Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Клеточные механизмы иммунного ответа на вакцину BCG у мышей линии CBA/N-xid

На правах рукописи

003465562

Линге Ирина Андреевна

клеточные механизмы иммунного ответа на вакцину всв у мышей линии сваш-хМ

14.00.36. «Аллергология и иммунология»

автореферат

Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 3 ;.:.'•.?

москва 2009

003465562

Работа выполнена в ГУ Центральном научно-исследовательском институте туберкулеза РАМН.

Научный руководитель:

доктор биологических наук Татьяна Константиновна Кондратьева

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Александр Александрович Ярилин доктор медицинских наук, профессор Михаил Александрович Владимирский

Ведущая организация:

Государственный Научный центр Институт иммунологии ФМБА РФ

Защита состоится «3» 2009г. в 11 часов на заседании

Диссертационного совета Д 001^007.01 при НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН

Автореферат разослан^» сМ'УуЧ 5 2009г.

Ученый секретарь Диссертационного совета Доктор медицинских наук, Профессор

Русакова Е.В.

общая характеристика работы

Актуальность темы. Туберкулез (ТБ) до сих пор является одним из самых распространенных инфекционных заболеваний и остается одной из основных причин гибели людей в мире, что делает проблему его изучения очень актуальной. При соблюдении баланса между собственными защитными реакциями и иммунным ответом хозяина Mycobacterium tuberculosis может, не вызывая реальной болезни, сохранять состояние латентное™ на протяжении всей жизни инфицированного индивида, что и происходит в 90% случаев [Kaufmann S. Н. Е. 2001, Russell D. G. 2007]. С другой стороны, у 10% инфицированных лиц рано или поздно происходит реактивация латентного ТБ. Считается, что возобновление активного размножения микобактерий происходит на фоне снижения иммунитета хозяина. Поскольку реактивация туберкулезного процесса часто сопровождается деструкцией легочной ткани и прорывом очагов в бронхи [Condos R., et.al., 1998], возникают условия для воздушно-капельной передачи микобактерий новым хозяевам.

Основными средствами борьбы с ТБ являются его профилактика, раннее выявление и применение эффективных терапевтических препаратов. Несмотря на массовую вакцинацию детей BCG и тот факт, что устранен дефицит противотуберкулезных препаратов первого ряда, по данным ВОЗ за 2004г. в мире зарегистрировано 14,6 млн. больных ТБ, в том числе 8,9 млн. новых случаев. Ежегодно от ТБ погибает 1,5-2 млн. человек [WHO, 2004, Frieden T.R., et al., 2003]. Создание новых вакцин, которые могли бы снизить заболеваемость ТБ, является приоритетным направлением современной науки. Тем не менее, вакцина BCG до сих пор остается единственной противотуберкулезной вакциной, широко используемой в профилактической медицине. Важно отметить, что способность отвечать на вакцинацию BCG в различных популяциях людей неодинакова. Так, исследования, проведенные в Индии, показали, что массовая вакцинация BCG детей в одном из штатов была неэффективна [Bloom B.R., Fine Р.Е.М., 1994]. По-видимому, одной из возможных причин высокой вариабельности ответа на вакцину BCG могут быть генетически детерминированные различия ответа на вакцинацию в разных популяциях и у разных индивидов, но этот вопрос никогда подробно не изучался. Более того, до недавнего времени не было описано надежных экспериментальных моделей генетических вариаций ответа на вакцину BCG.

Первая подобная модель была предложена лабораторией Иммуногенетики ЦНИИТ РАМН. Ранее было показано, что мыши линии CBA/N-xid, наряду с некоторыми другими инбредными линиями, включая мышей СВА, имеют промежуточную чувствительность к туберкулезной инфекции [Niconenko B.V., et al., 1991]. Однако, у мышей CBA/N, в отличие от мышей СВА, после вакцинации BCG не возникает защиты против последующего заражения вирулентным штаммом М. tuberculosis H37Rv [Niconenko B.V., et al., 1996]. Эти данные позволяют рассматривать мышей линии CBA/N как одну из возможных экспериментальных моделей для изучения генетических вариаций ответа на вакцину BCG. Мыши линии CBA/N отличаются от мышей СВА лишь точковой мутацией xid в гене btk, приводящей в первую очередь, к нарушению дифференцировки В-лимфоцитов. До сих пор остается неизвестным, какие механизмы нарушаются при мутации с преимущественной экспрессией в В-лимфоцитах и влияют на Т-зависимый ответ на вакцину BCG. В связи с этим изучение роли В-лимфоцитов в этом процессе с одной стороны и исследование влияния генетических дефектов В-клеток на формирование Т-клеточного противотуберкулезного иммунитета является актуальной проблемой.

Цель исследования: Изучить особенности иммунного ответа и миграции лимфоидных клеток у мутантных мышей CBA/N и мышей конгенной линии СВА на моделях вакцинации BCG и последующего заражения М. tuberculosis.

Задачи:

1. Охарактеризовать соотношение клеток иммунной системы и продукцию цитокинов при вакцинации BCG и экспериментальной туберкулезной инфекции у мышей CBA/N и СВА.

