Автореферат и диссертация по медицине (14.00.39) на тему:Клинико-диагностическое значение определения антител к ферментам гуаниновой ветви пуринового метаболизма у больных ревматоидным артритом с использованием иммобилизированной формы магнитоуправляемого сорбента

На правах рукописи

КОТЕЛЬНИКОВА Ольга Викторовна

КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ФЕРМЕНТАМ ГУАНИНОВОЙ ВЕТВИ ПУРИНОВОГО МЕТАБОЛИЗМА У БОЛЬНЫХ РЕВМАТОИДНЫМ АРТРИТОМ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ИММОБИЛИЗИРОВАННОЙ ФОРМЫ МАГНИТОУПРАВЛЯЕМОГО СОРБЕНТА

14.00.39 - ревматология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Волгоград - 2007

003163462

Работа выполнена в ГУ НИИ клинической и экспериментальной ревматологии РАМН и ГОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет Росздрава»

Научный руководитель:

доктор медицинских наук,

профессор ЗБОРОВСКАЯ Ирина Александровна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук,

профессор ЧИЖОВ Петр Александрович

доктор медицинских наук,

профессор КУЛИЧЕНКО Людмила Леонидовна Ведущая организация:

ГОУ ВПО «Российский государственный медицинский университет Росздрава»

Защита состоится «_» ____ 2008 г в __ часов на заседании

Диссертационного совета Д 208 008 02 при ГОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет Росздрава» по адресу 400131, г Волгоград, пл Павших борцов, 1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет Росздрава»

Автореферат разослан «_» декабря 2007 г

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 208 008 02 доктор медицинских наук, профессор

А Р Бабаева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Ревматические заболевания (РЗ) занимают важное место в структуре заболеваемости населения и имеют огромное социально-экономическое значение Среди регистрируемых нозологических форм РЗ в 2005 году в России показатель заболеваемости ревматоидным артритом (РА) у взрослых составил 240 на 100 000 человек (Насонов Е Л , 2007) Более половины пациентов с РА стойко теряют трудоспособность уже через 7-10 лет от начала заболевания Весьма тревожным является то обстоятельство, что инвалидизация наступает быстро и практически не оставляет шансов на возвращение к трудовой деятельности

Хроническое прогрессирующее течение РА ставит перед врачами задачу возможно более ранней его диагностики Однако распознавание РА на ранней стадии представляет значительные трудности По настоящее время не найдено строго специфичного для РА лабораторного теста Только сочетание многих клинических и лабораторных признаков может оказать помощь в диагностике этого заболевания Поэтому и сейчас продолжается поиск методов, позволяющих дифференцировать ревматоидный артрит среди множества воспалительных и дегенеративных болезней опорно-двигательного аппарата

По современным представлениям поражение соединительной ткани при РА является следствием развивающихся иммунопатологических нарушений Об аутоиммунной природе РА свидетельствует ряд признаков выявление ревматоидного фактора (РФ), циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК), сенсибилизированных к компонентам соединительной ткани лимфоцитов, а также широкого спектра аутоантител (Ат), в том числе и к различным ферментам Однако следует отметить, что патологическое действие подобных антител до конца не определено

В настоящий момент возрос интерес к изучению метаболизма пури-новых соединений в норме и при патологии, что связано не только со значением данного цикла в обмене нуклеиновых кислот, но и с той важной биологической ролью, которую выполняют его отдельные, составные части ферменты и промежуточные субстраты С активностью ряда ферментов гуаниновой ветви обмена пуриновых производных связаны процессы созревания Т-клеток и развитие Т-клеточного иммунитета в организме, процессы деградации пуринового нуклеозида - гуанозина, обладающего выраженными регуляторной и физиологической активностями

Согласно данным ряда авторов (Черных ТП, 2001, Заводовский Б В , 2004, Мартемьянов В Ф , 2006) у больных РА наблюдается существенные изменения активности ряда ферментов пуринового метаболизма в Л сыворотке крови, которые коррелируют со степенью активности патоло- [

гического процесса Учитывая характерные иммунологические нарушения при аутоиммунных заболеваниях, можно предположить, что изменение энзиматической активности ряда ферментов пуринового метаболизма может быть связано с гиперпродукцией аутоантител к ним

До настоящего времени в литературе имеются сведения только по изучению аутоантител к энзимам адениловой ветви пуринового обмена, в частности - аденозиндезаминазе, при некоторых ревматических заболеваниях (Lee J Y , 2002, Негметзянова, 2006) В то же время процессам ауто-антителообразования к ферментам других метаболических цепочек пуринов гуаниновой и инозиновой, имеющих, вероятно, не меньшее значение при РЗ, практически остается не изученной В связи с этим комплексное исследование у больных РА антител к основному энзиму гуаниновой ветви ПМ - гуаниндезаминазе (ГДА), так же антител к 5'-нуклеотидазе (5'-НТ) и пуриннуклеозидфосфорилазе (ПНФ), принимающих участие в распаде гуанозина, представляет собой актуальную задачу

Цель исследования Целью настоящего исследования является усовершенствование иммунологической диагностики, дифференциальной диагностики и объективизация контроля эффективности проводимой терапии у больных ревматоидным артритом путем исследования антителообразования к гуаниндезаминазе, 5'-нуклеотидазе и пуриннуклеозидфосфорилазе с использованием иммобилизированной формы магнитоуправляемого сорбента

Основные задачи исследования

1 Получить иммобилизированные формы ГДА, 5'-НТ и ПНФ, изучить их физико-химические свойства

2 Адаптировать иммуноферментный метод анализа с использованием ГДА, 5-НТ и ПНФ в качестве антигенной матрицы к изучению образования антител к этим ферментам

3 Изучить содержание антител к ГДА, 5'-НТ и ПНФ в сыворотке крови больных РА в зависимости от активности, стадии и характера течения заболевания

4 Изучить энзиматическую активность ГДА, 5-НТ и ПНФ и содержание антител к ним в сыворотке крови больных РА в зависимости от формы и клинических особенностей заболевания

5 На основе иммуноанализа изучить динамику антителообразования к ГДА, 5'-НТ и ПНФ у больных РА в процессе стационарного лечения, оценить возможность использования антител к данным ферментам в качестве объективных критериев эффективности проводимой терапии

Научная новизна исследования

Впервые для иммунодиагностики РА разработаны и применены в предложенном варианте иммуноферментного анализа методы с использованием иммобилизированных форм ГДА, 5-НТ и ПНФ, подобраны оптимальные условия их постановки В сыворотках крови больных РА обнаружены антитела к ГДА, 5'-НТ и ПНФ Показано, что их уровень достоверно отличается от содержания данных антител в сыворотке крови здоровых лиц и больных остеоартрозом

Выявлено, что концентрация антител к ГДА, 5'-НТ и ПНФ у больных РА коррелирует с активностью патологического процесса, а наличие висцеральных проявлений сопровождается максимальными значениями исследуемых аутоантител Динамика уровней Ат к ГДА, 5'-НТ и ПНФ позволяет прогнозировать клиническое течение РА и судить об эффективности проводимой терапии

Практическая ценность

Разработана доступная для применения в клинических лабораториях методика иммуноферментного определения уровня антител к ГДА, 5'-НТ и ПНФ на основе иммобилизированной формы магнитоуправляемого сорбента Выявление антител к ГДА, 5'-НТ и ПНФ в предложенной модификации ИФА может быть использовано в качестве дополнительных тестов в комплексной диагностике РА для характеристики активности патологического процесса, особенно на ранних стадиях заболевания, и прогнозирования клинических форм РА Определение антител к ГДА, 5'-НТ и ПНФ в динамике дает возможность судить об эффективности и адекватности проводимой терапии

Основные положения, выносимые на защиту

На защиту выносится положение о возможности использования определения антител к гуаниндезаминазе, 5'-нуклеотидазе и пуриннуклео-зидфосфорилазе иммуноферментным методом с помощью иммобилизированной формы магнитоуправляемого сорбента в качестве дополнительных тестов для диагностики степени активности, характера течения, формы, серологического варианта РА, оценки эффективности проводимой терапии

Внедрение в практику

Методы определения антител к ГДА, 5'-НТ и ПНФ у больных РА иммуноферментным методом с помощью иммобилизированной формы магнитоуправляемого сорбента внедрены в практику работы муниципального учреждения здравоохранения «Городская клиническая больница № 25» г Волгограда, государственного учреждения здравоохранения «Волгоградский областной клинический госпиталь ветеранов войн», му-

ниципального учреждения здравоохранения «Городская больница №1 им С 3 Фишера» г Волжского

Публикации и апробация диссертации По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, из которых 5 - в центральной, 6 - в местной, 1 - в зарубежной печати Материалы диссертации были представлены на ежегодных научно-практических конференциях Волгоградского государственного медицинского университета (2006, 2007 гг ), научных конференциях ГУ НИИ КиЭР РАМН (2006, 2007 гг), на конгрессе EULAR (Амстердам, Нидерланды, 2006 г), I Национальном конгрессе терапевтов (Москва, 2006), II Международной Пироговской научной медицинской конференции (Москва, 2007), XIV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2007), VIII Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы клиники, диагностики и лечения больных в многопрофильном лечебном учреждении» (Санкт-Петербург, 2007), XII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2007), научно-практической конференции «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины - 2007» (Санкт-Петербург, 2007)

Результаты диссертации были апробированы на совместном заседании Ученого Совета ГУ НИИ клинической и экспериментальной ревматологии РАМН и кафедры госпитальной терапии ГОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» 5 декабря 2007 года (Протокол №8).

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 170 страницах машинописного текста и состоит из введения, 8 глав, обсуждения результатов, выводов и практических рекомендаций Диссертация иллюстрирована 27 таблицами, 18 рисунками, 3 выписками из истории болезни Указатель литературы содержит 206 источников, в том числе 72 отечественных и 134 иностранных

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Под наблюдением находились 183 человека, из которых 89 больных с достоверным РА по критериям Американской коллегии ревматологов, 48 - ОА и 30 практически здоровых людей в возрасте от 24 до 46 лет (19 женщин и 11 мужчин) - доноров станции переливания крови, прошедших обычное обследование

Больные ревматоидным артритом

Под наблюдением находились 89 больных РА, из которых 63 (70,8%) женщин и 26 (29,2%) мужчин. Средний возраст больных - 48,9 ± 13,2 года. Средняя продолжительность РА составила 11,14 + 2,33 года.

