Автореферат и диссертация по медицине (14.01.10) на тему:Клинико-экспериментальное исследование влияния интрадермального введения модифицированной гиалуроновой кислоты на морфофункциональное состояние кожи с инволюционными изменениями

На правах рукописи

МИХАЙЛОВА НАТАЛЬЯ ПАВЛОВНА

Клинико-экспериментальное исследование влияния интрадермального введения модифицированной гиалуроновой кислоты на морфофункциональное состояние кожи с инволюционными изменениями

14.01.10 - Кожные и венерические болезни

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

15 ЯКЗ 2015

005557695

Москва - 2015

005557695

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова Минздрава России.

Научные руководители:

Потекаев Николай Николаевич - доктор медицинских наук, профессор Шехтер Анатолий Борисович - доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

Матушевская Елена Владиславовна - доктор медицинских наук, профессор, профессор кафедры дерматовенерологии и косметологии ФГБОУ ДПО Институт повышения квалификации ФМБА России г. Москва.

Баткаев Эдуард Алексеевич - доктора медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой клинической микологии и дерматовенерологии ФПК МР РУДЫ, президент общественной организации содействия последипломного образования, заслуженный врач РФ.

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова Минздрава России.

Защита состоится « 2015 г. в часов на заседании диссертационного

совета Д 208.040.10 , созданного на базе ГБОУ ВПО Первого Московского государственного медицинского университета им. И.М. Сеченова по адресу: 119992, Москва, ул. М. Трубецкая, дом 8, стр. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной медицинской библиотеке ГБОУ ВПО Первого МГМУ им. И.М. Сеченова (ЦНМБ) по адресу: 117998, г. Москва, Нахимовский бульвар, д. 49 и на сайте ГБОУ ВПО Первого МГМУ им. И.М. Сеченова www.mma.ru.

Ученый секретарь

Диссертационного совета Д 208.040.10, кандидат медицинских наук, доцент

Чебышева Светлана Николаевна

Актуальность темы.

На сегодняшний день вполне определенно можно констатировать, что среди многочисленных методик, применяемых с целью омоложения кожи в эстетической медицине и косметологии, инъекционные методы коррекции инволюционных изменений кожи привлекают особое внимание, как врачей, так и пациентов. Кроме того, в последнее время наблюдается тенденция к постоянному росту использования инъекционных методов терапии в коррекции инволюционных изменений кожи. Согласно отчету Американского общества эстетической и пластической хирургии (ASAPS) за 2009 год инъекции гиалуроновой кислоты (ГК) занимают второе место среди других нехирургических методов омоложения кожи (1 313038 инъекций ГК в США, 2009 г.), уступая первенство лишь инъекциям токсина ботулизма типа А (2 557 068 инъекций в США, 2009 г.) (Деев А.И., Чайковская Е.А., 2009).

Старение кожи, как частный случай старения всего организма можно рассматривать с точки зрения изменения стационарного состояния, при котором сложные соединения, например коллаген, эластин, кислые гликозаминогликаны (ГАГ) в их числе гиалуроновая кислота (ГК), непрерывно синтезируются в ходе одних процессов и распадаются в ходе других. Для поддержания здоровья кожи крайне важна координация процессов синтеза-распада (Oxlund V., Anderssen Т., 1980). Так, например, существует четкое соответствие между интенсивностью обмена ГАГ, их белковых соединений — протеогликанов и коллагеновых белков дермы. От соотношения этих процессов зависит интенсивность старения кожи. С возрастом, либо при воздействии неблагоприятных факторов внешней среды, это соотношение меняется в результате уменьшения скорости образования и возрастания скорости распада подобных биомолекул (Жирнова Н.С., 2007). С этой позиции, стратегия, которую необходимо реализовать в инъекционной косметологии, должна быть направлена на создание физиологически благоприятной среды для усиления метаболической активности клеток кожи, что приводило бы к активации синтеза основных компонентов межклеточного матрикса дермы (Хабаров В. Н., Зеленецкий А. Н. 2008). В дерматологии существует опыт введения монопрепаратов на основе ГК, как нативной, так и частично стабилизированной (Duranti F., 1998, Эрнандес Е. И., 2010). В инъекционной дерматологии первоначально гиалуроновой кислоте отводилась роль наполнителя межклеточного пространства, однако развитие экспериментальных и теоретических биофизических методов исследования

полимеров дало толчок к изучению ГК, как природного регулятора ряда биологических процессов; таких, как пролиферация и миграция фибробластов, пролиферация эпителиальных клеток, стимуляция ангиогенеза, активация компонентов гомеостаза, и д.р. (Suzuki М., 1995). Определена значимость ГК как транспортного средства для доставки и контролируемого освобождения лекарственных средств (Хадарцева А. А., 2003).

Благодаря развитию новых технологий появилась возможность создания препаратов гиалуроновой кислоты, модифицированной витаминами, микроэлементами, аминокислотами и олигопептидами с геропротекторным, в том числе антиоксидантным действием. Появились препараты для терапии инволюционных изменений кожи с ГК и витамином С, глицином, пролином, лизином, валином, цистеином, метионином, глутатионом и пр. (Хабаров В.Н., Бойков П.Я., Селянин М.А., 2012). В научной литературе имеются сведения о способности витамина С влиять на образование ГАГов, в частности, ГК и хондраитинсульфата, и стимулировать пролиферацию фибробластов (Millis А., 1992).

Физиологическое действие витамина С связывают не только со стимулированием продукции коллагена, но также и с уменьшением продукции металлопротеиназ - ферментов, разрушающих коллаген дермы. В многочисленных работах подтверждена способность аскорбиновой кислоты улучшать состояние кожи, поддерживать ее здоровье, в том числе эффективно борясь с первичными признаками старения (Ребров В.Г., Громова O.A., 2007). Аминокислоты: глицин, пролин, лизин, валин входят в состав основных белков межклеточного матрикса дермы. Их присутствие в инъекционных препаратах наряду с другими низкомолекулярными биорегуляторами и микроэлементами необходимо для запуска синтеза собственного коллагена и эластина, что чрезвычайно важно для достижения устойчивого, пролонгированного во времени эффекта. Серусодержащие аминокислоты цистеин, метионин и трипептид глутатион очень мощные антиоксиданты, действующие на различных стадиях свободнорадикального цепного процесса окисления биомолекул (Овчинников Ю.А., 1987).