2. Доказать в экспериментах in vivo наличие связи между функционированием клеток иммунной системы и эффективностью вакцинации BCG методами адоптивного переноса.

3. Исследовать функциональную активность фагоцитов мышей линий CBA/N и СВА in vivo и in vitro.

4. Оценить роль лимфоцитов В-1 в иммунном ответе на BCG и индукции протекгивного противотуберкулезного иммунитета:

5. Исследовать роль нейтрофилов в индукции специфического иммунного ответа при вакцинации BCG мышей CBA/N.

Новизна.

1. Методом переноса клеток костного мозга мышей линии СВА облученным мышам CBA/N впервые показано, что отсутствие способности к вакцинации BCG мышей CBA/N-xid является следствием дефекта клеток иммунной системы.

2. Впервые выявлено, что у мышей CBA/N нарушено формирование Т-клеток с фенотипом CD4+, продуцирующих IFNy - основной зффекторный цитокин, активирующий бактерицидную активность макрофагов.

3. В опытах in vivo впервые показано, что xid-мутация мышей CBA/N способствует тому, что в ответ на введение бактерий BCG нейтрофилы xid мигрируют быстрее и в большем количестве, чем нейтрофилы СВА.

4. Впервые в опытах in vivo продемонстрировано, что лимфоциты В-1, находящиеся в перитонеальной полости мышей СВА, но отсутствующие у мышей CBA/N-xid, тормозят приток нейтрофилов, а не стимулируют его.

5. В опытах in vitro показано, что нейтрофилы мышей CBA/N обладают большей подвижностью, чем нейтрофилы мышей СВА.

6. Впервые исследована динамика экспрессии ключевых хемокинов, участвующих в привлечении нейтрофилов у мышей линии СВА и CBA/N. Показано, что в ответ на введение BCG экспрессия этих факторов носит разнонаправленный характер и коррелирует с динамикой миграции нейтрофилов к месту введения вакцины.

7. Впервые в опытах in vivo показана негативная роль нейтрофилов при вакцинации BCG мышей CBA/N. Элиминация нейтрофилов за сутки до введения BCG восстанавливает способность к вакцинации у мышей CBA/N.

Практическая значимость. Работа носит экспериментальный характер и посвящена фундаментальной проблеме. Учитывая наличие у человека гена гомологичного xid и слабой изученности роли В-кпеток в протективном иммунном ответе при туберкулёзе, полученные данные дают новые представления о механизмах формирования протективного противотуберкулезного иммунитета и о

роли В-клеток в этом процессе. Материалы диссертации используются в курсе лекций для аспирантов и ординаторов ЦНИИТ РАМН.

Апробация работы. Апробация диссертации состоялась 25 декабря 2008 года на научной конференции отдела иммунологии ЦНИИТ РАМН.

Основные положения диссертации были доложены на X Всероссийском научном форуме «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2006), XI Всероссийском научном форуме «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2007), международном симпозиуме "Emerging trends in tuberculosis research: biomarkers, drugs & vaccines" (Нью-Дели, Индия, 2008).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ.

Объем работы. Диссертация изложена на 115 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы (5 глав), материалов и методов исследования, изложения и обсуждения собственных исследований (9 глав), выводов и библиографического указателя, включающего ссылки на 3 отечественные и 160 иностранных работ. Диссертация иллюстрирована 1 таблицей и 23 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Животные. Опыты проводили на мышах инбредных линий СБА и CBA/N-x¡d, поддерживаемых в питомнике ЦНИИТ РАМН в соответствии с требованиями по содержанию животных. В опытах использовали самцов и самок в возрасте 2-4 месяцев. В пределах одного эксперимента использовали животных обоих полов. Экспериментальная туберкулезная инфекция. В работе использовали микобактерии М. tuberculosis штамма H37Rv из коллекции Института Пастера (Франция), которые в препаративных количествах были получены и аликвотированы в лаборатории иммунохимии ЦНИИТ РАМН. Животных заражали внутривенно 5x106 КОЕ/мышь в 0,5 мл PBS в область ретроорбитального синуса [Apt A.S. et al., 1993]. Количество микобактерии в селезенке и легких зараженных мышей определяли путем культивирования серийных разведений гомогенатов легкого и селезенки на чашках Петри с агаром Дюбо. Выживаемость мышей оценивали ежедневно, начиная с 15-ого дня с момента заражения. Вакцинации мышей линий СВА и CBA/N проводили введением BCG подкожно в количестве 2x107 КОЕ/мышь. В эксперименте по исследованию влияния дозы вакцинации вводили также подкожно 2х105 КОЕ/мышь.

