Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Механизмы влияния полиненасыщенных жирных кислот на когнитивные функции при нейровоспалении

На правах рукописи

О

ТЫРТЫШНАЯ АННА АЛЕКСЕЕВНА

МЕХАНИЗМЫ ВЛИЯНИЯ ПОЛИНЕНАСЫЩЕННЫХ ЖИРНЫХ КИСЛОТ НА КОГНИТИВНЫЕ ФУНКЦИИ ПРИ НЕЙРОВОСПАЛЕНИИ

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

- 7 ОКТ 2015

Владивосток - 2015

005563092

005563092

Работа выполнена в лаборатории фармакологии Федерального государственного бюджетного учреждения науки «Институт биологии моря им. A.B. Жирмунского» Дальневосточного отделения Российской академии наук

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, доцент Хотимченко Максим Юрьевич Официальные оппоненты:

Калиниченко Сергей Георгиевич, доктор медицинских наук, доцент, Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Тихоокеанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, профессор кафедры гистологии, эмбриологии и цитологии

Новгородцева Татьяна Павловна, доктор биологических наук, профессор, Владивостокский филиал Федерального государственного бюджетного научного учреждения "Дальневосточный научный центр физиологии и патологии дыхания" Научно-исследовательского института медицинской климатологии и восстановительного лечения, заместитель директора по научной работе

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт фармакологии и регенеративной медицины имени Е.Д. Гольдберга"

Защита состоится «25» ноября в 10"° часов на заседании диссертационного совета Д 208.007.03 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования "Тихоокеанский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 690002, г. Владивосток, nfi-т Острякова, 2. Телефон: 8(423)2-451-736, (факс) 8(423)2-429-750.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования "Тихоокеанский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации и на официальном сайте www.lgrnu.ru

Автореферат разослан Q» сентября 2015 г Ученый секретарь диссертационного совета Доктор медицинских наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Психоневрологические расстройства, в том числе когнитивные и эмоциональные нарушения, являются частыми проявлениями органических поражений центральной нервной системы (ЦНС) (Fleminger et al., 2013). Состояние, характеризующееся крайней степенью нарушения когнитивных функций, называют деменцией (Преображенская, 2013). Согласно данным Всемирной организации здравоохранения, во всем мире насчитывается 47,5 миллиона человек с деменцией. Ежегодно происходит 7,7 миллиона новых случаев заболевания (Информационный бюллетень ВОЗ №362,2015). В России в возрасте после 70 лет деменцией страдают 4,6% людей, после 80 лет — 16-18% (Чухловина, 2010). Наиболее частой причиной демен-ции является болезнь Альцгеймера (БА), составляющая 60-70% случаев прогрессирующего ухудшения когнитивных функций при старении (Дамулин, 2013). Сосудистые поражения головного мозга считаются второй по частоте после БА причиной демен-ции у лиц пожилого и старческого возраста (Wimo et al., 2013). Учитывая большую распространенность заболеваний центральной нервной системы, сопровождаемых когнитивным дефицитом, содержание больных и симптоматические методы их лечения требуют значительных затрат (Зырянов, Белоусов, 2011). Общемировые затраты на лечение деменции составляют 1% от общемирового ВВП (World Alzheimer Report, 2010).

Методы фармакотерапии деменций ограничены применением пероральных форм ингибиторов ацетилхолинэстеразы (донепезил, ривастигмин, галантамин) и антагониста NMDA-рецепторов - мемантина (Васенина и др., 2013). Данные препараты воздействуют на отдельные звенья патогенеза деменции: снижение холинергической и усиление глутаматергической передачи в синапсах. В связи с этим, их применение позволяет лишь приостановить развитие психоневрологических симптомов нейроде-генеративной патологии на ранних этапах болезни, но на развитие заболевания, в целом, они не влияют (Noetzli, Еар, 2013).

В связи с необходимостью поиска новых препаратов для лечения и профилактики деменций, исследования, позволяющие детально изучить механизмы развития когнитивных расстройств и определить перспективные терапевтические мишени, чрезвычайно актуальны. Процесс нейровоспаления, сопровождающий основную долю заболеваний ЦНС и признанный ключевым компонентом развития когнитивных нарушений, представляет собой перспективную мишень терапевтического воздействия при лечении данных патологий (Салмина и др., 2015).

Длинноцепочечные со-3 полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК) играют важную роль в нормальном функционировании ЦНС (Schuchardt et al., 2010). Существуют данные о том, что потребление со-3 ПНЖК, в частности докозагексаеновой (ДГК) и эйкозапентаеновой (ЭПК), снижает риск развития деменций (Devore et al., 2009, Okubo et al., 2012) и способствует улучшению когнитивных функций (Swanson, 2012). В то же время, снижение содержания со-3 ПНЖК в головном мозге, сопровождающее процессы старения, часто связано с когнитивным дефицитом и развитием нейродегенеративных заболеваний (Salem, Eggersdorfer, 2015). В связи с тем, что со-3 ПНЖК и их метаболиты обладают противовоспалительными свойствами, их рассматривают в качестве потенциальных средств профилактики и лечения неврологических заболеваний, сопровождающихся реакцией нейровоспаления (Farooqui, 2012). Несмотря на активное исследование фармакологических свойств со-3 ПНЖК, механизмы их положительного влияния на когнитивные функции при патологиях, ассоциированных с нейровоспалением, малоизучены. Установление механизмов влияния со-3 ПНЖК на функции высшей нервной деятельности является важным этапом поиска фармакологических средств для коррекции когнитивных нарушений, сопровождающих заболевания ЦНС.

Целью работы является оценка роли со-3 полиненасыщенных жирных кислот в сохранении кислотно-основного равновесия нервной ткани при нейровоспалении.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить изменения рН нервной ткани на моделях острого, подострого и хронического нейровоспаления;

2. Исследовать влияние докозагексаеновой и эйкозапентаеновой кислот на когнитивные функции и неврологический статус экспериментальных животных при нейровоспалении;

3. Охарактеризовать влияние докозагексаеновой и эйкозапентаеновой кислот на экспрессию провоспалительных маркеров и морфологические характеристики микро-глии и астроглии в гиппокампе экспериментальных животных с нейровоспалением;

4. Исследовать влияние докозагексаеновой и эйкозапентаеновой кислот на накопление Р-амилоида в гиппокампе животных с экспериментальным нейровоспалением;

5. Установить влияние докозагексаеновой и эйкозапентаеновой кислот на внутри-и внеклеточный уровень рН гиппокампа при нейровоспалении.

Научная новизна. Экспериментально установлено снижение уровня рН в пирамидальных нейронах гиппокампа и внеклеточной среде при in vivo-индуцированном остром, подостром и хроническом нейровоспалении и при in vitro-

индуцированном нейровоспалении. Показано, что снижение уровня рН сопровождается нарушением когнитивных функций при нейровоспалении. Установлено, что со-3 ПНЖК при пероральном введении способствуют сохранению нормальных значений рН нейронов и интерстициальной жидкости гиппокампа у животных с экспериментальным нейровоспалением. Результаты работы свидетельствуют о протективном влиянии со-3 ПНЖК в отношении когнитивных функций через стабилизацию уровня рН нервной ткани.

