Автореферат и диссертация по медицине (14.00.51) на тему:Кошаперон белка теплового шока-маркер адаптации высококвалифицированных спортсменов к физической нагрузке

ДИССЕРТАЦИЯ
Кошаперон белка теплового шока-маркер адаптации высококвалифицированных спортсменов к физической нагрузке - диссертация, тема по медицине
АВТОРЕФЕРАТ
Кошаперон белка теплового шока-маркер адаптации высококвалифицированных спортсменов к физической нагрузке - тема автореферата по медицине
Гребенюк, Екатерина Сергеевна Москва 2010 г.
Ученая степень
кандидата биологических наук
ВАК РФ
14.00.51
 
 

Автореферат диссертации по медицине на тему Кошаперон белка теплового шока-маркер адаптации высококвалифицированных спортсменов к физической нагрузке

На правах рукописи

Гребешок Екатерина Сергеевна

КОШАПЕРОН БЕЛКА ТЕПЛОВОГО ШОКА - МАРКЕР АДАПТАЦИИ ВЫСОКОКВАЛИФИЦИРОВАННЫХ СПОРТСМЕНОВ К ФИЗИЧЕСКОЙ

НАГРУЗКЕ

14.00.51 - восстановительная медицина, лечебная физкультура и спортивная медицина, курортология и физиотерапия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

004601040

Работа выполнена в лаборатории молекулярной физиологии Федерального Государственного учреждения Всероссийский научно-исследовательский институт физической культуры и спорта

Научный руководитель:

доктор биологических наук, член-корреспондент РАН Тоневицкий Александр Григорьевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Абрамова Тамара Федоровна

кандидат биологических наук Трофимов Дмитрий Юрьевич

Ведущая организация:

Московский научно-исследовательский институт медицинской экологии Департамента здравоохранения г.Москвы

Защита диссертации состоится « 28 » апреля 2010 в на заседании

диссертационного совета Д.311.002.01 при Федеральном Государственном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт физической культуры и спорта по адресу: 105005, Москва, Елизаветинский пер., 10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального Государственного учреждения Всероссийский научно-исследовательский институт физической культуры и спорта

Автореферат разослан « «»» 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Пономарева А. Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Важнейшими составляющими спортивной успешности, являются физическая подготовленность и адаптация спортсменов к мышечным нагрузкам на всех этапах спортивной деятельности. Современный спорт требует невероятно высоких результатов на грани физических возможностей человека, вследствие чего организм подвергается большому количеству стрессовых факторов: гипоксия, гипертермия, оксидативный стресс, воспаление и повреждение, изменение концентрации кальция и аденозинтрифосфата (Benjamin I.J., 1998; Whithman М., 2008), поэтому так необходим индивидуальный подход к тренировочному процессу и более детальный мониторинг спортсменов, как в тренировочный, так и в восстановительный период.

Физические нагрузки являются сигналом для активации семейства белков теплового шока (БТШ). Они ответственны за сворачивание синтезированных полипептидов, предотвращение денатурации белков, их агрегацию и необходимы клетке для обеспечения механизмов адаптации и предотвращения алоптоза (Soufi F.G.,

Наиболее изученным является белок с молекулярным весом 70кДа (БТШ70). Он является внутриклеточным белком, но в ответ на оксидативный стресс, повышение температуры, воспаление или физиологический стресс, его концентрация стремительно возрастает и в крови (Сахаров Д.А., 2009). БТШ70 - АТФ-связывающий белок, обладающий АТФазной активностью. АТФ- связывающая форма белка имеет низкое сродство к денатурированному белку, в то время как АДФ форма наоборот прочно связывается с поврежденным белком. Поэтому изменение АТФазной активности может оказывать влияние на защитную функцию БТШ70.

Недавно был обнаружен БТШ70-связывающий белок - СБ1. Он является кошапероном БТШ70 и фактором нуклеотидного обмена. Взаимодействие СБ1 с АТФазным доменом БТШ70, влечет за собой конформационные изменения последнего, в результате чего происходит инактивация БТШ70-зависимого фолдинга белков (Лаупез О.А., 1998). Также было показано, что после запуска механизма секреции внеклеточных белков, шаперона БТШ70 и его кошалерона СБ1, происходит активация рецептора ЭФР (эпидермальный фактор роста), который регулирует рост и пролиферацию клеток. Возможно данная СБ1/БТШ70 зависимая активация рецептора может служить защитным механизмом для клеток в стрессовых условиях (Ме<1уес1еуа М.А.,2009).

2008).

Известно, что физическая нагрузка приводит к увеличению концентрации БТШ70 (Locke М., 2002). Но как происходит дальнейшая регуляция СБ1/БТШ70 в организме спортсменов и взаимосвязь адаптационной реакции с концентрацией белка СБ1 в крови в период тренировочного процесса не известно.

Все вышеизложенное актуализирует разработку новых специфических критериев адаптационных реакций и изучение связи между подготовленностью спортсмена и изменением концентрации стрессорных белков СБ1/БТШ70 в сыворотке в периоды интенсивных нагрузок.

Гипотеза. Предполагается, что во время физических нагрузок в организме активируется ауторегуляторный механизма секреции БТШ70. Изменение экспрессии мРНК и концентрации БТШ70 в крови, ведет к увеличению концентрации его кошаперона СБ1. Вероятно, СБ1 может быть одним из белков, регулирующих активные формы БТШ70, циркулирующих в сыворотке крови. Таким образом, он является специфичным маркером адаптационных реакций организма. Исследование новых белков-маркеров стресса и изучение их регуляции иммунохимически и на уровне транскрипции позволит приблизиться к пониманию механизмов адаптации спортсменов к физическим нагрузкам.

Цель исследования. Изучение изменения экспрессии мРНК белков СБ1 и БТШ70, и концентраций этих белков в сыворотке у высококвалифицированных спортсменов в процессе адаптации к физическим нагрузкам.

Задачи исследования:

1. Получить моноклональные и аффинные поликлональные антитела против

человеческого рекомбинантного белка СБ1;

2. Разработать тест-систему определения концентрации СБ1 в сыворотке

крови человека;

3. Провести оценку уровня концентраций СБ] и БТШ70 в крови, во время

тренировочного периода;

4. Проанализировать экспрессию мРНК гена СБ1 в лейкоцитах крови

спортсменов;

5. Определить уровень аутоиммунных антител против СБ1 и БТШ70 в

сыворотке спортсменов.

Объект исследования. Процессы молекулярно-биохимической адаптации организма спортсменов во время тренировочного периода.

Предмет исследования. Система регуляции белка теплового шока и его кошаперона.

Научпая новизна. Новизна работы состоит в исследовании изменения концентраций маркера адаптации СБ1 под влиянием физических нагрузок.

Разработана иммупоаффинная методика определения кошаперона СБ1 в сыворотке человека. С использованием разработанной тест-системы, впервые были получены данные о динамике изменения концентрации СБ1 у спортсменов в начале и в конце подготовительного периода. Впервые было показано, что кратковременный высокоинтенсивный стресс не вызывает изменения экспрессии и концентрации СБ1 в сыворотке на фоне увеличения экспрессии и концентрации БТШ70. Обнаружена корреляция между кошапероном СБ1 и его аутоантителами. Впервые было показано, что при увеличении концентрации СБ1, концентрация БТШ70 в сыворотке уменьшается и установлена взаимосвязь концентраций этих белков в сыворотке с подготовленностью спортсменов. У более подготовленных спортсменов к предсоревновательному периоду уровень БТШ70 снижается и выходит на базальный уровень, в то время как уровень СБ1 повышается, что вероятно говорит об адаптации организма к стрессовым нагрузкам.

Научно-практическая значимость. Данные исследования направлены на изучение фундаментальных основ процессов жизнедеятельности и восстановления организма на молекулярном уровне, изучение белков-маркеров стресса и изменений, происходящих под воздействием стрессовых условий. Материалы исследования могут быть использованы в научно-исследовательских центрах медико-биологического профиля, в высших учебных заведениях.

Разработанная иммуноаффинная методика позволит определять концентрацию кошаперона СБ1 в сыворотке. Установлена связь между концентрацией СБ1, БТШ70 и функциональными параметрами спортсменов, что позволит оценивать их подготовленность и адаптацию к физическим нагрузкам.

Полученные результаты могут быть использованы для разработки новых подходов к мониторингу реакции организма на стресс. Можно оценивать состояние, в котором спортсмен подошел к началу предсоревновательного периода, и, учитывая полученные данные, возможно построение тренировочного процесса, который будет способствовать эффективному протеканию адаптационных процессов.

Исследование новых белков-маркеров стресса и изучение их регуляции позволит приблизиться к пониманию механизмов адаптации возникающих в стрессовых условиях и дальнейшего восстановления организма.

Результаты диссертации внедрены в работу кафедры физического воспитания и спорта МГУ имени М.В. Ломоносова и кафедры спортивной медицины ФГУ РГУФКСиТ, что подтверждено актами внедрения.

Основные положения выносимые па защиту:

1. Работа максимальной аэробной мощности не влияет на изменение экспрессии и концентрации СБ1 в крови на фоне увеличении экспрессии и концентрации БТШ70;

2. В процессе подготовительного периода у спортсменов в сыворотке крови наблюдается изменение уровня кошаперона СБ1, что может служить маркером адаптации к стрессу;

3. У более подготовленных спортсменов к предсоревновательному периоду уровень СБ1 повышается, в то время как уровень БТШ70 снижается и выходит на базальный уровень, эти изменения в соотношениях белков могут являться критерием оценки работы адаптационных механизмов.

Структура и обьем диссертации. Диссертационная работа изложена на 119 страницах и состоит из введения, обзора литературы, методической части, результатов исследования, 5 глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы. Работа проиллюстрирована 35 рисунками; список литературы включает 130 источников.

МЕТОДЫ И ОРГАНИЗАЦИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ Методы исследования

В исследовании принимали участие 10 юношей, занимающихся академической гребле и 10 юношей, занимающихся лыжными гонками. Исследование проводили на протяжении подготовительного периода, который составил 28 дней.

Все спортсмены проходили осмотр кардиологом и давали письменное согласие на участие в экспериментах и использование полученных данных. Исследования были одобрены этическим комитетом ФГУ ВНИИФК.

