Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Комплексный анализ транскрипционного ответа, индуцированного лигандами Толл-подобных рецепторов 2,4,5, в различных органах грызунов (MusMusculus) и приматов (MacacaMulatta)

На правах рукописи

Артемичева Наталья Михайловна

Комплексный анализ транскрипционного ответа, индуцированного лигандами Толл-нодобных рецепторов 2,4,5, в различных органах грызунов (МииМияс и!и я) и приматов (МасасаМи1аШ).

14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

15 АПР 2015

005567170

Москва 2015

005567170

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф.Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России)

Научный руководитель: доктор биологических наук Логунов Денис Юрьевич

Официальные оппоненты:

Пинегии Борис Владимирович,

доктор медицинских наук, профессор,

заведующий отделом иммунодиагностики и иммунокоррекции ФГБУ «ГНЦ «Институт иммунологии» ФМБА

Лядова Ирина Владимировна,

доктор медицинских наук, заведующая лабораторией биотехнологии Центрального НИИ туберкулеза

Ведущая организация:

ФГБУН "НИИ вакцин и сывороток им.И.И.Мечникова'

Защита диссертации состоится «22» мая 2015 г. в 11.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.130.01 в ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России по адресу: 123098, г. Москва, ул. Гамалеи, д. 18.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава Россини на сайте центра wvvw.gamaleya.org

Автореферат разослан «20»апреля 2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор У Щ! и Русакова Е.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. В течение жизни организм человека сталкивается с огромным количеством микроорганизмов, однако лишь некоторые из них вызывают заболевания. Первой линией защиты организма от патогенных агентов является врожденная иммунная система. Рецепторы врожденной иммунной системы, в отличие от адаптивной, распознают не специфические антигены патогенов, а высококонсерватнвные структуры (молекулярные паттерны), общие для нескольких видов микроорганизмов.

Функцию обнаружения патогенов выполняют паттерн-распознающие рецепторы (pattern-recognitionreceptor, PRR). Одними из ключевых PRR являются Толл-подобные рецепторы [R.Medzhitov, CJJaneway, 1997], которые способны распознавать широкий спектр различных структур бактерий, вирусов и грибов (компоненты клеточной стенки, жгутика, бактериальную и вирусную ДНК и т.д.).

Основными рецепторами, которые распознают структуры бактериальной природы, являются Толл-подобные рецепторы 2,4,5. На нокаутных животных было продемонстрировано важное значение TLR2 и TLR4 в формировании иммунного ответа против многих бактерий (5. pneumoniae, В. subtilis, L. monocytogenes, СИ. trachomatis и др). На сегодняшний день получено множество данных, объясняющих роль этих рецепторов в защите организма от различных патогенов. Показано участие TLR в развитии целого спектра иммунных реакций, таких какактивация макрофагов, стимуляция фагоцитоза, секреция антимикробных пептидов, активация и созревание дендритных клеток, активация зрелых Т-клеток, пролиферация и созревание B-клеток и других [T.Kawai, S.Akira, 2007, L.C. Parkeretal, 2007, F. SandoretM. Вис, 2005].

Благодаря вышеперечисленным свойствам Толл-подсбных рецепторов, лнганды этих рецепторов активно исследуются в качестве компонентов вакцин (адъюванты) и самостоятельных лекарственных препаратов. Так, на сегодня проводятся около 400 клинических испытаний профилактических и терапевтических препаратов. Два лиганда разрешены к применению для лечения базально-клеточного рака кожи (лиганд TLR7 -имиквимод) и в составе вакцины против папиллома вируса человека (лиганд TLR4 - монофосфорил липид А).

Несмотря на значительный интерес к Толл-подобным рецепторам, в научной литературе имеются ограниченные данные, характеризующие органо- и тканеспецифические реакции, вызываемые лигандами TLR. При этом, орган является цельной системой, в которой клетки различных типов находятся в тесном контакте друг с другом. Предсказать какие реакции будут развиваться в том или ином органе в ответ на введение лигандов различныхТ1^очень тяжело. Это зависит от биораспределения лигандов, которые отличаются по химической структуре, клеточного состава органа, и спектра экспрессии TLR различными клетками.

Изучение и сравнение органо- и тканеспецифических свойств агонкстов TLRb перспективе позволит выявить органы, которые являются специфической мишенью для того или иного лиганда (в которых происходит наиболее сильная

индукция иммунных реакций), открывая новые возможности применения лигандов TLR.

Степень разработанности проблемы.

В 1989 году Ч.Дженуэй предположил, что существуют рецепторы, которые распознают определенные структуры (молекулярные паттерны), характерные для патогенов и отсутствующие в организме хозяина. Согласно его гипотезе, которая затем полностью подтвердилась, активация данных рецепторов являлась необходимым событиемдля активации антиген-презентирующих клеток (АПК) и индукции иммунного ответа.

В 1996 году Ж.Хоффман обнаружил, что ген Toll отвечающий у дрозофил за дорзо-вентральную поляризацию при эмбриональном развитии, также обеспечивает устойчивость данных насекомых к грибковой инфекции. В 1997 году Ч.Дженуей (вместе с Р.Меджитовым) обнаружил у млекопитающих ген гомологичный гену Toll дрозофил (сейчас он носит название TLR4).В 1998 году Б.Бётлери его коллеги также независимо определили, что отсутствие иммунного ответа у мышей на бактериальный липополисахарид связано с мутацией в гене (TLR4), гомологичном гену 7о//дрозофилы. За эти открытия Ж.Хоффман и Б.Бетлерв 2011 годубыли удостоены Нобелевской премии. Огромный вклад в изучение сигнальных каскадов, инициируемых активацией Толл-подобных рецепторов, внесли С. Акира и Р.Меджитов.

На протяжении последних лет было получено огромное количество новых данных об экспрессии Толл-подобных рецепторов различными клетками млекопитающих, их участии в иммунных реакциях как врожденной, так и адаптивной иммунной системы.

Среди отечественных исследователей, можно выделить А.Н.Полтарака, Р.И.Атауллаханова, С.А.Недоспасова, Л.В.Ковальчука, Б.С.Народицкого, Г.А.Севостьянову, О.Р.Катунину (2000-2014гг), которые внесли вклад в понимание механизмов функционирования врожденной иммунной системы, роли активации TLR при различных патологических состояниях и систематизацию данных об экспрессии TLR различными типами клеток.

Однако, несмотря на то, что Толл-подобные рецепторы довольно хорошо изучены, к настоящему моменту получено сравнительно мало данных о событиях, которые происходят в различных органах при системном введении лигандов различных Толл-подобных рецепторов (не известно в каких типах клеток происходит активация данных рецепторов, как изменяются профили экспрессии генов, как влияют TLR-зависимые реакции в различных органах на резистентность организма к разным инфекциям). Изучение всех этих процессов, возникающих при системном введении лигандов TLR является актуальной научной задачей.

Цели и задачи.

Целью работы являлась характеристика реакций врожденного иммунитета, их интенсивности и длительности в различных органах и тканях в ответ на

активацию Толл-иодобиого рецептора 5, в сравнении с Толл-подобными рецепторами 2,4.

