Автореферат и диссертация по медицине (14.01.01) на тему:Клиническое значение предикторов ангиогенеза и эндотелиальной дисфункции в прогнозировании исходов программ вспомогательных репродуктивных технологий

На правах рукописи

ГЕРИЛОВИЧ Людмила Александровна

КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ПРЕДИКТОРОВ АНГИОГЕНЕЗА И ЭНДОТЕЛИАЛЬНОЙ ДИСФУНКЦИИ В ПРОГНОЗИРОВАНИИ ИСХОДОВ ПРОГРАММ ВСПОМОГАТЕЛЬНЫХ РЕПРОДУКТИВНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ

14.01.01.- Акушерство и гинекология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

13 ИАй 2015

0055687/»

Иркутск-2015

005568775

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Красноярский государственный медицинский университет имени профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого» Минздрава России

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Егорова Антонина Тимофеевна Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор Салмина Алла Борисовна Официальные оппоненты:

Флоренсов Владимир Вадимович - доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО «Иркутский государственный медицинский университет» Минздрава России, кафедра акушерства и гинекологии с курсом гинекологии детей и подростков, заведующий

Одареева Елена Владимировна - кандидат медицинских наук, ГБОУ ДПО «Иркутская государственная медицинская академия последипломного образования» Минздрава РФ, кафедра перинатальной и репродуктивной медицины, доцент

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (г. Томск)

Защита состоится «26» мая 2015 г. в_часов на заседании диссертационного

совета Д 001.038.02 при ФГБНУ «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека» по адресу: 664003, г. Иркутск, ул. ТимирязеваДб

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и иа сайте www.n2medek.bvulleten.com ФГБНУ «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека»

Автореферат разослан « »_2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук,

профессор Шолохов Леонид Федорович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

В мире все большее распространение получает метод лечения бесплодия путем экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) преовуляторных ооцитов и переноса эмбрионов (ПЭ) на стадии дробления в полость матки. Использование метода экстракорпорального оплодотворения предоставляет возможность реализовать функцию деторождения при таких формах женского бесплодия, которые раньше считались абсолютно бесперспективными для лечения. Несмотря на совершенствование схем стимуляции яичников, внедрение современных гормональных препаратов и качествешю новых сред для культивирования эмбрионов in vitro, эффективность лечения бесплодия в мире в расчете частоты наступления беременности на одну попытку с переносом эмбрионов составляет в среднем 25-30%, причем за последние годы этот показатель значительно не меняется. Частота невынашивания беремешюсти после применения программ вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ), по данным разных авторов, колеблется от 11 до 66%, что снижает общую эффективность лечения бесплодия (Назаренко Т.А., 2008; Капустина М.В., 2009).

При проведении программ вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) стимуляция суперовуляции проводится с целью получения большого количества ооцитов, что достигается использованием различных гормональных препаратов. Нарушение фолликулярного и системного ангиогенеза в этих условиях способствует развитию дисфункции эндотелия. В настоящее время дисфункция процесса ангиогенеза может рассматриваться как один из ключевых патофизиологических факторов, ограничивающих имплантацию эмбрионов и способствующих развитию сосудистых осложнений во время беременности (Тепляшина ЕА., Пожиленкова Е.А, Екимова М.В., 2011; Zhao М., Chang С, Liu Z. et al., 2010).

Сосудисто-эндотелиальный фактор роста (СЭФР) выступает как ключевой ангиогенный маркер и ему отводится значительная роль в регуляции фолликулярного ангиогенеза, кроме того, он способен инициировать данный процесс и пролиферацию клеток фолликула. По мнению ряда авторов, СЭФР, оказывая эффект на сосудистую сеть органов репродуктивной системы может ограничивать фертильность в программах ВРТ и оказывать существенное влияние на гестационный процесс (Волкова JI.B., Аляутдина О.С., 2011; Гавриленко Т.И., Рыжкова Н.А., Пархоменко А.Н., 2011; Manau D., Fabregues F., Penairubia J. et al. 2007; Koo Y.A., Lee В., Park HJ. et al., 2009; Savchev S.I., Moragianni V.A., Senger D. etal. 2010).

Актуальность работы заключается в поиске оптимальных маркеров прогноза имплантации при лечении различных форм бесплодия методами ВРТ, что может позволить повысить частоту наступления беременности в стимулировагашх лечебных циклах.

Значимость работы определяется тем, что на основании обнаруженных связей между уровнем маркеров эндотелиалыюй дисфункции и частотой имплантации открываются новые подходы для разработки патогенетически обоснованной терапии, позволяющей повысить эффективность программ ВРТ и обеспечить благополучное течение ранних сроков беременности.

Цель исследования

Определить клиническое значение маркеров ангиогенеза и эндотелиальной дисфункции в прогнозировании исходов программ вспомогательных репродуктивных технологий при трубной и мужской формах бесплодия.

Задачи исследования:

1. Выявить влияние различных схем индукции суперовуляции на качество ооцитов, эмбрионов и эффективность программ ВРТ у пациенток с трубной и мужской формами бесплодия.

2. Выявить значимость маркера ангиогенеза СЭФР в прогнозировании имплантации эмбрионов в программах ВРТ.

3. Установить влияние эндотелиальной дисфункции на имплантацию эмбрионов при трубной и мужской формах бесплодия.

4. Обосновать рекомендации по коррекции эндотелиальной дисфункции в период проведения программ ВРТ для увеличения частоты имплантации эмбрионов.

