Автореферат и диссертация по медицине (14.03.02) на тему:Клинико-патоморфологический, ультраструктурный, иммуногистохимический и молекулярно-биологический анализ печени при хроническом гепатите

На правах рукописи

Виноградова Елена Владимировна

КЛИНИКО-ПАТОМОРФОЛОГИЧЕСКИЙ, УЛЬТРАСТРУКТУРНЫЙ, ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЙ И МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПЕЧЕНИ ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ ГЕПАТИТЕ

14.03.02 - патологическая анатомия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Новосибирск - 2015

Работа выполнена в лаборатории клинической морфологии и в лаборатории ультраструктурных основ патологии Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Институт молекулярной патологии и патоморфологии» (Новосибирск).

Научные консультанты:

доктор медицинских наук,

профессор Непомнящих Давид Львович

доктор биологических наук,

доцент Постникова Ольга Алексеевна

Официальные оппоненты:

Майбородин Игорь Валентинович, доктор медицинских наук, профессор, ведущий научный сотрудник лаборатории стволовой клетки ФГБУН Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (Новосибирск).

Кливер Евгений Эдуардович, доктор медицинских наук, заведующий патологоанатомическим отделением ФГБУ Новосибирского научно-исследовательского института патологии кровообращения имени академика E.H. Мешалкина МЗ РФ.

Авдалян Ашот Меружанович, доктор медицинских наук, заведующий лабораторией исследований молекулярно-генетических характеристик опухолей ФГБНУ «Российского онкологического научного центра имени H.H. Блохина, Алтайский филиал» (Барнаул).

Ведущая организация:

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт клинической и экспериментальной лимфологии», лаборатория функциональной морфологии лимфатической системы (Новосибирск).

Защита состоится: «_» _ 2015 г. в _ час.

на заседании совета Д 001.037.01 в ФГБНУ «Институт молекулярной патологии и патоморфологии» по адресу 630117, Новосибирск, ул. Ти-макова, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте ФГБНУ «Институт молекулярной патологии и патоморфологии» http:// pathomorphology.soramn.ru

Автореферат разослан «_»_2015 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета доктор биологических наук,

профессор Молодых Ольга Павловна

российская

ГОСУДАРС Mil III1ЛЯ БИШ1ИОПКД Г 2HI5

БЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Печень относится к органам, физиологическая и репаративная регенерация которых выражается примерно в одинаковой степени одновременно в двух формах - клеточной и внутриклеточной, т. е. осуществляется как с увеличением числа клеток, так и путем гиперплазии ультраструктур в сохранившихся клетках (Court F.G. et al., 2002).

Хронические заболевания печени являются серьезной проблемой современной гепатологии, что обусловлено значительным распространением и ростом заболеваемости острыми и хроническими формами вирусных гепатитов и алкогольных поражений печени (Ивашкин В.Т., 2002; Хазанов А.И., 2005; Poovorawan V. et al., 2002; Wang L.Y. et al., 2003). По данным А.И. Хазанова (2002), около 2/3 летально закончившихся заболеваний печени составляют циррозы. Вирусные гепатиты В, С и токсическое воздействие этанола являются наиболее частыми этиологическими факторами развития цирроза печени (Логинов А.С., Аруин Л.С., 1985; Шерлок Ш., Дули Дж., 1999; Хазанов А.И., 2004; Непомнящих Д.Л. и др., 2004, 2005).

Гепатоциты представляют собой огромную клеточную систему, специализированную на выполнение многообразных метаболических и биосинтетических функций. Несмотря на то, что ткань печени на первый взгляд выглядит мономорфной, она гетерогенна с точки зрения и структуры, и функции (Герок В., Блюм Х.Е., 2009). Эта гетерогенность обусловлена кровоснабжением дольки: клетки, локализующиеся в перипортальной зоне, отличаются от клеток перивенулярной зоны по набору ключевых ферментов, рецепторов и субклеточных структур и в связи с этим имеют различные функциональные способности (Kiniec Z., 2001 ). В большинстве случаев мозаичность повреждений связана с метаболической гетерогенностью гепатоцитов.

Изменения гепатоцитов, интерпретируемые как дистрофические, могут отражать как повреждение их структур и нарушение функции, так и наоборот, интенсивную функцию клеток, их повышенную метаболическую активность. Особенно наглядно это положение подтверждается при использовании элеюронной микроскопии, что позволяет не только видеть изменения ультраструктуры клегки, но одновременно оценивать ее функциональное состояние. Д.С.Саркисовым (1993) показано, что даже при выраженной жировой дистрофии гепатоцита сохраняется достаточно высокий уровень биосинтетических реакций в ядерном и цитоплазмати-ческом компартментах.

В исследование состояния печени включает группу вирусологических и иммунологических показателей, основанных на применении современных методов, в том числе молекулярной биологии. Имеется достаточно большое количество исследований по ассоциации полиморфизма генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков (Вавилин В. А., 2002,2013), опухолевым заболеваниям и быстро прогрессирующим циррозам печени

(Непомнящих Д.Л. и др., 2006). Тем не менее, даже в период высокоразвитого вирусологического, иммунологического и молекулярно-генетиче-ского анализа структурное исследование печени остается необходимым для оценки изменений ткани органа.

Известна пластичность эндотелиальных клеток сосудов, являющихся активными участниками ряда ключевых физиологических функций, в том числе транспорт кислорода и питательных веществ к тканям (Patel-Hett S., D'Amore Р.А., 2011 ). Среди других важных функций эндотелиоцитов - регуляция тонуса сосудистой стенки и процессов свертывания крови, участие в ангиогенезе и воспалении, что имеет фундаментальное значение в развитии широкого спектра адаптивных и патологических процессов (Bedi S. et al., 2008). Эндотелиоцитам свойственны тканевая специализация и тканеспеци-фичный полиморфизм, что определяет наличие нескольких дефинитивных форм структурной организации капилляров: соматических с непрерывной эндотелиальной выстилкой, фенестрированных и синусоидных (Braet F. et al., 2009; Jacobs F. et al., 2009; March S. et al., 2009; Cogger V.C. et al., 2010; Kawasaki T. et al., 2010; Xie G. et al., 2012; Yokomori H. et al., 2012).

Увеличение частоты выявления микст-инфекции HCV+HBV связано с улучшением качества идентификации вирусов (Михайлов М.И., 2002; Аб-дурахманов Д.Т., 2002). У пациентов с хронической HCVh HBV-инфекцией наблюдается более тяжелое течение и быстрое прогрессирование патологического процесса в печени, исходом которог о является цирроз (Змызгова

A.В., 2002; Майер К.-П., 2004; Lok A.S. et al., 2002). На развитие и темпы прогрессирования цирроза печени оказывают влияние такие повреждающие факторы, как употребление этанола, подпеченочный холестаз, прием гепатотоксичных лекарств, недостаточность кровообращения (Сюткин

B.В. и др., 2000; Танащук Е.Л., Апросина З.Г., 2001 ; Хазанов А.И., 2002; Маевская М.В., 2004).

Взаимодействие между вирусом гепатита С и иммунной системой инфицированного находится в фокусе активного изучения. HCV является РНК-вирусом с высоким уровнем генетической вариабельности, поэтому вирус может ускользать от иммунного ответа макроорганизма посредством продолжающихся мутаций (Colina R. et al., 1999; Kim Y.J. et al., 2005). Другой характеристикой HCV-инфекции является не только неадекватность гуморального и клеточного иммунного ответа, но и нередкое развитие аутоиммунного феномена (Ordi-Ros J. et al., 2000). Таким образом, перси-стенция 11CV связана с развитием спектра иммунопатологических реакций, варьирующих от «безопасной» продукции органонеспсцифических антител до лимфопролиферативных процессов, таких как смешанная криоглобули-нсмия II типа и неходжкинские лимфомы (Lauer G.M., Walker B.D., 2001).

HCV реплицируется не только в гепатоцитах, но и в мононуклеарных клетках периферической крови, клетках костного мозга и других органов, даже центральной нервной системы (Laskus Г. et al., 2000; Forton D.M. et al., 2004; Castillo I. et al., 2005; Goncalves P.L. et al., 2005). Лимфотропизм

HCV указывает на прямое взаимодействие специфических протеинов вируса, в частности, core, с регуляторными механизмами и функциями лимфоидных клеток (Schuttler C.G. et al., 2004; Tillmann H.L. et al., 2005). Результатом таких взаимодействий может быть модификация иммунного ответа против антигенов HCV и возникновение патологических реакций против аутоантигенов.

Остается спорным вопрос, действительно ли виремия отражает количество вируса в печени, так как методы, используемые для количественного определения уровня РНК в печени, основаны на первичной экстракции из общей РНК гепатоцитов, количественное содержание вируса в гепа-тоцитах (точнее, число инфицированных гепатоцитов) - на чувствительности и специфичности метода. При использовании гибридизации in situ (Rodriguez-Iñigo E. et al., 1999) установлено, что уровень виремии имеет отношение к числу инфицированных гепатоцитов у HCV-инфицированных пациентов с хроническим активным процессом - виремия коррелировала с процентом HCV-инфицированных гепатоцитов. Вероятно, оба варианта патогенеза хронической HCV-инфекции могут сосуществовать одновременно, и одним из возможных путей изучения является оценка корреляции между уровнем вирусной нагрузки и степенью повреждения печени (Haydon G.H. et al., 1998; Altiparmak. E. et al., 2001).

Цель исследования - изучить клиническо-патоморфологические, уль-траструюурные, иммуногистохимические и молекулярно-биологические основы межклеточных взаимодействий популяций печени для разработки концепции эндотелиально-стромально-паренхиматозньгх взаимодействий при хроническом гепатите.

Задачи исследования:

1. Изучить внутриклеточную реорганизацию основных клеточных популяций печени при воздействии РНК-содержащего вируса гепатита С (HCV-инфекция).

2. Провести иммуногистохимическое исследование биоптатов печени с использованием реакции с NS3-aHTHreHOM HCV для оценки количества HCV-инфицированных гепатоцитов и сопоставить полученные данные с результатами патоморфологического анализа.

3. Изучить роль репликации вируса гепатита С в развитии поражения печени при хронической HCV-инфекции по данным патоморфологического исследования биоптатов печени и молекулярно-биологического анализа различных биологических субстратов.

4. Изучить характер внутриклеточной реорганизации основных клеточных популяций печени при хронической HCV-инфекции и микст-инфекции HCV+HBV.

5. Провести кпинико-морфологическое изучение пациентов с циррозом печени инфекционно-вирусного генеза (микст-инфекция HCV+HBV).

6 . Провести клинико-морфологическое изучение пациентов с циррозом печени инфекционно-токсического (HCV+HBV+этанол) генеза.

Научная новизна. Впервые проведено исследование маркеров репликации вируса гепатита С в различных биологических субстратах (по данным ПЦР с РНК НСУ), количества инфицированных гепатоцитов (по данным иммунодетекции Ы83-антигсна НСУ в биоптатах печени), уровня виремии и генотипа НСУ в сопоставлении со степенью активности хронической НСУ-инфекции. Показано, что наличие РНК вируса гепатита С в крови и/или ткани печени (по данным ПЦР) и число инфицированных гепатоцитов (по экспрессии N83 Ag при иммуногистохимическом исследовании) не имеют достоверной связи со степенью активности инфекционного процесса, оцениваемой по клинико-биохимическим тестам и структурным изменениям печени.

Установлено, что при достаточно высоком уровне виремии (от 106 до 108 копий НСУ в 1 мл плазмы) доминировали минимальные изменения структуры печени: в 60% случаев выявлена слабо выраженная степень активности НСУ-инфекции (г=0,631, р < 0,001). Независимо от генотипа НСУ доминировала слабо выраженная степень активности инфекционного процесса (в том числе при генотипе 1Ь - в 70% случаев). Отсутствие зависимости между репликацией НСУ и степенью поражения печени при хронической НСУ-инфекции обусловлено выраженной антивирусной реакцией гепатоцитов, фенотипически проявляющейся клеточно-инво-лютивной дистрофией.

Проведено сравнительное комплексное исследование цирроза печени инфекционного (НСУ+НВУ) и токсического (этанол) генеза. Показано, что для инфекционно-вирусного цирроза печени наиболее типичны ге-патомегалия, холестаз и выраженные внепеченочные проявления; при инфекционно-токсическом циррозе печени сочетаются гепатоспленоме-галия, отечно-асцитический синдром и признаки декомпенсированной портальной гипертензии. Важное отличие этанолового цирроза печени -высокие показатели желтухи и холестаза, в том числе 1ТТ11, по сравнению с другими группами (р<0,05).

Особенностями морфологических изменений при НС У+Н ВУ-циррозе печени являются сочетание выраженного портального и перипортального фиброза (100%), центрального (метаболического) и перигепатоцеллюляр-ного фиброза (по 45% случаев), при сочетанием воздействии этанола увеличивается доля метаболического и перигепатоцеллюлярного фиброза, при алкогольном циррозе доминирует центральный (метаболический) фиброз.

Впервые установлено, что при хронической микст-инфекции НСУ+НВУ доминирует умеренно прогрессирующий фиброз печени - 54% случаев. При микст-инфекции в сочетании с воздействием этанола темны прогрессирования распределены равномерно, что определяется периодами абстиненции. В целом, отмечено ускорение темпов фиброгенеза и развития цирроза печени при воздействии гепатотоксичных факторов, главными из которых являются этанол и гельминтоцидные препараты.