В процессе выполнения работы предстояло решить следующие задачи.

1) Провести характеристику активации транскрипционного фактора ОТ-кВ в различных органах в ответ на стимуляцию Толл-подобного рецептора 5 в сравнении с Толл-подобными рецепторами 2,4.

2) Определить типы клеток, в которых происходит активация ОТ-кВ в ответ на стимуляцию Толл-подобного рецептора 5.

3) Провести полногеномный анализ изменения экспрессии генов в органах, в которых наблюдалась наиболее высокая активация ОТ-кВ.

4) Изучить влияние стимуляции Толл-подобных рецепторов 2,4,5 на экспрессию цитокинов и хемокинов в органах, в которых наблюдалась наиболее высокая активация №-кВ.

5) Изучить влияние активации Толл-подобных рецепторов 2,4,5 на резистентность к бактериальным инфекциям

Научная новизна.

В представленной работе впервые:

- проведена характеристика активации провоспалительного транскрипционного фактора ОТ-кВ в большом спектре органов в ответ на подкожное введение лигандов Толл-подобных рецепторов 2,4,5.

- показано, что подкожное введение лиганда ТЫ15 приводит к наиболее высокому уровню активации ОТ-кВ в печени и мочевом пузыре по сравнению с лигандами ТЪЯ2 и ТЫ14.

- было обнаружено, что в ответ на подкожное введение лигандов различных Т1Л1 активация ОТ-кВ происходит в разных клетках печени (в ответ на стимуляцию ТЬЛ5 - в гепатоцитах, а в ответ на стимуляцию Т1Л14 - в клетках Купфера).

- показано, что в мочевом пузыре активация ОТ-кВ в ответ на подкожное введение флагеллина и ЛИС происходит в уротелии, а в ответ на липопептид в уротелии и клетках соединительной ткани.

- показано, что активация Т1Л15 повышает резистентность организма по отношению к урологической инфекции, вызваннойЕ.со//.

Теоретическая и практическая значимость работы;

Работа представляет не только научный интерес, заключающийся в более глубоком понимании механизмов работы врожденной иммунной системы, но и в перспективе может иметь практическое применение, поскольку в результате работы были выявлены органы, в которых индуцируется наиболее мощный иммунный ответ при введении лигандов различных Т1Л. Также, было показано, что введение агониста ТЦ15 повышает резистентность организма к Б./урЫтипит и уропатогенным инфекциям. Полученные данные могут быть использованы при создании адъювантов и средств немедленной защиты от патогенных микроорганизмов.

Полученные результаты использованы для создания фармацевтической композиции на основе лигандов патгерн-распознающих рецепторовдля использования в качестве адъюванта в составе вакцин и для лечения инфекций, вызванных бактериальными и вирусными патогенами (патент № 2497541).

Отдельные результаты работы были использованы при разработке Методических рекомендаций «Оптимизация метода интравезикального введения различных веществ» М.-2014, утвержденные на Совете по внедрению научных достижений в практику ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России.

Методология и методы исследования;

В диссертации использованы современные иммунологические (мультиплексный иммуноферментный анализ на магнитных частицах, иммуногистохимический анализ, иммуноблотинг, иммуноферментный анализ), молекулярно-генетические (ОТ-ПЦР), гистологические (получение и окрашивание срезов печени и мочевого пузыря), биохимические (исследование активности люцифер азы) и микробиологические (работа с культурами Б.1урМтипитп Е.соИ) методы.

Положения, выносимые на защиту.

1) При подкожном введении лигандов Толл-подобных рецепторов 2,4,5 иммунные реакции в различных органах индуцируются не одинаково. При анализе активации провоспалительного фактора ОТ-кВ в ответ на введение лигандов 1X112,4,5 было обнаружено, что наиболее сильная активация происходит в печени и мочевом пузыре в ответ на флагеллин (лиганд ТЫ15).

2) Как в печени, так и в мочевом пузыре лиганды Толл-подобных рецепторов 2, 4 и 5 приводят к активации ОТ-кВ в различных клетках в составе органа.

3) Подкожное введение лигандов Т1Л12,4,5 приводит к различным изменениям в профиле экспрессируемых генов. В печени мыши увеличивается экспрессия более 8000 генов, из них от 3872 до 4620 являются уникальными для каждого лиганда; в мочевом пузыре мыши увеличивается экспрессия более 5000 генов, при этом 4043 и 4194 генов являются уникальными для флагеллина и Л ПС, соответственно.

4) Флагеллин приводит к увеличению резистентности мышей к инфекциям Блурттигштм уропатогенной Е.соИ

Степень достоверности и апробация результатов.

Для решения поставленных задач в работе использовались современные инструментальные методы. Обсуждение результатов проведено с учетом современных данных медицинской и биологической науки. Научные положения и выводы, изложенные в диссертации обоснованы и подтверждены фактическим материалом.

Результаты работы доложены на четвертой Международной школе молодых ученыхпо молекулярной генетике «Геномика и биология клетки» (Звенигород, 2010).

Апробация работы состоялась 20.01.2015 на расширенной научной конференции отделов иммунологии и медицинской микробиологии ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 научных работ виздательствах, в том числе 3 статьи в журналах,рекомендованныхВАК РФ и 2 в сборниках тезисов конференций и 1 патент РФ.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 129 странице машинописного текста и включает введение, обзор литературы, описание материалов и методов, собственные исследования, обсуждение результатов исследований, выводы и список использованной литературы, содержащий ссылки на 224 источника. Работа иллюстрирована 7 таблицами и 30 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Бактериальные штаммы. В работе использовали клинический изолят E.coli, который был любезно предоставлен д.б.н., проф. Мороз А.Ф., лабораторный штамм S. typhimurium iE147, любезно предоставленный к.б.н. Л.Н. Нестеренко, д.б.н. проф. Ю.М. Романовой.

Лиганды Толл-подобных рецепторов. В работе использовали флагеллин (лиганд TLR5), синтетический липопептид (лиганд TLR2), липополисахарид Е.coli(лиганд TLR4) (кат. № L2630, Sigma, США).

Лабораторные животные. В экспериментах использовали самок линии BALB/c весом 18-20г (питомник лабораторных животных «Столбовая» РАМН, Россия). Самки трансгенных мышей BALB/c Tg(lKBa-luc)Xen, содержащих в геноме репортерный ген люциферазы были приобретены институтом RoswellParkCancerlnstitute, Buffalo NY. Содержание лабораторных животных и проведение экспериментальных исследований проводились согласно СанПиН. N 1045-73.

Измерение интенсивности биолюминесценции в организме трансгенных мышей BALB/c в режиме реального времени.Определение активности транскрипционного фактора NF-kB проводили на Balb/c-Tg(IkBa-luc)Xen трансгенных мышах, содержащих в своем геноме ген люциферазы под контролем NF-kB зависимого промотора. Животным вводили лиганды TLR2 (5мкг/мышь), TLR4 (10 мкг/мышь), TLR5 (10 мкг/мышь). Через 3 часа мышам вводили по 100 мкл раствора 15мг/мл специфического субстрата люциферазы: D-люциферина (кат№ PI041, Promega, США). Через 5 минут после введения субстрата проводили измерение биолюминесценции на приборе Lumina II (PerkinElmer, США).

