Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Модулирующее действие вирусных антигенов на функциональные свойства клеток систем иммунитета и кроветворения

На правах рукописи

РГВ од

- 9 КЮ/1 1ЯЯ7

ЛАВРОВ Вячеслав Федорович

МОДУЛИРУЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ ВИРУСНЫХ АНТИГЕНОВ НА ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА КЛЕТОК СИСТЕМ ИММУНИТЕТА И

КРОВЕТВОРЕНИЯ

14.00.36 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва - 1997

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте вирусных препаратов Российской академии медицинских наук

Научный консультант: член-корреспондент РАЕН,

доктор биологических наук, профессор В.М. Манько.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Л.И. Краснопрошина; член-корреспондент РАЕН,

доктор медицинских наук, профессор Л.В.Ковальчук;

член-корреспондент РАМН,

доктор медицинских наук, профессор Г.Т. Сухих.

Ведущее учреждение:

НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН.

Защита состоится 1997 г. в 14 часов на заседании

специализированного совета Д 001.38.01 при Научно-исследовательском институте вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова Академии медицинских наук РФ по адресу:

103064 г.Москва, Малый Казенный пер., д.5а.

Автореферат разослан "/ / » д ^ 1997 г.

Ученый секретарь

специализированного ученого совета кандидат медицинских наук

Н.Г. Кудрявцева

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Научно-практическая значимость и актуальность настоящего исследования определяются прежде всего тем, что оно посвящено одному из наиболее сложных и малоизученных явлений, сопровождающих вирусные инфекции - в ирусиндуциро ванной иммуномодуляции. Ее основу формирует двойственная природа вирусов, являющихся агентами, способными к внутриклеточному паразитизму, цель которых - реализация вирусного генома в организме хозяина, и одновременно антигенами, вызывающими иммунный ответ, направленный на элиминацию инфекционного начала. Важность исследования данной проблемы очевидна, так как многие из вирусных заболеваний сопровождаются стойким снижением иммунологической реактивности, т.е. состоянием "вирусной иммунодепресснн", причины и механизмы развития которой при ряде вирусных инфекций не установлены или нуждаются в уточнении (Семенов Б.Ф. и др.,1982, Поляк Р.Я. и др.,1986, Dhar R., Ogra P.L.1985).

Следует отметить, что взаимодействие вируса и макроорганизма представляет собой сложную многофакторную систему, генетически детерминированную и хозяином, и возбудителем (Kilbourne E.D.,1983, Askonas В.А.,1982, Fujimami R.S. et al., 1987). Не исключено, что многие из индуцируемых вирусами сдвигов в иммуявом' статусе макроорганизма могут быть следствием прямого или опосредованного влияния возбудителя не только на зрелые формы иммуноцитов, но и на функциональные свойства полипотентных стволовых клеток - родоначальниц всех элементов кроветворной и иммунной систем. Изучение процесса взаимодействия вирусов со стволовыми кроветворными клетками является чрезвычайно важной, но практически не исследованной проблемой противовирусного иммунитета. Особый интерес представляет изучение влияния на стволовые клетт» ортомиксовирусов, для которых кроветворная система не является пермнсснвной и представители которых - вирусы гриппа А - вызывают наиболее массовые и опасные вирусные заболевания современного человечества.

Известно, что функции стволовых клеток в обычных условиях контролируются рядом клеточных и гуморальных факторов - стромальными элементами микроокружения ( Чертков И.Л., Фриденштейн А.Я., 1977), лимфоцитами (Петров Р.В. и др., 1979,1981), макрофагами и различными медиаторами, опосредующими действие клеток (Кравцов В.Д. и др., 1988,

Hansz J., 1989, Balkwill F.R.,1989, Wong G.G., Clark,1989), гормонами (Мороз Б.Б., 1978, Абрамов B.B., 1988). Однако регуляторное влияние этих агентов на ранние этапы кроветворения и иммуногенеза при гриппозной и многих других вирусных инфекциях не изучено. Кроме того, в литературе отсутствует или очень ограничен сравнительный анализ действия различных по патогекности и подтипу инфекционных штаммов вируса гриппа на функции стволовых и ряда популяций иммунокомпетентных клеток, синтез интерферона, некоторых регулирующих иммунитет гормонов и ферментов, что с учетом высокой изменчивости вируса (Килбурн Э.Д.,1978) приобретает особую актуальность.

Необходимо подчеркнуть, что грипп почти всегда протекает как смешанная инфекция, в которой кроме вируса гриппа могут участвовать около 100 вирусных и бактериальных возбудителей (Жданов В.М.,1986). В этих условиях вирусы гриппа способны не только утяжелять инфекционный процесс за счет синергизма с бактериальным возбудителем и оказывать иммуносупрессивное действие, но выступать также в роли иммуностимуляторов, повышающих антибактериальную резистентность (Janssen RJ.,1963, Fashiro М. et al.,1987). Исследование клеточных и гуморальных факторов, влияющих на течение и исход заболевания при вирус-бактериальном заражении, относится к числу важных, но недостаточно изученных проблем.

Видное место в исследовании принадлежит изучению функциональных особенностей клеток иммунной системы легких зараженных гриппом животных, их способности влиять на функции стволовых клеток. Исследования подобного рода являются актуальными ввиду исключительной роли альвеолярных макрофагов, лимфоцитов легких и выделяемых ими растворимых факторов в защите организма от респираторных инфекций, запуске местных и системных реакций противовирусного иммунитета. В свою очередь стволовые клетки, обладая уникальными возможностями пролиферировать и дифференцироваться в более зрелые в функциональном отношении формы, определяют ранние этапы развития иммуногенеза и кроветворения и, следовательно, патогенетические особенности развития болезни.

Таким образом, более глубокое понимание процессов взаимодействия вируса гриппа с кроветворными стволовыми клетками, другими элементами гемопоэтической и иммунной систем, определение конкретной роли отдельных клеточных и гуморальных факторов в регуляции кроветворения и иммуногенеза при гриппозной инфекции, выявление структурных

компонентов внриона, инициирующих супрессорную или стимуляторную активность вируса по отношению к иммунной системе, позволят в значительной степени расширить знания об этиологии и патогенезе гриппа и других вирусных инфекций, будут способствовать более успешному проведению практических противовирусных мероприятий.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в исследовании и сравнительном анализе влияния различных по подтипу и патогенности штаммов вируса гриппа А на иммунокомпетентные клетки, обеспечивающие функционирование основных звеньев системы иммунитета, а также на процессы костномозгового кроветворения на уровне центральных элементов гемопоэтической системы - кроветворных стволовых клеток.

В процессе выполнения работы решались следующие задачи:

1.Изучение влияния вируса гриппа А на пролиферативную функцию стволовых кроветворных клеток и клеток стромы костного мозга.

2.Выявление действия вируса гриппа А на процессы дифференцировки гемопоэтнческих клеток-предшественников костного мозга.

3.Исследование при гриппозной инфекции регуляторного действия клеток системы иммунитета на процессы пролиферации и дифференцировки гемопоэтнческих клеток-предшественников костного мозга.

4.Проведение сравнительного анализа пролиферативного ответа лимфоцитов, синтеза интерферонов и глюкокортикоидов в процессе гриппозной инфекции и под влиянием вирусных антигенов in vitro, а также функциональной актюности макрофагов, естественных клеток-киллеров (ЕКК), вирусспецифяческях цнтотокснческих Т-лимфоцитов (ЦТЛ).

5.0ценка неспецифического антибактериального эффекта, вызываемого вирусом гриппа А и его структурными компонентами в организме хозяина, с выявлением критериев устойчивости зараженного гриппом макроорганизма к стафилококковой инфекции.

Научная новизна работы. Впервые установлено, что вирус гриппа А обладает способностью оказывать угнетающее действие на процессы костномозгового кроветворения. Инфицирование вирусом доноров клеток костного мозга или костномозговых клеток мышей in vitro сопровождалось подавлением пролиферативной активности стволовых кроветворных клеток (СКК), культивируемых в организме летально облученных сингенных реципиентов. Эффект нарушения пролиферации СКК под влиянием вируса гриппа зависел от подтипа, дозы, инфекционности вируса и способа заражения животного. В определенных условиях опыта зарегистрировано стимулирующее действие вирусной инфекции на пролиферативные свойства

СКК. Не установлено коррелятивных связей между степенью патогенности вируса и его способностью вызывать супрессию или стимуляцию пролиферации стволовых клеток.

Впервые показано, что подавление вирусом гриппа селезеночного колониеобразоваяйя, индуцируемого СКК, происходило за счет угнетения роста колоний эритроидного (Э) и гранулоцитарного (Г) типов с изменением в ряде случаев нормального соотношения Э/Г.

Впервые выявлено, что лимфоциты зараженных вирусом гриппа мышей оказывали супрессивное действие на пролиферативные свойства сингенных СКК.

Впервые установлено, что заражение животных вирусом гриппа сопровождается зависимым от штамма возбудителя изменением состава клеток костного мозга и влиянием на пролиферацию клеток стромы костного мозга, формирующих кроветворное микроокружение.

Продемонстрированы ранее неизвестные данные о значительном супрессивном действии иммуноцитов легких зараженных гриппом мышей на колониеобразующую способность сингенных СКК с подавлением образования в селезенке колоний эритроидного и гранулоцитарного типов.

Установлено, что исследуемые штаммы вируса гриппа А при заражении ими мышей вызывали в организме животных усиление фагоцитарной активности макрофагов, цитотоксической активности ЕКК и образование противогриппозных штаммоспецифических и перекрестнореагирующих ЦТЛ.

Показано, что исследуемые штаммы вируса гриппа Л обладали различной митогенной активностью по отношению к лимфоцитам интактных мышей in vitro: вирусы подтипов H2N2 и H2N1 вызывали высокий, а вирусы подтипа H1N1 - низкий пролиферативный ответ лимфоцитов.

Выявлено, что исследуемые штаммы вируса гриппа А существенно различаются по способности вызывать синтез интерферонов и кортикостерона.

Показано, что заражение животных вирусом гриппа А, подтипов H2N2 и H1N1, или их иммунизация поверхностными антигенами вирионов, могут вызывать различно выраженное антибактериальное действие, защищая мышей от смертельной стафилококковой инфекции, а критерием устойчивости животных к бактериальному заражению может служить показатель активности 5-нухлеотидазы (5-н) макрофагов.

Практическая значимость. Материалы диисертации могут быть использованы в практике научно-исследовательских работ для изучения иммуномодулирующей активности применяемых в настоящее время средств защиты от вирусов и сравнительной оценки эффективности традиционных методов иммунокоррекции гриппа. Полученные данные могут также применяться при разработке и создании новых вирусных препаратов с целью

выявления наиболее действенных средств профилактики, лечения гриппа и других вирусных инфекций.

Основные положения, выносимые на защиту. 1. Заражение вирусом гриппа А приводит к изменению функциональных свойств СКК костного мозга мышей - угнетению пролиферации колониеобразующих единиц селезенки (КОЕс) и нарушению дифференцировки СКК с изменением нормального соотношения числа колоний эритроидного и гранулоцитарного типов. 2. В регуляции процессов кроветворения при гриппе на уровне СКК участвуют клетки системы иммунитета - лимфоциты. 3. Гриппозная инфекция у мышей сопровождается нарушениями в системе кроветворного микроокружения -угнетением пролиферации фибробластов костного мозга. 4. Клетки иммунной системы респираторного тракта мышей, зараженных вирусом гриппа, оказывают супрессивное действие на пролиферацию и дифференцировку сингенных КОЕс. 5. Изменения, индуцируемые вирусом гриппа А в клетках систем иммунитета и кроветворения, носят штаммозависимый характер: нарушения основных функций СКК костного мозга и вирусиндуцируемая пролиферация лимфоцитов in vitro тесно связаны с подтипом вируса; активация ЕКК и появление в организме хозяина вирусспецифических ЦТЛ коррелирует с патогенностью вируса.

, Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на: X Европейском иммунологическом конгрессе (Эдинбург, Великобритания, 1990), I Всесоюзном съезде радиобиологов (Москва, 1989), I Всероссийском съезде иммунологов (Новосибирск, 1992), Международной школе иммунологов (Пьяна Брашов, Румыния, 1988), Всесоюзном симпозиуме с международном участием "Иммунодефицита и аллергия" (Москва, 1986), Всесоюзной конференции "Молекулярные механизмы развития инфекционных заболеваний" (Звенигород, 1990), IX межинститутской научной конференции "Факторы клеточного и гуморального иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях"(Челябинск,1988), научной конференции "Иммунокоррекция при инфекционной патологии" (Ленинград,1988), отраслевом совещании "Микроскопические аспекты патогенеза вирусных инфекций" (Новосибирск,1991), заседаниях секции "Инфекционная иммунология" Всесоюзного общества иммунологов (Москва, 1989).

По материалам диссертации опубликовано 37 научных работ.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 206 страницах машинописного текста, иллюстрирована 15 таблицами и 19 рисунками. Состоит из введения, обзора литературы, 8 глав собственных исследований, заключения, выводов и библиографического указателя, включающего 443 отечественных и зарубежных источника.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В настоящей работе использованы:

- интактные мыши BALB/c, СВА, C57BL/6j, (CBAxC57BL/6j)F1,

- тимэктомированные летально облученные и защищенные сингенным костным мозгом мыши СВА, т.н. В-мыши,

- адреналэктомированные мыши (CBAxC57BL/6j)Fj,

- штаммы вируса гриппа A: PR/8/34 (H1N1), Краснодар/101/59 (H2N2), рекомбинантный между ними штамм РК-6-3 (H2N1) и Хабаровск/933//77 (H1N1) в аллантоисном и очищенном (Иордан А.Г. и др., 1983) вариантах, живые и инактивированные нагреванием при 56°С в течение 30 мин и при 100°С в течение 5 мин., а также поверхностные антигены вируса гриппа, выделенные из штаммов A/PR/8/34 и А/Краснодар/101/59 в виде комплекса гемагглютинина и нейраминидазы по методу Bachmayer Н.(1975).

Пролиферативную активность лимфоцитов селезенки мышей, стимулированных в культуре живыми и инактивированными вирусами гриппа или вирусными антигенами, определяли по стандартной методике (Лавров В.Ф. и др.,1987). Исследование активности ЕКК проводили по методу Herberman R.(1974), ЦТЛ - по методу Braciale T.J.(1979). Титрование интерферона (ИФН) в сыворотке крови мышей проводили по методу Носик H.H. и др.(1982), продукцию ИФН клетками БАЛЖ под влиянием специфических индукторов ИФН определяли по методу Соловьева В. Д. и др. (1^81). Активность 5-нуклеотидазы в клетках БАЛЖ и макрофагах перитонеального экссудата (МПЭ) определяли по методу Туманян М.А., Кирилличевой Г.Б.(1984). Подсчет стволовых колониеобразующих единиц селезенки (КОЕс) проводили по методу Till J., Мс Culloch Т.(1961). Для анализа характера дифференцировки СКК готовили серийные парафинизированные срезы селезенки облученных реципиентов клеток костного мозга толщиной 5мкм. Препараты окрашивали гематоксилином-эозином и подсчитывали число микроколоний различных гистологических типов: эритроидных, гранулоцитарных, мешкариоцитарных, смешанных, недифференцированных. О напаравлении дифференцировки СКК судили по отношению числа эритроидных колоний к гранулоцитарным. Эффективность колониеобразования фибробластов (ЭКОф) определяли по методу Fridenshtein A.J .et al.(1976). Кортикостерон в сыворотке крови мышей определяли радиоиммунологическим методом (Гончаров Н.П. и др. 1986). Статистическая обработка результатов проводилась с помощью параметрического метода оценки достоверности полученных данных с вычислением критерия t Стьюдента и непараметрического критерия U Уитни-Манна-Вилкоксона (Рокитский П.Ф.,1961, 1 ублер Е.В., Генкин A.A.,1973).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1.Исследование процессов пролиферации и дифференцировки кроветворных стволовых клеток и лимфоцитарного контроля гемопоэза при

гриппозной инфекции. 1.1.Сравнительный анализ модулирующего действия различных по подтипу и патогенности штаммов вируса гриппа А на пролиферацию и дифференцировку кроветворных стволовых клеток у мышей.