Теоретическая и практическая значимость. Полученные результаты раскрывают новые закономерности тканевых, клеточных и внутриклеточных реакций, имеющие большое теоретическое и практическое значение. Отсутствие зависимости между репликацией НСУ и степенью активности патологического процесса в печени требует критического пересмотра алгоритмов диагностики и лечения хронического гепатита С, ориентированных на результаты ПЦР как основной диагностический и прогностический фактор заболевания, и подчеркивает необходимость биопсии печени для адекватной диагностики и оценки динамики патологического процесса.

Данные проведенного исследования свидетельствуют о важности комплексного морфологического изучения биопсий печени для дифференциальной диагностики, определения прогноза и тактики терапии хронических заболеваний печени. Результаты исследования целесообразно внести в курс преподавания соответствующих разделов гистологии и гтатоморфологии.

Основные положения выносимые на защиту:

1. Морфогенез хронического гепатита определяется соотношением альтеративных факторов, к которым относятся прямое цитопатическое и иммуноопосредованное действие вируса, и адаптивных реакций организма, среди которых особую роль играют реакции паренхиматозных клеток печени, обладающих собственной программой антивирусной защиты.

2. Показано, что при минимальной и слабо выраженной активности инфекционного процесса (преобладающей в клинической картине НСУ-инфекции) центральные события локализуются в цитоплазме гепатоцитов с соблюдением баланса обратимых альтеративных изменений и внутриклеточной регенерации, что позволяет сохранять количественный и качественный состав популяции паренхиматозных клеток и обеспечивает длительный латентный этап развития инфекции.

3.Активность патологического процесса по данным биохимического анализа и морфологического исследования у больных с хронической НСУ-инфекцией не зависит от количества инфицированных вирусом гепатита С гепатоцитов (по данным иммунодетекции ^З-антигена НСУ в биоптатах печени), что свидетельствует об относительно слабом цито-патическом действии вируса, не вызывающем некрозов паренхиматозных клеток. Выявленная ассоциация интенсивности иммуногистохимической реакции с ^З-антигеном и выраженностью липидной инфильтрации гепатоцитов указывает на участие вируса гепатита С в развитии данного морфологического феномена, который может служить косвенным маркером НСУ-инфекции.

4. Наличие РНК НСУ в крови и/или ткани печени (по данным ПЦР) и число инфицированных гепатоцитов (по экспрессии NSЗAg) не имеют достоверной связи со степенью акгивности инфекционного процесса, оцениваемой по структурным изменениям печени и клинико-биохими-ческим тестам.

5. Особенностями морфологических изменений при HCV+HBV-циррозе печени являются сочетание выраженного портального и пери-портального фиброза, центрального (метаболического) и перигепатоцел-люлярного фиброза, атакже во всех случаях - гиперплазия лимфоидной ткани. Изменения паренхиматозного компартмента печени определялись мелко- и средневезикулярной липидной инфильтрацией гепатоцитов, ацидофильной дегенерацией, внутриклеточным холестазом и диффузной клеточно-инволютивной дистрофией, при сочетанном воздействии этанола увеличивается доля метаболического и перигепатоцеллюлярного фиброза.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на Всероссийской научно-практической конференции, посвященной памяти профессора Ю.Г. Целлариуса «Клинико-морфологические аспекты общепатологических процессов при социально-значимых заболеваниях» (Новосибирск, 2004), на V молодежной научной конференции СО РАМН «Фундаментальные и прикладные проблемы современной медицины» (Новосибирск, 2004), 12-й и 13-й Российской научно-практической конференции «Достижения современной гастроэнтерологии» (Томск, 2004, 2005), на Международных конгрессах «Евромедика» (Ганновер, 2004, 2005), на XV научно-практической конференции врачей «Актуальные вопросы современной медицины» (Новосибирск, 2005), на Ученом совете ГУ НИИ региональной патологии и патоморфологии СО РАМН (Новосибирск, 2005). 12-й Российской гастроэнтерологической неделе (Москва, 2006); 13-м Международном Славяно-Балтийском научном форуме «Санкт-Петербург- Гастро-2011» (Санкт-Пегербург, 2011); 19-й научно-практической конференции «Достижения современной гастроэнтерологии» (Томск, 2011); XVII Ежегодном Российском конгрессе «Гепатология сегодня» (Москва, 2012); 14-м Международном СлавяноБалтийском научном форуме «Санкт-Петербург - Гастро-2012» (Санкт-Петербург, 2012); IV Всерос-сийской научно-практической конференции с международным участием «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов» (Новосибирск, 2012); XVIII Ежегодном Российском конгрессе «Гепатология сегодня» (Москва. 2013); Ученом совете ФГБУ Научно-исследовательского института региональной патологии и патоморфологии СО РАМН (Новосибирск, 2014).

Публикации. По теме докторской диссертации опубликовано 48 научных работ, из них 20 - в журналах по списку ВАК и в системе цитирования (библиографической базе) Web of Science.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 280 страницах компьютерного текста; состоит из введения, обзора литературы - 1 глава, характеристики клинических наблюдений и методов исследования - 1 глава, результатов собственных исследований - 7 глав, обсуждения, выводов и списка литературы. Текст иллюстрирован таблицами и рисунками (диаграммы, микрофото- и электронограммы).

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Проведено комплексное морфофункциональное исследование печени при хроническом гепатите С, микст-инфекции НСУ+НВУ, циррозе печени при микст-инфекции НСУ+НВУ.

Хронический гепатит С. Исследованы 112 пациентов с хронической НСУ-инфекцией (75 мужчин и 37 женщин в возрасте от 18 до 62 лет); 43 пациента инфицированы при внутривенном употреблении наркотических веществ (опиатов), среди них преобладали мужчины молодого возраста, частота и длительность употребления наркотических веществ варьировали.

Хронический микст-гепатит С+В: Клинические варианты. Проведено комплексное клиническое и патоморфологическое изучение микст-инфекции НСУ+НВУ, которое включало 112 пациентов с маркерами хронических гепатитов С и В. Возраст пациентов составил от 16 до 69 лет, 68 мужчин и 44 женщины.

Цирроз печени при микст-инфекции НСУ+НВУ. Проведено клинико-морфологическое исследование 79 пациентов с циррозом печени вирусной (НСУ+НВУ-инфекция) и этаноловой этиологии. Возраст пациентов варьировал от 17 до 71 лет, 40 женщин, 39 мужчин. Пациенты разделены на три группы: 1 -ю составили 15 пациентов с циррозом печени инфекци-онно-вирусного генеза (микст-инфекция НСУ+НВУ), 2-ю - 19 человек с циррозом печени инфекционпо-токсического (НСУ+НВУ+этанол) генеза, 3-ю группу составили 45 пациентов с алкогольным циррозом печени.

При исследовании пациентов проводилось изучение эпидемиологического и этанолового анамнеза, клинической картины, результатов клинико-биохимического, серологического, молекулярно-биологическо-го и патоморфологического исследований. Применяли ультразвуковое сканирование и компьютерно-томографическое исследование органов брюшной полости, фиброэзофагогастродуоденоскопию, рентгенологическое исследование пищевода и желудка, пункционную биопсию печени. Исследовали в динамике биохимические показатели крови: уровень аминотрансфераз (АлАТ и АсАТ), щелочной фосфатазы (ЩФ), гамма-глютамилтранспептидазы (ГГТП), уровень билирубина, общего белка, альбуминов, холестерина, глюкозы. Изучали систему гемостаза: длительность протромбинового времени, уровень протромбинового индекса; определяли показатели периферической крови - гемоглобин, эритроциты, тромбоциты, лейкоциты, СОЭ.

Методы светооптического и электронно-микроскопического исследования. Световая микроскопия. Для проведения световой микроскопии образцы фиксировали в охлажденном до 4°С 4%-м растворе параформальдегида, приготовленном на фосфатном буфере Миллонига (рН 7,2 - 7,4). Далее следовали обезвоживание и заливка в парафин по общепринятой схеме. Парафиновые срезы окрашивали гематоксилином и эозином в комбинации с реакцией Перлса, по ван Гизону с докраской эла-

стических волокон резорцин-фуксином Вейгерта, ставили ШИК-реакцию (Меркулов Г.А., 1969; Саркисов Д.С., Перов Ю.Л., 1996). Полутонкие срезы окрашивали реактивом Шиффа и азуром П. Исследование проводили в универсальном микроскопе Leica DM 4000В (Германия). Микрофотографии получали с использованием цифровой фотокамеры Leica DFC 320 и компьютерной программы Leica QWin.

Электронная микроскопия. Использовали фиксацию в охлажденном до 4°С 4% растворе параформальдегида, приготовленном на фосфатном буфере Миллонига (pi 1 7,2 - 7,4). Материал дофиксировали в 1 % растворе 0s04, обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации, проводили через ацетон и помещали в смесь эпона и аралдита. Полутонкис срезы готовили на ультрамикротоме Tesla, окрашивали реактивом Шиффа и азуром II. Ультратонкие срезы получали на ультрамикротоме LKB III, контрастировали насыщенным спиртовым раствором уранилацетата и цитратом свинца в парах щелочи натрия и исследовали в электронных микроскопах серии JEM (100 SC и 1010) при ускоряющем напряжении 80 кВт.

При анализе патоморфологических изменений в биоптатах печени использована Лос-Анджелесская классификация хронических гепатитов (Desmet V.J. et al., 1994), выделяющая в качестве ведущей характеристики этиологический фактор, а также обязательное определение степени активности инфекционного процесса и стадии развития фиброза. Оценку степени активности (А) гепатита проводили по 4-х-балльной системе: AI - минимальные, А2 - слабо выраженные, A3 - умеренные, A4 - выраженные изменения. Общую степень активности инфекционного процесса оценивали по трем составляющим: клинической (болевой синдром и гепатомегалия), биохимических тестах с ведущей ролью цитолитического синдрома (АлАТ) и структурным изменениям печени.

Серологическое обследование проводили методом иммуноферментного анализа с использованием тест-систем ЗАО «Вектор-Ьест». Выявляли серологические маркеры вирусов гепатита: А (aHTHÜAV-IgM), В (HBsAg, HBeAg, HBc-IgM, HBc-IgG, HBsAb, I IBeAb), С (анти-HCV суммарные и антитела к Core- и NS-антигенам) и D (анти-HDV).

Методы иммуногистохимического исследования. Иммуногистохи-мическое исследование проводили на парафиновых срезах толщиной 5 мкм, помещенных на обработанные адгезивом предметные стекла. Применяли двухшаговый непрямой иммунопероксидазный метод со стрепта-видин-биотиновой системой визуализации. Демаскировку Ы83-антигена осуществляли кипячением в рабочем растворе ретривагена А (pH 6,5): эндогенную пероксидазную активность гепатоцитов ингибировали 0,3%-ным раствором 11202 в фосфатно-солевом буфере. В качестве первичных антител использовали мышиные моноклональные антитела класса lgG2b к рскомбинантному белку NS3 (NS3-HCV) (NovoCastra Laboratories Ltd, Великобритания) в разведении 1:25; в качестве вторичных антител - универсальные биотинилированные антитела. Инкубацию с первичными

и вторичными антителами и реакцию со стрептавидин-пероксидазным комплексом проводили в термостате 37°С. После визуализации продуктов иммунной реакции хромогеном (диаминобензидином) срезы докрашивали в течение 20 мин гематоксилином Майера и выдерживали в водопроводной воде 10 мин. Негативный контроль иммуногистохимического исследования состоял в использовании срезов без обработки первичными антителами.

Метод ПЦР. Исследования выполнены с помощью диагностических наборов QIAamp Viral PN A Kit (Cat 29504, QIAGEN, Germany), ЗАО «Сибэнзим» (Новосибирск), Q1AEX II Gel Extraction Kit (Cat 20021, QIAGEN, Germany) и коммерческих тест-систем научно-производственной лаборатории по разработке и производству препаратов для диагностики заболеваний человека и животных при ЦНИИ эпидемиологии (Москва).

Для выделения РНК вируса гепатита С из всех биологических субстратов использовали метод кислофенольной экстракции. Комплементарную ДНК получали путем реакции обратной транскрипции с помощью РНК-зависимой ДНК-полимеразы (транскриптазы/ревертазы). Далее проводили стандартную полимеразную цепную реакцию с помощью Тац-полимеразы с использованием праймеров, специфичных к наиболее консервативному участку генома вируса гепатита С. По стандартной методике проводили 40 циклов амплификации на термоцикл ере производства компании «Perkin Elmer». Детекция результатов реакции на определение вируса проводилась электрофоретическим методом в агарозном геле с концентрацией 1,75%.

Генотипирование. Генотипирование HCV осуществлялось путем сравнения последовательностей 5'IJTR и частей гена выявленных изолятов HCV с данными базы «Генбанк». Оценка уровня виремии проводилась с помощью тест-системы научно-производственной лаборатории ЦНИИ эпидемиологии (Москва). При исследовании пункционной биопсии печени, кроме световой микроскопии, парафиновых и полутонких срезов и электронной микроскопии, проводили иммуногистохимическое исследование парафиновых срезов на выявление NS3Ag HCV и гладкомышечного а-актина.

