Автореферат и диссертация по медицине (14.00.15) на тему:Морфо-функциональная характеристика клеточных защитных механизмов при аспергиллезе

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ ПОСЛЕДИПЛОМНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

ЛАБУНЕЦ Ирина Анатольевна

МОРФО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КЛЕТОЧНЫХ ЗАЩИТНЫХ МЕХАНИЗМОВ ПРИ АСПЕРГИЛЛЕЗЕ

14.00.13 - патологическая анатомия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой . степени кандидата медицинских наук

РГ8 ОД 1 7 ДЫ1 1393

На правах рукописи

Санкт-Петербург - 1993 -

Работа выполнена в Санкт-Петербургской медицинской академии последипломного образования.

Научный руководитель -

Член-корреспондент РАМН, заслуженный деятель науки Российской федерации профессор О.К.Хмельницкий

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор А.В.Цинзерлинг

доктор медицинских наук, профессор Р.А.Аравийский

Ведущее учреждение -

Санкт-Петербургский Государственный санитарно-гигиенический медицинский институт.

г

? /¿'защите диссертации состоится " ^ " О^/'Уо^^ ^¿^ 1994гв _часов на заседании специализированного ученого совете

Д 074.16.04- по защите докторских диссертаций при Санкт-Петербургской медицинской академии последипломного образования по адресу: 193015, Санкт-Петербург, ул. Салтыкова-Щедрина, 41.

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке института.

Автореферат разослан Ученый секретарь специализированного совета кандидат медицинских наук

-Ж" 99ЭГ.

/

А.В.Соболев

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. В последние десятилетия для многих развитых стран мира, в том числе и для стран СНГ, микозы, вызываемые условно-патогенными грибами, становятся все более острой медико-социальной проблемой. Увеличивается число Сольных, страдающих различными формами микозов (Материалы II Международного микологического симпозиума, 1991 г.). В зарубежной и отечественной литературе приводятся статистические данные о неуклонном росте асперлищезиой инфекции, что может быть связано как с широким распространением асперпшюв в природе, устойчивость» их спор к факторам внешней среда (Malla Ы., Renard И., Charplti J., 1983; Staib P., 1984; и др.), так и использованием этих грибов в ка, честве промышленных продуцентов антибиотиков, химических веществ и кормовых добавок.

Указывается, что аспергиллез развивается на фоне вторичного иммунодефицита. Снижение иммунной реактивности может быть связано с широким применением современных лекарственных препаратов (антибиотики широкого спектра действия, кортикостероиды, цитостатики и др.), с ионизируюцэй радиацией, а также с участившимися случаями заболеваний, которые, в свою очередь, создают благоприятный фон для развития микотических осложнений. К таким заболеваниям относятся туберкулез (особенно кавернозный) (Земсковв З.С., Дорок-кова И.Р., 1973; Караев 3.0., Яробкова Н.Д., Быков В.Л., 1988; Греймер М.С., Стрепетова Т.Н., Соловьева. Т.Н., 1988; Bader С.,1965; Saitou Yukio, Yamaguohi Y., et.al, 1988), гемобластозы, цирроз печени, сахарный диабет, опухоли, аутоиммунные болезни, AIDS (ВИЧ - инфекция) (Григорьев Б.А., 1984; Alvarez A., Suarez J.U., et.al., 1989; Khawand N.. JoneB 0., et.al.,1989; Berta L., Boldorinl R., et.al., 1989; Ihidi R., Lagier R., et.al., 1989).

Аспергиллы способны поражать любые органы и ткани. Развитие заболевания сопровождается интоксикацией и аллергизацией организма (Кашкин П.Н., Шэклаков Н.Д., 1978). Различают изолированные системные поражения и генерализованные формы инфекции, возникающие в результате гематогенной или лимфогенной диссеминации. Наиболее часто аспергиллы поражают бронхо-легочный аппарат и придаточные пазухи носа, реже - другие внутренние органы. Описаны аспергиллез желудочно-кишечного тракта, кожи, головного мозга, печени, почек и сердца. Единичные данные свидетельствуют о поражении железистых органов (поджелудочной, предстательной, щитовидной и молочной жолез), а также лимфоузлов. Опубликованы данные об

- А -

обнарукании аспергиллов в периферической крови и. костном мозге (AtkinBon J.В., Connor D.N., Robinowltz Ы., 1934s GreBenquet Q., Belek i., et.al., 1989).