Антигены. В качестве антигена в экспериментах использовали соникат -растворимую фракцию разрушенных ультразвуком М. tuberculosis H37Rv. Соникат был получен и любезно предоставлен для исследований Авдиенко В.В. [2006]. Получение суспензии клеток легкого осуществляли по модифицированной методике ферментативного переваривания [Holt et al., 1985; Lyadova et al., 1998]. Получение суспензий клеток селезенки и лимфатических узлов /ЛУ) осуществляли после цервикальной дислокации, извлекая подмышечные, паховые и/или подколенные ЛУ и селезенку, гомогенизировали их в стеклянном гомогенизаторе и центрифугировали (1100 об/мин, 8 мин). При получении суспензий клеток селезенки эритроциты лизировали раствором NH4CI, после чего клетки отмывали 2 раза, переводипи в среду для культивирования и подсчитывали число жизнеспособных клеток с трипановым синим. Суспензию перитонеальных макрофагов получали из перитонеального экссудата (ПЭ) интактных животных. Очистку от немакрофагальных клеток осуществляли адгезией макрофагов на культуральном пластике. Макрофаги переводили из монослоя в суспензию раствором Версена.

Гистопатология. Мышам вводили смертельную дозу барбитурата. Ткань лёгкого из средней правой доли была заморожена в режиме температурного градиента от -60°С до -20°С за 30 мин в электронном криотоме (ThermoShandon, Великобритания). Серийные срезы толщиной 8 мкм высушивали на воздухе в течение 1 часа и фиксировали в метаноле 10 мин. Далее срезы были окрашены гематоксилином и эозином и заключены в гистологическую заливку (ThermoShandon). Стёкла со срезами фотографировали при увеличении х150 (микроскоп Olympus ВНТ, фотокамера Nikon Coolpix 990).

Получение костномозговых химер. Мышей реципиентов облучали в дозе 950 рад из источника 60Со. Полученную суспензию клеток КМ переносили в PBS и вводили мышам-реципиентам в/в в количестве 20 млн./мышь. Последующие вакцинацию или заражение проводили через 2 месяца после введения клеток КМ. Перенос клеток эмбриональной печени проводили по методу, описанному Wardemann et al., 2002, после чего вводили их в/в в количестве 20 млн/мышь. Последующую вакцинацию проводили через 4 недели после введения клеток ЭП. Удаление нейтрофилов осуществляли введением антител анти-LyeG аХВК-1А5 в ПП (100 мкг/мышь) за сутки до вакцинации животных, изотипический контроль -антитела lgG2b к вирусу картофеля. Эффективность удаления нейтрофилов in vivo в периферической крови оценивали на проточном цитофлуориметре.

Фагоцитоз микобактерий перитонеальными макрофагами. Суспензию перитонеальных макрофагов переносили в лунки 24-луночного плейта (по 3,5*105 кл/лунку) и инкубировали 60 мин в среде RPMI, содержащей 2% FCS. К сформированным монослоям макрофагов добавляли: суспензию М. tuberculosis H37Rv (Pasteur) или BCG (Pasteur) в соотношениях 1:1, 5:1 или 10:1 MOI (multiplicity of infection) на 18 часов. Затем фиксировали и окрашивали макрофаги, содержащие микобактерии ауромином (Giemsa) и смесью азура и эозина. Затем микроскопически проводили подсчет бактерий внутри макрофагов. Фагоцитарный индекс рассчитывали по формуле ФИ=(£фагоцитир. бакт.)/(£фагоцитир. макроф.). Получение Т-линий. Иммунные клетки подколенных ЛУ мышей СВА и CBA/N отмывали, переводили в полную культуральную среду и инкубировали в концентрации 2x106 клеток/мл в присутствие 10 мкг/мл сониката H37Rv 24-луночном плейте (Costar) 10-14 дней при 37°С и 5% С02 [Pichugin A.V., et al., 1998]. Живые клетки выделяли из собранных культур центрифугированием на градиенте Lympholyte М с плотностью 1,088 г/см3 (Cebarlane, Канада) при 2500 g (20 мин, 23°С) и дважды отмывали. В следующем цикле стимуляции культивировали 2х105/мл полученных клеток в культуральном матрасе в присутствие сингенных АПК селезенки, обработанных митомицином С (1,5x106), и сониката H37Rv в течение 9-11 дней. Такие циклы стимуляции и отдыха повторялись до тех пор, пока клетки либо не погибали, либо не начинали расти как стабильная Т-клеточная линия.

Определение количества клеток, продуцирующих IFNy, в легких после иммунизации BCG и заражения М. tuberculosis H37Rv определяли с помощью двух методов в соответствии с рекомендациями фирмы-изготовителя. При использовании метода ELISPOT (PharMingen) количество пятен в лунках подсчитывали с помощью ELISPOT ридера (BioReader 4000 Pro-X, BIO-SYS). В случае определения методом IFNy secretion assay (MiltenyiBiotec, MACS) число лимфоцитов, продуцирующих IFNy, определяли с помощью проточного цитофлуориметра (см. ниже).

Постановку пролиферативных тестов проводили в 96-луночных плоскодонных плейтах (Costar) (Apt A.S., et al., 1991). Активированные свежевыделенные клетки подколенных ЛУ или готовые Т-линии (1, 2, 3 и 4x105 кпеток/лунку) культивировали in vitro в присутствие АПК (спленоциты - 3x105, клетки перитонеального эксудата - 1x104) и сониката H37RV или бактерий BCG в полной культуральной среде. Клетки культивировали в течение 48 часов в С02-

инкубаторе при 5% СОг и 37°С. На последние 18 часов культивирования в лунки вносили 0,5 мкКи [3Н]-тимидина. Затем содержимое лунок переносили на фильтры из стекловолокна с помощью полуавтоматического харвестра (Scarton, Норвегия). Включение радиоактивной метки регистрировали на жидкостном сцинтилляционном счетчике (Wallac, Франция).