Математическую обработку полученных данных проводили с помощью средств статистического анализа MS Excel ХР. Применяли методы корреляционного, регрессионного и дисперсионного анализа. Различия сравниваемых параметров считали значимыми, если вероятность ошибки Р была меньше 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Патоморфологическос исследование биоптатов печени пациентов с хронической HCV-инфекцией

Морфогенез хронического гепатита С можно рассматривать по трем взаимосвязанным составляющим: поражение гепатоцитов, реакция непаренхиматозных клеточных популяций печени и ремоделирование соединительной ткани - развитие фиброза.

Для паренхиматозного компартмента характерны поражения дистрофического характера. Наиболее часто обнаруживали гепатоциты в состоянии жировой инфильтрации разной степени выраженности: от мелковезикулярных липидных включений, выявляемых лишь на полутонких срезах, до замещения всей цитоплазмы огромной липидной каплей, вызывающей деформацию и дислокацию ядра. Отмечено, что для гепатита С характерны мелковезикулярные липидиые включения, располагающиеся диффузно или субплазмолеммально.

Вторым по частоте патологическим феноменом, характеризующим состояние паренхиматозных клеток, была клеточно-инволютивная дистрофия. Эти гепатоциты светооптически отличались своеобразным «опустошением» цитоплазмы, резким снижением содержания гликогена и гипохромностью ядер, располагались группами, иногда образуя округлые поля, занимающие территорию нескольких долек, или большинства фрагментов долек биоптата. В единичных случаях в биоптатах выявляли паренхиматозные клетки с признаками ацидофильной дегенерации, гомогенной резко эозинофильной цитоплазмой и пикнотичными ядрами. Как правило, эти гепатоциты локализовались перипортально.

Ультраструктурный анализ гепатоцитов выявил их значительную гетерогенность. Доминировали клетки с признаками клеточно-инволю-тивной дистрофии - феномен «опустошенности» связан с редукцией цитоплазматических органелл. Выявлялась динамика дистрофического процесса от фокальной редукции внутриклеточных органелл до почти тотальной «опустошенности». Процесс дегенерации сопровождается формированием гетерогенных резидуальных телец, иногда очень многочисленных, локализующихся в различных участках цитоплазмы, нередко мигрирующих к васкулярному полюсу гепатоцита и обнаруживаемых в прос транстве Диссе. В гепатоцитах с «опустошенной» цитоплазмой сохранялось ядро и перинуклеарные скопления элементов гранулярной цито-плазматической сети, свободных рибосом, полисом и мелких митохондрий.

В большинстве биоптатов наблюдали заметное расширение и деформацию портальных трактов за счет клеточной инфильтрации и склероза, обычно с сохранением четких паренхиматозно-стромальных границ. Состав инфильтрата представлен лимфоцитами, макрофагами, а также фибробластами различной степени зрелости, количественное соотношение которых определяется преобладанием фиброза или инфильтрации в портальном тракте. В половине биоптатов обнаружена гиперплазия лим-фоидной ткани портальной стромы в виде формирования округлых фол-ликупоподобных образований, в некоторых образцах выявлены крупные лимфоидные фолликулы с герминативными центрами - морфологический маркер инфекции НСУ, а также признаки лимфодиапедеза, в результате которого появлялись внутрисинусоидальные и интергепатоцеллюлярные цепочки лимфоцитов и внутридольковые лимфоидные инфильтраты. Не-кробиотические очаги в паренхиме обнаруживали крайне редко, лишь

при высокой степени активности НСУ-инфекции, иногда выявляли вну-тридольковые постнекротические гранулемы.

В большинстве биоптатов установлена стадия слабо выраженного фиброза, фиброзные изменения касались прежде всего портальной стро-мы. Однако в половине случаев (преимущественно у наркозависимых пациентов) наблюдали формирование прогностически неблагоприятного очагового или диффузного перисинусоидального фиброза, а также склероз центральных вен с перивенулярным фиброзом. В большинстве случаев фиброз при хроническом гепатите С слабо выражен.

При вирусных поражениях печени ведущую роль в морфо- и цито-генезе инфекционного процесса играет отношение субпопуляций альтерированных и регенерирующих гепатоцитов (Непомнящих Д.Л., 1994, 1998). Кроме описанных ранее структурных изменений печени (Серов В.В., Севергина Л.О., 1996; Серов В.В., 1999), показано, что при хроническом гепатите С преобладает особая форма повреждения гепатоцитов, характеризующаяся редукцией цитоплазматических органелл и визуальной картиной «опустошенности» клеток (Непомнящих Г.И. и др., 1999).

Основу данной формы дистрофии составляет не альтерация и последующий некроз гепатоцитов, а снижение процессов восстановления «изношенных» цитоплазматических органелл за счет угнетения синтеза структурных белков - синдром регенераторно-пластической недостаточности (Непомнящих Г.И. и др., 1992). Этот вид дистрофии гепатоцитов имеет инволютивный морфологический фенотип, но, учитывая сохранение ядера и очагов внутриклеточной регенерации, можно считать это состояние клетки обратимым. Это можно интерпретировать и как защитную реакцию клетки в условиях вирусной инфекции.

Определение степени активности хронического гепатита С. Из 112 наблюдений в 21 случае установлена минимальная степень активности (А 1), в 62 - слабо выраженная (А2), в 26 - умеренная (АЗ) и лишь в 3 -выраженная степень активности (А4) инфекционного процесса. При пато-морфологическом исследовании биоптатов печени минимальная степень активности характеризовалась очаговыми дистрофическими изменениями гепатоцитов, слабой или умеренной мононуклеарной инфильтрацией стромы, ограниченной пределами портальных трактов, и отсутствием очагов некроза и некробиоза. При слабо выраженной степени активности (А2) дистрофия гепатоцитов имела более распространенный характер, нередко захватывая несколько попавших в биоптат долек, мононуклеар-ная инфильтрация, как правило, ограничивалась портальными трактами, но формировались сегментарные участки лимфодиапедеза в паренхиму; очаги некроза и некробиоза отсутствовали.

При умеренной степени активности (АЗ) дистрофия гепатоцитов сочеталась с моноцеллюлярными или более крупными, но единичными, очагами некроза, некробиоза или постнекротическими гранулемами.

Клеточная инфильтрация стромы была более интенсивной и активно, с

разрушением пограничной пластинки, проникала внутрь долек, вызывая дезинтеграцию гепатоцитов и их дегенерацию («ступенчатые некрозы»). Выраженная степень активности (А4) характеризовалась наличием некротической компоненты (внутридольковые очаги некроза и некробиоза), а также интенсивной, иногда полиморфной, и прогрессирующей инфильтрацией, распространяющейся с портальных трактов на септальные перегородки и паренхиму.

Выявление РНК HCV в различных биологических субстратах. При моноинфекции HCV репликация вируса гепатита С в сыворотке крови имела место в 77% случаев, в мононуклеарных клетках крови - в 73%; в сыворотке и мононуклеарах одновременно - в 55% наблюдений. В 18% случаев репликация обнаружена в клеточных элементах и отсутствовала в сыворотке крови. РНК HCV выявлена в образцах слюны у 7 человек из 34, в моче - у 5, у 3 пациентов - в обоих субстратах. РНК HCV в нативной ткани печени выявлена в 79% случаев. При комплексном обследовании (сыворотка, мононуклеарные клетки крови, ткань печени) три положительных результата получены в 52% наблюдений, по 4-м субстратам (учитывая образцы слюны или мочи) - в 15% случаев и по 5-ти - в 1 наблюдении (рис. I).

Анализ сопоставления серологических маркеров репликации вируса по данным ПЦР и степени активности инфекционно-вирусного процесса показал, что при наличии PHKHCV в сыворотке и/или мононуклеарных клетках крови в 71% случаев в биоптатах обнаружена минимальная (16%) и слабо выраженная (55%) степень активности процесса. При отрицательной реакции на РНК HCV также преобладали минимальные патологические изменения в ткани печени, причем количественные показатели по степени активности практически совпадали (рис. 2). Статистический анализ не выявил корреляционной связи между наличием репликации вируса в образцах крови и выраженностью структурных изменений в биоптатах печени.

ПЦР на РНК HCV в крови (сыворотка и мононуклеарные клетки) и ткани печени имела положительный результат в 67% случаев. В 15% случаев репликация выявлена только в образцах крови, в 12% - только в образцах печени, в 6% - маркеры репликации отсутствовали. При наличии репликации вируса в крови и ткани печени степень активности патологического процесса была преимущественно минимальной или слабо выраженной (68% случаев). При наличии репликации вируса в ткани биоптата печени в отсутствие серологических маркеров репликации во всех случаях обнаружена невысокая степень активности (А1 и А2). Обращает на себя внимание, что даже в отсутствие репликации вируса во всех субстратах регистрировалась более высокая (A3) степень активности.

Необходимо отметить, что в 4 из 5 наблюдений с наличием РНК HCV в образцах мочи, имелись повышенные показатели AJ1T (от 116 до 239) и сравнительно высокая степень активности инфекционного процесса по

ПЦР +

Моноиуклеары 73%

Сыворотка

+ .;vHr Моноиуклеары ;

55%

Сыворотка (-) +

Моноиуклеары

Слюна 21%

Моча 15%

Слюна f

Моча

Ш

I

9%

Сыворотка + Моноиуклеары + Ткань печени 52%

По 4-м субстратам (+ слюна или моча) 15%

По 5-ти субстратам 3%

Рис. I. Выявление РНК НСУ в биологических субстратах 36 пациентов с НСУ-инфекцией.

12 3 4

степень активности процесса

Рис. 2. Выявление РНК HCV в биологических субстратах 36 пациентов с HCV-инфекцией.

данным структурных изменений в ткани печени (АЗ); у 4 из 7 человек с положительным результатом Г1ЦР в образцах слюны в биоптатах печени также обнаружены достаточно значительные структурные изменения (АЗ).

Оценка уровня виремии. Низкая виремия (от 1000 до 1 млн геномных копий в 1 мл плазмы) выявлена в 6, умеренная (106 - 108) (предел тест-системы) - в 83 случаях. При низком уровне виремии минимальная степень активности инфекционного процесса (А 1) обнаружена в 2 случаях, слабая (А2) - в 3 и умеренно выраженная (АЗ) - в 1. При умеренной виремии Al обнаружена в 7, А2 - в 50, АЗ - в 25 и А4 - в 1 случае. При низком уровне виремии корреляция статистически незначима, но имеется зависимость между умеренной виремией и слабо выраженной степенью активности HCV-инфекции (г = 0,631, р < 0,001) (рис. 3).

6 пациентов

83 пациента

60

г = 0.631

50

40

30

20

10

0

Степень активности □ минимальная к умеренная О слабо выраженная О выраженная

Низкая в премия Высокая виремия

1ü' -10® копий I мл пгепмы 1Ü1 -10* копий / мл плазмы

Рис. 3. Уровень виремии HCV и степень активности хронического гепатита С.

Иммуногистохимическое исследование биопгагов печени при HCV-инфекции. При иммуногистохимическом выявлении NS3-airrarena вируса г епатита С обнаруживали окрашенные хромогеном группы гепато-цитов в различных участках долек; иногда NS3-6ejioK визуализировался в большинстве паренхиматозных клеток биоптата, но особенно значи тельной была реакция в участках пери портальной лимфоидной инфильтрации. В 70% наблюдений имелось диффузное распределение ^З-положительного материала в ткани печени, а в 30% мелкие ярко-коричневые цитоплазма-тическис включения локализовались преимущественно в перипортальных гепатоцитах. Интенсивность и характер распределения NS-3-антигена варьировали, он обнаружен во всех биоптатах, что дает возможность использовать его в качестве специфического маркера HCV-инфекции.

Сопоставление данных по интенсивности выявления данного эпигона вируса гепатита С с пагоморфологичсскими маркерами HCV-индуцированного поражения печени не выявило какой-либо зависимости, кроме феномена мелковезикулярной липидной дистрофии. При малой интенсивности ^З-специфического окрашивания в 72% случаев выявлялись единичные мелковезикулярные липидные включения в небольшом количестве гепатоцитов, средняя интенсивность иммуногистохимичсской реакции часто сочеталась (67%) с наличием мелких липидных включений в 60 - 70% гепатоцитов в биоптате, высокая интенсивность выявления NS3-антигена сопровождалась выраженным накоплением мелковезикулярных липидных вакуолей с поражением более 90% гепатоцитов биоптата.

I le обнаружено корреляции между числом NS3Ag-no3HTHBHbix клеток и генотипом HCV или уровнем сывороточных аминотрансфераз. Интенсивная (выраженная и умеренная) иммуногистохимическая реакция с NS3-антигеном HCV в биогпатах печени нередко сочеталась с нормальными показателями аминотрансфераз. В большинстве случаев выявление антител к ^З-белку в сыворотке крови сочеталось с экспрессией NS3-anTHreHa в

92 наблюдения

| Генотип | . | | . |

г. при А1 г, при Аг г» при Аз ;

[ГТь | 0.632 р<0,001 0,б72ЙШГ1

I 2 0,220 р>0,05 0.230 р>0.05 0,390 р<0.001 ( | За {0,343 р=0,002 (0,287 р=0,007 0,368 р<0,001 !

П минимальная в слабо выраженная О умеренная 1Ь 1а 2 За

Рис. 4. Генотипирование НСУ и степень активности хронического гепатита С.