Анализировали влияние различных по патогенности для мышей и подтипу штаммов вируса гриппа: A/PR/8/34/ (H1N1) и А/Краснодар/101/59 (H2N2) на функциональную активность стволовых кроветворных клеток костного мозга инбредных мышей. С этой целью клетки костного мозга (ККМ), выделенные через 5 суток после интраназального и внутривенного заражения животных, трансплантировали летально облученным некнфицированным сингенным реципиентам. В контрольных опытах облученным мышам трансплантировали _ ККМ неза раженных сингенных доноров. В ряде опытов ККМ интактных мышей обрабатывали вирусным материалом - штаммами A/PR/8/34, А/Краснодар/101/59, А/РК-6-3 (H2N1) и А/Хабаровск/933/77 (H1N1) in vitro и также трансплантировали облученным сингенным реципиентам. О пролиферативной активности СКК судили по числу микроскопически учитываемых колоний, формируемых в селезенке реципиентов через 8-9 суток после пересадки ККМ. Характер дифференцировки СКК оценивали по отношению числа колоний эритроидного типа к гранулоцитарным колониям (Э/Г), определяемых на серийных гистологических срезах селезенок облученных реципиентов.

Установлено, что заражение мышей данными штаммами вируса гриппа приводит к существенному подавлению пролиферативной активности СКК.

Из табл.1 видно, что внутривенная инокуляция мышам-донорам костного мозга высоких доз патогенного штамма A/PR/8/34 вызывала в селезенках реципиентов значительную супрессию (на 34-51%) формирования колоний, образуемых КОЕс. Однако при этом не было отмечено достоверных изменений характера дифференцировки КОЕс ввиду того, что снижалось число как эритроидных, так и гранулоцитарных колоний, отношение Э/Г с 2,5 уменьшалось до 2,0-2,2 (группы 4,5).

Непатогенный для мышей вирус А/Краснодар/101/59 в аналогичных условиях супрессировал колониеобразование в меньшей степени, чем патогенный штамм, в среднем на 30%. Угнеталась, главным образом, дифференцировка КОЕс в гранулоцитарном направлении, отношение Э/Г

Таблица 1

Характер пролиферации и дифференцировки СКК мышей, зараженных вирусом гриппа А, в селезенке

летально облученных сингенных реципиентов.

Группа Штамм вируса используемый для заражения мышей , Доза вируса ОИД50) или) кол-во среды (мл) Способ заражения животных Число колоний на серийных срезах селезенки летально облученных реципиентов на 9-й день после пересадки ККМ Отношение Э/Г

Всего Эритроидного (Э)типа Гранулоцитарного (Г) типа

1 2 Контроль (среда без вируса) 0 л 0,05 В/в И/н 18,5+2,9 (20) 19,0+1,7 (20) 123+1,9 10,4+2,1 5,0+0,9 4,9+0,7 2,5 2,5

3 4 5 А/РК/8/34 5П03 5*10^ 5*106 В/в 17,0+1,8 (18) 9,0+1,2 (18) 12,2+1,6 (17) 12,0+1,5 5,0+0,8 7,0+1,1 43+0,7 23+0,4 3,5+0,4 2,8 . 2,2 2,0

6 7 8 А/РЯ/8/34 0;5Ч0? 1'Н)? 5-103 И/н II 163+1,8 (19) 16,0+1,5 (19) 14,7+2,1 (16) 103+1,5 10,0+1,8 11,5+1,5 43+0,9 3,8+0,7 5,0+0,8 2^ 2,7 23

9 10 11 А/Краснодар/ ^ и и 5'КР 5*101 5П06 В/в •• 16,0+2,0 (16) 13,0+1,9 (17) 12,5+1,7 (18) 9,5+1,4 93+1,7 93±1,9 4,8+0,6 3,0+0,5 2,7+0,5 2,0 3,0 3,4

12 13 14 А/Краснодар/ 101/59 0,5'КР 1«1<? 5П03 И/н •• н 17,8+2,2 (15) 9,5+13 17) 5,0+1,5 (19) 11,8+1,8 6,5+1,1 4,0+1,2 5,0+0,7 5,0+0,7 13+03 2,4 2,4 3,2

Примечание. Животным трансплантировали 2Ч05 ККМ. В/в - внутривенный; И/н - интраназальный. В скобках число реципиентов. Здесь и в табл. 2,3,4 приведено общее число микроскопически идентифицированных колоний, данные по смешанным и мегакаоиопитаоным колониям не ппивепены в связи с отсутствием пячличий V контгюльных и ппгтппытны* жмиптни»

увеличивалось с 2,5 до 3,0-3,4 (группы 10, 11). Внутривенное заражение животных низкими дозами исследуемых вирусов гриппа, не вызывая достоверного угнетения пролиферации СКК (группы 3 и 9), оказывало возмущающее воздействие на процесс дифференцировки КОЕс. При общей направленности дифференцировки в сторону эритропоэза при действии патогенного штамма вируса наблюдалась тенденция к усилению эритропоэза (отношение Э/Г увеличивалось с 2,5 до 2,8), при действии непатогенного штамма - к усилению гранулопоэза (отношение Э/Г падало с 2,5 до 2,0).

Интраназальное заражение доноров костного мозга вирусом A/PR/8/34 не приводило к достоверному изменению дифференцировочных процессов, соотношение эритроидных и гранулоцитарных колоний не отличалось от контрольных значений. Однако у этих животных наблюдалась устойчивая тенденция к снижению пролиферации КОЕс (группы 6,7), особенно при использовании высоких доз вируса (группа 8).

Интраназальное введение животным вируса А/Краснодар/101/59 сопровождалось подавлением пролиферации СКК на 49-83%. Степень угнетения роста колоний возрастала прямо пропорционально заражающей дозе вируса (группы 13,14), а использование низкой дозы вирусного материала (группа 12) также, как и в опытах по внутривенному инфицированию мышей, не изменяло рост КОЕс- При этом характер дифференцировки КОЕс также не изменялся - отношение Э/Г 2,4 (группы 12,13), или же отмечалось более выраженное угнетение дифференцировочных процессов в сторону гранулопоэза - отношение Э/Г 3,2 (группа 14).

Таким образом, эффект угнетения пролиферации зависит от подтипа вируса, дозы вводимого препарата и способа заражения животного. Прямые коррелятивные связи между степенью патогенности вируса й его способностью угнетать пролиферацию стволовых клеток in vivo не установлены. Супрессия колониеобразования не является результатом действия вирусной инфекции на один из анализируемых ростков кроветворения, а происходит вследствие угнетения роста колоний как эритроидного, так и гранулоцитарного типов.

Следует отметить, что клинические проявления гриппозной инфекции регистрировались у животных только после интраназального заражения патогенным вирусом с гибелью большинства мышей от смертельной дозы (5 103 ЭИД50) к концу второй недели после заражения. На 5-е сутки, т.е. в момент забора ККМ, у этих животных наблюдали лишь начальные признаки заболевания, определяя в костном мозге невысокие титры вируса. Данный

штамм вируса выявлялся в ККМ и внутривенно инфицированных мышей. Наличие в костном мозге зараженных мышей апатогенного штамма вируса обнаружить не удалось.

Был проведен также анализ действия нескольких штаммов вируса гриппа на функциональные свойства СКК при непосредственном контакте вируса и костномозговых клеток in vitro. Это позволило создать условия для более тесного взаимодействия клеточных элементов костного мозга, в том числе стволовых клеток, с вирусом, не опосредованного регуляторными системами целостного организма. Данный способ представлялся перспективным и для определения структурных компонентов вириона гриппа, инициирующих те или иные изменения пролиферативных и дифференцировочных процессов в силу наличия у рекомбинантного штамма А/РК-6-3 (H2N1) гена иммунодоминантного гликопротеина гемагглютинина (ГА) Н2, унаследованного от штамма А/Краснодар/101/59, а всех остальных генов от вируса A/PR/8/34. В этих опытах (табл.2) родительский штамм A/PR/8/34 суирессировал пролиферации СКК на 67,6%, наблюдалось также угнетение дифференцировки СКК, преимущественно в сторону гранулопоэза - отношение Э/Г увеличивалось с 2,5 до 4,8 (группа 2). Характерно, что утрата вирусом инфекционных свойств в результате 30-мипутного прогревания при 56°С не лишала его супрессорной активности (группа 3). Нагревание вирусного материала до 100°С несколько уменьшало, но не отменяло супрессивный эффект (группа 4). Таким образом, как и в опытах in vivo при внутривенном заражении мышей, обработка костномозговых клеток вирусом A/PR/8/34 in vitro приводила к подавлению пролиферации гемопоэтических клеток-предшественников. Однако, если при действии вируса in vivo наблюдалась тенденция к большему угнетению эритроидного ростка, то при действие вируса in vitro регистрировался обратный эффект - значительно сильнее подавлялась дифференцировка стволовых клеток в направлении гранулопоэза.

В отличие от штамма A/PR/8/34 вирус А/Краснодар/101/59 после контакта с ККМ in vitro вызывал стимуляцию дифференцировки СКК в гранулоцитарном направлении, отношение Э/Г с 2,5 снижалось до 1,8 (группа 5). Следует отметить, что прогревание вирусного материала при 56°С (группа 6) или термическая обработка при 100°С не лишала его способности влиять на характер дифференцировки КОЕс, отношение Э/Г состаляло 1,7. Учитывая, что при интраназальном и внутривенном заражении мышей данный штамм угнетал пролиферацию СКК, не влияя на характер

Таблица 2

Характер пролиферации и дифференцировки СКК мышей в селезенке летально облученных сингенных реципиентов после контакта костномозговых клеток in vitro с вирусом гриппа А.

руппа • Штамм вируса, Вид Число колоний на серийных срезах селезенки Отношение

используемый вирусного летально облученных реципиентов на 9-й день Э/Г

для обработки материала после пересадки ККМ

ккм .-----------

Всего Эритроиднсго Гранулоцитарного

(Э) типа (Г) типа

1 Контроль (ККМ без обработки вирусом) - 18^+2,9 (18) 123+1,9 5,0+0,9 2,5

2 3 4 A/PR/8/34 А Б В 6,0+0,8 (16) 83+1,4 (17) 10,5+2,2 (18) 4,8+1,4 63+1,5 7,8+2,8 1,0+0,2 13+0,4 23+0,8 4,8 5,0 3,4

5 6 7 А/Краснодар/101/59 А Б В 20,8+2,9 (18) 26,0+3,9 (17) 193+2,5 (16) 12,8+3,1 15,0+2,5 10,5+2,0 73+1,1 9,0+13 6,8+1,1 1,8 • 1,7 1.7

8 9 .0 А/РК-6-3 N А Б В 2,8+0,9 (19) 23+2,0 (18) 183+2,2 (18) 1,5+0,4 1,8+0,5 113+3,2 0 0 5,5+0,9 2,0

[1 12 А/Хабаровск/933/77 N А Б 83+1,6 (10) 133+2,1 (10) 4,8+13 8,5+1,6 33+0,9 5,0+13 1,5 1,7

Примечание. Животным трансплантировали 2Ч05 ККМ. А - инфекциионный вирус; Б - вирус, инактивирозанный 1агреванием при 56°С в течение 30 мин; В - вирус, инактивированиый нагреванием при 100°С в течение 5 мин. В опытах 1Спользовали очищенные варианты вируса гриппа за исключением штамма А/Хабаровск/933/77, который применяли в 1ллантоисном варианте.

дифференцировки кроветворных клеток-предшественников, можно сделать вывод, как и в случае с вирусом A/PR/8/34, о различных механизмах влияния вируса на СКК in vivo и in vitro.

Штамм А/Хабаровск/933/77, в отличие от вируса идентичного подтипа A/PR/8/34, не вызывал заболевания у мышей, подавлял образование колоний и угнетал дифференцировку стволовых клеток главным образом в эритроидном направлении, отношение Э/Г с 2,5 падало до 1,5-1,7. Супрессорная активность данного вируса сильно снижалась после 30-минутного прогревания при 56°С (группы 11,12)..

Наиболее выраженной супрессорной активностью по отношению к СКК обладал рекомбинантный штамм А/РК-6-3, обработка которым ККМ in vitro вела к сильному снижению роста колоний и значительному угнетению дифференцировки СКК. Число эритроидных колоний уменьшалось в 8 раз, а рост колоний гранулоцитарного типа был подавлен полностью (группы 8,9). Таким образом, опыты in vitro не только подтвердили результаты экспериментов in vivo, но позволили выявить новые факты, в частности, стимуляторный эффект вирусной инфекции, в значительной степени зависящий от структуры поверхностных антигенов вирионов, подтипа вирусного гемагглютинина.

Последующие эксперименты показали, что супрессия колониеобразования вирусом гриппа in vitro является дозозависимым процессом, причем степень супрессии прямо пропорциональна дозе вируса, используемой для обработки ККМ. Максимальный эффект в этих опытах достигался при дозе вируса 5 ЭИД50 на одну ядросодержащую клетку. Степень угнетения формирования КОЕс при данной дозе вируса (6,9+1,3 КОЕс) была достоверно выше (Р<0,01), чем при дозах 0,5 и 0,1 ЭИД50 -9,7+1,1 и 12,4+0,8 колоний соответственно. Когда животным трансплантировали костный мозг, не подвергавшийся воздействию вируса, количество колоний составляло 22,9+0,3. Нагревание вирусного материала до 56°С в течение 30 мин не влияло на его способность супрессировать функции КОЕс, обработка ККМ инактивированным вирусом снижала количество колоний в селезенке реципиентов до 5,3+1,2.

В целом, полученные данные показывают, что гриппозная инфекция in vivo или in vitro изменяет пролиферативные способности СКК и характер их дифференцировки в направлении эритро- и гранулопоэза. Эффект определяется штаммом используемого вируса, значительно сильнее проявляется при непосредственном контакте костномозговых клеток с

вирусами in vitro, не опосредованном регуляторными и эффекторными системами целостного организма.

1.2.Изучение пролиферации и дифференцировки костномозговых кроветворных стволовых клеток и влияния лимфоцитов на кроветворные клетки-предшественники в динамике развития гриппозной инфекции у

мышей.

С целью изучения пролиферации и дифференцировки СКК на фоне развития у мышей гриппозной инфекции животных интраназально заражали нелетальной дозой (500 ЭИД50) патогенного для них штамма A/PR/8/34. Через 24, 72 и 168 ч после инфицирования костномозговые клетки этих мышей трансплантировали сингенным летально облученным реципиентам. В ряде опытов у зараженных доноров костного мозга в те же сроки выделяли лимфоциты лимфатических узлов, смешивали их in vitro с ККМ сингенных интактных доноров в соотношении 100:1 и также пересаживали сингенным летально облученным реципиентам. Для сравнительного анализа влияния различных типов клеток иммунной системы на функциональные возможности СКК помимо лимфоцитов сингенным реципиентам пересаживали перитонеальные макрофаги и тимоциты в смеси с интактными ККМ. Пролиферацию и дифференцировку СКК оценивали в стандартных условиях.

Установлено, что при гриппозной инфекции у мышей происходит угнетение процесса пролиферации СКК и изменяется соотношение числа колоний эритроидного и гранулоцитарн ого типов. Эффект супрессии функций стволовых клеток при гриппе носит динамичный характер и проявляется в зависимости от сроков заболевания. Лимфоциты зараженных животных подавляют пролиферацию КОЕс костного мозга интактных сингенных мышей и изменяют направление их дифференцировки, сдвигая соотношение Э/Г с 2,2 до 1,2. Клетки тимуса и макрофаги в этих условиях не оказывают достоверного выраженного воздействия на функции СКК.