За три дня до начала подготовительного цикла спортсмены проходили нагрузочное тестирование со ступенчато повышающейся мощностью на беговой дорожке Venus (h/p/Cosmos) и на гребном эргометре Concept II (стартовая мощность 100 Вт с шагом 50 Вт, длительность каждой ступени составляла 3 минуты). Работу выполняли до невозможности поддерживать заданную мощность. В процессе теста измеряли показатели газообмена на приборе Oxycon Pro (Viasis). Венозную кровь отбирали до и после тестирования. ЧСС регистрировали с помощью монитора

сердечного ритма Polar S610 (Polar). Концентрацию лактата определяли с использованием автоматического анализатора глюкозы и лактата C_Line (Biosen). Концентрацию биомаркеров в сыворотке (КФК, АЛТ, ACT и др.) определяли на автоматическом биохимическом анализаторе HumaStar 300 (Human). Уровень БТШ70 в сыворотке крови спортсменов измеряли с помощью системы на основе ИФА, разработанной ранее в лаборатории молекулярной физиологии ФГУ ВНИИФКа (Сахаров Д.А., 2009.).

Для выделения мРНК венозную кровь собирали в пробирки PAXgene Blood RNA Tube (PreAnalytiX). мРНК выделяли согласно протоколу производителя с использованием набора PAXgene Blood RNA Kit (PreAnalytiX). Для исключения отжига праймеров на геномной ДНК образцы обрабатывали ДНКазой. Качество выделенной мРНК - RIN (RNA Integrity Number) оценивали на биоанализаторе Agilent 2100 Bioanalyzer. Обратную транскрипцию проводили с использованием набора для обратной транскрипции (ЗАО «НПФ ДНК-Технология»).

В работе для получения моноклональных антител использовали: самок мышей линии Balb/c; полный и неполный адъюванты Фрейнда (ПАФ и НАФ). Гибридомы получали слиянием спленоцитов иммунных мышей с миеломой Sp2/0 в ПЭГ. Миеломные клетки sp2/0 и полученные гибридомные клетки культивировали на среде RPMI1640 (Sigma). МоноАТ выделяли из асцитных жидкостей с помощью преципитации сульфатом аммония и дальнейшей ионообменной хроматографии на колонке «Mono Q» (Pharmacia Fine Chemicals).

Для получения поликлональных антител после четырехкратной иммунизации кроликов белком у них отбирали венозную кровь и получали сыворотку. Для создания аффинных сорбентов и выделяли специфические поликлональные антитела использовали активированную сефарозу (Thermo). Связавшиеся специфические антитела элюировали 0,1М глицином с pH 2,5 и IM трис(гидроксиметил)аминометаном pH 9, затем доводили до нейтрального pH.

В методе иммуноферментного анализа (ИФА) использовали: поликлональные антитела против рекомбинантного СБ1, места неспецифического связывания блокировали раствором 3% сухого молока, конъюгат стрептавидин-пероксидазы или конъюгат антител козы против иммуноглобулинов кролика (Sigma), тетраметилбензидина в буфере, содержащем цитрат натрия, фосфата натрия, раствор H2SO4. Детекцию оптической плотности осуществляли на ИФА спектрофотометре xMark (Bio-Rad) при 450 нм.

Электрофоретическое разделение белков проводилось по системе Лэммли в денатурирующих условиях на приборе Mini-Protein Tetra Cell (Bio-Rad). Образны из полиакриламидного геля переносили на мембрану из поливиниледенфторида (ПВДФ) Immobilon-P (Millipore) полусухим методом с использованием прибора Semi Dry Trans-Blot Cell (Bio-Rad). Конечную реакцию хемилюминисценции проводили с помощью набора SuperSignal WestPico (Pierce, США), детектировали прибором ChemiDoc XRS (Bio-Rad, США). Полученные результаты обрабатывали с помощью программного пакета Quantity One (Bio-Rad, США).

Уровень специфических аутоиммунных антител в сыворотке спортсменов так же оценивали с помощью ИФА. Использовали рекомбипантные белки СБ1 и БТШ70, конъюгат антител козы против иммуноглобулинов человека с пераксидазой хрена («IMTEK»).

Данные, полученные в работе, обрабатывались с применением статистической программы STATISTICA7 (StatSoft). Для определения достоверности использовали U критерий Манна-Уитни (р <0,05).

Организация исследования

На первом этапе работы была задача получить аффинные поликлональные антитела кролик и моноклональные антитела мыши направленные против рекомбинантного белка СБ1 человека.

На втором этапе была разработана иммунохимическая тест-система, позволяющая определять уровень СБ1 в сыворотке человека.

На третьем этапе были определены концентраций СБ1/БТШ70 и проведен анализ экспрессии мРНК СБ1/БТШ70 в лейкоцитах крови спортсменов до и после нагрузочного тестирования со ступенчато повышающейся мощностью.

На четвертом этапе проводили оценку концентраций СБ1 и БТШ70 в сыворотке спортсменов в подготовительный период и исследовали уровень аутоиммунных антител к изучаемым белкам в сыворотке спортсменов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Получение антител, направленных против рекомбинантного человеческого белка СБ1

Рекомбинантный человеческий белок СБ1, были любезно предоставлен проф. Л.П. Сащенко (Учреждение Российской академии наук Институт биологии гена, Москва, Россия). Рекомбинантный человеческий белок БТШ70 был предоставлен

проф. А.Г. Габибовым (Институт биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова, Москва, Россия).

Молекулярный вес рекомбинантных белков больше на 0,9 кДа, так как на конце они содержат сопроводительную гексагистидиновую аминокислотную последовательность.

Для получения моноклональных антител проводили анализ иммуногенности бежа СБ1. С помощью программы ААРРгЫ (Давыдов Я.И., 2009), позволяющей предсказывать В-клеточные эпитопы на основе частоты аминокислотных пар и метода опорных векторов, было произведено биоинформатическое предсказание иммуногенности белка СБ1. Этот анализ показал, что белок имеет три наиболее иммуногенные области, к которым преимущественно вырабатываются антитела (Табл.1).

Таблица 1. Иммуногенные области белка СБ1

Номера а.к. Последовательность

14-21 LPPASQGC

52-59 ITAGSEEP

231-238 FSVLMRAM

Эти данные позволяют предположить, что полученные далее моноклональные антитела против белка СБ1 могут иметь разные эпитопы.

Для иммунизации мышей использовали рекомбинантный человеческий белок СБ1. Проводили пятикратную иммунизацию, при первой и второй иммунизации для усиления иммунного ответа использовали полный и неполный адьюванты Фрейнда.

Качество иммунизаций проверяли по титру антител в сыворотках с помощью иммуноферментного анализа (ИФА). После четвертой иммунизации титр антител в сыворотках, против соответствующего антигена, составлял не менее 1:100000.

В ходе слияния было получено 5 наиболее активных гибридом, стабильно продуцирующих моноклональные антитела против рекомбинантного СБ1 человека. Активность полученных и очищенных моноклональных антител из асцита проверяли в ИФА.

Для получения поликлональной сыворотки, кролики иммунизировались рекомбинантным белком СБ1. Для выделения специфических антител из сыворотки был создан аффинный сорбент, содержащий ковалентно иммобилизированный рекомбинантный белок СБ1 с концентрацией 1мг/мл, Сыворотки кроликов после

иммунизации объединяли и инкубировали с аффинным сорбентом. Связавшиеся антитела элюировали и фракции проверяли в ИФА с антигеном на плате.

Далее фракции, содержащие аффинные антитела, с помощью диализа переводили в фосфатносолевой буфер. Концентрацию и чистоту антител определяли с помощью спектрофотометра по поглощению при 280 нм и электрофоретического разделения белков.

Разработка иммунохимической системы определения СБ1 в сыворотке

Методики определения СБ1 в сыворотке крови мало изучены, для количественной оценки этого белка использовали два иммунохимических подхода: сэндвич-ИФА и иммунноблотинг.

Наиболее распространенной методикой определения концентраций белков в гетерогенных образцах является сэндвич-ИФА. Для разработки тест-системы с помощью выбранной методики ИФА использовали рекомбинантный кошаперон и в разных комбинациях моноклональные антитела, а также поликлональные аффинно-очищенные антитела.

В первой системе сэндвич-ИФА исследовали в разных комбинациях 5 полученных моноклональных антител, так как они могут иметь разные эпитопы на белке. Результаты экспериментов показали, что связывания реагентов и образования тройного сэндвич-комплекса антител с белком СБ1 не происходило. Вероятно это связанно с тем, что все специфические антигенные эпитопы на белке СБ1 уже были блокированы антителами, иммобилизированными на плате. Полученные результаты свидетельствуют о том, что все антитела направлены к одному или перекрывающимся эпитопам на белке СБ 1.

Во второй системе сэндвич-ИФА исследовали взаимодействие белка СБ1 с комбинациями разных антител.

Варианты комбинации систем: 1. На иммунологическую плату сорбировали поликлональные кроличьи антитела. Вторыми вносили моноклональные мышиные антитела. В данной комбинации антител специфического сигнала не наблюдается, вероятно из-за того, что поликлональные антитела взаимодействуя с белком СБ1, связываются со всеми доступными эпитопами, и тем самым закрывают доступ к эпитопу на белке для моноклональных антител.

2. На иммунологическую плату сорбировали поликлональные кроличьи антитела. Вторыми вносили поликлональные кроличьи антитела меченые биотином. В данной комбинации антител наблюдался высокий специфический сигнал.

3. На иммунологическую плату сорбировали моноклональные мышиные антитела. Вторыми вносили поликлональные кроличьи антитела. Взаимодействие антител с антигеном в представленном третьем варианте также сопровождалось высоким специфическим сигналом.

Однако при сравнении второго и третьего вариантов комбинаций было показано, что третий вариант, где моноклональные антитела сорбированны на плате и поликлональные антитела в растворе, наблюдается самый высокий специфический сигнал. Таким образом, была подобрана наиболее специфичная комбинация антител для белка СБ 1.

Для определения СБ1 в сыворотке человека сэндвич-ИФА проводили следующим образом: на иммунологическую плату сорбировали моноклональные антитела против рекомбинантного белка СБ1 в концентрации 3 мкг/мл. Исследуемые сыворотки наносили, разведенные в два раза и калибровку рекомбинантного белка СБ1 в концентрациях от 0 нг/мл до 90 нг/мл. После вносили поликлональные антитела, в концентрации 1 мкг/мл.