Анализ клеток методом проточной цитофлуорометрии. Пробы, содержащие по 5x105 клеток, окрашивали моноклональными антителами anti-CD4, anti-CD8, anti-CD19, anti-CD44, anti-CD62L, anti-Ly6G, anti-F4/80, anti-IFNy меченными FITC, РЕ, PerCP и APC в соответствии с рекомендациями фирм-производителей (BDPharmingen, Caltag, eBioscience, MiltenyiBiotec). Анализ клеток проводили на проточном цитофлуориметре FACS Calibur (Beckton Dickenson). Выделениа суммарной РНК из суспензии клеток и получение кДНК. Для выделения тотальной РНК использовали 1,5-5х106 клеток при помощи набора SV Total RNA Isolation System (Promega, США) в соответствии с рекомендациями фирмы изготовителя. Для получения кДНК проводили обратную транскрипцию 2мкг тотальной РНК с помощью обратной транскриптазы M-MLV (Promega, США), согласно инструкции производителя. Для того чтобы обратная транскрипция проходила только с мРНК, в качестве праймеров использовали oligo(dT)i5. Определение продукции цитокинов и хемокинов клетками методом ПЦР в реальном времени. С помощью полуколичественного ПЦР в реальном времени (TaqMan® с использованием зондов, несущих двойную метку) оценивали транскрипцию генов цитокинов, хемокинов и транскрипционных факторов в различных субпопуляциях клеток, для чего использовали различные праймеры (ABI) и 2xPCR Master Mix Probe Assay (EGT Group). Уровень экспрессии сравнивали с экспрессией housekeeping-генов с постоянным уровнем экспрессии - GAPDH и актина. Анализ проводили на приборе ¡Cycler (Bio-Rad). Статистическую обработку результатов проводили по методу Стьюдента (t-тест). Полученные данные обрабатывали с помощью программы Excel (Microsoft Office).

результаты исследования

Мыши линии CBA/N отличаются от конгенной линии СВА точечной мутацией xid в гене btk, кодирующем тирозиновую киназу Брутона [Berning А.К. et al., 1980]. Животные обеих линий обладают относительной устойчивостью к первичной туберкулезной инфекции. Однако вакцинация мышей линии CBA/N

Mycobacterium bovis BCG в меньшей степени защищает их при последующем заражении вирулентным штаммом М. tuberculosis H37Rv по сравнению с мышами линии СВА [Никоненко Б. и соавт., 1990, Nikonenko В. et al., 1996]. Мутантный ген btk экспрессируется преимущественно в B-лимфоцитах, нарушая их дифференцировку и многие функции [Mano Н., et al., 1999]. Вместе с тем, иммунный ответ при ТБ, в основном осуществляют Т-лимфоциты и макрофаги [Hanekom W.A., et al., 2007]. Необходимо выяснить, почему нарушение в системе B-клеток влияет на Т-зависимый иммунный ответ при ТБ.

1. Влияние мутации xid на клеточный состав органов зараженных животных.

На первом этапе исследований предварительно вакцинированных мышей линий СВА и CBA/N-x¡d заражали внутривенно М. tuberculosis H37RV в летальной дозе 5x106 КОЕ. Через 1, 2 и 3 недели у трёх мышей из каждой группы выделяли легкие и оценивали клеточный состав полученных органов.

Через 1 неделю после заражения количество Т-лимфоцитов CD4+ в легких предварительно вакцинированных мышей исследуемых линий практически одинаково и составляет 16-20% от лимфоидных клеток. Активированные клетки с фенотипом CD44h'CD62Ll0 среди них составляют 60-70%. Через 3 недели после заражения число Т-лимфоцитов CD4+ в легких животных возрастает до 55%, 95% из которых являются активированными. При этом число Т-лимфоцитов CD8+ в легких животных обеих линий постепенно уменьшается от 75 до 15%. Количество B-лимфоцитов в легких зараженных мышей линии СВА увеличивается от 4,5% на первой неделе до 10% на третьей неделе после заражения. При этом у мышей линии CBA/N количество B-лимфоцитов остается неизменным и составляет примерно 2±0,4% на всех сроках после заражения.

Таким образом, мы получили данные, которые свидетельствуют о том, что после заражения в легкие вакцинированных мышей линий СВА и CBA/N мигрирует практически одинаковое количество Т-лимфоцитов CD4+. Число активированных клеток при этом среди них так же совпадает.

2. Оценка числа Т-лимфоцитов CD4+, продуцирующих IFNy в легких вакцинированных мышей после заражения.