Научная новизна исследования

Приоритетными являются новые сведения о корреляционных взаимосвязях уровней СЭФР и бРЕСАМ-1 в биологических жидкостях, полученных при проведении индукции суперовуляции в программах ВРТ при трубной форме бесплодия. Выявлено стимулирующее действие СЭФР на уровень циркуляции 8РЕСАМ-1, ограничивающее частоту имплантации эмбрионов в программах ВРТ при трубной форме бесплодия.

Показаны особенности ангиогенеза и эндотелиалыюй дисфункции, возникающие при индукции суперовуляции при трубной и мужской формах бесплодия.

Доказано, что при трубной форме бесплодия содержание СЭФР в сыворотке крови от 456 до 688 пг/мл является фактором, ограничивающим имплантацию эмбрионов. При мужской форме бесплодия при уровне эндотелина-1 от 1,0 до 3,4 фмоль/мл прогноз имплантации неблагоприятный.

Практическая значимость работы

Доказано, что значимыми прогностическими факторами имплантации эмбрионов в программах ВРТ при трубной и мужской формах бесплодия являются маркеры ангиогенеза и эндотелиальной дисфункции СЭФР и эндотелин-1.

Впервые представлены нормативные показатели маркеров ангиогенеза и эндотелиальной дисфункции при трубной и мужской формах бесплодия,

позволяющие прогнозировать имплантацию в программах ВРТ.

Обоснованы и внедрены в практическую деятельность репродуктивных центров г. Красноярска рекомендации по проведению лечебных мероприятий по коррекции эндотелиальной дисфункции, позволяющие повысить эффективность программ ВРТ.

Методология и методы исследования

Обследование включало анализ медицинской документации, анкетирование, комплекс стандартных клинико-лабораторных методов обследования, включающих общеклиническое, гинекологическое исследования, УЗИ органов малого таза, эндоскопические методы исследования (лапароскопия и гистероскопия) при наличии показаний.

Для определения содержания сосудистого эндотелиального фактора роста (СЭФР), растворимой формы молекулы РЕСАМ-1 (sPECAM-1), эндотелина-1 использовали наборы для иммуноферментного анализа фирмы «ВСМ Diagnostics» (Германия), «Bender MedSystems» (Австрия) и «Biomedica Gruppe» (Австрия) соответственно. Методика выполнялась согласно протоколу фирмы-производителя. Среднее медианное значение для содержания СЭФР составило 270 пг/мл, sPECAM-1 - 62,3 нг/мл, эндотелина-1 - 0,26 фмоль/мл.

Основные положения, выносимые на защиту

1. При трубной форме бесплодия проведение индукции суперовуляции по протоколу с использованием антагониста гонадотропин-рилизинг гормона позволило получить качественные ооциты и эмбрионы.

2. Предикторы ангиогенеза и эндотелиальной дисфункции сосудистый эндотелиальный фактор роста (СЭФР) и эндотелин-1 являются значимыми факторами для прогнозирования исходов программ ВРТ при трубной и мужской формах бесплодия.

3. Проведение лечебных мероприятий по коррекции эндотелиальной дисфункции в индуцированных циклах позволило увеличить частоту наступления беременности при трубной и мужской формах бесплодия.

Степень достоверности

Научные положения и выводы обоснованы достаточным объемом выполненных исследований с использованием современных методов, сертифицированного оборудования и реактивов.

Апробация работы

Данная работа проведена на кафедре акушерства и гинекологии ИПО, кафедре биологической химии с курсом медицинской, фармацевтической и токсикологической химии ГБОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздрава России в рамках проекта «Изучение особенностей эндотелиальной дисфункции в программах вспомогательных репродуктивных технологий»,

поддержанного в результате реализации государствешюго задания на выполнение фундаментальных научных исследований в 2012-2014г.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные вопросы акушерства и гинекологии» г. Красноярск 2013г; международной научно-практической конференции «От эмбриона к человеку» г. Новосибирск 2012 - 2013г.; на заседании кафедры акушерства и гинекологии ИПО 2013г.; на заседании проблемной комиссии «Педиатрия, акушерство и гинекология, детская хирургия, медицинская генетика» ГБОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздрава России.

Личное участие автора

Личный вклад автора состоит в непосредственном участии в получении исходных данных, апробации результатов исследования, обработке и интерпретации полученных данных, подготовке публикаций по выполненной работе, оформлении текста кандидатской диссертации.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, их них 5 - в журналах и изданиях, рекомендованных к публикации ВАК Минобразования и науки РФ.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, пяти глав, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы. Работа изложена на 109 страницах машинописного текста, иллюстрирована 9 рисунками, 23 таблицами. Указатель литературы включает 140 источников, из них - 53 на русском и 87 - на иностранном языках.

ОБЪЕКТЫ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты и дизайн исследования

В работе с людьми соблюдались этические принципы, предъявляемые статьей 24 Конституции РФ и Хельсинской Декларацией Всемирной медицинской ассоциации (World Medical Association Declaration of Helsinki 1964, 2000 ред.).

Данная исследовательская работа выполнена в период с 2009 по 2013гг. на кафедре акушерства и гинекологии института последипломного образования (заведующий кафедрой, д.м.н., проф. А.Т. Егорова), кафедре биологической химии с курсом медицинской, фармацевтической и токсикологической химии (заведующий кафедрой д.м.н., проф. А.Б. Салмина) ГБОУ ВПО «Красноярского государствешюго медицинского университета имени профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого министерства здравоохранения РФ».

В процессе выполнения работы на первом этапе исследования было проведено когортное исследование 158 супружеских пар с трубной и мужской формами бесплодия, получивших лечение методами вспомогательных репродуктивных технологий в ООО «Медицинский Центр гинекологической эндокринологии и репродукции «Три сердца» г. Красноярска.