Разработанная тест-система позволяет определять рекомбинантный СБ1 в диапазоне концентраций от 5 до 90 нг/мл. Но при исследовании экспериментальных образцов сыворотки оказалось, что полученная система является недостаточно чувствительной (предел чувствительности 5 нг/мл). Содержание СБ1 в сыворотке колеблется в диапазоне от 0,7 до 4 нг/мл. Поэтому необходимо концентрирование белка.

Для концентрирования нативного СБ1 из сыворотки человека получали аффинные сорбенты, содержащие ковалентно иммобилизированные очищенные поликлональные антитела к рекомбинантному белку с концентрацией 0,5 мг/мл. Первоначально на одну точку измерения отбирали 50 мкл аффинного сорбента, что соответствует 25мкг антител, и 5 мл исследуемого образца сыворотки. Так как известно, что концентрация белка СБ1 может достигать 4 нг/мл, то в 5 мл сыворотки может содержаться 20нг белка. Поэтому аффинного сорбента, с ковалентно пришитыми антителами, для связывания всего бежа в сыворотке, брали в избытке. Стандарты для калибровки использовали в диапазоне концентраций от 0,5 нг/мл до 20 нг/мл. После всех инкубаций к сорбенту со связавшимся белком добавляли элюирующий буфер, и весь образец наносили на электрофоретический гель.

Уникальность этой методики в том, что она позволяет наносить на гель весь сконцентрированный белок без потерь.

Далее образцы из геля переносили на мембрану из поливиниледенфторида (ПВДФ) методом полусухого переноса. Иммуноблоттинг проводили с моноклональными и аффинно-очищенными поликлональными антителами к рекомбинантному белку СБ1.

Моноклональные антитела в иммуноблоттинге как с рекомбинантным белком, так и с нативным, содержащимся в сыворотке, дают слабый специфический сигнал. Возможно, это объясняется тем, что моноклональные антитела имеют конформационный эпитоп, который при денатуриции белка в иммуноблоттинге деформируется, тем самым влияет на аффинность антител.

Взаимодействие поликлональных антител с человеческим белком СБ1 представлено на Рис.1.

1 2 3 4

О 20 40 60 80 100 120 140 160 Интенсивность, o.e.

Б)

Рис. 1. Определение СБ1 в сыворотке крови человека. А) 1 - взаимодействие поликлональных антитела с сывороточным белком СБ1; 2-4- взаимодействие поликлональных антител с рекомбинантным белком, калибровка: 0,5 нг/мл, 5нг/мл, 20 нг/мл. Б) Калибровочный график после оцифровки.

Из полученных результатов видно, что в сыворотке присутствует четкий, специфический сигнал соответствующий уровню миграции белка СБ1- 40кДа. Это

подтверждает, что поликлональные аффинно-очшценные антитела, специфичны к сывороточному белку СБ1 человека.

Таким образом, можно заключить, что нами были получены специфичные, поликлональные антитела, взаимодействующие с человеческим белком СБ1. Удалось разработать иммуноаффинную методику детекции СБ1 в сыворотке крови человека на основе очищенных поликлональных антител кролика. Чувствительность разработанной системы позволяет детектировать 0,5 нг/мл белка СБ 1.

Определение уровня концентраций СБ1 и БТШ70 после нагрузочного тестирования со ступенчато повышающейся мощностью

В исследовании принимали участие 10 юношей, систематически занимающихся академической гребле и 10 юношей, систематически занимающихся лыжными гонками, более шести лет, квалификации не ниже KMC, относящихся к одной возрастной группе и имеющих свойственные специализации размеры тела (Табл.2.)

Таблица 2. Антропометрические данные участников исследования

Участники исследования Возраст, Лет Вес, Кг Рост, См

Академическая гребля 18,5±0,7 90,9± 11,2 19],9±4,3

Лыжные гонки 18,7±2,1 69,9±7,8 174,9±6,9

По результатам теста со ступенчато повышающейся мощностью спортсменов разбили на две группы. У гребцов и лыжников в первую группу вошли спортсмены показавшие время 1 > 21 минуты, а во вторую группу 1 < 21 минуты. Значение максимального потребления кислорода (МПК) были полученным по данным газоанализа (Табл.3). Таблица 3. Исследуемые группы спортсменов

Вид спорта Участники исследования Время работы, мин (р <0,02) МПК/кг (р <0,02)

Академическая гребля Группа 1 23:56 ±1:44 54,Ш,7

Группа 2 19:24±1 33 47,5±1,9

Лыжные гонки Группа 1 22:05±1 18 72±6,5

Группа 2 19:19±1 39 65±1,1

В сыворотке крови всех спортсменов до и после кратковременной высокоинтенсивной нагрузки определяли: креатининфосфокиназу (КФК), алашгааминотрансфераза (АЛТ), аспартатаминотрансфераза (ACT).

Активность АЛТ, ACT и КФК до начала и после окончания тестирования находилась в пределах среднефизиологических показателей, что говорит об отсутствии повреждений гепатоцитов, кардиомиоцитов и скелетной мускулатуры. Существенных отличий между спортсменами выявлено не было.

Далее в сыворотках спортсменов с помощью разработанной иммуноаффинной методики определяли концентрацию СБ1, а также уровень БТШ70 (Рис.2). Результаты исследования показали, что в первых группах, показавших лучшее время в тесте, до кратковременной высокоинтенсивной нагрузки БТШ70 составил 15,5±5,6 нг/мл, после нагрузки 16,6±5,8 нг/мл. Во вторых группах 13,6±3,3 нг/мл и 16,0±3,4 нг/мл, соответственно. Концентрация БТШ70 между группами отличается не значительно. Наблюдается тенденция к увеличению концентрации БТШ70 после нагрузки, однако эти изменения являются статистически недостоверным.

Рис.2. Концентрации А) БТШ70 и Б) СБ1 до и после кратковременной высокоинтенсивной нагрузки.

Уровень кошаперона до и после кратковременной высокоинтенсивной нагрузки в группах не изменялся и составлял 1,2±0,2 нг/мл.

Вероятно, СБ I не является белком, который участвует в срочной адаптации и не успевает выйти в сыворотку за такой короткий промежуток времени, БТШ70 в свою очередь выходить в сыворотку.

Экспрессия мРНК СБ1 после работы максимальной аэробной мощности

Известно, что в условиях физиологического стресса происходит увеличение экспрессии мРНК БТШ70 (Khassaf М., 2001; Сахаров 2009), для мРНК СБ1 аналогичные данные не рассматривались.

Для изучения экспрессии СБ1 (ген HSPBP1) в ответ на максимальную аэробную нагрузку у испытуемых отбирали кровь для выделения мРНК из лейкоцитов до и после высокоинтенсивной нагрузки. В качестве положительного контроля, свидетельствующего о том, что мы достигли физиологического стресса, определяли экспрессию мРНК БТШ70 (ген HSPA1A). В качестве внутреннего контроля экспрессии мРНК ПЦР проводили с использованием двух «housekeeping»reHOB - В2М, HPRT. Относительное увеличение экспрессии оценивали по отношению значений до и после тренировки, нормализованные на экспрессии генов В2М и HPRT. Качество выделенной мРНК - RIN (RNA Integrity Number) оценивали на биоанализаторе Agilent 2100 Bioanalyzer. Для всех образцов РНК RIN был выше 8, говорящий о том, что исходная РНК не фрагментирована. На Рис.3 представлены результаты анализа экспрессии генов

мРНК.

2,4

2,2

о 2,0

Г°~1 Лыжные гонки Ш Академическая гребля

HSPA1A

HSPBP1

Рис.3. Различия в экспрессии мРНК генов.

В результате кратковременной высокоинтенсивной нагрузки происходит статистически значимое (р <0,05) увеличение экспрессии мРНК БТШ70 в лейкоцитах, которое свидетельствует о запуске в клетке адаптивных процессов в ответ на физиологический стресс. На фоне изменения экспрессии БТШ70, экспрессии СБ1 не изменяется. Характер изменения экспрессии мРНК СБ1 и БТШ70 в лейкоцитах спортсменов занимающихся академической греблей и лыжными гонками одинаков.

Полученные данные подтверждают, СБ1 не вовлекается в процесс срочной адаптации, вероятно, он участвует в более сложных и длительных адаптационных реакциях в организме, на фоне БТШ70, который является индуцибельным белком, экспрессия его мРНК возрастает в ответ на физические нагрузки.

Определение уровня концентраций СБ1 и БТШ70 в сыворотке спортсменов в подготовительный период

На втором этапе, проводили исследование на протяжении подготовительного периода, который составил 28 дней. У всех участников исследования измеряли в сыворотке уровень БТШ70 и СБ1 в начале и в конце периода.

Оценка концентраций СБ1 и БТШ70 в сыворотках спортсменов занимающихся академической греблей (Рис. 4-5).

р- Ш 1

рЬШ иЬ . Щж

А Б

Рис.4. Концентрация СБ1 в двух группах спортсменов. Академическая гребля А) до и Б) после подготовительного периода.

Рис.5. Концентрация БТШ70 в двух группах спортсменов. Академическая гребля А) до и Б) после подготовительного периода.

После анализа на содержание СБ1 в группах было обнаружено, что его базальный уровень в начале четырехнедельного подготовительного периода в обеих группах достоверно не отличается: в первой группе 1,0±0,1 нг/мл, во второй группе 1,2±0,1 нг/мл. Однако к началу предсоревновательного периода у группы, показавшей лучший результаты в тестировании, концентрация СБ1 увеличилась 2,5±0,4 нг/мл, а у второй группы не изменилась 1,2±0,3 нг/мл (Рис.4).

В случае с БТШ70 (Рис.5) базальный уровень у групп вначале достоверно не отличался, в первой группе 14,5±4,8 нг/мл, во второй группе 13,5±2,1 нг/мл. После подготовительного периода концентрация БТШ70 у первой группы уменьшилась и составила 8,0±2,0 нг/мл, а у второй группы увеличилась 16,5±3,5 нг/мл (р <0,02).

У спортсменов занимающихся лыжными гонками наблюдается похожая картина изменения концентраций белков СБ1 и БТШ70. (Рис. 6-7).

А Б

Рис.6. Концентрация СБ1 в двух группах спортсменов. Лыжные гонки А) до и Б) после подготовительного периода.