Принято считать, что IFNy является цитокином, играющим одну из главных ролей при защите от ТБ [Flynn J.L., Chan J., 2001]. IFNy, секретируемый лимфоцитами CD4+, активирует макрофаги и индуцирует их бактерицидную

активность. Мы исследовали число Т-лимфоцитов CD4+, продуцирующих IFNy в разных группах мышей СБА и CBA/N. Как видно из рисунка 1а, вакцинация BCG не вызывает появления различий в количестве лимфоцитов CD4+, продуцирующих этот цитокин в легких. Напротив, через 3 недели после заражения в легких вакцинированных мышей СВА зарегистрировано больше Т-лимфоцитов CD4+, продуцирующих IFNy, чем у мышей линии CBA/N (рис. 16). При этом у контрольных невакцинированных зараженных микобактериями животных обеих линий разницы в количестве подобных клеток не наблюдалось (рис. 16). Таким образом, показано, что у мышей СВА в 5-6 раз больше Т-лимфоцитов CD4+, продуцирующих IFNy, чем у мышей CBA/N. Эти различия проявляются только после заражения экспериментальных животных М. tuberculosis на фоне вакцинации. При оценке динамики изменения количества клеток CD4+ IFNy+ в легких вакцинированных животных в течение трех недель после заражения показано, что у мышей линии CBA/N таких клеток меньше на всех сроках и к третьей неделе разница становится очень значительной (данные не приведены).

б)

а)

Ф 2000

О 1800

Sé U 1600

О 1400

ц 1200

х 1000

к 600

О 600

н 0) 400

5 200 0

frl

И 25000 §20000 *15000

l-ioooo

£ 5000 \

® О J

ríi

Я

■ без антигена

! DIO мкг/мп сониката ; H37Rv

П п

СВА BCG

CBA/N CBA/N BCG

СВА

СВА CBA/N CBA/N BCG BCG

Рис. 1. В легких вакцинированных мышей СВА после заражения больше Т-лимфоцитов С04+, продуцирующих 1РЫу.

Таким образом, мы показали, что у вакцинированных мышей линии СВА с нормальным содержанием В-лимфоцитов после заражения в легких обнаруживается большее количество лимфоцитов СР4+, продуцирующих 1РЫу, чем у мышей СВАМ.

3. Зависимость эффективности вакцинации мышей СВАМ-хШ от дозы вводимой ВСв.

Существуют данные, предполагающие, что доза антигена, длительность его присутствия в организме и иммуногенность крайне важны для успешного формирования клеток памяти [Оийоп Р. \Л/., е{ а!., 1998]. В связи с этим мы решили

ВСв. Кроме того, было интересно выяснить, необходимы ли функциональные В-лимфоциты для эффективного ответа на вакцинацию. Чтобы попытаться ответить на этот вопрос мы использовали несколько подходов.

4.1. Влияние переноса костного мозга мышей СВА мышам СВМЫ на восстановление их способности к вакцинации.

В экспериментах, описанных в пункте 2.2, мы получили, что в ходе развития туберкулезной инфекции у вакцинированных мышей линии СВА/Ы в легких меньше Т-клеток С04+, продуцирующих цитокин 1ЫРу, чем у мышей СВА. Кроме того, генетически у них меньше В-лимфоцитов. Данные литературы о функциональной активности в других клетках, помимо 8-лимфоцитов, носят противоречивый характер. В связи с этим, мы решили перенести лимфоидные клетки СВА мышам СВА/М, в качестве источника которых был использован костный мозг (КМ) мышей СВА.

Заменив Т-клетки и восстановив недостающие В-лимфоциты мышей СВА/М, удается возобновить их способность к вакцинации. Кроме того, в этом эксперименте мы получили ответ на вопрос о вкладе в имеющийся феномен клеток неиммунной системы. Поскольку перенос КМ мышей СВА восстанавливает способность к вакцинации мышей СВА/М, то дефект х1с1 выражен только в клетках иммунной системы (данные не приведены).

4.2. Влияние переноса клеток эмбриональной печени мышей СВА мышам СВА/Ы на восстановление их способности к вакцинации.

Ранее показано, что у мышей СВА/Ы уменьшено количество всех В-лимфоцитов, а клеток В-1а в плевральной и перитонеальной полости вообще не обнаруживается [№гепс1гап А., е! а1., 1993]. Мы исследовали роль В-клеток и, в частности, В-1а, в формировании протективного иммунитета на антигены микобакгерий. Считается, что основным источником лимфоцитов В-1а является эмбриональная печень (ЭП). Мы также попытались восполнить дефицит клеток В-1а у мышей СВА/Ы. Для этого выделяли клетки ЭП мышей СВА на 16-17 день внутриутробного развития и вводили их в/в мышам линий С ВАМ и СВА.

Вакцинацию и заражение животных проводили стандартным способом через 4 недели после введения клеток ЭП. Изменение состояния мышей оценивали по бактериальной нагрузке в легких и селезенке и динамике гибели подопытных животных. Как показано на рис. За и 36 бактериальная нагрузка в легких и селезенке мышей СВА/М снижается до уровня мышей конгенной

проверить, не является ли выбранная нами доза для вакцинации избыточной, что может приводить к нарушению образования функциональных клеток памяти.