Данные, представленные в табл.3, указывают на то, что через 24 ч после заражения мышей - доноров костного мозга вирусом гриппа число микроколоний в селезенках реципиентов не отличается от такового у мышей, которым трансплантировали ККМ незараженньсх гриппом животных (группы 1,2). При этом соотношение Э/Г уменьшается с 2,0 до 1,2. Изменение дифференцировки СКК происходит за счет некоторого снижения числа эритроидных и увеличения количества гранулоцитарных колоний. Через 72 ч после заражения отмечено двукратное снижение числа микроскопически учитываемых колоний. При этом у большинства животных наблюдали существенное снижение числа колоний эритроидного н гранулоцитарного ,,

Таблица

Влияние гриппозной инфекции на пролиферацию и дифференцировку С! костного мозга мышей, выделенных через 24-168 ч после заражения живота вирусом А/РИ/8/34 и трансплантированных летально облученным сингенш реципиентам.

Группа

Продолжительность времени(часы) между заражением доноров СКК вирусом и извлечением ККМ

Число колоний на серийных срезах Отношение селезенки летально облученных реципиентов на 9-й день после трансплантации ККМ Э/Г

Всего

Эритроид-ного типа О)

Гранулоцитар-ного типа <Г)

1 Контроль 10,8+1,3 7,2+1,0 3,6+0,6(20) • 2,0 (ККМ неза-

раженных мышей)

2 24 11,6+1,6 6,0+1,2 5,3+1,0(26) 1,2

3 72 4,8+0,9 3,0+0,5 1,8+0,3(24) 1,7

4 168 7,3+1,4 5,7+0,8 1,7+0,3(23) 3,4

Таблица

Влияние КЛУ. выделенных у мышей через 24-168 ч после их заражения вирусс гриппа А/РЯ/8/34, на пролиферацию и дифференцировку СКК костного моз незаряженных гриппом сингенных животных при трансплантации смеси КЛУ ККМ летально облученным сингенным реципиентам.

Группа

Продолжительность времени (часы) между заражением доноров КЛУ и извлечением лимфоузлов

Число колоний на серийных срезах Отношение

селезенки летально облученных

реципиентов на 9-й день после

трансплантации КЛУ зараженных Э/Г

мышей в смеси с ККМ интактных

животных

Всего

Эритроид-ного типа О)

Гранулоци-тарного типа (Г)

1 Контроль (ККМ неза-раженных мышей) 10,8+1,3 7,2+1,0 3,6+0,6(20) 2,0

2 Контроль (ККМ неза- раженных мышей+КЛУ незараж. мышей) 10,7+1,5 7,0+1 ¡1 3,240,6(25) 2,2

3 24 11,6+2,0 7,8+1,3 3,4+0,7(24) 2.3

4 72 5,5+0,9 3,3+0,5 2,0+0,4(26) 1,6

5 168 12,6+1,6 6,6+1,0 5,4+0,9(22) 1,2

типов (группа 3). На 7-е сутки заболевания дифференцировка КОЕс в эритроидном направлении практически восстанавливалась, а гранулоцитарный росток оставался подавленным.

Результаты опытов по трансплантации реципиентам смеси ККМ интактных мышей и клеток лимфатических узлов (КЛУ) инфицированных гриппом животных в сингенной системе (табл.4) не только подтверждают положение о том, что процессы дифференцировки в костном мозге находятся под контролем Т-системы иммунитета (Петров Р.В. и др.,1979), но и обеспечивают его дальнейшее развитие. Известно, что активированные изоантигенами лимфоциты индуцируют изменение направления дифференцировки с эритроидного на гранулоцитарный. Эффект был обнаружен в несингенной системе при трансплантации смеси сингенных родительских клеток гибридным реципиентам (Петров Р.В. и др.,1973). Нами воспроизведен этот же эффект в полностью сингенной системе донор-реципиент при использовании для активации лимфоцитов вместо тканевых антигенов вируса гриппа. Установлено, что КЛУ, полученные от больных гриппом мышей на третьи сутки после заражения, обладали значительной супрессорной активностью по отношению к сингенным интактным СКК (группа 4). Таким образом, лимфоциты зараженных вирусом гриппа животных не только изменяют направления дифференцировки КОЕс, но и подавляют размножение гемопоэтических клеток-предшественников. Характерно, что лимфоциты, полученные от зараженных мышей через 24 и 168 ч после инфицирования животных вирусом, не оказывали столь выраженного влияния на рост КОЕ^, общее число колоний, определяемых в селезенках животных реципиентов из этих групп, не имело достоверных различий с контролем (табл.4, группы 3 и 5)). Тем не менее, были обнаружены различия в дифференцировке КОЕс, в частности, на 7-е сутки заболевания наблюдали подавление роста гранулоцитарных колоний (табл.3, группа.4), а КЛУ, полученные от больных животных в этот же срок, способствовали не только усилению дифференцировки КОЕс в гранулоцитарном направлении, но и содействовали нормализации процесса образования колоний в селезенке облученных реципиентов (табл.4, гр. 5).

Тимоциты больных гриппом мышей, добавленные in vitro к" ККМ интактных сингенных животных в соотношениях 5:1,30:1 и 100:1 (табл.5), как и макрофаги перитонеального экссудата этих мышей, трансплантируемые сингенным реципиентам в смеси с ККМ в соотношении 1:1, не изменяли пролиферативные' и дифференцировочные процессы, осуществляемые этими клетками.

Таблица

Влияние тимоцитов мышей, зараженных вирусом гриппа А/РЙ/8/34, 1 пролиферацию КОЕс при трансплантации смеси тимических и костномозговь клеток сингенным летально облученным реципиентам.

Группа Трансплантируемые Число колоний в Число опытов

клетки селезенке облучен- и животных

ных реципиентов (в скобках)

1. ККМ0 18,5+1,5 4(32)

2. ККМ0+КТ0 18,4+1,3 4(32)

3. KKM0+KTi 21,7+2,8 4(29)

4. ККМ0+КТ3 19,1+1,9 4(30)

5. ККМ0+КТ24 22,2+2,1 4(28)

6. ККМ0+КТ72 20,8+1,8 4(26)

7. KKMo+KTi20 19,9+1,7 4(25)

Примечание: ККМ0-клетки костного мозга интактных мышей, КТ0-клетки тиму интактных мышей, КТ1 -КТ) 20-клетки тимуса, полученные от мышей через 1-1! ч после заражения вирусом гриппа.

Таблица

Влияние лимфоцитов лимфатических узлов мышей, стимулированных in vit вирусом гриппа, на пролиферацию КОЕс при трансплантации лимфоидных костномозговых клеток сингенным летально облученным реципиентам.

Группа Трансплантируемые клетки Число колоний в селезенке облученных реципиентов Число опытов и животных (в скобках)

1. ККМ0 12,1+1,2 3(24)

2. ККМ0+КЛУ0 13,2+1,4 3(24)

3. ККМ0+КЛУ1 13,2+1,6 3(22)

4. ККМ0+КЛУ2 6,2+0,7 3(23)

5. ККМ0+НЖ0 15,2+1,7 3(24)

6. ККМ0+НЖ1 9,9+1,0 3(22)

7. ккм0+нж2 6,1+0,6 3(23)

Примечание:ККМ-клетки костного мозга, КЛУ-клетки лимфатических узлов, интактных мышей, 1-стимулированных вирусом А/Р11/8/34, 2-стимулированн! вирусом А/Краснодар/101/59, НЖ-надосадочная жидкость лимфоците Соотношение ККМ и КЛУ - 1:100.

¡.З.Влияние лимфоцитов, стимулированных in vitro вирусом гриппа, на рост экзогенных КОЕс

Принимая во внимание полученные данные о влиянии лимфоцитов зараженных гриппом мышей на функции СКК, были проведены эксперименты, целью которых являлось изучение взаимодействия стволовых и лимфоидных клеток после непосредственной стимуляции последних вирусами в' культуре.

Лимфоциты лимфатических узлов интактных мышей (CBAxG57BL/6j)Fi стимулировали вирусами A/PR/8/34 или А/Краснодар/101/59. Вирусный материал в культуру добавляли из расчета 5 ЭИД50 на одну клетку. Через 72 ч культивирования суспензию лимфоцитов смешивали с ККМ интактных сингенных животных в соотношениях 10:1 или 100:1 и трансплантировали сингенным летально облученным реципиентам. Часть ККМ ресуспендировали в среде культивирования лимфоцитов, а затем после 1 ч инкубации при 37°С смесь ККМ с лимфоцитами или суспензию ККМ в среде культивирования лимфоцитов трансплантировали синсенным летально облученным реципиентам, в селезенках которых через 9 дней подсчитывали число макроскопически видимых колоний.

Установлено, что лимфоциты, стимулированные в культуре in vitro вирусом A/PR/8/34. а также среда культивирования этих клеток не оказывали достоверного влияния на рост экзогенных КОЕс (табл.6).

Лимфоциты, стимулированные вирусом А/Краснодар/101/59, и среда культивирования этих клеток с вирусом вызывали в среднем 50% угнетение колониеобразования в селезенках реципиентов.

Таким образом, выявлена существенная разница во влиянии лимфоцитов, стимулированных патогенным вирусом гриппа в организме мышей и культуре клеток. Клетки, стимулированные штаммом A/PR/8/34 in vitro не оказывали влияния на рост КОЕс, а лимфоциты больных животных приобретали супрессивную акгоность по отношению к сингенным СКК. Из этого следует, что механизмы воздействия вируса в условиях целостного организма и при непосредственном контакте различны. 1.4.Исследование влияния клеток иммунной системы легких мышей, зараженных вирусом гриппа, на пролиферацию . и дифференцировку сингенных гемопоэтических клеток-предшественников.

Изучали влияние клеток иммунной системы, полученных из воздухоносных путей мышей, зараженных изучаемыми штаммами вируса гриппа, на функции СКК. С этой целью на 3-4 сутки после интраназального заражения от животных получали бронхоальвеолярную лаважную жидкость

(БАЛЖ), выделяли из нее клеточные элементы, смешивали их с сингенными костномозговыми клетками интактных мышей в соотношении 1:1 и после 60-минутной инкубации при 37°С внутривенно трансплантировали сннгенным летально облученным реципиентам. В контрольных опытах ККМ интактных мышей инкубировали с лишенной клеток БАЛЯС интактных хшвотных и мышей, инфицированных гриппом, а затем их такие трансплантировали скнгенным облученным мышам. На 9 сутки пиЕотных-реципиентов убивали, учитывали количество макроколошш на поверхности селезенок, а на серийных парафинизпрованных срезах селезенок подсчитывали число колоний кроветворных клеток разных гистологических типов.

Использование данной модельной системы было вполне оправданным ввиду того, что иммуноциты легких, представленные преимущественно элементами макрофагального и лпмфоидного типов, учитывая их физиологическую даслокащпо, первыми из клеток нммунной системы взаимодействуют с вирусом, испытывая при этом его модулирующее влияние, а костномозговые кроветворные клетки, в силу известных уникальных свойств, определяют ранние этапы иммуногенеза н, следовательно, патогенетические особенности развитая заболевания.

Установлены существенные различия ыеиду влиянием па функции СКК клеток БАЛЖ интактных мышей ы гахвотных, зараженных вирусами гриппа (рис.1). Так, в результате взаимодействия ККМ п клеток БАЛЖ интактных мышей происходило отчетливо выраженное усиление пролиферации СКК (группа 3). Не Еыязлено достоверных изменений пролиферации спкхлооых клеток после добавления к ККМ клеточных элементов из БАЛЖ ыышей, зараженных вирусом А/Краснодар/101/59 (группа 7). Сильная супрессня роста ICOEc обнаружена после контакта костномозговых клеток н клеток БАЛЖ еиеотных, га раненных штаммом A/PR/8/34 (группа 5).

Несколько иная динамика колонпеобразовання выявлена прп использовании для обработки костномозгового трансплантата бропхоальвеолярных смыбов, лишенных слеток. Так, БАЛЖ шпжктпых (группа 2) п ппфнцпроЕапных вирусом А/Краснодар/101/59 (группа б) мышей значительно усиливала пролиферативные возможности СКК, а БАЛЖ хшвотных, зараженных патогенным штаммом, утрачивала стимулирующие свойства, венду чего рост КОЕ^ в этой группе не отличался от такового в контроле (группа 4).

1316 12

3 •

4 -

1 2 3

4 5

-к

6 7

Рсс.1. Влжпгаз БЛЛ)Х п клеток Б АЛ Ж скнггшшх мытпей, плраг^шплс гхгрусом гриппа, на пролиферацию КОЕс з сястеке экзогенного колониеобразовантта.

По оси абсгксс: 1 - ККМ шггактных мышей; 2 - ККМ+БАЛЖ пптахтных мнтпей; 3 - ККМ+хлеткп БАЛ/Х пптактных ш*:пгн; 4 -ККМ+БАЛлС мышей, зарагеппых штаммом Л/РЙ/3/34; 5 - ККМ+клеткп БАЛХС !1ышей, зараженных штаммом А/РЙ./3/34; б - ККМ+БАЛЖ мьнлей, заракетптых штатном А/Краснодар/101/59; 7 - ККМ+хлеткн БАЛ/Х мышей, зараженных штаммом А/Краснодар/101/59.

По оси ординат: количество селезеночных колоний.

Тйблггтл 7.

Влияние клеток БАЛ"( мьнлей, зараженных рззлнчтшми штаммами вируса гриппа, на пролиферацию и дафференцировку СХХ костного мозга скнгешшх летально облучение реципкентоз.

Отношен:{е Э/Г

Клетки, транс Число колоний на серийных срезах плантируекыг селезенки летально облученных облученным рсцппие:ггот! (М+м) на 9 день поел 2 реципиентам пересадки 5г. 10,''ККМ шггактных мышей з снеся с 5г. 10 - меток БАЛуХ зар1-Ееиньк гриппом сянгектпж ттотпиг.

Всего Эрптропд-ного (Э) типа Гранулоип-тарпого (Г) типа

1.ККМ интакт- 12,2+1,6(25) 6,5+0,3 5,4+0,5 1,2

пых кыш:*

2.ККМ+клеткн 18,9+2,1(21) 11,4+1,2 7,2+1,1 1,6

БАЛЖ ннтак-

тных мышей

З.ККМ+клетки 2,8+0,3(22) 2,2+0,2 0

БАЛЖ мышей

зарахенных

вирусом

А/Р11/8/34

4.ККМ+клетки 8,7+1,3(24) 4,8+0,8 2,5+0,3 1,9

БАЛЖ мышей

зарахенных

вирусом А/Краснодар

101/59

Исследование дифференцировки КОЕс под влиянием клеток БАЛЖ показало (табл.7), что усиление пролиферации СКК происходит в основном за счет стимуляции эритроидного ростка кроветворения, хотя отмечали и тенденцию к усилению роста колоний гранулоцитарного типа. Снижение общего числа колоний после воздействия на ККМ клеток БАЛЖ мышей, зараженных вирусом А/РЯ/8/34, происходило за счет сильного уменьшения количества эритроидных и полного угнетения роста гранулоцитарных колоний. Как уже отмечалось, клетки БАЛЖ мышей, зараженных вирусом А/Краснодар/101/59, не оказывали достоверного влияния на рост макроколоний в селезенках реципиентов (рис.1). Однако гистологический анализ продемонстрировал при неизменном числе эритроидных колоний угнетение роста гранулоцитарных КОЕс, в результате чего отношение Э/Г увеличивалось с'1,2 до 1,9.

Таким образом, клетки, полученные из бронхоальвеолярных смывов зараженных гриппом животных, супрессировали пролиферацию. и дифференцировку СКК. Установлены пггаммовые различия влияния клеток БАЛЖ на эритроидный росток кроветворения: патогенный штамм вируса угнетал рост эритроидных колоний, а а патогенный вирус на них практически не действовал. Тем не менее, оба исследуемых штамма супрессировали дифференцировку стволовых клеток в гранулоцитарном напаравлении, что согласуется с результатами опытов при моделировании у животных естественного инфекционного процесса.

2.Изменения в стромальной ткани костного мозга и их влияние на кроветворение при гриппе.