гепатоцнтах, но в 37% случаев при позитивной иммуногистохимической реакции в сыворотке крови антитела к КБЗ-белку не выявлялись.

Таким образом, при полуколичественном анализе экспрессии ]М83А§ НСУ обнаружено, что поражение печени при хроническом гепатите С не зависит от числа инфицированных гепатоцитов: в 71% случаев обнаружена минимальная и слабо выраженная степень активности патологического процесса. В подавляющем большинстве случаев репликация НСУ в нативной ткани печени (80%) и образцах крови (83%) по данным ПЦР сопровождалась иммуногистохимическим выявлением ^З-антигена.

Генотипирование НСУ. Большинство пациентов (53% случаев) инфицированы вирусом генотипа 1Ь, 30% - генотипа 2 и 14% - генотипа За. При генотипах 1Ь и За почти в 100% случаев определялась умеренная виремия. При генотипе 2 в 10% наблюдений имела место низкая виремия, однако именно этот генотип ассоциировался с более высокими показателями активности патологического процесса (А2 и АЗ по 46% случаев). Наличие большого числа опийзависимых пациентов среди НСУ-инфицированных многократно увеличило пассаж вируса, что отразилось в довольно быстрой смене соотношения генотипов вируса (рис. 4).

Цитолитический синдром. Одним из основных функционально-биохимических маркеров активности гепатита является уровень сывороточных трансаминаз, в первую очередь, АлАТ. Показатели АлАТ колебались от 10 до 689 ЕД/л (112,62 ± 10,15 ЕД/л). При наличии репликации вируса в образцах крови уровень АлАТ составил 115,98 ± 11,42; в отсутствие репликации - 97,54 ± 19,98 ЕД/л (достоверные различия не выявлены).

Результаты статистического анализа показали, что существует положительная корреляция (Я = 0,66) между показателями АлАТ и выраженностью структурных изменений печени, но при детальном анализе обнаружено, что эта зависимость ослабляется при возрастании степени активности инфекционного процесса (Я2 = 0,52) (рис. 5). Преимущественно невысокий уровень АлАТ при хроническом гепатите С можно объяснить тем, что АлАТ является внутриклеточным ферментом, и увеличение его

Степень активности

Рис. 5. Зависимость степени активности НСУ-инфекции (1 - минимальная; 2 -слабо выраженная; 3 - умеренная; 4 - выраженная) но биоптатам печени (%) от уровня АлАТ.

показателей отражает цитолиз гепатоцитов, то есть гибель клетки путем колликвационного некроза; при хроническом гепатите С крайне редко развиваются некрозы такого типа.

Таким образом, обнаружены следующие основные закономерности, характеризующие патоморфогенез хронической НСУ-инфекции: отсутствие корреляционной связи между наличием РНК НСУ в крови и характером структурных изменений в печени; отсутствие зависимости между выявлением РНК НСУ одновременно в крови и ткани печени, а также уровнем виремии, и степенью активности процесса; поражение печени не зависит от числа инфицированных гепатоцитов (по иммунодетекции ^ЗАц НСУ).

Поражение печени при хронической НСУ-инфекции не имеет прямого отношения ни к количеству инфицированных гепатоцитов, ни к репликации ПСУ. Ведущими моментами в интерпретации этого феномена могут быть особенности патоморфогенеза хронической НСУ-инфекции. В биоптатах печени при хроническом гепатите С доминирует клеточно-инволютивная дистрофия (Непомнящих Г.И. и др., 1999), основным маркером которой является опустошенность цитоплазматического магрикса с сохранением ядерного компартмента и перинуклеарных фокусов внутриклеточной регенерации, что позволяет считать это состояние клетки обратимым.

Поданным комплексного морфологического исследования сделан вывод о том, что опустошение цитоплазмы является защитной реакцией или периодом санации гепатоцитов после цитопатического действия вируса. Санация гепатоцитов происходит путем экзоцитоза резидуальных структур без лизиса НСУ-ипфицированных клеток при сохранении структурно-функциональной целостности клетки и органа, в отличие от иммуноо-посредованной цитодеструкции, нередко сопровождающейся цитолизом гепатоцитов (Непомнящих Г.И. и др., 2002; Покровский В.И. и др., 2003).

По-видимому, ввиду определенной несостоятельности иммунной системы в борьбе с РНК-вирусом г епатита С, обладающим большим генети-

ческим разнообразием и изменчивостью, происходит экспрессия защитных реакций паренхиматозных клеток печени, их эволюционно сложившихся механизмов антивирусной защиты. Инфицированные гепатоциты могут быть активными участниками антивирусного ответа, и это является значительным изменением в существующей догме, которая рассматривает инфицированные гепатоциты в качестве только «жертв» инфекции.

Хронический микст-гепатит С+В: Клинические варианты

Клинико-патоморфологическое исследование микст инфекции НСУ+НВУ. В морфогенезе поражений популяции гепатоцитов при хронической микст-инфекции РНК-геномного вируса гепатита С и ДНК-геномного вируса гепатита В наибольшую роль играет ацидофильная дегенерация гепатоцитов, обнаруженная в 90% образцов. В целом, популяция паренхиматозных клеток характеризовалась выраженным полиморфизмом, обусловленным дистрофией гепатоцитов различного генеза - клеточно-инволютивной, ацидофильной, липидной, а также гетерогенностью по содержанию внутриклеточного гликогена. Липидные включения, преимущественно мелкокапельные, были выявлены практически во всех исследованных биоптатах, но количество липидосодержащих клеток было значительно меньшим по сравнению с моноинфекцией НСУ. Клеточно-инволютивная дистрофия, характеризующаяся редукцией ци-топлазматических органелл и «опустошенностью» цитоплазматического матрикса, развивалась достаточно часто, но найдена в меньшем числе образцов, чем при НСУ-инфекции, и с меньшим объемом вовлеченного в этот процесс гепатоцсллюлярного компартмента.

При хронической микст-инфекции НСУ+НВУ по сравнению с моноинфекцией НСУ реже наблюдается минимальная степень активности (18% против 33%) и чаще - умеренная (44% против 27%), что в целом характеризует течение хронического микст-гепатита В+С как более тяжелое. Распределение пациентов с гепатитом В+С по стадии заболевании имеет тот же профиль, что и при моноинфекции НСУ, с явным преобладанием случаев со слабо выраженным портальным фиброзом (69%), но при микст-ипфекции чаще была отмечена конечная стадия заболевания - цирроз печени.

В биоптатах печени при микст-инфекции НСУ+НВУ отмечена большая глубина и распространенность дистрофических изменений гепатоцитов в сравнении с моноинфекцией НСУ О превалировании патогенетической роли вируса гепатита С или В можно было косвенно судить по преобладанию того или иного вида дистрофических изменений в биоптате. Более чем в половине биоптатов были выявлены признаки умеренного либо слабо выраженного интрацеллюлярного холестаза, при этом гранулы желчных пигментов иногда имели тенденцию к диффузному распределению в цитоплазме паренхиматозных клеток. Нередко подобные включения обнаруживали также и в клетках Купфера.

Клеточная инфильтрация, в значительной мере определяющая активность патологического процесса, носила более выраженный характер. Часто клетки инфильтрата имели отчетливую тенденцию к проникновению в паренхиму, почти в трети случаев вызывая повреждение перипортальных гепатоцитов по типу ступенчатых некрозов. Вместе с тем, необходимо отметить снижение частоты формирования лимфоидных фолликулов в строме органа до 27% биопсий по сравнению с моноинфекцией HCV. Обращали на себя внимание значительно более часто обнаруживаемые альтеративные изменения в паренхиме печени в виде моноцеллюлярных и более крупных (занимающихтерриториюсгг2-4до6- 10 гепатоцитов) очагов некробиоза и некроза гепатоцитов с формированием постнекротических гранулем.

В 64% биопсий выявлены характерные изменения ядер перипортальных гепатоцитов в виде центральных просветлений нуклеоплазмы - перстневидные ядра, являющиеся морфологическим маркером репликации вируса гепатита В (Логинов A.C., Аруин Л.И., 1985). Количество двуя-дерных клеток, косвенно отражающих напряженность регенераторных процессов в печени, варьировало в разных биоптатах, но иногда было значительно повышенным.

Все портальные тракты расширены за счет клеточной инфильтрации и склероза, в большинстве случаев все портальные тракты фиброзирова-ны, в ряде случаев - с развитием фиброза междольковых перегородок и порто-центральных сепг. Светооптические изменения сосудистых компонентов портальных триад ограничивались изменениями их просвета: спазмом артерий и дилатацией вен. Морфологические признаки повышенной активности синусоидальных клеток обнаруживали реже, чем при моноинфекции HCV, менее характерным для биоптатов пациентов с микст-инфекцией было формирование лимфоидных фолликулов в строме и цепочек лимфоцитов в просветах синусоидов.

Выделены две группы пациентов с микст-гепати гом С+В: в 1 -й группе (серопозигивный вариант IiBV-инфекции) во всех случаях тестированы серологические маркеры и HCV-, и HBV-инфекции; во 2-й группе (серонегативный вариант) обнаружены серологические маркеры лишь HCV-инфекции, наличие HBV-инфекции подтверждено морфологическими маркерами (перстневидные ядра гепатоцитов - HBcorAg) и в ряде случаев - положительными результатами ПЦР на ДНК HBV в нативной ткани печени.

Клинико-морфологический анализ микст-инфекции HCV+HBV (се-ропозитивная и серонегативная формы HBV-инфекции) позволил выделить три патоморфогенетических варианта: типичный (с преобладанием типичных симптомов поражения печени) - 61 % случаев, холестатический - 25% и вариант с выраженными внепеченочными проявлениями - 14%. В клинико-морфологической диагностике патогенетических вариантов доминирующее значение имели клинические синдромы, биохимические тесты и результаты патоморфологического исследования биопсии печени.

Сравнительная характеристика клинических вариантов хронической микст-инфекции НСУ+НВУ. Выделены три варианта клинического течения хронической микст-инфекции НСУ+НВУ: типичный, холестати-ческий и микст-инфекция с внепеченочными проявлениями.

При типичном варианте доминируют симптомы преимущественного поражения печени - гепатомегалия, болевой и цитолитический синдромы при отсутствии выраженного холестаза и признаков внепеченочного поражения. Холестатический вариант характеризуется выраженным внутрипеченочным холестазом (100% наблюдений) при наличии симптомов поражения печени — гепатомегалия, цитолитический синдром, гипербилирубинемия. При внепеченочном варианте хронической микст-инфекции НСУ+НВУ доминируют симптомы внепеченочного поражения. Холестатический вариант микст-инфекции характеризуется наиболее значительной альтеративной компонентой (наличие очагов некробиоза и некроза, апоптотических телец Каунсильмена, постнекротических гранулем) и фиброзных изменений печени, что позволяет рассматривать этот вариант микст-инфекции как наиболее неблагоприятный в плане развития цирроза печени.

Все клинические наблюдения рассматривались в соответствии с особенностями клинического течения: с наличием типичных симптомов поражения печени, с преобладанием холестаза и группа пациентов с выраженными внепеченочными синдромами. Анализ эпидемиологического анамнеза выявил факторы риска заражения вирусами гепатитов С и В: переливание крови и ее компонентов, донорство, парентеральное введение лекарственных препаратов, наркомания с парентеральным введением наркотических веществ, инвазивные методы исследования и лечения, профессиональный контакт с кровью.

Установлены факторы дополнительного гепатотоксического воздействия: лекарственная гиперпрогмазия (33%), злоупотребление алкоголем (18%), сочетанное употребление этанола и наркотических веществ (4%). У 41 % пациентов имелась патология желудочно-кишечного тракта, у 24% - патология других органов и систем.

Спектр серологических маркеров вирусных гепатитов В и С при всех клинических вариантах не имел существенных различий, во всех наблюдениях регистрировались суммарные НСУАЬ, в большинстве случаев -антитела к ЫБ-антигенам ПСУ и набор антител и антигенов ИВУ, при этом отличительной особенностью серологического спектра холестатического варианта было более редкое выявление HBsAg и более частое обнаружение HBeAg. По данным ПЦР-диагностики, доминировала репликация НСУ (68% случаев при 52% НВУ). Важно отметить, что при холестатическом варианте хронической микст-инфекции НСУ+НВУ достоверно (р < 0,05) реже по сравнению с другими вариантами выявлялись РНК НСУ и ДНК НВУ, кроме того, не была зарегистрирована одновременная репликация НСУ и НВУ.

