 балла

Компактное ядро АДГ 4,7-5,0 балла 2,3-2,7 балла

черной субстанции АльДГ 1,0-1,2 балла 1,2-1,4 балла

Клетки Пуркинье АДГ 4,5-4,9 балла 2,6-3,0 балла

мозжечка АльДГ 1,3-1,5 балла 2,8-3,2 балла

(примечание к таблице 6: «-»- данные недостоверны)

выводы

1. В последние годы в г. Владивостоке отмечается увеличение смертности от отравлений, связанных с употреблением алкоголя. Наибольшее количество смертельных исходов наблюдается среди мужчин трудоспособного возраста, не имеющих работы и определенного места жительства, в весенне-летний период года, вечернее и ночное время суток, праздничные и выходные дни, ранний период фазы элиминации экзогенного этилового спирта. Указанные данные, по-видимому, отражают общую тенденцию к росту смертности от острого отравления этанолом у тех же лиц и при тех же обстоятельствах, свойственных для России в целом.

2. При отсутствии признаков интоксикации этанолом установлены существенные различия активности этанолокисляющих ферментов в медиаторно-дифференцированных отделах головного мозга: в нейронах бледного ядра шва гистохимически определяется средняя величина активности АДГ и АльДГ; в клетках Пуркинье мозжечка имеется высокая активность АДГ и средняя - АлъДГ; в компактном ядре черной субстанции и нейронах голубого пятна определяется высокая активность АДГ и низкая - АльДГ.

3. Смертельное отравление этиловым спиртом характеризуется комплексом дисциркуляторных расстройств. В ткани головного мозга наблюдается поражение сосудов микроциркуляторного русла (дистония, парез капилляров, стазы, сладжи, повышение проницаемости сосудов, плазматическое пропитывание их стенок и набухание базальных мембран, отек и деструкция эндотелия, периваскулярные кровоизлияния), периваскулярный и перицеллюлярный отек, набухшие и нередко ишемические нейроны, лизис их ядер, нейронофагия.

4. Для смертельного отравления этанолом в стадии его резорбции характерно статистически достоверное увеличение активности АДГ (4,7±0,04 балла) в нейронах бледного ядра срединного шва и снижение активности

АльДГ в компактном ядре черной субстанции (1,2±0,02 балла), нейронах голубого пятна (1,1+0,02 балла) и клетках Пуркинье мозжечка (1,4±0,02 балла).

5. В случаях смертельного отравления алкоголем в стадии его элиминации наблюдается одновременное увеличение активности АДГ и снижение величины активности АльДГ во всех изученных структурах головного мозга, отсутствие статистически достоверных различий энзиматической активности между нейронами.

6. Критериями хронической алкогольной интоксикации при смерти от осложнений алкогольной болезни являются ингибирование активности обоих ферментов в ткани головного мозга.

7. Морфологическая характеристика этанолокисляющих ферментов в медиаторно-дифференцированных структурах головного мозга может служить дополнительным критерием судебно-медицинской диагностики смертельного отравления этиловым спиртом, однако, лишь в сочетании с катамнестическими, секционными, гистологическими и судебно-химическими данными.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Сравнительная характеристика морфологических изменений внутренних органов при острых отравлениях наркотиками и этанолом в судебной медицине (Обзор) (в соавт. с Ю.И. Пиголкиным, Д.В. Богомоловым, И.Н. Богомоловой, Ю.Е. Морозовым, О.В. Должанским, В.К. Мамедовым, М.К. Букешовым, А.Б. Шорниковым) // Новости науки и техн. Сер. Мед. Вып. Алкогольная болезнь / ВИНИТИ. - 2003. - № 2. - С. 1-5.

2. Дифференциальная диагностика острых отравлений наркотиками и этанолом (в соавт. с Ю.И. Пиголкиным, Д.В. Богомоловым, И.Н. Богомоловой, Ю.Е. Морозовым, О.В. Должанским, В.К. Мамедовым, М.К. Букешовым, А.Б. Шорниковым) // Судебно-медицинская экспертиза. - 2003. - № 6. - С. 37-43.