Исследовали влияние гриппозной инфекции на количественный состав основных типов клеток костного мозга, динамику его изменений на фоне развития болезни, а также эффективность колониеобразования фибробластов (ЭКОф), являющихся элементами стромы костного мозга.

Мышей (СВАхС57В1Убрр1 интаназально заражали вирусами гриппа А/РЯ/8/34 или А/Краснодар/101/59 в дозах 1000 ЭИД50. На 1-е, 3-й и 5-е сутки после заражения стандартными методами выделяли ККМ, готовили окрашенные мазки и подсчитывали количество основных типов клеток костного мозга. Колонии фибробластов учитывали на 12-14 сутки путем приготовления окрашенных мазков. Эффективность колониеобразования определяли по формуле: ЭКОф ■ количество учтенных колоний/количество посеянных ККМ.

Установлено, что заражение мышей вирусом гриппа приводят к изменению нормального клеточного состава костного мозга. Характер и интенсивность изменений зависят от штамма вируса и сроков развития инфекционного процесса (табл.8). Так, через 24 ч после заражения мышей вирусом Л/РЯ/8/34 отмечалось увеличение количества макрофагоподобных клеток с резким сокращением их числа на 3-й и 5-е сутки заражения. В эти же сроки выявлено постепенное, но отчетливо выраженное снижение, числа клеток с базофяльной цитоплазмой. К 5-м суткам заболевания, после некоторого подъема на 3-й сутки, существенно сокращалось количество клеток лкмфоидного типа. Таким образом, инфекционный процесс, вызываемый патогенным штаммом вируса гриппа, сопровождается преимущественным сокращением в костном мозге больных мышей числа клеток, являющихся потомками кроветворных стволовых клеток. С другой стороны, под влиянием этого вируса в костном мозге, с максимумом на 5-е сутки, происходило нарастание относительного количества фибробластоподобных и дендритных клеток. Необходимо отметить, что практически сразу после заражения наблюдалась стимуляция пролиферации фибробластов, о чем свидетельствует увеличение количества колоний фибробластов на 1-е сутки заболевания в 1,8 раза (ЭКОф-1,8). На 3-й и особенно на 5-е сутки наблюдения ЭКОф постепенно снижалась.

Заражение мышей вирусом А/Краснодар/101/59 также, как и А/РЯ/8/34, приводило к сокращению в костном мозге меток макрофагально-гранулоцнтарного типов. Однако динамика индуцируемой вирусом супрессии имела существенные отличия - наиболее выраженное угнетающее действие вируса по отношению к макрофагам и лейкоцитам костного мозга отмечалось через сутхи после заражения, н только к 5-м суткам число макрофагальных элементов восстанавливалось. Количество клеток с базофильной цитоплазмой оставалось сниженным относительно контроля практически в 2 раза.

Характерной особенностью воздействия на костный мозг животных вируса А/Краснодар/101/59 можно считать его ярко выраженное стимулирующее влияние на лимфоидный ряд клеток: количество лимфоидных элементов в костном мозге к 5-м суткам наблюдения возрастало в 2,3 раза по сравнению с контролем. Учитывая, что число лимфоцдных клеток в костном мозге мышей, зараженных штаммом А/РИ/8/34, уменьшалось в 1,5 раза, можно полагать, что по данному признаку различия между двумя штаммами вируса гриппа являются наиболее существенными. Кроме того, очень важным, на наш взгляд, отличием воздействия изучаемых

Таблица 8

Влияние гриппозной инфекции на состав ККМ и пролиферативную активность КОЕл костного мозга мышей.

Тип клеток

Лимфоидного Макрофагально- С хорошо кон- Фибробласто- Дендритные

ряда (мелкие, го типа (с плохо турируемой подобные клетки

округлой фор- контурируемой цитоплазмой клетки

мы, скомпак- цитоплазмой, (базофильной)

тным ядром) встречаются с и ацентрично

двумя ядрами) расположенным ядром

А/РЛ/8/3* (НШ1) 1 3 5 1,8 0,6 ОД 17Д±ЗД 29315,7 13312,1 273+4Д 43чО,9 9,011,7 9^113 4,5+1,0 и+од 41,0+73 57,7+8,5 66,7193 4.5Ю.9 4Д+0.7 9,0+1,6

А/К^аснодар/ 1 3 5 ОД ОД 0,6 19,4133 27Д+4.6 48,017,5 53ИД 8,5+13 21,5+33 2,1-ЮЗ 53И.1 5,5+13 56318,5 54318,1 25,0+3,9 . 5ДИЗ 4.7+1/) 0

Норма (контроль) - 1,1 20,714,1 17313,5 10,4+1,5 47,617.9

Штамм вируса, Продолжи- ЭКОф

используемый тельность (колк-

для заражения (сут) между чество

мышей заражением колоний

доноров ККМ на 105

и извлече- ККМ) нием ККМ

Примечание. КОЕф - солоннсобразуюшне единицы фнбробластов.

ЭКОф - эффективность колониеобразования фнбробластов.

вирусов является нх влияние на стромальные клетки костного мозга -фнбробласты. Как узе отмечалось, стимуляция пролиферации колониеобразующнх единиц фибробластов (КОЕф) начиналась в костном мозге через сутки после заражения мышей вирусом A/PR/8/34. На более-поздних сроках заболевания относительно увеличивался н процент фибробластоподобных клеток. В то же время, через сутки'после заражения мышей вирусом А/Краснодар/101/59, ЭКОф была очень низкой (0,2), а процент фибробластоподобных клеток к 5-м суткам снижался в 2 раза.

Таким образом, оба изучаемых штамма вируса гриппа оказывают сильное супрессивное действие по отношешпо к потомкам клеток-предшественнкков миелоидного типа, что согласуется с результатами, полученными при исследовании процессов пролиферации и дифференцировки KOEj-, описанными в первой части работы.

З-Изученне фунгцконнрззатш лнмфондных клеток при гриппозной инфекции н под воздействием антигеноз вируса гриппа in vitro. 3.1. Анализ особенностей митогенной активности различных по подтипу и папогенности штаммов вируса гриппа А.

11ель данного исследованна заключалась в сравнительном' анализе мятогенной активности нескольких штаммов вируса гриппа А, принадлежащих к подтипам H1N1, H2N2 я H2N1, по отношению к лимфоцитам мышей ряда ннбредпых линий, разлнчающгохя по гаплотапу - СВА(Н-2^), C57BL6j(H-2^), BALB/c(H-2d) п габрядоз мкшеЭ (CBAxC57BL6j)Fi, (H-2k/H-2b), а также в изучения механизмов взаимодействия вирионов гриппа с лимфоцитами мышей в культуре. Кроме кнфскцисякых штаммов вируса в качестве митогеноз нсподьгсгаля впрусхый материал, инактивированный нагреванием при 56°С в теченне 30 минут, комплексы поверхностных антигенов (КПА), состоящие из гемштлютнгаша и нейраминидазы штаммов вируса гриппа А/Краснодар/101/59 (H2N2)n A/PR/8/34 (H1N1), а также матршссный рекомбинантнын белок Mj.

В реакции бластной трансформации лимфоцитов (РБТЛ) селезенки мышей, интраназально иммунизированных КПА H1N1 и H2N2, сравнивали модулирующее действие поверхностных антигенов вируса гриппа на функцию спленоцитов в условиях целостного организма, а также оценивали митогенные свойства соответствующих КПА и гомологичных вирионов.

Показано, что инфекционные штаммы вирусов подтипов H2N2 и H2N1 (А/Краснодар/101/59 и А/РК-6-3) вызывают высокий пролиферативный ответ лимфоцитов интактных животных, а вирусы подтипа H1N1 (A/PR/8/34 и А/Хабаровск/933/77), как правило, низкий ответ. Лишение вирусов

инфекционных свойств с помощью термообработки усиливало митогенную активность всех исследуемых штаммов за исключением A/PR/8/34, митогенные свойства которого не изменялись (рис.2). Усиление мито генной активности данного вируса происходило лишь после 100-кратного увеличения концентрации вирусного материала в культуре. Однако и в этих условиях пролифератжвная реакция лимфоцитов на данный вирус была в 1,5 раза ниже соответствующей реакции на вирус подтипа H2N2.

Выявлена генетически обусловленная зависимость пролиферативного ответа спленоцитов мышей на антигены вируса гриппа различных подтипов. Tax, лимфоциты мышей СВА, (CBAxC57BL/6j)Fi ■ BALB/c отвечают хорошей пролиферативной реакцией на стимуляцию вирусами подтипов H2N2, H2N1 н плохой на подтип H1N1, а лимфоциты мышей C57BL/6j плохо пролифернруют под воздействием всех перечисленных штаммов.

Необходимо отметить, что дозы КПА H1N1 и H2N2, вызывающие максимальный пролиферативный ответ лимфоцитов, в отличие от оптимальных мято генных доз цельных гомологичных вирионов очень близка по своим значениям. Однако ■ в опытах с КПА в качестве мито генов ответ на антигены H2N2 был достоверно выше такового на антиген H1N1.

28 24 20 16 12 ■ 8 •

¿1

it

h

ri

4

Рис 2.Пролиферативный ответ спленоцитов мышей (CBAxC57BL/6j) Fi .стимулированных в культуре инфекционными и инактивированными вирусами гриппа А. По оси абсцисс: 1- без стимуляции. А - стимуляция инфекционными вирусами, Б -стимуляция инактивиро ванными вирусами: 2 -A/PR/8/34 (H1N1), 3 - А/Хабаровск/ 933/77 (H1N1), 4 -А/Краспо-дар/101/59 (H2N2), 5 -А/РК-6-3 (H2N1). По оси ординат - количество (xl(r) имп/мин.

1 2345 2345

Стимуляция лимфоцитов КПА показала, что пролиферативный ответ на поверхностные антигены по сравнению с реакцией на цельные гомологичные вирноны гриппа снижен более чем в два раза. Стимуляция лимфоцитов М-белком продемонстрировала его способность вызывать достаточно высокий пролиферативный ответ, а суммарная реакция клеток на матриксный. белок и КПА была равна или приближалась по своим значениям к ответу лимфоцитов на цельные вирионы гриппа соответствующих подтипов.

Б

Иптраназальная иммунизация мышей КПЛ подтипоз Н1N1 или Н2Н2

приводила к резкому усилению пролиферативной активности спленоцитоз эти:; животных при их стимуляции в культуре цельными гомологичными вирионакп гриппа п отсутствием различий при использовании в качества митогенсз препаратов соответствующих поверхностных антнгеноз.

На ргс.З представлены результаты опытов по комбинированному введению в культуру лимфоцитов вирусов А/Краснодар/101/59 (Н2Ы2) п А/РИ/3/34 (Н1Н1). Стимуляция лимфоцитов Еирусамп в комбинации НШ1+Н2И2 с интервалом между введением препаратов в культуру 1 ч шга 24 ч вызывала достоверное снижение уровня пролиферации клеток по сравнению с ответом на один Н2К2 (Б,3 и 4). Добавление в культуру, стимулированную вирусом Н2Н2, через 1 ч или 24 ч вируса НШ1, напротив, усиливало пролиферацию клеток (В,3 и 4). Стимуляция лимфоцитов путем одновременного введения в культуру вирусоз Н1N1 и Н2М2 (А,4), а такзсе добавление к лимфоцита;.! вирусного материала в любой последовательности (Н2М2+Н1М илп НШ1+Н2М2) с интервалом 15 и 30 минут (Б,1 п 2, В,1 и 2) ке приводила к достоверно значимым изменениям"'РБТЛ .по сравнешпо с реакцией лимфоцитов на один Н2Ш.

Рис.З. Пролиферативный ответ спленоцитоз мышей прп комбишфопанной стимуляции двумя штаммами вируса гриппа А в культуре. А: 1 - без стимуляции. При стимуляции вирусами: 2 - НШ1, 3 -Н2К2, 4 -НШ1+Н2Ы2 одновременно.

Б: при стимуляции вирусами в комбинации НШ1+Н2К2 с интервалами: 15 мин(1), 30 мин (2), 60 мин (3), 24 ч (4).

В: при стимуляции вирусами в комбинации Н2Ы2+НШ1 с интервалами: 15 мин (1), 30 мин (2), 60 мин (3), 24 я (4). По оси ординат: количество (1(г) имп/мин.

Полученные результаты указывают на то, что взаимодействие вируса Н1М с лимфоцитами в течение 15 и 30 мин не является достаточным для запуска необратимой пролиферативной реакции на этот вирус. Доказательством в пользу данного вывода может служить то, что добавление в культуру, стимулированную "низкоактивным" митогеном НШ1, через 15-30 минут "высокоактивного" Н2Ш приводит к реализации ответа, характерного для

I I I_I > 1_|_1_|_:_I.

1234 1234 123 4

H2N2, но не H1N1. Введение в культуру лимфоцитов вируса H2N2 через 1 ч или 24 ч после стимуляции клеток H1N1 ухе не способствует усилению ответа - он остается низким, характерным для вируса подтипа H1N1. Таким образом, 60 минут является тем, вероятно, минимальным или близким к нему, отрезком времени, который- необходим вирусу подтипа H1N1 для связывания с соответствующими рецепторами на мембране лимфоцитов и запуска пролиферативной реакции.

Величина пролиферативного ответа лимфоцитов на вирусы в комбинации H2N2+H1N1 указывает на более широкий (поликлональный) спектр действия вируса H2N2 по сравнению с H1N1.

3.2.Анализ изменений функциональной активности естественных клеток-киллеров и вирусспецифических цитотоксических Т-лимфоцитов под

влиянием вируса гриппа А. 3.2.1.Модуляция вирусами гриппа A/PR/8/34 и А/Краснодар/101 /59 цитотоксической активности ЕКК.

Исследования проводили по общепринятой методике в 4-х часовом (для клеток мышей) и 18-часовом (для клеток человека) цитотоксическом тесте с использованием в качестве мишеней клеток Т-клеточной лимфомы мыши Yac-1 и клеток эритромиелолейкоза человека К-562, меченых .хромом-51. Источником клетэк-эффекторов у мышей служила селезенка, а у человека -периферическая кровь.

Установлено, что ннтраназальное н внутрибрюшинное заражение мышей вирусами приводило к усилению цитотоксической активности ЕКК этих хпаотпых с пиком на 8-е сутки после заражения. Выявлены значительные различия динамики активности ЕКК, зависящие от способа заражения кнвотных, штамма вируса и, по-видимому, его патогенности (табл.9). Патогенный штамм вируса A/PR/8/34 оказывал более выраженное влияние на цитотокснчность естественных киллеров, чем апатогенный штамм А/ Краснодар/101/59, что в известной степени коррелировало с уровнем накопления интерферона в сыворотке мышей и динамикой размножения вирусов в легких животных.

Было также установлено, что клетки-мишени Yac-1, инфицированные вирусом гриппа in vitro, в большей степени подвержены литическому действию ЕКК интактных мышей по сравнению с неинфицированными клетками. В данной модельной системе вирус A/PR/8/34 также оказывал более выраженное влияние на клетки-мишени по сравнению с вирусом А/Краснодар/101/59 (табл.10).

Таблица 9.

Активность ЕКК мышей после заражения вирусом гриппа А.

Подтип Функциональная активность ЕКК (ИЦ, в %)

вируса Срок после заражения доноров клеток селезенки (сут.)

2 5 6 10 20

Интраназальное заражение

H1N1 23,4+2,5 30,3+0,6 47,3+6,6 35,2+1,7 18,4+1,5

H2N2 19,3+0,9 20,6+1,5 41,3+0,5 13,6+1,1 13,2+1,0

Внутрибрюшинное заражение

H1N1 37,7+1,7 22,9+1,2 42,8+3,0 22,3+1,2 20,0+1,8

H2N2 23,1+3,5 20,9+0,8 41,3+2,7 26,7+1,9 20,1+2,0

Примечание: представлены данные, полученные при оптимальном для лизиса соотношении эффекторы/мишень 50:1, у интактных мышей ИЦ = 20,1+1,4%.

Таблица 10.