Цель исследования: Изучить характер интрадермального введения ГК, модифицированной биологически активными веществами на морфофункциональное состояние кожи.

Задачи исследования:

1. Изучить характер влияния воздействия модифицированной ГК при подкожном и внутрикожном введении на морфологическую структуру и ультраструктуру кожи в эксперименте на крысах и минисвиньях.

2. Провести клиническую оценку эффективности и переносимости модифицированной ГК лицами с инволюционными изменениями кожи.

3. Исследовать функциональные параметры инволюционно измененной кожи в процессе интрадермального введения модифицированной ГК.

4. Оценить влияние модифицированной ГК на структурные компоненты кожи с инволюционными изменениями.

Научная новизна

Впервые в эксперименте на крысах и минисвиньях изучен характер воздействия ГК, модифицированной биологически активными веществами (БАВ), на морфологическую структуру и ультраструктуру кожи в динамике при подкожном и внутрикожном введении.

Впервые показано, что модифицированная БАВ гиалуроновая кислота является биосовместимым и биологически инертным материалом, клинически значимая эффективность которого выше, чем у нативной (немодифицированной ГК).

Впервые установлено, что при инъекционном введении гелей ГК, модифицированной витамином «С» (per se и в комплексе с аминокислотами), олигопептидами и фолиевой кислотой активизируется пролиферация фибробластов и неоангиогенез, усиливается синтез и фибриллогенез коллагена и эластина но соединительнотканная капсула вокруг имплантата не формируется.

Впервые дана клиническая оценка влияния модифицированной ГК на структурные компоненты кожи с инволюционными изменениями.

Впервые доказано, что интрадермальное введение препаратов на основе ГК, модифицированной биологически активными веществами, такими, как витамины, аминокислоты, олигопептиды, создает физиологически благоприятную среду для усиления метаболической активности клеток кожи, что вызывает активацию синтеза основных компонентов межклеточного матрикса дермы, способствует омоложению кожи, снижает выраженность ее инволюционных изменений и улучшением ее функциональные параметров.

Проведена клиническая оценка эффективности и переносимости модифицированной ГК лицами с инволюционными изменениями кожи, что даст

возможность применять такие препараты в комплексной терапии инволюционных изменений кожи.

Практическая значимость.

Впервые применено интрадермальное введение модифицированной ГК, ковалентно связанной с биологически активными веществами, для коррекции инволюционных изменений кожи лиц разных возрастных групп; показана высокая эффективность и переносимость метода. Полученные результаты позволяют разработать патогенетические схемы лечения внешних признаков старения у лиц пожилого и старческого возраста, что позволит существенно повысит качество жизни таких пациентов.

Положения, выносимые на защиту.

- Препараты ГК, модифицированной витаминами, аминокислотами, олигопептидами обладают хорошей биосовместимостью и переносимостью, не вызывают образования соединительно-тканных капсул в месте введения и отрицательных реакций со стороны кожи, активизируют пролиферацию фибробластов и неоангиогенез, усиливают синтез и фибриллогенез коллагена и эластина.

- Интрадермальное введение модифицированной гиалуроновой приводит к существенному повышению регенеративного потенциала кожи и снижает степень проявления внешних признаков возрастной инволюции.

- Препараты на основе ГК, модифицированной биологически активными веществами, являются новым перспективным высокоэффективным методом лечения инволюционных изменений кожи.

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на I Московском форуме «Дерматовенерология и косметология: синтез науки и практики» (Москва, октябрь 2010 г), XI Всероссийском съезде дерматовенерологов (Екатеринбург, ноябрь 2010 г), III международном форуме медицины и красоты (Москва, декабрь 2010 г), X Международном симпозиуме по эстетической медицине (Москва, январь 2011 г), Практикуме-форуме «Образовательные дни для специалистов эстетической медицины и косметологии (Алма-Ата, апрель 2011 г), Международной конференции Украинского общества эстетической медицины «Эстетическая медицина - проблемы и решения. Стандартизация подходов при коррекции возрастных изменений» (Одесса, июнь 2011 г) XI Международном симпозиуме по эстетической медицине (Москва, январь 2012 г), 2-ом Конгрессе Евро-азиатской

ассоциации дерматовенерологов - V международном форуме медицины и красоты (Москва, март 2012), Конгрессе индустрии красоты Estet Beauty Ехро-2012 (Киев, апрель 2012), Форуме «Медицина Красоты» (Екатеринбург, июнь 2012), 15th International congress on neutron capture therapy. (10-14 September, 2012, Tsukuba, Japan) II Московском форуме «Дерматовенерология и косметология: синтез науки и практики» (Москва, октябрь 2012).

Апробация работы состоялась на совместной научно-практической конференции коллектива сотрудников кафедры кожных и венерических болезней ФППОВ ГБОУ ВПО Первого МГМУ имени И.М.Сеченова и лаборатории экспериментальной морфологии НИИ молекулярной медицины Первого МГМУ имени И.М.Сеченова Минздрава России 28 мая 2014г.

Внедрение в практику.

Результаты работы внедрены в практику работы лаборатории по изучению репаративных процессов в коже НИЦ и кафедре кожных и венерических болезней ФППОВ Первого МГМУ имени И.М.Сеченова, используются в лечебной работе клиники эстетической медицины «Реформа».

Личный вклад автора.

Автор принимал непосредственное участие во всех этапах исследования. Осуществил подкожное и внутрикожное введение гелей модифицированной и нативной ГК 180 лабораторным животным. Вел лабораторные журналы. Провел разделение пациенток на группы в зависимости от выраженности возрастных изменений. Выполнил по 3 процедуры внутрикожного введения модифицированной ГК 90 пациенткам. Провел клиническое обследование пациенток до и после курса процедур. Самостоятельно провел анализ экспериментальных и клинических результатов. Провел математическую обработку полученных результатов с использованием современных статистических программ, сформулировал обоснованные выводы и дал важные практические рекомендации.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 26 печатных работы, из них 5 статей в журналах, рецензируемых ВАК РФ.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности.