3. Значение определения алкогольокисляющих ферментов в головном мозге при отравлении этанолом // Фундаментальные науки и прогресс клинической

медицины: Ш конференция молодых ученых России с международным участием 20-24 января 2004 г., Москва, сборник тезисов, НИЦ ММА им. И.М. Сеченова, с. 314.

4. Ethanol oxidizing enzymes activity in adrenals under acute alcoholic intoxication (with Pigolkin Y.L, Mammadov V.G., Morozov Y.Y., Bukeshov M.K., Pigolkina Y.Y.) // Proceeding of the 3 rd European Academy of Forensic Science Meeting, September 22-27, Istanbul, Turkey; Forensic Science International, 2003, v. 136/suppl.l,p.327.

5. Aldehyddehydrogenase is the marker in differential diagnosis of ischemic heart disease and alcoholic cardiomyopathy in forensic medical practice (with Pigolkin Y.I., Mammadov V.G., Morozov Y.Y., Bukeshov M.K., Pigolkina Y.Y.) // Proceeding of the 3rd European Academy of Forensic Science Meeting, September 22-27, Istanbul, Turkey; Forensic Science International, 2003, v. 136/suppl. 1, p. 246247.

Отпечатано в 000 «Компания Спутник+» ПД № 1-00007 от 25.09.2000 г. Подписано в печать 12.10.04 Тираж ПО экз. Усл. п.л. 1,88 Печать авторефератов (095) 730-47-74,778-45-60

»208 65

РНБ Русский фонд

200S-4 20696

Актуальность исследования. Проблема алкоголизма на протяжении многих веков была, остается и еще долго будет актуальной для человечества в социальном, медицинском плане, а также в аспекте сохранения здорового генофонда людей (Cagdir et al., 2003). Смертность населения России от несчастных случаев, травм и отравлений занимает одно из ведущих мест, опережая показатели смертельных исходов от онкологических заболеваний (Кушнирева О.Н. и соавт., 2002). Из отчетов о деятельности региональных бюро судебно-медицинской экспертизы РФ за t

2002 год известно, что смертность от отравлений составила 27,5 %, причем ведущее место занимают случаи смертельных интоксикаций после приема этилового спирта - 55,2 %. Алкоголь способствует скоропостижной смерти от различных заболеваний, прежде всего, сердечно-сосудистой патологии (Морозов Ю.Е., 1998; Минеева Л.Д., 1999). Несчастные случаи в быту, на производстве, транспорте нередко связаны с алкогольным опьянением или его последствиями (Авходиев Г.И., Кузьмина О.В., 2002). Основная масса преступлений совершается в состоянии опьянения (Зороастров О.М., 2003).

Длительное злоупотребление алкоголем приводит к заболеванию хроническому алкоголизму (Билибин Д.П., Дворников В.Е., 1991). Приблизительно у 14 млн американцев - около 7,4 % взрослого населения -отмечены диагностические критерии алкоголизма (Dixit et al., 2000). В России число смертельных отравлений этиловым спиртом и его суррогатами остается практически одним из самых высоких в мире (Томилин В.В., Саломатин Е.М., 2001).

Немало исследований в области судебно-медицинской диагностики алкогольной интоксикации выполнено в последние годы (Красильникова Л.Н. и соавт., 1995; Наумов Э.С., Наумова Е.Ю., 1999; Пермяков А.В., I

Витер В.И., 2000; Морозов Ю.Е., 2001). В то же время недостаточно изученными остаются многие вопросы, касающиеся особенностей танатогенеза при отравлении этиловым спиртом, состояния этанолметаболизирующих ферментных систем и возможности их использования для дифференциальной диагностики причин смерти (Пиголкин Ю.И., 2003).