Активность ЕКК мышей по отношению к клеткам-мишеням Yac-1, инфицированным вирусом гриппа А.

Соотношение 50:1 100:1

гффекторы/мишень

Интахтные Yac-1 ИЦ 22,3+1,2% 19,3+1,4%

Yac-l, пзфнцнро- ИЦ 25,9+1,4% 28,2+2,1%

Еанные вирусом

H2N2

Yec-1, ппфзцаро- ИЦ 34,3+2,5% 48,1+3,1%

ванные впрусом

H1N1

Учлтит-аа, что элементы Т-клеточной лимфомы Уас-1 не являются пер?гпсспЕной системой для вируса гриппа и в первые 48 ч после заражения прнзнгсоз размножения исследуемых штаммов в клетках не обнарухено, повышение чувствительности к литическому действию ЕКК может быть связано с маркированием впрусиыми антигенами клеточных мембран. Нельзя исключить п активацию ЕКК вирусными антигенами при непосредственном контакте инфицированной мшпенп и эффектора в процессе киллинга. Наконец, возможна активация ЕКК в результате угнетения под влиянием вирусной инфекции клеточных систем, регулирующих функционирование естественных киллеров. В пользу этого могут свидетельствовать результаты микроскопических исследований цитотоксической реакции, показавшие что достоверных различий в числе конъюгатов (образований, в которых к одной клетке-мишени присоединяется три и более клеток-эффекторов) в системе с

вирусом п без него нет. В первые 30 мин взаимодействия число конъюгатов было наибольшим и составляло 17,0+2,0%, а к 20 ч их количество снижалось до 10,0+1,5%. Тем не менее, количество мертвых клеток (окрашенных трплановым синим) среди инфицированных вирусом клеток-мишеней было в первые 4 ч реакции достоверно больше по сравнению с неинфицированнымп Уас-1 (табл.11), что также может быть подтверждением предположения о повышении активности ЕКК и/или о повышении чувствительности клеток-кшшеней к цитотоксическому действию ЕКК.

Таблица 11.

Чувствительность клеток Уас-1, инфицированных вирусом А/РЙ/8/34, к цитотоксическому действию ЕКК в тесте с трипановым синим.

Время взаимодействия 0,5 ч 2 ч 4 ч 20 ч

Уас-1 с ЕКК

Число мертвых Уас-1, 43,3+0% 43,4+4% 48,0+6% 83,0+10%

неинфициро ванных

вирусом

Число мертвых Уас-1, 65,0+5% 71,7+7% 76,0+9% 84,0+11%

инфицированных

вирусом

Примечание: заражение клеток Уас-1 вирусом не влияло на их жизнеспособность, которая составляла в контроле 94,0+3%.

В результате опытов по инфицированию ЕКК человека вирусом гриппа in vitro получен четко выраженный стимулирующий ЕКК эффект. Как патогенный, таг и апатогенный штаммы вируса вызывали стимуляцию цитолитической активности этих клеток. Индекс стимуляции (ИЦ) составлял соответственно 42,8+2,1% и 39,4+1,8%, т.е. в данной модельной системе оба штамма стимулировали активность ЕКК практически одинаково. Интересно отметить, что рекомбннантный штамм А/РК-6-3 (H2N1), обладающий как родитель A/PR/8/34 патогенностыз для мышей и как родитель А/Краснодар/101/59 высокой митогенной активностью в культуре лимфоцитов, проявлял наиболее значительное стимулирующее по отношению к ЕКК действие - ИЦ увеличивался до 51,1+2,3% по сравнению с 27,5+1,4% в контроле.

3.2.2.0бразование в организме зараженных вирусом гриппа мышей вирусспецифических ЦТЛ.

В используемой модели экспериментальной гриппозной инфекции как патогенный - A/PR/8/34, так и апатогенный - А/Краснодар/101/59 штаммы

паруса гриппа вызывала образование в селезенке зараженных животных ЦТЛ, способных in vitro распознавать н лнзнровать сннгенные клетхи-мншенн, инфицированные гомологичным и гетерологичным штаммами вируса гриппа.

Первую часть исследований проводили на мышах BALB/cftf-i'O, которых внутривенно инфицировали очищенными вариантами указанных штаммов вируса. Через 3 недели из селезенок животных выделяли лимфоциты, которые свешивали in vitro с скнгеннымн лимфоцитами, обработанными гомологичным вирусом и митомицином С в соотношении 1:10, н ннкубирогала в течение 5 суток, а затем использовали в цитотоксическом тесте в качестве клеток-эффекторов. Мишенями служили клетки перевиваемой линии Х-бЗ(Н-2^) с адсорбированными на их поверхности гомологичными а гетерологнчныки ннрисаама гриппа. Соотношение эффекторы/ мишень составляло 100:1, 50:1 и 25:1. Цитотоксичиость ЦТЛ определяли также, как и в опытах по выявлению активности ЕКК.

Установлено, что активность ЦТЛ, полученных от мышей, зараженных патогеппым вирусом A/PR/8/34, была достоверно выше активности ЦТЛ мышей, инфицированных апатогенным штаммом А/Краснодар/101/59 (рис.4).

80'

Рнс.4.Уровни штаммоспецифической и типоспецифической активности ЦТЛ из селезенок мышей BALB/c, зараженных вирусами А/ PR/ 8/34 н А/Краснодар/101/59, по отношению к клеткам-мишеням (КМ) перевиваемой линии Х-63.

1.КМ(А/РЯ/8/34)+ЦТЛ(А/Рй/8/34),

2.КМ (А/Краснодар/101 /59)+ ЦТЛ(А/Р11/8/34).

3.КМ (А/Краснодар/101/59)+ ЦТЛ (А/ Краснодар/101/59),

4.КМ (A/PR/8/34)+ ЦТЛ (А/Краснодар/101/59).

По оси ординат ИЦ (%).

Было также проведено сравнительное изучение образования ЦТЛ в селезенке, легких, мсдиаспшальных лимфатических узлах мышеЗ BALB/c, пнтраназально инфицированных патогенным и непатогенным штаммами вируса гриппа. Органы извлекали з различное время после начала инфекция, выделяли лимфоциты и определяли их цитотоксическую актигностъ по отношению к сингенным клеткам, инфицированным гомологичным (штаммоспецифическая активность) или гетерологичным (типоспецнфнческая активность) штаммами вируса гриппа (рис.5, б). В качестве клеток-мишеней я этой серии опытов использовали клетки первичной культуры почек новорожденных сингенных мышат.

60 -

20 *

+

2

3

а

Как видно из приведенных ва рвс-5, 6 данных, ЦТЛ при гриппозной инфекция образуются во всех исследуемых органах зараженных мышей практически одновременно. При этом динамика цитотоксической активности в случае заражения животных патогенным и апатогенным для них вирусами достаточно сходна: первый пик активности наблюдается на 7-й день после заражения, затем отмечен существенный спад и очередное усиление цитолиза на 21-28-е сутки заболевания.

во а

Ч

40

20

Рес-5.Агппшость штамм осп ецифэтеешх ЦТЛ из селезенки (а), легких (б) к ЛЕмфствческкх узлов (в) мышей В АО/с, зараженных вирусами А/РйУ8/34 (—) н

А/Краснодар/101/59 (---), по

отношению к КМ из первичной культуры почек новорожденных сингенных мьпват.

По оси абсцисс: дни после заражения, по оси ординат - ИЦ (%).

Рис.бАггявность •гаП0СП£ЦЕф.5ЧССКЕХ ЦТЛ пз селезенки (а), легких (б) п лимфатических узлоз (В) мышей В ALB/с, зараженных вирусами A/PR/8/34 (—) и

А/Краснодар/101 /59 (---), по

отношению к КМ из первичней культуры почек новорожденных сингенных мышат. По оси абсцисс -дни после заражения, по оси ординат - ИЦ<%).

Представленные результаты еще раз подтверждают вывод о ток, что штамм А/РЯ/8/34 является более активным индуктором образования штамм осп ецифическ их и типоспецифических ЦТЛ по сравнению с А/Краснодар/101/59. Отчетливо прослеживается связь между степенью патогенноств вируса для животных и его повышенной способностью индуцировать формирование в организме популяций вирусспецифнческих ЦТЛ.

3.Z3.Развитие гриппозной инфекции у мышей в условиях Т-клеточного

иммунодефицита.

Полученные данные об участии впрусспецифнческях ЦТЛ в распознавании и лизисе инфицированных .•леток-мишеней, а также в обеспечении устойчивости организма к гриппозной инфекции, дали основание для провеягния экспериментов с гшвотными, лишенными зрелых Т-лзмфоцятов. Для изучения особенностей защитных реакций организма в условиях Т-клеточного иммунодефицита использовали тнмэктомнрованных гпЕОтных (В-мышей).

Мышей подвергали тишктомнп (Семепхов В.Ф. и др., 1985), облучали н защищали сннгешшм костным мозгом. Через 2 месяца мышей ннтраназалъпо заражала патогенным вирусом A/PR/8/34 в различных дозах.

Были получены неожиданные результаты. Выяснилось, что -пгмэктомия способствовала задержке гибели зараженных хпгвотных: В-мыши погибали на 11-15-й деиь после га раненая их летальной дозой вируса, а контрольные (лозшооперарованные) животные гибли на 7-11-й день. Необычной оказалась и повышенная устойчивость В-гшшей к пысоким (5000 ЭИД5д) дозам Еируса гриппа при их предзарзтеяьасм прямярованли (за 1 месяц до заражения) цпззнка (50 ЗИДл)) доггма гомологичного штамма по сравнению с контрольными яязотпымл (табл. 12).

Таблица 12.

Елгпггг Т-алсточного тамуподефщпта гд резистентность мьппей к летальным патогенного ззрусз A/PR/8/34.

Грузия Тип г-озде^спша Легтзлы;сстъ

(%)

i Облучегне 3 глота сзпггнным

г.сстяни мозгом

1 + + + 59+12

2 + + 92+9

Могпю сделать пьпгсд, что тямгктомнз, а следовательно, Т-хлеточный иммунодефицит, в условиях первичного гзрзлекия иъпзеЗ патогенным вирусом гриппа пе только не ускоряет, а заметно замедляет гябель гшзотных. Примзрование пммунодефяшттных мьппей кпзкнмн дозами патогенного штамма повышает их выживаемость после зараиенла скертелыюй дозой гомологичного вируса до 40% по сравнению с группой контрольных (лозашоперировлнных) животных, в которой выживало лишь 8% мышей.

¿Изучение влияния вируса гриппа на количественны« и морфофункциональные параметры клеток системы мононуклсарных фагоцитов мышей.

Выявленные изменения функций сингекных СКК под влиянием нммунощгтов легких зараженных гриппом мышей и обнаруженные при этом межппаммовые различия (разд. 1.4) определили даяьиейтий ход исследования. Был проведен ряд экспериментов, ставивших своей целью изучение некоторых количественных и морфофункционалышх сдвигов, происходящих в гетерогенной популяции клеток иммунной системы респираторного тракта мышей, а также среди макрофагов перитонеалыгого эксудата (МПЭ) этих животных на фоне заражения вирусом гриппа.

4.¡.Изменение количественного состава клеток бронхоальвеолярной лаважной жидкости мышей, зараженных вирусом гриппа.

Установлено, что иэтраназальное заражение мышей вирусом гриппа приводит к немедленному изменению состава клеток. БАЛЖ. Так, уже через 1 ч после инфицирования животных наблюдали резкое снижение в БАЛЖ числа макрофагов, составляющих у интактных мышей ВА1£/с 69,7±3,2% от общего количества всех клеток БАЛЖ (рис.7). Динамика снижения количества макрофагов у мышей, зг раженных вирусами А/РЯ/8/34 и А/Краснодар/101/59, была достаточно сходной. И все же штамм А/Краснодар/101/59 вызывал более глубокое и устойчивое снижение уровня

РисЛДинамиха изменений

клеточного состава БАЛЖ после интраиазалъного заражения мышей вирусом гриппа, а-нейтрофклы, б-махрофаги.

1 - после заражения штаммом А/Красиодар/101/59,

2 - после заражения штаммом А/РЙ/8/34.

По оси абсцисс: время наблюдения (ч), по оси ординат • количество клеток (%). Примечание: на рнсл нейт-рофилы в БАЛЖ интактных мышей отсутствуют.

Показательным было появление в БАЛЖ зараженных гриппом мышей нейгрофилов - клеток, как правило, отсутствующих в воздухоносных путях здоровых мышей. По этому признаку различия между двумя исследуемыми штаммами вируса были весьма существенными - иейтрофильиая реакция на вирус А/Краснодар/101/59 начиналась очень быстро с нарастанием количества

этих клеток по сравнению с А/РЛ/8/34.

ео\-

п 96 по

этих клеток в БАЛЖ через 8 ч и особенно через 24 ч после заражения. У мышей, инфицированных вирусом А/РЯ/8/34, этот процесс запаздывал, увеличение числа нейтрофилов обнаруживали только через 48 ч с максимумом на 3-й сутки после заражения. Таким образом, появление нейтрофилов в БАЛЖ мыш*й, зараженным патогенным вирусом гриппа, отмечалось на 40 ч позже, чем у- животных, инфицированных апатогенным штаммом.

Сравнительный анализ числа лимфоидных клеток в БАЛЖ мышей, инфицированных двумя исследуемыми штаммами вируса, показал, что и по данному признаку имелись существенные различия (табл.13). Было установлено, что на фоне снизения числа макрофагов и нарастания количества нейтрофилов в легких мышей происходит интенсивное увеличение числа лимфоцитов. Особенно отчетливо данный процесс проявлялся у животных, зараженных апато генным вирусом. Количество лимфоцитов в БАЛЖ этих мышей во все сроки наблюдения было в 2-5 раз выше, чем у животных, зараженных штаммом А/РИ/8/34. Таким образом, апато генный штамм вируса А/Краснодар/101/59 индуцировал более интенсивную и раннюю реакцию со стороны клеток иммунной системы мышей по сравнению с патогенным, что в итоге может отражать различную ответную реакцию животных на заражение этими штаммами.

Таблица 13.

Соотношение числа макрофагов п лимфоцитов в БАЛЖ мышей линии ВАЬВ/с, интраназально зараженных вирусом гриппа А.

Штамм вируса 1 8 Срок после заражения (ч) 24 48 72 96 120

А/РЯ/8/34 1:4 1:1,5 1:2 1:2 1:1 1:1 1:2,5

А/Краснодар/101/59 1:9 1:3 1:7 1:10 1:3 1:4 1:4

Примечание: у интактных мышей соотношение макрофагов н лимфоцитов составляло 3:1.

Интраназальное введение зивотным вместо инфекционных вирусов поверхностных антигенов вириона, состоящих из ГА и НА, также приводило к зависимому от подтипа вируса изменению клеточного состава БАЛЖ -появлению нейтрофилов и снижению числа макрофагов. Тем не менее, макрофагальная реакция на антигены Н2№ и НШ1 заметно отличалась от реакции этих клеток на цельные гомологичные вирусы, способные к репродукции. Это может быть связано с некоторыми отличиями в структуре

поверхностных антигенов цельных вирпонов п выделенных антигенов и/илн дополнительной реакцией макрофагов па процесс репродукции. В то зге время нейтрсфЕЛьная реакция па вирусные антигены и цельный инфекционный вирус была практически одинаковой. Вполне вероятно, что появление в Б АЛ Ж пейтрофшюз гглсется в основном реакцией ка антигенное воздействие п в игныпгй степсся связано с процессом размполеппз сиру сов. Напротив, }дарофаги, cíi слстгп, поддеркивающке в определенных условиях абортивный цнн репродукции вируса гриппа, в большей степени реагируют кг инфекционный вирус.

4.2.Изменение ультраструктуры и фагоцитарной активности макрофагов перитонеалъного экссудата мышей под влиянием вируса гриппа.