30-.-.-----.-

25

~Г 20

15

го

га 1

Рис.7. Концентрация БТШ70 в двух группах спортсменов. Лыжные гонки А) до и Б) после подготовительного периода.

В начале подготовительного периода в обеих группах уровень СБ1 одинаковый: в первой группе 1,2±0,2 нг/мл, во второй группе 1,2±0,3 нг/мл. К началу предсоревновательного периода у первой группы СБ1 достоверно увеличился 2,3±0,7 нг/мл, а у второй группы не изменился 1,3±0,1 нг/мл (Рис.6).

В случае с БТШ70 (Рис.7) базальный уровень у групп в начала достоверно не отличается, в первой группе 18,5±6,0 нг/мл, во второй группе 15,0±4,0 нг/мл. После подготовительного периода концентрация БТШ70 у первой группы также уменьшилась и составила13,2±5,4 нг/мл, а у второй группы увеличилась 23,8±4,0 нг/мл (р <0,02).

На основе полученных данных видно, что в группах более подготовленных спортсменов в конце подготовительного периода уровень БТШ70 понижается и выходит на базальный уровень (11,3±4,б нг/мл) в то время как уровень СБ1 повышается (2,6±0,6 нг/мл). Это свидетельствует в пользу того факта, что СБ1 возможно является регулятором концентрации БТШ70 в сыворотке, при адаптации организма к стрессовым нагрузкам. У спортсменов, входящих в группы с более низкой подготовкой, концентрация БТШ70 увеличивается (19,2±5,б нг/мл), а концентрация СБ1 не изменяется (1,2±0,2 нг/мл), возможно, это говорит о менее активной реакции адаптации в ответ на стрессовые нагрузки.

Также надо заметить, что характер изменения концентрации СБ1 у спортсменов, занимающихся греблей и лыжными гонками одинакова, и в том и в другом случае На основании этого можно сделать предположение, что изменение концентрации СБ1 может являться маркером адаптивности спортсменов.

Вероятно, СБ1 может быть одним из белков регулирующих активные формы БТШ70 циркулирующих в сыворотке крови, а динамика концентраций СБ1 и БТШ70 может быть рассмотрена, как критерий оценки способности организма к адаптации.

Исследование уровня аутоиммунных антител направленных к белкам БТШ70 и его кошаперону СБ1 в сыворотке спортсменов

Регуляция СБ1/БТШ70 может осуществляться и их аутоиммунными антителами. Выявленная активация СБ1 на продолжительные физические нагрузки, вероятно, при определенных концентрациях влияет на аутоиммунный ответ, который является в свою очередь маркером состояния организма.

Исследование аутоиммунного ответа на белки СБ1 и БТШ70 проводили с образцами сывороток спортсменов в начале и конце тренировочного периода с помощью ИФА. В качестве первых реагентов на планшет сорбировали рекомбинантные белки СБ1 и БТШ70 в концентрации 5 мкг/мл. Иисследуемые сыворотки наносили в разведении 1:5,1:10,1:50и 1:100.

Результаты исследования показали, незначительное изменение уровня аутоантител к СБ1 и БТШ70 в начале и в конце тренировочного периода.

Однако при исследовании концентраций СБ1 и его аутоантител после тренировочного периода была обнаружена значимая корреляция между ними (р <0,02). Как видно на Рис. 8 при более высокой концентрации СБ1 у спортсмена концентрация его аутоантител также выше и наоборот.

1000

л о:

П

га &

х о 3

1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 Концентрация СБ1, нг/мл

1000

X

л

I

га к з:

го

I

5

Б)

1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 Концентрация СБ1, нг/мл

Рис. 8. Корреляция между базальной концентрацией СБ1 и его аутоантител в сыворотке спортсменов. А - Лыжные гонки (г2= 0,62; р <0,02). Б - Академическая гребля (г2= 0,80; р <0,002).

В начале тренировочного периода данной корреляции не наблюдали (г2= 0,10; р >0,05). Вероятно, появление корреляции является одним из способов приспособления организма, который отвечает на изменения концентраций белка СБ1 под воздействием физических нагрузок. Однако регуляция концентрации аутоантител является более сложным и многокомпонентным механизмом.

Таким образом кратковременный высокоинтенсивный стресс не вызывает изменения экспрессии и концентрации СБ1 в сыворотке. Тогда как по завершению четырехнедельного подготовительного периода наблюдается изменение концентрации БТШ70 и СБ1. При уменьшении концентрации БТШ70, концентрация СБ1 в сыворотке увеличивается. Установлена взаимосвязь концентраций этих белков в сыворотке с подготовленностью спортсменов. У более подготовленных спортсменов в конце подготовительного периода уровень СБ1 повышается, в то время как уровень БТШ70 снижается и выходит на базальный уровень, что говорит об адаптации организма к стрессовым нагрузкам и выходе спортсменов на пик своей спортивной формы.

Полученные данные позволяют предположить, что длительные физические нагрузки приводят к изменению концентрации кошаперона СБ1 в крови, а вследствие и концентрации БТШ70, как проявление механизма регуляции концентрации последнего. БТШ70 выходит в сыворотку, взаимодействуя с клетками иммунной системы, ингибирует их активность. Взаимодействие же кошаперона с АТФазным доменом БТШ70, влечет за собой конформационные изменения последнего, в результате чего происходит инактивация БТШ70. Вероятно, СБ1 может быть одним из белков регулирующих активные формы БТШ70 циркулирующих в сыворотке крови.

Исследование белков-маркеров стресса и изучение их регуляции позволит приблизиться к пониманию механизма адаптации организма в стрессовых условиях.

ВЫВОДЫ

1. Получены поликлональные аффинно-очищенные антитела кролика против рекомбинантного кошаперона СБ1 человека, специфично взаимодействуюпще как в ИФА так и в иммуноблотинге.

2. Разработана иммунно-аффинная тест-система на основе поликлональных антител, которая позволяет определять концентрацию СБ1 в сыворотке человека и использовать для мониторинга функционального состояния спортсмена.

3. Показано, что кратковременный высокоинтенсивный стресс не вызывает изменения экспрессии мРНК СБ1 в лейкоцитах и концентрации СБ1 в сыворотке.

4. Показано, что длительные физические нагрузки приводят к изменению концентрации СБ1 и БТШ70, направленность изменений зависит от уровня подготовленности спортсменов. У более подготовленных наблюдается увеличенне базальной концентрации СБ1 (2,6±0,6 нг/мл) и в тоже время уменьшение концентрации БТШ70 (11,3±4,6 нг/мл), у менее подготовленных концентрация СБ1 не изменяется (1,2±0,2 нг/мл), а концентрация БТШ70 увеличивается (19,2±5,б нг/мл).

5. Разработана тест-система, позволяющая определять уровень аутоантител СБ1. Показано, что в конце тренировочного периода появляется корреляция между концентрацией СБ1 и его аутоантителами, свидетельствующая о приспособлении организма к изменениям концентрации белков в течение тренировочного периода.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. При оценке функционального состояния организма следует учитывать, что к предсоревновательному периоду уровень СБ1 у более подготовленных спортсменов должен быть выше 2 нг/мл, при концентрации БТШ70 ниже 15 нг/мл.

2. Базальный уровень концентраций СБ1 и БТШ70, а также изменение соотношения их концентраций в процессе тренировок, являются маркерами адаптации организма спортсмена к физическим нагрузкам. Мониторинг этих показателей на регулярной основе может быть рекомендован к применению в образовательных учреждениях спортивного профиля и в медицинских центрах

сборных команд для оценки функциональных резервов спортсменов, активации молекулярных механизмов реакции организма, а также индивидуальной коррекции тренировочных курсов.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Гребешок, Е.С. Влияние шестичасового ультрамарафона на уровень 1Ь-6, Ь№ и вСЕ / А.Е. Донников, М.Ю. Шкурников, Е.Б. Акимов, С.А. Хаустова, Е.М. Шахматова, А.Г. Тоневицкий // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2009. - №147(11). - С. 573-575.

2. Гребенюк, Е.С. Работы по проведению проблемно-ориентированных поисковых исследований и созданию научно-технического задела в области геномных и постгеномных технологий создания лекарственных средств с участием научных организаций Германии / Я.И. Давыдов, Е.В. Трушкин, Е.А. Гудим, А.Г. Тоневицкий // Сборник тезисов "Живые системы". - 2009. - С. 124-125.

3. Гребенюк, Е.С. Предсказание эпитопов в близкородственных белках с помощью нового алгоритма / Я.И. Давыдов, С. Фидалго, С.А. Хаустова, В.Г. Лелянова, Ю.А. Ушкарев, А.Г. Тоневицкий // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2009. - №148(12). - С.628-632.

4. Гребенюк, Е.С. Экспрессия ранних генов иммунного ответа при физической нагрузке / В.А. Шлепцова, Е.В. Трушкин, О.А. Быстрых, Я.И. Давыдов, Н.П. Образцова, А.Г. Тоневицкий // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2010. - №148(1). - С.97-100.

Подписано в печать 24.03.2010 Формат бумаги 60x90/16 Усл.печ.л. 0,8 Тираж 100

Сдано в производство 25.03.2010 Бум.офсетная Усл.-изд.л. 0,9 Заказ № 642

Отпечатано в ООО «Петроруш». г.Москва ул. Палиха - 2а, тел. 250-92-06 www.postator.ru

 
 

Оглавление диссертации Гребенюк, Екатерина Сергеевна :: 2010 :: Москва

Введение.

Глава 1. Обзор литературы. Белок теплового шока с молекулярным весом 70кДа и его связывающий кошаперон СБ1.

Глава 2. Организация, материалы и методы исследования.

Собственные исследования

Глава 3. Получение моноклональных антител.

Глава 4. Получение поликлональных антител.

Глава 5. Разработка иммунохимической системы определения СБ1 в сыворотке.

Глава 6. Определение экспрессии мРНК белка СБ1 и уровня концентраций СБ1 и его белка мишени после нагрузочного тестирования со ступенчато повышающейся мощностью «до отказа».

Глава 7. Базальный уровень концентраций СБ1 и его белка мишени в сыворотке спортсменов в течение конечного мезоцикла подготовительного периода.

Глава 8. Исследование уровня аутоиммунных антител, направленных к белкам СБ1 и БТШ70 в сыворотке спортсменов.