Таблица 1. Сравнительная характеристика основных клинических синдро-

мов хронической микст-ин< Секции НСУ+НВУ (%)

Клинические синдромы Типичный вариант Холестатиче-ский вариант Внепеченоч-ный вариант Всего

Астеновегетативный 53 50 100 59

Болевой абдоминальный 53 42 71 53

Диспептический 33 42 43 37

Гепатомегалия 57 92 71 67

Спленомегалия 17 67 71 37

Желтуха 23 92 57 45

Геморрагический 3 8 29 8

Холестаз 100 71 35

Печеночная энцефалопатия 17 50 29 27

Внепеченочные проявления 100 14

Таблица 2. Сравнительная характеристика биохимических показателей крови при хронической микст-инфекцин НСУ+НВУ

Показатели Типичный вариант Холестатиче-ский вариант Внепеченоч-ный вариант Всего

АЛ'Г 102,9 ± 5,5 129,0 + 9,9 163,8+10,3 137,5 + 8,9

ACT 75,7 ±6,5 104,8 ±7,9 101,8 ±8,4 105,7 ±7,5

Билирубин

- общий 24,0 ± 3,9 33,8 ±4,7 14.2 + 2,3 24.3 ± 2,5

- прямой 4,7 ± 1,4 8,6 ± 2,7 3,0 + 0,8 5,1 + 1,4

- непрямой 23,6 ± 4,2 32,3 ± 5,2 11.2± 1,7 20.4 + 2,1

ЩФ 151,8 + 6,6 194,4+ 15,3 158,8+11,3 180,8 + 8,2

ГГТП 28,3 ± 3,4 100,4 ±7,1 76,8 + 5,5 62,1 + 6,0

Для пациентов с типичным вариантом хронического гепатита С+В наиболее частые проявления заболевания - гепатомегалия, астеновеге-тативный и болевой абдоминальный синдромы (табл. 1), более редкие - диспепсия, желтуха, спленомегалия и печеночная энцефалопатия. В единичных случаях наблюдали геморрагический синдром, симптомы холестаза и внепеченочных поражений отсутствовали.

Степень выраженности цитолиза в большинстве случаев соответствовала минимальной и слабо выраженной степени активности, других значимых изменений биохимических показателей не выявлено (табл. 2). Изменения основных показателей периферической крови и системы гемостаза (незначительное удлинение протромбинового времени) определялись в единичных случаях.

Особенностью клинической картины холестатического варианта было сочетание синдрома холестаза с гепатомегалией и желтухой (92% наблю-

дений), более частые, в сравнении с типичным вариантом, спленомегалия, симптомы печеночной энцефалопатии и астеновегетативные проявления. Кроме того, цитолитический синдром был более выраженным и в большинстве случаев сочетался с повышением уровня маркеров холестаза.

Для внепеченочного варианта наиболее характерны сочетания астено-вегетативного синдрома и симптомов внепеченочного поражения (100%), а также гепатомегалия, спленомегалия и холестаз по 71 % пациентов. Кроме того, у 50% пациентов отмечены изменения системы гемостаза-удлинение протромбинового времени и снижение прогромбинового индекса. Изменения показателей периферической крови (анемия и тромбоцитопения) носили более выраженный характер в сравнении с 1-м и 2-м вариантами.

При патоморфологическом исследовании биоптатов печени пациентов с различными вариантами клинического течения хронического гепатита С+В выявлен достаточно выраженный полиморфизм. Липидная инфильтрация была ведущей формой дистрофии гепатоцитов, особенно при типичном варианте и наличии внепеченочных симптомов (85 и 81% случаев соответственно). Диффузный интрацеллюлярный холестаз и ацидофильная дегенерация достигали наибольшей выраженности при холестатиче-ском варианте. Клеточно-инволютивная дистрофия гепатоцитов, особенно диффузная, доминировала при манифестации внепеченочных симптомов. Перстневидная трансформация ядер гепатоцитов (структурный маркер HBcAg) отмечена в 87% биоптатов при наличии внепеченочных симптомов, в 71% - при типичном варианте и в 57% - при холестатическом варианте поражения печени. Альтеративная компонента (наличие очагов некробиоза, телец Каунсильмена и постнекротичсских гранулем) играла более заметную роль при холестатическом варианте.

Клеточная инфильтрация портальной стромы имела, как правило, мононуклеарный харакгер с распространением в паренхиму; особенно активный лимфодиапедез отмечен при холестатическом варианте. Фиброзные изменения печени в наибольшей степени выражены при холестатическом и внепеченочном вариантах. Эпителий желчных протоков подвергался альтерации и компенсаторной пролиферации при типичном и холестатическом вариантах (81 и 78% соответственно).

Таким образом, внутрипеченочный холестаз обусловливает более тяжелое поражение печени при хронической микст-инфекции НСУ+НВУ. Клинически это проявляется выраженными симптомами поражения печени и тенденцией к прогрессированию заболевания по сравнению с типичным вариантом микст-инфекции.

Электронно-микроскопическое исследование биоптатов печени. В биоптатах печени при трех клинических вариантах хронической микст-инфекции НСУ+НВУ выявлены стереотипные изменения ультраструктуры гепатоцитов, отражающие комплекс альтеративных и компенсаторных перестроек. Во всех случаях, в том числе при НВзА§-негативной форме, в перипортальных гепатоцитах обнаружены специфичные для НВУ-

инфекции перстневидные ядра - торообразная конструкция конденсированного хроматина с лизисом нуклеолеммы. В двуядерных гепатоцитах перстневидной трансформации могло быть подвергнуто одно из ядер. Как правило, изменения ультраструктурной организации цитоплазмы гепато-цитов не зависели от перстневидной трансформации ядер.

Значительная гетерогенность гепатоцитов обусловлена варьированием электронной плотности цитоплазматического матрикса, содержания гликогена, различной степенью альтерации и редукции мембранных ор-ганелл, а также полиморфизмом липидных капель и резидуальных телец. В большинстве случаев редуцированы и повреждены митохондрии - с резко уменьшенным количеством крист и просветленным матриксом. В части гепатоцитов на фоне опустошенности цитоплазмы перинуклеарная зона сохраняла комплекс органелл - регенераторный потенциал в виде элементов гранулярной цитоплазматической сети и митохондрий. Для токсических воздействий характерна гиперплазия элементов гладкой цитоплазматической сети и крупновезикулярная липидная инфильтрация. В целом деструкция цитоплазматических органелл гепатоцитов соответствовала степени активности инфекционного процесса, достигая наибольшей выраженности при высоких показателях цитолиза, чаще ассоциируясь с синдромом холестаза.

При значительном количестве резидуальных телец или перстневидной трансформации ядра цитоплазма гепатоцитов имеет структурированный вид. Напротив, «опустошенные» гепатоциты содержат малоизмененные ядра и хорошо выраженные перинуклеарные фокусы регенерации при отсутствии или малочисленности дегенерирующих образований. Таким образом, комбинация РНК-геномного и ДНК-геномного вирусов гепатита С и В вызывает фенотипическую гетерогенность популяции гепатоцитов. РНК-геномный вирус гепатита С обусловливает деградацию цитоплазматического компартмента клетки, ДНК-геномный вирус гепатита В, в первую очередь, вызывает деградацию ядра.

Электронно-микроскопически иногда наблюдались картины пери-и эмпериполеза как проявления взаимодействия цитогоксических Т-лимфоцитов с клеткой-мишенью, развитием иммуноопосредованного повреждения гепатоцитов (киллерный эффект) и их последующей апоп-тотической гибелью.

Типичный вариант характеризовался значительной гетерогенностью популяции паренхиматозных клеток, обусловленной полиморфизмом внутриклеточной организации. Холестатический вариант определяли множественные компоненты желчи и вторичные фагосомы с накоплением осмиофильных гранул липофусцина и резидуальных телец, расположенные не только вблизи билиарных полюсов, но и диффузно в цитоплазме клеток, в единичных случаях - в просветах синусоидов. Клинический вариант с внепеченочными проявлениями отличала наибольшая выраженность клеточно-инволютивной дистрофии гепатоцитов, интерпретируемая

как защитная реакция клеток (Непомнящих Д.Л., 1994; Покровский В.И. и др., 2003), что и способствовало, по-видимому, манифестации внепе-ченочных синдромов.

При типичном варианте суммарно серопозитивной и серонегативной форм хронической микст-инфекции HCV+HBV доминировали симптомы преимущественного поражения печени - гепатомегалия, болевой синдром при минимальном цитолизе и отсутствии выраженного холестаза. В образцах крови в 77% случаев типичного варианта обнаружена РНК HCV и в 57% - ДНК HBV, одновременная репликация HCV и HBV - в 30% случаев. Обращает на себя внимание более редкое тестирование маркеров репликации в образцах крови при холестатическом варианте - и ДНК HBV (при серопозитивной форме HBV-инфекции) и РНК HCV (при серонегативной форме). Это можно связать с выраженными и диффузными дегенеративными изменениями гепатоцитов, «не способными» обеспечить более высокий уровень репликации вирусов.

Холестатический вариант микст-инфекции отличался выраженным внутрипеченочным холестазом, сочетающимся с гепатомегалией и желтухой (по 92%), гипербилирубинемией (75%), спленомегалией (67%) и более выраженным цитолитическим синдромом по сравнению с типичным вариантом. Сочетание гипербилирубинемии с повышением показателей холестаза и цитолиза установлено в 58% случаев. Поданным ПЦР, в 80% случаев выявлена РНК IICV, ДНК HBV - только при HBsAg-позитивной форме (43%).

При хронической микст-инфекции HCV+HBV с внепеченочными проявлениями присутствовали те же клинические синдромы, что и при типичном и холестатическом вариантах, при ведущей роли синдромов внепеченочной патологии. Репликация вируса гепатита С поданным ПЦР выявлена в 71% наблюдений, вируса гепатита В - в 57%, сочетание РНК IICV и ДНК HBV - в 50% наблюдений.

Структурные изменения печени при типичном варианте хронической микст-инфекции HCV+HBV отличались дистрофией гепатоцитов с минимальной альтеративной компонентой и наименьшей степенью клеточной инфильтрации и фиброза. Патогномоничным признаком холестатического варианта был интрагепатоцеллюлярный холестаз, обусловливающий гибель гепатоцитов, и значительная клеточная инфильтрация. При внепече-ночном варианте доминировали дистрофические изменения гепатоцитов, преимущественно клеточно-инволютивная дистрофия.

При хронической микст-инфекции HCV+HBV выявлена высокая частота HBsAg-негативных случаев (45%). Следует отметить, что латентная форма HBV-ипфекции требует к себе более внимательного отношения в связи с тем, что в большинстве клинико-морфологических характеристик HBsAg-позитивной и HBsAg-негативной (латентной) форм HBV-инфекции нет значимых различий. Ведущую роль в диагностике HBV-инфекции в этих наблюдениях имеют морфологическое исследование биоптатов

печени с обнаружением перстневидных ядер гепатоцитов (структурный маркер HBcAg) и ПЦР-исследование нативной ткани печени. Особенностью типичного варианта микст-инфекции при латентной HBV-инфекции была более частая желтуха по сравнению с типичным вариантом 1-й группы. Отличия клинических особенностей холестатического варианта при латентной форме HBV-инфекции - более редкие и менее выраженные основные симптомы поражения печени (гепатомегалии, желтухи, гипербилирубинемии).

В большинстве работ микст-инфекция HCV+HBV характеризуется более тяжелым прогрессирующим течением по сравнению с моноинфекциями HCV и HBV (Сюткин В.Е. и др., 2000; Игнатова Т.М., 2002; Серов В.В., Апросина З.Г., 2002). К патоморфологическим маркерам репликации вируса гепатита В относят обнаружение в гепатоцитах HBcAg (по перстневидным ядрам и иммуногистохимическим маркерам). Установлено, что одновременное обнаружение HBcAg в гепатоцитах и наличие HBeAg в сыворотке положительно коррелирует с высокой степенью активности хронического гепатита В (Chu С.M. et al., 1997).

Одним из важных разделов гепатологии является цирроз печени, причем микст-инфекция HCV+HBV рассматривается как один из важнейших триггеров его развития (Хазанов А.И., 2004). Особенностью хронической микст-инфекции HCV+HBV в стадии развивающегося цирроза печени являлось выраженное повышение маркеров холестаза, а также диспротеинемия, снижение уровня протромбинового индекса, тромбоцитопения, моноцитоз, лимфопения и ускорение СОЭ, в трети наблюдений - гипербилирубинемия, преимущественно за счет повышения непрямой фракции.

Цирроз печени при микст-инфекции HCV+HBV

Клипическая характеристика цирроза печени при микст-инфекции HCV+HBV. Наиболее частыми причинами инфицирования вирусами гепатитов В и С - оперативные вмешательства (в 1 -й группе - 67% случаев, во 2-й - 56% наблюдений) и гемотрансфузии (1-я группа - 40%, 2-я группа - 37%) (табл. 3). Во всех группах в большинстве случаев первые клинические симптомы определялись на стадии цирроза печени. В группе с циррозом печени инфекционного генеза заболевание отмечено преимущественно астеновегегативным синдромом - в 80% случаев, во 2-й и 3-й группах - астеновсгетативным, абдоминальным болевым синдромами в сочетании с желтухой и геморрагическим синдромом. В двух наблюдениях 1-й группы и в трех 3-й группы заболевание проявлялось кровотечением из варикозно расширенных вен пищевода. Во всех изученных случаях после появления клинической симптоматики отмечалось дальнейшее прогрессирование процесса с нарастанием печеночно-клеточной недостаточности и декомпенсацией портальной гипертензии.

