Автореферат и диссертация по медицине (14.01.09) на тему:Клинико-иммунологическая характеристика хронического гепатита С с учетом факторов противовирусного иммунитета

Федеральное государственное бюджетное учреждение Научно-исследовательский институт ГРИППА Министерства здравоохранения Российской Федерации

На правах рукописи

т. Л4 tJ.ru. С7 и*£.и I ¿и^Ч J I

СЕЛЬКОВА

Мария Сергеевна

Клинико-иммунологическая характеристика хронического гепатита С с учетом факторов противовирусного иммунитета

14.01.09 - Инфекционные болезни

Научный руководитель

Доктор медицинских наук

профессор Эсауленко Елена Владимировна

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

ч

Санкт-Петербург, 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

ОГЛАВЛЕНИЕ.......................................................................................................................................2

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ....................................................................................................................4

ВВЕДЕНИЕ.............................................................................................................................................6

Глава 1. КЛИНИКО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКАЯ, ВИРУСОЛОГИЧЕСКАЯ И

ИММУНОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ХРОНИЧЕСКОГО ГЕПАТИТА С.................12

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРНЫХ ДАННЫХ...............................................................................................12

1.1 Социально-экономические аспекты ХГС................................................................................12

1.2 Эпидемиологические особенности ХГС..................................................................................13

1.3 Строение ВГС и связанные с ним механизмы персистенции возбудителя. Вирусологическая диагностика ХГС.............................................................................................14

1.4 Иммунопатогенез ХГС..............................................................................................................18

1.4.1 роль иммунной системы в патогенезе ХГС......................................................................18

1.4.2 Особенности содержания и функционального состояния цитотоксических лимфоцитов у пациентов с ХГС.................................................................................................20

1.4.3.Роль иммунорегуляторных клеток в патогенезе ХГС.....................................................25

1.4.4. Особенности синтеза эндогенных интерферонов у пациентов с ХГС..........................30

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ...............................................................33

2.1 Общая характеристика пациентов, включенных в исследование.........................................33

2.2. Общеклинические методы исследования...............................................................................34

2.3 Лабораторно-инструментальные методы исследования........................................................36

2.3.1. Молекулярно-биологические и серологические методы исследования.......................36

2.3.2 Биохимические методы исследования..............................................................................36

2.3.3.Неинвазивный метод «Фибротест» оценки фибротических изменений в ткани печени

........................................................................................................................................................37

2.3.4 Исследование субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови........38

2.3.4.1 Исследование общих маркеров Т- и В-клеток (СБЗ СЭ4 СБ8 СБ19)........................38

2.3.4.2 Исследование численного состава и функциональной активности МК-клеток и ИКТ-клеток............................................................................................................................................39

2.3.4.3 Исследование уровня регуляторных Т-клеток..............................................................42

2.3.5. Исследование интерферонового статуса.........................................................................46

2.3.6. Методы статистической обработки данных....................................................................48

Глава 3. КЛИНИКО-ЛАБОРАТОРНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ОБСЛЕДОВАННЫХ ПАЦИЕНТОВ.......................................................................................................................................49

3.1 Клиническая характеристика пациентов с ХГС......................................................................49

3.2 Биохимическая характеристика течения ХГС.........................................................................51

3.3 Молекулярно-биологические характеристики возбудителей ХГС.......................................54

3.4 Особенности содержания маркеров развития соединительной ткани печени у пациентов с различными формами ХГС.............................................................................................................57

Глава 4. ОЦЕНКА ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ ПАРАМЕТРОВ ОБСЛЕДОВАННЫХ ПАЦИЕНТОВ.......................................................................................................................................60

4.1 Характеристика цитотоксическских лимфоцитов и взаимосвязь их уровня с биохимическими показателями, молекулярно-биологическими характеристиками и степенью прогрессии заболевания...................................................................................................................60

4.2 Характеристика регуляторных Т-лимфоцитов и взаимосвязь их уровня с биохимическими показателями, молекулярно-биологическими характеристиками и степенью прогрессии заболевания.......................................................................................................................................79

4.3 Интерфероновый статус пациентов и взаимосвязь их уровня с биохимическими показателями, молекулярно-биологическими характеристиками и степенью прогрессии