Теоретическая и практическая значимость работы. Данное исследование расширяет представление о фундаментальных механизмах развития процесса нейро-воспаления. Полученные данные позволяют рассматривать изменения уровня рН головного мозга в качестве основного механизма когнитивных нарушений, сопровождающих неврологические заболевания, ассоциированные с нейровоспалением. В процессе исследования получены новые данные о механизмах влияния ш-3 полиненасыщенных жирных кислот на течение процесса нейровоспаления. Выявлены новые механизмы влияния ш-3 ПНЖК на память, неврологический статус и локомоторную активность животных с экспериментальным нейровоспалением. Работа позволяет экспериментально обосновать возможность использования ш-3 ПНЖК для создания средств профилактики и терапии когнитивных расстройств при неврологических заболеваниях. Полученные экспериментальные данные являются основой для более глубоких доклинических исследований и клинических испытаний ю-3 ПНЖК, обладающих нейропротективной активностью.

Разработан оригинальный метод калибровки показаний рН-чувствительного красителя ВСЕСИ-ат, представляющий собой комбинацию микроэлектродного и ни-герицинового методов.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Острое и подострое нейровоспаление сопровождается снижением внутриклеточного уровня рН нервной ткани, что приводит к изменению функционирования белковых молекул клеток головного мозга, и, как следствие, к нарушению когнитивных функций;

2. Докозагексаеновая и эйкозапентаеновая кислоты при пероральном введении способствуют стабилизации внутри- и внеклеточного уровня рН в гиппокампаль-ном отделе головного мозга при нейровоспалении, что препятствует снижению когнитивных функций.

Степень достоверности. Все научные положения и выводы диссертации аргументированы, обоснованы и достоверны. Фактические материалы, представленные в

диссертации, полностью соответствуют первичной документации - протоколам исследований. Достоверность полученных результатов и выводов основывается на достаточном объеме выборки, использовании современных методов исследования, корректном анализе полученных данных, адекватной статистической обработке.

Апробация работы. Материалы работы доложены на Международной конференции «Neuroscience 2013» (США, Калифорния, Сан-Диего, 9-13 ноября, 2013 г.), XXII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 6-10 апреля 2015 г.), X Тихоокеанском медицинском конгрессе с международным участием «Человек и лекарство» (Владивосток, 19-20 сентября 2013 г.), X Международной (XIX Всероссийской) Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых (Москва, 19 марта 2015 г.), III Научно-практической конференции молодых ученых и студентов Школы биомедицины ДВФУ (Владивосток, 24 апреля 2015 г.), ежегодных научных конференциях ИБМ ДВО РАН (Владивосток, 2013 г., 2014 г. и 2015 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе 3 статьи в научных журналах, входящих в перечень ведущих рецензируемых изданий, рекомендованных ВАК, и 1 - в международном издании, реферируемом базой Web of Science. Остальные работы представлены в форме тезисов на научно-практических конференциях.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 163 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, раздела «Материалы и методы», двух глав, отражающих результаты собственных исследований, главы «Обсуждение», заключения и выводов. Работа иллюстрирована 34 рисунками и 4 таблицами. Список литературы содержит 262 источника.

Роль автора в работе. Вся теоретическая и экспериментальная работа выполнена непосредственно диссертантом.

Финансовая поддержка. Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской федерации (проект № 14-50-00034 и проект № 14-575-21-0038) и Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере в рамках программы «УМНИК».

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Характеристика экспериментальной модели. Исследование выполнено на мышах-самцах линии CD1 весом 35 г в возрасте 8 и 12 месяцев и линии Ts65Dn весом

30-35 г в возрасте 12-14 месяцев, содержащихся в стандартных условиях вивария. Для моделирования острого нейровоспаления раствор липополисахаридов (ЛПС) {Escherichia coli Olli:В4, Sigma Aldrich) вводили внутрибрюшинно в дозе 5 мг/кг однократно, для моделирования подострого нейровоспаления ЛПС вводили в дозе 200 мкг/кг/день в течение 7 дней. В качестве модели хронического нейровоспаления использовали мышиную линию Ts65Dn. Для моделирования нейровоспаления in vitro была использована модель переживающих срезов гиппокампа (Takano, 2014). Нейро-воспаление индуцировали путем инкубации срезов в 1 мкМ растворе ЛПС. Схема процесса моделирования нейровоспаления in vitro и подготовки срезов для измерения внутриклеточного уровня pH представлена на рисунке 1.

Изготовление срезов, 0°С

Восстановление срезов 15 мин, 35°С+ I ч, 24 °С

Инкубация в 1 мкМ ЛПС I ч, 35°С

Инкубация в ИСЖ, 1 ч. 35°С

Промывка 5 мин х 3

Окрашивание BCECF 30 мии

Измерение pH

Рисунок 1 - Дизайн эксперимента по измерению внутриклеточного уровня рН при in vitro-индуцированном нейровоспалении.

Исследование влияния со-3 ПНЖК на поведенческие, морфологические, биохимические параметры и рН нервной ткани животных проводили на модели подострого нейровоспаления. Препарат этиловых эфиров докозагексаеновой и эйкозапентаено-вой кислот (Omacor, Abbott Laboratories) вводили перорально в дозе 300 мг/кг/день в течение 48 дней. Ежедневная доза ДГК составляла 114 мг/кг, ЭПК - 138 мг/кг. С 42 по 48 день введения ПНЖК животным вводили внутрибрюшинно раствор ЛПС (200 мкг/кг) один раз в день, ежедневно. Процедуры введения ПНЖК и ЛПС осуществляли с 9 до 11 утра. В эксперименте присутствовало 4 группы животных: группа «Контроль» - введение 200 мкл молока перорально, 200 мкл 0,9% NaCl внутрибрюшинно; группа «ЛПС» — введение 200 мкл молока перорально, 200 мкл р-ра ЛПС в 0,9% NaCl внутрибрюшинно; группа «ПНЖК» - введение 200 мкл ПНЖК перорально, 200 мкл 0,9% NaCl внутрибрюшинно; группа «ПНЖК + ЛПС» - введение ПНЖК перорально, 200 мкл р-ра ЛПС в 0,9% NaCl внутрибрюшинно.

Физиологические и поведенческие исследования проводили через 3 часа после внутрибрюшинного введения ЛПС. Оценку неврологического статуса животных осуществляли по стандартной шкале NSS (Neurological Severity Scores) (Stahel, 2000) для лабораторных животных (мышей) с целью определения степени выраженности неврологического дефицита при нейровоспалении на фоне введения ю-3 ПНЖК. Для

этого было проведено 7 тестов, направленных на определение моторной функции, рефлексов, равновесия и мотивации. При выполнении каждого теста в лабораторном журнале фиксировали баллы, которые затем суммировали для каждого животного.