Несмотря на большое количество морфэлогичвскга; исследований, посвященных органопатологии аспергиллеза, в. настоящее время: остаются неизученными некоторые асягосш. л^мс^ф^в^Г;^^^«».^»)-лования. Нет целостного представления, о заветных клеточных реакциях при развитии этой ш^кцяи. Вероятно, это связано с тем, что данные по патологической анатомии аспергиллеза основаны главным образом на изучении отдельных наблюдений в разные сроки болезни баз учета последовательности развития-ив5экционного процесса. В связи с этим, сведения о Фагоцитарной активности лейкоцитов и макрофагов в отношении аспергилл весьма противоречивы. Предпринятые попытки воспроизведения аспергиллеза в эксперименте не ставили своей целью выяснить последовательность защитных клеточных реакций и создать представление о патоморфогенезе этой инфекции. Учитывая вышэизлокенное, мы отказались от неосуществимой задачи воспроизвести в опыте патоморфогенез аспергиллеза целиком и предприняли попытку изучения основных его звеньев на внутрибрю-шинной модели заражения морских свинок спорами Aspergillus iumigatus. Проследить "завязку" аспергиллеза, начиная с возможно более ранних сроков взаимодействия гриба с тканями организма. Выявить последовательность развивающихся защитных клеточных реакций, которые обеспечивают санацию организма от возбудителя. Одновременно мы преследовали задачу рассмотреть систему взаимодействия "макроорганизм - микроорганизм" (Мм) при аспергиллезе с особым обращением внимания на состояние иммунокомпетентных органов.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью настоящего исследования является изучение защитных клеточных реакций при внутрибрюшшном заражении морских свинок спорами Aspergillus fumigatua и выявление особенностей течения инфекционного процесса с учетом морфо-функционального состояния иммунной системы.

Для выполнения поставленной цели было намечено решение следующих задач:

1. Разработать адекватную поставленной цели модель внутриб-рюшшшого заражения кивотных минимальными дозами возбудителя, вызывающими инфекционный процесс, поддающийся комплексному патомор-

Дологическому исследованию.

2. Изучить в эксперименте патоморфогенез аспергиллеза у морских свинок при интактной иммунной системе.

3. Сопоставить последовательность защитных тканевых и неточных реакций при аспергиллезе с морфофункциональным состоянием иммунокомпетвнтной системы (ИКС), изменениями в крови, с патомор-фологическими изменениями во внутренних органах и микологическими показателями (высевами из брюшной полости и крови).

4. Для выявления особенностей неспецифической резистентности организма изучить функциональную активность нейтрофильных грану-лоцитов (НГ) и соотношение основных клеточных элементов, обеспечивающих защитные реакции.

5. На основа комплексного изучения экспериментального аспер-гиллеза при интраперитонеальном заражении животных выяснить закономерности взаимоотношений в системе "макроорганизм-микроорганизм" (Мм) при возникающем инфекционном процессе.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА ИССЛЕДОВАНИЯ. Впервые проведено комплексное гисто- цитоморфологическое исследование экспериментального еспергиллеза брюшой полости с оценкой функционального состояния ИКС, жизнеспособности гриба АврегвШив Гиглigat.ua, функциональной активности различных звеньев клеточной защиты в динамике.

Выявлено, что отдельные штаммы гриба Аврег§111ив гит^а^а являются достаточно патогенными и токсигенными, и в малых дозах способны вызывать инфекционный процесс, подтвержденный соответствующими сдвигами з периферической крови, в органах ИКС, изменениями в большом сальнике и внутренних органах, а также подтвержденный микологическими высовами из бршной полости и определением жизнеспособности гриба.

Установлено, что Аврег^Шиа Гип^а1ив способен выбывать достаточно выраженный вторичный иммунодефицит у интактных зшвот-1шх, тем самым приводя к неполно ценности ивттних клеточных механизмов, выражающейся в удлинении периода санации организма от возбудителя и усилении фиброплзстмческих процессов.

Впервые в патсморфогенезе аспоргиллеза отмочена циклическая эстафетная передача защитных функций от И' к макрофагам (МФ), а в случае несостоятельности к инактивации возбудителя возможность передачи этой функции новой популяции НГ.

ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ И ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РАБОТЫ. На экспериментальной модели внутрибрюшшного заражения морских свинок малыми дозами Аврег§111ив Гша^иш изучена последовательная смена защитных клеточных реакций в большом сальнике, морфофункциональное состояние гриба и окружающей ткани, изменения в органах ИКС и внутренних органах (сердце, печени, легких, почках) и периферической крови.

Уточнены и дополнены представления о течении оспергиллезной инфекции в условиях интактной иммунной системы, о взаимоотношениях различных клеточных популяций, участвующих в санации очага воспаления.Отмечены особенности защитных клеточных реакций при аспергиллезэ, которые могут.быть использованы для дифференциальной диагностики с другими микотическимл инфекциями.

. ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ РАБОТЫ. Утверждены два рационализаторских предложения: "Способ моделирования аспергиллезной инфекции в эксперименте" (БРИЗ СПб МАЛО, Н1296 от 23.11.93Г.) и "Способ фиксации и окраски цитологических мазков при диагностике аспергиллеза" (БРИЗ МАЛО. Н1295 от 23.11.93г.).

Данные, полученные в.диссертационной работе, внедрены в лекционные курсы и семинарские занятия на кафедре патологической анатомии СПб МАЛО. '

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации доложены на научных заседаниях кафедры патологической анатомии СПб МАЛО (1991, 1992, 1993), на заседании Петербургского научного общества патологоанатомов (1993, 1993), на заседании круглого стола "Актуальные проблемы медицинской микологии (1993), на Международном семинаре "Проблемы моделирования патологических процессов у человека и животных и испытание биологически активных препаратов" (1992). По теме диссертации опубликовано 2 работы, 2 приняты к печати.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ. ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Особенностью изучения патоморфогенеза вспэргиллеЗа в эксперименте является невозможность воспроизведения инфекционного процесса полностью соответствующего клинике, так как у человека аспергиллез развивается на фоне предшествующей патологии и вторичного иммунодефицита. Целесообразно изучение отдельных звеньев

патологического процесса для выяснения последовательности защит-г ты клеточных механизмов при этой инфекции.