Таблица 3. Общая характеристика клинических наблюдений и методы исследования

Группы наблюдений Количество пациентов Пол Возраст (лет) Микроскопия биоптатов

м ж световая электронная

1 группа. Цирроз печени инфекционно-вирусного генеза (НСУ+НВУ) 15 6 9 17-63 38 12

2 группа. Цирроз печени инфекционно-токсического (НСУ+НВУ+этанол) генеза 19 12 7 34-65 57 16

3 группа. Цирроз печени алкогольного генеза 45 21 24 30-71 36 11

Всего: 79 39 40 17-71 131 39

В клинической картине цирроза печени (табл. 4) во всех группах доминировал астеновегегативный синдром, наиболее высоким этот показатель был во 2-й группе - 89% случаев, но в 3-й группе данный синдром носил более выраженный характер. Снижение массьг тела регистрировалось у 45% пациентов с циррозом печени этанолового генеза. Волевой абдоминальный синдром выявлялся несколько чаще в 1 -й и 2-й группах (80% и 84% соответственно), основными были жалобы на тупые ггоющие боли в правом подреберье, нередко в сочетании с болями в левом подреберье. Дисггеггтический синдром встречался несколько реже, бьгл наиболее выраженным в группе с циррозом печени вирусно-токсического генеза - 53% случаев. Гепатомегалия диагностирована в 100% случаев в г руппе с циррозом печени вирусно-токсического генеза, в 1-й и 3-й группах увеличение размеров печени регистрировалось несколько реже. Во всех наблюдениях при пальпации определялся плотный, острый край печени, что является важным клиническим критерием цирротической трансформации органа.

Синдром холестаза с большей частотой выявлялся в группах с циррозом печени алкогольно-вирусного и алкогольного генеза. При ин-фекционно-вирусном циррозе печени данный синдром чаще всего верифицировался по повышению ЩФ и ГГТП при отсутствии клинической симптоматики холестаза. При инфекционно-токсическом и, в наибольшей степени, этаноловом циррозе печени холестаз проявлялся желтухой, выраженным кожным зудом; ггри биохимическом исследовании сыворотки крови определяли повышение уровня билирубина, ЩФ и ГГТП, которые при сравнении 1-й и 3-й групп являлись статистически значимыми (табл. 5). Синдром желтухи значительно чагце регистрировался у пациентов 3-й группы - в 60% случаев.

Геморрагический синдром встречался намного реже, практически с одинаковой частотой, варьировал в пределах 25 - 27%, проявлялся преимущественно носовыми и десневьгми кровотечениями. Отечно-асцитический

Таблица 4. Характеристика частоты клинических синдромов при циррозе печени различного гемеза (%)

Синдромы Цирроз печени

HCV+HBV HCV+HBV+этанол этанол

Астеновегетативный 80 89 82

Болевой абдоминальный 80 84 71

Диспептический 40 53 46

Гепатомегалия 93 100 84

Холестаз 67 74 82

Желтуха 40 37 60

Геморрагический 27 26 25

Отеч но-асцитический 40 53 75

Портальная гипертензия

- компенсированная -субкомпенсированная 33 27 26 16 5 23

- декампенсированная 40 58 72

Варикозное расширение вен 47 53 66

пищевода

Кровотечения из варикозно 20 11 11

расширенных вен пищевода

Спленомегапия 53 58 80

Печеночная энцефалопатия 33 26 52

Внепеченочные проявления 67 42 43

Класс цирроза печени по шкале Чайлд-Пью Л В С 47 47 7 32 58 11 21 65 14

Таблица 5. Характеристика биохимических показателей крови при циррозе печени различного генеза

Показатели Цирроз печени

HCV+HBV HCV+HBV+этанол этанол

АЛТ 106,7+21,73 79,5+25,53 50,1 + 13,71

ACT 142,9+28,67 115,5+15,53 96,8+13,13

Билирубин общий 42,7+8,44 43,5+10,54 73,2+9,62*

ЩФ 477,4+20,19* 361,5+23,8 359,4+20,72

ГГТП 187,7+11,28 170,5+26,15 252,8+26,11*

Общий белок 75,2+4,19 76,18+3,56 73,95+2,56

Альбумины 77,1+5,01 33,36+0,2 31,72+2,71

Примечание. * - р<0,05 - достоверность различий между 1-й и 3-й группами.

синдром значительно чаще выявлялся в 3-й группе (75%). Синдром портальной гипертензии регистрировался во всех наблюдениях, преобладала декомпенсированная стадия, особенно при циррозе печени этанолового генеза. В этой же группе, по сравнению с 1-й и 2-й, значительно чаще регистрировались варикозное расширение вен пищевода, спленомегалия и асцит. В 1-й группе наличие варикозного расширения вен пищевода выявлялось реже, чем в остальных группах, но кровотечения из варикозно расширенных вен регистрировались чаще всего - в 20% наблюдений, что обусловлено преобладанием III - IV ст. варикозного расширения вен пищевода в данной группе.

Во всех наблюдениях преобладала субкомпенсированная печеночно-кле-точная недостаточность. У пациентов 1-й группы реже отмечалась гиперби-лирубинемия, в меньшей степени страдала белоксинтезирующая функция печени. При циррозе печени инфекционно-вирусного генеза реже всего регистрировались проявления печеночной энцефалопатии - 26% клинических наблюдений. Для цирроза печени алкогольной этиологии характерны высокая частота печеночной энцефалопатии, проявляющаяся головными болями, заторможенностью, печеночным запахом, а также несколько более выраженное нарушение белоксинтсзирующей функции печени.

В соответствии с прогностической шкалой Чайлд-Пыо, во всех группах большинство наблюдений относятся к классу «В» - 47%, 53% и 65% соответственно. Наиболее редко класс «С» отмечается при ин-фекционно-вирусном циррозе печени, чаще всего - при циррозе печени этаноловой этиологии. В 1-й и 3-й группах преобладали показатели Ал AT, соответствующие нормальным значениям, при минимальном повышении активности АсАТ; в группе с вирусно-токсическим циррозом печени чаще определялось минимальное повышение активности АлАТ и АсАТ, при этом статистически значимых изменений показателей аминотрансфераз между тремя группами не выявлено.

Спектр серологических маркеров HCV- и HBV-инфекций в 1 -й и 2-й группах не имел существенных различий, в большинстве наблюдений выявлены суммарные HCVAb, HCVcoreAb, антитела к неструктурным белкам NS, HBsAg и НВсогеАЬ. Основными маркерами прогрессии фиброза печени были повышение коэффициента де Ритиса (АсАТ/АлАТ) более 1, регистрируемое в большинстве наблюдений, и тромбоцитопения, наиболее выраженная в 1-й и 2-й группах (по 53%).

На основании длительности инфицирования (периода времени от предполагаемого момента инфицирования до трансформации в цирроз печени) определялась скорость прогрессирования фиброза: медленно прогрессирующий фиброз - более 20 лет, умеренно прогрессирующий - 10 - 20 лет и быстро прогрессирующий - менее 10 лет. При хронической микст-инфекции HCV+HBV доминировал умеренно прогрессирующий фиброз печени - 54% случаев, медленно прогрессирующий фиброз определялся в 9%, быстро прогрессирующий - в 27% наблюдений; в 10% случаев форму

течения фиброза определить не представлялось возможным. При микст-инфекции в сочетании с воздействием этанола формы прогрессирования фиброза печени зависели от длительности периодов абстиненции и были условно распределены следующим образом: медленно прогрессирующий фиброз выявлен у 41% пациентов, умеренно прогрессирующий - у 25% человек, быстро прогрессирующий - у 33% больных. При циррозе печени алкогольного генеза определение темпов прогрессирования заболевания не представлялось возможным.

В 1-й группе среди дополнительных повреждающих факторов, влияющих на скорость прогрессирования фиброза печени, доминировали прием гепатотоксичных препаратов - в 47% наблюдений (у 40% больных

- преднизолон, у 7% пациентов - цитостатическая терапия), ЖКБ - в 47% случаев, сахарный диабет - у 27% пациентов. Во 2-й группе ведущими триггерами фиброгенеза были злоупотребление этанолом - во всех случаях, прием гепатотоксичных лекарств - в 32% наблюдений, причем у 21% пациентов применялись антигельминтные препараты, у 11% человек

- туберкулостатики, у 5% больных - преднизолон.

Патоморфологическое исследование цирроза печени при микст-инфекции НСУ+НВУ. При патоморфологическом исследовании био-птатов печени выявлены структурные изменения паренхиматозного и стромального компартментов органа (табл. 6). Данные изменения можно разделить на характерные для ПСУ- и НВУ-инфекции и этанолового воздействия, при смешанном генезе заболевания морфогенез структурных реакций печени определялся сочетанием структурных маркеров вирусного и токсического воздействия.

Во всех изученных образцах общее строение паренхимы печени было значительно нарушено за счет выраженного разрастания соединительной ткани с образованием множества фиброзных полей, септ и тяжей, деформирующих дольковую архитектонику. При циррозе печени инфекционно-вирусного генеза фиброзные изменения носили менее выраженный и более ограниченный хараетер, по сравнению со 2-й и особенно с 3-й группами, в 1 -й группе преобладал портальный и перипортальный фиброз. В группе с циррозом печени вирусно-токсического генеза на фоне этанолового воздействия отмечался фиброз центральных вен с распространением на пе-рицентральную зону, в сочетании с диффузным перигепатоцеллюлярным фиброзом, который имел более выраженный характер в перипортальной и перицентральной областях.В биоптатах печени при циррозе этанолового генеза отмечался портальный, центральный, перицентральиый и диффузный перигепатоцеллюлярный фиброз.

В большинстве случаев фиброз имел прогрессирующий характер, однако группа с циррозом печени вирусно-токсического генеза характеризовалась более активными процессами фибриллогенеза. В группе с циррозом печени этаноловой этиологии фиброз был представлен грубо-волокнистой соединительной тканью.

Таблица 6. Патоморфологическое исследование биоптатов печени при циррозе различного генеза (%)

Структурные изменения Цирроз печени

НСУ+НВУ НС У+Н В У+этанол Этанол

Фиброз

- портальный 100 100 100

- центральный и перицентральный 45 77 100

- перигепатоцеллюлярный 45 72 100

Дистрофии гепатоцитов

- клеточно-инволютивная (диффузная) 32 29 24

- ацидофильная дегенерация и тельца Каунсильмена 43 46 47

- липидная мелко- и средневезикулярная 100 85 38

- липидная крупнокапельная - 85 75

- внутриклеточный холестаз (выраженный) 34 39 50

-гемосидерин 10 23 25

- алкогольный гиалин - - 63

Лимфоидные агрегаты и фолликулы 100 92 -

Пролиферация эпителия дуктул 100 92 72

Популяция гепатоцитов в ткани печени отличалась значительной гетерогенностью. Диффузная клеточно-инволютивная дистрофия преобладала в 1-й группе, гепатоциты характеризовались увеличенными размерами, «опустошенной», нечетко структурированной цитоплазмой, резким снижением или отсутствием зерен гликогена. Ядра отличались гипохроми-ей, нередко с явлениями кариорексиса и кариолизиса. Во всех группах с примерно одинаковой частотой, варьировавшей в пределах 43 - 47%, выявлялись гепатоциты с признаками ацидофильной дегенерации: клетки небольших размеров, с уплотненной, резко ацидофильной цитоплазмой и гиперхромными, пикнотичными ядрами. В ряде случаев в синусоидах перипортальной области обнаруживали тельца Каунсильмена, которые в сочетании с гепатоцитами с перстневидными ядрами патогенетически связаны с активностью НВУ-инфекции.

Во всех группах лидирующее место принадлежало липидной дистрофии гепатоцитов. В группах с инфекционно-вирусным и вирусно-ал-когольным циррозом печени при активной репликации вируса гепатита С, подтвержденной ПЦР-диагностикой, преобладающий характер имела мелко- и средневезикулярная липидная инфильтрация (100 и 85% био-птатов соответственно). При преобладании во 2-й группе роли эганоло-вого воздействия и особенно в 3-й группе преимущественно выявлялась крупнокапельная липидная инфильтрация, с характерным оттеснением

ядра к периферии и зачастую с образованием жировых кист. Данный вид дистрофии носил обратимый характер - при наличии полной абстиненции наблюдалась отчетливая положительная динамика, прослеженная при повторных патоморфологических исследованиях. В 3-й группе отмечена наибольшая частота выявления признаков внутриклеточного холестаза (50% случаев). Внутриклеточные включения алкогольного гиалина были обнаружены исключительно в группе с циррозом печени этаноловой этиологии. Включения гемосидерина выявлялись с примерно одинаковой частотой (23 - 25%) во 2-й и 3-й группах, несколько реже - в 1-й группе.

Клеточная инфильтрация определялась во всех случаях, ассоциировалась непосредственно с фиброзом, имела полиморфный характер. 1-я и 3-я группы характеризовались слабо выраженной, реже - умеренной клеточной инфильтрацией. В группе с циррозом печени этанолового генеза «паренхиматозная активность» была более выраженной, клетки инфильтрата активно распространялись на фиброзные сепгы и вглубь паренхимы по синусоидам или с формированием «ступенчатых некрозов» и в ряде случаев - интралобулярных гранулем, включающих фрагменты некротизированных гепатоцитов. Гиперплазия лимфоидной ткани в виде формирования лимфоидных агрегатов и фолликулов в пределах портальных трактов отмечена в 100% случаев в 1-й группе и в 92% наблюдений во 2-й группе.