Исследование фагоцптарпой агтизностп МПЭ проводили в модельных системах in vitro п in vivo. В 1-й серии опытов культуру микробных клеток золотистого стзфплогогга (штамм V/ood-46) вводили шипам внутркбрюаппшо через 72 ч после шпралазальпого заражения этих гшзотных патогетшм (A/PR/8/34) к апатогешаш (А/КраешэдЕр/101/59) штаммами вируса грипп?.. МПЭ выдглсяи ох мышей через 1 ч с 3 ч после инфкцирогапаа стафллохогтом. Во 2-й серии ошл-оз у мышей, зароненных вирусами грипп?., через 72 ч после заражения выделяли МПЭ п выращивали их в течение 2-х суток в культуралыюй средг па покровных стеклах. Через 48 ч культивирования 50%-й иопослой макрофагов заражали стафилококком с фиксацией ьатергала сразу после зароены, а также спустс 1 ч п 3 ч после инфицирования. Исследования проводили с помощью световой п злектронкол микроскопии.

Изучение фагоцитоза in vivo показало, что через 1 ч после введения в перитонеальную полость культуры микроорганизмов у мышей линии BALB/c с одной эукариотичессой клеткой было ассоциировано с среднем 10, линии C57BL/6j - С, линии СБА - 6 микробных тел (МТ). В более поздние сроки эта соотношения сохранялись на прежнем уровне. Установлено, что через 1 ч после микробного заражения значительная часть стафилококков располагалась внутри фагосом, но некоторые МТ бьиш адгезированы на поверхности фагоцитов или находились в стадии захвата отростками. Наблюдалось попарное слияние фагосом, в которых содержалось три н более МТ. Через 3 ч фагосомы превращались в фаголизосомы. Вероятно, содержимое лизосом выделялось в фагосомы, внутри которых появлялись скопления плотного мелкозернистого вещества. Структура микробных клеток изменялась, через 1 ч после заражения у отдельных стафилококков снижалась плотность цитоплазмы, клеточная стенка

отделилась от протопласт и таким образом увеличивалась ширина сгргшлззматпческого пространства. Через 3 ч наблюдали усиление деструкция гсзро организмов, внутри фзгоссм выявлялись лишь остатки клеточной стенал, плзг;щпчегзой мембраны дгспергироЕапного содерззшого МТ.

При ппфгцнрсЕакта МПЭ стг.фзлсгокком ia vitro ^гбщтпрпля била несколько пззе, г:м in vivo. И* ees ~е колячестто япг.рсергапг :мсз, сссоцпЕрояанных с одпем фагоцитом, у мышеЗ, з.зрапеяпых вирусом rpinna, была з 2-3 ргга больше, чем у янтазтпых литагаых. Кром» того, г. ипрсфагах мышей, гзралвяных гарусом, более актигао проходило сг!:.-:;:'.-; ф^гссом п чаще истретадгсь круипне ф итзеоян с большем холичестсом поглегг.еишх j ангрсорггжямоз. Среди фзгоцитсроядято: МТ наблюдали аномальные фор'сы с признаками изменений клеточной стенхл. Через 3 ч =осле икфицирозаЕтя происходило разюканпе коитурез клеточной стенкл, 2гатлтел!но? у сет;--.':?'""; ез Еолпахтпзироззпного гшехтротшо-плотесго слоя п одновременное гогтитлюттеияе nenes плотного слот без четких грзпкц.

образен, в лгппых гхсперчзггиталыгых условиях пирус гриппа пе только гз подавлял фупглеп ^рм^трующлх клеток по стяошепяю г сихтерг-ям, по з сютякльно?! ctshkei способствовал усялегопэ фгпяптгоза МПЭ. Улътрзструктурпкг в юкрофагах, активированных вирусом, и

поглосепных яя гпзробзх более -пггепепзтто, чем з гпгастпых

клетлах. Зто сппдегглъстзует el г^тггчтции спстемы естгетгеяпой резгстсэтгсстн органязка гз услезнп гг^чевяла гриппом, что пе исключает m опр-гдглехтом этапе епбатег-г-^гл п?.рггтгпг:а гглгнпй угагтгппд сктпптсстп иггрсфзсз. Используете ¡.«-гурды пе кнгзпли кгчеп-лябо рззлпчтй, СЕЗОННЫХ со птзжсон спрута гряпгв, его пзтогепнсстью для мышей, а таглг гзплотттпем зар^зеняых птттт:.'::. В дальнейшем полозптелъпая роль усиления фагопяпрней сипвпсста мгтоз сгсткш г'ояозукдеарнкя фэпнцтгоз iiinneff, езразеиных грзвпом, кттатагь пря медеяггеггппя у гтях ггягокялх огертггьянх форм Сг.еготгаЗ п еогпоЗ) сгфялогсхг.ог.оЛ гпфеирти.

4.3.Синтез в альвеолярных макрофагах лышей схрусспецифичесхих РНК.

Учптигая, что вирус гр:гпт прч пепздаштн в реептгпатсршпй трагт способен кардинально изменять ке только нормальную количественную структуру клеток иммунной сг.сте?гн легких, но и оказывать модулирующее действие на функциональные свойства этих клеток, было проведено исследование способности алыгеоляргшх иакрофагоз (AM) поддерживать синтез

внрусспецифических РНК при заражении in vitro двумя изучаемыми нами штаммами вирусагриппа - A/PR/8/34 и А/Краснодар/101/59.

Методом непрямой иммунофлюоресценции было показано, что через 1820 ч после инфицирования большая часть AM, культивируемых с вирусом, содержала в цитоплазме и ядре вирусспецифические белки. На фоне подавляемого актнномицином Д (10 мкг/мл) синтеза собственной РНК в макрофагах выявлен синтез вирусспецифнчесхих РНК. Установлено, что интенсивность синтеза РНК в AM не зависела от патогенности штамма гриппа или его подтипа, т.е., судя по данному признаку, макрофаги реагировали на каждый из исследуемых штаммов вируса практически одинаково. Ни в одном из опытов выход в среду зрелых вирионов не наблюдали. Отсутствие полноценной репродукции вируса в AM свидетельствует, что они являются факторами защиты, но не патогенеза, активно способствуют успешному исходу заболевания.

4.4.Изменение активности 5-нуклеотидазы (5-н) альвеолярных макрофагов и макрофагов перитонеального экссудата мышей, зараженных вирусом гриппа.

Известно, что 5-н - один из основных ферментов пуринового катаболизма, а продукт 5-нуклеотидазвой реакции - аденозин - играет важную роль в регуляции иммунологических процессов (Edelson PJ., Cohn Z.A.,1976). Весьма показательной явилась 5-нуклеотидазная реакция клеток БАЛЖ мышей на интраназальное введение животным инфекционных штаммов вируса гриппа. Вирус А/Краснодар/101/59 во все сроки наблюдения угнетал активность фермента, что указывает на стабильное повышение функциональной активности AM. Несколько отличной была ферментная реакция клеток БАЛЖ на заражение вирусом A/PR/8/34. На фоне снижения активности 5-н через 24 и 72 ч после заражения к 7 суткам было отмечено повышение активности фермента, а на 15 день наблюдения активность 5-н снова снижалась.

Таким образом, под влиянием вируса гриппа, как патогенного, так и апатогеного штаммов, происходит преимущественное угнетение активности 5-н в клетках БАЛЖ зараженных животных, свидетельствующее о повышении функциональной активности этих клеток. На определенном этапе инфекционного процесса (7-е сутки), т.е. в разгар клинических проявлений болезни, вызванной патогенным для мышей штаммом A/PR/8/34, активность фермента увеличивается, превышая контрольный уровень. По-видимому, это означает угнетение функциональной активности макрофагов, что, однако, носит транзиторный характер, так как к 15 суткам наблюдения активность 5-н снова снижается относительно контроля.

Анализ активности 5-н в МПЭ мышей нескольких инбредных линий, зараженных вирусом гриппа, показал, что и в этих клетках активность данного фермента существенно изменяется. Так, у мышей линии СВА через 3 ч после их инфицирования вирусом А/РЯ/8/34, наблюдалось резкое увеличение активности фермента. Уже через сутки активность 5-н значительно уменьшала :ь, оставаясь, однако, повышенной относительно контроля. В последующие сроки наблюдения ферментная активность МПЭ падала с максимальным снижением на 7-е сутки. Кривая изменений активности 5-н после заражения животных вирусом А/Краснодар/101/59 в общих чертах повторяла изменения, отмеченные после воздействия патогенного вируса. Однако снижение активности 5-н под влиянием данного штамма было более глубоким, особенно в первые 3-е суток наблюдения. У мышей линии С57ВЬ/б.)', зараженных патогенным и апатогенным вирусами гриппа, активность фермента с 1-х по 7-е сутки наблюдения между собой практически не различалась, на 37-е сутки не выявлено достоверных различий с контролем. Лишь к 15-м суткам наблюдения отмечено падение активности 5-н, более глубокое у животных, зараженных вирусом А/Краснодар/101/59. Самые низкие показатели активности 5-н выявлены у мышей линии ВАЬВ/с. У этих животных активность фермента была снижена почти во все сроки наблюдения. Лишь на 7-е сутки инфекции, вызванной патогенным штамом А/РЛ/8/34, активность 5-н повышалась и ее значения не имели достоверных различий с контролем. Показательно, что у мышей данной линии наблюдали повышение ферментной активности также и в клетках ВАЛ Ж после заражения животных патогенным штаммом, т.е. реакция на вирус перитонеальных и альвеолярных макрофагов была достаточно сходной.

Таким образом, полученные результаты дают основание полагать, что 5-н является универсальным биохимическим маркером функционального состояния перитонеальных и альвеолярных макрофагов при гриппе. Уровень активности фермента не имеет прямых корреляций со степенью патогенности вируса. Более значимы, вероятно, подтип вируса и га плотил животных -источников макрофагов, что может свидетельствовать о генетической детерминированности данного биохимического признака. Так как уровень активности 5-н в МПЭ и в клетках БАЛЖ мышей ВАЬВ/с коррелирует с высокой фагоцитарной активностью МПЭ этих животных и значительным повышением их устойчивости к заражению стафилококком, можно сделать вывод, что активность 5-н макрофагов может отражать уровень резистентности мышей при моделировании вирус-бактериальной смешанной инфекции.

5. Синтез интерферона клетками иммунной системы в респираторном тракте мышей, зараженных вирусом гриппа.

Изучение влияния клеток БАЛЖ мышей, зараженных двумя исследуемыми штаммами вируса гриппа - A/PR/8/34 и А/Краснодар/101/59, на функциональные свойства сингенных СКК костного мозга показало, что в результате межклеточных взаимодействий происходит супрессия пролиферации и дифференцировки стволовых клеток. При этом нарушения функций СКК носят выраженный штаммозависнмый характер н индуцируются не только вследствие непосредственного контакта клеток БАЛЖ и костного мозга, но и после обработки ККМ лаважной жидкостью, лишенной клеток. Не вызывает сомнений участие в этом процессе растворимых факторов, синтезируемых клетками из бронхоальвеолярных смывов зараженных гриппом животных. Полученные данные о штаммозависимом накоплении в сыворотке зараженных гриппом мышей высоких титров интерферона (ИФН), а также наличие в составе клеток БАЛЖ значительного числа лимфоцитов и макрофагов, как известно, хорошо синтезирующих ИФН, дали основание для изучения синтеза данного цитокина клетками БАЛЖ инфицированных гриппом животных. Учитывая, что все три известных типа ИФН - альфа, бета и гамма в здоровом организме синтезируются в определенной пропорциональной зависимости, которая может быть нарушена в процессе заболевания (Ершов Ф.И. и др.,1991), проводили сравнительный анализ синтеза клетками БАЛЖ всех типов ИФН.

С этой целью мышей BALB/c ннтраназально заражали вирусом гриппа в дозе 2000 ЭИДзд. Через 24, 48 и 72 ч после заражения животных забивали, получали от них БАЛЖ, нз которой выделяли клеточные элементы. Синтез ИФН клетками БАЛЖ определяли, воздействуя на них in vitro специфическими индукторами ИФН: вирусом болезни Ньюкасла (ВБН), камедоном, ларифаном, стафилококковым энтеротоксином (СЕА) и конканавалином А (Кон А). Установлены существенные различия в динамике синтеза ИНФ клетками БАЛЖ мышей, зараженных вирусами A/PR/8/34 и А/Краснодар/101/59. Титры ИФН у мышей, инфицированных патогенным штаммом, через 24 ч после заражения были относительно невысоки. Через 48 ч и особенно через 72 ч синтез существенно повышался. При заражении животных а патогенным вирусом отмечали высокие титры ИФН в БАЛЖ на 1-3 сутки наблюдения, т.е. данный штамм вируса индуцировал более раннее появление ИФН в респираторном тракте мышей. Показано, что на фоне развития инфекции, вызванной вирусом A/PR/8/34, клетки БАЛЖ отвечают выделением сразу нескольких типов ИФН. В частности, отмечен полноценный синтез альфа-ИФН

под влиянием ВБН на протяжении всего срока наблюдения. Синтез данного белка после стимуляции клеток камедоном был менее выражен, особенно через 24 ч после заражения животных. Учитывая, что максимальное угнетение выделения альфа-ИФН при стимуляции клеток камедоном отмечено на 1-е сутки после заражения, т.е. в период наиболее высокой фагоцитарной активности альвеолярных макрофагов, можно предположить, «по эффект снижения синтеза ИФН происходит за счет уменьшения количества этих клеток, гь эиущих в острой фазе воспалительного процесса, вызываемого патогенным вирусом. Вероятно, синтез ИФН лимфоцитами оставался полноценным, хотя не исключено некоторое транзиторное снижение синтетической активности В-клеток при гиперфункции Т-лимфоцитов. Ларифан, вызывающий, как известно, образование альфа/бета-ИФН Т-клетками и макрофагами, индуцировал синтез данного белка, сравнимый с контрольными значениями.

Как уже отмечалось, заражение мышей вирусом А/Краснодар/101/59 приводило к полноценному синтезу ИФН, начиная с 1-х суток наблюдения. Динамика его образования во многом отличалась от таковой у мышей, инфицированных вирусом А/РК/8/34. Так, ВБН и камедон вызывали синтез альфа-ИФН, сравнимый с уровнем данного цитокина у интактных животных. Под влиянием ларифана уровень альфа/бета-ИФН через 24 ч после заражения превышал контрольные значения з 32 раза. Кон А индуцировал образование гамма-ИФН в количестве, также превышающем значения контроля в 16-32 раза. 4-х кратное повышение синтеза гамма-ИФН вызывал СЕА. В результате устгпоилепо, что синтез альфа-ИФН у мышей, зараженных зирусом А/Кргсяодар/101/59, под влиянием ВБН и камедона не изменялся, находясь в пределах нормы, а выделение клетками альфа/бета-ИФН при воздействии ларифана и гамма-ИФН при воздействии Кон А отличалось высокой интенсивностью, особенно в 1-е сутки после заражения, с постепенным снижением до нормального уровня к 3-му дню.

Таким образом, выявлены коренные различия в возможностях изучаемых вирусов гриппа вызывать синтез ИФН клетками бронхоальвеолярных смывов зараженных мышей. Штамм А/РЙ/8/34, патогенный для мышей, сразу после попадания в респираторный тракт животных угнетал ннтерферонообразованне. Апато генный вирус А/Краснодар/101/59, напротив, был мощным интерфероногеном. Наиболее характерные различия отмечены в ситезе гамма-ИФН, что, вероятно, могло быть связано со значительным лимфоцитозом, наблюдаемым в БАЛЖ мышей.

инфицированных а патогенным штаммом и выраженной митогенной активностью данного вируса.

6. Синтез глюкокортикоидов и их влияние на показатели клеточного и гуморального иммунитета у зараженных гриппом мышей.