Определение двигательной активности и рабочей памяти проводили в Y-образ-ном лабиринте. С целью вычисления коэффициента спонтанных альтернаций и определения двигательной активности фиксировали количество и последовательность входов в рукава лабиринта (Knowles, 2013). Для вычисления коэффициента спонтанных альтернаций использовали следующую формулу: Ks=R/A, где R - количество правильных альтернаций (три последовательных входа в неповторяющиеся рукава лабиринта), А - общее количество возможных альтернаций.

Исследование долговременной памяти проводили с использованием теста «Распознавание новых объектов» по протоколу Bevins и Besheer (Bevins, Besheer, 2006). На этапе тестирования «знакомство» 2 одинаковых объекта помещали в диагонально противоположные углы камеры. Мышь помещали в середину камеры между объектами и оставляли на 10 минут. Через 24 часа один из объектов в камере заменяли на новый объект, аналогичный по высоте и объему, но отличающийся по форме и внешнему виду. Мышь вновь помещали в камеру, позволяя ей исследовать объекты в течение 5 минут. Активность мышей записывали с помощью видеокамеры. При анализе полученных записей определяли общее время контакта с каждым объектом. Коэффициент распознавания вычисляли по формуле: R=T„0B* 100%/То5ш, где Т„ов - время контакта с новым объектом на втором этапе тестирования; Тобщ - общее время контакта с новым и старым объектом на втором этапе тестирования. У животных, не страдающих нарушениями долговременной памяти, длительность контакта с новым объектом выше, чем с уже знакомым и, как следствие, значение индекса распознавания выше.

Спонтанную локомоторную активность оценивали в автоматизированном открытом поле (Med Associates Inc, St. Albans, VT). Мониторинг активности производили с помощью автоматизированной системы отслеживания (Med Associates Activity Monitor, версия 5.93.773). Проводилась автоматическая оценка следующих параметров, характеризующих локомоторную активность: пройденная дистанция, количество прыжков и длительность вертикальной активности.

Иммуногистохимические исследования. Для проведения иммуногистохимиче-ских исследований животных после проведения поведенческих тестов анестезировали путем внутрибрюшинного введения тиопентала натрия (3%, 60 мг/кг), перфузировали 4% раствором параформальдегида, приготовленным на 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,4). Использованный в работе иммуногистохимический метод состоял из следующих

этапов: фиксация кусочков ткани (4% параформальдегид) в течение 12 ч и их промывка; изготовление сагиттальных срезов толщиной 30 мкм с помощью криостат-микротома (НМ525, Thermo Scientific); инкубация в растворе, блокирующем эндогенную пероксидазную активность (0,3% раствор Н202) и неспецифическое связывание антител (5% обезжиренное молоко в PBS); инкубация срезов в растворе первичных антител при 4°С, 24 ч (информация об использованных первичных антителах представлена в таблице 1); инкубация срезов в растворе вторичных антител, меченных пе-роксидазой хрена: PI-1 ООО (anti-rabbit), PI-2000 (anti-mouse), 1:100 (Vector Laboratories, США). Для проведения иммунопероксидазной реакции использовали хромоген ImmPACT™ DAB Peroxidase Substrate (SK.-4105, Vector Laboratories). Окрашенные срезы отмывали 0,1 M фосфатным буфером (рН 7,4), обезвоживали и заключали в среду VectaMount (Н-5000, Vector laboratories) по стандартной методике. Полученные изображения анализировали с использованием программы ImageJ (NIH, США). Для подсчета иммунопозитивных элементов использовали сетку с размером ячеек 2000 мкм2.

Таблица 1 — Характеристика первичных антител

Антитела Характеристика маркера Производитель Разведение

ИЛ-lß, кроличьи поликлональные Провоспалительный цитокин ab9722, Abeam, США 1:100

GFAP, кроличьи поликлональные Маркер астроцитов ab7260, Abeam, США 1:1000

Iba-1, козьи поликлональные Маркер микроглии ab 10715 9, Abeam, США 1:500

AßM2 Компонент амилоидных бляшек 700254, Life technologies, США 1 мкг/мл

Изготовление переживающих срезов. Животных выводили из эксперимента сразу после проведения поведенческих тестов методом декапитации под изофлурано-вым наркозом. Головной мозг быстро извлекали, погружая на 2 минуты в искусственную спинномозговую жидкость (ИСЖ) (t ~ 4°С) следующего состава: 119 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 2,5 мМ СаС12, 1,3 мМ MgS04, 1 мМ NaH2P04, 26 мМ ЫаНСОз, 10 мМ глюкозы; с осмолярностью 310 мосм/л и pH 7.4. Через ИСЖ постоянно пропускали карбоген (95% С02, 5% 02). Гиппокамп быстро извлекали и изготавливали с помощью вибратома (Leica 1000) срезы толщиной 350 мкм, которые помещали в ванночку с ИСЖ и постоянным притоком карбогена.

Измерение внеклеточного уровня pH микроэлектродным методом. Определение внеклеточного уровня pH осуществляли при помощи концентрических рН-чув-ствительных микроэлектродов. Изготовление микроэлектродов производили вручную согласно методике Fedirko et al. (2006). Для измерения внеклеточного уровня pH срез перемещали в камеру для записи, представляющую собой ванночку, постоянно перфузируемую свежей оксигенируемой ИСЖ со скоростью 3 мл/мин. Электрод подводили к срезу, используя микроскоп ВХ-51 с камерой sCMOS (Olympus, Япония) и программным обеспечением MetaMorph program (Molecular devices, США). Используя увеличение Х63, электрод подводили к CAI области гиппокампа и медленно с постоянной скоростью погружали в срез на глубину 200 мкм, постоянно фиксируя электродный потенциал.

Измерение внутриклеточного уровня pH ратиометрическим методом. Измерение внутриклеточного уровня pH производили ратиометрическим методом с помощью pH-чувствительного красителя BCECF-am (В-1170, Life technologies). Измерение заключалось в определении pH-зависимого отношения интенсивности излучения при возбуждении красителя светом с длиной волны 470 нм к интенсивности излучения при возбуждении красителя светом с длиной волны 440 нм (изобестическая точка). Детекцию флуоресценции производили при длине волны 535 нм. Для измерения внутриклеточного уровня pH срезы после восстановления в течение 30 минут инкубировали в 5 мкМ растворе BCECF-am в ванночке с постоянно оксигенируемой ИСЖ (t = 32°С), тщательно промывали и переносили в камеру для записи, как и в случае измерения внеклеточного уровня pH. Далее производили последовательное облучение среза светом с длиной волны 440 нм и 470 нм и детекцию флуоресценции при длине волны 535 нм (Рисунок 2).