 
 

Введение диссертации по теме "Восстановительная медицина, спортивная медицина, курортология и физиотерапия", Гребенюк, Екатерина Сергеевна, автореферат

Важнейшими составляющими спортивной успешности являются физическая подготовленность и адаптация спортсменов к мышечным нагрузкам на всех этапах спортивной деятельности. Современный спорт требует высоких результатов на грани физических возможностей человека, вследствие чего организм подвергается большому количеству стрессовых факторов: гипоксия, гипертермия, оксидативный стресс, воспаление и повреждение, изменение концентрации кальция и аденозинтрифосфата [Benjamin I.J., 1998; Whithman М., 2008], что обуславливает необходимость более детального мониторинга спортсменов в тренировочной и в восстановительной фазе, разработки новых критериев адаптации, позволяющих охарактеризовать эффективность не только систем срочной адаптации к интенсивным физическим нагрузкам, характерным для соревновательного периода, но и долгосрочной адаптации в процессе тренировочного периода.

Физические нагрузки являются сигналом для активации семейства белков теплового шока, так называемых белков-маркеров стресса. Главной функцией, которых является сворачивание синтезированных полипептидов, предотвращение денатурации белков, их агрегации [Soufi F.G., 2008].

Наиболее изученным является белок теплового шока с молекулярным весом 70кДа (БТШ70). Он является внутриклеточным белком, но в ответ на оксидативный стресс, повышение температуры, воспаление или физиологический стресс, его концентрация стремительно возрастает и в крови [Сахаров Д.А., 2009]. БТШ70 - АТФ-связывающий белок, обладающий АТФазной активностью. АТФ-связывающая форма белка имеет низкое сродство к денатурированному белку, в то время как АДФ форма напротив прочно связывается с поврежденным белком, восстанавливая его структуру. Поэтому АТФазная активность определяет функциональные возможности БТШ70.

БТШ70-связывающий белок - СБ1 является кошапероном БТШ70 и регулятором нуклеотидного обмена. Взаимодействие СБ1 с АТФазным доменом белка мишени (БТШ70) в клетке влечет за собой его конформационные изменения, в результате чего происходит инактивация БТШ70-зависимого восстановления структуры поврежденных белков [Raynes D.A., 1998]. Также было показано, что после запуска механизма секреции внеклеточных белков - шаперона БТШ70 и его кошаперона СБ 1 происходит активация рецептора ЭФР (эпидермальный фактор роста), который регулирует рост и пролиферацию клеток. Возможно, данная СБ1/БТШ70 зависимая активация рецептора может служить защитным механизмом для клеток в стрессовых условиях [Evdonin А., 2009].

Таким образом, физическая нагрузка приводит к увеличению концентрации БТШ70 [Locke М., 2002], функциональные возможности которого детерминируются изменением концентрации его кошаперона СБ1. Однако, до настоящего времени не определена роль белка СБ1 в сыворотке крови и не исследовано соотношение концентраций СБ1 и его белка мишени в крови спортсменов в условиях адаптации к физическим нагрузкам.

Гипотеза.

Предполагается, что физические нагрузки активируют механизм секреции семейства белков теплового шока и их кошаперонов. Адаптация к физическим нагрузкам различной длительности сопровождается изменением концентрации БТШ70, что приводит к увеличению концентрации его кошаперона СБ1 в крови. Белок СБ1 является новым маркером отражающим реакции адаптационных процессов. Исследование молекулярного маркера СБ1 и изучение его регуляции иммунохимически и на уровне транскрипции позволит приблизиться к пониманию механизмов адаптации спортсменов к физическим нагрузкам.

Цель исследования.

Изучение роли кошаперона СБ1 в процессе адаптации высококвалифицированных спортсменов к физическим нагрузкам различной длительности. Разработка новых критериев оценки адаптационных процессов на основе концентрации СБ1.

Задачи исследования;

1. Получить моноклональные и аффинные поликлональные антитела против человеческого рекомбинантного белка СБ1;

2. Разработать тест-систему определения концентрации СБ1 в сыворотке крови человека;

3. Проанализировать экспрессию мРНК гена СБ1 в лейкоцитах и концентрацию этого белка в сыворотке крови спортсменов под влиянием кратковременной физической нагрузки;

4. Исследовать влияние тренировочного мезоцикла на концентрации СБ1 и БТШ70 в сыворотке крови спортсменов. Разработать критерий оценки адаптационных процессов на основе концентрации СБ1;

5. Разработать тест-систему, позволяющую определять уровень аутоантител к СБ1 в сыворотке человека. Определить уровень аутоиммунных антител против СБ1 и БТШ70 в сыворотке спортсменов.

Объект исследования. Процессы молекулярно-биохимической адаптации организма спортсменов к напряженным физическим нагрузкам.

Предмет исследования. Система регуляции кошаперона и белка теплового шока.

Научная новизна.

Новизна работы состоит в исследовании изменения концентраций маркера адаптации СБ 1 под влиянием физических нагрузок.

Разработана иммуноаффинная методика определения кошаперона СБ1 в сыворотке человека. С использованием разработанной тест-системы впервые было показано, что работа со ступенчато повышающейся мощностью «до отказа» не вызывает изменения экспрессии и концентрации СБ1 в сыворотке на фоне увеличения экспрессии и концентрации его белка мишени. Впервые были получены данные об изменении концентрации СБ1 у спортсменов в течение тренировочного процесса. Впервые было показано, что соотношения концентраций СБ1 и БТШ70 является показателем адаптации спортсменов к физическим нагрузкам. У более выносливых спортсменов, за период длительного тренировочного процесса, уровень СБ1 повышается, в то время как уровень БТШ70 снижается и выходит на базальный уровень. У менее выносливых спортсменов за тот же период времени концентрация СБ1 не изменяется, на фоне увеличения концентрации БТШ70. Выявлена корреляция между кошапероном СБ1 и его аутоантителами.

Теоретическая значимость.

Данные исследования расширяют знания о фундаментальных основах процессов жизнедеятельности и восстановления организма на молекулярном уровне. Исследование новых белков-маркеров стресса и изучение их регуляции позволит приблизиться к пониманию механизмов адаптации, возникающих в стрессовых условиях и дальнейшего восстановления организма. Материалы исследования могут быть использованы в научно-исследовательских центрах медико-биологического профиля, в высших учебных заведениях.

Практическая значимость.

Разработанная иммуноаффинная методика позволит определять концентрацию кошаперона СБ1 в сыворотке. Установленная связь между концентрацией СБ1, БТШ70 и функциональными параметрами спортсменов, что является новым маркером подготовленности и адаптации к физическим нагрузкам. Расширенные возможности медико-биологического подхода, могут быть использованы для мониторинга реакции организма на стресс, рекомендовано к применению в учреждениях спортивного профиля и в медицинских центрах сборных команд для оценки функциональных резервов спортсменов, активации молекулярных механизмов адаптивной реакции организма, а также определения индивидуального прогресса спортсменов.

Результаты диссертации внедрены в работу Государственного образовательного учреждения Московского среднее специального училища олимпийского резерва (ГОУ МСС УОР) №2 г.Москвы отделения академической гребли и ООО «Союз биатлонистов России», что подтверждено актами внедрения.

Основные положения выносимые на защиту:

• Разработана высокочувствительная тест-система, на основе поликлональных антител, которая позволяет определять концентрацию белка СБ 1 в сыворотке крови;

• Изменение концентрации белка СБ1, под воздействием длительных физических нагрузок, является маркером долгосрочной адаптации;

• Выявлена обратная зависимость между концентрациями СБ1 и БТШ70 в сыворотке высококвалифицированных спортсменов в конце мезоцикла подготовительного периода. Предложен новый критерий оценки адаптационных возможностей организма.

 
 

Заключение диссертационного исследования на тему "Кошаперон белка теплового шока-маркер адаптации высококвалифицированных спортсменов к физической нагрузке"

Выводы

1. Получены поликлональные аффинно-очищенные и моноклональные антитела против кошаперона СБ1 человека.

2. Разработана иммуно-аффинная тест-система на основе поликлональных антител, которая позволяет определять концентрацию СБ1 в сыворотке человека и может быть использована для наблюдения за функциональным состоянием спортсмена.

3. Показано, что кратковременная высокоинтенсивная физическая нагрузка не вызывает изменения экспрессии мРНК СБ1 в лейкоцитах и концентрации СБ1 в сыворотке.

4. Показано, что длительные физические нагрузки приводят к изменению концентраций СБ1 и БТШ70. Направленность изменений зависит от функциональных показателей спортсменов в тесте со ступенчато повышающейся мощностью. У более выносливых наблюдается увеличение базальной концентрации СБ1 (2,5±0,6 нг/мл) и в тоже время уменьшение концентрации БТШ70 (11,0±4,3 нг/мл), у менее выносливых концентрация СБ1 не изменяется (1,2±0,2 нг/мл), а концентрация БТШ70 увеличивается (19,7±5,2 нг/мл). Предложен новый критерий оценки адаптационных возможностей организма, отражающий изменения концентраций в системе шаперон-кошаперон.

5. Разработана тест-система, позволяющая определять уровень аутоантител к СБ1 в сыворотке человека. Показано, что в конце тренировочного периода появляется корреляция между концентрацией СБ1 и его аутоантителами, свидетельствующая о приспособлении организма к изменениям концентрации белка в течение тренировочного периода.

Практические рекомендации

1. При оценке функционального состояния организма следует учитывать, что к концу последнего мезоцикла подготовительного периода уровень СБ1 у более подготовленных спортсменов должен быть выше 2 нг/мл, при концентрации БТШ70 ниже 15 нг/мл, у менее подготовленных концентрация СБ1 менее 1,5 нг/мл, а концентрация БТШ70 более 15 нг/мл.

2. Для характеристики адаптационных реакций организма нужно оценивать соотношение изменения базальных концентраций СБ1 к БТШ70 в начале и конце мезоцикла. У более подготовленных спортсменов это соотношение превышает единицу, у менее подготовленных - меньше единицы. Мониторинг этих показателей рекомендован к применению в учреждениях спортивного профиля и в медицинских центрах сборных команд для оценки функциональных особенностей спортсменов, активации молекулярных механизмов реакции организма, а также определения индивидуального прогресса спортсменов.

3. Для оценки концентраций СБ1 в сыворотке спортсменов рекомендуется использовать предложенную методику определения этого белка.