Известно, что глюкокортикоиды участвуют в реакциях клеточного и гуморального иммунитета, активно модулируя иммунный ответ на различные антигены in vitro и in vivo (Корнева Е.А. и др.61978, Мороз Б.Б.,1978, Абрамов В.В.,1988). Показана важная роль кортикостероидов при вирусной патологии, в частности, при гриппозной инфекции (Носик М.Н.,1959, Kalter S.S. et al, 1951, Paran M. et al,1973, Markham P.D. et al.,1986). Однако большинство исследований посвящено влиянию на противовирусный иммунитет экзогенных кортикостероидов, хотя в регуляции естественного инфекционного процесса участвуют эндогенные гормоны, вырабатываемые корой надпочечников. Учитывая, что синтез глюкокортикоидов в течение заболевания гриппом может постоянно меняться, что отражается на иммунном статусе организма и состоянии противовирусной резистентности, нами проведены опыты по изучению накопления в сыворотке крови зараженных гриппом мышей эндогенного кортикостерона, а также эксперименты, - изучающие иммунологическую реактивность организма зараженных гриппом животных с эндогенным гипокортицизмом (мышей с удаленными оперативным путем надпочечниками).

Для создания состояния эндогенного гипокортицизма мышей (CBAxC57BL/6j)Fi подвергали .двусторонней адреналэктомии, снижая таким образом вдвое уровень эндогенного кортикостерона в крови (Семенков В.Ф., Афиногенова С.А.,1982). Контрольных животных подвергали аналогичной операции, за исключением удаления надпочечников. На 3-й день после операции мышей интраназально заражали патогенным вирусом A/PR/8/34 в дозах 5, 50 и 6000 ЭИД50- Для оценки развития у мышей резистентности к летальной дозе вируса им через 30 дней после первого заражения повторно вводили гомологичный штамм вируса в дозе 6000 ЭИДзд. Концентрацию вируса в легких определяли на 3-й день после первого и второго заражения. Сыворотку от зараженных мышей получали на 19-25-й день после инфицирования. Уровень антител определяли в РТГА и РН вируса в соответствии с рекомендациями ВОЗ (1959). Пролиферативный ответ лимфоцитов селезенки определяли, через 3 дня после заражения мышей вирусом. В качестве антигенов использовали очищенные инактивированные штаммы вируса гриппа А - PR/8/34 и Краснодар/101 /59.

Было установлен« что средние титры вируса А/РЯ/8/34 были выше у адреналэктомиро -о1Х, чем у ложнооперированных мышей, зараженных в дозах 5 и 50 ЭИД50. При введении животным 6000 ЭИД50 вируса, его титры в опытной и контрольной группах не имели достоверных различий. Заражение мышей в дозе 5 ЭИД50 не приводило к их гибели как в опытной, так и в контрольной группах. Доза 50 ЭИД50 вызывала гибель 25% адреналэктомиро ванных животных при отсутствие летальности у ложнооперированных мышей. От 6000 ЭИД50 вируса все опытные животные погибали к 9-му дню болезни, с началом гибели на 5-й день заболевания. Эта же доза вируса не оказывала столь выраженного эффекта на контрольных мышей, их гибель начиналась на 2 дня позже и составляла около 67% от общего числа зараженных. Через 30 дней, когда мышей повторно заражали гомологичным вирусом в дозе 6000 ЭИД50, у опытных и контрольных животных регистрировалось существенное подавление репликации вируса в легких, однако степень супрессии была выше у ложнооперированных мышей. Средние титры вируснейтрализирующих антител были выше у ложнооперированных мышей при заражающих дозах вируса 5 ЭИД50 и 50 ЭИД50, титры тормозящих гемагглютинацию антител при дозе 5 ЭИД50 имели в опытной группе- животных тенденцию к увеличению, а при дозе 50 ЭИД50 практически не отличались от контроля.

Пролиферативный ответ лимфоцитов селезенки мышей с эндогенным гипокортикозом, зараженных вирусом А/РЯ/8/34, возрастал по сравнению с контролем при стимуляции гомологичным штаммом в 1,7 раза, гетерологичным вирусом А/Краснодар/101/59 в 1,5 раза, с увеличением спонтанной пролиферации клеток в 1,3 раза. Как и у нормальных мышей, у животных с удаленными надпочечниками ответ спленоцитов в культуре на вирус Л/Краснодар/101/59 был значительно выше такового на А/РЙ/8/34.

Таким образом, выявлен двоякий эффект вирусного заражения мышей с эндогенным гипокортицизмом. С одной стороны, пониженное содержание в организме мышей глюкокортикоидов создавало условия для усиления размножения вируса в легочной ткани, снижения показателей гуморального иммунитета, способствовало гибели животных от гриппозной инфекции. С другой стороны, наблюдалось увеличение пролиферативного ответа лимфоцитов при их стимуляции в культуре гомологичным и гетерологичным штаммами вируса, т.е. гипокортицизм способствовал усилению реакций клеточного иммунитета.

В дальнейших исследованиях было установлено, что заражение нормальных мышей вирусом гриппа вызывает штаммо- и дозозависимое

изменение синтеза у этих животных эндогенного кортикостерона. Заражение животных патогенным вирусом А/РИ/8/34 вызывало стабильное повышение уровня гормона практически во все срокп после заражения, а также при использовании различных доз вируса. Можно констатировать, что данный штамм вируса обладал выраженным кортик осте рониндуцирующим действием. Рекомбинантный вирус вызывал менее выраженный стимулирующий эффект, однако высокие дозы вируса на 5-7-е сутки после заражения индуцировали уровень кортикостерона, превышающий контроль в 3-4 раза. Штамм А/Краснодар/101/59 стимулировал повышенный синтез кортикостерона лишь в первые двое суток после заражения. На 5-е и 7-е сутки уровень гормона под влиянием этого вируса существенно снижался.

Таблица 14.

Уровни кортикостерона в сыворотке крови мышей (СВАхС57ВЬ/6.рр1 после и нтра на зального заражения вирусом гриппа.

Штамм Время после заражения (ч)

вируса, 18 24 48 72 120 168

доза

вируса

ОИД50)

А/РВ/8/34

5x10* 65+8 89+10 57+7 59+5 70+9 100+20 2x10, - 51+7 96+7 122+8 127+6 137+15

5x103 - 73+8 46+5 50+6 88+5 100+10

А/РК-6-3

5x10* 29+2 30+3 32+4 31+1 29+5 26+4

2x103 - 47+4 96+8 65+7 65+5 125+20

5х103 - 48+6 40+7 26+3 135+15 158+14

А/Крас-нодад

5x10* 35+3 58+5 48+2 14+2 19+4 47+6

2x1 о| - 101+16 81+5 52+6 29+2 34+2

5x103 - 72+7 71+5 43+3 47+6 22+3

Примечание: уровни гормона определялись в нг/мл; контроль - 42+3.

Необходимо отметить, что способность штамма А/Краснодар/101/59 активно стимулировать иммунную систему зараженных животных, вызывая пролиферацию лимфоцитов в костном мозге и появление большого количества этих клеток в респираторном тракте мышей, его высокая интерфероногенная активность (появление в Б АЛ Ж мышей значительных титров иммунного ИФН) коррелирует с его способностью подавлять синтез эндогенного кортикостерона.

7.Литибактериальнсе протектизное действие вируса гриппа при коделированин острой легочной и коаной форм стафилококковой инфекции

у мышей.

Грипп почти всегда протекает как смешанная инфекция, в которой кроме вируса грнша участвуют около 180 различных возбудителей, включая бактериальные - шпсоплазмы, хламидин, стрептококки и др. (Жданов В.М., 1986). В свпзт с этим изучение влияния вируса гриппа на устойчивость организма к некоторым распространении формам бактериальных инфекций является весьма актуальным. Кгх известно, инфицирование животных^ вирусом гриппа и микробным агентом мог.ет приводить к утгхелению ннфехцнонпого процесса, вызвать развитие смешанных вирус-бактериальных инфекций. Однако, нами показано, что в определенных экспериментальных условиях, когда животных до инфицирования стафилохоххом шгграпазально заражали апатетенным штаммом вируса гриппа или иммунизировали вирусными антигенами, устойчивость мышей х бактериальной инфекции значительно возрастала. Так, установлено, что ¡штрапазальное введение мьапам BALB/c апатогеннсго штамма вируса грипгл А/Красподар/101/59 (H2N2) з дозе 5С0 ЭИД50 га 72 ч до их интранагальпого заражения летальной дозой золотистого стефялохокха (штамм Wood-i б) снижала гибель гпгеотных от острой легочной стафилококковой инфекции более чем з 2 раза. Внутривенное введение з этих условиях данного вируса не охазипало достоверного протехтивного эффгхтз. Не вызывала защитного дейстзпя и предварительное иптраназальнее пли внутривенное инфицирование мышей соответствующими дозами патогенного вируса A/PR/8/34 (H1N1). В то г:; время единый пггамм вируса не увеличивал гибель мышей от бактериально"! гпфезщяи, что, вероятно, объпснается гсинхронностью накопления з легких гжвотных стафилококка п вируса гриппа.

Установлено, что протехтпвпое ептимнхребне-е действие вируса Л/Краснодар/101/59 возникает не тольсэ после заражения зивотпых, по и при введении им в респираторный тракт антигенов этого вируса - гемапупотннива н пейраминидазы. Иптраназальнее ваедекпе "гнеотлым указанного антигенного комплекса в дозе 7,0 мкг белка на ижяь за 72 ч до их пнтраназального заражения стафилококком приводило к защитному антимикробному эффекту, превышающему антистафилококковое действие инфекционного вируса. Эффективность защиты зависела от заражающей дозы стафилококка. Интересно, что антигены вируса A/PR/8/34, в отличие от самого вируса, также обладали антистафилококковым действием. Если заражающая доза стафилококка составляла 2,5х109 МТ, то предварительное введение животным

антигенов H1N1 снижало гибель мышей в 2,6 раза, а введение высокопротективных антигенов H2N2 - в 4 раза по сравнению с группой животных, которым вводили один стафилококк. После 2-кратного увеличения заражающей дозы стафилококка до 5х10' МТ антибактериальный эффект вирусных антигенов снижался приблизительно в 2 раза. Введение мышам антигенов H2N2 снижало их гибель в 2,3 раза, а антигенов H1N1 - в 1,2 раза. Фактически защитное действие вирусных антигенов было обратно пропорционально заражающей дозе бактериального агента.

Исследование и анализ нескольких потенциальных факторов противомикробной защиты организма, стимулированных введением мышам цельных инфекционных вирионов или вирусных антигенов, показало, что вклад каждого из них в антибактериальную резистентность неодинаков. Так, титры антиальфагемолизина при заражении мышей вирусами былг невысоки (1:50). Достоверных пггаммовых различий не наблюдалось. Не установлено различий в бактерицидности бронхоальвеолярных смывов и экстракта гомогената легких у контрольных и опытных животных. Активность ЕКК селезенки зараженных вирусами мышей несколько увеличивалась, с 17,9+1,2% в контроле до 21,8+0,9% у животных, зараженных патогенным вирусом, и 22,5+1,3% у мышей, инфицированных апатогенным штаммом. В то же время иммунизация мышей антигенами H2N2 угнетала активность ЕКК до 12,6+0,6%, что свидетельствует, вероятно, о различных механизмах влияния на данный фактор естественной резистентности организма вирусной инфекции и антигенного воздействия. Нельзя не отметить выраженное усиление пролиферативной реакции спленоцитов мышей, интраназально иммунизированных вирусными антигенами, особенно H2N2, при их стимуляции в культуре цельными гомологичными вирионами (гл.3.1), указывающие на исключительно высокие иммуностимулирующие свойства вирусных антигенов. Весьма показательной являлась количественная перестройка состава клеток из бронх оальвеолярных смывов зараженных животных - появление нейтрофилов и большого количества лимфоидных клеток, а также усиление функциональной активности макрофагов, высокий синтез клетками БАЛЖ интерферона, в частности, гамма-ИФН.

Необходимо подчеркнуть, . что инициированная вирусом гриппа антибактериальная защитная реакция носила не только местный (легочный), но и генерализованный характер. Об этом свидетельствует усиление фагоцитарной активности МПЭ, интенсификация процесса разрушения в них микробных клеток (гл.4.2) и угнетение активности 5-нуклеотидазы (гл.4.4). Кроме того,

'зараженные вирусом А/Краснодар/101/59 в дозе 500 ЭИД50, проявляли повышенную устойчивость к кожной форме смертельной стафилококковой инфекции (микробный агент вводился на 15-й день после заражения животных вирусом гриппа).

Заключение

Представленные в работе материалы показывают, что в ответ на внедрение вируса гриппа в организме хозяина возникает генерализованная реакция, охватывающая в зависимости от степени поражений практически все жизненно важные системы организма. Эта реакция включает неспецифические и образованные de novo специфические формы противовирусной резистентности. В процессе ее развития вполне определенно проявляется двойственность природы вирусов гриппа, как раздражителей или стимуляторов иммунной системы и агентов, способных супрессировать функции некоторых систем организма, в частности, кроветворной. Выяснилось , что вирус гриппа вызывает в организме модулирующий эффект не только в отношении зрелых клеточных форм системы иммунитета (МФ, ЕКК, вирусспецифических ЦТЛ), но объектом его влияния могут бьпъ гемопоэтические предшественники иммуногенеза - стволовые кроветворные клетки костного мозга. Вирус обладает способностью прямо или опосредованно угнетать основные функции этих клеток - пролиферацию и дифференцировку и таким образом оказывать действие на ранние этапы становления кроветворной и иммунной систем. Несомненно, что подобное влияние затрагивает и, возможно, определяет патогенетические особенности течения и исход инфекционного процесса. Оказалось, что угнетение функциональной активности СКК при гриппе осуществляется формируемым в организме хозяина пулом лимфоцитов с супрессивными по отношению к собственным СКК свойствами. Однако, нарушения в костномозговом кроветворении при гриппе не ограничиваются изменением функционирования только стволовых клеток, наблюдается вовлечение в этот процесс системы кроветворного микроокружения -обнаружены нарушения пролиферации стромальных элементов костного мозга. Существует высокая степень вероятности, что нарушения на уровне СКК и клеток, формирующих кроветворное микроокружение, тесно взаимосвязанные и, более того, взаимозависимые процессы. Очевидно, что вирусиндуцированная модуляция костномозгового кроветворения при гриппе является результатом не только непосредственнного взаимодействия клеток на территории костного мозга, в частности, СКК и лимфоцитов, а опосредуется рядом растворимых

факторов, синтезируемых этими клетками, в том числе, иммунным интерфероном. Существенную роль при этом играют эндогенные глкж'окортикоиды, уровень которых у инфицированных животных постоянно меняется, а состояние эндогенного гипокорпщизма изменяет иммунный статус мышей и повышает их смерность от гриппа.. Выяснилось, что у зараженных гриппом мышей очень быстро меняется состав клеток иммунной системы респираторного тракта, что коррелирует с зафиксированными нарушениями на уровне костномозговых предшественников. Клетки из бронхоальвеолярных смывов зараженных гриппом мышей * при контакте с ККМ угнетают формирование сингенных КОЕс, нарушают их дифференцировку, в то время, как клетки, полученные от интактных животных, активно стимулируют колониеобразоваиие. Не исключено, что между СКК и иммуноцитами легких инфицированных животных возникают взаимоотношения, осуществляемые по типу так называемой "обратной связи". Практически все установленные во время исследований эффекты вируса гриппа носят штаммозависимый характер и, как выяснилось, связаны с подтипом вирусного гемагглютиннна. Помимо супрессивного действия вирус гриппа способен оказывать и стимулирующий эффект, особенно выраженный у штаммов, обладающих высокой митогенной активностью. Необходимо подчеркнуть, что модулирующее действие проявляют не только инфекционный вирус, но также и инактивированные вирусы, и даже фрагменты вирнонов. Таким образом, имеет место вирусиндуцированная модуляция системы иммунитета, начиная с ранних этапов ее формирования на уровне СкК костного мозга. Несомненно, описанные выше изменения в системе кроветворения и иммуногенеза при гриппе, могут приводить к нарушению иммунологического надзора, возникновению

иммунопатологических состояний (вторичных иммунодефицитов), смешанных инфекций, в том числе, вирус-бактериальных. Однако, можно полагать, что в подавляющем большинстве случаев заболевания гриппом данные изменения обратимы и носят транзиторный характер. При этом становится очевидным, что временные вирусиндуцированные перестройки в системе кроветворения на ранних этапах иммуногенеза способствуют усиленной мобилизации адекватных воздействию вируса защитных факторов и восстановлению нарушенного инфекцией гомеостаза. Таким образом, выявленные механизмы взаимодействия вируса гриппа с кроветворной, иммунной и эндокринной системами могут стать отправной точкой для создания принципиально новых методов коррекции вирусной патологии, проверки эффективности и безвредности вновь создаваемых вирусных препаратов и, наконец, расшифровки неизвестных сторон патогенеза гриппа и других вирусных инфекций.