Определение интенсивности биолюминесценции в органах трансгенных мышей.Трансгенным мышам линии Balb/c-Tg(IkBa-luc)Xen, содержащим в своем геноме ген фермента люциферазы под контролем NF-kB зависимого промотора вводили лиганды TLR2 (5 мкг/мышь), TLR4(ot 10 мкг/мышь до ЮООмкг/мышь), TLR5(ot 5мкг/мышь до 10 мкг/мышь). Через 1 час и 3 часа после инъекции мышей усыпляли и производили отбор ряда органов

(селезенка, печень, почки, сердце, легкие, мочевой пузырь, матка, тонкий кишечник, толстый кишечник). Затем органы гомогенизировали в лизирующем буфере ReporterLysis 5х Buffer (кат. № Е3971, Promega, США), который содержал смесь ингибиторов клеточных протеаз ProteaselnhibitorCocktail, (кат. № Р8340, Sigma США). Определение количества белка в пробах производили с помощью реактива QuickStart™ BradfordProteinAssay (500-0201, Bio-Rad, США). Измерение уровня активности транскрипционного фактора NF-kB в образцах гомогенатов органов мышей проводили по определению интенсивности биолюминесценции в нормированных по содержанию белка пробах (10мг), используя прибор Wallac 1420 platereader (PerkinElmer, США).

Иммуногистохимическое окрашивание гистологических срезов.Срезы нагревали при температуре 37°С 10 минут. Далее стекла помещали на 20 минут в 10% раствор формалина и затем промывали 3 раза ФСБ. После этого инкубировали срезы с блокирующим раствором. Затем срезы 3 раза промывали ФСБ и помещали в раствор 1:100 первичных антител (ab 16502, ab9023, аЬ8229). Через час срезы промывали и далее инкубировали с вторичными антителами (аЬ150073, аЬ150108, аЬ150135), помеченными флуоресцентными красителями. Затем срезы 3 раза промывали ФСБ и необходимости окрашивали ядра DAPI. На последнем этапе срезы подсушивали и заключали под покровное стекло с помощью синтетической среды Biomount (Bio-Optica, Италия). Исследование окрашенных препаратов проводили на микроскопе Axiolmager (CarlZeiss, Германия).

Измерение концентрации цитокинов. Для определения концентраций хемокинов и цитокинов ((ИЛ-1а, ИЛ-lß, ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-9 ИЛ-10, ИЛ-12 (р40), ИЛ-12 (р70), ИЛ-13, ИЛ-17, эотаксин, Г-КСФ, ГМ-КСФ, ИФН-у, МСР-1, MlP-la, MIP-lß, RANTES, ФНО-а) в исследуемых образцах использовали набор Bio-Plex 23-plex (кат. номеры L60-009RDPD, Bio-Rad, США) для мультиплексного иммуноферментного анализа на магнитных частицах Magpix (Bio-Rad, США). Подготовку проб и анализ производили согласно методике производителя.

Модель инфекции S.typhimurium на лабораторных жнвотных.Б.typhimurium культивировали при 37°С с шутелированием в среде Лурия-Бертани в течение 18 часов. Затем бактерии осаждали 5000g 10 минут и разводили в стерильном ФСБ. Ориентируясь по стандартам мутности, подготавливали раствор бактерий с концентрацией около 2*106 КОЕ/мл. Точную концентрацию бактерий определяли методом высева на дифференциально-диагностическую твердую среду Ml08 (HiMedia, Индия). Далее бактериальную суспензию вводили перорально по 0,5 мл мышам линии BALB/c, самкам, 18-20 г. Все процедуры проводили в ламинарном шкафу с соблюдением правил асептической работы. Изменение веса и выживаемость животных оценивали в течение 30 дней.

Модель урологической инфекции E.coli на лабораторных животных.Бактериальную суспензию центрифугировали в течение 3 минут при

скорости 500(^. Надосадочную жидкость удаляли, а бактериальный осадок разводили в стерильном фосфатном буфере до 7,5 единиц МакФарланда. Данную суспензию использовали для инфицирования мышей.

Мышам линии ВАЬВ/с (самкам) подкожно вводили раствор для анестезии, содержащий 45 мг/кг Золетила и 7,5 мг/кг Рометара. Далее животным вводили в мочевой пузырь катетер, обработанный стерильным вазелиновым маслом. Затем через катетер в мочевой пузырь вводили 50 мкл полученной суспензии Е.соИ. Бактериальную суспензию выдерживали в мочевом пузыре в течение 20 минут, затем катетер удаляли. Все процедуры проводили в ламинарном шкафу с соблюдением правил асептической работы.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Анализ способности лигандов Толл-подобных рецепторов 2,4,5 активировать транскринционный фактор NF-kB in vivo.

Распознавание структурных компонентов патогенов Толл-подобными рецепторами индуцирует широкий спектр иммунных реакций, которые направлены на детекцию патогена, предотвращение дальнейшего распространения и, в конечном итоге, его элиминацию из организма.

Начало иммунных ответов связано с активацией целого ряда транскрипционных факторов (NF-kB, АР-1 и IRF3/7), среди которых одним из основных является NF-kB. Он регулирует экспрессию большого количества генов, продукты которых участвуют в развитии реакций как врожденного, так и адаптивного иммунного ответа. Кроме того, NF-kB активируется в ответ на стимуляцию всех Толл-подобных рецепторов, поэтому его активацию можно считать маркерной.

На первом этапе исследования, мы оценили способность лигандов Толл-подобных рецепторов 2,4,5 активировать транскрипционный фактор NF-kB в различных органах. Для этого были использованы трансгенные мыши линии Balb/c-Tg(IkBa-luc)Xen, содержащие в своем геноме репортерный ген люциферазы под контролем NF-kB-зависимого промотора.

Животные были разделены на 4 группы, которым вводили подкожно по 10 мкг/мышь флагеллина (лиганд TLR5), 10 мкг/мышь ЛПС (лиганд TLR4), 5 мкг/мышь липопептид (лиганд TLR2) или 100 мкл фосфатно-солевого буфера. Через 3 часа измеряли биолюминесценцию invivo. Полученные данные представлены на рисунке 1.

Результаты эксперимента показали, что наиболее сильная активация NF-kB наблюдалась в группе животных, которым вводили лиганд Толл-подобного рецептора 5 - флагеллин. Также, отличался характер распределения люминесценции в организме мыши. В ответ на лиганд TLR5 было отмечено свечение в районе печени, тогда как в ответ на агонисты TLR2 и TLR4 люминесценция была распределена более диффузно.