В зависимости от этиологической формы бесплодия, установленной после полного клинико-лабораторного обследования, пациентки были разделены на две группы: в основную группу вошли 122 женщины с нарушениями проходимости и функциональной несостоятельностью маточных труб (ТФ); контрольную группу с мужским фактором бесплодия составили 36 супружеских пар (МФ). У мужчин из этих пар установлена различная патология сперматозоидов — идиопатическая астенозооспермия, идиопатическая олигозооспермия. Исследуемые группы были дополнительно разделены на подгруппы с учетом наступления беременности (наступившая беременность - Б+, отсутствие беременности - Б").

Критерии включения в исследование:

- трубная форма бесплодия;

- бесплодие, обусловленное мужским фактором - идиопатическая астенозооспермия, идиопатическая олигозооспермия.

Критерии исключения из исследования:

- бесплодие в сочетании с миомой матки;

- бесплодие, обусловленное эндометриозом;

- мужской фактор бесплодия - тератозооспермия и тяжелые нарушения эректильной дисфункции.

Клиническую оценку состояния здоровья обследованных пациенток проводили с помощью разработанной статистической карты.

При сборе анамнеза обращали внимание на:

- время появления первой менструации, характер менструальной функции, регулярность и продолжительность менструальных циклов;

- особенности половой жизни: возраст начала половой жизни, какой брак по

счету;

- детородную функцию: паритет, сведения о каждой беременности;

количество самопроизвольных выкидышей и неразвивающихся беременностей;

- количество медицинских абортов;

- наличие своевременных и преждевременных родов в анамнезе;

- перенесенные гинекологические заболевания;

- экстрагенитальные заболевания;

- перенесешгые оперативные вмешательства.

Всем пациенткам, включенным в исследование, проводилось определение уровней гормонов плазмы крови (ФСГ, ЛГ, пролактин, эстрадиол).

Обследование на инфекции включало взятие мазков на флору содержимого цервикального канала, влагалища и уретры, исследования методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) отделяемого цервикального канала и влагалища и исследования крови методом ИФА на определение Ig А, М, G к комплексу TORCH. Бактериологический метод использовался при проведении световой микроскопии для исследования мазков на флору после окраски по Граму.

На втором этапе нашей работы осуществлялся выбор протокола стимуляции суперовуляции и проведение программы ЭКО и ПЭ (рисунок 1). Перед началом стимуляции суперовуляции с каждой пациенткой была проведена беседа о планируемом протоколе стимуляции и получено информированное согласие. Все исследования выполнены с разрешения локального этического комитета ГБОУ ВПО КрасГМУ (протокол № 21/2009 от 22.01.2010 года).

I этап исследования

Полное клинико - лабораторное обследование пациенток исследуемых групп для определения группы бесплодия

Анализ анамнестических данных

ЗЗЕ

Исключение инфекционной патологии органов репродуктивной системы

Оценка уровней яичниковых и гонадотропных гормонов

Группа трубный фактор бесплодия (ТФ), п=122 Группа контроля (мужской фактор бесплодия - МФ), п=37

Родившиеся дети, п=16 Родившиеся дети, п=7

ч>

II этап исследования Выбор схемы индукции суперовуляции, проведение программы ЭКО и ПЭ. Оценка эффективности выбранных схем индукции суперовуляции

■ О

Оценка маркеров ангиогенеза и эндотелиальной дисфункции в сыворотке крови и фолликулярной жидкости

О

Беременность есть, п=46 Беременность есть, п=14

Рисунок 1 - Программа исследования.

Программы ЭКО и ПЭ включали:

1. Индукцию суперовуляции.

2. Аспирацию фолликулов.

3. Эмбриологический этап.

4. Перенос эмбрионов (ПЭ) с поспрансферной поддержкой и диагностикой ХГЧ.

Стимуляцию суперовуляции осуществляли с применением трех протоколов. Длинный протокол с агонистом гонадотропин-рилизинг-гормона трипорелином, короткий протокол с агонистом гонадотропин-рилизинг-гормона трипторелином и короткий протокол с антагонистом гонадотропин-рилизинг-гормона цетрореликсом. Для каждой пациентки выбор протокола осуществлялся индивидуально с учетом овариального резерва. Фоллитропин альфа использовался во всех применяемых схемах индукции суперовуляции.

С учетом нормальных параметров овариальных резервов пациенток исследуемых групп стартовая доза рФСГ не превышала 150-225 ЕД/сут, в каждом конкретном случае вопрос о величине начальной дозы препарата решался индивидуально. Средняя доза рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона (рФСГ) - фоллитропина альфа на цикл стимуляции была одинаковой: в группе с трубной формой составила 1222±36,62 ME, в контрольной группе данный показатель составил 1260,6±62,5 ME. Средняя продолжительность индукции овуляции была сопоставима между группами и составила 8,3±0,2 дня в группе с трубной формой бесплодия и 8,2±0,4 дня в контрольной группе.

В качестве триггера овуляции использовали хориогонадотропин альфа — в дозе 6500 ME. Оценка эффективности индукции овуляции осуществлялась в период с 3 по 14 день менструального цикла с применением трансвагинальной эхографии.

Морфологическую оценку ооцитов в лаборатории осуществляли по состоянию внешнего вида полученных ооцит-кумулюс-комплексов: «прозрачности», размера и «степени разрыхления» клеток кумулюса и лучистого вепца.

Контроль за качеством и морфологическим развитием эмбрионов осуществлялась ежедневно. Проводилась оценка дробления, количества и морфологии бластомеров. Использовались критерии оценки развития бластоцист по классификации, предложенной Д.К. Гарднером (dr. D.K. Gardner) - при описании морфологии эмбрионов цифрами обозначалось количество бластомеров в эмбрионе, буквами - особенности морфологии.