Согласно современным литературным данным головной мозг является одним из главных органов-мишеней для действия этанола (Пермяков А.В., Витер В.И., 2002; Пиголкин Ю.И. и соавт., 2003). Злоупотребление алкоголем ведет к прямому повреждению нервных клеток (Riihioja et al., 1999). Отмечейо, что при алкоголизме выборочно выпадают нейроны в ядрах головного мозга (Baker et al., 1996; Harding et al., 1997). Окисление этанола с участием оксидоредуктаз - алкогольдегидрогеназы (АДГ) и ацетальдегидцегидрогеназы (АльДГ) - представляет собой основной путь метаболизма алкоголя в организме (J. Hashimoto et al., 1977; Т. Watabiki et al., 1989; P.A. Motavkin et al., 1990; S.M. Zimatkin et al., 1997). Степень их влияния также может быть определена в зависимости от медиаторной организации нервных центров (Арушанян Э.Б., 1977; Tabakoff et al., 1987). Наиболее чувствительными структурами для токсического действия экзогенного этаноЛа являются моноаминергические нейроны, в результате чего их рассматривают как критические центры (Motavkin et al., 1990; Пиголкин Ю.И. и соавт., 2003).

Изменение поведения, эмоциональные расстройства и симптомы психопатологических состояний, характерные для алкоголизма, имеют прямую связь с нарушением нейромедиаторных систем (Сытинский И.А., 1980; Tabakoff et al., 2000).

Учитывая, что нейромедиаторная система нарушается при алкоголизме (Tabakoff et al., 1980; Weiss et al., 2002), данный факт позволяет предположить актуальность de гистохимического изучения в приложении к алкогольной интоксикации.

Исходя из вышеизложенного, целью исследования явилось:

Выяснение закономерностей метаболизма этилового спирта по показателям активности этанолокисляющих ферментов в медиаторно-дифференцированных структурах головного мозга и возможности использования указанных закономерностей для судебно-медицинской диагностики смертельных отравлений этанолом.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи исследования:

1. Провести эпидемиологический анализ судебно-медицинских заключений (актов) экспертиз (исследований) трупов на примере одного из регионов России с целью определения распространенности и условий смертельных отравлений этанолом.

2. Установить нормальное распределение активности этанолокисляющих ферментов в медиаторно-дифференцированных отделах головного мозга.

3. Изучить активность алкоголь- и альдегиддегидрогеназы в моноаминергических ядрах головного мозга при смертельном отравлении этиловым спиртом, а также у лиц с хронической алкогольной интоксикацией и умерших трезвыми от осложнений алкогольной болезни.

4. Определить возможность использования результатов настоящего исследования в качестве дополнительных критериев для судебно-медицинской диагностики смерти от отравления этанолом и алкогольной болезни.

Новизна исследования. На основании данных Приморского областного бюро судебно-медицинской экспертизы впервые проведен анализ случаев смертельного отравления этанолом по г. Владивостоку за последние 5 лет (1999-2003 гг.), в котором отражена тенденция к увеличению распространения алкоголизма. Проведено определение окисляющих этанол ферментов в медиаторно-дифференцированных нервных центрах на практическом судебно-медицинском материале.

Установлены закономерности распределения и изменения гистохимической активности алкогольдегидрогеназы и ацетальдегиддегидрогеназы в структурных отделах головного мозга при смерти от различных причин. На основании полученных данных предложены дополнительные судебно-медицинские критерии диагностики острой и хронической алкогольной интоксикации с учетом индивидуальной толерантности к этиловому спирту. 1

Практическая значимость. Использование дополнительных объективных критериев поражения головного мозга, предложенных в диссертации, позволяет повысить точность судебно-медицинской и патологоанатомической диагностики острой и хронической алкогольной интоксикации, а также провести их дифференциальную диагностику.

Структура диссертации. Работа включает введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследований, результаты собственного исследования, 'обсуждение результатов и выводы. Список литературы включает 246 источников, из них 143 на русском языке и 103 — на иностранных. Текст изложен на 153 страницах, содержит 16 таблиц, иллюстрирован 21 микрофотографиями и 20 диаграммами. В конце работы помещено развернутое приложение показателей активности этанолокисляющих ферментов, полученных в результате исследования (5 стр.).

выводы

1. В последние годы в г. Владивостоке отмечается увеличение г смертности от отравлений, связанных с употреблением алкоголя. I

Наибольшее количество смертельных исходов наблюдается среди мужчин

5 трудоспособного возраста, не имеющих работы и определенного места

I жительства, в весенне-летний период года, вечернее и ночное время суток, ■ праздничные и выходные дни, ранний период фазы элиминации экзогенного этилового спирта. Указанные данные, по-видимому, отражают 1 з общую тенденцию к росту смертности от острого отравления этанолом у тех же лиц и при тех же обстоятельствах, свойственных для России в целом.