20000

40000

60000

ФСБ Липопептид

ЛПС Флагеллнн

срч

Рисунок 1. Прижизненное определение уровня активности транскрипционного фактора ЫР-кВ в организме Ва1Ь/с-Т«(1кВа-1ис)Хеп мышей после введения им лигандов Т1Л2,4,5.

Данные, полученные в ходе эксперимента позволили нам предположить, что при введении агонистов разных ТЪЯ уровень активации №-кВ в различных органах может сильно отличаться. Для того, чтобы сравнить активность ИБ-кВ в различных органах, мы провели аналогичный эксперимент. Животным вводили агонисты ТЬЯ2,4,5 и далее через 1 час и 3 часа отбирали ряд органов. Все образцы ткани гомогенизировали в лизирующем буфере при добавлении ингибиторов клеточных протеаз. Измерение уровня активности ОТ-кВ в гомогенатах органов мышей проводили по определению интенсивности биолюминесценции в нормированных по содержанию белка пробах. Полученные результаты представлены на гистограмме (рисунок 2).

Как видно из результатов эксперимента, стимуляция ТЬЯ 2,4,5 приводит к разному профилю активации ОТ-кВ по органам, который практически не отличается через 1 час и 3 часа после введения лигандов. При этом в ответ на ЛПС и липопептид во всех образцах наблюдались сравнимые значения (увеличение до 25 раз по сравнению с контрольными животными). Тогда как при введении агониста ТЫ15 была обнаружена чрезвычайно высокая активация ОТ-кВ в печени (до 64 раз по сравнению с контрольными животными) и мочевом пузыре (до 140 раз по сравнению с контрольными животными).

35 30 25 20 15 10 5 0

1 час после введения лигандов

■ Лкпопептнл

■ ЛПС

I ■ Флагеллин

-«--!-■ 1*1 — 1 1... .1

160 140 120 100 ВО 60 40

Почки Селезенка Сердце Матка

3 час после введения лигандов

Мочевой пузырь

Толстый Тонкий кишечник кишечник

1 ■ ■ ■ Лнпопептнл ЛПС Флагеллин

--- 1 . - 1 ..■

Печень Почки Селезенка Сердце Матка

Мочевой пузырь

Легкие Толстый Тонкий кишечник кишечник

Рисунок 2. Измерение активации транскрипционного фактора ОТ-кВ в различных органах мышей после ведения лигандов ТЬЯ2,4,5.

Результаты данного эксперимента позволяют предположить, что именно в печени и мочевом пузыре будут наиболее эффективно развиваться местные иммунные реакции. Поэтому дальнейшие исследования проводились именно на этих органах. Работа выполнена совместно с И.И.Гитлиным (Институт Розвела Парка, США).

2. Определение типа клеток в печени, в которых происходит активация ОТ-кВ в ответ на стимуляцию Толл-подобного рецептора 5.

На следующем этапе исследования мы определили, в каких типах клеток в печени происходит активация транскрипционного фактораЫР-кВ. Для этого мышам линии Ва1Ь/с вводили лиганды ТЬЯ4 (10 мкг/мышь), ТЫ15 (5 мкг/мышь) или фосфатный буфер. Через 30 минут животных усыпляли и отбирали печень, из которой далее получали криосрезы. Активацию транскрипционного фактора кВ определяли методом иммуногистохимического окрашивания. Для этого срезы ткани инкубировали с антителами (мечеными зеленым флуорохромом) против р65 субъединицы ЫР-кВ, которая при активации данного транскрипционного фактора мигрирует в ядро.

Результаты проведенного эксперимента показали, что у животных, которым вводили лиганд Толл-подобного рецептора 5 - флагеллин, активация транскрипционного фактора ОТ-кВ происходила главным образом в гепатоцитах печени, тогда как у животных, которым вводили ЛПС (лиганд ТЫ14), ОТ-кВ активировался в клетках Купфера.

Таким образом, результаты экспериментов показали, что при подкожном введении лигандов различных Толл-подобных рецепторов активация

транскрипционного фактора NF-kB происходит в различных типах клеток. Главным типом клеток в печени, которые обеспечивают мощную активацию NFkB, являются гепатоциты.Работа выполнена совместно с А.С.Глейберманом (ClevelandBiolabs, США).

3. Полногеномный анализ изменения экспрессии генов в печени после введения лигандов Толл-подобных рецепторов 2,4,5.

Поскольку было обнаружено, что тип индуцируемых клеток, а также сила ответа на различные лиганды TLR существенно отличаются, мы предположили, что это приведет к разному профилю экспрессируемых генов. Чтобы определить, какие изменения происходят в печени мышей после введения лигандов TLR2,4,5, мы провели полногеномный анализ изменения экспрессии 30000 генов (микроэррей анализ проводился в подразделении Affimetrix при Институте рака Розвелла Парка из средств проф. А.В.Гудкова).

Для данного эксперимента были использованы мыши линии BALB/c, которых разделили на 4 группы. Животным подкожно вводили 5 мкг/мышь флагеллина (лиганд TLR5), 10 мкг/мышь ЛПС (лиганд TLR4), 5 мкг/мышь липопептид (лиганд TLR2) или 100 мкл фосфатно-солевого буфера. Через 30 минут у животных отбирали печень и экстрагировали из нее РНК, которую затем использовали для микроэррей-анализа.

Анализ полученных данных показал, что в ответ на стимуляцию всех TLR, более чем в два раза (по сравнению с контрольной группой) повышается экспрессия от 8314 до 9291 генов. При этом, профиль генов значительно различается (было обнаружено только 1050 генов, экспрессия которых повышалась во всех группах).

В ответ на все лиганды было обнаружено повышение экспрессии цитокинов, хемокинов, антимикробных пептидов, регуляторов метаболизма, клеточного цикла, роста и др. (таблица 1). При этом спектр генов, экспрессия которых увеличивалась отличался. Например, в ответ на флагеллин наиболее сильно увеличивалась экспрессия CXCL1, CXCL10, CXCL2, CXCL9. В ответ на ЛПС максимально увеличивалась экспрессия таких цитокинов, как CCL2, CCL4, CSF1, в ответ на липопептид - TNF.

Таблица 1. Изменение экспрессии генов в печени после стимуляции Толл-подобных рецепторов 2,4,5._

Категория Ген Изменение количества мРНК относительно контрольных мышей, разы

Флагеллин ЛПС Липопептид

Цитокины CXCL1 110 18 7

CXCL10 406 48 36

CXCL2 150 99 54

CCL2 2 33 8

CCL4 375 1711 1434

CSF1 4 5 3

TNF 53 163 174

11ЛВ 25 45 37

СХСЬ9 6 2 3

Антимикробные пептиды НАМР2 1304 574 1

ЬСЫ2 2 1 1

5АА1 4 2 3

БААЗ 17 1,6 6

Б100А8 1 7 4

Б100А9 1 9 6

^КВИ 69 14 17

Транскрипционные АТРЗ 56 25 31

факторы Л1Ы 23 3 3

ЖР1 12 4 3

ЕвЮ 14 15 7

ллмв 8 6 2

NFKБIA 5 2 1

Регуляторы клеточного РОЗ 151 222 127

цикла РЬКЗ 6 2 3

Ростовые факторы ООР15 26 0 1

Антиапоптотические факторы 1ЕЯЗ 43 38 18

Результаты проведенного анализа показывают, что подкожное введение агониетов ТЬЯ, значительно меняет экспрессию генов в печени мышей. При этом профиль экспрессии во многом зависит от того, какой Толл-подобный рецептор был активирован.