Диссертация соответствует паспорту номенклатуры специальности научных работников 14.01.08 кожные и венерические болезни; формуле специальности: кожные и венерические болезни - область медицинской науки, изучающая кожный покров и видимые слизистые оболочки в норме и патологии; основное внимание

уделяется этиологии, эпидемиологии, патогенезу, диагностике, лечению и профилактике дерматозов и инфекций, передаваемых половым путем, согласно пункту 4.

Структура диссертации.

Диссертация изложена на 134 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Библиографический указатель включает 173 литературных источника, из них 83 отечественных и 90 иностранных. Работа иллюстрирована 57 рисунками и 14 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ. Материалы и методы

Экспериментальные исследования были выполнены с целью изучения особенностей резорбции (сроки, полнота, тканевая реакция) гелей немодифицированной (нативной) и модифицированной ГК при подкожном (I серия) и внутрикожном (И серия) введении.

В I серии экспериментов изучены 5 вариантов гелей ГК различных степеней структурирования, содержащих различные включения: витамины, аминокислоты, олигопептиды, вспомогательные вещества.

1. Гидрогель ГК нативный без добавок (Гель №1)

2. Гидрогель ГК, модифицированный витамином «С» (Гель №2)

3. Гидрогель ГК, модифицированный глютатионом (Гель №3)

4. Гидрогель ГК, модифицированный фолиевой кислотой (Гель№ 4)

5. Гидрогель ГК, модифицированный витамином «С», пролином, глицином, лизином (Гель №5)

Содержание ГК в геле во всех случаях составляла 1,4 масс.%, содержание добавок 0,4 масс.%

Эксперимент выполнен на 180 белых лабораторных крысах-самцах массой тела 120-140 г. Наркотизированным животным в межлопаточной области спины слева от средней линии подкожно стерильной иглой вводили по 1,5 мл изучаемых образцов гелей. Справа аналогично вводили 5% раствор нативной ГК.

Животных выводили из эксперимента в сроки 1, 3, 7, 14 суток. Визуально оценивали макроскопическую картину места введения гелей: их сохранность и внешний вид, наличие капсулы, состояние окружающих тканей и пр. После этого остатки геля вместе с капсулой отбирали для последующего гистологического

изучения. Отобранный материал фиксировали в 10% растворе нейтрального (забуференного) формалина. После 3-х суток фиксации из биоптата вырезали образец размером 0,3-0,8 см и заливали в парафиновые блоки по стандартной методике. Парафиновые срезы 4-5 микрон окрашивали гематоксилином и эозином, пикрофуксином по Ван-Гизону (для выявления зрелых коллагеновых волокон), толуидиновым синим на кислые гликозаминогликаны (ГАГ). Использовали также окраску серебром по Гомори для выявления коллагеновых волокон различной степени зрелости. Полученные микропрепараты изучали с использованием светового микроскопа Olympus ВХ51 (Olympus, Япония), оснащенного цифровой видеокамерой SDU-252 («Спецтелетехника», Россия). Микрофотографирование гистологических препаратов проводилось помощью этой камеры и программы Launch CamView. Полученные изображения сохраняли в формате Tiff (16 bit).

II серия экспериментов - внутрикожное введение гелей.

В этой серии экспериментов изучали резорбцию и тканевую реакцию при внутрикожном введении гелей ГК. Эксперимент выполнен в Центре биомедицинских технологий РАМН на 3-х минисвиньях породы «светлогорская», массой тела 16-20 кг.

Изучены 3 варианта гелей гиалуроновой кислоты:

1. Нативная гиапуроновая кислота (контроль)

2. Гидрогель ГК, модифицированной витамином «С», глицином, пролином и лизином

3. Гидрогель ГК, модифицированной витамином «С» и глютатионом.

Изучаемые гели вводили на депилированных участках заднебоковой поверхности спины внутрикожно из 3-х вколов, отстоящих друг от друга на 1,5 см. Места вколов отмечали маркером.

Сроки наблюдения — 1, 3, 5 суток. В указанные сроки под местной анестезией иссекали полоску кожи в зоне введения гелей. Образовавшуюся рану ушивали наглухо. Из всей толщи кожи на местах вколов (через центр вкола) вырезали по 2 образца размером 5X8 мм для гистологического изучения и электронно-микроскопического исследования. Фиксация образцов, изготовление срезов и их окрашивание для гистологического изучения по обычной методике.

На 3-й сутки после введения гелей ГК на биоптатов, изъятых у всех 3-х животных, проводили электронно-микроскопическое исследование по стандартной методике: фиксация глютаровым альдегидом, заливка в эпон-аралдит, просмотр полутонких (толщиной 1-1,5 мкм) срезов при помощи светового микроскопа,

просмотр ультратонких срезов (толщиной 25 нм) на электронном микроскопе ШОЬ ШМ-2000 ИХП, Япония.

Клинические исследования. В исследованиях приняли участие 90 пациентов женского пола зрелого (от 35 до 50 лет) и пожилого возрастов (от 60 лет). Средний возраст пациенток, участвующих в исследовании, составил 47,4 года (минимальный возраст - 35 лет, максимальный возраст - 62 года).

У всех пациенток имелись возрастные изменения кожи, а также проявления фотостарения - снижение тонуса кожи, морщины и складки (динамические мимические и статико-мимические), очаговая гиперпигментация, неоднородность цвета лица, а также явления обезвоживания (от чувства стягивания после контакта с водой до наличия шелушения в течение дня, некомпенсируемое или компенсируемое в незначительной степени применением увлажняющих кремов).

Пациентки были разделены на 3 группы по степени выраженности проявлений фото- и хроностарения (согласно шкале Глогау):

1 группа - наличие 2-3 признаков II типа - возраст от 35 до 40 лет;

2 группа - преобладание признаков II типа- возраст от 41 до 55 лет;

3 группа - преобладание признаков III типа- возраст от 56 до 62 лет.