2. Модель внутрибрюшинного заражения морских свинок малыми дозами Aspergillus funiigatus позволяет изучить ратше стадии инфекционного процесса и механизмы санации организма от возбудителя.

3. Клеточные реакции при аспергиллезном перитоните характеризуются преобладающей ролью НГ в защитных механизмах на ранних этапах воспалительного процесса, в передаче фагоцитарной и споро-цидной функций МФ в более поздние сроки. При несостоятельности перитонеальных МФ полностью инактивировать возбудитель, защитные функции переходят к новой популяции НГ.

4. Пагоморфологичоскт изменения в ИКС и внутренних органах показывают, что Aspergillus funigatua даже в минимальной заражающей дозе способен оказывать иммунодепрессивное и токсическое действие на организм.

СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертационная работа изложена на 211 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4 .глав (Обзор литературы, Материалы и метода, Собственные исследования, Обсуждение результатов), заключения, выводов и списка использованной литературы. Диссертация содержит 7 таблиц, 18 графиков; иллюстративный материал представлен 68 микрофотографиями. Указатель литературы включает источников, в том «иоле отечественных и зарубежных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Экспериментальный материал. Для комплексного морфологического исследования использованы 160 самцов морских свинок массой 200-230 г, полученных из питомника п.Раплоловс.

Моделирование инфекционного процесса проводилось .путем заражения животных малой дозой гриба Aspergillus iumigatua, а именно 50 ооо конидий в I мл изотонического раствора хлорида натрия (ИРХН). Культура Aspergillus funigatuu была выделена от больного генерализованным аспергиллезом непосредственно перед опытами и любезно предоставлена сотрудниками лаборатории живых культур НИО глубоких микозов СПб МАЛО. Грибы выращивали на агаре Чапека при 37 °С в течение 7 суток.

Объект и методы исследования. Все исследования проводились

комплексно и анализировались по совокупности данных, дополняя друг друга. Изучены мазки-отпечатки сальника, брыжейки и брюшинной полости. В целях систематизации и объективизации исследований был разработан алгоритм изучения препаратов большого сальника, позволивший максимально унифицировать полученные результаты. Ци-тограммы сальника определяли по общепринятой в цитологической практике методике (Автандалов Г.Г., 1984) как процентное соотношение различных клеток специфической и неспецифической резистентности. Функциональное состояние НГ оценивали по количественному содержанию гликогена ("Цитохимические исследования лейкоцитов", 1970) и по содержании нефермэнтных катионных белков лизосом с использованием лизосомально-катионного теста (ЖТ) по В.Е.Пигарввс-кому (1978). Жизнеспособность спор в сальнике изучали по пленкам и мазкам-отпечаткам, окрашенным прочным зеленым и докрашенным азу-ром А путем определения процентного, соотношения неокрашенных (на-тивных, жизнеспособных) спор к окрашенным прочным зеленым (за счет осаждения на них неферментшх катионных. белков лизосом НГ, то есть частично утилизированных) или азуром А (расценивались как нежизнеспособные споры с нарушенной клеточной стенкой). На всех сроках для контроля кизнеспособности спор, а также для оценки течения инфекционного процесса осуществлялся полуколичбственный высев из бршной полости на твердые питательные среда Сабуро и Чапека и количественный посев крови на жидкую среду Сабуро по общепринятой в микологической практике методике. Параллельно иссследовали перифе-ческую кровь на количественное содержание лейкоцитов, эритроцитов и процентное соотношение различных клеточных элементов крови (гемограммы).

Морфологические изменения в легких, сердца, почках и печени изучали на гистологических препаратах с целью выявления токсического действия гриба на ткани внутренних органов, а также для исключения генерализации инфекции.

Оценку состояния ИКС проводили в соответствии с рекомендациями ВОЗ (А.Котье, К.Тюрк, А.Собен, 1973) и отработанными на нашей рафедре морфологическими методами (Хмельницкий O.K., Беля-нин В.Л. и др., 1983; 1986) с определением количества'малых лимфоцитов, плазмоцитов, макрофагов, митозов, а в тимусе ретикулоэ-пителиальных клеток, средних лимфоцитов и лимфэбластов в условной единице площади, а также соотношения толщины коры и мозгового вещества .тииуса. Морфомэтрические исследования проводили по методу

Г.Г.Автандилова (1984) и на приборе "Интеграл 2МТ". Иммунологические исследования по определению удельной концентрации клеток в органах ИКС и содержанию Г- и В-лимфоцитов осуществляли на сроках 7, 14 и 21 сутки на базе НИ лаборатории биорегуляторов СПб BMA.

Методы фиксации и окраски гистосрезов,. пленочных препаратов и мазков-отпечатков указаны в таблице.