Для проверки этой гипотезы мы брали мышей обеих линий и вакцинировали их ВСЭ в двух дозах, стандартной - 2x107, и пониженной - 2x105 КОЕ на мышь. Затем всех животных заражали внутривенно стандартным способом. Мы оценивали способность к вакцинации по продолжительности жизни зараженных животных. Как показано на рис. 2, для мышей линии СБА эффект оказался прямо пропорциональным, т.е. чем выше доза вводимой вакцины, тем дольше они выживают при последующем заражении. Однако для мышей линии СВА/Ы доза вакцинации не имела значения. В обоих случаях средняя продолжительность жизни вакцинированных и зараженных животных была одинакова.

СВА CBA/N

Кроме того, можно предположить, что у мышей CBA/N вакцина быстрее выводится из организма, что препятствует индукции эффективного протективного иммунитета. Для исследования этого предположения мы оценивали персистенцию BCG в органах мышей СВА и CBA/N. Показано, что через 5 недель после вакцинации количество микобактерий не отличается и составляет в селезенке 66.7±26.7 и 120±48.2 КОЕ, а в лимфатических узлах 440±46.2 и 220±100 КОЕ у мышей линий СВА и CBA/N соответственно. Таким образом, предположение о снижении способности к вакцинации, связанной с различным временем персистенции BCG у мышей СВА и CBA/N не подтвердилось.

4. Роль B-лимфоцитов в формировании иммунного ответа на туберкулезную инфекцию.

Считается, что в иммунном ответе на микобактериальные антигены, в основном участвуют Т-лимфоциты и макрофаги. Однако мутация xid приводит, преимущественно, к нарушению дифференцировки и функций B-лимфоцитов. В связи с этим встает вопрос, почему же мутация клеток, не играющих особой роли при ТБ, мешает формированию полноценного иммунного ответа при вакцинации

80

Рис. 2. Эффективность вакцинации мышей СВА/М не зависит от дозы вводимой ВСС.

линии. Продолжительность жизни вакцинированных зараженных мышей CBA/N, которым вводили клетки ЭП СВА, увеличивается, по сравнению с контрольными животными (рис. Зв).

а) 6)

О 10 20 30 40 50

день после заражения

Рис. 3. Внутривенное введение клеток ЭП СВА мышам восстанавливает их способность отвечать на вакцинацию ВСв.

CBA/N

Таким образом, восстановление только В-лимфоцитов у мышей линии CBA/N приводит к тому, что они становятся чувствительными к вакцинации BCG и формируют полноценный иммунный ответ на микобактериальные антигены.

4.3. Оценка способности мышей линии CBA/N формировать протективный иммунный ответ, при вакцинации соникатом микобактерий.

Следующим вероятным объяснением отсутствия вакцинного эффекта у мышей CBA/N было возможное нарушение презентация микобактериальных антигенов В-клетками. Показано, что иммунный ответ на пептиды меньше зависит от присутствия В-лимфоцитов [Constant S. L., et al., 1995, Rivera A., et al., 2001]. В связи с тем, что вакцинация дефектных по В-кпеткам мышей линии CBA/N целыми бактериями оказалась не эффективной, мы проверили способность сониката микобактерий индуцировать протективный эффект у экспериментальных животных.

а)

б)

12

0

Е ю Í 8

1 6

5 4

й о

В)

I.

M.tb. son+M.tb

120 100 80 60 40 20 о

Ъ

50

¿40

i 30

i 20 о

g 10 -I

§ oí

i

□ CBA ■ CBA/N

-CBA ■ CBA/N -CBA son CBA/N son

0 100 200 300

время после заражения (дни)

Рис. 4. Мыши линии CBA/N вакцинируются соникатом микобактерий.

Для этого в качестве вакцины был использован соникат, полученный с помощью ультразвука из бактерий М. tuberculosis H37RV. Животных исследуемых линий вакцинировали соникатом в неполном адъюванте Фрейнда (НАФ) подкожно (10 мкг/мышь), после чего заражали в/в стандартным способом. Протективный эффект иммунизации оценивали по уровню бактериальной нагрузки в легких и селезенке через 3 недели после заражения, а также по выживаемости животных. На рисунке 4а и 46 показано, что после заражения вакцинированных соникатом мышей линии CBA/N, число микобактерий в легких и селезенке уменьшается по сравнению с контрольными животными. Продолжительность жизни этих животных достоверно увеличивается и становится одинаковой у мышей линий СВА и CBA/N (рис. 4в). Таким образом, показано, что присутствие В-лимфоцитов не обязательно для формирования вторичного иммунного ответа на растворимые микобактериальные антигены.

Итак, мы показали, что В-лимфоциты необходимы для формирования полноценного иммунного ответа при вакцинации мышей целыми бактериями BCG. Вместе с тем, иммунизация растворимыми антигенами микобактерий мышей линии CBA/N, с дефицитом В-клеток, способствует защите этих животных при последующем заражении туберкулезом.

5. Влияние мутации xid на функции макрофагов.

