Автореферат и диссертация по медицине (14.00.23) на тему:Морфофункциональная характеристика дефинитивного миокарда при культивировании в организме животных

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И МЕДИЦИНСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ОРЕНБУРГСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ

На правах рукописи ДЕДКОВ Эдуард Иванович

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДЕФИНИТИВНОГО МИОКАРДА ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ В ОРГАНИЗМЕ ЖИВОТНЫХ

14.00.23 - гистология, цитология, эмбриология

и ; > ■ 1 ■ 1 ».

2 9 АПР

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И МЕДИЦИНСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ОРЕНБУРГСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ

На правах рукописи ДЕДКОВ Эдуард Иванович

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДЕФИНИТИВНОГО МИОКАРДА ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ В ОРГАНИЗМЕ ЖИВОТНЫХ

14.00.23 - гистология, цитология, эмбриология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Работа выполнена на кафедре гистологии, цитологии и эмбриологии Оренбургской государственной медицинской академии.

Научный руководитель

Доктор биологических наук, профессор СТАДНИКОВ А.А.

Официальные оппоненты —

Доктор медицинских наук, заслуженный деятель науки РФ, профессор ДУНАЕВ П.В.

Доктор медицинских наук, профессор ЯМЩИКОВ Н.В.

Ведущее учреждение —

Защита состоится

¿ащи

ш

Российская Военно-медицинская академия.

«—ЗА_»_ЩЛ

.1996 г.

часов на заседании диссертационного совета К 084.51.02 при Оренбургской государственной медицинской академии по адресу: 460000, г.Оренбург, ул.Советская,6. Тел. (3532) 47-61-03, факс (3532) 47-94-08.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Оренбургской государственной медицинской академии.

Автореферат разослан «.

Щ2

.1996 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук, доцент

СЕМЧЕНКО Ю.П.

ОБЩАЯ

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Среди наиболее значимых проблем современной морфологии сердца ведущее значение занимают исследования структурных основ жизнедеятельности миокарда. К настоящему времени широко представлены светооптическая и ультраструктурная характеристики эмбриогенеза мышцы сердца (Румянцев,1967; Manasek,1968а; V¡-ragh.Challice, 1973; Anversa et al.,1975). Обоснованы основные проявления репарации поврежденного миокарда (Zak, 1974; Клишов,1977; Румянцев,1982). Подчеркнуто важнейшее значение для компенсации нарушенных функций этого органа механизмов внутриклеточной регенерации и процессов гиперплазии ультраструктур кардиомиоцитов (Глаголева,Чечулин,1967; Саркисов,Втюрин,1967; Dusek et al.,1971; Orón,Mandelberg,1985; Маркво, Колосова, 1986; Vracko et al.,1988а). Выявлены возможности сердечных миоцитов (СМ) к определенным формам клеточной репродукции (Klinge,Stocker,1968; Neffgen,Korec-ky, 1972; Сидорова, Большакова,1976; Katzberg et al.,1977;Rumyant-sev,1977; Бродский,Урываева, 1981). Установлены базисные процессы гистогенезов, закономерности реорганизации тканевых элементов миокарда и характер их взаимодействия на этапах постнаталь-ного развития с позиций иерархического принципа построения живых систем и клеточно-дифферонной организации тканей (Ямщиков,1973; Korecky,Rakusan,1978; Bugaisky,Zak, 1979; Anversa et al.,1980; Большакова,1981 ;Румянцев,1982; Cluzeaut.Maurer-Schult-ze,1986; lcardo,1988; Данилов,Ибрагимова,1993).

Стержневыми в теории репаративной регенерации миокарда взрослых млекопитающих по-прежнему являются вопросы об источниках происхождения и механизмах развития тканевых компонентов мышцы сердца в процессе восстановления органоспецифической структуры.

В данной проблеме открытыми остаются вопросы, касающиеся особенностей реактивных и регенераторных возможностей СМ и немышечных клеток (НК) сердца, характера их взаимодействия в очаге повреждения друг с другом и с пришлыми клетками воспаления. Требуют уточнений сведения о роли, которую играют различные клеточные элементы миокарда на этапах репарации и о влиянии на этот процесс межсистемных регуляторных факторов.

Известно, что в миокарде взрослых млекопитающих отсутствует обособленный пул миогенных клеток-предшественников (Sasaki et al.,1968; Manasek,1970; Weinstein,Hay,1970), а в условиях патологического или экспериментального воздействия на сердце наряду с

активизацией интерстициальных элементов отмечается лишь незначительная реинициация синтеза ДНК в дефинитивных СМ (Мира-кян,Румянцев,1968; Roña,Kahn, 1969; Lochner et ai.,1973; Таланкин,1975; Rumyantsev,Kassem,1976; Махова,Шляпников,1978). В этой связи большинство исследователей утверждают, что репаративные процессы в мышце сердца ограничиваются только внутриклеточной регенерацией краевых СМ и развитием в области повреждения соединительной ткани (Bing,1951 ;Сидорова, Большакова,1976; KIs-cher.Shetlar, 1979; Новиков,Хлопонин,1982; Nag et al.,1983;Vracko et al.,1989). Тем не менее в отдельных работах встречаются указания на появление в области деструкции миокарда переживающих мио-генных клеточных форм, которые, как полагают, в определенных условиях способны обеспечивать его полноценную регенерацию (Op-pel,1901; Anitsckow, 1913; Воронов, 1975; Polezhaev,1980; Butler,1989).

В последние годы большое внимание уделяется поиску различных, и в первую очередь нейроэндокринных факторов, участвующих в регуляции тканевого гомеостаза, в том числе процессов репара-тивных гистогенезов (Zachary et al., 1987; Стадников,1989). Однако работ, изучающих влияние гипоталамических факторов на диапазон гисто- и органотипических свойств миокарда, очень мало (Hamao-ka,Sawada,1987), особенно в плане исследования их прямого воздействия на клеточные элементы мышцы сердца.