Методы Фиксирующая Окраски и цитохимические

жидкость реакции

Общегистоло- 10$ нейтральный Гематоксилин-эозин; Азур-эозин;

гические формалин Грам-Вейгерт

Цитологичес- 96% этанол; Гематоксилин-эозин; Азур-эозин по

кие См. Никифорова Романовскому-Гимзе;

10% нейтральный

формалин

Цито-химичес-

киэ:

- выявление 96% этанол; РАЭ-раакция

гликогена

- выявление метанол; Окраска нефермонтных катиогешх

белков белков лизосом НГ прочным зеленым

при рН=8.1 по В.Е.Пигаревскому

Получении- цифровой материал обрабатывали методами вариаци-. отой статистики (Ашмаршг И.П., и др. 1971; Автандилов Г.Г., 1984), в ряде случаев на компьютере РО XT. Результаты исследований документируются микрофотографиями, выполненными на микроскопе "Виолам И".

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В результате проделанной работы получены данные о последовательности защитных клеточных реакций на отдельных этапах патомор-фогенеза аспергиллеза. Общие закономерности развития аспергиллез-ного инфекционного, процесса на фоне интактной иммунной системы прослежены на модели внутрибрюшинного заражения морских свинок малой дозой Aspergillus fumlgatus (50 тыс. спор/мл ИРХН).

Несмотря на то, что интраперитонеальная модель аспергиллеза шроко использовалась в опытах В.М.Лещенко и его сотрудников (1970; 1973), нам пришлось создать новую модель, отвечающую поставленной в работе цели. Это связано с тем, что аспергиллы обладают высокой специфичностью даже в пределах одного вида по своим патогенным, токсинообразующим и аллергенным свойствам. Особенно ярко эти отличия проявляются между музейными штаммами и штаммами, выделенными непосредственно перед опытами от больных людей или животных (Спесквцева Н-А., 1960; 1964; и др.). Ни в одной из ' изученных нами отечественных экспериментальных работ (Лещенко В.М., 1970; Дворкин Л.Б. и др., 1977; Морозов В.Л. и др., 19Э9, Степанов С.А., 1991 и др.) мы не встретили характеристики, используемого штамма. Заражающие дозы в пределах от нескольких миллионов до 2 миллиардов позволили нам предположить, что в эспе-рименты были взяты музейные штаммы с длительным сроком хранения, а 'следовательно и многократным пересевом грибов на питательные среды. Поэтому мы разработали собственную интрадаритонеальную модель, предварительно проведя опыты по выбору штамма, обладающего высокой патогешюстыо и низкими аллергенными и токсигенными свойствами; и подбору минимальной заражающей дозы, позволяющей изучать инфекционный процесс морфологическими методами исследования.

Необходимость комплексной оценки гистологических, пленочных и цитологических препаратов большого сальника с целью совокупной характеристики состояния возбудителя и защитных клеточных реакций хозяина выдвигала требование использовать в работе дифференциальные, широко распространенные и в то же время, позволяющие выявить элементы гриба, методы фиксации и окраски. Изучение тиякториаль-ных свойств Aspergillus fumiga tus (конидий д мицелия) было также проведено на предварительном этапе исследований.

Противоречивые данные относительно макрофагальной, фунгицид-ной и фунгистатической функций перитонеальных Ш> (Sohaitner A. et al., 1993; Diamond R.D. et al., 1983; Liebermann-Meffert D. et al., 1989) in vitro требовали проверки функциональной активности этих клеток in vivo. Вопрос динамики нарастания и смены защитных клеточных реакций, как было отмечено в обзоре литературы, до сегодняшнего дня не ставился исследователями, изучавшими аспергил-лез в эксперименте, а многочисленные клинико-морфологические наблюдения позволяют лишь приблизительно судить о давности процесса.

Некому же из звеньев неспецифичэской клеточной резистентности, макрофагальному или лейкоцитарному, принадлежит приоритет в защитных механизмах, также оставалось неясным. Иммуноморфогенез аспер-гиллеза, сроки включения иммунных реакций in vivo, также оставались неизученными. Пагоморфэлогическио изменения, возникающие во внутренних органах под действием токсинов аспергиллов, достаточно полно описаны во многих работах (Purohaee I.P.N., 1974; Willie T.D. et al., 1974; Stoloff L., 1977; Ахметели M.A. и др., 1973; Лещенко B.M., 1976 и др.), однако, без анализа этих изменнаний в динамике. Мы попытались ответить на все эти поставленные вопросы в основных разделах нашей работы.

Схематично основные моменты патоморфогеназа можно представить следующим образом:

1. С первых часов и до 1 суток включительно основным защитным барьером являются НГ, которые активно и весьма успешно фагоцитируют и инактивируют конидии аспергилла.

2. Через 24-48 часов после инфицирования реакции смещаются в в сторону макрофагального звена клеточной защиты. Иеритонеальные МФ, несмотря на некоторое запаздывание, активно включаются в процессы фагоцитоза и транспортировки спор в млечные пятна, которые постепенно превращаются в центры формирующихся абсцессов. Они обладают на сроках 1-2 суток споростатическими и менее выраженными спороцидными факте ами. МФ 3-7 суток сохраняют высокую фагоцитарную активность на фоне заметного снижения споростатической и спроцидной функций. Это явилось причиной прорастания в отдельных случаях конидий внутри МФ на 7 сутки инфекционного процесса.Часть спор может длительно (до 21 дня по нашим наблюдениям и до з месяцев по данным В.М.Лещенко (1973)) персистировать в цитоплазме пе-ритонеальных МФ, что при снижении резистентности организма можот привести как к инвазивному аспергиллезному перитодату, так и генерализации инфекции в целом..