4 Определение влияния стимуляции Толл-подобных рецепторов на уровень секреции цитокинов в гомогенате печени.

Согласно данным микроэррей анализа в ответ на стимуляцию ТЬЯ2,4,5 в печени увеличивается количество мРНК целого ряда цитокинов. Поэтому на следующем этапе работы мы проверили, согласуются ли данные анализа транскриптома мыши с повышением продукции цитокинов и хемокинов на уровне белка.

Для выполнения поставленной мышам линии Ва1Ь/с вводили лиганды Т1Л12: липопептид (10 мкг/мышь), Т1Л14: ЛПС (10 мкг/мышь), Т1Л15: флагеллина (10 мкг/мышь). В качестве отрицательного контроля использовали животных, которым вводили раствор фосфатно-солевого буфера (ЮОмкл/мышь). Через 1, 2, 4, 6, 18, 24 и 48 часов после введения агониетов ТЫ1 производили отбор образцов печени. В нормированных по белку гомогенатах ткани, методом мультиплексного иммуноферментного анализа на магнитных частицах определяли концентрации 23 хемокинов и цитокинов (ИЛ-1а, ИЛ-1(3, ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-9 ИЛ-10, ИЛ-12 (р40), ИЛ-12 (р70), ИЛ-13, ИЛ-17, эотаксин, Г-КСФ, ГМ-КСФ, ИФН-у, МСР-1, М1Р-1а, М1Р-1Р, ЮШТЕБ, ФНО-а).

Было зарегистрировано статистически достоверное повышение экспрессии 16 цитокинов и хемокинов. В ходе работы, было отмечено, что при стимуляции различных Толл-подобных рецепторов экспрессия цитокинов может

регулироваться по-разному. Например, хемокин КС секретировался в ответ на флагеллин, больше, чем в ответ на лиганды других ТЫ1 (рисунок 3). Кроме того, для данного хемокина были отмечены различия в динамике ответа в зависимости от того, какой Толл-подобный рецептор был активирован. В ответ на флагеллин наблюдалась более мощная продукция КС с пиком экспрессии через 1 час (после введения лиганда), тогда как в ответ на ЛПС и липопептид была отмечена меньшая продукция данного хемокина с пиком экспрессии через 8 часов (после введения лигандов). Полученные данные согласуются с данными микроэррей анализа.

Время, часы

Рисунок 3. Цитокины, максимальная экспрессия которых наблюдалась в ответ на введение флагеллина

Для двух цитокинов (ФНО-а и Г-КСФ) наибольшее увеличение концентрации наблюдалось в ответ на агонист ТЪЯ2 (рисунок 4). Для ФНО-а полученные данные также соответствуют данным микроэррей анализа.

Время после введения лигандовТЦг, часы

Рисунок 4. Цитокины, максимальная экспрессия которых наблюдалась в ответ на введение липоппептида

Экспрессия 10 цитокинов и хемокинов (ИЛ-1а, ИЛ-1Р, ИЛ-6, ИЛ-10, ИЛ-12 (р40), ИЛ-12 (р70), МСР-1, МПЧа, МПЧр, КАШЕБ) максимально увеличивалась в ответ на введение ЛПС (рисунок 5).

Флмгаплм Пяпопмтмд Л и полол ис ■ мряд

Время после введения лигандов ТЬР, часы

Рисунок 5. Цитокины, максимальная экспрессия которых наблюдалась в ответ на введение липополисахарида.

Также, было обнаружено 3 цитокина, экспрессия которых изменялась приблизительно одинаково в ответ на все три лиганда (рисунок 6).

Время после введения лигандов ТШ. чесы

Рисунокб Цитокины, экспрессия которых изменялась одинаково в ответ на флагеллин, липополисахарид и липопептид.

Таким образом, в ходе выполнения работы было обнаружено повышение экспрессии 16 цитокинов и хемокинов, при этом спектр данных молекул отличался в зависимости от того, какие Т1Л1 были активированы.

5. Определение влияния стимуляции Толл-подобных рецепторов на выживаемость мышей при инфекции Б^рМтипит.

В предыдущих экспериментах мы обнаружили, что лиганды ТЫ12,4,5 сильно отличаются по активации ОТ-кВ, спектру индуцируемых генов и цитокиновому профилю в печени, поэтому важно было определить будет ли влиять стимуляция данных рецепторов на резистентность мышей к инфекционным агентам. В качестве инфекционной модели была выбрана Б.ЦрМтигшт, поскольку известно, что печень играет важную роль в патогенезе данной бактерии.

Мышам линии ВАЬВ/с вводили лиганды Толл-подобных рецепторов: 10 мкг/мышь флагеллина (лиганд ТЬЯ5), 10 мкг/мышь ЛПС (лиганд ТЬЯ4), 5 мкг/мышь липопептида (лиганд ТП12) или 100 мкл фосфатно-солевого буфера. Через 3 дня животных инфицировали Ы)50 ЗлурЫтш'шт. Далее определяли выживаемость мышей на протяжении 30 дней. Результаты представлены на графике выживаемости (рис 7).

£

н |

1» Я

а

*

2 а

ХШ

Флагеллин -ь- ЛПС

-о- Липопептид ФСБ

0 5 10 15 20 25 30

Дни после инфекции

* р<0,05

Рисунок 7. График выживаемости мышей от инфекции Блур1итигшт.

16

Как видно из полученных данных, положительный эффект наблюдался в группах, которым вводили флагеллин (лиганд Т1Л5) и ЛПС (лиганд ТЫ14). Однако, статистическая обработка данных показала, что достоверно увеличивает выживаемость мышей от инфекции Б.фрИтшгшттопько введение флагеллина (р<0,05, лог-ранговый критерий).

Полученные результаты были подтверждены также данными эксперимента по определению количества бактерий в печени животных после введения им лигандов Т1Л1и заражения БлурЫттЫт и данными гистологического исследования. Было показано, что введение флагеллина приводит к достоверному снижению титра бактерийв печени животных (по сравнению с контрольной группой), а также уменьшению патологических изменений печени вызванных Е.гурЫтиг'шт.

6. Определение типа клеток в мочевом пузыре мыши, в котором происходит активация ОТ-кВ в ответ на стимуляцию ТЫ* 5.

Мочевой пузырь является органом, в котором была обнаружена наиболее высокая активация ОТ-кВ (увеличение в 140 раз по сравнению с контролем) после подкожного введения агониста Толл-подобного рецептора 5 флагеллина. Для того чтобы определить в каких типах клеток происходит активация ОТ-кВ, мы использовали метод иммуногистохимического окрашивания срезов мочевого пузыря на р65 субъединицу ОТ-кВ, которая при активации данного транскрипционного фактора мигрирует в ядро.