Таким образом, имеется ряд малоизученных и дискуссионных вопросов о механизмах реорганизации (ремодуляции) СМ и НК миокарда, характере их взаимоотношений при повреждении сердца, в том числе и в условиях экспериментальных моделей.

Правильное понимание и оценка диапазона компенсаторно-приспособительных возможностей дефинитивного миокарда в цепи претерпеваемых им превращений могут быть осуществлены лишь при условии точного учета последовательности структурных преобразований различных гистологических компонентов органа в тесной их взаимосвязи друг с другом (Хлопин,1946). В этом отношении экспериментальная методика, в первую очередь метод органотипических культур, может дать достаточно ясные результаты в связи с выявлением общих и специальных закономерностей реактивных изменений и взаимодействий СМ и НК сердца при измененных условиях существования. Это обеспечивает прочные основы для правильной трактовки некоторых гистопатологических процессов в сердце, возникающих в частности при заживлении поврежденного миокарда или в условиях трансплантации органа.

Цель и задачи исследования.

Цель исследования: Изучение морфофункциональных свойств, гисто- и органотипических потенций, взаимоотношений СМ и НК де-

финитивного миокарда левого желудочка (ЛЖ) в условиях культивирования in vivo, а также установление характера прямого воздействия на них нейроэндокринных факторов крупноклеточных ядер гипоталамуса.

Задачи исследования:

1. Изучить на светооптическом и ультраструктурном уровнях особенности имплантационного процесса, закономерности морфофун-кциональных превращений и реактивные свойства СМ и НК миокарда ЛЖ взрослой крысы при культивировании в организме по методу Лазаренко.

2. Выяснить характер реактивных изменений, объем гисто- и органотипических потенций и межклеточные взаимоотношения структурных элементов миокарда при культивировании в диффузионных камерах (ДК) ¡n vivo.

3. Определить фенотипические особенности и характер взаимодействия СМ и НК миокарда в условиях его совместного культивирования с супраоптическими (СО) и/или паравентрикулярными (ПВ) ядрами гипоталамуса в двойных ДК in vivo.

Научная новизна исследования.

Впервые проведено культивирование дефинитивного миокарда млекопитающих по методу Лазаренко и изучение его имплантаци-онных превращений на светооптическом и электронномикроскопи-ческом уровнях. Получены новые данные о характере реактивных изменений дефинитивных кардиомиоцитов. Выявлены ультраструктурные особенности клеток интерстиция и микрососудов трансплантированной мышцы сердца. Описана морфология миоидных элементов, появляющихся в проекции разрушающихся фрагментов культивируемого миокарда. Получены дополнительные доказательства ор-ганоспецифичности интерстициальных соединительнотканных элементов миокарда и сосудов микроциркуляции, проявляющиеся в условиях культивирования мышцы сердца in vivo. Обнаружены новые факты, подтверждающие положение о стойкой детерминированности тканеспецифических свойств СМ и НК миокарда. Впервые показан диапазон органо- и гистобластических потенций предсуществую-щих в миокарде НК при культивировании в ДК. Впервые установлено прямое влияние нонапептидов гипоталамуса на характер реорганизации клеток миокарда при его совместном культивировании в двойных ДК с крупноклеточными ядрами. Сформулировано положение о разнонаправленном влиянии факторов СО и ПВ ядер на диапазон компенсаторно-приспособительных возможностей НК миокарда.

Научно-практическая значимость работы.

Полученные результаты позволяют дополнить существующие представления о закономерностях репаративного процесса в миокарде взрослых млекопитающих. Они создают теоретическую базу для дальнейшего уточнения механизмов восстановления поврежденного миокарда человека. Выявленные в описательном плане констатации фенотипической реорганизации реактивно измененных СМ и различных видов НК расширяют представления о диапазоне их биологических потенций в условиях органотипического культивирования мышцы сердца in vivo. Проведенное исследование открывает перспективы для последующего изучения прямого влияния нонапепти-дов крупноклеточных ядер гипоталамуса на процессы гибели, переживания, пролиферации, роста и цитодифференцировки клеток дефинитивного миокарда, в том числе и для целей коррекции репаративного кардиомиогенеза. В своей совокупности полученные данные создают предпосылки для дальнейшего развития научной базы прикладных аспектов клинической кардиологии.

Внедрение.

Результаты работы используются в учебном процессе при изложении материала на лекциях и проведении практических занятий со студентами на кафедрах гистологии Оренбургской медицинской академии, Омской медицинской академии, Ярославской медицинской академии; на кафедре анатомии и гистологии Оренбургского аграрного университета; на кафедре анатомии, физиологии человека и животных Оренбургского педагогического института. •

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Культивирование дефинитивного миокарда ЛЖ in vivo выявило полиморфный характер реактивных изменений кардиомиоцитов (дегенерирующие, переживающие и перестраивающиеся клетки).

2. Стадийность превращений, наблюдаемая в условиях классической модели культивирования по методу Лазаренко, в имплантированных фрагментах мышцы сердца частично прослеживается только для клеток соединительной ткани и микрососудов интерсти-ция, в то время как в отношении СМ полностью отсутствует.

3. Условия органотипического культивирования миокарда in vivo обнажают морфогенетическую гетерогенность составляющих его клеточных популяций. Сформулировано положение о необходимости комплексной оценки гисто- и органобластических потенций всех тканевых элементов миокарда в процессе установления диапазона его компенсаторно-приспособительных возможностей.

4. В процессе реорганизации фрагментов миокарда при культивировании in vivo обнаружены органоспецифические особенности фе-

нотипических превращений клеточных элементов соединительной ткани интерстиция и сосудов микроциркуляции.