 
 

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2010 года, Гребенюк, Екатерина Сергеевна

1. Шаталов Ю.В. Hsp70 образует стабильный цитотоксический комплекс с Tag7/PGRP-S / Ю.В. Шаталов, Е.А. Духанина, А.В. Демин, C.JI. Киселев, Н.В. Гнучев // Доклады Академии наук. -2004.-№395. С.270-273.

2. Abe М. Plasma levels of heat shock protein 70 in patients with prostate cancer: a potential biomarker for prostate cancer / M. Abe, J.B. Manola, W.K. Oh, D.L. Parslow, D.J. George, C.L. Austin, P.W. Kantoff// Clin Prostate Cancer. 2004. - №3. - P.49-53.

3. Andrei C. The secretory route of the leaderless protein interleukin lbeta involves exocytosis of endolysosome-related vesicles / C. Andrei, C. Dazzi, L. Lotti, M.R. Torrisi, G. Chimini, A. Rubartelli // Mol Biol Cell. 1999. - №10. - P. 1463-1475.

4. Andrei C. Phospholipases С and A2 control lysosome-mediated IL-1 beta secretion: Implications for inflammatory processes / C. Andrei, P.

5. Margiocco, A. Poggi, L.V. Lotti, M.R. Torrisi, A. Rubartelli // Proc Natl Acad Sci USA.- 2004. №101. - P.9745-9750.

6. Arispe N. ATP and ADP modulate a cation channel formed by Hsc70 in acidic phospholipid membranes / N. Arispe, A. De Maio // J Biol Chem. 2000. - №275. - P.30839-30843.

7. Arispe N. Hsc70 and Hsp70 interact with phosphatidylserine on the surface of PC 12 cells resulting in a decrease of viability / N. Arispe, M. Doh, O. Simakova, B. Kurganov, A. De Maio // FASEB J. 2004. -№18. - P.1636-1645.

8. Asea A. Mechanisms of HSP72 release / A. Asea // J Biosci. 2007. -№32. - P.579-584.

9. Asea A. Stress proteins and initiation of immune response: chaperokine activity of hsp72 / A. Asea // Exerc Immunol Rev. -2005.-№11. P.34-45.

10. Asea A. HSP70 peptidembearing and peptide-negative preparations act as chaperokines / A. Asea, E. Kabingu, M.A. Stevenson, S.K. Calderwood // Cell Stress Chaperones. 2000. - №5. - P.425-431.

11. Basu S. CD91 is a common receptor for heat shock proteins gp96, hsp90, hsp70, and calreticulin / S. Basu, R.J. Binder, T. Ramalingam, P.K. Srivastava// Immunity. 2001. - №14. - P.303-313.

12. Becker T. CD40, an extracellular receptor for binding and uptake of Hsp70-peptide complexes / T. Becker, F.U. Hartl, F. Wieland // J Cell Biol.-2002.-№158. P.1277-1285.

13. Beere H.M. "The stress of dying": the role of heat shock proteins in the regulation of apoptosis / H.M. Beere // J Cell Sci. 2004. - №117. - P.2641-2651.

14. Bimston D. BAG-1, a negative regulator of Hsp70 chaperone activity, uncouples nucleotide hydrolysis from substrate release / D. Bimston, J. Song, D. Winchester, S. Takayama, J.C. Reed, R.I. Morimoto // EMBO J. 1998.-№17. - P.6871-6878.

15. Broquet A.H. Expression of the molecular chaperone Hsp70 in detergent-resistant microdomains correlates with its membrane delivery and release / A.H. Broquet, G. Thomas, J. Masliah, G. Trugnan, M. Bachelet // J Biol Chem. 2003. - №278. - P.21601-21606.

16. Bukau B. Getting newly synthesized proteins into shape / B. Bukau, E. Deuerling, C. Pfund, E.A. Craig // Cell. 2000. - №101. - P.119-122.

17. Calderwood S.K. Extracellular heat shock proteins in cell signaling and immunity / S.K. Calderwood, S.S. Mambula, P.J. Gray, Jr. // Ann N Y Acad Sci. 2007. - №1113. - P.28-39.

18. Chen S. Translocation of constitutively expressed heat shock protein Hsc70 to synapse-enriched areas of the cerebral cortex after hyperthermic stress / S. Chen, I.R. Brown // J Neurosci Res. 2007. -№85. - P.402-409.

19. Demand J. Cooperation of a ubiquitin domain protein and an E3 ubiquitin ligase during chaperone/proteasome coupling / J. Demand, S. Alberti, C. Patterson, J. Hohfeld // Curr Biol. 2001. - №11. -P.1569-1577.

20. Evdonin A. Extracellular HspBPl and Hsp72 synergistically activate epidermal growth factor receptor / A. Evdonin, A. Kinev, N. Tsupkina, V. Guerriero, D.A. Raynes, N. Medvedeva // Biol Cell. -2009.-№101. P.351-360.

21. Febbraio M.A. HSP72 gene expression progressively increases in human skeletal muscle during prolonged, exhaustive exercise / M.A. Febbraio, I. Koukoulas // J Appl Physiol. 2000. - №89. - P. 10551060.

22. Febbraio M.A. Exercise induces hepatosplanchnic release of heat shock protein 72 in humans / M.A. Febbraio, P. Ott, H.B. Nielsen, A. Steensberg, C. Keller, P. Krustrup, N.H. Secher, B.K. Pedersen // J Physiol. 2002. - №544. - P.957-962.

23. Fehrenbach E. Influence of different types of exercise on the expression of haem oxygenase-1 in leukocytes / E. Fehrenbach, A.M. Niess, F. Passek, S. Sorichter, A. Schwirtz, A. Berg, H.H. Dickhuth, H. Northoff// J Sports Sci. 2003. - №21. - P.383-389.

24. Fehrenbach E. Transcriptional and translational regulation of heat shock proteins in leukocytes of endurance runners / E. Fehrenbach, A.M. Niess, E. Schlotz, F. Passek, H.H. Dickhuth, H. Northoff // J Appl Physiol. 2000. - №89. - P.704-710.

25. Fehrenbach E. Exercise intensity and duration affect blood soluble HSP72 / E. Fehrenbach, A.M. Niess, K. Voelker, H. Northoff, F.C. Mooren // Int J Sports Med. 2005. - №26. - P.552-557.

26. Fehrenbach E. Free radicals, exercise, apoptosis, and heat shock proteins / E. Fehrenbach, H. Northoff // Exerc Immunol Rev. 2001. -№7. - P.66-89.

27. Fehrenbach E. HSP expression in human leukocytes is modulated by endurance exercise / E. Fehrenbach, F. Passek, A.M. Niess, H. Pohla, C. Weinstock, H.H. Dickhuth, H. Northoff// Med Sci Sports Exerc. -2000. №32. - P.592-600.

28. Fischer C.P. Vitamin E isoform-specific inhibition of the exercise-induced heat shock protein 72 expression in humans / C.P. Fischer, N.J. Hiscock, S. Basu, B. Vessby, A. Kallner, L.B. Sjoberg, M.A.

29. Febbraio, B.K. Pedersen // J Appl Physiol. 2006. - №100. - P.1679-1687.

30. Flaherty K.M. Three-dimensional structure of the ATPase fragment of a 70K heat-shock cognate protein / K.M. Flaherty, C. DeLuca-Flaherty, D.B. McKay // Nature. 1990. - №346. - P.623-628.

31. Fleshner M. Cat exposure induces both intra- and extracellular Hsp72: the role of adrenal hormones / M. Fleshner, J. Campisi, L. Amiri, D.M. Diamond // Psychoneuroendocrinology. 2004. - №29.1. P.1142-1152.

32. Fleshner M. Endogenous extra-cellular heat shock protein 72: releasing signal(s) and function / M. Fleshner, J.D. Johnson // Int J Hyperthermia. 2005. - №21. - P.457-471.

33. Floto R.A. Dendritic cell stimulation by mycobacterial Hsp70 is mediated through CCR5 / R.A. Floto, P.A. MacAry, J.M. Boname, T.S. Mien, B. Kampmann, J.R. Hair, O.S. Huey, E.N. Houben, J. Pieters, C. Day // Science. 2006. - №314. - P.454-458.

34. Frydman J. Folding of newly translated proteins in vivo: the role of molecular chaperones / J. Frydman // Annu Rev Biochem. 2001. -№70. - P.603-647.

35. Gallucci S. Natural adjuvants: endogenous activators of dendritic cells / S. Gallucci, M. Lolkema, P. Matzinger // Nat Med. 1999. - №5. -P.1249-1255.

36. Gottwald E. Expression of the cochaperone HspBPl is not coordinately regulated with Hsp70 expression / E. Gottwald, M.

37. Herschbach, В. Lahni, R.L. Miesfeld, S. Kunz, D.A. Raynes, V. Guerriero // Cell Biol Int. 2006. - №30. - P.553-558.

38. Graner M.W. The heat shock response and chaperones/heat shock proteins in brain tumors: surface expression, release, and possible immune consequences / M.W. Graner, R.I. Cumming, D.D. Bigner // J Neurosci. 2007. - №27. - P. 11214-11227.

39. Gromov P.S. Identification of two molecular chaperons (HSX70, HSC70) in mature human erythrocytes / P.S. Gromov, J.E. Celis // Exp Cell Res. 1991. - №195. - P.556-559.

40. Gross C. Interaction of heat shock protein 70 peptide with NK cells involves the NK receptor CD94 / C. Gross, D. Hansch, R. Gastpar, G. Multhoff// Biol Chem. 2003. - №384. - P.267-279.

41. Harrison C.J. Crystal structure of the nucleotide exchange factor GrpE bound to the ATPase domain of the molecular chaperone DnaK / C.J. Harrison, M. Hayer-Hartl, M. Di Liberto, F. Hartl, J. Kuriyan // Science. 1997. -№276. -P.431-435.

42. Hartl F.U. Molecular chaperones in the cytosol: from nascent chain to folded protein / F.U. Hartl, M. Hayer-Hartl // Science. 2002. - №295. - P.l852-1858.

43. Hightower L.E. Selective release from cultured mammalian cells of heat-shock (stress) proteins that resemble glia-axon transfer proteins / L.E. Hightower, P.T. Guidon, Jr. // J Cell Physiol. 1989. - №138. -P.257-266.

44. Hohfeld J. GrpE-like regulation of the hsc70 chaperone by the anti-apoptotic protein BAG-1 / J. Hohfeld, S. Jentsch // EMBO J. 1997. -№16. - P.6209-6216.