Степень активности патологического процесса определялась в соответствии с диагностическими критериями и рабочей классификацией РА, на основании которых 1-ая (минимальная) степень выявлена у 17 (19,1%), 11-ая (умеренная) - у 64 (71,9%) и Ш-я (максимальная) - у 8 (9%) больных.

Медленно прогрессирующий характер течения (МПТ) патологического процесса отмечен у 56 (62,92%), быстро прогрессирующий (БПТ) -у 33 (37,08%) больных РА. На основании результатов проведенного комплексного клинико-инструментального и иммуно-биохимического обследования больных РА внесуставные проявления выявлены у 34 (38,2%) пациентов. Следует отметить, что преимущественно наблюдалось комплексное поражения нескольких органов и систем, а внесуставные проявления РА расценивались, в основном, как результат прогрессирования основного заболевания с поражением соединительно-тканных структур различных органов.

На основании критериев Штейнброкера установлены следующие рентгенологические стадии поражения суставов: 1-ая стадия - у 9 (10,11%), П-ая - у 52 (58,43%), Ш-я - у 24 (26,97%) и 1У-я - у 4 (4,49%) больных РА. Прогрессирование деструктивно-воспалительных изменений в пораженных суставах наблюдалось при увеличении продолжительности заболевания (см. рисунок 1).

< 5 лет 6-10 лет 11 -15 лет 16-20 лет > 20 лет ЕЗ Стадия I № Стадия II 0 Стадия III С2 Стадия IV

Рисунок I. Соотношение стадии поражения суставов с продолжительностью ревматоидного артрита

По степени функциональной недостаточности суставов распределение больных было следующим 1 функциональный класс (ФК) установлен у 4 (4,5%), Н-ой ФК - у 33 (37,1%), Ш-й ФК - у 48 (53,9%), 1У-й ФК - у 4 (4,5%) больных РА

У большинства больных (91,01%) выявлялся полиартрит У 65 (73,03%) больных в крови методом латекс-агглютинации был обнаружен ревматоидный фактор (РФ) класса ^М

Комплексное лечение больных РА (НПВП, ГК, препаратами базисной и симптоматической терапии, локальная терапия, ФТЛ, ЛФК) проводилось по общепринятым схемам с учетом клинических особенностей заболевания С целью изучения влияния различных видов проводимой в условиях стационара терапии были подобраны четыре группы больных со И степенью активности РА и сопоставимыми клинико-лабораторными данными, которым проводилось следующее лечение I группа - изолированное применение НПВП (9 человек), II группа - НПВП в сочетании с местным (внутрисуставно, периартикулярно) введением ГК (22 человека), III группа - НПВП в сочетании с системным (5-15 мг/с) введением ГК (18 человек), IV группа - НПВП и ГК в комбинации с БПВП (метотрексат, лефлуномид, гидроксихлорохин, сульфасалазини др ) (15 человек)

Больные остеоартрозом Под наблюдением находились 48 больных ОА, из которых 18 (37,5%) мужчин и 30 (62,5%) женщин Средний возраст больных -52,9+1,39 (ББ 9,64) лет Наиболее многочисленной являлась группа больных ОА в возрастном интервале от 41 до 60 лет (женщины - 65%, мужчины - 35%), лица трудоспособного возраста составили 44% Четверо больных ОА (8%) имели инвалидность по основному заболеванию Средняя продолжительность заболевания составила 10,3±3,2 лет По данным рентгенологического метода обследования 1-ая стадия поражения суставов установлена у 18 (38%), Н-ая - у 26 (54%) и Ш-я - у 4 (8%) больных ОА.

Соотношение продолжительности заболевания и стадий поражения суставов наглядно демонстрирует утверждение, что чем продолжительнее заболевание, тем тяжелее стадия поражения суставов (см таблицу 1)

Таблица 1

Стадии поражения суставов и продолжительность заболевания

Стадия Количество Продолжительность заболевания

поражения больных < 5 лет 6-10 лет 11-15 лет > 15 лет

I 18 10(56%) 8 (44%) - -

II 26 2 (8%) 8(31%) 12(46%) 4(15%)

III 4 - - 1 (25%) 3 (75%)

Всего 48 12(25%) 16(33%) 13 (27%) 7(15%)

По степени функциональной недостаточности суставов больные распределены следующим образом ФНС-0 - 7 (15%), ФНС-1 - 34 (70%), ФНС-2 - 7 (15%) больных Нарушение функциональных возможностей суставов во многом связано с наличием синовита, явления которого выявлены у 27 (56%) больных ОА Олиго- и моноартроз выявлены у 11 (23%) больных, полиостеоартроз - у 37 (77%) Узелковая форма ОА обнаружена у 12 (25%), безузелковая - у 36 (75%) Явления остеохондроза обнаружены у 13 (27%) больных Наиболее часто поражаются коленные (83%), тазобедренные суставы (42%) и суставы кистей (73%)

В качестве антигенов использовались коммерческие препараты исследуемых ферментов производства фирмы «Sigma» (США)

1 Препарат 5'-нуклеотидазы (ЕС 3 13 5) из яда гремучей змеи (5-Nucleotidase from Crotalus atrox venom, Cat № N5880),

2 Препарат пуриннуклеозидфосфорилазы (ЕС 2.4 2.1) из крови человека (Nucleoside Phosphorylase from human blood, Cat № N3514),

3 Препарат гуаниндезаминазы (ЕС 3 5 4 3) из печени кролика (Guanase from rabbit liver, Cat № G5752)

Ат к 5'-HT, ПНФ и ГДА определялись иммуноферментным методом при иммобилизации антигена на микротитрационных полистироловых планшетах Immulon 2 (Dynatech Labs) и с использованием иммобилизиро-ванной формы магнитоуправляемых сорбентов (MC) Иммобилизацию 5'-НТ, ПНФ и ГДА проводили методом эмульсионной полимеризации в потоке газообразного азота с включением магнитного материала в структуру полиакриламидного геля по методике И П Гонтаря с соавт (1991)

Результаты учитывали на многоканальном спектрофотометре АС-8К при длине волны 450 нм, полученные значения выражали в условных единицах оптической плотности (е о п) Наличие антител считалось положительным при превышении значений оптической плотности на 3 средних квадратических отклонения от значений контрольной группы

Активность 5'-НТ в сыворотке крови определялась по методике Wood R, Williams D (1981), активность ПНФ - по методике Robertson ВС и Hoffe РА (1973), активность гуанивдезаминазы - по методике CarawayWT (1966) Указанные исследования проводились унифицированными методами в биохимической лаборатории (заведующий - профессор, д м н Мартемьянов В Ф ), иммунологические пробы, позволяющих охарактеризовать иммунный статус больных РА, - в лаборатории клинической иммунологии (заведующий - профессор, д м н Гонтарь И П ) ГУ НИИ клинической и экспериментальной ревматологии РАМН

Эффективность лечения больных оценивалась с помощью одинаковых клинико-лабораторных и иммунобиохимических показателей

Статистический анализ экспериментальных данных выполнялся с помощью программного пакета «STATISTICA 6 0 FOR WINDOWS» (StatSoft Inc, USA), а также «SPSS 10 0 FOR WINDOWS» и по оригинальным программам с использованием формул, приведенных в соответствующих руководствах Представление описательных статистик и выбор статистических критериев производились исходя из цели исследования, решаемых при этом задач и рекомендаций руководств по биостатистике Достоверными считались результаты при уровне р<0,05

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Изучение влияния специфических иммуноглобулинов на ферментативную активность 5'-НТ, ПНФ и ГДА

Источником специфических иммуноглобулинов служили сыворотки больных РА с заранее определенными высокими титрами антител (экс-тинкция >0,16еоп)к 5'-НТ, ПНФ и ГДА В качестве контроля применяли растворы 5'-НТ, ПНФ и ГДА в физиологическом растворе (п=30, для каждого фермента) и сыворотки практически здоровых людей (п=30)

После взаимодействия каждого фермента с соответствующими чистыми антителами было выявлено снижение ферментативной активности 5'-НТ, ПНФ и ГДА различной степени выраженности (см таблицу 2)

Таблица 2

Сравнительная характеристика активности растворимой и иммобилизи-рованной форм 5-НТ, ПНФ и ГДА после взаимодействия с антителами

Фермент Форма фермента Исходная активность фермента Активность фермента после взаимодействия

с физиол раствором с сывороткой доноров с чистыми Ат

5'-НТ (Ед/л) Растворимая 41,85 ±5,44 42,64 ± 5,61 35,58 ±4,12 26,96 ±3,18

Иммобили-зированная 38,69 ±4,12 39,26 ±4,89 30,62 ± 3,04 19,22 ±2,79

ПНФ (мкмоль/л/ мин) Растворимая 22,14 + 2,71 21,49 ±2,93 18,56 ±2,66 12,82 ±2,78

Иммобили-зированная 20,99 ±2,82 20,68 ±3,12 16,44 ±2,11 10,38 ±2,07

ГДА (МЕ/л) Растворимая 28,17 ±3,46 27,51 ±3,94 16,52 ±2,46 12,62 + 1,02

Иммобили-зированная 27,55 ±3,67 27,68 ±4,01 10,38 ± 1,86 2,28 ±0,17

Следует отметить, что изменение ферментативной активности изучаемых энзимов было различным при использовании растворимой и им-мобилизированной форм ферментов Так, например, активность растворимой формы 5'-НТ после взаимодействия со специфическими («чистыми») Ат снизилась менее, чем на 40%, различия с контрольной группой (физ р-р) и донорами достоверны (р=0,008 и р=0,046, соответственно)

Уменьшение активности иммобилизированной формы 5'-НТ по сравнению с исходными значениями произошло почти в 2 раза; выявлены статистически достоверные различия с физ. р-ром (р=0,0007) и донорами (р=0,0077) (см. табл. 2). Сходная картина наблюдалась и при изучении влияния специфических Ат на активность растворимой (достоверные различия с физ. раствором, р=0,036 и недостоверные с донорами, р=0,141) и иммобилизированной форм ПНФ (достоверные различия с физ. р-ром, р=0,007 и донорами, р=0,045). Ферментативная активность иммобиллизи-рованной ГДА практически полностью ингибировалась специфическими антителами (р<0,0001), в отличие от растворимой формы фермента, при использовании которой,хотя и наблюдалось снижение активности, но не столь существенное (р<0,0012).