Распределение пациентов по группам представлено в таблице 1.

Таблица 1.

Возрастной состав пациенток, отобранных для участия в клиническом

исследовании

Исследуемые группы

Группа 1 Группа 2 Группа 3

Количество пациенток 30 31 29

Возраст пациенток, лет 35-40 41 -55 56-62

Средний возраст пациенток, М±т 36,4±0,90 48,3±0,62 60,97±0,67

Для оценки динамики морфофункциональных параметров кожи пациентов использовались неинвазивные методы диагностики функций и морфологии кожи (таблица 2).

Таблица 2.

Методы неинвазивной диагностики кожи

Методы диагностики функций кожи

Методы диагностики морфологии кожи

1 .Измерение влажности

корнеометрия

2. Определение рН кожи - рН- метрия 3.Оценка салоотделения (жирности) -себометрия

4.0ценка эластичности кожи эластометрия_

1.Оценка микротопографии кожи -ультразвуковое дермасканирование 2 Прижизненное изучение морфологии кожи - конфокальная лазерная сканирующая микроскопия 3. Оценка рельефа кожи визиосканирование_

Измерения проводили до начала курса лечения (исходное состояние кожи) и через 3-4 недели после завершения процедур.

Для неинвазивной оценки микротопографии кожи у пациентов с инволютивными изменениями кожи до и после введения препаратов модифицированной ГК применяли метод ультразвукового сканирования с использованием аппарата «DermaScan С ver.3» («Cortex ТесЬпо^у»Дания).

Исследование путем конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (KJICM) проводилось на аппарате Vivascope 1500 (Lucid, Inc., США). Данный метод позволяет получать изображения клеток в реальном времени, слой за слоем, как на живой, так и на иссеченной ткани и по разрешающей способности приближается к оптической микроскопии.

Для оценки показателей микрорельефа кожи в процессе селективного импульсного воздействия применялся аппарат Visioscan VC 98 (Courage+Khazaka electronic, Германия).

Исследование эластической способности кожи проводилось с помощью насадки аппарата Soft Plus (Callegary, Италия) в стандартизированной точке согласно протоколу измерения эластичности кожи на данном аппарате - область "гусиных лапок».

Исследование влажности кожи проводилось с помощью насадки аппарата Soft Plus (Callegary, Италия) в стандартизированных точках согласно протоколу измерения увлажненности кожи на данном аппарате - центральная часть лба, центральная часть обеих скуловых областей, подбородок.

Исследование рН кожи проводилось с помощью специальной насадки аппарата Soft Plus (Callegary, Италия) в точке, соответствующей центру скуловой области.

Исследование функции сальных желез проводилось с помощью насадки аппарата Soft Plus (Callegary, Италия) в стандартизированной точке согласно протоколу себометрии на данном аппарате — центральная часть скуловой области.

Методы введения модифицированной гиалуроновой кислоты

Для коррекции инволютивнных изменений кожи пациенткам вводили препарат, содержащий магниевую соль ГК (14 мг/мл), модифицированную витамином «С» и аминокислотами (пролин, лизин, глицин).

Препарат вводили внутрикожно на глубину 1,5-3 мм по всей поверхности лица, с расстоянием между точками инъекций 1 см. Общий объем препарата, вводимого однократно, 1,5 мл. Количество процедур составило 3, межпроцедурный интервал - 3 недели.

Процедуры проводились следующим образом:

1. Аппликационная анестезия мазью Эмла 5% за 15-20 минут до проведения процедуры.

2. Дезинфекция кожи 0,5% раствором хлоргексидина биглюконата

3. Проведение инъекций.

4. Дезинфекция кожи 0,5% раствором хлоргексидина биглюконата

Аналогичным способом вводили немодифицированную ГК (гель с

концентрацией 14 мг/мл) пациентам контрольной группы.

Методы статистической обработки данных. Статистическая обработка материала проводилась с помощью программного обеспечения Statistica 6.0 for Windows. Для сравнения количественных показателей до и после лечения использовали критерий Стьюдента. Критерием статистической достоверности был уровень р < 0,05.

Результаты исследования и обсуждение.

Экспериментальные исследования включали в себя макроскопическое, гистологическое, гистохимическое и электронно-микроскопическое изучение гелей ГК, модифицированной витаминами, аминокислотами, олигопептидами при подкожном и внутрикожном введении.

Гистологическое и гистохимическое изучение имплантатов при подкожном введении гелей ГК установило, что, начиная с 1 суток, все виды гелей присутствуют под кожей в местах инъекций частично в виде свободно лежащих компактных образований, а также частично пропитывая близлежащие подкожно-жировую клетчатку и соединительную ткань. К 3-7-м суткам после введения происходит постепенная деградации гелей путем макрофагальной резорбции, а также бесклеточного ферментативного лизиса. К 14 суткам остатки гелей обнаруживались либо в тканях в виде отдельных небольших фрагментов, либо - в гиперплазированных лимфоузлах и в макрофагах, фагоцитировавших гель.

В зависимости от иммобилизированного с ГК вещества, определяющего физико-химические и биологические свойства препарата, гель либо быстрее выводился через лимфатическую систему, либо дольше оставался в клетчатке в виде отдельных рыхлых конгломератов. Наибольшая длительность существования отмечалась у гелей ГК, модифицированной либо одним витамином «С», либо его комплексов с аминокислотами. Гель немодифицированной ГК подвергался практически полной резорбции уже на 3 сутки после введения. Вероятно, это было связано с меньшей степенью структурирования немодифицированной ГК, т.к. для нее была также отмечена большая степень пропитывания гелем жировой клетчатки, что обусловлено не только меньшей степенью молекулярного структурирования, но и большим содержанием жидкости в геле. Отмеченная нами динамика деградации исследованных препаратов доказывает достаточную длительность нахождения их в тканях, что является важным положительным свойством, т.к. позволяет при введении препаратов пациентам с целью коррекции возрастных изменений создать депо биологически активных веществ. Длительное нахождение препаратов ГК в тканях отмечено в литературе только для стабилизированных препаратов, которые используются для аугументации и, как правило, не обладают стимулирующим влиянием на кожу (Ваитапп Ь.,2012).