440 н.ч 470 нм 440/470 нм

Рисунок 2 - Характерные примеры изображений, полученных при возбуждении красителя ВСЕСР светом с длинами волн 440 нм и 470 нм; ратиометрическое отношение (справа). Нейроны, выбранные для получения количественных данных, выделены пунктирными окружностями.

Изображения анализировали с помощью программного обеспечения MetaMorph (Molecular devices, США). Для перевода полученных отношений светимостей F470/440 в единицы pH производили калибровку с использованием комбинации нигерицинового (Murphy et al., 2005) и микроэлектродного методов.

Определение жирнокислотного состава фосфолипидов головного мозга. Сразу после проведения поведенческих тестов мышей выводили из эксперимента путем внутрибрюшинного введения тиопентала натрия (3%, 60 мг/кг) с последующей декапитацией и быстрым извлечением головного мозга. Извлеченный мозг помещали на лед, быстро выделяя гиппокамп и кору больших полушарий, которые затем замораживали в жидком азоте и хранили при температуре минус 70°С. Экстракцию липи-дов из ткани производили по методу Folch et al. (1957). После проведения реакции метанолиза фракцию метиловых эфиров отделяли методом тонкослойной хроматографии на пластинках силикагеля, экстрагируя хлороформом, и анализировали методом газовой хроматографии. Для анализа использовали газовый хроматограф Shimadzu GC-17A (Shimadzu, Япония) с пламенно-ионизационным детектором и капиллярной колонкой Supelcowax 10, 30м х 0,25 мм (Sigma, США). Пики метиловых эфиров жирных кислот идентифицировали по времени удерживания путем сравнения их со временем удерживания стандартов (47015-U SUPELCO, Sigma, США).

Измерение концентрации малонового диальдегида (МДА) в гиппокампе и коре головного мозга проводили согласно методике Wasowicz et al. (1993). Метод основан на реакции МДА с тиобарбируровой кислотой (ТБК) при температуре 95°С.

Статистическая обработка результатов. Для статистического анализа результатов исследования рассчитывали средние арифметические величины (х) и среднеквадратичные отклонения средних величин (с). Оценку достоверности различий результатов проводили путем сравнения с контролем с применением t-критерия Стью-дента. Уровень значимости считали достоверным при р<0,05 (Юнкеров, 2002). Статистический анализ проводили с использованием программного обеспечения Microsoft Excel (США).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Уровень pH в нервной ткани при нейровоспалении. В данном исследовании в качестве терапевтического подхода, направленного на нормализацию когнитивных функций при нейровоспалении, рассматривалось применение ш-3 ПНЖК. Мы предположили, что фармакологическая активность ДГК и ЭПК, связанная с подавлением

реакции нейровоспаления, снижением интенсивности перекисного окисления липи-дов и улучшением физико-химических свойств клеточных мембран, способствует стабилизации кислотно-основного равновесия нервной ткани и нормализации когнитивных функций. В процессе исследования реакции нейровоспаления на in vitro и in vivo моделях нами получены данные, демонстрирующие нарушения кислотно-основного равновесия нервной ткани. Обнаружено достоверное снижение внутриклеточного уровня рН пирамидальных нейронов гиппокампа при индукции нейровоспаления in vitro на 0,26±0,10 в экспериментальной группе по сравнению с контролем (Рисунок 4А). Данные результаты сопоставимы с результатами, полученными при индукции нейровоспаления in vivo. При подостром периферически-индуцированном нейровос-палении снижение внутриклеточного уровня рН гиппокампальных нейронов составило 0,34±0,10 единицы. При остром нейровоспалении уровень рН достоверно снизился в среднем на 0,19±0,10 (Рисунок 4А).

На in vivo моделях острого, подострого и хронического нейровоспаления показаны изменения внеклеточного уровня рН, которые имели менее выраженный характер по сравнению с изменениями внутриклеточного рН. Так, через 3-6 часов после индукции острого нейровоспаления наблюдалось снижение внеклеточного рН, в среднем, на 0,08±0,04 (р<0,01) (Рисунок ЗВ). На данный промежуток времени приходилась максимальная экспрессия провоспалительного цитокина ИЛ-ip в гиппокампе, что подчеркивает связь процесса нейровоспаления с «закислением» нервной ткани (Рисунок ЗА, Б).

'О . чЧ •' f "ж ■ < - 6 h . ' "г-. * 12 h

24 h. 72 h i „v4í -N 7 d

I III ID 10

3 ч 6 ч 12 ч 24 ч 36 ч 72 ч 7 д ■ Кон i ро. ¡i. а л ПС

Id ID ID I

Рисунок 3 — Динамика экспрессии ИЛ-1 р и изменений внеклеточного уровня рН в гиппокампе мышей при нейровоспалении. А. Экспрессия П-1Ье1а в СА1-области гиппокампа мыши через 3, 6, 12,24, 72 часа и 7 дней после введения ЛПС (5 мг/кг) или 0.9% раствора №С1; Б. Среднее количество 1Ь-1 р позитивных клеток/мм2 ± а, *р<0.0001, п=8 (количество срезов); В. Внеклеточный уровень рН в СА1-области гиппокампа через 3, 6, 12 и 24 часа после инъекции ЛПС (5 мг/кг), х ±а, р<0,01, п=8 (количество срезов); масштабный отрезок - 50 мкм.

При подостром нейровоспалении снижение внеклеточного уровня рН составило 0,10±0,02 по сравнению с контролем (р<0,01) (Рисунок 4Б). В качестве in vivo модели хронического нейровоспаления для измерения внеклеточного уровня рН использовали мышиную линию Ts65Dn, представляющую собой генетическую модель синдрома Дауна. При хроническом нейровоспалении уровень рН внеклеточной среды гиппокампа был на 0,11±0,03 ниже, чем рН в контрольной группе однопометных мышей с нормальным кариотипом (Рисунок 4Б).

Менее выраженные изменения кислотности внеклеточной среды по сравнению с изменениями во внутриклеточном пространстве могут свидетельствовать о первичном снижении рН внутри клетки и последующем нарушении кислотно-основного баланса во внеклеточной среде.

А Б 7Í ..

7.5 pll , „ . Р» « * *

! Го Го Го !■□■□■□

kuHipo.il, .ПК Контроль ЛИС Контроль .IIH Контроль .ПК Контроль ЛИС Контрадь 1s65Dn

in vivo ocrpoi* in vivo nojotipot invilro in vivo ocipof in vivo полострое in vivo vpoHimrck'iir

Рисунок 4 - Внутриклеточный и внеклеточный уровень рН в CAI-области гиппокампа. А. Внутриклеточный уровень рН при in v/vo-индуцированном остром и подостром нейровоспалении и ш у;7то-индуцированном нейровоспалении. Б. Внеклеточный уровень рН при ш v/vo-индуцирован-ном остром, подостром и хроническом нейровоспалении, х ± а, *р<0,01.