заболевания.......................................................................................................................................90

Глава 5. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ.........................................................101

ВЫВОДЫ............................................................................................................................................119

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ............................................................................................120

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..................................................................................................................121

СПИСОК СОКРАЩЕНИИ

ХГС- хронический гепатит С ВГС - вирус гепатита С ПЦР - полимеразная цепная реакция РНК - рибонуклеиновая кислота AJ1T - аланинаминотрансфераза ACT - аспартатаминотрансфераза ГГТП - у-глутамилтранспептидаза ЩФ - щелочная фосфатаза

NK-клетки - клетки с фенотипом CD3" CD16+ CD56+ NKT-клетки - клетки с фенотипом CD3+ CD16+ CD56+

Активированные NK-клетки - клетки с фенотипом CD3~CD16+CD56+CD107a+ Т-регуляторные клетки (Т-регуляторные лимфоциты) - клетки с фенотипом CD4+CD25+CD127low

NCAM (neural cell adhesion molecule) - адгезионная молекула нервной ткани NKG2D, NKG2A - фенотипы лектиновых рецепторов NK-клеток TRAIL (tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand) - зависимый механизм апоптоза

Fas-леганд (CD 95) - леганд для Fas-рецептора клетках

CCL3 - хемокин CCL3

CCL4- хемокин CCL4

CCL5 - хемокин CCL5

XCL1 - хемокин XCL1

МНС 1 класса (major histocompatibility complex) - главный комплекс гистосовметимости 1 класса

МНС II класса (major histocompatibility complex) - главный комплекс гистосовметимости 2 класса

FcrRIII - рецептор для семейства иммуноглобулинов на NK-клетках

TGF (3 (Transforming growth factor beta) - трансформирующий ростовой фактор (3

KIR (killer inhibitory receptor) - ингибирующий рецептор на NK-клетках ITIM-мотив (immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif) - ингибиторный участок на NK-клетках IL-2 (Interleukin-2) - интерлейкин - 2 IL-4(Interleukin-4) - интерлейкин - 4 IL-7(Interleukin-7) - интерлейкин - 7 IL-13 (Interleukin-13) - интерлейкин - 13 IL-15(Interleukin-15) - интерлейкин - 15 IL-17(Interleukin-17) - интерлейкин - 17 TCR (T cell receptor) - Т-клеточный рецептор Th (T-helper cell) - Т-хелперные клетки Thl - Т-хелперные клетки 1 Th2 - Т-хелперные клетки 2 Th3 - Т-хелперные клетки 3 Thl7 - Т-хелперные клетки 17

LAMP (Lysosomal-associated membrane protein) - гликозилированный протеин CTLA- 4 (Cytotoxic T-Lymphocyte Antigen 4) - цитотоксический Т-лимфоцит-ассоциированный антиген

GITR (glucocorticoid-induced TNFR-related protein) - индуцированный

глюкокортикостероидами TNF-подобный рецептор

LAG-3 (Lymphocyte activation gene 3) - ген активации лимфоцитов

FOXP 3 (forkhead box РЗ) - транскрипционный фактор Т-регуляторных клеток

IFN (interferon) - интерферон

TRIF (transcription factors IRF3) - транскрипционный фактор синтеза интерферонов

MAVS (mitochondrial antiviral signaling protein) - транскрипционный фактор синтеза интерферонов

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы

Проблема вирусных гепатитов с парентеральным путем заражения остается

одной из самых актуальных в инфекционной патологии. Особого внимания заслуживает вирусный гепатит С, которым страдает приблизительно 150 млн. человек во всем мире.

По данным Всемирной организации здравоохранения ежегодно более 350000 человек умирают от ассоциированных с ВГС болезней печени (Информационный бюллетень № 164 ВОЗ, июль 2012 г.). Чрезвычайно высока вероятность развития первичной гепатокарциномы (20% случаев хронических гепатитов) [29, 43, 49].

С тех пор как в 1989 году вирус гепатита С (ВГС) был идентифицирован, продолжается его интенсивное изучение. Успехи этиологической верификации вирусных гепатитов, в том числе определение ВГС, ограничили в последние годы их распространение при гемотрансфузиях, операциях и прочих медицинских манипуляциях, однако значительной группой риска остаются парентеральные потребители наркотиков [165]. При анализе путей возможного инфицирования следует учитывать также парамедицинские процедуры (татуаж, пирсинг).