Включение фермента в пространственную решетку полиакриламид-ного геля (иммобилизированная форма) придает антигену (5'-НТ, ПНФ, ГДА) новые свойства, благодаря которым он приобретает определенные преимущества перед растворимой формой. Такой метод приводит к возникновению незначительных конформационных изменений, сохраняющих активность фермента, но, в то же время, способствующих, например, экспрессии гидрофобных участков молекулы энзима, содержащих «скрытые эпитопы».

0,14 0,12 0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 0

Ат к 5-НТ Ат к ПНФ Ат к ГДА

□ До сорбции Ш После сорбции

Рисунок 2. Содержание антител к 5'-НТ, ПНФ, ГДА в сыворотке крови больных РА после взаимодействия со специфическим МС

Параллельно в иммуноферментном методе были исследованы сыворотки крови больных РА (п=30 для каждой серии опытов) на наличие антител к 5-НТ, ПНФ, ГДА после взаимодействия со специфическим маг-нитоуправляемым сорбентом, в результате которого исходная концентрация антител к 5'-НТ и ПНФ уменьшилась в 2,7 — 2,8 раза, а уровень АТ к ГДА снизился почти в 3,5 раза (см. рисунок 2).

Полученные результаты демонстрируют в основном ингибирующее влияние специфических иммуноглобулинов на ферментативную активность изучаемых энзимов Тем не менее, антиферментные Ат, как правило, специфичны не по отношению к активному центру энзима, а по отношению к белку в целом Если антигенные детерминанты фермента расположены вне его активного центра, то последний и в фермент-антиферментном комплексе может оставаться доступным для субстрата (5'-НТ и ПНФ) В случае, когда участки фермента, от которых зависят его антигенные свойства, частично захватывают и область активного центра (ГДА), антифермент может выступать в качестве ингибитора, конкурирующего с субстратом

Содержание антител к 5'-НТ, ПНФ и ГДА в контрольных группах и у больных РА

Здоровые лица. Содержание Ат к 5'-НТ, ПНФ и ГДА определялось в сыворотке 30 практически здоровых людей Установив среднюю концентрацию антител к изучаемым ферментам в донорских сыворотках (для 5'-НТ - 0,027±0,003 е о п , для ПНФ - 0,032±0,004 е о п , для ГДА -0,023±0,003 е о п ), вычислили уровень нормальных показателей оптической плотности (М ± За) Таким образом, значения оптической плотности 0,08 е.о.п для 5'-НТ, 0,097 еоп для ПНФ и 0,072 еоп для ГДА (в ЕЫ8А-тесте с использованием МС) были приняты за верхнюю границу нормы (показатели, превышающие эти значения, считались положительными по соответствующим антителам) Проведенные исследования существенных различий в содержании антител к 5'-НТ, ПНФ и ГДА в зависимости от пола и возраста не выявили

Больные остеоартрозом. Под наблюдением находились 48 больных ОА Повышенный уровень антител к 5'-НТ отмечался у 16,67% больных ОА (8 человек), к ПНФ - у 18,75% больных ОА (9 человек), к ГДА -у 8,33% больных ОА (4 человека)

При поступлении на лечение больных ОА (группа в целом) по сравнению со здоровыми лицами отмечен рост уровней Ат к 5'-НТ (р<0,05) и Ат к ПНФ (р<0,001), достоверно значимых различий в содержании антител к ГДА выявлено не было (р>0,05) (см таблицу 3) При выписке из стационара все изучаемые показатели практически не отличались от уровня здоровых лиц (р>0,05)

При изучении влияния формы ОА на содержание Ат к 5'-НТ, ПНФ и ГДА не было получено достоверных различий как в группе больных с узелковой формой ОА, так и в группе больных с безузелковой формой заболевания (р>0,05) (см таблицу 3) У больных ОА с полиостеоартро-зом по сравнению со здоровыми лицами отмечались достоверный рост уровней Ат к 5'-НТ (р<0,01) и ПНФ (р<0,001) и тенденция к росту уров-

ня Ат к ГДА (р>0,05), а по сравнению с моно- олигоартрозом достоверные изменения отмечены только по изменению уровня ПНФ (р<0,05)

Таблица 3

Содержание Ат к 5'-НТ, ПНФ и ГДА у больных ОА

Контингент N St Ат к 5'-НТ Ат к ПНФ Ат к ГДА

А Б А Б А Б

Здоровые 30 М а m 0,027 0,0164 0,003 0,032 0,0219 0,004 0,023 0,0164 0,003

Больные ОА (группа в целом) "48 М о m 0,051 0,048 0,007 0,038 0,035 0,005 0,061 0,042 0,006 0,042 0,035 0,005 0,033 0,028 0,004 0,029 0,028 0,004

Больные ОА, узелковая форма 12 М а ш 0,045 0,043 0,013 0,033 0,029 0,009 0,066 0,046 0,014 0,048 0,039 0,012 0,040 0,029 0,009 0,038 0,036 0,011

Больные ОА, безузелковая форма 36 М а т 0,052 0,048 0,008 0,039 0,036 0,006 0,058 0,042 0,007 0,043 0,030 0,005 0,031 0,030 0,005 0,026 0,024 0,004

Больные ОА, моно- и оли-гоартроз 11 М а m 0,041 0,038 0,012 0,037 0,034 0,011 0,039 0,032 0,010 0,034 0,032 0,010 0,030 0,028 0,009 0,036 0,034 0,011

Больные ОА, полиостеоар-троз 37 М сг ш 0,054 0,049 0,008 0,039 0,036 0,006 0,068 0,043 0,007 0,045 0,036 0,006 0,035 0,030 0,005 0,026 0,024 0,004

Продолжительность ОА < 5 лет 12 М а ш 0,046 0,036 0,011 0,028 0,026 0,008 0,067 0,049 0,015 0,044 0,039 0,012 0,031 0,029 0,009 0,035 0,033 0,010

Продолжительность ОА 6-15 лет 29 М а т 0,049 0,047 0,009 0,040 0,037 0,007 0,061 0,053 0,010 0,040 0,037 0,007 0,034 0,032 0,006 0,027 0,026 0,005

Продолжительность ОА > 15 лет 7 М о m 0,058 0,047 0,019 0,053 0,051 0,021 0,064 0,044 0,018 0,043 0,041 0,017 0,038 0,036 0,015 0,041 0,039 0,016

Примечание N - число наблюдений, St - статистические показатели,

А - до лечения, Б - после лечения Давность заболевания не оказывала какого-либо существенного влияния на результаты проведенных иммунологических тестов (см таблицу 3) при сравнении показателей содержания Ат к 5-НТ, ПНФ и ГДА между группами больных с различной продолжительностью ОА достоверных изменений обнаружено не было (р>0,05) Статистически достоверной зависимости в содержании всех изучаемых антител у больных ОА

с наличием или отсутствием явлений синовита также не выявлено (р>0,05)

Больные ревматоидным артритом

Под наблюдением находились 89 больных РА Количество больных РА с повышенным уровнем Ат к 5'-НТ составило 53,9% (48 человек), к ПНФ - 59,5% (53 человек), к ГДА - 44,9% (40 человек) Дескриптивные статистики исходных показателей уровня антител к 5'-НТ, ПНФ и ГДА представлены в таблице 4

Таблица 4

Уровни антител к 5'-НТ, ПНФ и ГДА у больных РА

Показатель М БО ГП 95% ДИ для М Ме Мо 1(311

Ат к 5'-НТ 0,123 0,051 0,0054 0,112 0,134 0,113 0,079 0,085

Ат к ПНФ 0,137 0,052 0,0055 0,126 0,148 0,136 0,078 0,089

АткГДА 0,075 0,029 0,003 0,069 0,081 0,067 Ми1пр1е 0,034

Примечание М - среднее значение, 5Ю - стандартное отклонение, ш -ошибка репрезентативности, ДИ - доверительные интервалы, Ме - медиана, Мо - мода, 1С>Я - межквартильный размах

При поступлении на лечение (см таблицу 5) по сравнению со здоровыми обнаружено увеличение содержания Ат к 5-НТ, ПНФ и ГДА (р< 0,0001) По окончании курса стационарного лечения, на фоне улучшения клинического состояния больных, содержание Ат к 5'-НТ и ПНФ существенно уменьшилось (р<0,001), но, тем не менее, оставалось выше показателей здоровых лиц (р<0,001) Также была отмечена тенденция к снижению уровня Ат к ГДА (р>0,05)

Таблица 5

Показатели Ат к 5'-НТ, ПНФ и ГДА у больных РА до и после лечения

Контингент N Ат к 5'-НТ Ат к ПНФ Ат к ГДА

А Б А Б А Б

Здоровые 30 М а ш 0,027 0,0164 0,003 0,032 0,0219 0,004 0,023 0,0164 0,003

Больные ОА (группа в целом) 48 М ст ш 0,051 0,048 0,007 0,038 0,035 0,005 0,061 0,042 0,006 0,042 0,035 0,005 0,033 0,028 0,004 0,029 0,028 0,004

Больные РА (группа в целом) 89 М су ш 0,123 0,051 0,005' 0,076 0,032 0,003 0,137 0,052 0,006 0,082 0,034 0,004 0,075 0,029 0,003 0,069 0,035 0,004

Примечание N - число наблюдений, Б! - статистические показатели, А - до лечения, Б - после лечения

У больных РА (группа в целом) был выявлен ряд статистически значимых корреляций уровней аутоантител к 5'-НТ, ПНФ и ГДА с клиническими и лабораторными показателями (см таблицу 6)

Таблица 6

Корреляции уровней антител к 5'-НТ, ПНФ и ГДА с клиническими и лабораторными показателями у больных РА