45. Hohfeld J. Hip, a novel cochaperone involved in the eukaryotic Hsc70/Hsp40 reaction cycle / J. Hohfeld, Y. Minami, F.U. Hartl // Cell. 1995.-№83. - P.589-598.

46. Hunter-Lavin C. Hsp70 release from peripheral blood mononuclear cells / C. Hunter-Lavin, E.L. Davies, M.M. Bacelar, M.J. Marshall, S.M. Andrew, J.H. Williams // Biochem Biophys Res Commun. -2004.-№324. -P.511-517.

47. Ianaro A. HSFl/hsp72 pathway as an endogenous anti-inflammatory system / A. Ianaro, A. Ialenti, P. Maffia, B. Pisano, M. Di Rosa // FEBS Lett. 2001. - №499. - P.239-244.

48. Ireland H.E. Measuring the secretion of heat shock proteins from cells / H.E. Ireland, F. Leoni, O. Altaie, C.S. Birch, R.C. Coleman, C. Hunter-Lavin, J.H. Williams // Methods. 2007. - №43. - P. 176-183.

49. Jaattela M. Heat-shock proteins protect cells from monocyte cytotoxicity: possible mechanism of self-protection / M. Jaattela, D. Wissing // J Exp Med. 1993. - №177. - P.231-236.

50. Johnson B.D. Hop modulates Hsp70/Hsp90 interactions in protein folding / B.D. Johnson, R.J. Schumacher, E.D. Ross, D.O. Toft // J Biol Chem. 1998. - №273. - P.3679-3686.

51. Johnson J.D. Releasing signals, secretory pathways, and immune function of endogenous extracellular heat shock protein 72 / J.D. Johnson, M. Fleshner // J Leukoc Biol. 2006. - №79. - P.425-434.

52. Kabani M. Nucleotide exchange factor for the yeast Hsp70 molecular chaperone Ssalp / M. Kabani, J.M. Beckerich, J.L. Brodsky // Mol Cell Biol. 2002. - №22. - P.4677-4689.

53. Kabani M. Slslp stimulates Sec63p-mediated activation of Kar2p in a conformation-dependent manner in the yeast endoplasmic reticulum / M. Kabani, J.M. Beckerich, C. Gaillardin // Mol Cell Biol. 2000. -№20. - P.6923-6934.

54. Kabani M. HspBPl, a homologue of the yeast Fesl and Slsl proteins, is an Hsc70 nucleotide exchange factor / M. Kabani, C. McLellan, D.A. Raynes, V. Guerriero, J.L. Brodsky // FEBS Lett. 2002. -№531. - P.339-342.

55. Khassaf M. Time course of responses of human skeletal muscle to oxidative stress induced by nondamaging exercise / M. Khassaf, R.B. Child, A. McArdle, D.A. Brodie, C. Esanu, M.J. Jackson // J Appl Physiol. 2001. - №90. - P. 1031-1035.

56. Kluger M.J. Effect of heat stress on LPS-induced fever and tumor necrosis factor / M.J. Kluger, K. Rudolph, D. Soszynski, C.A. Conn, L.R. Leon, W. Kozak, E.S. Wallen, P.L. Moseley // Am J Physiol. -1997.-№273. P. 858-863.

57. Kneller D.G. Improvements in protein secondary structure prediction by an enhanced neural network / D.G. Kneller, F.E. Cohen, R. Langridge//J Mol Biol. 1990. -№214. -P.171-182.

58. Kregel K.C. Heat shock proteins: modifying factors in physiological stress responses and acquired thermotolerance / K.C. Kregel // J Appl Physiol. 2002. - №92. - P.2177-2186.

59. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 / U.K. Laemmli // Nature. 1970. -№227. - P.680-685.

60. Lakhotia S.C. Regulation of heat shock proteins, Hsp70 and Hsp64, in heat-shocked Malpighian tubules of Drosophila melanogaster larvae / S.C. Lakhotia, P. Srivastava, K.V. Prasanth // Cell Stress Chaperones. -2002. №7. - P.347-356.

61. Lamb D J. Molecular mimicry in atherosclerosis: a role for heat shock proteins in immunisation / DJ. Lamb, W. El-Sankary, G.A. Ferns // Atherosclerosis. 2003. - №167. - P. 177-185.

62. Lancaster G.I. Exosome-dependent trafficking of HSP70: a novel secretory pathway for cellular stress proteins / G.I. Lancaster, M.A. Febbraio // J Biol Chem. 2005. - №280. - P.23349-23355.

63. Lancaster G.I. Exercise induces the release of heat shock protein 72 from the human brain in vivo / G.I. Lancaster, K. Moller, B. Nielsen, N.H. Secher, M.A. Febbraio, L. Nybo // Cell Stress Chaperones. -2004.-№9. P.276-280.

64. Lee W.C. Heat shock protein 72 overexpression protects against hyperthermia, circulatory shock, and cerebral ischemia during heatstroke / W.C. Lee, H.C. Wen, C.P. Chang, M.Y. Chen, M.T. Lin // J Appl Physiol. 2006. - №100. - P.2073-2082.

65. Lewis M.J. Involvement of ATP in the nuclear and nucleolar functions of the 70 kd heat shock protein / M.J. Lewis, H.R. Pelham // EMBO J. 1985. - №4. - P.3137-3143.

66. Li Z. Roles of heat-shock proteins in antigen presentation and cross-presentation / Z. Li, A. Menoret, P. Srivastava // Curr Opin Immunol. -2002.-№14. P.45-51.

67. Liu Y. Human skeletal muscle HSP70 response to training in highly trained rowers / Y. Liu, S. Mayr, A. Opitz-Gress, C. Zeller, W. Lormes, S. Baur, M. Lehmann, J.M. Steinacker // J Appl Physiol. -1999.-№86. P.101-104.

68. Liu Y. Changes in skeletal muscle heat shock proteins: pathological significance / Y. Liu, J.M. Steinacker // Front Biosci. 2001. - №6. -P. 12-25.

69. Mackey M.F. The role of CD40/CD154 interactions in the priming, differentiation, and effector function of helper and cytotoxic T cells / M.F. Mackey, R.J. Barth, Jr., R.J. Noelle // J Leukoc Biol. 1998. -№63. -P.418-428.

70. Malhotra V. Interactions between the heat shock response and the nuclear factor-kappaB signaling pathway / V. Malhotra, H.R. Wong // Crit Care Med. 2002. - №30. - P.89-95.

71. Maloyan A. beta-Adrenergic signaling and thyroid hormones affect HSP72 expression during heat acclimation / A. Maloyan, M. Horowitz // J Appl Physiol. 2002. - №93. - P. 107-115.

72. Mambula S.S. Heat shock protein 70 is secreted from tumor cells by a nonclassical pathway involving lysosomal endosomes / S.S. Mambula, S.K. Calderwood // J Immunol. 2006. - №177. - P.7849-7857.

73. Marini M. Oxygen radicals induce stress proteins and tolerance to oxidative stress in human lymphocytes / M. Marini, F. Frabetti, D. Musiani, C. Franceschi // Int J Radiat Biol. 1996. - №70. - P.337-350.

74. Matz J.M. Adrenergic regulation of the heat shock response in brown adipose tissue / J.M. Matz, K.P. LaVoi, M.J. Blake // J Pharmacol Exp Ther.- 1996.-№277. P.1751-1758.

75. Mayer M.P. Hsp70 chaperone machines / M.P. Mayer, D. Brehmer, C.S. Gassier, B. Bukau // Adv Protein Chem. 2001. - №59. - P. 1-44.

76. McLellan C.A. HspBPl, an Hsp70 cochaperone, has two structural domains and is capable of altering the conformation of the Hsp70 ATPase domain / C.A. McLellan, D.A. Raynes, V. Guerriero // J Biol Chem. 2003. - №278. - P.19017-19022.

77. Millar D.G. Hsp70 promotes antigen-presenting cell function and converts T-cell tolerance to autoimmunity in vivo / D.G. Millar, K.M. Garza, B. Odermatt, A.R. Elford, N. Ono, Z. Li, P.S. Ohashi // Nat Med.-2003.-№9. P.1469-1476.

78. Morton J.P. The exercise-induced stress response of skeletal muscle, with specific emphasis on humans / J.P. Morton, A.C. Kayani, A. McArdle, B. Drust // Sports Med. 2009. - №39. - P.643-662.

79. Moseley P.L. Nitric oxide and the stress response—two 2-edged swords swung together / P.L. Moseley // Exerc Sport Sci Rev. 2009. -№37. -P.57.

80. Muller E. Interaction between tumor necrosis factor-alpha and HSP 70 in human leukemia cells / E. Muller, R. Munker, R. Issels, W. Wilmanns // Leuk Res. 1993. - №17. - P.523-526.

81. Multhoff G. Activation of natural killer cells by heat shock protein 70 / G. Multhoff// Int J Hyperthermia. 2002. - №18. - P.576-585.

82. Nickel W. Unconventional secretory routes: direct protein export across the plasma membrane of mammalian cells / W. Nickel // Traffic. 2005. - №6. - P.607-614.

83. Niess A.M. DNA damage after exhaustive treadmill running in trained and untrained men / A.M. Niess, A. Hartmann, M. Grunert-Fuchs, B. Poch, G. Speit // Int J Sports Med. 1996. - №17. - P.397-403.

84. Pal A. Heat modifiability of outer membrane protein of Pasteurella multocida serotype B:2 / A. Pal, S.K. Srivastava, V.P. Singh // Indian J Exp Biol. 2002. - №40. - P.106-108.

85. Panjwani N.N. Heat shock proteins gp96 and hsp70 activate the release of nitric oxide by APCs / N.N. Panjwani, L. Popova, P.K. Srivastava // J Immunol. 2002. - №168. - P.2997-3003.

86. Petersen R. The Drosophila hsp70 message is rapidly degraded at normal temperatures and stabilized by heat shock / R. Petersen, S. Lindquist//Gene. 1988. -№72. -P.161-168.

87. Pittet J.F. Serum levels of Hsp 72 measured early after trauma correlate with survival / J.F. Pittet, H. Lee, D. Morabito, M.B. Howard, W.J. Welch, R.C. Mackersie // J Trauma. 2002. - №52. -P.611-617.