Нами было отмечено развитие умеренного асептического воспаления на границе между гелями и окружающими тканями. Наблюдалась слабая нейтрофильная инфильтрация с максимумом на 1 сутки, которая сменялась лимфоцитарно-макрофагальной инфильтрацией на более поздних сроках, что могло быть проявлением тканевой реакции на повреждение в виде инъекции и введение препарата. К 14 суткам содержание фагоцитирующих клеток и лимфоцитов в основном возвращалось к норме.

Отмеченные нами изменения доказывают, что инвазивность самих инъекций, провоцирует процессы, подобные протекающим при ранениях кожи, но с меньшей глубиной и в меньших масштабах. Повреждение различных типов клеток в тканях приводит к высвобождению лизосом и лизосомных ферментов в межклеточный матрикс. Запускается каскад межклеточных взаимодействий, состоящий из серий реакций различных типов клеток поврежденной ткани под контролем локальных медиаторов - факторов роста. С одной стороны, интенсифицируются процессы ферментативного расщепления биополимеров, в частности гиапуронидазой, и отщепления сульфатированных гликозаминогликанов от белкового компонента протеогликанов, протеолиза белков и т.д. С другой стороны, развиваются процессы

репаративной регенерации, противостоящие разрушению и направленные на восстановление структуры межклеточного матрикса. В конечном счете, по закону избыточной компенсации, репаративные процессы в клетках не только восстанавливают повреждения, но и приводят к обновлению («омоложению») структур клеток и внеклеточного вещества и способствуют выходу на более высокий стационарный уровень, где сбалансированные процессы синтеза-распада протекают с повышенными скоростями. Модифицированная низкомолекулярными биорегуляторами ГК является источником биологически активных соединений необходимых для протекания процессов биорепарации.

Результаты экспериментальных исследований доказали способность препаратов модифицированной ГК усиливать процессы регенерации. На границе между гелем и жировой клетчаткой, начиная с 3 суток эксперимента, постепенно усиливались пролиферация фибробластов и новообразование капилляров. Эти процессы были наиболее выражены при введении препарата ГК, модифицированной витамином «С» (рис. 1)

Рис. 1. Гель №2 (модификация витамином С), 3-й сутки после введения. Внизу - гель с большим количеством крупных макрофагов, вверху - жировая кчетчатка с полнокровием сосудов, клеточной инфильтрацией и пролиферацией фибробластов (стрелки).

Внутрикожное введение минисвиньям препаратов ГК, модифицированной веществами с антиоксидантными и геропротекторными свойствами (витамином «С», глицином, пролином, лизином и глутатионом) также приводило к выраженной пролиферации фибробластов и неоангиогенезу, а при введении гелей, в состав которых входит, кроме аскорбиновой кислоты, аминокислотный комплекс или

олигопептид глютатион, активация пролиферативной активности клеток сопровождалась, по данным электронной микроскопии, повышением синтеза и фибриллогенеза коллагена и эластина.

Развитие фиброза в месте введения препарата - это патологическое состояние, которое может стать почвой для развития дальнейших патологических изменений. Наши гистологические исследования показали, что при введении всех изучаемых образцов модифицированной ГК происходило врастание фибробластов и капилляров в гель. Однако, на всех сроках экспериментов по подкожному и внутрикожному введению гелей признаков образования соединительно-тканной капсулы вокруг имплантата не обнаружено (рис.2).

- т * ' ,, -V '' Т ' ' ?■ ' ___.

:. - "Г

'•. * ' "•>•'•" л;-:-- „

Ч>. ' " • » ^ о •- ! к

•т ..6

V Л ---

•л л1 . <"

-.V / ■ У", ¿кЛ

Рис. 2. Гель №2 (модификация витамином С), 7-е сутки после введения. В центре препарата - гель с нейтрофилами и макрофагами. Вверху - участок геля с проросшими фибробластами и сосудами, внизу - жировая клетчатка. Соединительная капсула отсутствует. Окраска Г-Э, увеличение X 400

Это подтверждает высокую биосовместимость вводимых препаратов с живыми тканями и является отличительной особенностью всех исследованных образцов.

Сравнительное изучение разных образцов гидрогелей ГК показало специфичность тканевого ответа на низкомолекулярные регуляторы. В исследованиях использовались препараты ГК модифицированной витамином «С», фолиевой кислотой, аминокислотами (глицин, пролин, лизин) и глютатионом. Установлено, что эти низкомолекулярные вещества обладают геропротекторными свойствами, являясь факторами антиоксидантной защиты, антигипоксантами, а

также улучшают обмен веществ в коже. Среди них более выраженным действием на регенерацию кожи обладали препараты ГК, модифицированные витамином «С» и аминокислотами. По сравнению с другими образцами гидрогель немодифицированной ГК не проявил столь существенного влияния на структуру и функции кожи.

Результаты клинических исследований. Большинство испытуемых с инволюционными изменениями кожи и ее придатков субъективно отметили значительный положительный эффект после курса терапии: улучшение тонуса, цвета кожи уменьшение выраженности морщин, повышение увлажненности кожи (таблица 3). Последний эффект имел тенденцию к нарастанию и пролонгации по мере увеличения количества процедур. Нежелательные явления и осложнения отсутствовали.

Таблица 3.

Результаты субъективной оценки пациентками состояния кожи после курса

процедур

Критерии оценки Средняя оценка пациентов ( по 4-х бальной системе: 0-3 баллов)

Группа 1 Группа 2 Группа 3

Тонус кожи 2,6 2,5 2,5

Улучшение цвета кожи 2,5 2,4 2,6

Уменьшение выраженности морщин 2,7 2,5 2,5

Увлажняющий эффект 2,5 2,5 2,5

Для оценки эффективности инъекционного внутридермапьного введения ГК, модифицированной витамином «С» в комплексе с аминокислотами, было проведено динамическое изучение морфофункционального состояния кожи с помощью неинвазивных методов исследования, включавших рН-метрию, себометрию, корнеометрию, эластометрию, визиосканирование, ультразвуковое сканирование и конфокальную лазерную сканирующую микроскопию. Измерения проводили до начала курса лечения (исходное состояние кожи) и через 3-4 недели после завершения процедур.