Показатель Ат к 5'-НТ Ат к ПНФ Ат к ГДА

г Р г Р г Р

Активность РА (индекс ОА828) 0,7614 * 0,000 0,6952 * 0,000 0,3075 * 0,003

Концентрация ^М 0,0914 0,394 0,1943 0,068 0,3696 * 0,000

Концентрация ^А 0,8081 * 0,000 0,4634 * 0,000 0,4139* 0,000

Геомет титр РФ 0,4396 * 0,000 0,7029 * 0,000 0,1577 0,139

соэ 0,2807 * 0,011 0,2537 * 0,022 0,0446 0,692

ЦИК 0,2651 * 0,012 0,4501 * 0,000 0,2076 0,051

Примечание звездочкой (*) отмечены корреляции с р<0,05

Клинико-лабораторное многообразие РА обусловили целесообразность более детального рассмотрения изучаемых показателей в зависимости от активности и характера течения ревматоидного процесса, а также наличия внесуставных проявлений

Содержание антител к 5'-НТ, ПНФ и ГДА у больных РА в зависимости от активности патологического процесса Учитывая, что активность РА оказывает значительное влияние на содержание Ат к 5'-НТ и ПНФ, нами также был проведен анализ зависимостей уровней данных антител с индексом активности Европейской противоревматической лиги (DAS 28) Коэффициенты корреляции уровней Ат к 5'-НТ, Ат к ПНФ и Ат к ГДА с индексом активности DAS 28 составили соответственно 0,761 (р<0,001), 0,695 (р<0,001) и 0,307 (р=0,003) Следует подчеркнуть, что индекс DAS 28 хорошо коррелировал с методом оценки активности РА по диагностическим критериям и рабочей классификации (р<0,001)

При поступлении на стационарное лечение у больных РА с I степенью активности (см таблицу 7) отмечалось достоверное увеличение уровней всех исследуемых антител по сравнению, как со здоровыми лицами (р<0,001), так и с больными ОА (tnb№ =2,02, р<0,05, tr-дл =3,53, р< 0,001), кроме значений Ат к 5'-НТ (t5.ht =1,52, р>0,05) Повышенные уровни Ат к 5'-НТ определялись у 2 (11,8%), Ат к ПНФ - у 5 (29,4%) и Ат к ГДА - у 3 (17,6%) пациентов из данной группы Перед выпиской из стационара содержание Ат заметно снизилось (F54rr=21,79, РПнф=17,62, р< 0,0001), кроме Ат к ГДА (Fr;iA=0,08, р=0,781), но, тем не менее, оставалось достоверно выше уровня здоровых лиц (р<0,001)

Таблица 7

Показатели содержания Ат к 5'-НТ, ПНФ и ГДА в сыворотке крови больных РА в зависимости от активности патологического процесса

Контингент обследуемых N St Ат к 5'-НТ Ат к ПНФ Ат к ГДА

Здоровые 30' м а ш 0,027 0,0164 0,003 0,032 0,0219 0,004 0,023 0,0164 0,003

Больные ОА (группа в целом) 48 М а m 0,051 0,048 0,007 0,061 0,042 0,006 0,033 0,028 0,004

Больные РА с I степенью активности 17 М и ш 0,069 0,009 0,002 0,082 0,015 0,004 0,062 0,032 0,008

Больные РА со II степенью активности 64 М а т 0,127 0,042 0,005 0,142 0,046 0,006 0,078 0,028 0,004

Больные РА с III степенью активности 8 М а m 0,204 0,045 0,016 0,210 0,016 0,006 0,079 0,019 0,007

У больных со II степенью активности РА (см таблицу 7) по сравнению с минимальной активностью патологического процесса обнаружено увеличение уровней Ат к 5-НТ и ПНФ Cts'-нт =5,92, tnH<x> =5,06, р<0,001), наметился рост Ат к ГДА (tr-дл =1,82, р>0,05) Повышенные уровни Ат к 5'-НТ определялись у 46 (71,8%), Ат к ПНФ - у 43 (67,2%) и Ат к ГДА - у 32 (50%) пациентов из данной группы После проведенного в условиях стационара лечения у больных РА отмечена существенная динамика показателей содержания Ат к 5'-НТ и ПНФ (F5-.ht =62,07, Гцнф =83,08, р< 0,0001) Уровень Ат к ГДА в процессе терапии не претерпел значимых изменений (FraA = 1,07, р=0,303) Содержание всех изучаемых Ат в сыворотке крови больных РА данной группы после лечения оставалось достоверно высоким по сравнению с группой доноров (Fs-.ht =62,02, FnHo =71,28, FrM =45,68, р<0,0001)

У больных РА с Ш степенью активности по сравнению со II степенью выше содержание 5'-НТ, ПНФ (р<0,0001) и практически неизменные уровни Ат к ГДА (РГдА =0,008, р=0,93) По сравнению с I степенью активности у больных с Ш степенью патологического процесса содержание всех исследуемых антител существенно выше (р<0,0001), кроме Ат к ГДА (Fr-дд =1,95, р=0,176) По окончании курса стационарного лечения отмечено достоверное снижение показателей содержания Ат к 5'-НТ и ПНФ (р <0,0001), изменение уровней Ат к ГДА было не столь выраженным, что

вполне объяснимо существенными иммунологическими сдвигами у больных данной группы (Тгда=2,53, р=0,134)

Таким образом, у больных РА с низкой активностью патологического процесса антитела к 5'-НТ, ПНФ и Г ДА выявлялись в низком проценте случаев, в то время как у больных с умеренной активностью заболевания частота положительных результатов достигала 72% (для Ат к 5'-НТ), 67% (для Ат к ПНФ), 50% (для Ат к ГДА), а при высокой активности - 100% (для всех изучаемых антител)

Содержание антител к 5'-НТ, ПНФ и ГДА в зависимости от характера течения ревматоидного артрита Учитывая наличие выраженных связей между уровнями антител к ПНФ, ГДА и характером течения РА, нами была проведена попытка анализа особенностей иммунологических нарушений, связанных с гуанино-вой ветвью пуринового метаболизма, в зависимости от вариантов быстро и медленно прогрессирующего течения заболевания

В таблице 8 представлены основные дескриптивные статистики исходных показателей уровня антител к 5'-НТ, ПНФ и ГДА у больных РА с различным характером течения заболевания

Таблица 8

Показатели содержания Ат к 5'-НТ, ПНФ и ГДА в сыворотке крови больных РА в зависимости от характера течения заболевания

Течение N Ат к 5'-НТ Ат к ПНФ АткГДА

56 М 0,117 0,127 0,070

Медленно а 0,048 0,052 0,027

прогресси- ш 0,007 0,007 0,004

рующее 95% ДИ 0,104 0,130 0,113 0,141 0,063 0,077

33 М 0,133 0,153 0,083

Быстро о 0,054 0,047 0,031

прогресси- т 0,009 0,008 0,005

рующее 95% ДИ 0,114 0,153 0,136 0,169 0,072 0,094

Примечание N - число наблюдений, - статистические показатели; ДИ - доверительные интервалы для средней (М)

При поступлении на стационарное лечение у больных РА с медленно прогрессирующим течением заболевания уровни Ат к 5'-НТ, ПНФ и ГДА достоверно отличались от уровня здоровых лиц (р<0,001) Содержание Ат к ПНФ и ГДА у больных с быстро прогрессирующим течением РА было выше, чем у больных с медленно прогрессирующим течением заболевания (р<0,05), а статистически значимых различий по содержанию Ат к 5-НТ у больных РА с различным характером течения выявлено не было (р>0,05) После проведенного в условиях стационара лечения у больных РА отмечена существенная динамика показателей содержания Ат к 5'-НТ

и ПНФ как в группе больных с медленно прогрессирующим течением заболевания (р<0,0001), так и с быстро прогрессирующим характером течения РА (р<0,0001) Уровень Ат к ГДА в процессе терапии не претерпел значимых изменений ни в одной из исследуемых групп (р>0,05) Таким образом, определение Ат к 5'-НТ и ПНФ может служить дополнительным критерием степени прогрессирования патологического процесса

Содержание антител к 5'-НТ, ПНФ и ГДА в различных клинических группах больных ревматоидным артритом Повышенные уровни Ат к 5'-НТ определялись у 29 (52,7%), Ат к ПНФ - у 26 (47,3%) и Ат к ГДА - у 21 (38,2%) пациентов с суставной формой РА Повышенные уровни антител к 5'-НТ, ПНФ и ГДА в группе больных с системными проявлениями РА определялись у 19 (60%), 27 (79,4%) и 19 (60%), соответственно

При поступлении на стационарное лечение у больных с суставной формой РА (см таблицу 9) отмечалось значительное увеличение уровней всех исследуемых антител по сравнению со здоровыми лицами (р<0,001) и достоверно сниженное содержание антител по сравнению с больными РА с наличием внесу ставных проявлений (р<0,01)

Таблица 9

Показатели содержания Ат к 5'-НТ, ПНФ и ГДА в сыворотке крови боль-

ных РА в зависимости от клинико-анатомической формы заболевания

Форма РА N Ат к 5'-НТ Ат к ПНФ Ат к ГДА

55 М 0,111 0,120 0,069

Суставная и 0,043 0,044 0,026

ш 0,006 0,006 0,003

95% ДИ 0,099 0,122 0,108 0,132 0,063 0,077

34 М 0,143 0,164 0,084

С системными а 0,056 0,052 0,031

проявлениями т 0,010 0,009 0,005

95% ДИ 0,123 0,163 0,145 0,182 0,073 0,095

Примечание N - число наблюдений, Бг - статистические показатели, ДИ - доверительные интервалы для средней (М) Перед выпиской из стационара содержание Ат к 5'-НТ и ПНФ у больных РА в обеих группах заметно снизилось (суставная форма РА Р5. нт =42,17, Бпнф "45,22, р<0,0001, РА с системными проявлениями Р5.Нт =22,08, РПнф =44,78, р<0,0001) Проведенное лечение не влияло на содержание антител к ГДА у больных РА независимо от формы заболевания (РГда=1 165, р=0,283 и РГд41=0,525, р=0,471, соответственно)

Следует отметить, что ревматоидный васкулит отмечался значительно чаще в группах больных с повышенным содержанием всех исследуемых антител (для Ат к 5'-НТ %2 с поправкой Йетса = 5,61, р=0,0179,