5. Нонапептиды гипоталамуса при совместном культивировании крупноклеточных нейросекреторных ядер и фрагментов мышцы сердца в двойных ДК in vivo в ранние сроки оказывают на СМ и НК адаптационное воздействие. В то время как на поздних стадиях они, в основном, играют роль факторов, усиливающих активизацию, пролиферацию и гистотипический рост клеток интерстиция и микрососудов трансплантированного миокарда.

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на:

1.Всесоюзной научной конференции студентов и молодых ученых «Физиология и патология сердечно-сосудистой системы» (Махачкала, 1991). 2.Всесоюзной научной конференции студентов и молодых ученых «Актуальные проблемы клинической и экспериментальной кардиологии» (Киев, 1991). 3.Научной конференции молодых ученых-медиков «Молодыеученые -здравоохранению» (Оренбург, 1992). 4.XI итоговой конференции молодых ученых-медиков «Молодые ученые - здравоохранению» (Оренбург, 1993). 5.Научной конференции «Критерии и методы оценки жизнеспособности тканей в раневом процессе» (С-Петербург,1993). 6.II Всероссийской научной конференции «Влияние антропогенных факторов на структурные преобразования органов, тканей, клеток человека и животных» (Саратов, 1993). 7.XII итоговой конференции молодых ученых-медиков «Молодые ученые-здравоохранению», посвященной 50-летию института (Оренбург, 1994). 8.Ill Съезде анатомов, гистологов, эмбриологов Российской Федерации (Тюмень, 1994). 9.IV Всероссийской конференции «Нейро-эндокринология - 95» (С-Петербург,1995). Ю.Региональной конференции молодых ученых и специалистов (Оренбург, 1995). 11.111 Всероссийской научной конференции «Влияние антропогенных факторов на структурные преобразования клеток, тканей и органов человека и животных» (Волгоград, 1995). 12.Научной конференции «Гистогенез и регенерация тканей», посвященной памяти проф. А.А.Кли-шова (С-Петербург,1995). 13.11 съезде физиологов Сибири и Дальнего Востока (Новосибирск, 1995). 14.XII итоговой конференции «Молодые ученые - здравоохранению» (Оренбург,1995). ^.Международном научном конгрессе студентов, аспирантов и молодых ученых «Молодежь и наука - третье тысячелетие /YSTM-96/ » (Москва.1996).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 16 научных работ.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 217 страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, обзора литературы, главы «Материал и методы исследования», 3-х глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов с данными литературы и выводов. Диссертация иллюстрирована 96 рисунками, 6 таблицами. Библиография включает 129 отечественных и 278 зарубежных источников. Диссертация написана на русском языке.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы исследования.

Работа выполнена на 185 белых беспородных крысах-самцах массой 180-230 г. Проведены 3 серии экспериментов по органотипи-ческому культивированию in vivo кусочков интрамурального миокарда средней трети свободной стенки ЛЖ. В первой серии опытов использован метод культивирования в организме по Лазаренко (1959). Во второй - применялось культивирование миокарда в ДК (Евгень-ева,1983). В третьей серии проведено совместное культивирование кусочков мышцы сердца с фрагментами гипоталамуса, содержащими СО и/или ПВ ядра в двойных ДК. Выделение крупноклеточных ядер гипоталамуса производили при помощи микроскопа МБС-9, используя стереоiaiu,H-iei,i\/i¿ карты (Cypciü с согвт.,196?) Для контроля в третьей серии опытов сокультивировали кусочки миокарда с участками коры больших полушарий (КБП).

Исследование имплантатов проведено через 1,3,6,8 и 10 сут. от начала культивирования. Всего изучено 332 имплантата (в первой серии опытов - 50, во-второй - 51, в-третьей - 231).

Для светооптического исследования материал фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина и после стандартной гистологической обработки заливали в парафин. Срезы толщиной'5-6 мкм окрашивали гематоксилином Майера и эозином, пикрофуксином по ван-Гизону и методом Массона.

Для электронно-микроскопического исследования материал фиксировали в смеси 2% параформальдегида и 2,5% глутаральде-гида на 0,1 M фосфатном буфере по Glauert (1975). Постфиксирова-ли в 2% растворе 0s04 на том же буфере. Обезвоживали в спирте возрастающей концентрации и абсолютном ацетоне. Образцы заключали в смесь эпон-812 и аралдит (Уикли,1975). На ультратоме LKB-V с блоков получали полутонкие и ультратонкие срезы. Полутонкие срезы окрашивали метиленовым синим и основным фуксином (Sato, Shamoto, 1973), фотографировали в световом микроскопе при помощи микрофотонасадки МФН-12. Ультратонкие срезы подвергали

двойному контрастированию в насыщенном спиртовом растворе ура-нилацетата и цитрате свинца (Reynolds, 1963), просматривали и фотографировали в электронном микроскопе ЭМВ 100АК при увеличениях от 4000 до 24000.

Светооптическая авторадиография проведена на парафиновых и полутонких срезах. Для изучения ДНК-синтетической способности клеток использован ЗН-тимидин (3,7x104 Бк/1 г массы). Для приготовления гистоавтографов использовали жидкую эмульсию типа «Р» (производства НИИХИМфото) по методике Жинкина (1959). Меченными считали клетки, ядра которых содержали не менее 5 зерен серебра.

Количественная информация о размерах ядер, ядрышек и цитоплазмы клеток получена в ходе морфометрических исследований полутонких срезов в световом микроскопе при использовании винтового окуляр-микрометра MOB-I-I5* у4.2.

Стереологический анализ проведен при помощи наложения точечной сетки на микрофотографии (Стропус с соавт., 1986). Определяли объемную плотность (относительный объем) ядер и цитоплазмы кардиомиоцитов (Непомнящих с соавт., 1986).