3. В случае несостоятельности перитонеальных МФ в отношении возбудителя, на 7 сутки параллельно с ростом жизнеспособности спор в брюшной полости наблюдается приток новой популяции НГ из костного мозга в периферическую кровь и очаг воспаления - сальник. Эта новая волна НГ обладает высоким содержанием ЛКБ и гликогена и успешно элиминирует прорастающие конидии. Таким образом, имеет место циклическая эстафетная передача барьерных функций от НГ .к МФ,- а в случае их неспособности к перевариванию спор, от МФ

г 12 -

к новой волне НГ.

4- На сроках от 3 до 5 суток включаются пусковые механизмы иммунных клеточных реакций, отмечается постепенный рост числа малых ЛФ в сальнике и периферической крови, а также выявление умеренных . периваскуляриых лимфо-плазмоцитарных инфильтратов, в очаге воспаления на фоне опустошения тимуса, селезенки и периферических лимфоузлов. На 5-7 сутки просходит формирование гранулем смешанного типа. Образуются ГМК 2 типов - клетки Пирогова-Лангханса и клетки инородных тел. То есть в наших исследованиях при аспергил-лезном перитоните имели место реакции ГЗТ.

5. Последним защитным механизмом является пролиферация фиб-робластов и фиброцитов, что приводит к формированию мощной соединительно-тканной капсулы вокруг, гранулем, механически отграничи- ■ ва иной очаги поражения и скопления конидий от неповрежденных тканей. , .

Еще на этапе "первой встречи" конидий гриба с клетками хозяина развитие и выражэнность инфекционного процесса зависят как ог патогенных, токсигенных и аллергенных свойств возбудителя, так и от функциональной активности НГ (в первую очередь) и МФ. Ведущее значение для развития аспергиллеза, как нам кажется, имеет не столько место заражения, сколько пластичность биохимических систем гриба - переход и течение процесса в анаэробных условиях, то есть своеобразный дуализм аспергшша, способного приспосабливаться к меняющимся условиям обитания и проявлять при этом более агрессивные свойства. ' ,

Более того, само пребывание аспергиллов в организме оказывает иммунодвпроссивное действие на ИКС,, угнетая пролиферзтивную функцию в тимусе и периферических лимфоузлах, сохраняя при этом способность клеточных элементов к дифференцировке. Вероятнее всего, пролиферативная и дифференциальная функции костного мозга не нарушаются. Об этом свидетельствует приток новых популяций НГ, моноцитов и лимфобластов на 7 сутки инфекционного процесса.

Следует отметить, что начиная с 3-5 суток в очаге воспаления происходит стимуляция даффоренцировки местных камбиальных элементов в сторону образования•резидентных макрофагов. Количество их резко возрастает в эти сроки, однако, они не способны к полной элиминации ко;шдий, в, результате чего жизнеспособность спор на 5-7 сутки увеличивается, часть из них прорастает. Но инвазии не происходит, так как в процесс вовлекается новая "волна" НГ, коли-

честно которых резко возрастает как в очаге воспаления, так и в периферической крови, что позволило нам говорить о стимуляции костного мозга продуктами жизнедеятельности гриба ( вероятнее всего его мицелиальной формы). Добавим, что содержание лизосо-' мально-катионннх белков и гликогена у "вновь прибывших" НГ близко к таковому у НГ, участвовавших в воспалительных реакциях на ранних сроках инфицирования.

Таким образом, основным защитным звеном при аспергиллезном инфекционном процессе являются НГ. Эта популяция клеток обладает полным набором фунгицидных систем, что позволяет НГ успешно выполнять защитные функции в процессе санации организма от аспергилл. Теоретически это подтверждают многочисленные клинические наблюдения, описывающие случаи инвазивного аспергиллеза на фоне выраженного агранулоцитоза (Fietta A.et al., 1904; Бухвальд Й, 1987; и др.), а также других заболеваний, приводящих к снижению функциональной активности НГ (Alvarez A. et al., 1989; Khavard N. et al., 1989; Berta L. et al., 1989; Ihidi R. et al., 1989 и др.). Американские ученые Diamond R.D, Huber E.A. et. al. (1904), изучавшие ферментные системы НГ и МФ, подтвердили это положение в своих исследованиях in vitro. Нам удалось это показать in vivo.

Что жэ касается потенциальных возможностей к инактивации конидий Aspergillus fumigatus гаритонеальными макрофагами,' то вопрос этот, на наш взгляд, очень сложен.,Shafiner a. et al. (19вз) считают, что перитонеалыше и альвеолярные МФ отличаются по своей фагоцитарной активности при взаимодействии с аспергиллами (в работе не указан вид возбудителя, исследования проводились in vitro). В результате наших исследований доказана высокая фагоцитарная активность перитонеалышх в отношении как конидий, так и мицелия этого гриба (коллективный фагоцитоз).