Перенос эмбрионов на стадии бластоцисты проведен всем пациенткам. Посттрансферная подддержка проводилась с момента аспирации фолликулов и продолжалась в течение 12 дней после ПЭ микронизированным прогестероном в дозе 600 мг в сутки трансвагиналыю.

Одновременно на втором этапе у 77 пациенток производилась оценка уровней маркеров ангиогенеза (СЭФР) и эндотелиалыюй дисфункции (sPECAM-1 и эндотелина-1) в сыворотке крови и фолликулярной жидкости, полученных при пункции фолликулов на этапе проведения программ ВРТ. Это исследование

проведено 60 пациенткам с трубной формой бесплодия и 17 пациенткам с мужским фактором бесплодия. Пациентки с ТФ отнесены нами в основную группу исследования, а пациентки с бесплодием, обусловленным мужским фактором, составили контрольную группу. Данные исследуемые группы были также дополнительно разделены на подгруппы с учетом наступления беременности (наступившая беременность — Б+, отсутствие беременности - Б").

Методы исследования

Обследование включало анализ медицинской документации, анкетирование, комплекс стандартных клинико-лабораторных методов обследования, включающих общеклиническое, гинекологическое исследования, УЗИ органов малого таза, эндоскопические методы исследования (лапароскопия и гистероскопия) при наличии показаний.

Инструментальные методы исследования

Ультразвуковое исследование органов малого таза, фолликулометрию проводили при помощи аппарата «Aloka-5500» влагалищным датчиком 5,0 МГц. Пункцию фолликулов осуществляли трансвагинальным доступом под контролем ультразвука с применением аппарата «Profocus - 2202».

Лабораторные методы исследования

В качестве материала для исследования использовалась сыворотка крови и фолликулярная жидкость. Образцы фолликулярной жидкости получали во время аспирации преовуляторных фолликулов, достигших диаметра 18-20 мм, трансвагинальным доступом под контролем ультразвука с применением аппарата «Profocus - 2202». Параллельно проводился забор крови из локтевой вены пациентки толстой иглой в количестве 15 мл и исследовалась сыворотка крови вены.

Определение уровней гормонов плазмы крови (ФСГ, ЛГ, пролактин, эстрадиол) проводилось при помощи метода радиоиммунного и радиоферментного анализа наборами фирмы «Immunotech» (Чехия) на базе лаборатории ИХМИ Красноярского государственного медицинского университета на 5-7 и 20-22 дни менструального цикла. Уровень ФСГ менее 10 ЕД/л указывал на нормальную резервность яичников и являлся основанием для выбора схемы индукции суперовуляции.

Определение содержания сосудистого эндотелиального фактора роста (СЭФР), растворимой формы молекулы РЕСАМ-1 (sPECAM-1), эндотелина-1 проводилось на ИФА-анализаторе с использованием наборов для иммуноферментного анализа фирмы «ВСМ Diagnostics» (Германия), «Bender MedSystems» (Австрия) и «Biomedica Gruppe» (Австрия) соответственно. Методика выполнялась согласно протоколу фирмы-производителя в Центральной научно -исследовательской лабораторш! КрасГМУ (руководитель - д.м.н., проф. Ю.В. Котловский), г. Красноярск.

Методы статистической обработки результатов исследования

Полученные данные регистрировались в компьютерной базе данных с помощью электронных таблиц Excel.

Использовалась описательная статистика: частота в процентах, средняя арифметическая (М), стандартное отклонение (s). Методы непараметрической статистики: Манна-Уитни, %2. Для оценки связи признаков применен корреляционный анализ с расчетом корреляции по методу Спирмена. Проводились расчеты множественной и логистической регрессий. При значении коэффициента корреляции |г| >0,75 связь между признаками оценивалась как сильная, при коэффициенте 0,25 <|г|<0,75 - зависимость средней силы, при [г| <0,25 - слабая степень корреляции. Различия считали статистически значимым при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ОБСЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Характеристика обследованных женщин

Сравнительный анализ клинико-анамнестических характеристик женщин исследуемых групп демонстрирует сопоставимость по ряду параметров. В частности, нами установлено отсутствие достоверных различий при изучении возрастных характеристик исследуемых пациенток. Средний возраст в группе с трубным бесплодием составил 34,3±0,4 года, тогда как при мужской форме бесплодия - 32,8±0,8 года. Однако в группе с трубным фактором бесплодия прослеживается тенденция увеличения доли пациенток старшего репродуктивного возраста по сравнению с группой с мужским фактором бесплодия, которая составила 44,3% (54) и 25% (9) соответственно. Это говорит с одной стороны о поздней обращаемости пациенток за специализированной медицинской помощью по поводу бесплодия, с другой - о длительном неэффективном лечении существующей проблемы.

При изучении характера менструальной функции группы были сопоставимы по возрасту наступления менархе, продолжительности менструального цикла и длительности менструальной кровопотери, что свидетельствует о нормальных параметрах менструального цикла у данных пациенток. В группе с трубной формой бесплодия (ТФ) наблюдались межменструальные кровянистые выделения - 8,2% (10), альгоменорея - 25,4% (31) и диспареуния - 5,7% (7). Данные нарушения у паценток этой группы могут свидетельствовать о наличии воспалительных заболеваний органов малого таза, которые занимают ведущее место среди факторов формирования трубного бесплодия.

При изучении форм и длительности бесплодия было выявлено, что в группе с трубной формой бесплодия превалировало вторичное бесплодие, что составило 74,6% (91), в то время как в контрольной группе (МФ) большинство пациенток имели первичное бесплодие - 52,8% (19) (р<0,05). Для женщин с трубной формой средняя длительность бесплодия составила 7,3±0,4 года, тогда как среди пациенток с мужской формой длительность бесплодия составила 6,1 ±0,7 лет (р<0,05), что

указывает на более раннее обращение за специализированной медицинской помощью данной категории супружеских пар.