При проведении статистического анализа вычисляли среднеарифметические значения и их среднеквадратические отклонения. Оценка различий сравниваемых показателей проводилась с помощью t-критерия Стьюдента при заданном уровне значимости Р<0,05 и Р<0,01. Обработка полученных данных проведена в соответствии с рекомендациями Автандилова (1990).

Результаты исследования и их обсуждение.

Культивирование миокарда по методу Лазаренко.

Обнаружено, что стадийность превращений, наблюдаемая по классическому варианту метода для эпителиальных тканей (Лазаренко, 1959), в имплантированной мышце сердца частично прослеживается только для клеток соединительной ткани интерстиция, эн-дотелиоцитов и периваскулярных элементов микрососудов, в то время как для СМ полностью отсутствует.

В ранние сроки культивирования (через 1-3 сут.) клеточные элементы миокарда имеют выраженный гетероморфизм реактивных изменений. В сердечной мышечной ткани выделены три группы СМ: переживающие, дегенерирующие и перестраивающиеся формы.

Переживающие кардиомиоциты имеют светлые эухроматичные ядра, незначительно измененную цитоархитектонику и сохранную ци-толемму. Однако, как правило, в таких СМ наблюдаются просветление гиало- и кариоплазмы, свидетельствующие об умеренном внутриклеточном отеке.

В дегенерирующих СМ отсутствует поперечная исчерченность, ядра пикнотизированы, гомогенизированная цитоплазма подвергается глыбчатому распаду. В отдельных клетках заметны волны пересокращения миофибрилл. На ультраструктурном уровне в таких кардиомиоцитах отмечаются дискомпозиция внутриклеточных структур, многочисленные разрывы сарколеммы и выход органелл в межклеточное пространство.

Полученные сведения об альтеративных изменениях СМ подтверждают представления о том, что ведущим фактором в их гибели являются ишемия (или гипоксия) и нарушения целостности сарколеммы (Jennings,Ganóte, 1974; Ganóte et al.,1977; Schaper et al.,1979; Шаров с соавт.,1988).

Главным признаком перестраивающихся СМ на светооптичес-ком уровне является присутствие сохранного ядра на фоне деструктивно измененной цитоплазмы клетки. Электронно-микроскопическое исследование таких кардиомиоцитов показало наличие в проекции их клеточной территории ядерно-цитоплазматических комплексов (ЯЦК), отграниченных от остальных частей клетки при помощи элементарной цитоплазматической мембраны.

При интерпретации этого феномена необходимо учитывать данные Nag (1980) о присутствии в миокарде взрослых крыс макрофаго-подобных клеток, располагающихся в тесной пространственной взаимосвязи с интактными кардиомиоцитами. Кроме того появление подобных структур в СМ может свидетельствовать о процессах секвестрации или аутофагии некротизированных участков цитоплазмы культивируемых клеток (Sybers et al.,1979; Авцын,Шахламов,1979; Nag et al.,1903a). Имеются также сведения о возможности обособления из культей мышечных волокон поврежденного миокарда миогенных (ми-областоподобных) клеточных элементов (Oppel, 1901; Anitsckow, 1913; Чэнь Ди,1957; Запрягаев, 1971; Миракян,Шперлинг,1972; Воронов,1975; Полежаев,1975). Однако отсутствие митотической активности в наблюдаемых нами ЯЦК позволяет рассматривать их скорее как аналог палимбластов («paiimblasts»), появление которых впервые было показано в поврежденном миокарде взрослых крыс Butler (1989).

В интерстиции и микрососудах также присутствуют клеточные элементы с различной степенью структурных преобразований: погибающие, переживающие и активизированные формы.

Дегенерирующие клетки в это время элиминируются макрофагами реципиента и в незначительной степени путем аутолиза. Выявленное разнообразие реактивно измененных форм СМ и НК миокарда согласуется с понятием о структурной надежности биологических систем в обеспечении компенсаторно-приспособительных реакций, которая базируется на общем принципе асинхронной работы однои-

менных тканевых и клеточных элементов (Крыжановский,1974; Сар-кисов,1977).

На 3 сут. культивирования в проекции органоспецифических фрагментов миокарда наблюдались дифференцирующиеся миоид-ные элементы. Однако источник происхождения таких клеток установить не удалось.

Присутствие в имплантатах миокарда на этом этапе переживающих, погибающих и активизированных эндотелиоцитов указывает на различную их реактивность в условиях культивирования in vivo. Это подтверждает положение о морфофункциональной неоднородности эндотелия (Чернух с соавт.,1984), что, вероятно, отражается в мозаичном характере его ответа на данное воздействие.

Активизированные эндотелиальные клетки гемокапилляров в ряде случаев формировали почки роста. При этом в микрососудах мышцы сердца наблюдаются также многочисленные переживающие и активизированные перициты и леймиоциты. В этой связи мы полагаем, что эндотелиальные и периваскулярные клетки сосудов мик-роциркуляторного русла миокарда обладают значительной устойчивостью к действию повреждающих факторов и способны широко проявлять свои гисто- и органотипические потенции в условиях репара-тивной регенерации сердца.

На поздних сроках эксперимента (6, 8 и 10 сут.) в кусочках мышцы сердца нарастает гибель СМ. Интерстициальные фибробласты и макрофаги выходят из депрессивного состояния и начинают активно функционировать. В связи с тем, что на светооптическом уровне идентификация таких клеток строилась в зависимости от их фенотипи-ческих особенностей и места локализации в культивируемом фрагменте миокарда, при их описании были использованы термины фиб-робластоподобные (ФбПК) и макрофагоподобные клетки (МфПК). Мы полагали, что в межмышечных промежутках присутствовали преимущественно ФбПК, в то время как в в проекции разрушающихся кар-диомиоцитов - МфПК. Соединительнотканные клетки миокарда, как правило, имели крупные размеры и в большом количестве содержали ОВ. При этом их ядра практически не включали ЗН-тимидин. По сравнению с ними клеточные элементы развивающейся грануляционной ткани реципиента (фибробласты, эндотелиоциты и макрофаги) не содержали ОВ и интенсивно инкорпорировали ЗН-тимидин. Эти факты рассматриваются нами в свете положения, указывающего на приобретение соединительнотканными клетками в составе разных органов специфических биологических особенностей (Хлопин,1946).