Изучение, жизнеспособности спор показало, что на 1-3 сутки течения инфекционного процесса в сальнике количество инактивиро-ванных внутри МФ конидий резко увеличивается, а процент нативных спор заметно снижен. Мы предполагаем, что на ранних сроках в реакциях участвовали преимущественно МФ моноцитарного происхождения, обладающие полноценными фунгистатическими и фунгицидны.ми системами. Начиная с 3 суток в препаратах отмечается резкое увеличение. тканевых МФ, имеющих несколько иную мор^юлогию (многочисленные выросты цитолеммы в виде бахромы, большое число' гюкуо-лей, способность располагаться в виде комплексов и т.д.).Б ли те-

ратуре чаще всего приводятся данные по изучению ■ фунгицидных свойств перитонеальных МФ in vitro (Diamond R.D. et al., 1983; Sohaffner А. С соавт., 1983; biebermann-Mefiert B. et al., 1989), то есть резидентных МФ. Считается, что эти макрофаги в большей степени ориентированы на выполнение иммунологических функций, чем бактерицидных (Kapp Я., 1978). В это же время отмечается увеличение процента жизнеспособных спор внутри МФ, достигающее максимума не 5 сутки, что совпадает с пиком содержания МФ в сальнике при относительном снижении НГ. Вероятно, не обладая полноценным комплексом фунгицидных систем, эти резидентные МФ не справляются с барьерными функциями, что приводит к прорастанию отдельных спор на 7 сутки. И, как мы уже указывали выше, мицелиальная форма гриба стимулирует костный мозг, в свою очередь, отвечающий выбросом новой популяции НГ в периферическую кровь, а затем в очаг воспаления. На этом сроке инвазии гриба препятствуют не только НГ, которые весьма успешно санируют сальник от спор, но и хорошо сформированные на этом сроке инфекционного процесса гранулемы с мощной соединительно-тканной капсулой по периферии.

Таким образом, последним защитным клеточным, звеном являются фибробласты и фиброциты. Фибропластические процессы при аспергил-лезе сильно выражены,. Начало "выселения" фиЗробластов на периферию абсцессов и формирование тонкой соединительно-тканной полоски зокруг множественных воспалительных фокусов можно наблюдать уже на з cvtkh. ГиторфиСроз сальника и развитие выраженной спаечной болезни явилось причиной смерти у ряда животных на 14-21 сутки.

Цикличность "эстафетной" передачи защитных клеточных реакций - одно из основных условий полного освобождения организма от возбудителя. Равновесие в системе Мм столь подвижно, что смещение сил в ту или иную сторону тотчас же сказывается на течении инфекционного процесса. Не касаясь свойств микроорганизма, а рассматривая сдвиги только в защитных клеточных механизмах, можно предположить, что при увеличении функциональной активности НГ и МФ будут наблюдаться обширные некрозы; при гиперфункции лимфоцитов - различные аллергические реакции; при усилении фибропласти-ческих процессов развивается спаечная болезнь. Снижение функциональной активности клеток также приводит к различным патоморфоло-гическим изменениям: неполноценности процесса санации, инвазии гриба в ткани организма, а нередко и к генерализованным формам аспергиллеза.

Вопросы иммуноморфологии сальника в доступной нам литературе не описаны. Формирование гранулем на 5-7 сутки после инфицирова-. ния свидетельствует о реакции ГЗТ со стороны макроорганизма в ответ на внедрение возбудителя. При аспергиллезном перитоните образуются гранулемы смешанного типа: в центра их нередко видны грибные массы, подвергшиеся некробиотическим изменениям под действием лизосомалыга-катионных белков НГ и МФ (Diamond R.D. et al., 1983), окруженные валом НГ; далее выявляется более светлый слой МФ и впителиоидных клеток; периферия гранулем представлена грубоволокнистой соединительно-тканной капсулой и зоной гиганских многоядерных клеток. Количество ГМК не велико, но размеры, как правило, очень больше (более 50-75 ядер). По типу это могут быть как клетки Пирогова-Лангханса, так и типа клеток инородных тел. Только в цитоплазме нескольких клеток нам удалось наблюдать "тени" головок или кусочков мицелия, размеры которых существенно превосходили размеры НГ или МФ.

Другим компонентом иммуноморфологических сдвигов в сальнике являются лимфо-плазмоцитарныэ инфильтраты периваскулярных областей, наблюдающиеся в пленочных препаратах на 3-5 сутки. По времени процесс образования лимфо-плазмоцитарных инфильтратов совпадает с резким увеличением числа лимфоцитов в очаге воспаления и периферической крови. В органах ИКС при этом отмечается увеличение числа лим£юбластов и средних лимфоцитов в тимусе и пе-рифэрических лимфоузлах (особенно брыжеечных) на фоке снижения количества малых лимфоцитов и плазмоцитов (опустошение органов ИКС). .

Иммунологические методы исследования in vivo подтвердили наши иммуноморфологические данные, выполненные in vitro: на 7 сутки инфекционного процесса отмечается резкое снижение удельной концентрации клеток в тимусе и в меньшей мере селезенке и периферических лимфоузлах при. увеличении числа клеток в костном мозге. Результаты определения количества Т- и В-лимфоцитов показали, что удельная концентрация клеток падает в органах ИКС преимущественно за счет Т-лимфоцитов.