При изучении соматического статуса выявлено, что женщины контрольной группы имели самую низкую среднюю частоту встречаемости экстрагенитальной патологии, которая составила 0,7±0,05 из расчета на одну пациентку (р<0,05).

Оценивая репродуктивные характеристики пациенток исследуемых групп с вторичным бесплодием нами выявлено, что группы были сопоставимы по возрасту сексуального дебюта, первой беременности, первых родов, среднему числу беременностей на одну пациентку.

Изучение гинекологического анамнеза исследуемых групп показало, что в группе с ТФ достоверно чаще в 30,3% (37) случаев у пациенток имелись эктопические беременности, послужившие основанием для удаления маточных труб (р<0,05). Доля женщин этой группы, у которых первая беременность закончилась искусственным прерыванием до 12 недель, составила 33% (30), спонтанным самопроизвольным выкидышем - 11% (10) и в 15,4% (14) случаев наблюдалась замершая беременность. Срочными родами первая беременность закончилась у 36,3% (33) пациенток из этой группы, что достоверно меньше, чем в группе с МФ (Р<0,05).

Анализ гинекологического анамнеза в контрольной группе с МФ позволил установить, что в 64,7% (11) случаев первая беременность у пациенток данной группы закончилась срочными родами. Частота артифициальных абортов составила 47,1% (8). Доля пациенток в группе с МФ бесплодия с неразвивающейся беременностью в анамнезе составила 11,8% (2). Самопроизвольных выкидышей у них не наблюдалось.

При изучении структуры гинекологических заболеваний нами была выявлена высокая частота нарушений со стороны репродуктивной системы среди пациенток с трубной формой бесплодия. Воспалительные заболевания органов малого таза с локализацией в придатках наблюдались в 41,8% (51) случаев, хронический эндометрит выявлен и морфологически подтвержден у 55 женщин, что составило 45,1% случаев (р<0,05). Данный факт являлся одним из специфических факторов в развитии трубного бесплодия.

При изучении инфекционных заболеваний в анамнезе у пациенток исследуемых групп нами было выявлено преобладание хламидийной 15,6% (19) и уреаплазменной 14,8% (18) инфекций в группе с ТФ бесплодия.

Таким образом, изучение медико-социального анамнеза пациенток исследуемых групп показал низкий уровень репродуктивного здоровья в группе с трубной формой бесплодия, ограничивающий естественную фертильность.

При выборе схемы индукции суперовуляции в программах ВРТ выявлено сохранение овариальных резервов у 100% пациенток исследуемых групп, поскольку уровень ФСГ у всех пациенток находился в пределах до 8 МЕ/л, уровень эстрадиола - в пределах 80 пг/мл, а среднее число антральных фолликулов на 2-3-й день цикла составило от 8 до 11.

При проведении стимуляции суперовуляции с целью адекватного выбора схемы индукции суперовуляции выделяют несколько вариантов ответа яичника: низкий ответ (до 3 фолликулов), умеренный ответ (4-10 фолликулов) и выраженный ответ (более 10 фолликулов). Овариальный ответ яичников на проводимую индукцию суперовуляции в группах с трубной формой и в контрольной группе нами оценивался как умеренный и выраженный.

При изучении показателей имплантации в зависимости от овариального ответа на индукцию суперовуляции показано, что в группе с трубной формой бесплодия беременность чаще наступает при умеренном ответе яичников 54% (25), а в группе с мужским фактором бесплодия - при выраженном ответе яичников 69% (11), однако данные результаты оказались статистически не значимыми. При низком ответе в исследуемых группах чаще наблюдалось отсутствие имплантации, что подтверждается литературными данными, но в нашем исследовании статистически не подтвердилось.

Во всех исследуемых группах наиболее часто применялся протокол с ант-ГнРГ. Эффективность применяемого протокола стимуляции суперовуляции оценивается качеством полученных ооцитов. При изучении влияния протоколов индукции суперовуляции на качество ооцитов в группе с трубной формой бесплодия выявлено, что наибольшее количество зрелых и наименьшее количество незрелых ооцитов получено при использовании наиболее часто применяемого в данной группе протокола с ант-ГнРГ (р<0,05). Выбор данного протокола в этой исследуемой группе можно считать наиболее приемлемым, учитывая наибольшую долю пациенток старшего репродуктивного возраста по сравнению с другими группами, а также ожидаемый сниженный овариальный резерв и «бедный» ответ у пациенток, перенесших оперативные вмешательства на придатках матки. Одновременно показано, что при использовании протокола с ант-ГнРГ в группе с трубной формой бесплодия можно получить более качественные ооциты, поскольку ант-ГнРГ позволяют сохранить и пролонгировать до преовуляторного периода фолликулы, растущие на фоне введения ГТ, то есть создаются улучшенные условия для созревания преовуляторных ооцитов.

При сравнении зрелости ооцитов и показателей имплантации в исследуемых группах выявлено, что в контрольной группе с мужским фактором бесплодия у забеременевших женщин (в подгруппе Б4) количество зрелых ооцитов было статистически значимо больше по сравнению с группой ТФ - 10,9±1,9 против 6,7±0,6 (р<0,05).

После оплодотворения ооцитов не менее важным моментом в процедуре экстракорпорального оплодотворения является культивирование и развитие качественных эмбрионов, способных к имплантации. Перенос эмбрионов осуществлялся на стадии бластоцисты, которая является наиболее поздней стадией развития зародыша человека, доступной для наблюдения врача-репродуктолога. Контроль за оплодотворением и последующим развитием эмбриона осуществлялся ежедневно. Проводилась оценка дробления, количества и морфологии бластомеров.