Для подтверждения развития нейровоспаления после введения ЛПС проводили поведенческие тесты и иммуногистохимические исследования. Поведенческие эксперименты продемонстрировали нарушения памяти и локомоторной активности. Показатель долговременной памяти «индекс распознавания» при остром нейровоспалении достоверно уменьшился на 18%, при подостром нейровоспалении - на 22% по сравнению с контролем. Уменьшение показателя рабочей памяти при подостром нейровоспалении составило 19% (р=0,001), при остром нейровоспалении изменение признано статистически недостоверным. Снижение показателя локомоторной активности «Количество входов в рукава Y-лабиринта» по сравнению с контрольной группой при остром и подостром нейровоспалении составило 33% и 37%, соответственно. Пройденная дистанция в автоматизированном «открытом поле» достоверно уменьшилась

при остром нейровоспалении на 50%, при подостром нейровоспалении на 25%. Длительность вертикальной активности у животных с острым нейровоспалением достоверно уменьшилась в 2 раза по сравнению с контролем, при подостром нейровоспалении произошло уменьшение в 2,7 раза (Таблица 2).

Нейровоспаление подтверждалось изменением активности глиальных клеток (астроцитов и микроглиоцитов) в гиппокампе. Выявлено достоверное увеличение количества глиоцитов и характерные для нейровоспаления морфологически изменения: увеличение средней площади клеточных тел, обусловленное гипертрофией цитоплазмы, окружающей неизмененное ядро, у некоторых клеток слегка смещенное эксцентрично, а также укорачивание и утолщение отростков (Рисунок 5). Так, количество GFAP-позитивных астроцитов в CAI области гиппокампа после индукции острого нейровоспаления увеличилось на 25% (р=0,00033), после индукции подострого нейровоспаления наблюдалось увеличение на 55% (р<0,0001). Длина астроцитарных отростков при остром и подостром нейровоспалении достоверно уменьшилась на 13% и 35%, соответственно. Площадь тел астроцитов увеличилась в среднем в 2,8 раза при остром нейровоспалении и в 2 раза при подостром нейровоспалении. Наблюдались изменения и в количестве Iba-1-позитивных микроглиоцитов: при остром нейровоспалении их количество достоверно увеличилось в среднем в 2 раза, при подостром -в 2,5 раза. Площадь тел микроглиоцитов при остром нейровоспалении достоверно увеличилась в среднем на 30%, при подостром - на 50% (Таблица 2). Выявленные поведенческие и морфологические изменения свидетельствуют о наличии реакции нейровоспаления как после однократного введения ЛПС в дозе 5 мг/кг, так и после введения в дозе 200 мкг/кг в течение 7 дней (Godbout, 2005).

GFAP lba-1 GFAP lha-1

Рисунок 5 - Экспрессия GFAP и Iba-1 в CAI области гиппокампа при остром (А) и подостром (Б) нейровоспалении; масштабный отрезок — 50 мкм.

Таблица 2 - Средние поведенческие и морфологические показатели острого и подострого ЛПС-индуцированного нейровоспапения, * - статистически достоверное различие с группой «Контроль» (р<0,05).

5 мг/кг, однократно (острое нейровос-паление) 200 мкг/кг, 7 дней (подострое нейровоспале-ние)

Контроль х±о ЛПС х±я Р Контроль X ± о ЛПС х±о Р

Поведенческие показатели

Индекс распознавания, % 61,80 ± 3,64 46.01 ±2,26 0,003* 60 ± 2,63 42,80 ± 7,36 0,0033*

Коэффициент спонтанных альтернаций, % 72,93 ± 3,26 67,00 ± 2,40 0,5 68,33 ±3,11 55,18 ±2,58 0,001*

Количество входов в рукава У-лабиринта, п 21,40 ± 1, 60 14,30 ±2, 16 0,03* 26,83 ± 1,3 16,33 ±2,10 0,001*

Дистанция, см 428,12 ± 47,70 231,98 ±25, 80 0,02* 416,77 ±40 315,98 ± 20,55 0,03*

Вертикальная активность, сек 10,66 ± 2,60 4,90 ± 1,50 0,0002* 11,8 ± 2,5 4,30 ± 0,68 0,0002*

Прыжки, п 12,50 ± 3,20 2,60 ± 0,90 0,0001* 12,1 ± 1,87 5,00 ± 1,40 0,0003*

Морфологические показатели

СГАР*-астроциты 600,00 ± 67.30 798,75 ± 16,00 0,00033* 633,33 ±37,20 1422 ±82,4 <0,0001*

1Ьа-1+-микроглия 300,00 ± 58 570,02 ± 28,00 0,0009* 237,5 ± 59,00 587,5 ± 114,00 <0,0001*

Длина отростков астро-цитов, мкм 17,84 ± 0.60 13,44 ±0,72 0,045* 18,23 ± 0,67 11,65 ±0,83 <0,0001*

Площадь тел астроци-тов, мкм2 5,95 ± 0,70 17,04± 1,60 <0,0001* 8,54 ± 1,25 17,25 ± 1,05 <0,0001*

Площадь тел микро-глиоцитов, мкм1 14,85 ± 1,02 21,54± 1,70 <0,000* 12,66 ±0,90 23,57 ± 1,20 <0,0001*

Влияние со-3 ПНЖК на уровень рН нервной ткани. В процессе исследования мы обнаружили, что введение ДГК и ЭПК в течение 48 дней предотвращает ЛПС-индуцированное снижение рН как в нейронах, так и во внеклеточной жидкости. При этом, в группе, получавшей ПНЖК, внутриклеточный рН при нейровоспалении уменьшился в среднем на 0,11±0,05 (р<0,001), в группе, не получавшей жирные кислоты снижение уровня рН составило 0,34±0,07 (р<0,0001). Внеклеточный рН у мышей, получавших ПНЖК, при введении ЛПС остался неизменным, у мышей, не получавших смесь ПНЖК, уровень рН снизился на 0,1±0,02 (р<0,0001) (Рисунок 6).

В то же время, данные, полученные при измерении концентрации малонового диальдегида (МДА) в гиппокампальном отделе головного мозга, свидетельствуют об антиоксидантных свойствах вводимой смеси ДГК и ЭПК. У мышей, получавших ПНЖК, концентрация МДА в тканях гиппокампа при нейровоспалении оказалась на 33% ниже, чем у мышей, которым ПНЖК не вводили (р=0,03). Таким образом, одним

из возможных механизмов нормализации рН при введении ПНЖК является снижение интенсивности ПОЛ в нервной ткани.