ВЫВОДЫ

1 .Исследование механизмов развития вирусной патологии на примере экспериментальной гриппозной инфекции показало, что при гриппе в организме хозяина возникает немедленная генерализованная реакция, включающая наряду с многофакторным ответом со стороны иммунной системы комплекс значительных перестроек в кроветворной и эндокринной системах.

2.Нарушение процессов кроветворения при гриппе происходит на уровне полипотентных стволовых клеток костного мозга и заключается в снижении пролиферативных способностей СКК, нарушении характера их дифференцировки в направлении эритро- и гранулопоэза.

3.Под влиянием гриппозной инфекции происходит изменение нормального состава ККМ, нарушается пролиферация стромальных элементов (КОЕф), формирующих кроветворное микроокружение.

4.Заражение вирусом гриппа сопровождается появлением в региональных лимфоузлах хозяина лимфоцитов с супрессивными свойствами, способных угнетать пролиферацию сннгенных СКК и изменять в селезенке летально облученных реципиентов нормальное соотношение числа колоний эритроидного и гранулоцитарного типов.

. 5.Вирус гриппа индуцирует перестройки в иммунной системе респираторного тракта инфицированных животных - в бронхоальвеолярных смывах мышей наблюдается резкое снижение числа макрофагов, появление нейтрофилов, многократное увеличите количества лимфоцитов и усиление синтеза альфа-, бета- и гамма-ИФН.

6. Клетки, выделенные из бронхоальвеолярных смывов зараженных гриппом мышей, в отличие от клеток БАЛЖ интактных животных, активно стимулирующих рост КОЕс, в значительной степени нарушают пролиферацию и дифференцировку сингенных СКК.

7.Вирусы гриппа обладают генетически обусловленной митогенной активностью: высота пролиферативного ответа лимфоцитов, стимулированных вирусами in vitro, зависит от подтипа вирусного ГА и гаплотипа мышей -источников лимфоцитов.

8.Гриппозная инфекция in vivo и in vitro стимулирует клетки иммунной системы мышей: возрастают фагоцитарная активность альвеолярных и перитонеальных макрофагов, цитотоксическая активность ЕКК селезенки; в легких, селезенке и лимфоузлах зараженных мышей появляются типоспецифические и перекрестнореагирующие ЦТЛ.

9.Интраназальное заражение мышей вирусом гриппа или их иммунизация вирусным гемагглютинином в комплексе с нейраминидазой вызывают протективный, антибактериальный эффект - животные приобретают повышенную устойчивость к легочной и кожной формам стафилококковой инфекции.

10. 5 - нуклеотидаза макрофагов, являясь биохимическим маркером активации или супрессии этих клеток при различных формах антигенного воздействия, мояет служит критерием устойчивости зараженных гриппом мышей к бактериальной (стафилококковой) инфекции.

11. Заражение гриппом вызывает в организме мышей стабильное повышение синтеза кортикостерона, а адреналэктомия животных (создание у них состояния эндогенного гипокортицизма) способствует повышению гибели мышей от гриппозной инфекции.

12. Изменения, вызываемые гриппозной инфекцией в кроветворной и иммунной системах хозяина, а также при взаимодействии вируса с кроветворными и иммунокомпетентными клетками in vitro носят пггаммозависимый характер: нарушения основных функций СКК и вирусиндуцируемая активация лимфоцитов in vitro зависят от подтипа вируса гриппа, а активация ЕКК и появление вирусспецифических ЦТЛ коррелируют с патогенностью вируса.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1.Клицунова Н.В., Гостева В.В., Лавров В.Ф., Ратгауз ГЛ., Кириличева Г.Б. К механизму иммуномодулирующего действия вируса гриппд А при смешанной вирус-стафилококковой инфекции // Тез.докл.6 Всероссийск.сьезда ВИОМЭП - Н.Новгород,1991.- Т.1.- С.204.

2.Клицунова Н.В., Лавров В.Ф. Ратгауз ГЛ., Кириличева Г.Б., Гостева В.В., Соловьева М.С. Изменение ультраструктуры, фагоцитарной и ферментативной активности перитонеальных макрофагов мышей под воздействием вируса гриппа // Ж.микробиол,- 1994.- N 6.- С.90-91.

3.Кириличева Г.Б., Ратгауз ГЛ.Лавров В.Ф., Соловьева М.С., Дворецкий A.A. . Активность 5-нуклеотидазы макрофагов при экспериментальной гриппозно-стафилококковой инфекции // Молекулярные механизмы развития инфекционных заболеваний: Тез.докл.Всесоюзн.конфер,-Звенигород, 1990.- С.53.

4Лавров В.Ф., Ходакова Л.П., Основные механизмы противовирусной цитотоксической активности Т-лимфоцитов // Профилактика вирусных

инфекций в свете современных достижений иммунологии: Сб.научн.трудов. М.,1985.- С.87-97.

5Лавров В.Ф., Ратгауз ГЛ., Ходакова Л.П., Семенков В.Ф., Агеева О.Н., Акатов А.К., Самсонова Т.М. Вакцинаторный эффект вируса гриппа на течение стафилококковой инфекции и пролиферативный ответ лимфоцитов ин витро у мышей // Актуальные вопросы теоретической и прикладной иифекционюй иммунологии; механизмы противоинфекционного иммунитета: Тез.докл.11 Всесоюзи.конфер.- М.,1987.- С.69-70.

бЛавров В.Ф, Семенков В.Ф., Алибаева P.A., Агеева О.Н., Назарова Г.М. Цитотоксическая активность нормальных киллеров и пролиферативный ответ лимфоцитов на специфические вирусные антигены при гриппозной инфекции у мышей // Вопр.вирусол.- 1987,- N 6.- С.666-670.

7Лавров В.Ф., Орлова Н.Г., Ратгауз ГЛ., Акатов А.К., Агеева О.Г. Роль фагоцитоза и неспецифической активности лимфоцитов при моделировании вирус-бактериальной инфекции in vitro // Факторы клеточного и гуморального иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях: Тез.доклЛХ межинститут.научн.кояфер.- Челябинск, 1988.- С.74.

8Лавров В.Ф., Орлова Н.Г., Ратгауз ГЛ., Акатов A.K.t Агеева О.Н., Ходакова Л.П., Маргулис И.У., Мамонтова Т.В., Роль клеточных и гуморальных факторов резистентности организма в развитии экспериментальной гриппозно-стафилококковой инфекции у мышей // Ж.микробиол.- 1989.- N 4.- С.73-76.

9Лавров В.Ф., Семенков В.Ф., Агеева О.Н. Пролиферативный ответ спленоцитов мышей ин витро при их стимуляции двумя штаммамр вируса гриппа А с различными свойствами // Вторичные иммунодефицита инфекционной и неинфекционной этиологии: Тез.докл.1 обл.конфер.-Харьков,1989.- С.57.

10Лавров В.Ф., Семенков В.Ф., Ходакова Л.П. Колониеобразование в селезенке летально облученных, мышей при воздействии вируса гриппа на клетки костного мозга сингенных доноров ин витро и ин виво // Тез.докл.1 Всесоюзн.радиобиол.сьезда - Путцино,1989.- Т.1.- С.209.

11 Лавров В.Ф., Ратгауз ГЛ., Мажуль Л.А. Митогенная активность вируса гриппа, его компонентов и золотистого стафилококка при стимуляции лимфоцитов мышей // Молекулярные механизмы развития инфекционных заболеваний: Тез.докл.Всесоюзн.конфер,- Звенигород,1990.- С.53.

12 Лавров В.Ф., Семенков В.Ф. Вирус гриппа изменяет дифференцировку полипотентных стволовых клеток // Там же - С.54.

13Лавров В.Ф., Семеяков В.Ф. Инфицирование мышей вирусом гриппа угнетает дифференцировку костномозговых предшественников в эритроидном н гранулоцитарном направлениях // Вопр.вирусол,- 1991.- N 4.- С.284-286.

14Лавров В.Ф., Орлова Н.Г., Ратгауз ГЛ., Ходакова Л.П., Махуль ЛА., Кириличева Г.Б., Соловьева М.С., Агеева О.Н., Ахатов А.К. Иммуномодулирующее действие поверхностных антигенов вируса гриппа А при экспериментальной стафилококковой инфекции // Ж.микробиол.- 1991.- N 6.-С.53-56.

15 Лав ров В.Ф., Орлова Н.Г., Дворецкий АЛ., Кириличева Г.Б., Мамонтова Т.В., Ратгауз ГЛ., Семенков В.Ф., Агеева О.Н. Влияние бронхоальвеолярной жидкости мышей, инфицированных вирусом гриппа, на костномозговые предшественники гемопоэза // Ж.микробиол.- 1992.- N 7.-С.45-48.

16 Лавров В.Ф., Семенков В.Ф. Изменение дифференцировкн костномозговых предшественников в условиях инфицирования вирусом гриппа // Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии: Тез .докл. 2 Всесоюзн. симпоз.- М.,1991.- С.115.

17 Лавров В.Ф., Семенков В.Ф., Дворецкий A.A. Исследование зависимости функции Т-лимфоцитов от супрессивных и стимуляторных эффектов вируса гриппа на костномозговые предшественники антигенпредставляющих клеток // Микроскопические аспекты патогенеза вирусных инфекций: Материалы отрасл. со вещ. - Новосибирск, 1991.- С.15.

18Лавров В.Ф., Семенков В.Ф., Смирнова Г.В., Дворецкий АА. Изменение дифференцировкн костномозговых предшественников гемопоэза как существенный компонент патогенеза гриппозной инфекции // Там же - С. 16.

19ЛИ>ров В.Ф., Кириличева Г.Б., Ратгауз ГЛ., Соловьева М.С., Батурина И.Г., Дворецкий A.A., Семенков В.Ф., Агеева О.Н. Влияние вируса гриппа на активность 5-нуклеотидазы макрофагов и устойчивость мышей к стафилококковой инфекции // Вопр.вирусол.- 1992.-N 3.- С. 170-173.

20Лавров В.Ф., Смирнова Г.В., Дворецкий A.A. Корреляция между повышением уровня эндогенного кортик осте ро на и угнетением дифференцировкн костномозговых предшественников у мышей, зараженных вирусом гриппа // Тез.докл. I съезда иммунологов России Новосибирск, 1992.- С.226.

21 Лавров В.Ф. Динамика репликации вируса гриппа в легких и синтеза специфических антител у мышей при воздействии сублетальных доз ионизирующего излучения // Материалы научно-практ. конфер., посвящ. 70-

летаю И-та им.Пастера - С.-Петербург, 1993.- ч.1, Кишечные и рес пират, инфекция.- С. 135.

22Лавров В.Ф., Кириличева Г.Б., Ратгауз ГЛ. Влияние стафилококкового энтеротоксина А на бактериальные и вирусную инфекции у мышей // 7ам хе - ч.З, Иммунология и биотехнология - С.Зб.

23.Ратгауз ГЛ., Лавров В.Ф., Орлова Н.Г., Акатов А.К., Агеева О.Н., Ходакова Л.П., Маргулис И.У. Клеточные факторы резистентности при смешанной гриппозно-стафилококковой инфекции // Иммунокоррекция при инфекционной патологии: Тез.докл. научн. конфер.- Л., 1988,- С.72.

24.Семенков В.Ф., Агеева О.Н., Лавров В.Ф., Короткое А.А., Ходакова Л.П., Левина Л.В., ' Кусельтан И.В., Малашенко A.M., Алибаева Р.А., Маросинская Е.И., Анджапаридзе О.Г., Влияние генотипа и фенотипа организма хозяина на проявление патогенных свойств вируса гриппа.// Вопр.вирусол.- 1985.- N 2.- С.159-163.

25.Семенхов В.Ф., Лавров В.Ф., Агеева О.Н., Левина Л.В. Изучение сенсибилизирующего и вакцинирующего эффектов вирусов гриппа в условиях Т-клеточного иммунодефицита // Иммунодефицита и аллергия: Тез-докл.Всесоюзн. симпоз. с мехдунар. участ,- М.,1986.- С.275-276.

26.Семенков В.Ф., Лавров В.Ф., Ходакова Л.П. Супрессивное действие вируса гриппа на стволовые клетки костного мозга у мышей // Вопр.вирусол.-1988,- N 8.- С.416-419.

27.Семенков В.Ф., Лавров В.Ф., Манько В.М., Агеева О.Н. Инактивация сингенными лимфоцитами стволовых колониеобразующих клеток костного мозга при различии взаимодействующих клеток по антигену Н-У // Генетика.-1988.- Т.24,- N 9.- С.1602-1607.

28.Семенков В.Ф., Лавров В.Ф., Агеева О.Н., Левина Л.В. Оценка роли внутренних и поверхностных антигенов вируса гриппа в индукции противогриппозного иммунитета // Факторы клеточного н гуморального иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях: Тез.докл. IX мехинсппут.научн.хонфер. - Челябинск, 1988.- С.74.

29.Семенков В.Ф., Тупикнн Г.В., Беляков В.К. Лавров В.Ф. Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения различных длин волн на костномозговые предшественники иммунохомпетентных клеток // Тез.докл. I Всесоюзн. радиобиол. съезда - Пущнно,1989.- Т.1.- С.209.

30.Семенков В.Ф., Лавров В.Ф. Супрессивное действие вируса гриппа на ранние этапы иммуногенеза // Тез. докл. I Всесоюзн. съезда иммунол.-М.,1989.- С.246.

31.Семенхов В.Ф., Левина Л.В., Лавров В.Ф., Агеева О.Н. Влияние эндогенного гипокортицизма на репликацию вируса в легких мышей и продукции, специфических антител // Акта вирологика.- 1990.- Т.34.- N 1.-С.36-42

32.Семенков В.Ф., Лавров В.Ф., Манько В.М. Сравнительная оценка супрессивных и стимуляторных эффектов патогенных и непатогенных штаммов вируса гриппа на дифференцировку гемопоэтических костномозговых предшественников у мышей // Иммунология.- 1991.- N 2.- С.72-75.

33.Семенков В.Ф., Лавров В.Ф., Мажуль Л Л. Иммунодоминантный гемагглютинин вируса гриппа как активатор и суп рессор диффереицировки костномозговых предшественников грануло- и эритропоэза // Тез.докл.1 съезда иммунологов России, Новосибирск,1992.- С.425-426.

34.Семенков В.Ф., Беляков В.К., Лавров В.Ф., Тупикин Г.В. Влияние малоинтенсивного лазерного излучения различных длин волн на костномозговые предшественники иммуногенеза // Биофизика.- 1993.- Т.38.-вып.З.- С.504-506.

35.Semenkov V.F., Lavrov V.F. The role of viral supression in hemopoietic precursor of bone marrow for pathogenesis of acquired immunodeficiency // New trends in basic and clinical immunology the deviated immune response. Program Abstracts. Poiana Brasov/Romania 12-15 may, 1988, P.80.

36.Semenkov V.F., Lavrov V.F., Ageeva O.N. Supressive effect of influenza virus on stem cells of bone marrow //7th International Congress of Immunology, Berlin West, 1989.- P.351.

37.Semenkov V.F., Lavrov V.F., Ageeva O.N. Functional relationship immunodominant epitops of hemagglutinin of noninfectious strain influenza virus in recombinant molecule // European federation of immunological societies 10th meeting Edinburgh, 1990.- P.89.

äükil___Тир 100

ЫГП -АТОМПОЛИГРАФСЕРВИС-