для Ат к ПНФ % с поправкой Йетса = 4,27, р=0,0388, для Ат к ГДА %2 с поправкой Йетса = 8,46, р=0,0036)

Сравнение между собой групп больных РА, позитивных (48 человек, группа I) и негативных (41 человек, группа II) по антителам к 5'-НТ, продемонстрировало большую тяжесть поражения почек, сердца и органов РЭС (р<0,05) у больных, имевших аутоантитела к 5'-НТ (см таблицу 10)

Таблица 10

Частота поражения внутренних органов у больных РА с различным

уровнем антител к 5'-НТ

Клинические проявления Частота выявления (абсолютное колич-во и %) Достоверность

Позитивные по АТ к 5-НТ Негативные по АТ к 5'-НТ (%2' Р) Фи-квадрат

Поражение почек 10(11,24%) 2 (2,25%) Х2-4,83 р=0,028 0,0542

Ревматоидный вас-кулит 8 (8,99%) 0 Х"=7,51 р=0,006 0,0844

Поражение сердца 9(10,11%) 2 (2,25%) Х2=3,93 р=0,0475 0,0441

Полинейропатия 5 (5,62%) 2 (2,25%) Х-0,94 р=0,3333 0,0105

Поражение печени 6 (6,74%) 3 (3,37%) Х-0,65 р=0,4189 0,0073

Поражение РЭС 10(11,24%) 2 (2,25%) Х-4,83 р=0,028 0,0542

Снижение активности 5'-НТ может оказывать выраженное влияние на клеточное звено иммунитета и служить причиной хронизации РА В механизме данного эффекта, очевидно, играют роль промежуточные продукты пуринового метаболизма, такие как деокси- формы некоторых нук-леотидов, обладающие иммуносупрессивным действием Наряду с этим, можно предположить, что изменение активности 5'-НТ при РА может быть вызвано наличием аутоантител к данному ферменту Снижение активности 5'НТ может привести к накоплению в лимфоцитах деоксинук-леотидов, усугубляющих иммунные нарушения на клеточном уровне и способные содействовать развитию аутоиммунных реакций на новые антигены При этом иммунный ответ к 5'НТ может действовать по принципу «порочного круга», способствуя самоподдерживающему характеру воспаления при РА

В таблице 11 представлена частота поражения внутренних органов при РА у больных, имеющих повышенное содержание антител к ПНФ (53 человека, группа I) и не имеющих их (36 человек, группа II) Из таблицы

11 видно, что в группе больных РА, имеющих повышенные уровни Ат к ПНФ, по сравнению со второй группой, наблюдалось достоверно более частое поражение почек (х2 с поправкой Йетса= 7,58, р=0,006), печени (%2 с поправкой Йетса = 5,06, р=0,0245) и ССС (х2 с поправкой Йетса = 3,75, р=0,05) Несколько чаще, но статистически незначимо, у больных с наличием антител к ПНФ отмечалось поражение мышц (р>0,05)

Таблица 11

Частота поражения внутренних органов у больных РА с различным

уровнем антител к ПНФ

Клинические проявления Частота выявления (абсолютное колич-во и %) Достоверность

Позитивные по АТ к ПНФ Негативные по АТ к ПНФ (х2, Р) Фи-квадрат

Поражение почек 12(13,48%) 0 Х-9А2 р=0,0021 0,1059

Ревматоидный вас-кулит 8 (8,99%) 0 х2=5,97 р=0,0146 0,0671

Поражение мышц 4 (4,49%) 0 х-2,84 р=0,0917 0,0319

Поражение сердца 10(11,24%) 1 (1,12%) х2=5,12 р=0,0236 0,0576

Поражение печени 9(10,11%) 0 х-6,80 р=0,0091 0,0764

Отмечено, что больные РА с поражением почек чаще серопозитив-ны по перинуклеарным антинейтрофильным цитоплазматическим антителам по сравнению с больными без нефропатии Более частое обнаружение антител к 5'-НТ и ПНФ у больных РА с поражением почек, положительная корреляционная связь с величиной протеинурии при этом заболевании, а также положительная динамика антител к 5'-НТ и ПНФ на фоне терапии могут служить косвенными доказательствами важной роли данных антител в патогенезе нефропатии при РА

Сравнение между собой групп больных РА, позитивных (40 человек, группа 0 и негативных (49 человек, группа И) по антителам к ГДА, продемонстрировало большую тяжесть поражения печени (х2 с поправкой Йетса = 5,96, р=0,0146) и почек (х2 с поправкой Йетса = 3,76, р=0,05) у больных, имевших аутоантитела к ГДА (см таблицу 12)

В литературе имеется достаточно сведений об относительной орга-носпецифичности ГДА по отношению к печени, в которых повышение активности фермента в сыворотке крови интерпретируется как признак поражения данного органа В связи с этим, в затруднительных случаях для уточнения степени активности патологического процесса у больных

РА с поражением печени необходимо ориентироваться не на показатели активности гуаназы, а на уровень антител к ГДА и имеющуюся клиническую картину заболевания

Таблица 12

Частота поражения внутренних органов у больных РА с различным

уровнем антител к ГДА

Клинические проявления Частота выявления (абсолютное колич-во и %) Достоверность

Позитивные по АТ к ГДА Негативные по АТ к ГДА (х2,р) Фи-квадрат

Поражение почек 9(10,11%) 3 (3,37%) г=5,06 р=0,0244 0,0569

Ревматоидный вас-кулит 8 (8,99%) 0 х2= 10,77 р=0,001 0,1209

Поражение сердца 8 (8,99%) 3 (3,37%) х-3,92 р=0,0479 0,0439

Поражение печени 8 (8,99%) 1 (1,12%) х2=7,81 р=0,0052 0,0878

При изучении влияния Ат к 5'-НТ, ПНФ и ГДА на ферментативную активность изучаемых энзимов в сыворотке крови больных РА была выявлена обратная корреляция умеренной силы (г= -0,434, р<0,001) между активностью 5'-НТ и уровнем соответствующих аутоантител, обратная корреляция высокой силы (г= -0,736, р<0,0005) между активностью ПНФ и уровнем соответствующих антител Не было выявлено корреляционных связей между содержанием Ат к ГДА и активностью данного фермента в сыворотке крови больных РА (р>0,5) Заслуживает внимания тот факт, что ГДА, являясь относительно специфическим индикатором печеночной патологии, не показал корреляционных связей с поражением печени (по уровню аланинаминотрансферазы) у больных РА (г=0,165, р>0,1), в то время как связь антител к ГДА с поражением печени (по уровню аланинаминотрансферазы) была достаточно определенной (г=0,335, р=0,001)

Влияние терапии на содержание антител к 5'-НТ, ПНФ и ГДА у больных ревматоидным артритом

Результаты исследования динамики АТ к 5'-НТ, ПНФ и ГДА, а также показателей, отражающих активность патологического процесса, представлены в таблице 13 Различия в динамике изучаемых лабораторных показателей для разных видов лечения (I - II группы) также были незначительными и тесно коррелировали со снижением активности патологического процесса

В Ш-ей группе отмечено достоверное снижение антител к 5'-НТ 0=3,07 р<0,01) и тенденция к нормализации уровней антител к ПНФ

(1=3,07, р>0,05) и ГДА (1=3,07, р>0,05) У пациентов, принимавших ГКС внутрь, снижались СОЭ, СРВ, уровень (р<0,05)

Таблица 13

Динамика клинико-лабораторных показателей у больных РА __на фоне лечения_

Показатель Группы больных РА

1(п=9) НПВП II (п=22) НПВП + ГК (локально) 111 (п=18) НПВП + ГК (внутрь) IV (п=15) НПВП + ГК + БПВП

ОАБ28 4,43+0,28 3,95+0,41 4,5810,33 4,04+0,29 4,2910,35 3,55+0,28 4,3810,32 3,3110,26*

Ат к 5'-НТ 0,131+0,014 0,102+0,016 0,126+0,012 0,09810,011 0,129+0,015 0,07010,012 * 0,12210,012 0,064+0,009 "

Ат к ПНФ 0,149+0,018 0,113+0,014 0,13910,017 0,10210,012 0,13510,022 0,084+0,014 0,146+0,019 0,05810,011 #

Ат к ГДА 0,072+0,012 0,07410,014 0,06810,009 0,064+0,010 0,07910,010 0,06310,008 0,08110,012 0,06510,008*

Эритроциты (хЮ'О 3,8710,09 4,0310,11 3.9910.08 3.9310.09 3.5810.11 4.0210.12 * 3,8210,10 4,1110,09*

СОЭ (мм/ч) 32,5314,88 23,6113,24 34,8514,22 22,5613,18 * 39,2815,07 22,94+3,46 * 40,2813,47 24,1212,24*

СРБ (мг/л) 19,5813,03 15,3612,87 20,1513,28 11,23+2,64* 18,0912,64 9,9511,83 * 22,3812,47 10,1112,09 *

РФ 3,88+0,95 4,0310,69 4,5010,61 3,6810,44 4,08+0,52 2,9910,86 3,44+1,12 2,25+0,93

ЦИК 6,74+1,05 4,3910,92 7,2510,98 5,8711,14 7,66+1,22 4,94+0,67 8,0311,44 5,3310,88

^М (г/л) 1,0410,03 1,08+0,07 0,9210,09 0,8610,12 0,8710,10 0,7510,11 1,0810,13 0,9110,10

(г/л) 11,2510,99 10,74+0,96 11,43+1,22 12,0210,85 12,4610,84 10,1810,71 * 12,3211,28 9,0410,86 *

1§А (г/л) 1,5310,46 0,9810,35 1,4510,38 1,5210,23 1,9810,21 1,6710,32 2,1410,29 1,8310,19

Примечание верхняя строка - до лечения, нижняя строка - после лечения, *~р<0,05, #-р<0,001 Иное положение дел наблюдалось в IV группе больных РА, когда на фоне проведенного лечения было отмечено существенное снижение Ат к 5'-НТ 0=3,87, р<0,001) и ПНФ 0=4,01, р<0,001) Наряду с положительной динамикой иммунологических показателей, отмечался достоверный рост числа эритроцитов и нормализация уровня ^О (р<0,05), снижение СОЭ и СРБ (р<0,001)