В межмышечных промежутках миокардиальных кусочков через 6 сут. имплантационного процесса наблюдаются многоклеточные тяжи из активизированных эндотелиоцитов. От скоплений ФбПК они отличались более плотным характером расположения, отсутствием

в цитоплазме ОВ и способностью клеток к митотическому делению. При этом на 8-10 сут. культивирования вокруг таких многоклеточных образований формируется базальная мембрана и в центре появляется щелевидный просвет. Полученные факты подтверждают положение о стойкой детерминированности эндотелиоцитов сердца и сохранении ими в условиях культивирования гистобластических потенций (Хлопин,1946; 51пгпопезки,5Ыопе5ки,1979; №еез е1 а1.,1981; □дНо е1 а1.,1988; СгаГе ^ а1.,1993).

Следует заметить, что при анализе полученного в данных экспериментах материала возникали существенные затруднения в отношении оценки тканеспецифических свойств пересаженных структур в связи с проникновением в них клеток из организма «хозяина» (реципиента).

Культивирование миокарда в подкожно имплантированных диффузионных камерах.

Метод культивирования тканей в ДК исключает возможность проникновения в трансплантируемый материал клеток из организма реципиента (А1д1ге е1 а1.,1954; Лурия,1963). В этой связи наблюдаемые в камерах трансформационные превращения мы считаем проявлением только «внутренних» компенсаторно-приспособительных возможностей миокарда, основанных на гисто- и органотипических потенциях его тканевых элементов.

Через 1 сут. культивирования кусочков мышцы сердца в ДК также наблюдается выраженный гетероморфизм реактивных изменений кардиомиоцитов и НК миокарда.

В общей популяции СМ присутствуют дегенерирующие, переживающие и перестраивающиеся клетки. В проекции последних нередко определялись изолированные структуры подобные малодиф-ференцированным элементам. В интерстициальной соединительной ткани обнаружены погибающие и переживающие клеточные формы. В стенках гемокапилляров и артериол в большом количестве отмечаются активизированные клетки.

Перициты и леймиоциты отделяются от стенок микрососудов и мигрируют по межмышечным промежуткам. В цитоплазме они часто содержат округлые ОВ. Реорганизующиеся эндотелиоциты придают гемокапиллярам вид клеточного тяжа или многоядерного симплас-та. В артериолах эндотелиальные клетки утрачивают полярность и приобретают звездчатую форму. Полученные нами сведения о структурной перестройке эндотелиоцитов микрососудов в органотипических культурах согласуются с данными других авторов (А1о1'з1 е1 а1., 1970; Пийрсоо,1980). При этом отростчатая форма эндотелиальных клеток в артериолах вероятно является отражением снятия с них контактного торможения и приобретения эндотелиоцитами способности

к передвижению (Haudenschild,1980).

На 3-6 сут. в кусочках миокарда увеличивается число дегенерирующих СМ. В межмышечных промежутках появляются немногочисленные ФбПК, аналогичные описанным ранее в имплантатах миокарда при его культивировании по методу Лазаренко.

В сосудах микроциркуляции усиливаются процессы реорганизации клеточных элементов. В просвете артериол образуются скопления округлых эндотелиальных клеток, формирующих эпителиальные островки. Полученные факты подтверждают способность культивируемых эндотелиоцитов к росту в виде эпителиоморфного пласта (Gimbrone,1976; Schwartz, 1978; Миронов с соавт.,1985). Отделившиеся перициты и леймиоциты приобретают отростчатую или удлиненную форму и становятся похожими на ФбПК. Вместе с последними они мигрируют по межмышечным промежуткам. Выявленный феномен о приобретении гладкомышечными клетками сосудов в процессе их структурной ремодуляции фибробластического фенотипа согласуются с данными Кауфман (1987). Эти же результаты доказывают способность модифицированных леймиоцитов к активному передвижению (Kisher,Shetlar,1979; Vracko,Thorning,1991; Kawahara et al., 1990).

Нами сделано заключение, что приобретение различными клетками микрососудов (перициты, леймиоциты и эндотелиоциты) однотипного фибробластоподобного строения в условиях культивирования мышцы сердца in vivo еще раз подчеркивает общность их мезен-химального генеза (Заварзин,1945).

Через 6 сут. в культивируемых фрагментах присутствуют в основном дегенерирующие СМ. Одновременно в интерстициальных промежутках обнаружены скопления ФбПК.

На 8-10 сут. в трансплантатах наблюдаются различные виды новообразованных клеток.

В проекции разрушающихся СМ присутствуют немногочисленные макрофагические элементы, среди которых имелись крупные МфПК и небольшие макрофаги. Полученные факты подтверждают сведения о незначительном количестве фагоцитирующих элементов, изначально присутствующих в интерстициальной соединительной ткани интрамурального миокарда in situ (Cutilletta et al., 1977; Непомнящих, 1991). Фенотипическое разнообразие этих клеток, вероятно, является отражением гетерогенности их происхождения (Wada.Pol-lak,1967; Запрягаев,1971; Newman et al.,1971; Garfield et al.,1975; Nag,1980; Чернух с соавт.,1984).

В интерстициальных промежутках кусочков миокарда наблюдаются тяжи из фибробластоподобных и веретеновидных клеток. Рядом с ними обнаружены также клеточные элементы с многочисленными ОВ, которые получили название - липофаги. Мигрирующие

на периферию ФбПК формируют вокруг трансплантатов зону роста.