• 2. При отсутствии признаков интоксикации этанолом установлены существенные различия активности этанолокисляющих ферментов в медиаторно-дифференцированных отделах головного мозга: в нейронах

I бледного ядра шва гистохимически определяется средняя величина г активности АДГ и АльДГ; в клетках Пуркинье мозжечка имеется высокая

I активность АДГ и средняя - АльДГ; в компактном ядре черной субстанции ' ■ и нейронах голубого пятна определяется высокая активность АДГ и низкая

-АльДГ.

3. Смертельное отравление этиловым спиртом характеризуется ; комплексом дисциркуляторных расстройств. В ткани головного мозга наблюдается поражение сосудов микроциркуляторного русла (дистония, парез капилляров, стазы, сладжи, повышение проницаемости сосудов, плазматическое пропитывание их стенок и набухание базальных мембран, отек и деструкция эндотелия, периваскулярные кровоизлияния), | периваскулярный и перицеллюлярный отек, набухшие и нередко ишемические нейроны, лизис их ядер, нейронофагия.

4. Для смертельного отравления этанолом в стадии его резорбции характерно статистически достоверное увеличение активности АДГ

4,7+0,04 балла) в нейронах бледного ядра срединного шва и снижение активности АльДГ в компактном ядре черной субстанции (1,2±0,02 балла), нейронах голубого пятна (1,1±0,02 балла) и клетках Пуркинье мозжечка (1,4±0,02 балла).

5. В случаях смертельного отравления алкоголем в стадии его элиминации наблюдается одновременное увеличение активности АДГ и снижение величины активности АльДГ во всех изученных структурах головного мозга, отсутствие статистически достоверных различий энзиматической активности между нейронами.

6. Критериями хронической алкогольной интоксикации при смерти от осложнений алкогольной болезни являются ингибирование активности обоих ферментов в ткани головного мозга.

7. Морфологическая характеристика этанолокисляющих ферментов в медиаторно-дифференцированных структурах головного мозга может служить дополнительным критерием судебно-медицинской диагностики смертельного отравления этиловым спиртом, однако, лишь в сочетании с катамнестическими, секционными, гистологическими и судебно-химическими данными.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Для объективизации данных, полученных в результате судебно-медицинского исследования трупа при острой алкогольной интоксикации, необходимо использовать унифицированные подходы к исследованию головного мозга с соблюдением правил изъятия, фиксации, проводки и окраски секционного материала. В настоящих рекомендациях приведены основные условия проведения гистохимической реакции для одновременного определения активности АДГ и АльДГ в одном гистопрепарате и признаки судебно-медицинской диагностики алкогольной интоксикации по изменениям активности этанолокисляющих ферментов головного мозга.

После изъятия фрагментов головного мозга их помещают на полоску фильтровальной бумаги и в биксе с сухим льдом доставляют в лабораторию и переносят в предварительно охлажденную до -18° С камеру криостата. Образцы монтируют на столике микротома МК-25 так, чтобы срезы соответствовали фронтальному сечению мозга, при наклоне ножа микротома 7,5° готовят срезы головного мозга толщиной 25 мкм. Полученные срезы размещают на предметных стеклах, расправляют кисточкой, размораживают пальцем и подсушивают на воздухе. Ферментативная активность АДГ и АльДГ в ткани мозга определяется по методу \yatabiki Т. (1989). Предметные стекла со срезами размещают в инкубационных контейнерах, где проводят фиксацию 2 минуты в 2 % глутаральдегиде (ОЬА) в 0,1 % фосфатном буфере, РН 7,4 при 4° С, а затем промывка в том же буфере 1 час при 4° С. Инкубация срезов выполняется в два этапа:

1. Определение активности АДГ по интенсивности выпавшего осадка формазана синего цвета.

Фиксированные срезы инкубируют в течение 30 минут при 37° С в растворе следующего состава: 0,1 М фосфатный буфер, рН 7,4 - 10 мл; 45% этанол - 3 мл; нитротетразолиевый синий 16,4 mg/6 ml - 6 мл; дистиллированная вода - 1,0 мл; NAD - 60 мг; PMS - 3 мг.