А 7.пж 1. * .. " ** .1 Б 7-5Р"° «

II Н I п I

□ ■ ü I и 1

■ Контроль алпс = ПНЖК иПНЖК+ЛПС ■ Контроль П.1ПС ЭПНЖК ШПНЖК+ЛПС

Рисунок 6 — Внутриклеточный (pH¡) и внеклеточный (рН0) уровень рН в CAI области гиппо-камиа при нейровоспалении. А. Средние значения внутриклеточного уровня рН. Б. Средние значения внеклеточного уровня рН, п = 60 (количество срезов на группу), *р<0,0001, **р<0,001.

Экспрессия маркеров нейровоспаления и накопление бета-амилоида в гип-покампе животных на фоне введения ДГК и ЭПК. Помимо данных, демонстрирующих антиоксидантные свойства со-З ПНЖК, нами получены результаты, свидетельствующие о снижении процессов нейровоспаления в гиппокампе под действием ДГК и ЭПК. У мышей, получавших ПНЖК, количество ИЛ-ф-позитивных элементов в гиппокампе при нейровоспалении оказалось меньше на 30%, чем в группе мышей, не получавших эфиры жирных кислот (р=0,01). Стоит отметить, что ИЛ-1 (3-позитивные клетки имели морфологические признаки микроглиоцитов, свидетельствуя об активации микроглии провоспалительного (М1) фенотипа. Это говорит о способности со-З ПНЖК подавлять воспалительный ответ на ранних стадиях, когда микроглиоциты, подвергаясь активации, начинают синтезировать провоспалительные цитокины. Кроме того, введение со-З ПНЖК препятствовало развитию микро- и астроглиоза в гиппокампе при нейровоспалении, сохраняя нормальные морфологические характеристики микроглии и астроцитов. У мышей, получавших ПНЖК, при нейровоспалении как количество астроцитов, так и количество микроглиоцитов в 1 мм2 оказалось на 30% ниже, чем у мышей, не получавших смесь эфиров жирных кислот. В группе «ПНЖК + ЛПС» при нейровоспалении средняя площадь тел астроцитов была достоверно меньше площади в группе «ЛПС» в 2 раза. Средняя длина отростков астроцитов в группе «ЛПС» при нейровоспалении оказалась на 20% ниже, чем в группе животных, получавших ПНЖК. Средняя площадь тел микроглиоцитов у мышей, получавших ПНЖК, при нейровоспалении оказалась на 30% ниже, чем в группе, не получавшей ПНЖК (Рисунок 7, Таблица 3). Активированные глиальные клетки, как известно, являются ключевым компонентом реакции нейровоспаления и основным источником

АФК при окислительном стрессе. В глиальных клетках продукция АФК катализируется, в основном, НАДФ-оксидазой, окисляющей молекулярный кислород в супероксидный анион (Ог*") при участии НАДФН в качестве донора электронов (Bedard, Krause, 2007). Данный процесс способствует накоплению Н+ в глиальных клетках, вызывая деполяризацию и ацидификацию цитоплазмы (De Vito, 2006). Кроме того, активированная микроглия имеет более высокую потребность в энергии и использует преимущественно гликолиз для синтеза АТФ даже в нормооксических условиях, вызывая, при этом, локальное повышение концентрации лактата и протонов (Magistretti, Allaman, 2013). Таким образом, стабилизация pH гиппокампа на фоне введения ПНЖК, может быть следствием снижения интенсивности реакции нейровоспаления.

Еще один возможный механизм действия ю-3 ПНЖК на когнитивные способности заключается в их влиянии на накопление бета-амилоида (Aß). Введение ДГК и ЭПК позволило не только предотвратить ЛПС-индуцированное накопление Aß, но и снизить базовый уровень данного маркера в гиппокампе мышей в 2,3 раза (Рисунок 7, Таблица 3).

Рисунок 7 — Экспрессия маркеров нейровоспаления и накопление пептида Ар42 в СА1 -области гиппокампа мышей с подострим нейровоспалением на фоне введения со-3 ПНЖК. А. Экспрессия ИЛ-1 р. Б. Экспрессия СРАР. В. Экспрессия 1Ьа-1. Г. Накопление пептида Ар42; масштабный отрезок — 50 мкм.

Таблица 3 - Иммуногистохимические показатели CAI-области гиппокампа мышей с экспериментальным нейровоспалением при введении га-3 ПНЖК; * - статистически достоверное различие с группой «ЛПС» (р<0,05), ** - статистически достоверное различие с группой «Контроль» (р<0,05).

Контроль ЛПС ПНЖК пнжк+лпс

ИЛ-1+-элементы/1 мм2 87,30±11,24 185,18±17,17 59,17±14,51 123,81±14,51*

GFAP+-acTpounTb[/l мм2 600,01±67,32 798,14±16,08 556,02±22,00 566,50±18,32*

Длина отростков астроци-тов, мкм 17,84±0,56 11,87±0,72 18,54±0,43 14,61±0,59*

Площадь тел астроцитов, мкм2 6,01 ±0,75 16,82±1,62 7,37±0,68 7,74±0,62*

1Ьа-1+-микроглия/1 мм2 300,00±58,63 570,00±28,50 370,00±48,73 420,00±45,41 *

Площадь тел микроглиоци-тов, мкм2 13,64±1,12 22,02±1,50 15,64±1,08 15,73±1,23*

Ар+-элементы/1 мм2 233,91±75,81 483,41±71,09 101,36±43,26** 124,75± 39,35*

Снижение рН является фактором, ускоряющим накопление Ар в нервной ткани в связи с повышением активности у-секретазы — ключевого фермента синтеза Ар из белка-предшественника (АРР) (Campbell et al., 2003). у-секретаза наиболее интенсивно продуцирует Ар40 и Ар42 при значениях рН, близких к 6,8 (Mclendon et al., 2000). В нашем исследовании снижение рН внутриклеточного пространства достигло значения 6,9, при этом, количество Ар42-позитивных элементов в гиппокампе мышей увеличилось в 2 раза. Смещение рН в кислую сторону подобное тому, что мы наблюдаем в настоящем исследовании при введении ЛПС может являться причиной накопления Ар и, как следствие, нарушения когнитивных функций. Полученные нами данные об уменьшении накопления нейротоксического пептида при введении со-З ПНЖК соотносятся с данными о стабилизации рН, объясняя положительное действие вводимых со-З ПНЖК на когнитивные функции.

Влияние о>-3 ПНЖК на двигательную активность, память и неврологический статус животных. Мы сопоставили снижение рН нервной ткани с нарушением когнитивных функций и неврологического статуса животных при нейровоспалении, а также оценили влияние со-З ПНЖК на данные показатели. У животных, получавших смесь со-З ПНЖК, показатели локомоторной активности, рабочей и долговременной памяти оказались достоверно выше данных показателей в группе, не получавшей жирные кислоты. Так, в группе «ПНЖК + ЛПС» показатели локомоторной активности «Пройденная дистанция», «Количество прыжков» и «Количество входов в рукава Y-

лабиринта» при иейровоспалении на фоне введения со-3 ПНЖК оказались достоверно выше, чем в группе «ЛПС» (Рисунок 8).