По краю мышечных фрагментов располагаются полостные образования щелевидной и пузыревидной формы, напоминающие си-нусоидоподобные капилляры. Появление в трансплантатах новообразованных сосудов подтверждает принцип непрерывного разрастания эндотелия (Серов,Шехтер,1981; Чернух с соавт.,1984; Саркисов, 1987). Кроме того наличие в зоне роста на отдалении от края мио-кардиальных кусочков среди фенотипически однотипных ФбПК крупнопетлистых разрастаний из активно пролиферирующих эндотелио-цитов свидетельствует о способности их к передвижению на значительные расстояния. Полученные сведения можно трактовать как феномен образования сосудов in situ из ФбПК-предшественников (Rongish et al., 1994). Однако эти же факты могут свидетельствовать и о проявлении эндотелием своих гистобластических потенций как эпителиального пласта, который отвечает на повреждение и условия культивирования стереотипной (миграционной) реакцией (Schwartz et al., 1978). Особенности строения новообразующихся в зоне роста кусочков мышцы сердца сосудистых структур, вероятно, являются отражением различных морфогенетических потенций гетерогенной популяции эндотелиоцитов интрамурального миокарда, возникающих в процессе его васкулогенеза из разных эмбриональных источников (Manasek,1971; Hirakow,1983; Hutchins etal.,1988; Vi-ragh,Kalman,-1989). При этом способность эндотелиальных клеток микрососудов мышцы сердца формировать в культуральных условиях гистотипичсские структуры свидетельствует о стойкой детерминированности их гисто- и органобластических потенций.

Культивирование миокарда совместно с крупноклеточными ядрами гипоталамуса в подкожно имплантированных двойных диффузионных камерах.

Используя комбинацию колец в двойных ДК можно изучать зависимость роста одной ткани от другой и характер действия на клетки различных регуляторных факторов (Евгеньева,1983).

Для проверки одного из механизмов мобилизации компенсаторно-приспособительных возможностей СМ и НК сердца, реализуемых на уровне межсистемной регуляции процессов репаративного кар-диомиогенеза, мы исследовали влияние на трансформационные процессы в миокардиальных кусочках нонапептидов крупноклеточных ядер гипоталамуса.

В опыте и контроле (сокультивирование с КБП), в основном, выявлена этапность структурных превращений, ранее уже показанная в ДК для миокардиальных кусочков. Однако следует отметить и некоторые специфические особенности структурной реорганизации СМ и НК миокарда, возникающих, по-видимому, под действием ней-

росекреторных факторов.

Через 1 сут. опыта в трансплантатах наблюдаются кардиомио-циты только двух типов: дегенерирующие и переживающие. При этом в последних отмечается хорошая адаптированность к условиям со-культивирования в ДК. Это подтверждают увеличение объема ядер и размеров цитоплазмы переживающих СМ (табл.1).

Пока затруднительно объяснить механизм прямого адаптоген-ного эффекта нейросекреторных факторов крупноклеточных ядер ги-

Таблица 1.

Морфометрические и стереометрические показатели переживающих кардиомиоцитов через 1 сут. опыта (М±т)

Измеряемый параметр Контроль Опыт

Объем ядер (мкм3) 58,5±6,3 108,2±12,3**

Объемная плотность ядер (%) 2,1 ±0,1 2,5±0,1*

Площадь поперечного

сечения ядер (мкм2) 10,4±1,7 18,7±3,1*

Объемная плотность

цитоплазмы (%) 6,6±0,5 8,4±6,1

Площадь поперечного

сечения цитоплазмы (мкм2) 366,5±53,7 476±58,8

* Различия по сравнению с контролем значимы при Р<0,05. ** Различия по сравнению с контролем значимы при Р<0,01.

поталамуса на культивируемые СМ. Тем более, что присутствие мембранных рецепторов к гипоталамическим нонапептидам у дефинитивных кардиомиоцитов пока достоверно не обнаружено (Ыгазау/а ег а1.,1994).

На последующих этапах сокультивирования (3,6,8 и 10 сут.) происходит выраженная деструкция переживающих СМ.

Со стороны клеток соединительной ткани интерстиция и сосудов микроциркуляции в это время наблюдаются прогрессирующая активизация, пролиферация и рост. При этом уже на 6 сут. в пересаженных кусочках мышцы сердца отмечается заметный гетероморфизм новообразованных клеточных элементов. Одновременно происходит формирование вокруг трансплантатов зоны роста.

Через 8 сут. от начала эксперимента, в сравнении с контролем,

наблюдается усиление пролиферативной активности новообразую-щихся клеточных элементов. Кроме того в МфПК обнаружено увеличение объемов ядра, ядрышка и цитоплазмы (табл.2). В зоне роста веретеновидные и фибробластоподобные клетки имеют плотный характер расположения в виде «частокола». При этом у ФбПК значительно возрастает синтетическая активность, о чем свидетельствует гипертрофия их ядрышкдвого аппарата (табл.2).

В доступной литературе нами не обнаружено указаний о прямом влиянии нонапептидов гипоталамуса на соединительнотканные

Таблица 2.

Морфометрические показатели ФбПК (Ф) и МфПК (М) через 8 сут. опыта (М±т)

Измеряемый параметр Контроль Опыт

Объем ядер (мкм3) Объем ядрышек (мкм3) Площадь цитоплазмы (мкм2) Объем ядер Ф (мкм3) Объем ядрышек Ф (мкм!) 107,7±25,4 5,9±1,7 4857,6±1637,9 367,8±69,5 7,9±1,2 244,3±69,9 7,6±3,9 8326,1±1384,5 355,9+68,9 18,03+4,8*

* Различия по сравнению с контролем значимы при Р<0,05.