При исследовании качества эмбрионов в исследуемых группах получены следующие результаты: всего получено 328 эмбрионов. В группе с трубной формой бесплодия получено 256 эмбрионов, из них высокого качества - 45,3%, среднего — 43,4%, низкого - 11,3%. В контрольной группе с мужским фактором бесплодия получено 72 эмбриона, из них высокого качества - 36%, среднего - 56,9%, низкого — 6,9%.

Во всех группах наибольшее количество эмбрионов было высокого и среднего качества. Процент переносов в группе с трубной формой бесплодия составил 93, а в контрольной группе с мужским фактором - 83. Наиболее низкий процент переносов эмбрионов наблюдался в группе с мужским фактором бесплодия. В большинстве случаев - 50% (3) он был связан с низким качеством полученных ооцитов, в 33,3% (2) с развившимся СГЯ и в 16,7% (1) с торможением пролиферативной активности эндометрия. В группе с трубной формой бесплодия СГЯ являлся причиной отказа в 11,2% (1) случаев, и в равных соотношениях по 44,4% (4) встречались синдром пустых фолликулов и низкое качество полученных ооцитов.

Среднее количество эмбрионов на перенос в исследуемых группах было примерно одинаковым и составило 2,3-2,4, при средней толщине эндометрия 9,6±0,1 мм при трубной форме и 10,7±0,3мм при мужской форме бесплодия.

Качество эмбрионов было сопоставлено с показателями имплантации.

При сравнении качества эмбрионов внутри групп с учетом наступления беременности выявлено, что в группе с трубной формой бесплодия количество эмбрионов с высоким и средним качеством было выше у пациенток с наступившей беременностью в подгруппе Б+, чем с ее отсутствием в подгруппе Б" (р<0,05). В группе с мужской формой бесплодия наблюдалась противоположная ситуация и количество эмбрионов с высоким и средним качеством было выше у пациенток с отсутствием беременности в подгруппе Б" (р<0,05).

Частота наступления беременности на эмбриоперенос в группе с трубной формой составила 39,3%, а в контрольной группе с мужским фактором бесплодия -45,2%.

Полученные результаты свидетельствуют, что, несмотря на большое количество перенесенных эмбрионов высокого и среднего качества при трубной форме и мужской формах бесплодия, имплантации может не наступить ввиду наличия определенных факторов, сдерживающих имплантацию. Это может быть результатом проявления эндотелиальной дисфункции различной степени выраженности, наступившей на фоне стимуляции суперовуляции гонадотропинами.

Осуществляя поиск оптимальных маркеров прогноза имплантации, проводилось изучение уровней маркеров ангиогенеза (СЭФР) и эндотелиальной дисфункции (вРЕСАМИ, эндотелина-1) в сыворотке крови и фолликулярной жидкости пациенток исследуемых групп.

Выявлена прямая корреляционная связь средней силы между содержагшем СЭФР и бРЕСАМ-1 в биологических жидкостях в группе с трубной формой бесплодия (в сыворотке крови г=0,356, р=0,005, в фолликулярной жидкости г=0,407,

р=0,001), и в фолликулярной жидкости в группе с мужской формой бесплодия (г=0,6, р=0,014). Данные результаты указывают на то, что увеличение уровня яРЕСАМ-! в биологической жидкости может являться сигналом к увеличению продукции СЭФР, что запускает механизмы неоангиогенеза при эндотелиальной дисфункции и ограничивает имплантацию.

У женщин с трубной формой бесплодия с наступившей беременностью показатели СЭФР в сыворотке крови находились в интервале от 289 до 433 пг/мл, в то время как у пациенток с отсутствием беременности значения находились в интервале 456-688 пг/мл. У пациенток с трубной формой бесплодия с отсутствием беременности отмечается 1,5 - кратное увеличение содержания СЭФР в сыворотке крови в сравнении с женщинами, имеющими положительные результаты (р<0,01) (рисунок 2).____________

I 700

I 600

| 500 \ 400 I 300

! 200

I

100 I о

572,6*

73,8 £

388,5

112,8 —

111й

5.б1

81,8

п

МФ

О СЭФР сызорогки О СЭФР г фолликулярной жидкости

Рисунок 2 - Уровни сосудистого эндотелиального фактора роста (СЭФР) в фолликулярной жидкости и сыворотке крови в исследуемых группах (пг/мл)

Примечание:* - р<0,01 (сравнение подгрупп в группе с ТФ, критерий Манна-Уитни). Проведенный многофакторный анализ, а именно методы множественной и логистической регрессии показали, что СЭФР в сыворотке крови у пациенток с трубной формой бесплодия может являться значимым предиктором нарушений имплантации (рисунок 3).

Model: Logiatic ragresaon (iogií) У=вхР0 i1288588524553+{-,01 54441196773)*x)/(1+exp(1,1288588524553+(-,0154441196

VarlO

Рисунок 3 - График логистической регрессии в группе ТФ. Влияние уровня СЭФР в сыворотке крови на наступление беременности.

Таким образом, у пациенток с трубной формой бесплодия высокое содержание СЭФР в сыворотке крови является неблагоприятным прогностическим фактором для имплантации. При превышении показателя более 433 пг/мл в сыворотке крови требуется проведение коррекции патологического ангиогенеза с целью улучшения исходов программ ВРТ.