А боо

500

| 300 \ 2(Н) 100

В„

I

I

□

: 25

I 1" 20

8 " 15 2 10

I

■ контроль Я ПНЖК

□ ЛПС

Ш|ПЖК+. ПК

■ К'ОН I pO.ll.

К ПНЖК

□ ЛПС

ШПНЖК+ЛПС

■ KoHipo.il.

епнжк

□ ЛПС

ипнжк+лпс

Рисунок 8 - Локомоторная активность животных при иейровоспалении на фоне введения ПНЖК. А. Дистанция, пройденная за 5 минут в автоматизированном «открытом поле», %. Б. Количество прыжков. В. Количество входов в рукава У-лабиринта, х ± ст, *р<0,001, **р<0,01, #р<0,05, п = 10 (количество животных в группе).

Показатель рабочей памяти «Коэффициент спонтанных альтернаций», определяемый при тестировании в У-образном лабиринте, в группе «ПНЖК + ЛПС» оказался на 5% выше, чем в группе «ЛПС». Исследование долговременной памяти в тесте «Распознавание новых объектов» в группе «ПНЖК + ЛПС» не выявило статистически достоверных отличий от контрольной группы, в группе «ЛПС» показатель снизился на 20% по сравнению с группой «Контроль». Показатель неврологического статуса при иейровоспалении у мышей, получавших ПНЖК, оказался на 17% выше, чем у животных, которым ПНЖК не вводили (Рисунок 9).

| 10«

1 * 80 £ 160

I : 4о = -

•!■ * 20 ♦

■I О

I

= 70

= 60

а:

Ё 5«

I 40

Е..50

г 20 5 ю - о

I

100 хо 60 40 20

1п

■ Ко Н1 роль - ПНЖК

□ ЛПС

о инжк+лис

■ Контроль в IIНЖК

□ ЛПС

ШПНЖК+ЛПС

■ Контроль в ПНЖК

РЛПС:

11 пнжк+лпс

Рисунок 9 - Поведенческие показатели при иейровоспалении на фоне введения ПНЖК. А. Показатель рабочей памяти «Коэффициент спонтанных альтернаций», %. Б. Показатель долговременной памяти «Индекс распознавания» в тесте «Распознавание новых объектов», %. В. Неврологический статус мышей по шкале N88, %; ЗГ± а, *р<0,001, #р<0,05, п = 10 (количество животных в группе).

Предварительное введение со-3 ПНЖК наряду со стабилизацией рН способствовало нормализации памяти животных, локомоторной активности и их неврологического статуса. Стабилизация рН как во внеклеточной среде, так и в нейронах и гли-альных клетках является важнейшим параметром нормального функционирования ЦНС и сохранения нормальных когнитивных функций. Уровень рН оказывает влияние на конформацию белковых молекул и, тем самым, на функциональную активность ферментов, рецепторов и ионных каналов (Chesler, 2003). Снижение уровня рН способствует усилению ГАМК-ергической и ослаблению глутаматергической передачи (Mozrzymas, 2004 Dravid et al., 2007, Dietrich, Morad, 2010), что влияет на синаптиче-скую пластичность и приводит к нарушению когнитивных функций (Kleschevnikov et al., 2012, Paoletti et al., 2013).

Анализ жирнокислотного состава фосфолипидов головного мозга мышей после введения полиненасыщенных жирных кислот. В рамках данного исследования, нами был проведен количественный анализ содержания жирных кислот в фосфо-липидах головного мозга методом газовой хроматографии. Мы обнаружили, что введение со-3 ПНЖК в течение 48 дней способствовало статистически достоверному повышению содержания ДГК в фосфолипидах клеточных мембран гиплокампа в 2 раза, в фосфолипидах коры - на 13% (Рисунок 10). Важнейшим показателем, определяющем степень накопления со-3 или ш-6 ПНЖК в головном мозге является отношение концентрации докозагексаеновой кислоты к концентрации арахидоновой кислоты (АК). По результатам проведенных экспериментов, соотношение ДГК/АК в коре больших полушарий у контрольной группы составило 2,03, в группе «ПНЖК» - 2,29; в гиппокампе: 1,25 и 1,63, соответственно. Увеличение соотношения ДГК/АК свидетельствует о частичном замещении арахидоновой кислоты докозагексаеновой кислотой в фосфолипидах головного мозга. При этом, ДГК и ЭПК служат в качестве субстратов для ферментов циклооксигеназ и липооксигеназ, снижая интенсивность окисления арахидоновой кислоты и образования провоспалительных медиаторов - проста-гландинов и тромбоксанов (Wall et al. 2010). В то же время, повышается интенсивность образования противовоспалительных медиаторов, окисленных производных ДГК и ЭПК, протектинов и резольвинов (Zhao et al. 2011). Доказана положительная корреляция между величиной соотношения ДГК/АК и когнитивными функциями, а также отрицательная корреляция между данным соотношением и образованием продуктов апоптоза при введении А|3 (Hashimoto et al., 2005).

А

30

I 20

I 10

I 0

■X

Л

■ Контроль □ ПНЖК

|!ц

■п во к__

■ л

Б

30

25

* 20

я 15

с.

= 10

1 5

3 ■Л 0

■ Контроль □ ПНЖК

[_.____В — я

I

Т № « К

О О О О1 .О — » ^ в о ^

ючэ&ссЁТЁеЕкгс — — — — — = — ~ Т:

ж ж 66 П в о о в «м м — — — омчмммм

Рисунок 10 - Относительное содержание жирных кислот в фосфолипидах коры головного мозга и гиппокампа. А. Содержание жирных кислот в фосфолипидах гиппокампа. Б. Содержание жирных кислот в фосфолипидах коры больших полушарий, С%±<т, п=Ю, *р<0,01.

В данном исследовании мы установили, что при остром, подостром и хроническом нейровоспалении происходит снижение внутриклеточного и внеклеточного уровня рН гиппокампа. Уровень рН внутриклеточного пространства при подостром нейровоспалении достигает значения 6,9±0,01, при остром - 7,05±0,07. Кислотность нервной ткани является важным регулятором синаптической пластичности и, как следствие, памяти и способности к обучению. «Закисление» нервной ткани объясняет развитие когнитивного дефицита при неврологических заболеваниях, ассоциированных с нейровоспалением и, как следствие, является перспективной терапевтической мишенью. Мы обнаружили, что введение этиловых эфиров докозагексаеновой и эй-козапентаеновой кислот в течение 48 дней предотвращает развитие ЛПС-индуциро-ванного нейровоспаления, повышение ПОЛ, накопление (3-амилоида в гиппокампе и снижение рН как в нейронах, так и во внеклеточной жидкости. Стабилизация уровня рН нервной ткани на фоне введения со-3 ПНЖК сопровождается улучшением показателей памяти, неврологического статуса и нормализацией локомоторной активности у животных с экспериментальным нейровоспалением.