В настоящей работе показано, что мыши линии CBA/N способны формировать полноценный иммунный ответ при вакцинации растворимыми антигенами, но не целыми бактериями. Пептиды гораздо проще фагоцитируются АПК, для них не требуется процессинг, а, следовательно, их проще презентировать Т-клеткам. Ген btk экспрессируется не только в В-лимфоцитах, но и в макрофагах [Mukhopadhyay S. et al., 1999, Mukhopadhyay S. et al., 2002]. Макрофаги играют одну из ключевых ролей при ТБ - они являются профессиональными АПК, а, кроме того, непосредственно вызывают гибель микобактерий [Flynn J.L., Chan J., 2001]. Следовательно, макрофаги фагоцитируют антигены для их дальнейшей презентации. В связи с этим мы исследовали влияние мутации xid на способность макрофагов к фагоцитозу.

Для определения фагоцитарной активности клеток in vitro мы выделяли перитонеальные макрофаги, помещали их в 24-луночный плейт в количестве 3,5x105 кл./лунку. Затем добавляли к ним бактерии BCG в соотношениях 1/1, 5/1 и 10/1 MOI на 18 часов. Эффективность фагоцитоза микобактерий макрофагами оценивали, проводя подсчет окрашенных бактерий внутри макрофагов с помощью флуоресцентного микроскопа. Во всех случаях фагоцитарный индекс (ФИ) макрофагов не отличался и составлял 2,1±0,05 и 2,2±0,10 для мышей СВА и CBA/N соответственно. Для определения фагоцитирующей способности макрофагов in vivo мы вводили бактерии BCG (10е КОЕ/мышь) в перитонеальную полость мышей линий СВА и CBA/N на 2 часа. Затем проводили подсчет фагоцитированных бактерий в выделенных клетках с помощью микроскопа. Макрофаги мышей СВА и CBA/N фагоцитировали бактерии BCG in vivo с одинаковой эффективностью (ФИ=8,1±0,35 и ФИ=8,7±0,31, соответственно).

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что экспрессия мутантного гена xid в макрофагах CBA/N не влияет на их способность фагоцитировать микобактерии.

6. Оценка влияния мутации xid на способность макрофагов презентировать антиген Т-лимфоцитам.

Как описано в предыдущем разделе, АПК (макрофаги) мышей линий СВА и CBA/N с одинаковой эффективностью фагоцитируют целые микобактерии. В связи с этим следующим шагом стала проверка эффективности презентации антигенов микобактерий Т-лимфоцитам. Это предположение возникло также и

вследствие того, что мыши линии CBA/N эффективно вакцинируются соникатом микобакгерий, презентировать который гораздо проще, чем целые бактерии. Для проверки антигенпрезентирующей функции макрофагов мы исследовали способность этих клеток индуцировать пролиферативный ответ специфических Т-клеток обеих исследуемых линий мышей in vitro.

В качестве АПК мы использовали клетки перитонеального эксудата (КПЗ), нагруженные бактериями BCG in vivo. Для этого мы выделяли КПЭ через 2 часа после введения бактерий BCG (108 КОЕ/мышь) в перитонеальную полость (ПП) мышей обеих линий. Эффективность презентации BCG оценивали по пролиферации специфических Т-линий СБА и CBA/N в ответ на стимуляцию КПЭ, нагруженными бактериями BCG.

Рис. 5. Клетки перитонеального эксудата мышей линии CBA/N не способны стимулировать специфические Т-лимфоциты к пролиферации.

Количество APC (х 104)

Как видно из рисунка 5, КПЭ мышей СВА, нагруженные бактериями BCG, эффективно стимулируют пролиферацию Т-лимфоцитов мышей обеих линий. Напротив, КПЭ мышей CBA/N не способны активировать специфические к микобактериальным антигенам клетки Т-линий ни СВА, ни CBA/N.

7. Особенности миграции нейтрофилов мышей линий СВА и CBA/N-xid.

Следующий раздел работы посвящен выяснению причин того, почему КПЭ мышей CBA/N с BCG оказались не способны активировать специфические Т-лимфоциты. Это кажется особенно важным, так как полученные в предыдущем разделе данные могут иметь непосредственное отношение к исследуемому нами феномену отсутствия вакцинного эффекта BCG у мышей CBA/N.

На первом этапе мы исследовали, какие именно клетки были выделены из брюшной полости через 2 часа после введения BCG. Оказалось, что среди КПЭ мышей CBA/N через 2 часа после введения микобактерий примерно 70% составляют нейтрофилы, а на макрофаги приходится лишь 30%. Напротив, у мышей линии СВА через 2 ч после введения антигена наблюдается противоположная картина. Нейтрофилы составляют лишь 26%, а макрофаги

12000 10000 2 8000 о 6000 4000 2000

-КПЭ СВА + Т-кл. СВА

КПЭ CBA/N + T-кл. СВА

О КПЭ CBA/N + Т-кл.

соответственно 74% (данные не приведены). Таким образом, у мышей CBA/N мы выделяли КПЗ, большую часть которых составляли нейтрофилы, которые при добавлении в культуру in vitro быстро погибали, а не презентировали антиген Т-лимфоцитам. Таким образом, полученный нами результат отражает не свойство макрофагов различных линий по-разному презентировать BCG, а показывает, что у мышей CBA/N через 2ч после введения бактерий BCG мигрируют преимущественно нейтрофилы, тогда как у мышей СВА мы обнаруживаем в основном макрофаги.