При изучении маркера эндотелиальной дисфункции sPECAM-1 нами выявлено двукратное увеличение его концентрации в фолликулярной жидкости, полученной в периовуляторный период, чем в сыворотке крови во всех исследуемых группах, независимо от формы бесплодия, однако различий в показателях sPECAM-1 в исследуемых группах как в сыворотке, так и в фолликулярной жидкости не обнаружено.Таким образом, sPECAM-1 не может являться индикатором патологического фолликулогенеза в программах ВРТ, однако он маркирует ответ эндотелия сосудов яичника на само применение гонадотропинов.

При исследовании маркера эндотелиальной дисфункции эндотелина-1 у женщин с мужской формой бесплодия с наступившей беременностью его показатели в сыворотке крови находились в интервале от 0,2-1,0 фмоль/мл, в то время как у пациенток с отсутствием беременности значения находились в интервале 1,0-3,4 фмоль/мл (рисунок 4).

|3,5 | 3

Б+ 5- Б* Б-

7® и'Ф

О Зндотелин-1 сыворотки О Эндотелин-1 в фолликулярной жидкости

Рисунок 4 - Уровни эндотелина-1 в фолликулярной жидкости и сыворотке крови в исследуемых группах (фмоль/мл)

Примечание: *- р<0,05 (критерий Манна-Уитни).

У пациенток контрольной группы в сыворотке крови выявлено повышение уровня эндотелина-1 при отсутствии имплантации (р<0,05). Таким образом, можно предположить, что эндотелиальная дисфункция, развившаяся у женщин без значимой патологии органов репродуктивной системы в сочетании с мужским фактором бесплодия, негативно сказывается на процессе имплантации эмбриона в программах ВРТ. При превышении показателя более 1,0 фмоль/мл в сыворотке крови требуется проведение коррекции эндотелиальной дисфункции для улучшения исходов программ ВРТ.

У пациенток, прошедших индукцию суперовуляции в циклах ЭКО, присутствие СЭФР и эндотелина-1 в сыворотке крови и фолликулярной жидкости показывает степень вовлечения эндотелиновой системы в процесс фолликулогенеза человека и имплантации перенесенных эмбрионов. Установлено, что СЭФР и эндотелии-1 являются значимыми предикторами в прогнозе имплантации эмбрионов в программах ВРТ. Разработанные нормативные интервалы содержания маркеров ангиогенеза (СЭФР) и эндотелиальной дисфункции (эндотелин-1) в сыворотке крови позволили обосновать терапию по коррекции эндотелиальной дисфункции в индуцированных циклах, что способствовало увеличению частоты имплантации эмбрионов.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что при трубной форме бесплодия наибольшее количество зрелых ооцитов - 13,3±1,2 получено при проведении индукции суперовуляции по протоколу с использованием антагониста гонадотропин-рилизинг гормона. В контрольной группе с мужским фактором бесплодия у пациенток, получивших

беременность количество зрелых ооцитов было больше по сравнению с группой с трубной формой бесплодия 10,9*1,9 против 6,7±0,6.

2. Применение протокола стимуляции суперовуляции с использованием антагониста гонадотропин-рилизинг гормона позволяет получить эмбрионы высокого и среднего качества при трубной форме бесплодия - 45,3% и 43,4% и при мужской форме бесплодия - 36% и 56,9% соответственно. Эффективность программ ВРТ с учетом переноса качественных эмбрионов составила при трубной форме -39,3%; при мужской форме бесплодия - 45,2%.

3. При трубной форме бесплодия достоверное увеличение уровней СЭФР в сыворотке крови является предиктором неблагоприятного прогноза имплантации эмбрионов в программах ВРТ. Разработанные нормативные показатели уровней СЭФР в сыворотке крови от 289 до 433 пг/мл являются благоприятным прогностическим фактором имплантации эмбрионов, содержание СЭФР в сыворотке крови от 456 до 688 пг/мл является фактором, ограничивающим имплантацию эмбрионов.

4. При мужской форме бесплодия уровень эндотелина-1 в сыворотке крови является предиктором прогноза имплантации эмбрионов в программах ВРТ. При нормативных показателях эндотелина-1 от 0,26 до 1,0 фмоль/мл прогноз имплантации эмбрионов благоприятный, при уровне эндотелина-1 от 1,0 до 3,4 фмоль/мл прогноз имплантации неблагоприятный.

5. Разработанные методические рекомендации по коррекции эндотелиалыюй дисфункции позволили увеличить частоту имплантации эмбрионов в программах ВРТ при трубной форме бесплодия с 35,2% до 39,3%, а в группе с мужским фактором бесплодия с 38,2% до 45,2%.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. У пациенток с трубной формой бесплодия для оценки прогностических факторов в программах ВРТ проводится исследование сыворотки крови, полученной в день аспирации фолликулов с последующим определением в ней уровня СЭФР.

2. У пациенток с мужским фактором бесплодия для оценки прогностических факторов в программах ВРТ проводится исследование сыворотки крови, полученной в день аспирации фолликулов с последующим определением в ней уровня эндотелина-1.

3. Прогпоз имплантации эмбрионов при трубной и мужской формах бесплодия определяется уровнем маркеров ангиогенеза и эндотелиальной дисфункции (таблица 1).

Таблица 1 - Уровни СЭФР и эндотелина-1 в сыворотке крови при различных формах бесплодия в контексте прогноза имплантации_

Форма бесплодия Уровень маркера в сыворотке крови Прогноз имплантации

Трубная СЭФР 289-433 пг/мл высокий

СЭФР 456-688 пг/мл низкий

Мужской фактор Эндотелии-1 0,26-1,0 фмоль/мл высокий

Эндотелии-1 1,0 -3,4 фмоль/мл низкий

4. При трубной и мужской формах бесплодия, выявленные в сыворотке крови уровни СЭФР и эндотелина-1 являются основанием для назначения низкомолекулярных гепаринов после переноса эмбрионов (таблица 2).