Полученные нами данные о механизмах действия со-3 ПНЖК на нервную ткань позволяют обосновать возможность применения ш-3 жирных кислот в качестве средств профилактики и терапевтической коррекции заболеваний центральной нервной системы, сопровождающихся развитием когнитивных нарушений.

ВЫВОДЫ

1. При остром нейровоспалении происходит достоверное снижение внутриклеточного уровня рН пирамидальных нейронов гиппокампа на 0,19±0,10 единицы и сниже-

ние внеклеточного уровня pH гиппокампа на 0,08±0,04 единицы. При подостром ней-ровоепалении сдвиг внутриклеточного уровня pH в кислую сторону составляет 0,34±0,10 единицы, внеклеточный уровень pH достоверно снижается на 0,10±0,02 единицы. При хроническом нейровоспалении снижение внеклеточного уровня pH гиппокампа составляет 0,11±0,03 единицы.

2. Докозагексаеновая и эйкозапентаеновая кислоты при пероральном введении нормализуют локомоторную активность, восстанавливают неврологический статус, улучшают показатели рабочей и долговременной памяти у мышей с экспериментальным нейровоспалением.

3. Докозагексаеновая и эйкозапентаеновая кислоты при пероральном введении снижают экспрессию провоспалительных маркеров и препятствуют формированию морфологических признаков активации микроглии и астроглии в гиппокампе.

4. При пероральном введении докозагексаеновой и эйкозапентаеновой кислот наблюдается уменьшение содержания ß-амилоида 42 в гиппокампе мышей в 2,3 раза. Индукция нейровоспаления на фоне введения докозагексаеновой и эйкозапентаеновой кислот не приводит к накоплению ß-амилоида 42.

5. Докозагексаеновая и эйкозапентаеновая кислоты при пероральном введении предотвращают снижение внеклеточного и внутриклеточного уровня pH гиппокампа у мышей с экспериментальным нейровоспалением.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Публикации в рецензируемых журналах

1. Тыртышная A.A., Зозуля A.A. Влияние периферически-индуцированного нейровоспаления на когнитивные функции у молодых и старых мышей // Тихоокеанский медицинский журнал. 2014. № 2. С. 23-26.

2. Тыртышная A.A. Механизмы влияния докозагексаеновой кислоты на когнитивные функции при нейровоспалении // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. 2014. Т. 16. № 5 (2). С. 809-812.

3. Манжуло И.В., Дюйзен И.В., Огурцова О.С., Ламаш Н.Е., Латышев H.A., Касьянов C.B., Тыртышная A.A. Дозозависимый антиболевой эффект докозагексаеновой кислоты при экспериментальной периферической нейропатии // Тихоокеанский медицинский журнал. 2013. № 2. С. 31-33.

4. Lysenko L.V., Kim J., Henry С., Tyrtyshnaia A., Kohnz R., Madamba F., Simon G., Kleschevnikova N., Nomura D., Ezekowitz R., Kleschevnikov A. Monoacylglycerol lipase inhibitor JZL184 improves behavior and neural properties in Ts65Dn mice, a model of Down syndrome//PLoS one. 2014. Vol. 9. No. 12. DOI: 10.1371/journal.pone.Ol 14521.

Работы, опубликованные в сборниках трудов и материалах конференций

1. Тыртышная A.A. Исследование изменения интерстициального уровня pH нервной ткани при нейровоспалении // Наука и образование в XXI веке: сборник научных трудов по материалам Международной научно-практической конференции 30 сентября 2013 г.: в 34 частях. Часть 32. Тамбов: Изд-во ТРОО «Бизнес-наука-общество», 2013. С. 150-151.

2. Тыртышная A.A., Хотимченко М.Ю., Клещевников A.M. Изменение кислотности нервной ткани при нейровоспалении: исследование на переживающих срезах мозга // Сборник материалов X Дальневосточного регионального конгресса «Человек и лекарство», 19-20 сентября 2013 г. Владивосток: Изд-во «ДВ Медицина», 2013. С. 74-75.

3. Тыртышная A.A., Зозуля A.A. Механизмы влияния докозагексаеновой кислоты на когнитивные функции при нейровоспалении // Сборник материалов XXII Российского национального конгресса «Человек и лекарство», Москва, 6-10 апреля 2015 г. М.: Изд-во ЗАО РИЦ «Человек и лекарство», 2015. С. 270.

4. Зозуля A.A., Тыртышная A.A. Влияние алкилглицеридов на липополисахарид-индуцированное нейровоспаление // Сборник материалов XXII Российского национального конгресса «Человек h лекарство», Москва, 6-10 апреля 2015 г. М.: Изд-во ЗАО РИЦ «Человек и лекарство», 2015. С. 206.

5. Тыртышная A.A. Изменение интерстициального уровня pH нервной ткани при нейровоспалении // Вестник Российского государственного медицинского университета. №2. Москва. 2015. С. 323-324.

6. Тыртышная A.A. Механизмы влияния полиненасыщенных жирных кислот на когнитивные функции при нейровоспалении [Электронный ресурс] // Сборник Тезисов III Научно-практической конференции молодых ученых и студентов, 24 апреля 2015 г. Владивосток: Дальневост. федерал, ун-т, 2015. С. 84. Режим доступа: http://www.dvfu.ru/web/otdelorganizacii-naucno-issledovatelskojraboty-studentov/publikacii-oonirs

7. Tyrtyshnaia A., Lysenko L., Madamba F., Kim J., Khotimchenko M., Kleschevnikov A. M. Acute lipopolysaccharide (LPS) - induced neuroinflammation provokes interstitial acidification in mouse hippocampus [Электронный ресурс] // Neuroscience 2013, Nov 913, 2013. San Diego, USA. Режим доступа: http://www.sfn.org/annual-meeting/neuroscience-2013/Abstracts-and-Sessions/Program/Abstract-PDFs-2013

8. Tyrtyshnaia A.A., Kleschevnikov A.M., Khotimchenko M. Intracellular acidification during the acute phase of neuroinflammation [Электронный ресурс] // Neuroscience 2015, Oct 17-21, 2015. Chicago, USA. Режим доступа: http://www.sfn.org/Annual-Meeting/Neuroscience-2015/Sessions-and-Events/Program/Abstract-PDFs-2015

Тыртышная Анна Алексеевна

МЕХАНИЗМЫ ВЛИЯНИЯ ПОЛИНЕНАСЫЩЕННЫХ ЖИРНЫХ КИСЛОТ НА КОГНИТИВНЫЕ ФУНКЦИИ ПРИ НЕЙРОВОСПАЛЕНИИ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано в печать 14.09.2015 г. Формат 60x84 1/16. Усл. п. л. 1. Тираж 100 экз. Заказ 348 Отпечатано в типографии Дирекции публикационной деятельности ДВФУ 690990, г. Владивосток, ул. Пушкинская, 10..