Таким образом, иммунологические исследования подтверждают высказанное нами выше предположение, что Aspergiliua fumigatuc оказывает иммунодепрессивное действие на периферическое звино ИКС: тимус (резкое,опустошение), селезенку и лимфоузлы , стимулируя при аспргиллезном инфекционном процессе костный мозг. В но-

лом можно сказать, что с одной стороны имеет место- иммунодеп-рессия ИКС продуктами жизнедеятельности аспергилла, а с другой стороны - имеет место "выход" малых лимфоцитов и плазмоцитов в очаг воспаления,„ где в эти сроки происходит запуск иммунологических реакций, преимущественно по ГЗТ. Реакция гиперчувствительности замедлешгаго типа подтверждает широко известный факт, что аспергиллы обладают выраженными аллергенными свойствами. В нашей работе эти реакции были слабовыражешшми, так как мы на этапе предварительных опытов по выбору штамма возудителя стремились максимально снизить эти проявления, отобрав наименее аллергенный штамм Aspergillus fumigatms.

Тем не менее нам не удалось полностью нивелировать токсиген-ные свойства аспергилла (к чему мы также стремились). Токсичность штамма подтверждается изменениями во внутренних органах. Для картины . токсического поражешя внутренних органов характерно острое расстройство кровообращения по типу ДВС (Зербино Д.Д., Лукасевич Л.Л., 1989) и дистрофические, а иногда и некробиотические изменения, вплоть до сливащихся абсцессов в паренхиматозных органах. Элемонты гриба во внутренних органах не выявлены, то есть имола место резорбтивная токсикоемия, когда токсины аспергилла и продукты клеточного распада при разлитом перитоните всасываются в кровь, вызывая повреждение органов.

Наиболее ярко о токсичности гриба свидетельствуют сосудистые реакции. Нам удалось проследить динамику сосудистых изменений в пленочных препаратах сальника, то есть непосредственно в очаге " воспаления. Сосудистые реакции отличались выраженностью и стойкостью изменений. Уже через 12-18 часов после инфицирования наблюдалось паретическое расширение сосудов всех типов, но наиболее выраженными были нарушения гемодинамики в микроциркуляторном русле. Отмечалось нарушение микроциркуляции в виде стаза, сладжа и пристеночных тромбов. В артериолах, венулах и капиллярах отмечается краевое стояние лейкоцитов, а резкое расширение межэндоте-лиальиых толей капилляров приводит к выходу плазмы и форменных элементов крови за продели сосудистого русла. В сальнике видны обширные кровоизлияния и выраженный отек. Нередко можно наблюдать целые "озера" серозного экссудата, в котором плавают элементы гриба.

Выражонное переполнение сосудов кровью и серозно-геморрагкческая экссудация сохраняются вплоть до ъ суток, когда мелкие сосуды на-

чинают сдавливаться разрастающейся соединительной тканью и постепенно запустевают. Вокруг формирующихся на месте абсцессов грану-лэм идет образование новых сосудов. Эндотелий сосудов также бурно реагирует на токсины аспергилла: на 3-5 сутки инфекционного процесса отмечается резкая гиперплазия эндотелиоцитов, за счет чего сосудистая стенка заметно утолщается. Однако, это может быть связано и с вовлечением сосудов в воспалительный процесс, так как на этих сроках появлялись периваскулярные лейкоцитарные инфильтраты в виде "муфт", которые наблюдались вплоть до 14 суток. Следует добавить, что обширные кровоизлияния, отеки, гиперплазия эндотелия, тромбообразование и периваскулиты выявлялись во всех внутренних органах, то есть повторяли характер сосудистых реакций в очаге воспаления. Напомним, что элементы гриба во внутренних органах при этом ,не выявлены. Такая выраженная сосудистая реакция является морфологическим подтверждением токсического и аллергического воздействия возбудителя на сосуды. Как известно, ДВС часто возникает под действием эндо- и экзотоксинов, а также комплексов антиген-антитело, которые повреждают эндотелий сосудов (Зер-бино Д.Д., Лукасевич. Л.Л., 1989).

На основании комплексного изучения патоморфогенеза аспергил-лезного инфекционного процесса с применением рутинных цитологических и гистологических методов, а также цитохимии, гистохимии и морфометрии в сопоставлении с иммунологическим! и микологическими исследованиями удалось выявить многообразие и вариабельность морфологических изменений, наблюдающиеся в начальной стадии заболевания, вызываемого АврегвШив Гигг^аШз. В результате проведенного нами исследования было получено более полное, чем описано до сих пор, представление о динамике защитных клеточных реакций со стороны макроорганизма в ответ на внедрение возбудителя, а также о механизмах санации организма в условиях предварительно ненарушенной естественной резистентности.

выводы

1. На созданной оригинальной модели внутрибршинного заражения морских свинок малой дозой Aspergillus fumigatus (50 ООО спор на 1 мл ИРХН) выявлена последовательная смена защитных клеточных реакций, что позволило составить более полное представление об отдельных звеньях патоморфогеяеза аспергиллэза и дать патоморфо-логическую характеристику ранних стадий развития болезни.