88. Pockley A.G. Detection of heat shock protein 70 (Hsp70) and anti-Hsp70 antibodies in the serum of normal individuals / A.G. Pockley, J. Shepherd, J.M. Corton // Immunol Invest. 1998. - №27. - P.367-377.

89. Pockley A.G. Circulating heat shock protein 60 is associated with early cardiovascular disease / A.G. Pockley, R. Wu, C. Lemne, R. Kiessling, U. de Faire, J. Frostegard // Hypertension. 2000. - №36. -P.303-307.

90. Puntschart A. Hsp70 expression in human skeletal muscle after exercise / A. Puntschart, M. Vogt, H.R. Widmer, H. Hoppeler, R. Billeter // Acta Physiol Scand. 1996. - №157. - P.411-417.

91. Quintana F.J. Heat shock proteins as endogenous adjuvants in sterile and septic inflammation / F.J. Quintana, I.R. Cohen // J Immunol. -2005. №175. - P.2777-2782.

92. Radons J. Immunostimulatory functions of membrane-bound and exported heat shock protein 70 / J. Radons, G. Multhoff // Exerc Immunol Rev. 2005.-№11. - P. 17-33.

93. Raynes D.A. Increased expression of the Hsp70 cochaperone HspBPl in tumors / D.A. Raynes, M.W. Graner, R. Bagatell, C. McLellan, V. Guerriero // Tumour Biol. 2003. - №24. - P.281-285.

94. Raynes D.A. Inhibition of Hsp70 ATPase activity and protein renaturation by a novel Hsp70-binding protein / D.A. Raynes, V. Guerriero, Jr. // J Biol Chem. 1998. - №273. - P.32883-3288.

95. Raynes D.A. Isolation and characterization of isoforms of HspBPl, inhibitors of Hsp70 / D.A. Raynes, V. Guerriero // Biochim Biophys Acta. 2000. - №1490. - P.203-207.

96. Ryan A.J. Acute heat stress protects rats against endotoxin shock / A.J. Ryan, S.W. Flanagan, P.L. Moseley, C.V. Gisolfi // J Appl Physiol. 1992. -№73. - P.1517-1522.

97. Ryan A.J. Synthesis of 70K stress protein by human leukocytes: effect of exercise in the heat / A.J. Ryan, C.V. Gisolfi, P.L. Moseley // J Appl Physiol. 1991. - №70. - P.466-471.

98. Sashchenko L.P. Cytotoxic T lymphocytes carrying a pattern recognition protein Tag7 can detect evasive, HLA-negative but Hsp70-exposing tumor cells, thereby ensuring FasL/Fas-mediated contact killing / L.P. Sashchenko, E.A. Dukhanina, Y.V. Shatalov,

99. D.V. Yashin, T.I. Lukyanova, O.D. Kabanova, E.A. Romanova, S.V. Khaidukov, A.V. Galkin, N.V. Gnuchev // Blood. 2007. - №110. -P.1997-2004.

100. Sharp F.R. Heat-shock protein protection / F.R. Sharp, S.M. Massa, R.A. Swanson // Trends Neurosci. 1999. - №22. - P.97-99.

101. Shastry S. HSP70 and HSP90 expression in leucocytes after exercise in moderately trained humans / S. Shastry, D.O. Toft, M.J. Joyner // Acta Physiol Scand. 2002. - №175. - P. 139-146.

102. Sondermann H. Structure of a Bag/Hsc70 complex: convergent functional evolution of Hsp70 nucleotide exchange factors / H.

103. Sondermann, С. Scheufler, С. Schneider, J. Hohfeld, F.U. Hartl, I. Moarefi // Science. 2001. - №291. - P.1553-1557.

104. Srivastava P. Interaction of heat shock proteins with peptides and antigen presenting cells: chaperoning of the innate and adaptive immune responses / P. Srivastava // Annu Rev Immunol. 2002. -№20. - P.395-425.

105. Srivastava P. Roles of heat-shock proteins in innate and adaptive immunity / P. Srivastava // Nat Rev Immunol. 2002. - №2. - P. 185194.

106. Steel R. Hsp72 inhibits apoptosis upstream of the mitochondria and not through interactions with Apaf-1 / R. Steel, J.P. Doherty, K. Buzzard, N. Clemons, С .J. Hawkins, R.L. Anderson // J Biol Chem. -2004.-№279. P.51490-51499.

107. Sun L. Activation of HSF and selective increase in heat-shock proteins by acute dexamethasone treatment / L. Sun, J. Chang, S.R. Kirchhoff, A.A. Knowlton // Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2000. -№278. - P.1091-1097.

108. Suzuki K. Changes in markers of muscle damage, inflammation and HSP70 after an Ironman Triathlon race / K. Suzuki, J. Peake, K. Nosaka, M. Okutsu, C.R. Abbiss, R. Surriano, D. Bishop, M.J. Quod,

109. H. Lee, D.T. Martin // Eur J Appl Physiol. 2006. - №98. - P.525-534.

110. Theriault J.R. Extracellular HSP70 binding to surface receptors present on antigen presenting cells and endothelial/epithelial cells / J.R. Theriault, S.S. Mambula, T. Sawamura, M.A. Stevenson, S.K. Calderwood//FEBS Lett. 2005. -№579. - P.1951-1960.

111. Tonkiss J. Regulation of heat shock gene transcription in neuronal cells / J. Tonkiss, S.K. Calderwood // Int J Hyperthermia. 2005. -№21. -P.433-444.

112. Udelsman R. Adrenergic regulation of adrenal and aortic heat shock protein / R. Udelsman, D.G. Li, C.A. Stagg, C.B. Gordon, R. Kvetnansky // Surgery. 1994. - №116. - P. 177-182.

113. Vabulas R.M. HSP70 as endogenous stimulus of the Toll/interleukin-1 receptor signal pathway / R.M. Vabulas, P. Ahmad-Nejad, S. Ghose, C.J. Kirschning, R.D. Issels, H. Wagner // J Biol Chem. 2002. -№277. - P.15107-15112.

114. Visintin A. Regulation of Toll-like receptors in human monocytes and dendritic cells / A. Visintin, A. Mazzoni, J.H. Spitzer, D.H. Wyllie, S.K. Dower, D.M. Segal // J Immunol. 2001. - №166. - P.249-255.

115. Vogt M. Molecular adaptations in human skeletal muscle to endurance training under simulated hypoxic conditions / M. Vogt, A. Puntschart, J. Geiser, C. Zuleger, R. Billeter, H. Hoppeler // J Appl Physiol.-2001.-№91. P. 173-182.

116. Walsh R.C. Exercise increases serum Hsp72 in humans / R.C. Walsh, I. Koukoulas, A. Garnham, P.L. Moseley, M. Hargreaves, M.A. Febbraio // Cell Stress Chaperones. 2001. - №6. - P.386-393.

117. Wang M.H. Forced expression of heat-shock protein 70 increases the secretion of Hsp70 and provides protection against tumour growth / M.H. Wang, M.E. Grossmann, C.Y. Young // Br J Cancer. 2004. -№90. - P.926-931.

118. Watkins A.M. Heat acclimation and HSP-72 expression in exercising humans / A.M. Watkins, D.J. Cheek, A.E. Harvey, K.E. Blair, J.B. Mitchell // Int J Sports Med. 2008. - №29. - P.269-276.

119. Whitham M. Effect of blood handling on extracellular Hsp72 concentration after high-intensity exercise in humans / M. Whitham, M.B. Fortes // Cell Stress Chaperones. 2006. - №11. - P.304-308.

120. Whitham M. Heat shock protein 72: release and biological significance during exercise / M. Whitham, M.B. Fortes // Front Biosci. 2008. - №13. - P.1328-1339.

121. Whitham M. Leukocyte heat shock protein expression before and after intensified training / M. Whitham, S.L. Halson, G.I. Lancaster, M.

122. Gleeson, A.E. Jeukendrup, A.K. Blannin // Int J Sports Med. 2004. -№25. - P.522-527.

123. Wick G. Atherosclerosis—an autoimmune disease due to an immune reaction against heat-shock protein 60 / G. Wick // Herz. 2000. -№25. - P.87-90.

124. Wright B.H. Elevated levels of circulating heat shock protein 70 (Hsp70) in peripheral and renal vascular disease / B.H. Wright, J.M. Corton, A.M. El-Nahas, R.F. Wood, A.G. Pockley // Heart Vessels. -2000.-№15. P.18-22.

125. Xu Q. The role of heat shock proteins in protection and pathophysiology of the arterial wall / Q. Xu, G. Wick // Mol Med Today. 1996. - №2. - P.372-379.

126. Young J.C. More than folding: localized functions of cytosolic chaperones / J.C. Young, J.M. Barral, F. Ulrich Hartl // Trends Biochem Sci. 2003. - №28. - P.541-547.i

127. Zeiner M. Mammalian protein RAP46: an interaction partner and modulator of 70 kDa heat shock proteins / M. Zeiner, M. Gebauer, U. Gehring // EMBO J. 1997. - №16. - P.5483-5490.

128. Zhang Y. The 70-kDa heat shock protein chaperone nucleotide-binding domain in solution unveiled as a molecular machine that can reorient its functional subdomains / Y. Zhang, E.R. Zuiderweg // Proc Natl Acad Sci USA.- 2004. №101. - P.10272-10277.-J/8

129. Директор Федерального Государственного Учреждения

130. Внедрения результатов научно-исследовательской работы

131. Место внедрения: ООО «Союз биатлонистов России».

132. Автор-разработчик S С (/// ^' Гребешок Е.С.

133. Исполнительный директор ООО «Союз биатлонистов России»1 Ч1. Кущенко С.В.

134. Директор Федерального Государственного Учреждения «Всероссийский научно-исследовательский физической культуры и спорта» доктор биологических наук, профессор, член-корр. РАН1. А.Г. Тоневицкий10» декабря 2009 г.1. ДРЕНИЯ

135. Автор Гребенюк Екатерина Сергеевна

136. Объект и место внедрения Спортсмены отделения академической гребли (старший тренер Панков П.М.) ГОУ МСС УОР №2 г. Москвы.

137. Наименование внедрения Методика оценки физического состояния спортсменов по соотношению концентраций шаперона БТШ70 и его кошаперона СБ1 в сыворотке крови.

138. Генеральный директор ГОУ МСС УОР №2 г. Москвы1. Захаров А.А.