Исследование функциональных параметров кожи выявило возрастные особенности. В первой группе пациенток от 35 до 40 лет все изучаемые показатели до процедуры находились в пределах нормы. У пациенток средней и старшей возрастных групп наблюдались возрастные отклонения от нормальных значений разной степени выраженности. Особенно выраженной была дегидратация кожи.

Среднее значение увлажненности у пациенток старшей возрастной группы (3 группа) было на 62% ниже чем у пациенток 1 группы, а разница в показателях эластичности между 1 и 3 группой составила 52%. При применении препарата ГК, модифицированной витамином С и аминокислотами (глицин, пролин, лизин), отмечено повышение эластичности кожи (рис.3), наиболее выраженное у 2 группы пациентов.

группа 1 группа 2 группа 3

Рис. 3. Динамика средних показателей эластометрии

Ответ на терапию был разным в различных возрастных группах. Так у пациентов 35-40 лет, у которых все функциональные показатели кожи до курса процедур находились в пределах нормы, после терапии они приближались к верхней границе нормы. В группе от 41 до 55 лет терапия привела к более существенному улучшению всех исследованных параметров. В группе пациенток в возрасте 56-62 года (с преобладанием признаков III типа старения по Глогау) проведенный курс терапии привел к наибольшему приросту показателей, в особенности увлажненности и жирности кожи по сравнению с пациентками более молодого возраста (рис. 4 и 5). Показатель увлажненности вырос на 87%, а жирности на 46%.

Влажность, жирность и рН кожи характеризуют ее барьерные свойства. Поскольку известно, что у женщин старшей возрастной группы наиболее выражен дефицит антиоксидантов в крови и коже, введение ГК модифицированной аскорбиновой кислотой, привело к снижению интенсивности ПОЛ в коже, стабилизации клеточных мембран, нормализации рН кожи, а в результате, ее барьерных свойств, что привело повышению ее гидратации. Однако, по данным объективной оценки

морфофункционального состояния тканей в результате терапии не произошло компенсации имеющихся возрастных изменений кожи в этой группе пациенток, поскольку после процедур показатели, несмотря на увеличение, не соответствовали физиологически нормальным. По субъективным оценкам самих пациенток 3 процедуры были недостаточными для компенсации имеющихся возрастных изменений кожи.

80 70 60 50 40 30 20 10 0

I

группа 1 группа 2 группа 3

□ до курса Ш после курса

Рис. 4. Динамика средних показателей корнеометрии

50 40 30 20 10

группа 1 группа 2 группа 3

□ до курса ВЗ после курса

Рис. 5. Динамика средних показателей себометрии

Исследование микроструктуры кожи после курса процедур также показало положительную динамику. По данным УЗ-сканирования (таблица 4) отмечалось более равномерное строение эпидермиса с уменьшением участков истончения, более равномерное его прилегание к дермальным структурам, что говорит о

восстановлении морфофункционального состояния этого слоя (рис.6). Со стороны эпидермо-дермального слоя отмечалось увеличение толщины, более равномерное распределение структур, т.е. увеличение гиперэхогенности и сокращение участков гипоэхогенности, в том числе и уплотнение сосочковой зоны дермы, что указывает на оптимизацию функционального состояния кожи в результате действия компонентов препарата.

Таблица 4

Динамика средних показателей УЗИ-картнны кожи

Средняя эпидермо-дермальная толщина, мм Интенсивность (плотность) дермальных структур, %

До курса После курса До курса После курса

Группа 1 2,1±0,1 2,33±0,16 4,3±0,35 5,7±0,5

Группа 2 1,65+0,3 1,9±0,14 4,0±0,45 5,7±0,25

Группа 3 1,56±0,21 1,7±0,21 3,6±0,22 4,7±0,3

А) Б)

Рис.6 Пациентка М.. 60 лет - динамика УЗ-картины кожи:

А - до проведения курса терапии препаратом модифицированной ГК;

Б - после курса терапии препаратом модифицированной ГК.

При оценке рельефа кожи методом визиосканирования положительная динамика отмечена по всем исследуемым показателям. Наилучшие показатели после курса терапии были получены в 1 группе, где пациентки имели изначально менее выраженные изменения по сравнению с другими группами. Во 2 группе также отмечалась положительная динамика показателей, в результате они приближались к средним значениям параметров микрорельефа 1 группы. В 3

группе терапия также привела к улучшению микрорельефа кожи, при этом наилучшие результаты среди всех исследованных показателей были получены при тестировании параметра «гладкость». Он возрос на 81% по отношению к начальному значению (р<0,05) и приблизился к значениям «гладкости» у 1 группы пациентов, что явилось следствием высокой увлажняющей способности препарата модифицированной ГК.

Исследование конфокальной лазерной сканирующей микроскопии КЛСМ выявило основные КЛСМ-признаки инволюционных изменений кожи. На уровне рогового слоя у всех пациентов определялись наряду с характерными безъядерными полигональными клетками высокорефрактерные включения белого цвета (чешуйки), количество которых соответствовало степени выраженности ксероза кожи, отмечалось уменьшение высоты сосочкового слоя дермы. У пациентов старшего возраста в ходе визуализации структур кожи на уровне верхних слоев дермы отмечалось фиксация сосочковых капилляров в меньшем количестве, чем у более молодых исследуемых. На более глубоких слоях дермы встречались участки с перекрещивающимися нитевидными структурами неодинаковой толщины с различной степенью архитектурного хаоса, что отражает выраженность деградации межклеточного каркаса дермы.

Общая тенденция КЛСМ - картины кожи после 3 процедур введения модифицированной ГК сводилась к общему улучшению степени рефрактерности слоев, т.е. улучшению оптических свойств ткани, что было обусловлено восстановлением уровня гидратации и оптимизацией механизмов гидрорезерва тканей.