г. Развитие инфекционного процесса в сальнике, вызываемого Aspergillus fumigatus характеризуется выраженной стадийностью процесса. Фагоцитоз и элиминация спор НГ в первые сутки сменяется через 24-43 часов эстафетной передачей защитных функций от НГ к МФ. в результате чего происходит формирование абсцессов. На э-5 сутки наблюдается появление очаговых лимфо-плазмоцитарных инфильтратов в периваскулярных областях, что свидетельствует о включении механизмов иммунной защити. Вслед за этим на 5-7 сутки происходит формирование гранулем преимущественно смешанного типа. В дальнейшем отмечается отграничение очагов воспаления разрастаниями соединительной ткани, приводящее на 14-21 сутки к выраженному фиброзу сальника.

3. Для выявленной цикличности защитных клеточных реакций при экспериментальном аспергиллезе характерно не только передача защитных функций от НГ к МФ через 24-48 часов после инфицирования, но и возможность, в случае несостоятельности перитоноальных МФ в отношении инактивации конидий гриба, передачи этой функции новой популяции НГ на 5-7 сутки течения инфекционного процесса.

4. Ч1тамм Aspergillus fumigatus,выделенный от больного генерализованным аспергиллезом и выбранный для эксперимента после предварительного всестороннего изучения, обладал высокой патоген-ностью и токсичностью, что морфологически подтверждалось острым расстройством -кровообращения по типу ЛВС, а также наличием дистрофических и некробиотических изменений в паренхиматозных органах. Вместе с тем, отмечались слабые аллергизующие свойства использованного штамма Aspergillus fumigatus, способного вызвать лишь реакцию ГЗТ, что документировалось наличием очаговых лим-фо-плазмацитаршх инфильтратов и гранулем в сальнике.

5. В ходе развития инфекционного процесса при интраперитоне-альном заражении морских свинок малыш дозами Aspergillus fumigatua у экспериментальных животных возникали явления вторич-

ного иммунодефицита, о чем свидетельствовали как патоморфологи-ческие изменения в органах ИКС, так и специальные иммунологические исследования In vitro. Наблюдалось опустошение периферических лимфоузлов и тимуса, блокада пролиферативной функции лимфоцитов в этих органах, с сохранением способности к дифференци-ровке. На 14 сутки после инфицирования отмечалось резкое снижение удельной концентрации клеток в ИКС, преимущественно за счет Т-лимфоцитов.

6. Проведенное морфофункциональное исследование аспергилло-за, выявило определенную вариабельность обнаруживаемых патоморфо-логических изменений в инфицированном сальнике, что можно связать с подвижностью системы взаимодействия "макроорганизм - микроорганизм" у различных животных.Усиление клеточных реакций на том или ином этапе со стороны макроорганизма может привести л!бо к обширным некрозам при повышенной нейтрофильной и макрофагальной активности, либо к аллергическим реакциям при усилении функции лимфоцитов, либо к фиброзу и спаечной болезни при усилении фиброп-ластических процессов.

7. Наиболее информативным методом, как для оценки клеточных реакций макроорганизма на внедрение возбудителя , так и для выявления конидий и мицелия гриба в патологическом материале, является метод фиксации цитологических мазков 10% нейтральным формалином с последующим окрашиванием препаратов азур-эозином.

8. Разработанная внутрибрюашнная модель аспергиллеза морских свинок, позволила проследить течение инфекционного процесса и механизмы санации организма от возбудителя на фоне интактной ИКС. Модель может быть использована при изучении особенностей защитных клеточных реакций, развивающихся при этой инфекции в условиях предшествующего заракению иммунодефицита и депрессии кроветворения, а также для разработки и обоснования иммунокорригирующей терапии.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

В связи . с выявленным ингибирующим действием грибов Aspergillus fumigatus на иммунную систему и токсичность отдельных штаммов возбудителя, целесообразно рассматривать аспэргиллез кьк заболевание, обуславливающее развитие вторичного иммунодефицита, что предусматривает назначение иммунокорригирующей и дезинтокси-

кационной терапии в ранние срски заболевания. Учитывая изменения во внутренних органах, наблюдающиеся даже при изолированных формах аспергиллеза, необходимо следить за их функциональным состоянием, за общими и иммунологическими показателями периферической крови, а при неоднократном выделении одного и того же вида аспергилла определять токсигенность штамма.

Созданная нами модель может быть использована для изучения аспергиллеза в условиях иммунодефицита и депрессии кроветворения и возможности их коррекции иммуно- и гемостимуляторами.

список работ, опубликований: по теме диссертации

1. Изучение защитных клеточных механизмов на модели ексдари-ментвльного аспергиллеза //-в сб."Проблемы моделирования патологических процессов у человека и животных и испытвние биологических" - с.14-15 (Материалы международного семинара - Санкт-Петербург - Нурма - 1992). .

2. Система взаимодействия "макроорганизм-микроорганизм" при аспергиллеза. // в сб."Актуальные проблемы медицинской микологии" - с.24-29 - СПб. - 1993. (соавт. Хмельницкий O.K., Белянин В.Л.).

3. Латоморфогонез аспергиллеза. - в печати.

4. Анализ пяти наблюдений аспергиллеза у людей. - в печати.