Отсутствие специфических мер профилактики наряду с высокой стоимостью противовирусной терапии и, ее недостаточной эффективностью делает хронического гепатита С (ХГС) актуальной медицинской и социальной проблемой [48, 71,150].

С момента выявления различных генотипов вируса предпринимались и предпринимаются до настоящего времени попытки определить зависимость клинической картины и эффективность терапии от определенного генотипа вируса и вирусной нагрузки [108].

Практически отсутствуют данные о взаимосвязи изменений различных популяций иммунокомпетентных клеток пациентов в зависимости от генотипа вируса, вирусной нагрузки и характера изменений в ткани печени.

Гуморальные факторы специфического иммунитета при ХГС практически не играют протективную роль, а их определение имеет преимущественно диагностическое значение [186, 191]. Поэтому особое внимание привлекает изучение клеточных факторов иммунитета [140]. При этом основную роль в механизмах элиминации вируса и развитии патологических процессов в печени отводят клеточным факторам иммунитета, в том числе врожденного, в частности цитотоксическим клеткам, а также системе интерферонов [115].

Практически не изучена при ХГС роль Т-регуляторных лимфоцитов, определяющих интенсивность иммунного ответа и ограничивающих иммунопатологические реакции в органах-мишенях.

Полученные данные, характеризующие содержание и функциональные особенности иммунекомпетентных клеток у пациентов с ХГС, могут иметь значение, как для оценки прогноза заболевания, так и для разработки новых подходов к иммуноориентированной терапии.

Цель и задачи исследования Цель:

изучить роль цитотоксических клеток, системы интерферонов и Т-регуляторных лимфоцитов в патогенезе хронического гепатита С (ХГС). В соответствии с указанной целью были поставлены и решены следующие

задачи:

1. Охарактеризовать клинико-биохимические особенности ХГС у пациентов с различными вариантами течения заболевания.

2. Определить этиологическую гетерогенность и уровень вирусной нагрузки у больных ХГС.

3. Оценить состояние интерферонового статуса у пациентов с различными вариантами течения ХГС.

4. Выяснить характер изменений содержания МКТ- и 1ЧК- клеток, в том числе их активированных форм у больных ХГС.

5. Уточнить роль Т-регуляторных лимфоцитов в прогрессировании ХГС.

Положения выносимые на защиту:

1. У пациентов с различными вариантами течения ХГС снижено содержание

активированных форм КК-клеток на всех стадиях заболевания. Содержание 1ЧКТ-клеток уменьшается по мере прогрессирования заболевания. ХГС сопровождается существенными изменениями интерферонового статуса, характеризующимися повышением сывороточного интерферона и снижением способности к продукции а/(3- и у-интерферонов лейкоцитами независимо от стадии заболевания.

2. При ХГС развитие фибротических изменений в ткани печени определяется иммуносупрессивными механизмами, связанными с Т-регуляторными лимфоцитами.

3. Для оценки тяжести и прогноза заболевания важное значение имеет сопоставление иммунологических параметров, в частности содержания и функциональной активности цитотоксических клеток, Т-регуляторных клеток, интерферонового статуса и биохимических параметров.

Научная новизна

Впервые на основании комплексной оценки содержания цитотоксических клеток установлено, что у пациентов с ХГС наблюдается снижение количества активированных форм МК-клеток. Получены новые данные, показывающие взаимосвязь повышения содержания Т-регуляторных клеток с прогрессированием фибротических изменений в ткани печени. Выявлено снижение способности к продукции эндогенных интерферонов, что может являться дополнительным патогенетическим обоснованием назначения интерферонотерапии при ХГС.