клетки мышцы сердца. В этой связи нерешенными остаются вопросы в отношении механизмов прямого или опосредованного (пара/ аутокринного) действия гипоталамических нейропептидов на гипертрофические и гиперпластические процессы в клеточных элементах соединительной ткани культивируемого миокарда.

На 10 сут. опыта в зоне роста заметны крупные синусоидопо-добные капилляры, глубоко внедряющиеся в межмышечные промежутки пересаженных кусочков миокарда. Клетки в таких эндотели-альных разрастаниях проявляют высокую митотическую активность. Перикапиллярно всегда присутствовали липофаги и ФбПК.

При раздельном культивировании кусочков миокарда с крупноклеточными ядрами гипоталамуса на фоне однотипных изменений со стороны СМ значительно более выраженная активизация клеток соединительной ткани и сосудов микроциркуляции обнаружена в опытах с СО ядрами. В то время как в экспериментах с ПВ ядрами при отсутствии соединительнотканной реакции отмечалось повышенное накопление ОВ в гладкомышечных клетках.

Как известно, содержание вазопрессина в СО ядре в два раза выше, чем в ПВ, при этом в последнем, наоборот, преобладает секреция окситоцина (Palkovits, 1983; Mannisto,1987; Угрюмов,1989). Учитывая эти особенности структурно-функциональной организации СО и ПВ ядер гипоталамуса, можно предположить, что адаптивное, гиперпластическое и гипертрофическое действие на интерстициаль-ные тканевые элементы мышцы сердца оказывает преимущественно вазопрессин. В то время как окситоцин при сохранении адаптивного эффекта на СМ в ранние сроки культивирования, вероятно, отвечает за депонирование жировых включений в леймиоцитах микрососудов.

ВЫВОДЫ

1. Стадийность превращений, описанная Лазаренко и его последователями при культивировании in vivo эпителиальных тканей, в имплантированной мышце сердца взрослых крыс частично прослеживается только для клеток соединительной ткани интерстиция, эн-дотелиоцитови периваскулярных элементов микрососудов, в то время как в отношении СМ она отсутствует.

2. В ранние сроки культивирования in vivo (1-3 сут.) дефинитивные кардиомиоциты и НК (фибробласты, макрофаги, эндотелиоци-ты, перициты и леймиоциты) проявляют гетероморфный характер реактивных изменений (погибающие, переживающие, активизированные и перестраивающиеся формы клеток).

3. Приобретение различными клетками интерстиция и микрососудов миокарда в органотипической культуре однотипного фибро-бластоподобного строения (3-6 сут.) подтверждает единство их эмбрионального происхождения их мезенхимального источника.

4. Появление на поздних этапах культивирования мышцы сердца (8-10 сут.) фибробластоподобных, макрофагоподобных клеток и новообразующихся капилляров на фоне тотально погибающих СМ подтверждают высокую устойчивость клеточных элементов интерстиция и микрососудов к действию повреждающих факторов и их способность в большей степени, чем кардиомиоцитов, проявлять свои гисто- и органобластические потенции в репаративном процессе.

5. Крупные размеры фибробластоподобных и макрофагоподобных клеток в кусочках миокарда донора, наличие в их цитоплазме многочисленных округлых осмиофильных включений и отсутствии у них ДНК синтетической способности по сравнению с клеточными элементами грануляционной ткани реципиента (фибробласты, эндоте-лиальные клетки и макрофаги) могут свидетельствовать об органо-специфических особенностях реактивно измененных соединительнотканных клеток мышцы сердца, проявляющихся в условиях культи-

вирования in vivo.

6. На всех стадиях имплантационного процесса в кусочках миокарда не образуются миосимпластические структуры, свойственные поперечнополосатой мышечной ткани скелетного типа, что является дополнительным свидетельством стойкой детерминированности гис-тотипических свойств дефинитивных кардиомиоцитов и подтверждает принадлежность сердечной мышечной ткани к самостоятельному тканевому типу.

7. На этапах культивирования фрагментов мышцы сердца в условиях ДК получены сходные результаты о структурно-функциональных изменениях СМ и НК миокарда по сравнению с обнаруженными в аналогичные сроки имплантации по методу Лазаренко. При этом удалось более четко проследить характер адаптации, реорганизации, роста и цитодифференцировки предсуществующих в пересаженных кусочках клеток интерстиция и микрососудов (фибробласты, макрофаги, эндотелиоциты, перициты, леймиоциты).

8. Новообразование в трансплантатах миокарда при культивировании в ДК (8-10 сут.) эндотелиальных разрастаний подтверждает стойкую биологическую детерминированность эндотелиальных клеток микрососудов мышцы сердца и сохранение ими органо- и гисто-бластических потенций. Описанные особенности формирующихся структур (тонкостенные синусоидоподобные капилляры, распластанные крупнопетлистые или сетевидные образования), вероятно, являются отражением гетерогенности клеточной популяции эндотели-оцитов интрамурального миокарда взрослых млекопитающих.

9. Совместное культивирование в двойных ДК кусочков миокарда ЛЖ с супраоптическими и/или паравентрикулярными ядрами гипоталамуса показало хорошую сохранность НСК (6-8 сут.). Нонапеп-тиды гипоталамуса в ранние сроки (1 сут.) оказывают на кардиомио-циты адаптогенный эффект (переживание и гипертрофия большого числа клеток). На поздних стадиях (8-10 сут.) они в основном играют роль факторов, усиливающих активизацию, пролиферацию и гистотипический рост клеток интерстиция и сосудов микроциркуляции трансплантированных фрагментов мышцы сердца.