В 1 группе по данным КЛСМ отмечалось полное нивелирование проявлений ксероза (уменьшение вплоть до полного исчезновения белых ярко окрашенных полигональных структур на поверхности рогового слоя - чешуек). Архитектоника дермального слоя кожи не претерпевала значительных изменений, что укладывается в возрастные морфологические особенности возрастных изменений в данной группе.

Во 2 группе, где изначально отмечались более выраженные проявления сухости кожи, большая степень рефрактерности структур на всех уровнях сканирования, структура эпидермиса, клеточное строение каждого слоя по данным КЛСМ после курса терапии сохраняли свои морфологические особенности без тенденции к каким-либо изменениям, что говорит о безопасности проводимой методики.

В 3 группе после введения модифицированной ГК значительно уменьшились явления ксероза поверхностных слоев кожи. У этой группы отмечались наибольшие проявления компенсации имеющегося ксероза кожи, как наиболее выраженного симптомокомплекса среди всех наблюдаемых пациенток. На уровне дермы отмечалось улучшение качественных характеристик сетчатой структуры: волокна имели более упорядоченное расположение с тенденцией к более равномерной структуре.

Для объективной оценки данных КЛСМ - сканирования были изучены параметры средней толщины эпидермиса, тк они косвенно отражают состояние гидрорезерва и метаболической активности более глубоких слоев кожи (таблица 5).

Таблица 5

Динамика показателя средней толщины эпидермиса при КЛСМ-исследовании кожи.

Средняя толщина эпидермиса, мкм

До курса После курса

Группа 1 83,52±3,4 88,5±4,3

Группа 2 74,3±5,7 79,7±3,8

Группа 3 64,5±4,6 72,1±3,5

После проведенной терапии отмечалось улучшение изучаемого параметра во всех 3 группах наблюдения.

Таким образом, проведенные экспериментальные и клинические исследования показали безопасность и хорошую переносимость препаратов модифицированной ГК. Показана стимуляция регенерации кожи при введении гелей лабораторным животным и хорошая клиническая эффективность при коррекции возрастных изменений кожи у пациентов разных возрастных групп. Предложенная методика может быть рекомендована для курсовой anti-age -терапии с коррекцией длительности и количества сеансов для различной степени инволюционных изменений кожи. Выводы

1 .Установлено, что при подкожном введении гидрогели немодифицированной (нативной) ГК подвергались ферментативному лизису и макрофагальной резорбции к 3 суткам, в то время как гели модифицированной витамином «С», аминокислотами, олигопептидами и фолиевой кислотой ГК - к 14 суткам после инъекции. Образования соединительнотканной капсулы вокруг имплантата на всех сроках эксперимента не

было, в отличие от гидрогелей ГК, модифицированных диглицидиловых эфиров (ДЭ) диолами. Внутрикожное введение гидрогелей модифицированной ГК, приводило к выраженной пролиферации фибробластов и неоангиогенезу, что, по данным гистохимии и электронной микроскопии, сопровождалось повышением синтеза и фибриллогенеза коллагеновых и эластических волокон.

2. Результаты клинических исследований показали хороший клинический эффект, безопасность и хорошую переносимость ГК, модифицированной витамином «С» с комплексом аминокислот. 100% испытуемых с инволюционными изменениями кожи и ее придатков субъективно отметили значительный положительный эффект: уменьшение выраженности мимических и статических морщин, улучшение цвета кожи, повышение ее тонуса и увлажненности. Нежелательные явления и осложнения отсутствовали.

3. Установлено, что при применении модифицированной ГК происходили нормализация жирности и показателя pH кожи, достоверное повышение эластичности и увлажненности кожи. Максимальные изменения показателей наблюдались у пациенток старшего возраста, у которых жирность кожи повысилась на 46%, эластичность в 1,3 раза, а увлажненность на 87%.

4. Установлено положительное влияние предложенной методики на структурные компоненты кожи, что подтверждалось данными УЗ-сканирования, визиосканирования и конфокальной лазерной сканирующей микроскопии. Отмечено увеличение толщины эпидермиса, эпидермо-дермапьного соединения и сосочкового слоя дермы, что привело к улучшению микрорельефа кожи во всех возрастных группах. У пациенток старшей возрастной группы наблюдались самые существенные изменения микрорельефа и микроструктуры кожи: параметр «гладкость» кожи возрос на 81% по отношению к начальному значению (р<0,05), эластиновые и коллагеновые волокна имели более упорядоченное расположение и более равномерную структуру, чем до курса процедур.

Практические рекомендации.

Предложенная методика может быть рекомендована для обязательного включения в программы anti-age -терапии для пациентов с инволютивными изменениями кожи разной степени выраженности. Пациенткам старшей возрастной группы (в возрасте 56-62 года, с преобладанием признаков III типа старения по Глогау) и пациенткам средней возрастной группы (41-55 лет, II тип старения по Глогау) с признаками преждевременного старения кожи необходима индивидуальная коррекция курса в сторону увеличения количества процедур, что позволит улучшить морфофункциональные показатели кожи у этих пациенток до физиологической нормы.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Хабаров В.Н., Селянин М.А., Михайлова Н.П., Зеленецкий А.Н. Биоактивные композиции на основе модифицированной гиалуроновой кислоты.//Вестник Эстетической Медицины. - 2009.- том 8 - №1.- С. 14-18.

2. Хабаров В.Н., Бойков П.Я., Чижова H.A., Селянин М.А., Михайлова Н.П. Значение параметра молекулярной массы гиалуроновой кислоты в препаратах для эстетической медицины.// Вестник Эстетической Медицины. - 2009. - том 8 - №4. - С. 20-24.

3. Михайлова Н.П. Гиалуроновая кислота в эстетической медицине.// Мезотерапия. - 2009. - № 8. - С. 12-18.