Следует отметить, что, несмотря на улучшение клинического состояния пациентов и положительную динамику ряда показателей в процессе лечения, сохранение некоторых клинико-лабораторных сдвигов у больных РА при выписке из стационара свидетельствует о неполной клинической ремиссии и необходимости наблюдения за больными на фоне продолжения курса лечения в амбулаторных условиях

Таким образом, определение Ат к 5'-НТ, ПНФ, ГДА в комплексе с другими клинико-лабораторными данными у больных РА способствуют уточнению степени активности патологического процесса, характера течения и клинического варианта заболевания, что позволяет проводить индивидуализированную адекватную терапию Кроме того, динамика содержания Ат к 5'-НТ, ПНФ, ГДА в процессе лечения помогает в оценке эффективности проводимой терапии, так как изменения данных показателей взаимосвязаны с динамикой клинического состояния больных.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИТЕЛ К 5'-НТ, ПНФ И ГДА В ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКЕ РА И О А

Трудность дифференциальной диагностики воспалительных и дегенеративных РЗ из-за схожести клинических проявлений особенно на ранних этапах заболеваний обусловила необходимость сравнения иммунологических и ферментных показателей сыворотки крови при РА и ОА (см таблицу 14) При сравнении больных ОА и здоровых лиц были обнаружены достоверные различия в содержании Ат к 5'-НТ и ПНФ (р=0,010 и р=0,0008, соответственно) Различия в содержании Ат к ГДА, как и в активности 5'-НТ, ПНФ и ГДА между данными группами не носили статистической достоверности (р>0,05)

Таблица 14

Активность 5'-НТ, ПНФ, ГДА и содержание Ат к 5'-НТ, ПНФ и ГДА

у больных ОА и РА с минимальной активностью заболевания

N Атк Ат к Ат к N Акт Акт Акт

5'-НТ ПНФ ГДА 5-НТ ПНФ ГДА

Здоровые лица 30 М а 0,027 0,0164 0,032 0,0219 0,023 0,0164 27 13,92 5,329 3,525 1,919 4,289 2,614

ш 0,003 0,004 0,003 1,026 0,369 0,503

Больные ОА М 0,051 0,061 0,033 13,94 3,338 4,869

48 а 0,048 0,042 0,028 45 4,873 2,067 2,394

ш 0,007 0,006 0,004 0,726 0,308 0,357

Больные М 0,069 0,082 0,062 14,19 4,877 3,111

РА, актив- 17 а 0,009 0,015 0,032 17 6,246 1,804 1,999

ность I т 0,002 0,004 * 0,008" 1,515 0,437 * 0,485 *

Примечание * - р<0,05, # - р<0,001 (различия между больными ОА и больными РА с минимальной активностью заболевания)

У больных РА с минимальной степенью активности патологического процесса на фоне слабо повышенной активности 5'-НТ (р=0,879, по сравнению с донорами; р=0,868, по сравнению с ОА), повышенной активности ПНФ (р=0,0248, по сравнению с донорами; р=0,0089, по сравнению с ОА) и сниженной активности ГДА (р=0,120, по сравнению с донорами; р=0,0087, по сравнению с ОА) отмечаются существенные различия в содержании АТ к данным'энзимам.

Уровень антител к ГДА при I степени активности РА значительно превышает соответствующие показатели у больных ОА (р=0,0008) и здоровых лиц (р<0,0005), тогда как различия между больными ОА и донорами недостоверны (р=0,0803). Содержание антител к ПНФ в данной группе также значимо отличалось от показателей больных ОА (р=0,0489) и здоровых лиц (р<0,001). Не было отмечено достоверных различий в содержании Ат к 5'-НТ в группах больных РА (активность I) и ОА (р>0,05).

Таким образом, комплексное определение активности и антител к ПНФ и ГДА может служить дополнительным критерием в сложном процессе дифференциальной диагностики остеоартроза и РА на начальных стадиях заболевания.

0.00 .25 ,50 ,75 1,00

1 - Специфичность

Рисунок 3. Характеристическая (ROC) кривая определения диагностической ценности исследования уровня Ат к 5'-НТ (А), ПНФ (Б) и ГДА (В) в дифференциальной диагностике РА и ОА.

Учитывая сложность дифференциальной диагностики воспалительных и дегенеративных ревматических заболеваний, были построены характеристические кривые для уровня антител к 5'-НТ, ПНФ и ГДА Анализ этих кривых (см рисунок 3) показал, что наиболее чувствительным и специфичным тестом является определение Ат к 5'-НТ (площадь под кривой 0,924, р<0,0005, 95% доверительный интервал 0,879 - 0,969), точка разделения (в которой сумма значений чувствительности и специфичности максимальна) для антител к 5'-НТ равна 0,065 е о п

Незначительно в чувствительности и специфичности данному тесту уступает определение Ат к ПНФ (площадь под кривой 0,895, р<0,0005, 95% доверительный интервал 0,841 - 0,948, точка разделения равна 0,075 е о п ) Анализ характеристической кривой антител к ГДА в дифференциальной диагностике РА и OA (см рисунок 3) показал ограниченные возможности применения этого параметра Площадь под кривой составила 0,620 (р=0,020, 95% доверительный интервал 0,519 - 0,722), точка разделения - 0,065 е о п при чувствительности 60,7% и специфичности 58,3%

Таким образом, при РА обнаружены новые группы аутоантител -антитела к ПНФ и ГДА, определение которых, особенно в сочетании с определением антител к 5'-НТ, в сыворотке крови иммуноферментным методом с применением иммобилизированной формы магнитоуправляе-мого сорбента может использоваться для уточнения отдельных звеньев иммунопатогенеза РА, улучшения качества диагностики и дифференциальной диагностики данного заболевания Контроль за уровнем Ат к ПНФ и 5'-НТ может служить критерием эффективности проводимой терапии и для уточнения механизма действия некоторых лекарственных препаратов

ВЫВОДЫ

1 В сыворотке крови больных РА методом иммуноферментного анализа с применением иммобилизированной формы магнитоуправляемого сорбента в 53,9% случаев выявлены антитела к 5'-НТ (ЕС 3 1 3 5), в 59,5% - Ат к ПНФ (ЕС 2 4 2 1) и в 44,9% - Ат к ГДА (ЕС 3.5 4 3)

2 Антитела к изучаемым энзимам m vitro оказывают в основном ингиби-рующее влияние на ферментативную активность 5'-НТ (снижение активности на 35,6%), ПНФ (снижение активности на 42,1%) и ГДА (снижение активности на 55,2%)

3 Антитела к 5'-НТ, ПНФ и ГДА появляются на ранних стадиях развития РА и их обнаружение может быть использовано для своевременной диагностики этого заболевания Комплексное определение активности ПНФ, ГДА и антител к данным ферментам может служить дополнительным критерием в сложном процессе дифференциальной диагностики остеоартроза и РА на начальных стадиях заболевания

4 Антитела к 5'-НТ чаще и в более высоком титре выявляются у пациентов с высокой активностью РА, наличием ревматоидного васкулита, поражением почек, сердца и органов РЭС

5 Уровени антител к ПНФ и ГДА у больных РА повышаются при более высокой активности патологического процесса, быстропрогрессирую-щем течении заболевания, наличии ревматоидного васкулита, поражении почек и печени

6 Положительная динамика антител к 5'-НТ, ПНФ и ГДА, наблюдаемая на фоне проводимой терапии, позволяет использовать данные показатели в качестве дополнительного критерия эффективности лечения больных РА наряду с традиционными клинико-лабораторными показателями

7 Наиболее эффективно подавляет образование аутоантител к 5'-НТ, ПНФ и ГДА терапия с включением базисных препаратов, глюкокорти-костероиды, назначаемые per os, оказывают значимое влияние только на содержание антител к 5'-НТ На фоне внутрисуставных инъекций ГК и монотерапии нестероидными противовоспалительными препаратами происходит частичная нормализация уровней антител к 5'-НТ, ПНФ и ГДА

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1 Полученные иммобилизированные формы магнитоуправляемых сорбентов на основе 5'-НТ, ПНФ и ГДА рекомендуется использовать для выявления аутоантител к данным энзимам у больных РА в иммуно-ферментном методе анализа

2 Для диагностики и дифференциальной диагностики РА следует применять одновременное определение активности ГДА и исследование антител к 5'-НТ и ПНФ в иммуноферментном анализе с использованием полученных иммобилизированных магнитоуправляемых сорбентов

3 При определении антител к 5'-НТ, ПНФ и ГДА иммуноферментным методом с использованием иммобилизированных МС за норму следует считать показатели здоровых лиц - менее 0,06 е о п (для Ат к 5'-НТ), менее 0,076 е о п (для Ат к ПНФ) и менее 0,056 е о п (для Ат к ГДА)

4 Для уточнения степени активности РА рекомендуется дополнительно использовать совместное определение показателей уровня антител к 5'-НТ и ПНФ, при этом 1-ой степени активности заболевания соответствуют значения экстинкции в диапазоне 0,065-0,073 е о п (для Ат к 5'-НТ) и 0,078-0,089 е о п (для Ат к ПНФ), Н-ой степени активности -0,317-0,138 еоп (для Ат к 5'-НТ) и 0,131-0,154 е о п (для Ат к ПНФ), Ш-ей степени - 0,167-0,242 еоп (для Ат к 5'-НТ) и 0,197-0 223 е о п (для Ат к ПНФ)

5 Выявление высокого уровня Ат к 5'-HT, ПНФ и Г ДА у больных РА (выше 0,168 е о п , 0,168 е о п , 0,168 е о.п , соответственно) при отсутствии нормализации определяемых показателей в течение 3-4 недель стационарного лечения может свидетельствовать о наличии внесустав-ных поражений (развитие ревматоидного васкулита, поражение почек, печени) и необходимой коррекции проводимой терапии

6 В процессе лечения рекомендуется использовать значения уровней Ат к 5'-НТ, ПНФ и ГДА, рассматривая снижение этих показателей как признак эффективности проводимой терапии При обнаружении повышенного уровня Ат к 5'-НТ и ПНФ назначение глюкокортикосте-роидов per os или БПВП более предпочтительно, чем внутрисуставных инъекций ГК и нестероидных противовоспалительных препаратов