Клеточный инфильтрат во всех образцах представлен мононуклеар-ными клетками (фибробластами, лимфоцитами, макрофагами), встречались немногочисленные плазматические клетки, нейтрофилы (характерные для цирроза печени этанолового генеза) и редкие эозинофилы. Количественное соотношение клеток в инфильтрате зависело от преобладания фиброза или инфильтрации в портальном тракте. Обращает на себя внимание тот факт, что чем активнее были процессы фибриллогенеза, тем более выраженной клеточной инфильтрацией они сопровождались. Активная пролиферация эпителия желчных протоков портальных трактов наблюдалась во всех случаях в 1-й группе и несколько реже во 2-й и 3-й группах (92 и 72% наблюдений соответственно), часто в сочетании с перидуктулярным фиброзом.

Во всех образцах ткани печени при НСУ-инфекции в качестве морфологических признаков вирусного поражения рассматривались мелковезикулярная субплазмолеммальная липидная инфильтрация и клеточно-инво-лютивная дистрофия гепатоцитов, формирующиеся в портальных трактах на фоне полиморфно-клеточной инфильтрации лимфоидные агрегаты и фолликулы, «цепочки» лимфоцитов в синусоидах и пролиферация дук-тального эпителия. Морфологическими маркерами НВУ-инфекции-ацидофильная дегенерации гепатоцитов с образованием телец Каунсильмена в сочетании с перстневидными ядрами гепатоцитов преимущественно перипортальной локализации.

Этаноловый характер поражения паренхимы печени подтверждало наличие крупнокапельной жировой дистрофии гепатоцитов, выявление гепатоцитов в состоянии клеточно-инволютивной дистрофии преимущественно перицентральной локализации, обнаружение алкогольного гиалина, присутствие в клеточном инфильтрате нейтрофилов, а также выраженный центральный и перицентральный фиброз и диффузный перигепатоцеллюлярный фиброз. При воздействии вирусов гепатита В и С и этанола наблюдалось сочетание структурных маркеров, степень выраженности которых зависела от доминирующей роли вирусного или алкогольного поражающего фактора.

ВЫВОДЫ

1. Наличие РНК вируса гепатита С в крови и/или ткани печени по данным полимеразной цепной реакции и число инфицированных гепатоцитов (по экспрессии NS3Ag при иммуногистохимическом исследовании) не имеют достоверной связи со степенью активности инфекционного процесса, оцениваемой по клинико-биохимическим тестам и патомор-фологическому исследованию биоптатов печени. При позитивной им-мунодетекции NS3Ag HCV в биоптатах печени установлена слабо выраженная (53% случаев) и минимальная (18% случаев) степень активности хронического гепатита С при различном количестве экспрессирующих NS3Ag гепатоцитов. Количество инфицированных гепатоцитов не коррелировало со степенью активности инфекционно-вирусного процесса. При сравнительно высоком уровне виремии (от 106 до 108 копий HCV в 1 мл плазмы крови - предел тест-системы) доминируют минимальные изменения структуры печени: в 60% случаев выявлена слабо выраженная степень активности HCV-инфекции (г=0,631, р < 0,001).

2. При генотипировании HCV в 53% случаев выявлен генотип Ib, в 30% случаев - генотип 2, в 15% - генотип За. Сопоставление генотипа НС V с уровнем виремии и степенью активности инфекционного процесса не выявило корреляционной связи. При генотипе Ib в 80% случаев установлена слабо выраженная (70% случаев) и минимальная (10% случаев) степень активности инфекционного процесса. При тестировании пяти биологических субстратов РНК HCV выявлена преимущественно в ткани печени - 79% случаев, в сыворотке крови - 77% и мопонуклеарных клетках крови - 73%; одновременно и в сыворотке, и в мононуклеарах - в 55% наблюдений, при этом в 18% случаев РНК HCV обнаружена в клеточных элементах и отсутствовала в сыворотке крови. РНК IICV выявлена в образцах слюны у 7 человек, в моче - у 5, у 3 пациентов - в обоих субстратах.

3. Наличие РНК HCV в нагивной ткани печени сопровождалось имму-ногистохимичсским выявлением №3-антигена, т.е. иммунодстекция NS3

в гепатоцитах может рассматриваться как структурный маркер репликации вируса гепатита С. В большинстве случаев выявление антител к NS3 в сыворотке крови сочеталось с экспрессией NS3-aHTHreHa в гепатоцитах. Интенсивная (выраженная и умеренная) иммуногистохимическая реакция с NS3-aHTHreHOM HCV в биоптатах печени в большинстве случаев сочеталась с нормальными показателями аминотрансфераз.

4. Анализ сопоставления серологических маркеров репликации вируса гепатита С по данным ПЦР и степени активности инфекционно-вирусного процесса по биоптатам печени показал, что при наличии РНК HCV в сыворотке и/или мононуклеарных клетках крови в 71% случаев в биоптатах обнаружена минимальная (16%) и слабо выраженная (55%) степень активности процесса. При отрицательной реакции на РНК HCV также преобладали минимальные патологические изменения в ткани печени. Статистический анализ не выявил корреляционной связи между наличием репликации вируса в крови и проявлениями структурных изменений в ткани печени. Отсутствие зависимости между репликацией HCV и степенью поражения печени при хронической HCV-инфекции обусловлено выраженной антивирусной реакцией гепатоцитов, фенотипически проявляющейся клеточно-инволютивной дистрофией.

5. Комбинация РНК-вируса гепатита С и ДНК-вируса гепатита В вызывает фенотипическую гетерогенность популяции гепатоцитов. РНК-геномный вирус гепатита С повреждает преимущественно цитоплазма-тическиеорганеллы при сохранении ядра. ДНК-геномный вирус гепатита В вызывает деградацию ядерного компартмента при относительном сохранении ультраструктуры цитоплазматического. Ведущими ультраструктурными маркерами этанолового воздействия наряду с крупновезикулярной липидной инфильтрации гепатоцитов являются формирование мегамитохондрий и гиперплазия агранулярной цитоплазматической сети.

6. При микст-инфекции HCV+HBV доминирует умеренно прогрессирующий фиброз печени - 54% случаев. При микст-инфекции в сочетании с воздействием этанола темпы прогрессирования распределены равномерно, что определяется периодами абстиненции. При циррозе печени алкогольного генеза достоверное определение темпов прогрессирования затруднено. В целом отмечено ускорение темпов фиброгенеза и развития цирроза печени при воздействии гепатотоксичпых факторов, главными из которых являются этанол и гельминтоцидные препараты.

7. При циррозе печени инфекционно-вирусного генеза (HCVh HBV) в клинической картине преобладали гепатомегалия (93%), астеновегета-тивный и болевой абдоминальный синдромы (по 80%), холестаз (67%) (уровень щелочной фосфатазы достоверно выше по сравнению с другими группами), выраженные внепеченочные проявления (67%, в том числе ар-тралгии - 27% и сахарный диабет - 26%) и спленомегалия (53% случаев). По шкале Чайлд-Пью классы цирроза печени (А, В и С) распределились по 47, 47 и 7% соответственно.

8. При циррозе печени инфекционно-токсического генеза (НСУ+ НВУ+этанол) доминировали гепатомегалия (100%), астеновегетативный и болевой абдоминальный синдромы (89 и 84% соответственно), холестаз (74%), спленомегалия (58%), отечно-асцитический синдром и варикозное расширение вен пищевода (по 53%). По шкале Чайлд-Пью классы цирроза печени (А, В и С) распределились следующим образом: 32, 58 и 11 % случаев.

9. В биоптатах печени при циррозе алкогольного генеза имели место портальный, значительный центральный, перицентральный и диффузный перигепатоцеллюлярный фиброз (по 100% случаев), диффузная крупновезикулярная липидная инфильтрация гепатоцитов (75%) (маркер токсического воздействия), присутствие в клеточном инфильтрате ней-трофильных лейкоцитов, наличие алкогольного гиалина (63%) и более часто встречающийся, по сравнению с циррозом НСУ+НВУ и циррозом печени смешанной этиологии, внутриклеточный холестаз.

10. Особенностями морфологических изменений при НСУ+НВУ-циррозе печени являются сочетание выраженного портального и пери-портального фиброза (100%), центрального (метаболического) и пери-гепатоцеллюлярного фиброза (по 45% случаев), а также во всех случаях - гиперплазия лимфоидной ткани. Изменения паренхиматозного ком-партмента печени определялись мелко- и средневезикулярной липидной инфильтрацией гепатоцитов (100%), ацидофильной дегенерацией (43%), внутриклеточным холестазом (34%) и диффузной клеточно-инволютивной дистрофией (32% случаев). При сочетанном воздействии этанола увеличивается доля метаболического и перигепатоцеллюлярного фиброза (77 и 72% соответственно), а также в 2,3 раза возрастает выявление гемоси-дерина в биоптатах печени.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Отсутствие зависимости между репликацией НСУ и степенью активности патологического процесса в печени требует критического пересмотра алгоритмов лечения хронического гепатита С, ориентированных на результаты ПЦР как на основной диагностический и прогностический фактор заболевания, и подчеркивает необходимость биопсии печени для адекватной диагностики и оценки динамики патологического процесса в печени.

2. Проведенное исследование свидетельствует о важности и необходимости патоморфологического изучения биопгатов печени у больных гепатитами С или В+С. Выявленные косвенные морфологические маркеры вирусного и токсического поражения печени могут иметь важное значение в дифференциальной диагностике заболеваний печени, уточнении этиологии гепатита, определении степени активности патологического процесса, стадии вирусной инфекции и ее прогноза.

3. Выделение трех вариантов клинического течения хронической микст-инфекции HCV+HBV с комплексной оценкой каждого из вариантов, дополненное описанием морфологической картины, имеет большое практическое значение для выбора тактики терапии. Высокий процент встречаемости HBsAg-негативных вариантов микст-инфекции HCV+HBV определяет необходимость использования более широкого спектра выявления серологических тестов, а также морфологического исследования биоптатов печени и ПЦР-диагностики. Чрезвычайно важным для клинической практики является выделение холестатического варианта как прогностически наиболее неблагоприятного в плане развития цирроза печени, что определяет соответствующую тактику терапии.

4. Использованные в работе морфологические маркеры токсического поражения (ультраструктурные модификации митохондриального компар-тмента) целесообразно использовать при исследовании эффективности антитоксической терапии.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Виноградова Е.В., Непомнящих Д. Л., Нохрина Ж.В., Бабошкина Ю.В Клинические особенности фиброзов и циррозов печени вирусного генеза // Клинико-морфологические аспекты общепатологических процессов при социально-значимых заболеваниях. - Новосибирск, 2004. - С. 136 - 137.

2. Виноградова Е.В., Непомнящих Д.Л., Бабошкина Ю.В. Клинический анализ цирроза печени смешанной этиологии (алкогольный + HCV) // Актуальные вопросы современной медицины: Сборник материалов XIV научно-практической конференции врачей. - Новосибирск, 2004. - С. XI-5.

3. Непомнящих Д.Л., Нохрина Ж.В., Бабошкина Ю.В, Виноградова Е.В. Клинические особенности циррозов печени вирусного генеза // Диз-регуляционная патология органов и систем: III Российский конгресс по патофизиологии. - Москва, 2004. - С. 89.

4. Непомнящих Д.Л., Нохрина Ж.В., Виноградова Е.В. Клинико-мор-фологическая диагностика хронического гепатита С+В // Клинико-морфологические аспекты общепатологических процессов при социально-значимых заболеваниях. - Новосибирск, 2004. - С. 137 - 138.

5. Непомнящих Д.Л., Бабошкина Ю.В., Виноградова Е.В., Терехова A.A. Клинический анализ цирроза печени вирусной этиологии // Сибирский журнал гастроэнтерологии и гепатологии. - 2004. - № 18. - С. 46 - 48.

6. Бабошкина Ю.В., Кладова Т.И., Виноградова Е.В. Клинический анализ цирроза печени вирусной и смешанной этиологии // Фундаментальные и прикладные проблемы современной медицины. - Новосибирск, 2004. - С. I - 2.

7. Непомнящих Д.Л., Бабошкина Ю.В., Виноградова Е.В. Комплексное клинико-патоморфологическое исследование цирроза печени HCV-этиологии // Актуальные вопросы современной медицины: Материалы XV научно-практической конференции врачей. - Новосибирск, 2004. - С. 207 - 208.

8. Nepomnyashchikh D.L., Nohrina J.V., Vinogradova E.V. Clinical-morphological diagnostics of hepatitis C+B // International Congress Fachmesse «Euromedica»: Programm Abstracts. - Hannover, 2004. - P. 85 - 86.

9. Виноградова E.B., Непомнящих Д.Л., Бабошкина Ю.В. Клинические особенности цирроза печени инфекционно-токсического генеза // Сибирский журнал гастроэнтерологии и гепатологии.-2005. -№ 19.-С. 30-31.

10. Бабошкина Ю.В., Непомнящих Д.Л., Виноградова Е.В. Цирроз печени: факторы и скорость прогрессирования // Сибирский журнал гастроэнтерологии и гепатологии. - 2005. - № 19. - С. 19 - 20.

11. Nepomnyashchikh D.L., Nohrina J.V., Vinogradova E.V. Baboshkina Yu.V. Clinical variants of chronic HCV+ HBV-infection // International Congress Fachmesse «Euromedica»: Programm Abstracts. - Hannover, 2005. - P. 69 - 70.

12. Непомнящих Д. Л., Виноградова Е.В., Постникова О. А., Капустина В.И. Клинические и патоморфологические особенности цирроза печени инфекционно-вирусного генеза // Сибирский журнал гастроэнтерологии и гепатологии. - 2006. - № 20. - С. 28 - 31.