Таблица 2 - Показания к назначению низкомолекулярных гепаринов в программах

Форма бесплодия Уровень маркера в Количество Доза применяемого

сыворотке крови фолликулов в низкомолекулярного

яичнике при гепарина*

пункции

Трубная СЭФР <10 Профилактическая

456-688 пг/мл доза при массе тела

Мужской фактор Эндотелии-1 50-90 кг (10-14 дней

1,0-3,4 фмоль/мл после переноса

эмбрионов):

-Надропарин кальций

5700МЕ ежедневно;

- Эноксапарина Na

40мг ежедневно;

Лечебная доза при

массе тела 50-90 ra-

>10 íl 0-14 дней после

переноса эмбрионов):

-Надропарин

кальций

86 ЕД/кг/каждые 12

часов;

- Эноксапарина Na

1 мг/кг каждые 12

часов.

♦Согласно клиническим рекомендациям «Профилактика венозных тромбоэмболических осложнений в акушерстве и гинекологии», 2013г.

Разработанные методические рекомендации применялись в течение 2014 года в центре гинекологической эндокринологии и репродукции «Три сердца», г. Красноярск и позволили увеличить частоту наступления беременности при трубной форме бесплодия с 35,2% до 39,3%, а в группе с мужским фактором бесплодия с 38,2% до 45,2%.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Публикации в ведущих научных рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ:

1. Сыромятникова CA., Герилович Л.А., Базина М.И., Егорова А.Т. Короткий протокол индукции овуляции с антагонистами ГнРГ, клинические исходы при различных формах бесплодия в программах вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) // Проблемы репродукции. - 2013.- №1,- С.62-65.

2. Герилович Л.А., Салмина А.Б., Егорова А.Т., Жирова Н.В. Роль гипергомоцистеинемии в реализации репродуктивных потерь и методы ее коррекции//Акушерство и гинекология. - 2013. - № 4,- С.84-88.

3. Герилович Л.А., Салмина А.Б., Егорова А.Т., Базина М.И., Моргун A.B., Сыромятникова С.А. Роль маркеров ангиогенеза у пациенток с различными формами бесплодия в программах вспомогательных репродуктивных технологий // Проблемы репродукции. - 2013. - №5.- С.60-63.

4. Герилович Л.А., Базина М.И., Егорова А.Т., Моргун A.B., Салмина А.Б. Эндотелии-1 у пациенток с различными формами бесплодия в программах вспомогательных репродуктивных технологий // Медицина и образование в Сибири. -2013,- №6.

5. Герилович Л.А., Базина М.И., Егорова А.Т., Моргун A.B., Тростянская A.B. Эффективность программ вспомогательных репродуктивных технологий в зависимости от качества ооцитов и эмбрионов // Сибирское медицинское обозрение. -2014. - № 2.

Публикации в прочих изданиях:

6. Егорова А.Т., Герилович Л.А. Этические и социальные аспекты вспомогательных репродуктивных технологий // Вестник перинатологии, акушерства и гинекологии - Выпуск 17,- Красноярск, КрасГМУ,- 2011.- С.213-223. i

7. Герилович Л.А., Базина М.И., Егорова А.Т. Значение овариального резерва при стимуляции функции яичников (обзор литературы) // Сборник научных трудов -Актуальные вопросы акушерства и гинекологии,- Красноярск, Версо.- 2013.- С.19-22.

8. Герилович Л.А., Базина М.И., Егорова А.Т., Маисеенко Д.А. Социально-гигиенические аспекты репродуктивного здоровья женщин с трубно-перитонеаяьным фактором бесплодия, вступивших в программу ЭКО // Сборник научно-практических статей, посвященный 55-летию МБУЗ Городская клиническая больница №20 им. И. С. Берзона. - Красноярск, Версо.- 2013,- С.5-6.

9. Герилович Л.А., Салмина А.Б., Егорова А.Т., Базина М.И., Моргун A.B., Сыромятникова С.А. Роль СЭФР в процессе имплантации эмбрионов у пациенток с различными формами бесплодия в программах вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) // Материалы конференции «От эмбриона к человеку». -Новосибирск, 2013. - С. 69-71.

10. Герилович Л.А., Салмина А.Б., Егорова А.Т., Базина М.И., Моргун A.B., Сыромятникова C.A. sPECAM-1 в контексте прогноза имплантации эмбрионов в программах вспомогательных репродуктивных технологий // Материалы конференции «От эмбриона к человеку». - Новосибирск, 2013. - С. 71-72.

аГн-РГ - агонисты Гн-РГ ант-РГ - антагонисты Гн-РГ

ВРТ - вспомогательные репродуктивные технологии

Гн-РГ - гонадотропин-рилизинг гормон

ЛГ - лютеинизирующий гормон

МФ - мужской фактор бесплодия

ПЭ - перенос эмбрионов

рФСГ- рекомбинантный ФСГ

СГЯ - синдром пшерстимулнрованных яичников

СПЯ - синдром поликистозных яичников

СЭФР - сосудисто-эндотелиальный фактор роста

ТФ - трубная форма бесплодия

ФСГ - фолликулостимулирующий гормон

ХГЧ - хорионический гонадотропин человеческий

ЭД - эндотелиальная дисфункция

ЭКО - экстракорпоральное оплодотворение

ЭФ - эндокринный фактор бесплодия

5РЕСАМ-1 — растворимая форма молекулы тромбоцитарно-эндотелиоцигтарной клеточной адгезии.

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

Отпечатано: ООО «Новые компьютерные технологии» г. Красноярск, ул. КМаркса, 62; офис 120; тел.: (391)226-31-31,226-31-11