ПУБЛИКАЦИИ

1 Подбор оптимальных условий определения антител к ферментам пу-ринового метаболизма при ревматоидном артрите // Сборник научных работ «Актуальные проблемы современной ревматологии», выпуск 23 - Волгоград, 2006 г - С 9-10 Соавт Александров А.В , Негметзянова Е С , Никитин M В , Сычева Г Ф

2 Клинико-патогенетическое значение определения аутоантител к ферментам адениновой ветви пуринового метаболизма у больных ревматоидным артритом // Сборник научных работ «Актуальные проблемы современной ревматологии», выпуск 23 - Волгоград , 2006 г - С 1011 Соавт Александров А В , Негметзянова Е С, Бедина С А, Гонтарь И П , Никитин M В , Сизова M В., Зборовская И.А

3 Clinical and pathogenetic significance of investigation of autoantibodies to enzymes of adenyl branch of punne metabolism in rheumatoid arthritis patients // Annals of the Rheumatic Diseases - 2006 - Vol 65, Supplément II - P 623 Zborovsky A В, Alexandrov A V , Gontar I P, Negmetzyanova E S , Bedma S A , Nikitm M V , Sizova M V , Zborovskaya I A

4 Частота выявления аутоантител к ферментам адениновой и гуаниновой ветвей пуринового метаболизма при ревматоидном артрите // Материалы I Национального конгресса терапевтов «Новый курс консолидация усилий по охране здоровья нации», Москва 1 -3 ноября 2006 г - M , Издательство «Бионика», 2006 - С 7 Соавт Александров А В , Негметзянова Е С, Зборовская И А

5 Определения аутоантител к ферментам адениновой и гуаниновой ветвей пуринового метаболизма у больных ревматоидным артритом // Вестник РГМУ. - 2007 - №2(55) - С 32 Соавт Негметзянова Е С , Зборовская И А , Александров А В

6 Клиническое и диагностическое значение определения антител к ферментам гуаниновой ветви пуринового метаболизма при аутоиммунных

заболеваниях // Актуальные проблемы современной ревматологии Сборник научных работ / под ред Академика РАМН А Б Зборовского/ - Вып XXIV, Волгоград, ООО «Царицынская Полиграфическая компания», 2007 с 6-7 Соавт Алехина И Ю , Александров А В , Мнаца-канян С Г , Сычева Г Ф , Зборовская И А

7 Частота выявления аутоантител к ферментам пуринового метаболизма при ревматических заболеваниях И Тезисы докладов XIV Российский национальный конгресс «Человек и лекарство», - 16-20 апреля 2007, г. Москва - С 44 Соавт Александров А В , Алехина И Ю , Шилова Л Н , Гонтарь И П , Мнацаканян С Г, Зборовская И А

8 Иммобилизированные магнитосорбенты новые возможности повышения качества иммунодиагностики ревматических заболеваний // Приоритетный национальный проект «Здоровье» на территории Волгоградской области - реализация, перспективы (2007, г Волгоград) -Материалы научно-практической конференции - Волгоград НП «Здоровье и экология», 2007 - С 59-62 Соавт Александров А В , Алехина И Ю., Гонтарь И И., Мнацаканян С Г, Негметзянова Е С , Старова

О В , Зборовская И А

9 Иммунологические и биохимические особенности изучения аутоанти-генных свойств ферментов адениновой ветви пуринового метаболизма у больных ревматоидным артритом // Вестник Российской военно-медицинской академии -2007 -№1(17), Приложение (часть I) -

С 425-426 Соавт Александров А В , Негметзянова Е С, Мнацаканян С Г , Зборовская И А

10 Аутоантитела к ферментам пуринового метаболизма клинико-патогенетическая роль антител к гуаниндезаминазе при аутоиммунных заболеваниях // Вестник Российской военно-медицинской академии -2007 -№1(17), Приложение (часть I) -С 426 Соавт АлехинаИЮ, Александров А В , Мнацаканян С Г, Зборовский А Б

11 Патогенетическая роль антител к ферментам пуринового катаболизма при аутоиммунных заболеваниях // XII Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Молодые ученые в медицине» 25-26 апреля 2007 г Тезисы докладов Казань Отечество, 2007 - С 206 Соавт Алехина И Ю , Мнацаканян С Г

12 Иммобилизированные магнитосорбенты на основе ферментов пуринового метаболизма новые возможности диагностики ревматических заболеваний // Материалы научно-практической конференции «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины - 2007», 16 мая 2007 года - СПб ГОУ ДПО СПбМАПО Росздрава - 2007 -

С 104-105 Соавт Алехина И Ю , Новикова О В , Мнацаканян С Г, Александров А В

КОТЕЛЬНИКОВА Ольга Викторовна

КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ФЕРМЕНТАМ ГУАНИНОВОЙ ВЕТВИ ПУРИНОВОГО МЕТАБОЛИЗМА У БОЛЬНЫХ РЕВМАТОИДНЫМ АРТРИТОМ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ИММОБИЛИЗИРОВАННОЙ ФОРМЫ МАГНИТОУПРАВЛЯЕМОГО СОРБЕНТА

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Формат 60x84/16 Тираж 100 экз Бумага офс Уч-печ л 1,62 Заказ № !У7

Отпечатано в типографии Издательства ВолГМУ 400063, Волгоград, ул Рокоссовского 1а

АКТУАЛЬНОСТЬ

Ревматические заболевания (РЗ) занимают важное место в структуре заболеваемости населения и имеют огромное социально-экономическое значение [45, 62, 63, 47]. Среди многочисленной группы РЗ одно из ведущих мест по распространенности и частоте инвалидизации лиц, причем, молодого, наиболее трудоспособного возраста отводится ревматоидному артриту (РА), регистри-руемость которого столь велика, что привлекает к себе внимание ведущих ученых мира и врачей различных специальностей [3, 28, 45].

Среди регистрируемых нозологических форм РЗ в 2005 году в России показатель заболеваемости ревматоидным артритом у взрослых составил 240 на 100 000 человек [45]. Более половины пациентов с РА стойко теряют трудоспособность уже через 7-10 лет от начала заболевания [32, 39, 187]. Весьма тревожным является то обстоятельство, что инвалидизация наступает быстро (50% больных РА становятся инвалидами П-й или 1-й группы в течение первых 3-х лет от момента постановки диагноза) и практически не оставляет шансов на возвращение к трудовой деятельности [45]. Результатом ограничения двигательной активности пациентов является ухудшение их жизнедеятельности и социальная дезадаптация [2].

Следует учитывать, что РА отличается высокой "стоимостью" лечения. Кроме того, данному заболеванию свойственны трудно измеряемые, но играющие огромную роль в жизни человека дополнительные расходы, обусловленные снижением качества жизни из-за постоянно испытываемой боли, нарушения способности не только к труду, но и к самообслуживанию, что влечет за собой серьезные психоэмоциональные проблемы.

Хроническое прогрессирующее, нередко инвалидизирующее течение ревматоидного артрита ставит перед врачами задачу возможно более ранней его диагностики. Однако распознавание РА на ранней стадии представляет значительные трудности. По настоящее время не найдено строго специфичного для РА лабораторного теста. Только сочетание многих клинических и лабораторных признаков может оказать помощь в диагностике этого заболевания. Поэтому и сейчас продолжается поиск методов, позволяющих дифференцировать ревматоидный артрит среди множества воспалительных и дегенеративных болезней опорно-двигательного аппарата.

По современным представлениям поражение соединительной ткани при ревматоидном артрите является следствием развивающихся иммунопатологических нарушений. Об аутоиммунной природе РА свидетельствует ряд признаков: выявление ревматоидного фактора (РФ), циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК), сенсибилизированных к компонентам соединительной ткани лимфоцитов, а также широкого спектра аутоантител (Ат), в том числе и к различным ферментам. Однако следует отметить, что патологическое действие подобных антител до конца не определено. л

В настоящий момент возрос интерес к изучению метаболизма пуриновых соединений в норме и при патологии. Это связано не только со значением данного цикла в обмене нуклеиновых кислот, но и с той важной биологической ролью, которую выполняют его отдельные, составные части: ферменты и промежуточные субстраты. Так хорошо известно, что с активностью ряда» ферментов гуаниновой ветви обмена пуриновых производных связаны процессы созревания Т-клеток и развитие Т-клеточного иммунитета в организме, процессы деградации пуринового нуклеозида — гуанозина, обладающего выраженными ре-гуляторной и физиологической активностями.

Согласно данным ряда авторов [21, 27, 68], у больных РА наблюдается существенные изменения активности ряда ферментов пуринового катаболизма в сыворотке крови, которые коррелируют со степенью активности патологического процесса. Учитывая характерные иммунологические нарушения при аутоиммунных заболеваниях, можно предположить, что изменение энзиматиче-ской активности ряда ферментов пуринового метаболизма может быть связано с гиперпродукцией аутоантител к ним.

До настоящего времени в литературе имеются сведения только по изучению аутоантител к энзимам адениловой ветви пуринового обмена, в частности — аденозиндезаминазе, при некоторых ревматических заболеваниях [49,138]. В то же время процессам аутоантителообразования к ферментам других метаболических цепочек пуринов: гуаниновой и инозиновой, имеющих, вероятно, не меньшее значение при РЗ, практически остается не изученной. В связи с этим нам представляется перспективным комплексное исследование у больных РА антител к основному энзиму гуаниновой ветви ПМ - гуаниндезаминазе (ГДА), так же антител к5-нуклеотидазе (5'-НТ) и пуриннуклеозидфосфорилазе (ПНФ), принимающих участие в распаде гуанозина.

Настоящая работа является фрагментом отраслевой научно-технической программы в области медицины.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью настоящего исследования является усовершенствование иммунологической диагностики, дифференциальной диагностики и объективизация контроля эффективности проводимой терапии у больных ревматоидным артритом путем исследования антителообразования к гуаниндезаминазе, 5'-нуклео-тидазе и пуриннуклеозидфосфорилазе с использованием иммобилизированной формы магнитоуправляемого сорбента.