Эксперимент был выполнен по следующей схеме: мышам линии Ва1Ь/с вводили подкожно 5 мкг/мышь флагеллина (лиганд ТЬЯ5), 10 мкг/мышь ЛПС (лиганд ТЫМ), 5 мкг/мышь липопептида (лиганд ТЬЯ2). Через 30 минут у всех животных отбирали образцы мочевого пузыря, из которых затем готовили криосрезы. Далее проводили иммуногистохимическое окрашивание срезов ткани (рис 8).

Наименьшее количество клеток, у которых был активирован транскрипционный фактор ОТ-кВ, наблюдалось в ответ на липополисахарид и липопетид. При этом, также, как и в печени, в ответ на стимуляцию разных рецепторов наблюдалась активация ОТ-кВ в различных типах клеток. Стимуляция ТЫ14 приводила к активации ОТ-кВ в эпителии, но не в других клетках мочевого пузыря. В ответ на липопептид была обнаружена активация №-кВ в клетках эпителия и собственной пластинки.

В ответ на стимуляцию ТЫ15 №-кВ активировался в наибольшем количестве клеток, что полностью согласуется с результатами, полученными нами на Ва1Ь/с-Тц(1кВа-1ис)Хеп трансгенных мышах (пункт 1). Также, как и в ответ на ЛПС, активация ОТ-кВ была обнаружена только в клетках эпителия.

Можно предположить, что именно за счет ответа эпителиальных клеток достигалась такая мощная активация ОТ-кВ в ответ на введение агониста Толл-подобного рецептора 5.Работа выполнена совместно с И.И.Гитлиным (Институт Розвела Парка, США, А.С.Глейберманом (С1еуе1апс1Вю1аЬ5, США).

12 .<4 5

Флагеллин

Липопептид

ЛПС

ФСБ

Рисунок 8. Фотографии срезов мочевого пузыря мыши, окрашенных ОАР1 (1), антителами к р65 (2), к цитокератину 8(3), к Р-актину (4); объединенная фотография (5).

7. Определение типа клеток в мочевом пузыре макаки резус, в котором происходит активация NF-kB в ответ на стимуляцию ТЫ* 5.

На следующем этапе работы было интересно определить является ли обнаруженный нами эффект мощной активации Т<ГР-кВ в мочевом пузыре после подкожного введения флагеллина специфическим для мыши, или же полученные данные можно экстраполировать на другие виды млекопитающих. Приматы представляют собой одну из наиболее удобных экспериментальных моделей для фундаментальных и прикладных биомедицинских исследований благодаря большому генетическому и физиологическому сходству с человеком. Поэтому для данного эксперимента был выбран вид приматов средней величины Масасаши1аиа (макака резус). Животные были разделены на 4 группы по 4 животных в каждой группе (2 самки и 2 самца). Далее макакам вводили подкожно лиганды Толл-подобных рецепторов 2,4,5 в дозе 20 мкг/кг. Через 1 час производили отбор мочевых пузырей. Затем получали гистологические срезы ткани и проводили их иммуногистохимическое окрашивание (рис. 9).

Наибольшее количество клеток с активированным транскрипционным фактором ОТ-кВ было в группе животных, которым вводили флагеллин. При этом данная активация наблюдалась только в клетках эпителия. В ответ на липопептил мы обнаружили активацию ОТ-кВ как в эпителии, так и в клетках собственной

пластинки. В ответ на ЛПС активация ОТ-кВ была найдена в единичных эпителиальных клетках.

12 3 4

Флагеллин И'1 Ш!

Липопептид ШЛ ии

ЛПС в

ФСБ Ш ШШЖ

Рисунок 9 Фотографии срезов мочевого пузыря мыши, окрашенных ЭАР1 (1), антителами к р65 (2), к цитокератину 8(3), объединенная фотография (4).

Таким образом, можно заключить, что данные, полученные на модели макака резус, полностью совпали с результатами аналогичного эксперимента, проведенного на мышах.

Работа выполнена совместно с И.И.Гитлиным (Институт Розвела Парка, США, А.С.Глейберманом (С1еуе1ап<1Вю1аЬ5, США).

8 Полногеномный анализ изменения экспрессии генов в мочевом пузыре мыши после введения лигандов Толл-подобных рецепторов 2,4,5.

Поскольку тип индуцируемых клеток, а также сила ответа на различные лиганды ТЬК существенно отличаются, мы предположили, что это приведет к отличиям в профиле экспрессируемых генов. Поэтому на следующем этапе нашего исследования, мы провели полногеномный анализ транскриптома мышей через 1 час и 3 часа после введения флагеллина (5 мкг/мышь), ЛПС (10 мкг/мышь). В каждой группе органы отбирали как минимум у трех животных, чтобы обеспечить количество РНК достаточное для анализа, а также, чтобы минимизировать различия между животными.

Результаты микроэррей анализа показали, что в ответ на оба лиганда экспрессия около 6000 генов повышалась более чем в 2 раза по сравнению с контрольными животными. При этом, также, как и в печени, спектр генов, экспрессия которых изменялась, сильно отличался в зависимости от вводимого

лиганда ТЫ1. В таблице 2 представлена часть данных об экспрессии различных групп генов, в ответ на подкожное введение ЛПС и флагеллина.

Таблица 2. Изменение экспрессии генов в мочевом пузыре мыши после

Категория Ген Изменение количества мРНК относительно контрольных мышей, разы

Флагеллин ЛПС

1 час Зчаса 1 час Зчаса

Цитокины 1Ы7С 887 9 32 2

ССЬ2 1461 248 624 1

ССЕЛО 521 47 16 1

ССЬЗ 41 6 194 14

СС1Л 42 36 226 129

ССЬ7 148 604 102 199

СХС1Л 987 249 647 75

СХС1Л0 3477 50 752 3

СХСЫ5 35 1 14 1

СХСЫ6 8 14 2 11

СХСЬ2 4175 92 467 114

Антимикробные пептиды НАМР 118 27 6 9

ЬСИ2 64 137 23 56

СН131Л 11 124 4 38

САМР 6 23 10 18

14 4 1 4

Рецепторы врожденного иммунитета и их адаптеры РТХЗ 310 69 526 4

С1-ЕС20 3 4 1 4

К1Ж}2 3 4 2 3

\1YD88 3 7 2 7

1ЯАКЗ 3 9 2 11

Кластеры дифференцировки (СО) СЭ177 6 23 0 4

С040 9 26 4 14

С069 25 10 28 30

С070 55 520 10 68

Ростовые факторы С5Р1 10 15 5 1

СБиг 203 10 17 4

АЯЕО 162 63 32 23

Таким образом, результаты данного анализа показали, что в ответ на агонисты Толл-подобных рецепторов 4 и 5, увеличивается экспрессия большого количества групп генов (транскрипционных факторов, цитокинов, регуляторов роста, антимикробных факторов и др.) При этом профиль генов в каждой группе животных отличался. Например, в ответ на флагеллин было отмечено наиболее сильное повышение таких цитокинов, как: 1Ы7С, ССЬ2, ССЬ20, тогда как в ответ на ЛПС наблюдалась более мощная индукция экспрессии ССЬЗ, ССЬ4.Обнаруженные в ходе микроэррей анализа отличия в профиле экспрессируемых генов в дальнейшем могут приводить к индукции различных иммунных реакций в мочевом пузыре в ответ на подкожное введение лигандов Т1Л14 и 5.