10. В своей совокупности полученные результаты о фенотипи-ческих проявлениях реактивных изменений СМ и НК дефинитивного миокарда и реализации ими гистобластических потенций в различных вариантах культивирования ¡n vivo свидетельствуют о резервных «внутренних» компенсаторно-приспособительных возможностях тканевых элементов мышцы сердца взрослых млекопитающих, осуществляемых в условиях измененного структурного гомеостаза при участии факторов внутри- и межсистемной регуляции.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Светооптическое и электронномикроскопическое исследование сердечной мышечной ткани в культуре in vivo. В кн.: Тезисы докладов Всесоюзной научной конференции студентов и молодых ученых «Актуальные проблемы клинической и экспериментальной кардиологии». Киев, 1991, с.27.

2. О гисто- и органотипических потенциях миокарда, выявленных в условиях эксперимента. В кн.: Тез. докл. конференции патофизиологов Урала «Системные и клеточные механизмы адаптации организма к действию повреждающих факторов». Челябинск, 1991, с.140-141 (соавт. АА.Стадников, С.Д.Валов, И.И Рыбкин).

3. Изучение морфогенетических потенций дефинитивных кардиомиоцитов в условиях их культивирования по методу Ф.МЛазаренко. В кн.: Тез. докл. в VIII зональной научно - практической конференции молодых ученых «Медико-биологические и экологические проблемы развития Севера». Архангельск, 1992, с.34-36.

4. Об оценке специфичности реактивно измененных кардиомиоцитов в условиях культур тканей и экспериментального инфаркта миокарда. В кн.: Материалы научной конференции «Критерии и методы оценки жизнеспособности тканей в раневом процессе». С-Петербург, 1993, с.43. (соавт. А.А.Стадников, И.И.Рыбкин).

5. Изучение роли гипоталамических нонапептидов какмежуровневых регуляторов тканевого гомеостаза в условиях культивирования тканей в организме и вне организма. В кн.: Материалы 2-й Всероссийской конференции «Влияние антропогенных факторов на структурные преобразования органов, тканей, клеток человека и животных». Саратов, 1993, ч.З, с.108. (соавт. А.А.Стадников, С.Д.Валов, А.Н.Мухортова, И.И.Рыбкин).

6. О роли гопоталамических нонапептидов и монаминов в регуляции процессов пролиферации и цитодифференцировки покровных, железистых эпители-ев и некоторых эндокриноцитов. В кн.: Сборник научных трудов ученых Оренбургского государственного медицинского института «Актуальные вопросы теоретической и клинической медицины». Оренбург,1994, T.XXIX, с.60-65 (соавт. А.А.Стад-ников, Н.Н.Шевлюк, И.И.Рыбкин, Ю.П.Семченко, А.Н.Мухортова, С.Д.Валов, В.С.Полякова, М.Ф.Митрофанова).

7. О новых подходах к изучению элементарных процессов репаративных гистогенезов. В кн.: Материалы III съезда анатомов, гистологов, эмбриологов Российской Федерации. Тюмень, 1994, с.191. (соавт. ААСтадников, АН. Мухортова, И.И.Рыбкин).

3. Структурные основы нейроэндокринной регуляции реактивных, пластических и регенераторных возможностей тканей целомического и эпидермального типов (сердце и органы, производные головной кишки). Российские морфологические ведомости, 1994, N.4, с.62. (соавт. ААСтадников, И.И.Рыбкин, Ю.П.Семченко, А.Н.Мухортова).

9. Ультраструктурные особенности реактивных изменений кардиомиоцитов взрослых крыс при культивировании in vivo. Морфология, 1994, т.106, N 4-6, с.124-129 (соавт. ААСтадников).

10. О существенном значении гипоталамических нонапептидов (ГН) и монаминов (МА) как межуровневых регуляторов репаративных гистогенезов. В кн.:Те-зисы докладов IV-й Всероссийской конференции «Нейроэндокринология-95».С-Петербург, 1995, с.117. (соавт. A.A. Стадников, И.И. Рыбкин, А.Н. Мухортова, Л.В.Ковбык, Л.И. Завершинская).

11. К вопросу об источниках репаративного миокардиогенеза. В кн.: Тезисы докладов региональной конференции молодых ученых и специалистов. Оренбург, 1995, с.41-42.

12. Характер изменения цитоскелета кардиомиоцитов (КМ Ц) крыс в условиях экспериментального инфаркта миокарда (ИМ) и в процессе культивирования в организме по Ф.МЛазаренко и in vitro. В кн.: Материалы 3-й Всероссийской научной конференции «Влияние антропогенных факторов на структурные преобразования клеток, тканей и органов человека и животных». Волгоград, 1995, с.113. (соавт. И.И.Рыбкин).

13. Изучение гисто- и органотипических свойств миокарда при культивировании в диффузионных камерах. В кн.: Материалы научной конференции «Гистогенез и регенерация тканей», посвященной памяти профессора ААКпишова. С-Петербург, 1995, с.40. (соавт. ААСтадников).

14. Морфофункциональные аспекты прямого влияния гипоталамических нонапептидов на тканевые элементы дефинитивного миокарда. В кн.: Тезисы научных сообщений II съезда физиологов Сибири и Дальнего Востока. Новосибирск, 1995, Часть 1,с.131-132.

15. Характер межклеточных взаимоотношений в процессе репаративного мио-кардиогенеза. В кн.: Тезисы докладов II конгресса кардиологов Центральной Азии. Ал-маты, 1995, с.180. (соавт. ААСтадников).

16. Изменения миокарда взрослых крыс при культивировании в диффузу онных камерах in vivo. Морфология, 1995, т.108, N.2, с.46-48.

ДЕДКОВ Эдуард Иванович

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДЕФИНИТИВНОГО МИОКАРДА ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ В ОРГАНИЗМЕ ЖИВОТНЫХ

Подписано в печать 10.04.1996 г.

Объем 1,25 п.л. Формат 60х84'/16; Гарнитура «Ариал».

Бумага офсетная №1. Тираж 150 эк~. Заказ №759

Смакетировано и отпечатано в типографии АО «ДиМур» Оренбург, Челюскинцев, 17. Тел. (3532) 72-87-02