Для достижения намеченной цели были поставлены следующие задачи:

1. Получить иммобилизированные формы гуаниндезаминазы, 5'-нуклео-тидазы и пуриннуклеозидфосфорилазы, изучить их физико-химические свойства.

2. Адаптировать иммуноферментный метод анализа с использованием гуаниндезаминазы, 5'-нуклеотидазы и пуриннуклеозидфосфорилазы в качестве антигенной матрицы к изучению образования антител к этим ферментам.

3. Изучить содержание антител к гуаниндезаминазе, 5'-нуклеотидазе и пуриннуклеозидфосфорилазе в сыворотке крови больных РА в зависимости от активности, стадии и характера течения заболевания.

4. Изучить энзиматическую активность гуаниндезаминазы, 5-нуклеотидазы пуриннуклеозидфосфорилазы и содержание антител к ним в сыворотке крови больных РА в зависимости от формы и клинических особенностей заболевания.

5. На основе иммуноанализа изучить динамику антителообразования к гуаниндезаминазе, 5-нуклеотидазе и пуриннуклеозидфосфорилазе у больных РА в процессе стационарного лечения; оценить возможность использования антител к данным ферментам в качестве объективных критериев эффективности проводимой терапии.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ

Впервые для иммунодиагностики РА разработаны и применены, в; предложенном варианте иммуноферментного анализа методы с использованием, иммобилизированных форм гуанозиндезаминазы, 5'-нуклеотидазы и пуриннуклеозидфосфорилазы, подобраны оптимальные условия их постановки. В1 сыворотках крови больных РА обнаружены антитела к гуанозиндезаминазе, 5'-нуклеотидазе и пуриннуклеозидфосфорилазе. Показано, что их уровень достоверно отличается от содержания данных АТ в сыворотке крови здоровых лиц и больных остеоартрозом.

Выявлено, что концентрация антител к ГДА',,5-НТ и ПНФ у больных РА коррелирует с активностью патологического процесса, а наличие висцеральных проявлений сопровождается максимальными значениями исследуемых аутоан-тител. Динамика уровней АТ к ГДА, 5-НТ и ПНФ позволяет прогнозировать клиническое течение РА и судить об эффективности проводимой терапии.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ

Разработана доступная для применения в клинических лабораториях методика иммуноферментного определения уровня антител к ГДА, 5'-НТ и ПНФ на основе иммобилизированной формы магнитоуправляемого сорбента. Выявление антител к ГДА, 5'-НТ и ПНФ в предложенной модификации ИФА может быть использовано в качестве дополнительных тестов в комплексной диагностике РА для характеристики активности патологического процесса, особенно на ранних стадиях заболевания, и прогнозирования клинических форм РА. Определение антител к ГДА, 5-НТ и ПНФ в динамике дает возможность судить об эффективности и адекватности проводимой терапии.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

На защиту выносится положение о возможности использования определения антител к гуаниндезаминазе, 5'-нуклеотидазе и пуриннуклеозидфосфори-лазе иммуноферментным методом с помощью иммобилизированной формы магнитоуправляемого сорбента в качестве дополнительных тестов для диагностики степени активности, характера течения, формы, серологического варианта РА, оценки эффективности проводимой терапии.

ПУБЛИКАЦИИ И АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, из которых 5 — в центральной, 6 - в местной, 1 - в зарубежной печати, в том числе 3 работы в изданиях, рекомендованных ВАК для опубликования основных результатов диссертаций на соискание ученой степени кандидата медицинских наук. Материалы диссертации были представлены на ежегодных научно-практических конференциях Волгоградского государственного медицинского университета (2006, 2007 гг.), научных конференциях ГУ НИИ КиЭР РАМН (2006, 2007 гг.), на конгрессе ЕЦЬАК. (Амстердам, Нидерланды, 2006 г.), I Национальном конгрессе терапевтов (Москва, 2006), II Международной Пироговской научной медицинской конференции (Москва, 2007), XIV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2007), научно-практической конференции «Приоритетный национальный проект «Здоровье» на территории Волгоградской области — реализация, перспективы» (Волгоград, 2007), VIII Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы клиники, диагностики и лечения больных в многопрофильном лечебном учреждении» (Санкт-Петербург, 2007), III Всероссийской конференции «Социальные аспекты ревматических заболеваний: Боль - междисциплинарная проблема» (Смоленск, 2007), Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов — 2007» (Москва, 2007), XII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2007), научно-практической конференции «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины - 2007» (Санкт-Петербург, 2007).

Результаты диссертации были апробированы на совместном заседании Ученого Совета ГУ НИИ клинической и экспериментальной ревматологии РАМН и кафедры госпитальной терапии ГОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» 5 декабря 2007 года (Протокол №8).

ВНЕДРЕНИЕ В ПРАКТИКУ

Методы определения антител к гуаниндезаминазе, 5-нуклеотидазе и пу-риннуклеозидфосфорилазе у больных РА иммуноферментным методом с помощью иммобилизированной формы магнитоуправляемого сорбента внедрены в практику работы муниципального учреждения здравоохранения «Городская клиническая больница № 25» г. Волгограда, государственного учреждения здравоохранения «Волгоградский областной клинический госпиталь ветеранов войн», муниципального учреждения здравоохранения «Городская больница №1 им. С.З.Фишера» г. Волжского. С результатами исследований, возможностями и перспективой иммунологической диагностики ревматических заболеваний систематически знакомятся студенты Волгоградского государственного медицинского университета, практические врачи на семинарах, научно-практических и клинических конференциях.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация изложена на 170 страницах машинописного текста и состоит из введения, 8 глав, обсуждения результатов, выводов и практических рекомендаций. Диссертация иллюстрирована 27 таблицами, 18 рисунками, 3 выписками из истории болезни. Указатель литературы содержит 206 источников, в том числе 72 отечественных и 134 иностранных.

ВЫВОДЫ

1. В сыворотке* крови больных РА методом иммуноферментного анализа с применением иммобилизированной формы магнитоуправляемого сорбента в 53,9% случаев выявлены антитела к 5'-НТ (ЕС 3.1.3.5), в 59,5% - антитела к ПНФ (ЕС 2.4.2.1) и в 44,9% - антитела к ГДА (ЕС 3.5.4.3).

2. Антитела к изучаемым энзимам in vitro оказывают в основном ингиби-рующее влияние на ферментативную активность 5'-НТ (снижение активности на 35,6%), ПНФ (снижение активности на 42,1%) и ГДА (снижение активности на 55,2%).

3. Антитела к 5'-НТ, ПНФ и ГДА появляются на ранних стадиях развития РА и их обнаружение может быть использовано для своевременной диагностики этого заболевания. Комплексное определение активности* ПНФ, ГДА и антител к данным ферментам может служить дополнительным критерием в сложном процессе дифференциальной диагностики остеоартроза и РА на начальных стадиях заболевания.

4. Антитела к 5'-НТ чаще и в более высоком титре выявляются у пациентов с высокой активностью РА, наличием ревматоидного васкулита, поражением почек, сердца и органов РЭС.

5. Уровени антител к ПНФ и ГДА у больных РА повышаются при более высокой активности патологического процесса, быстропрогрессирую-щем течении заболевания, наличии ревматоидного васкулита, поражении почек и печени.

6. Положительная, динамика антител к 5'-НТ, ПНФ и ГДА, наблюдаемая на фоне проводимой терапии, позволяет использовать данные показатели в качестве дополнительного критерия эффективности лечения больных РА наряду с традиционными клинико-лабораторными показателями.

7. Наиболее эффективно подавляет образование аутоантител к 5'-НТ, ПНФ и ГДА терапия с включением базисных препаратов; глюкокорти-костероиды, назначаемые per os, оказывают значимое влияние только на содержание антител к 5'-НТ. На фоне внутрисуставных инъекций ГК и монотерапии нестероидными противовоспалительными препаратами происходит частичная нормализация уровней антител к 5'-НТ, ПНФ и

ГДА

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Полученные иммобилизированные формы магнитоуправляемых сорбентов на основе 5'-НТ, ПНФ и ГДА рекомендуется использовать для выявления аутоантител к данным энзимам у больных РА в иммуно-ферментном методе анализа.

2. Для диагностики и дифференциальной диагностики РА следует применять одновременное определение активности ГДА и исследование антител к 5'-НТ и ПНФ в иммуноферментном анализе с использованием полученных иммобилизированных магнитоуправляемых сорбентов.

3. При определении антител к 5'-НТ, ПНФ и ГДА иммуноферментным методом с использованием иммобилизированных МС за норму следует считать показатели здоровых лиц - менее 0,06 е.о.п. (для Ат к 5'-НТ),. менее 0,076 е.о.п. (для Ат к ПНФ) и менее 0,056 е.о.п. (для Ат к ГДА).

4. Для уточнения степени активности- РА рекомендуется дополнитель-■ но использовать совместное определение показателей уровня антител к 5'-НТ и ПНФ, при этом 1-ой степени активности заболевания соответствуют значения экстинкции в диапазоне 0,065-0,073 е.о.п. (для Ат к 5'-НТ) и 0,078-0,089 е.о.п. (для Ат к ПНФ), И-ой степени активности - 0,117-0,138 е.о.п. (для Ат к 5'-НТ) и 0,131-0,154 е.о.п. (для Ат к ПНФ), Ш-ей степени - 0,167-0,242 е.о.п. (для Ат к 5'-НТ) и 0,197-0,223 е.о.п. (для Ат к ПНФ).

5. Выявление высокого уровня антител к 5'-НТ, ПНФ и ГДА у больных РА (выше 0,168 е.о.п., 0,168 е.о.п., 0,168 е.о.п., соответственно) при отсутствии нормализации определяемых показателей в течение 3-4 недель стационарного лечения может свидетельствовать о наличии внесуставных поражений (развитие ревматоидного васкулита, поражение почек, печени) и необходимой коррекции проводимой терапии.

6. В процессе лечения рекомендуется использовать значения уровней антител к 5'-НТ, ПНФ и ГДА, рассматривая снижение этих показателей как признак эффективности проводимой терапии. При обнаружении повышенного уровня антител к 5'-НТ и ПНФ назначение глюкокорти-костероидов per os или БПВП более предпочтительно, чем внутрисуставных инъекций ГК и нестероидных противовоспалительных препаратов.