9. Полногеномный анализ изменения экспрессии генов в мочевом нузыре макаки резус после введения лигандов Толл-подобных рецепторов 2,4,5.

На следующем этапе работы мы провели полногеномный анализ изменения экспрессии тридцати тысяч генов макаки резус после введения лигандов ТЫ12,4,5 (микроэррей анализ проводился в подразделении Айтйпх при Институте рака Розвелла Парка из средств проф. А.В.Гудкова). Животные были разделены на три группы, которым вводили липопептид (10мкг/кг), липополисахарид (20мкг/кг), флагелин (20мкг/кг). Через 30 минут и через 2 часа у животных отбирали образцы мочевого пузыря, которые использовались для выделения РНК и далее для проведения микроэррей анализа.

Полученные данные показали, что в ответ на ЛПС поднимается (более чем в два раза) экспрессия 1374 генов, в ответ на липопептид - 886 генов и в ответ на флагеллин - 668 генов. При этом, также, как и в результате микроэррей анализа на модели мышей, было обнаружены большие отличия в профиле экспрессируемых генов.В ходе анализа полученных данных было отмечено повышение экспрессии цитокинов, антимикробных белков, рецепторов врожденного иммунитета, костимулирующих молекул, ростовых факторов и др. Частично данные микроэррей анализа представлены в таблице 3.

Таблица 3. Изменение экспрессии генов в мочевом пузыре макаки резус

после стимуляции Толл-подобных рецепторов 2,4,5.

Изменение количества мРНК относительно контрольных мышей, разы

Ген Флагеллин ЛПС Липопептид

30 мин. 2 часа 30 мин. 2 часа 30 мин. 2 часа

ССЬ2 2 79 3 29 10 13

Категория ССЬ20 31 5 1 23 14 23

ССЬЗ 1 7 1 4 1 9

ССЬ4 4 4 8 3 4 4

сси 1 94 1 15 14 10

СХС1Л 111 319 23 46 83 60

схсио 3 29 2 24 2 6

СХС1Л6 1 3 1 3 1 2

11ЛВ 12 43 29 11 20 16

Антимикробные факторы НАМР 1 1 11 1 1 1

1_СШ 1 5 1 1 1 1

САМР 1 8 2 1 1 1

Рецепторы РТХЗ 5 500 2 146 17 25

врожденного МУ088 1 2 2 3 1 2

иммунитета и их адаптеры 1ЯАКЗ 1 2 1 2 2 1

Кластеры дифференцировки (СО) С040 2 8 2 7 2 3

СЭ83 6 30 9 12 6 5

АЛЕОВ 3 6 1 4 2 3

Ростовые СвИЗ 2 11 1 1 4 1

факторы ЕОЯ1 7 30 4 5 16 3

СРР15 2 3 2 1 3 2

IGFBP3 2 1 1 1 1 1

KLF10 2 3 1 2 2 2

ВМР2 10 1 3 1 8 4

Таким образом, результаты полногеномного анализа экспрессии генов в мочевом пузыре макаки резус показали, что в ответ на агонисты Толл-подобных рецепторов 4 и 5, увеличивается экспрессия многих групп генов (цитокинов, ростовых факторов, костимулирующих молекул, антимикробных факторов и др.) При этом профиль экспрессируемых генов в каждой группе животных отличался.

При сравнении, данных полученных при микроэррей анализе образцов мочевого пузыря мыши и макаки резус, были обнаружены сходные тенденции изменения экспрессии многих генов: цитокинов (например, CCL2, CCL20, CCL3, CCL4, CCL7, CXCL1, CXCL10), антимикробных белков (LCN2, CAMP), костимулирующих молекул (CD40), ростовых факторов (AREG) и др.

10 Изменение цитокинового/хемокинового статуса в мочевом пузыре мыши.

В следующем эксперименте мы определили изменения в спектре экспрессии цитокинов и хемокинов в мочевом пузыре мышей. Животным вводили лиганды различных Толл-подобных рецепторов: 5 мкг/мышь липопептида, 10 мкг/мышь липополисахарида, 10 мкг/мышь флагеллина или 100 мкл фосфатно-солевого буфера. Мочевые пузыри отбирали через 1, 2, 4, 8, 16, 24, 48 часов. В каждой группе было не менее трех животных на точку отбора образцов. Далее органы гомогенизировали в лизирующем буфере, совместно с ингибитором протеаз. Полученные гомогенаты ткани нормировали по содержанию белка и использовали для мультиплексного иммуноферментного анализа на магнитных частицах (наборВю-Р1ехРго™ 23-plex, Bio-Rad, США). С помощью данного набора возможно определение концентрации 23 хемокинов и цитокинов (ИЛ-1а, ИЛ-lß, ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-9 ИЛ-10, ИЛ-12 (Р40), ИЛ-12 (Р70), ИЛ-13, ИЛ-17, эотаксин, Г-КСФ, ГМ-КСФ, ИФН-у, МСР-1, MIP-la, MIP-lß, RANTES, ФНО-а). Полученные результаты представлены на рисунке 10.

МСР-1

—— Флагеллм Лшюлешкд —■— Лмюлолмсахщмд

Время после введения лигандовТ1Д часы Рисунок 10. Изменение экспрессии цитокинов, после подкожного введения лигандов ТЬЯ2,4,5.

В результате проведенного анализа было обнаружено увеличение продукции двух хемокинов: МСР-1 и КС. При этом максимальная экспрессия

обоих наблюдалась в ответ на лиганд ИЛ15 - флагеллин, через час (КС) и через 2 часа (МСР-1).

11 Определение влияния лигапда Толл-подобпого рецептора 5 на резистентность мышей к урологической инфекции, вызванной Е.соИ.

На заключительном этапе исследования необходимо было определить, способен ли идентифицированный эффект усиления иммунных реакций в мочевом пузыре в ответ на введение флагеллина влиять резистентность животных к урологичкским инфекциям.В качестве инфекционного агента была выбрала Е.соИ, которая является наиболее частым (до 85%) возбудителем инфекций мочевого пузыря. Для эксперимента использовали мышей линии ВАЬВ/с, самок 18 г, которым за 16 часов и за 8 часов до внутрипузырной инсталляции Е.соН вводили лиганд Толл-подобного рецептора 5 - флагеллин. Внутрипузырное заражение животных Е.соИ осуществляли через катетер. Через 1 и 4 дня после заражения в каждой группе усыпляли по 7 животных, у которых отбирали мочевой пузырь. Органы гомогенизировали на шаровой мельнице. Далее для каждой пробы готовили набор 10-кратных разведений. Количество бактерий определяли методом высева разведений гомогенатов мочевого пузыря на средуЭндо. Через сутки подсчитывали количество колоний Е.соН выросших на твердой питательной среде. Результаты эксперимента представлены на рисунке 11 (количество бактерий в мочевом пузыре через 1 день и через 4 дня после заражения животных).