13. Непомнящих Д.Л., Куделя Л.М., Мигуськина Е.И., Нохрина Ж.В., Виноградова Е.В. Бронхиальная астма, ассоциированная с гастроэзофа-геальным рефлюксом: клинико-патоморфологическое исследование // Сибирский консилиум. - 2007. - № 8 (63), вып. 5. - С. 8 - 10.

14. Непомнящих Г.И., Айда1улова С.В., Непомнящих Д.Л., Нохрина Ж.В., Виноградова Е.В., Караваева Ю.Ю. Морфогенез хронического гепатита С и цирроза печени инфекционно-вирусного генеза // Бюллетень Сибирского отделения РАМН. - 2008. - № 6. - С. 66 - 77.

15. Непомнящих Д.Л., Нохрина Ж.В., Виноградова Е.В. Сравнительная характеристика клинических вариантов хронической микст-инфекции HCV+ HBV // Бюллетень Сибирского отделения РАМН. - 2008. - № 6. - С. 98 - 103.

16. Aidagulova S.V., Zhomik Т.М., Nepomnyashchikh D.L., Marinkin I.O., Vinogradova E.V., Nohrina Zh.V. Ultrastructural modification of the endothelium in placental insufficiency and microangiopathies // Bulletin of Experimental Biology and Medicine.-2009.-Vol. 147, N 5.-P. 650-654.

17. Непомнящих Д.Л., Виноградова E.B., Нохрина Ж.В. Клинические варианты хронической микст-инфекции HCV+ HBV// Сибирский научный вестник. - 2009. - Вып. 12. - С. 67 - 72.

18. Непомнящих Д.Л., Бурковская В.А., Айдагулова С.В., Бакарев М.А., Постникова О.А., Капустина В.И., Нохрина Ж.В., Виноградова Е.В. Структурные модификации эпителия гастроэнтеральной системы

при иммунозависимом гранулематозе// Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2010. - Т. 150, № 10. - С. 467 - 471.

19. Непомнящих Д.Л., Бурковская В.А., Айдагулова С.В., Бакарев М.А., Капустина В.И., Постникова О.А., Виноградова Е.В., НохринаЖ.В. Структурная характеристика эпителия гастроэнтеральной системы при иммунозависимом гранулематозе // Сибирский научный вестник. -2010. -Вып. 14.-С. 39-42.

20. Непомнящих Д. Л., Бурковская В. А., Айдагулова С.В., Бакарев М.А., Нохрина Ж.В., Виноградова Е.В., Савченко С.А. Болезнь Крона и неспецифический язвенный колит: патоморфологическое исследование биоптатов печени // Сибирский научный вестник. - 2010. - Вып. 13. - С. 61 - 66.

21. Nepomnyashchikh D.L., Burkovskaya V.A., Aidagulova S.V., Bakarev M.A., Postnikova О.A., Kapustina V.I., Nohrina Zh.V., Vinogradova E.V. Structural modifications of gastrointestinal epithelium during immune-dependent granulomatosis // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. - 2010. - Vol. 150, № 10. - P. 490 - 494.

22. Непомнящих Д.Л., Вавилин В.А., Айдагулова С.В., Макарова С.И., Караваева Ю.Ю., Щепотина Е.Г., Постникова О.А., Нохрина Ж.В., Виноградова Е.В., Ляхович В.В. Полиморфизм цитохрома Р450 2D6 -молекулярно-генетический маркер прогрессирования цирроза печени // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.-2011.-Т. 152, № И.-С. 568-571.

23. Постникова О.А., Айдагулова С.В., Непомнящих Д.Л., Нохрина Ж.В., Виноградова Е.В., Караваева Ю.Ю. Ультраструктурное и стереологи-ческое исследование печени при хронической микст-инфекции HCV+HBV // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2011. - Т. 152,№12.-С. 713-716.

24. Постникова О.А., Непомнящих Д.Л., Айдагулова С.В., Виноградова Е.В., Капустина В.И., Нохрина Ж.В. Структурно-функциональная характеристика звездчатьгх клеток печени в динамике фиброза // Фундаментальные исследования. - 2011. - № 10. - С. 359 - 362.

25. Айдагулова С.В., Непомнящих Д.Л., Постникова О.А., Нохрина Ж.В., Виноградова Е.В. Хронический микст-гепатит С+В: Клинические варианты // Фундаментальные исследовании. - 2011. - № 10. - С. 457 -461.

26. Вавилин В.А., Непомнящих Д.Л., Макарова С.И., Айдагулова С.В., Караваева Ю.Ю., Щепотина Е.Г., Постникова О.А., Нохрина Ж.В., Виноградова Е.В., Ляхович В.В. Молекулярно-генетический маркер прогрессирования цирроза печени - полиморфизм цитохрома Р450 2D6 // Сибирский научный вестник. - 2011. - Вып. XV. - С. 17 - 20.

27. Непомнящих Д.Л., Айдагулова С.В., Бакарев М.А., Постникова О. А., Капустина В.И., Виноградова Е.В., Нохрина Ж.В. Роль Helicobacter pylori в этиологии и патогенезе хронических заболеваний желудка // Сибирский научный вестник. - 2011. - Вып. XV. - С. 53 - 57.

28. Постникова О.А., Айдагулова С.В., Непомнящих Д.Л., Виноградова Е.В., Караваева Ю.Ю., Нохрина Ж.В. Комплексное патоморфологическое, электронно-микроскопическое и стереологическое исследование биопта-тов печени при хронической микст-инфекции HCV+HBV // Сибирский научный вестник. - 2011. - Вып. XV. - С. 70 - 73.

29. Непомнящих Д.Л., Айдагулова С.В., Бакарев М.А., Постникова О.А., Капустина В.И., Нохрина Ж.В., Виноградова Е.В. Роль Helicobacter pylori в гастропатологии. Дискуссионные вопросы // Сибирский вестник гепатологии и гастроэнтерологии. - 2011. - № 2. - С. 27 - 31.

30. Nepomnyashchikh D.L., Burkovskaya V.A., Aidagulova S.V., Bakarev М.А., Postnikova O.A., Kapustina V.I., Nohrina Zh.V., Vinogradova E.V. Structural modification of the gastrointestinal epithelium during immune-dependent granulomatosis // Bulletin of Experimental Biology and Mcdicine. - 2011. - Vol. 150, № 4. - P. 490 - 494.

31. Непомнящих Г.И., Постникова О.А., Бакарев M.A., Непомнящих Д.Л., Виноградова Е.В., Капустина В.И. Структурно-функциональные особенности липидосодержащих гепатоцитов при гепатите С // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2012. - Т. 153, № 5.-С. 751 -754.

32. Постникова О.А., Непомнящих Д.Л., Бакарев М.А., Нохрина Ж.В., Виноградова Е.В., Айдагулова С.В., Савченко С.А. Хронический вирусный гепатит в сочетании с описторхозом: патоморфология и клинические особенности // Сибирский медицинский журнал (Томск). - 2012. - Т. 27, №1.-С. 119-122.

33. Непомнящих Г.И., Айдагулова С В., Постникова О.А., Непомнящих Д.Л., Нохрина Ж.В., Виноградова Е.В. Морфогенез хронического гепатита С и цирроза печени инфекционно-вирусного генеза // Клинические перспект ивы гастроэнтерологии, гепатологии. - 2012. - № 2. - С. 9 - 17.

34. Непомнящих Д.Л., Постникова О.А., Айдагулова С.В., Караваева Ю.Ю., Виноградова Е.В., Нохрина Ж.В., Савченко С.А. Универсальные структурные маркеры лекарственно-индуцированного поражения печени // IV Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов». -Новосибирск, 2012. - С. 364 - 366.

35. Виноградова Е.В., Непомнящих ПИ., Вавилин В.А., Караваева Ю.Ю., Постникова О.А., Непомнящих Д.Л. Роль полиморфизма генов цитохрома Р450 2D6 в развитии фиброза и цирроза печени // Материалы 14-го Международного Славяно-Балтийского научного форума «Санкт-Петербург- Гастро-2012». Гастроэнтерология Санкт-Петербурга. -2012. -№2-3.-С. М65.

36. Виноградова Е.В., Постникова О.А., Непомнящих Г.И., Бакарев М.А., Капустина В.И. Структурные особенности липидосодержащих гепатоцитов при вирусном гепатите// Сибирский научный вестник. -2012. -Т. 16.-С. 50-53.

37. Виноградова Е.В., Постникова O.A., Непомнящих Г.И., Непомнящих Д.Л., Капустина В.И., Юданов A.B. Внутриклеточный холестаз в условиях вирусного гепатита // Сибирский научный вестник. - 2012. - Т. 16.-С. 57-60.

38. Nepomnyashchikh D.L., Vavilin V.A., Aidagulova S.V., Makarova S.I., Karavaeva Yu.Yu., Shchepotina E.G., Postnikova O.A., Nohrina J.V., Vinogradova E.V., Lyakhovich V.V. Cytochrome P450 2D6 polymorphism is a molecular genetic marker of liver cirrhosis progression // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. - 2012. - Vol. 152, № 5. - P. 633 - 636.

39. Nepomnyashchikh G.I., Postnikova O.A., Bakarev M.A., Nepomnyashchikh D.L., Vinogradova E.V., Kapustina V.l. Structural and functional features of lipid-containing hepatocytes in Hepatitis С // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. - 2012. - Vol. 153, № 5. - P. 787 -790.

40. Postnikova O.A., Aidagulova S.V., Nepomnyashchikh D.L., Nohrina Zh.V., Vinogradova E.V., Karavaeva Yu.Yu. Ultrastructural and stereological study of the liver in chronic mixed HCV+HBV infection // Bulletin of Experimental Biology and Medicine.-2012.-Vol. 152,№6.-P. 764 - 767.

41. Вавилин В. А., Непомнящих Д.Л., Щепотина Е.Г., Караваева Ю.Ю., Макарова С.И., Виноградова Е.В., Кудряшов A.B., Нохрина Ж.В., Ляхович В.В. Полиморфизм гена цитохрома Р450 2D6 у пациентов с циррозом печени // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2013. - Т. 156, № 8. - С. 144 - 148.

42. Непомнящих Г.И., Бакарев М. А., Непомнящих Д.Л., Юданов A.B., Капустина В.И., Мигуськина Е.И., Постникова O.A., Виноградова Е.В., Нохрина Ж.В., Савченко С.А. Роль липидной инфильтрации гепатоцитов в морфогенезе хронического гепатита С // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2013. - Т. 156, № 8. - С. 250 - 254.

43. Вавилин В.А., Макарова С.И., Виноградова Е.В., Караваева Ю.Ю., Кудряшов A.B., Непомнящих Д.Л. Прогрессирование цирроза печени у пациентов с полиморфными вариантами I846G и 1846А гена цитохрома Р450 2D6 // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, коло-проктологии. - 2013. - Т. 22, № 2. Приложение № 40. Материалы XVIII Ежегодного Российского конгресса «Гепатология сегодня», 25-27 марта 2013г., Москва.-С. 26.

44. Вавилин В.А., Непомнящих Д.Л., Щепотина Е.Г., Караваева Ю.Ю., Макарова С.И., Виноградова Е.В., Кудряшов A.B., Ляхович В.В. Система биотрансформации чужеродных соединений и полиморфизм гена цитохрома Р450 4F2 у пациентов с циррозом печени // Сибирский научный вестник.-2013.-Т. 17.-С. 21-24.

45. Непомнящих Г.И., Бакарев М.А., Непомнящих Д.Л., Юданов A.B., Капустина В.И., Постникова O.A., Виноградова Е.В., Савченко С.А. Ли-пидная инфильтрация гепатоцитов в морфогенезе хронического гепатита С // Сибирский научный вестник. - 2013. - Т. 17. - С. 50 - 53.

46. Непомнящих Г.И., Бакарев M.А., Непомнящих Д.Л., Юданов A.B., Капустина В.И., Постникова O.A., Виноградова Е.В., Русинова С.Г., Телегина Т.А. Ультраструктура клеточных популяций печени и почек у пациентов с маркерами HCV- и HBV- инфекций // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.-2014.-Т. 158,№8.-С. 240-245.

47. Непомнящих Г.И., Бакарев М.А., Непомнящих Д.Л., Юданов A.B., Капустина В.И., Постникова O.A., Виноградова Е.В., Русинова С.Г., Телегина Т.А. Ультраструктурный анализ печени и почек при вирусном гепатите // Сибирский научный вестник. - 2014. - Т. 18. - С. 12-16.

48. Nepomnyashchikh G.I., Bakarev M.A., Nepomnyashchikh D.L., Yudanov A.V., Kapustina V.l., Postnikova O.A., Vinogradova E.V., Rusinova S.G., Telegina T. A. Ultrastrucutre of hepatorenal cell populations in patients with HCV and HBV infection markers. Hepatorenal associations // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. - 2014. - Vol. 158, № 2. - P. 268 - 273.

Соискатель

Е.В.Виноградова

Подписано в печать 23.12.2014. Формат 60x84/16. Гарнитура Тайме. Бумага Zoom plus. Усл. печ. л. 2,0.

Тираж 100 экз. Заказ № 07._

Отпечатано в типографии ОАО "НИИ систем" Новосибирск-58, ул. Русская, 39. т. 306-67-39

1 5 - - 43ûS

0016350

2010016350