Теоретическая значимость работы

Показана возможная роль снижения цитотоксического потенциала 1ЧК-клеток в патогенезе ХГС. Установлено снижение функционально активированных Ж -клеток (СОЗ СБ16+С056+СЭ107а+) у пациентов с ХГС. Получены данные о взаимосвязи вирусной нагрузки с содержанием цитотоксических лимфоцитов и их функциональной активностью. Определено, что выраженность холестатического синдрома у пациентов ХГС связана с повышением содержания МКТ-клеток (С03+С016+СБ56+). Выявлено снижение способности к продукции эндогенных интерферонов, свидетельствующее о существенных изменениях неспецифической противовирусной резистентности у пациентов с различными вариантами течения ХГС. Установлено, что по мере прогрессирования заболевания увеличивается содержание Т-регуляторных клеток в периферической

крови пациентов, что может свидетельствовать о важной роли иммуносупрессивных механизмов в патогенезе ХГС и прогрессировании фибротических изменений в ткани печени.

Практическая значимость работы

Оценка содержания и функционального потенциала МК-клеток может

служить важным иммунологическим критерием прогрессирования ХГС. Так, снижение содержания активированных МК-клеток (СХ)30}16+С056+СВ107а+) является одним из показателей неблагоприятного течения ХГС. Выявленные у пациентов ХГС существенные изменения интерферонового статуса,

характеризующиеся снижением способности к продукции а/р~ и у-интерферонов лейкоцитами, могут служить дополнительным обоснованием для назначения интерферонотерапии. Определение содержания Т-регуляторных лимфоцитов позволяет оценить выраженность иммуносупрессивных механизмов у пациентов с ХГС, способствующих прогрессированию заболевания.

Апробация и внедрение результатов работы в практику

Результаты работы доложены на VII Всероссийской научно-практической

конференции "Вирусный гепатит - проблемы эпидемиологии, диагностики, лечения и профилактики" (М, 2007), Международной конференции «Развитие научных исследований и надзор за инфекционными заболеваниями» (СПб, 2010), XIV Всероссийском научном форуме с международным участием им. акад. В.И.Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (СПб, 2011), Научной конференции молодых ученых с международным участием «Актуальные вопросы инфекционной патологии - 2011» (СПб, 2011), V Междисциплинарной научно-практической конференции с международным участием «Урогенитальные инфекции и репродуктивное здоровье: клинико-лабораторная диагностика и терапия» (СПб, 2012), Объединенном иммунологическом форуме (Нижний Новгород, 2013).

Результаты работы внедрены в лечебно-диагностическую практику отделения экспериментальной терапии вирусных гепатитов ФГБУ «НИИ гриппа» МЗ РФ, ГКУЗ Ленинградской области «Центр по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями», используются в учебном курсе для студентов V и VI курсов и слушателей на циклах постдипломного образования на кафедре инфекционных болезней и эпидемиологии с курсом ВИЧ-медицины ГБОУ ВПО «СПбГМУ им.акад. И.П.Павлова» МЗ РФ.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 10 работ, в том числе 3 статьи - в ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях, рекомендуемых ВАК РФ.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 143 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Диссертация иллюстрирована 18 таблицами и 11 рисунками. В библиографический указатель включено 206 источника, из них 29 работ отечественных и 177 зарубежных авторов.

Глава 1. КЛИНИКО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКАЯ, ВИРУСОЛОГИЧЕСКАЯ И ИММУНОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ХРОНИЧЕСКОГО ГЕПАТИТА С

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРНЫХ ДАННЫХ 1.1 Социально-экономические аспекты ХГС

Проблема вирусных гепатитов с парентеральным путем заражения остается одной из самых актуальных в инфекционной патологии. Особого внимания заслуживает ВГС в связи с тем, что возбудителем этой инфекции (ВГС) инфицировано более 150 млн. человек во всем мире (Информационный бюллетень № 164 ВОЗ, июль 2012 г.).

В Российской Федерации тенденция к увеличению частоты хронизации вирусного гепатита С прослеживается на протяжении нескольких лет, в то время как число острых форм вирусного гепатита С неуклонно сокращается. Так например, если в 2000 году было зарегистрировано 21,1 %00 хронических форм гепатита С и 22,2 %оо острых форм, то уже в 2008 году соотношение резко изменилось и составило 2,8 %оо острых (манифестных) форм гепатита С и 39,1 %оо хронических форм гепатита С [20].

Наиболее неблагоприятными регионами Российской федерации считаются Дальневосточный, Уральский, Сибирский и Северо-Западный федеральные округа, где регистрируется устойчиво высокое количество всех форм данной инфекции.

В Санкт-Пет