И П)

ю о

о т

8 $

Б 5

? д

£ ш

§ °

X 6

Критерий Стьюдента р=0,31 р=0,21

4

Критерий Стьюдента р=0,44 р=0,03

Флагеллин Флагеллин Контроль -16 часов -8 часов

Флагеллин Флагеллин Контроль -16 часов -8 часов

Рисунок 11. Количество бактерий в мочевом пузыре через 1 день (А) или 4 дня (Б) после заражения мышей £.со//(красным показана медиана).

Таким образом, в результате эксперимента было показано, что введение мышам флагеллина за 8 часов до внутрипузырного заражения £ со/г достоверно увеличивает резистентность организма к данной инфекции.

Полученные в результате работы данныепозволшш выявить органы, в которых при подкожном введении лигандов Т1Л2,4,5 происходит индукция наиболее сильных иммунных реакций, и в дальнейшем могут быть использованы при создании новых более эффективны адъювантов и иммуномодуляторов, а также при разработке средств немедленной защиты от патогенных микроорганизмов.

выводы.

1) Показано, что профиль активации ОТ-кВ в органах в ответ на стимуляцию различных представителей Толл-подобных рецепторов значительно варьирует.

2) Впервые показано, что подкожное введение лиганда ТЪЯ 5 приводит к высокому уровню активации ОТ-кВ в печени (в 64 раза) и мочевом пузыре (в 140 раз), в отличие от лигандов Т1Л2 и ТЫ14, для которых максимальное увеличение активации ОТ-кВ относительно контроля на превышает 30 раз для печени и 10 раз для мочевого пузыря.

3) Впервые показано, что в клетках печени активация ОТ-кВ в ответ на стимуляцию ТЬЯ5 происходит в гепатоцитах, а в ответ на стимуляцию 1X1*4 в клетках Купфера

4) Впервые показано, что в мочевом пузыре активация ОТ-кВ в ответ на подкожное введение флагеллина и ЛПС происходит в уротелии, а в ответ на липопептид в уротелии и клетках соединительной ткани.

5) Показано, что при стимуляции ТЫ12,4,5 профиль экспрессии генов принципиально различается как в печени, так и в мочевом пузыре.

6) Показано, что цитокиновый и хемокиновый статус в печени и мочевом пузыре отличаются при стимуляции лигандами ТЫ12,4,5.

7) Показано, что активация ТЫ1 5, в отличие от 1X1*2,4, повышает резистентность организма по отношению к Б.ЦрЫтигтт.

8) Впервые показано, что активация ТЬЯ5 повышает резистентность организма по отношению к урологической инфекции, вызванной£.со/г.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Tukhvatulin AI. Combined stimulation of Toll-like receptor 5 and NODI strongly potentiates activity of NF-кВ, resulting in enhanced innate immune reactions and resistance to Salmonella enterica serovar Typhimurium infection. / AI Tukhvatulin, II Gitlin, DV Shcheblyakov, NM Artemicheva, LG Burdelya, MM Shmarov, BS Naroditsky, AV Gudkov, AL Gintsburg, DY Logunov.// Infect Immun. - 2013 -81(10) - C.3855-3864.

2. Burdelya LG. Central role of liver in anticancer and radioprotective activities of Toll-like receptor 5 agonist/ LG Burdelya, CM Brackett, В Kojouharov, II Gitlin, KI Leonova, AS Gleiberman, S Aygun-Sunar, J Veith, С Johnson, GJ Haderski, P Stanhope-Baker, S AUamaneni, J Skitzki, M Zeng, E Martsen, A Medvedev, D Scheblyakov, NM Artemicheva, DY Logunov, AL Gintsburg, BS Naroditsky, SS Makarov, AV Gudkov//Proc Natl AcadSci U S A -2013-110(20)-C.1857-1866.

3. Spengler ML. Core circadian protein CLOCK is a positive regulator of NF-KB-mediated transcription/ ML Spengler, KK Kuropatwinski, M Comas, AV Gasparian, N Fedtsova, AS Gleiberman, II Gitlin, NM Artemicheva, KA Deluea, AV Gudkov, MP Antoch/Proc Natl AcadSci USA- 2012-109(37) - C.2457-2465.

4. Артемичева H.M. Тезисы IV международной школы молодых ученых по молекулярной генетике «ГЕНОМИКА И БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ»/Н.М. Артемичева,Д.В.Щебляков, Д.Ю. Логунов/ Звенигород, 2010

5. Артемичева Н.М. ТсзисыУШмсждународпой научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения», Москва 2010

6. Фармацевтическая композиция на основе лигандов патгерн-распознающих рецепторов, способ ее использования в качестве иммуностимулятора для лечения инфекций, вызванных бактериальными и вирусными патогенами, способ ее использования в качестве адъюванта в составе вакцин: пат. 2497541 Рос. Федерация: МПК А61К38/05, А61К31/739, А61Р31/00, А61Р37/04 / ТухватулинА.И., Логунов Д.Ю., Щебляков Д.В., Артемичева Н.М., Филиппова Н.Е., Народицкий Б.С., Гинцбург А.Л.; заявитель и патентообладатель федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации, заявл. 20.07.2012, опубл. 10.11.2013

БЛАГОДАРНОСТИ

Выражаю глубокую благодарность моему научному руководителю, доктору биологических наук Логунову Денису Юрьевичу, а также доктору биологических наук, профессору Народицкому Борису Савельевичу, доктору биологических наук, профессору Гудкову Андрею Владимировичу за предоставление возможности выполнения данной диссертационной работы, всестороннюю помощь и внимание. Искренне благодарю доктора биологических наук, Глейбермана Анатолия Симоновича, Гитлина Илью Исааковича, Леонову Катеринуза помощь в выполнении отдельных этапов работы. Выражаю искреннюю благодарностькандидату биологических наук Тухватулину АмируИльдаровичу, а также сотрудникам лабораторий молекулярной биотехнологии, клеточной микробиологии, иммунобиотехнологии ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, сотрудникам лаборатории клеточного стрессаГ^шеПРагкСапсегГпзМШс, ВиЯа1о>ГУ за помощь и ценные советы в работе.

Выражаю свою признательность ученому секретарю диссертационного совета доктору медицинских наук, профессору Русаковой Екатерине Владимировне, рецензенту кандидату биологических наук, Седовой Елене Сергеевне и рецензенту кандидату биологических наук Кожушному Андрею Петровичу за помощь в подготовке материала диссертации к защите.

Подписано в печать 19.03.2015 г.

Заказ № 104 Типография ООО "Медлайн-С" 125315, г. Москва, Ленинградский пр-т, д.78, к.5 Тел. (499)152-00-16 Тираж 100 шт.