4. Хабаров В.Н., Бойков П.Я., Чижова H.A., Селянин М.А., Михайлова Н.П. Сравнительный анализ молекулярно-массового распределения коммерческих образцов гиалуроновой кислоты.// Мезотерапия. - 2009. -№8.-С. 18-24.

5. Хабаров В.Н., Михайлова Н.П. Твердофазная модификация гиалуроновой кислоты - способ создания новых препаратов для биоревитализации.// Эстетика в медицине. - 2009 - №4 - С.60-64.

6. Хабаров В.Н., Михайлова Н.П., Селянин М.А. Биорепаранты - новый класс инъекционных препаратов.//Эстетическая медицина. - 2010.- том IX - №2 - С. 3-12.

7. Михайлова Н.П. Новые препараты в мезотерапии. Биорепаранты в косметологии — эволюция или революция?// Вестник дерматологии и венерологии. - 2010. - № 6. - С 141-146.

8. Хабаров В.Н., Селянин М.А., Михайлова Н.П. Инновационные технологии в инъекционной косметологии, с точки зрения биоорганической химии: линия «Гиалрипайер».// Вестник Эстетической Медицины, - 2010,- том 9. - №2. - С. 69-77.

9. Хабаров В.Н., Михайлова Н.П., Селянин М.А. Изучение антиоксидантных свойств гиалуроновой кислоты, глутатиона, цистеина, метионина и производных аскорбиновой кислоты, использующихся в препаратах для мезотерапии.// Мезотерапия. - 2010. - №9/01. - С. 6-14.

10. Михайлова Н.П. Антиоксиданты в мезотерапии.// Мезотерапия. -2010. - №9/01,- С. 14-22.

11. Михайлова Н.П. Коррекция признаков фотостарения кожи у пациентов возрастной группы 35-45 лет.// Мезотерапия. - 2010. - №10/02. - С. 5662.

12. Михайлова Н.П., Варваричева О.С. Процедура биорепарации для зоны «лицо-шея-декольте».// Мезотерапия. - 2010. - №12/04. - С. 68-72.

13. Михайлова Н.П. Коррекция возрастных изменений лица у пациенток с избыточными жировыми отложениями в субмандибулярной зоне и птозом нижней трети лица.// Вестник дерматологии и венерологии. - 2011. - № 1. - С 105-112.

14. Михайлова Н.П., Фролова О.В. Применение гиалуроновой кислоты в мезотерапевтических коктейлях.//Мезотерапия. — 2012. - №18/02. - С. 48-56.

15. Михайлова Н.П., Селянин М.А. Все, что вы хотели знать о биорепарантах.// Мезотерапия. - 2012. - №19/03. - С. 6-14.

16. Базарный В.В., Михайлова Н.П., Кочурова И.В., Исайкин А.И. Оценка влияния гиалуроновой кислоты на состояние гуморального иммунитета.// Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2012. - №2. - С.18.

17. Михайлова Н.П., Хабаров В.Н. Гиалуроновая кислота. Применение в косметологии и медицине.// Изд-во: LAMBERT Academic Pubkishing, Saarbrucken, Германия, 2012. - 165 с.

18. Koryakin S.N., Yadrovskaya V.A., Ulyanenko S.E., Isaeva E.V., Beketov E.E., Ivanov P.L., Zelenetskii A.N., Khabarov V.N., Michailova N.P., Selyanin M.A. The study of hyaluronic acid-based boron compound distribution in tumor and surrounding tissues of mice with melanoma B-16 depending on methods of administration.// Abstracts 15th International congress on neutron capture therapy. 10-14 September, 2012. Tsukuba, Japan - p.83.

19. Ulyanenko S.E., Yadrovskaya V.A., Koryakin S.N., Isaeva E.V., Beketov E.E., Ivanov P.L., Zelenetskii A.N., Khabarov V.N., Michailova N.P., Selyanin M.A. Modeling of new hyaluronic acid and boron-10 based compounds distribution in organism of mice with melanoma B-16 in vivo.//

Abstracts 15th International congress on neutron capture therapy. 10-14 September, 2012. Tsukuba, Japan - p.82.

20. Михайлова Н.П. Гиалуроновая кислота в эстетической медицине: зависимость свойств препаратов от методов модификации. Возможности и клинические эффекты препаратов на основе модифицированной гиалуроновой кислоты.// [Тезисы докладов] II Московский форум «Дерматовенерология и косметология: синтез науки и практики». 17-19 октября 2012, Москва. - С. 36.

21. Михайлова Н.П. Клиническая оценка влияния интрадермального введения модифицированной гиалуроновой кислоты на морфофункциональное состояние кожи пациенток с возрастными изменениями.// Мезотерапия. - 2013. - №23/03. - С. 6-14.

22. Михайлова Н.П. Влияние интрадермального введения модифицированной гиалуроновой кислоты на морфофункциональное состояние кожи у пациенток с инволюционными изменениями.// Вестник дерматологии и венерологии. — 2013. - № 5. - С. 152-159.

23. Михайлова Н.П., Шехтер А.Б., Руденко Т.Г. Морфологическое исследование результатов подкожного введения гелей немодифицированной и модифицированной гиалуроновой кислоты.// Мезотерапия. - 2013. - №24/04. - С.6-16.

24. Михайлова Н.П. Биорепаранты - новый класс препаратов на основе гиалуроновой кислоты, модифицированной низкомолекулярными соединениями.// Инъекционные методы в косметологии. - 2013. - №4. -С.36-47.

25. Михайлова Н.П. Клинико-экспериментальное исследование интрадермального введения модифицированной гиалуроновой кислоты.// Инъекционные методы в косметологии. - 2014. - №1. — С.27-39.

26. Михайлова Н.П. Клинико-экспериментальное изучение морфо-функционального состояния кожи с инволюционными изменениями при введении модифицированной гиалуроновой кислоты.// Клиническая дерматология и венерология. - 2014. - №2. - С.14-21.

Заказ № 85-Р/11/2014 Подписано в печать 2411.14 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,2

ООО "Цифровичок", г. Москва, Большой Чудов пер., д.5

тел. (495)649-83-30 V V"' У www.cfr.ru ; e-mail: zakpark@cfr.ru