После инкубации срезы промывают в дистиллированной воде 10 минут при 4° С. Для образования металл-формазанового комплекса контейнеры со срезами помещают в 40 мМ сульфат меди в дистиллированной воде на 30 минут при 4° С, а затем промывают в дистиллированной воде 10 минут при той же температуре.

2. Определение активности АльДГ по интенсивности выпавшего осадка ферроцианида меди коричневого цвета.

Те же срезы инкубируют 60 минут при 37° С в растворе следующего состава: 0,1 М фосфатный буфер, pH 7,4 - 10 мл; 0,1 М sodium citrate - 0,8 мл - 30 мМ сульфат меди - 2 мл; дистиллированная вода - 2,2 мл; 5 мМ potassium ferricyanide - 2 мл; 900 мМ ацетальдегид - 3 мл; NAD - 60 мг.

После инкубации срезы промывают в дистиллированной воде, фиксируют, обезвоживают, просветляют в ксилоле и заключают в бальзам.

Препараты изучают на оптическом микроскопе. Гистотопографию нейронов уточняют с помощью контрольных срезов, окрашенных гематоксилином и эозином и по Нисслю.

Величину активности ферментов оценивают в баллах от 0 до 5-ти: 0 баллов - отсутствие активности; 1 балл - очень низкая активность; 2 балла - низкая активность; 3 балла - средняя активность; 4 балла - сильная активность; 5 баллов - очень сильная активность. Рассчитывают средний показатель значения активности ферментов на основании ее определения не менее, чем в 20 участках исследуемого объекта.

Ниже приводятся доверительные интервалы величины активности ферментов метаболизма экзогенного этанола в головном мозге при различных причинах смерти.

Для случаев смерти от острой кровопотери в результате механической травмы (контрольная группа наблюдений) характерен следующий комплекс показателей:

- нейроны голубого пятна: АДГ - 3,6-4,0 балла, АльДГ - 1,8-2,0 балла;

- бледное ядро срединного шва: АДГ - 3,1-3,4 балла, АльДГ - 2,7-3,0 балла;

- компактное ядро черной субстанции: АДГ - 3,8-4,2 балла, АльДГ -1,9-2,1 балла;

- клетки Пуркинье мозжечка: АДГ - 4,1-4,5 балла, АльДГ - 2,9-3,2 балла.

При смертельном отравлении этанолом выявлены следующие показатели:

1) в фазе резорбции этилового спирта:

- нейроны голубого пятна: АДГ - 4,5-5,0 балла, АльДГ - 1,0-1,2 балла;

- бледное ядро срединного шва: АДГ - 4,5-4,9 балла, АльДГ - 2,1-2,5 балла;

- компактное ядро черной субстанции: АДГ - 4,7-5,0 балла, АльДГ

1.0-1,2 балла;

- клетки Пуркинье мозжечка: АДГ - 4,5-4,9 балла, АльДГ - 1,3-1,5 балла.

2) в фазе элиминации этилового спирта:

- нейроны голубого пятна: АДГ - 4,4-4,8 балла, АльДГ - 1,1-1,3 балла;

- бледное ядро срединного шва: АДГ - 4,1-4,6 балла, АльДГ - 2,0-2,2 балла;

- компактное ядро черной субстанции: АДГ - 4,6-4,9 балла, АльДГ

1.1-1,3 балла;

- клетки Пуркинье мозжечка: АДГ - 4,3-4,7 балла, АльДГ - 1,2-1,4 балла.

Для случаев смерти от хронической алкогольной интоксикации характерна следующая совокупность показателей:

- нейроны голубого пятна: АДГ - 2,0-2,4 балла, АльДГ - 0,9-1,1 балла;

- бледное ядро срединного шва: АДГ - 2,7-3,1 балла, АльДГ - 2,6-2,9 балла;

- компактное ядро черной субстанции: АДГ - 2,3-2,7 балла, АльДГ -1,2-1,4 балла;

- клетки Пуркинье мозжечка: АДГ - 2,6-3,0 балла, АльДГ - 2,8-3,2 балла.