В следующей серии экспериментов мы исследовали динамику миграции нейтрофилов в ПП мышей обеих линий в ответ на введение микобактерий BCG. Для этого мы вводили бактерии BCG в ПП мышей обеих линий, после чего через 45, 90, 135, 180 и 225 минут выделяли КПЗ и морфологически оценивали клеточный состав полученной популяции. На рис.б показано, что через 45 мин после введения BCG количество нейтрофилов в ПП мышей обеих линий одинаково и составляет примерно 5%. Однако уже через 90 минут видны межлинейные различия в составе КПЗ. На этот срок у мышей CBA/N нейтрофилы составляют уже 66%, в то время как у мышей линии СВА этих клеток по-прежнему не более 5-6%. Через 135 мин. после введения бактерий у мышей CBA/N нейтрофилы составляют уже 75%, а у СВА - 25%. К 3,5 часам после введения бактерий количество нейтрофилов в ПП мышей СВА и CBA/N постепенно выравнивается и составляет 85-95%. Таким образом, показано, что в ответ на введение BCG у мышей СВА и CBA/N наблюдается абсолютно разная динамика мигрирации нейтрофилов к месту введения BCG.

Рис. 6. Нейтрофилы мышей линии СВА/Ы быстрее мигрируют в ПП в ответ на введение ВСБ.

Единственное отличие в клеточном составе ПП мышей СВА и СВА/Ы -отсутствие лимфоцитов В-1 у последних. В связи с этим мы попытались выяснить, влияют ли эти клетки на динамику миграции нейтрофилов в ответ на введение ВСС. Для этого за сутки до введения ВСв в ПП мышей СВА/Ы переносили неприлипающие КПЗ мышей СВА, среди которых присутствовали и В-лимфоциты. Как видно на рис.7, перенос неприлипающих КПЗ СВА мышам СВА/Ы приводит к

тому, что после введения BCG нейтрофилы мышей обеих линий мигрируют в ПП с одинаковой скоростью. Таким образом, скорость миграции нейтрофилов в ответ на введение бактерий BCG зависит от присутствия лимфоцитов В-1.

Рис. 7. Перенос перитонеальных лимфоцитов мышей СВА мышам CBA/N приводит к выравниванию скорости миграции нейтрофилов мышей обеих линий в ответ на введение BCG.

45 135 180 минуты

Роль В-клеток в миграции нейтрофилов мы попытались определить в опытах in vitro. Для этого была использована система Transwell, позволяющая оценивать миграцию нейтрофилов. Мы сравнивали спонтанную миграцию нейтрофилов СВА и CBA/N (в нижней камере «трансвела» содержалась только культуральная среда) и миграцию в ответ на присутствие лимфоцитов. Нейтрофилы были получены из ПП мышей обеих линий через 18 часов после введения пептона. На этот срок нейтрофилы составляли примерно 90% от всех КПЭ (данные не приведены). В нижнюю камеру помещали различные количества неприлипающих лимфоцитов, выделенные из ПП мышей СВА. На рис. 8 показано, что при добавлении неприлипающих клеток мышей СВА в нижнюю камеру «трансвела» нейтрофилы CBA/N мигрируют быстрее, чем нейтрофилы СВА. Кроме того, видно, что спонтанная подвижность нейтрофилов CBA/N, без добавления неприлипающих лимфоцитов, также выше (рис. 8а). Интересно, что добавление бактерий BCG в нижнюю камеру не влияло на скорость миграции нейтрофилов (рис. 86).

Таким образом, полученные нами данные показали, что нейтрофилы CBA/N обладают большей подвижностью in vivo и in vitro. Весьма важным фактом, полученным в этой серии экспериментов является то, что in vivo наличие В-лимфоцитов в ПП мышей СВА приводит к меньшей миграции туда нейтрофилов в ответ на введение BCG. Вместе с тем в опытах in vitro показано, что добавление В-клеток в нижнюю камеру «трансвел» стимулирует миграцию нейтрофилов обеих линий. Кроме того, оказалось, что спонтанная миграция нейтрофилов CBA/N также выше, чем СВА.

О 250000 X

■9" 200000

п.

>1 150000

О

X

О 100000 ь

3 50000

I rll

чистая лимфоциты лимфо<1иты пкмфоциты среда 3x10*5 0,6x10*5 0,12x10*5

•fr 200000 -а

»5 150000

Ii

чистая лимЗоцтты лиифх^пы iMMffotpnw среда Зх10"5 0,е*10"5 0.12x10*5

Рис. 8. Нейтрофилы мышей линии CBA/N обладают большей подвижностью, чем СВА in vitro.

8. Оценка экспрессии генов хемокинов, участвующих в миграции нейтрофилов.

На следующем этапе мы исследовали кинетику экспрессии генов некоторых цитокинов и хемокинов, таких как цитокин G-CSF, рецептора к G-CSF, а также СХС хемокинов КС и MIP-2, участвующих в привлечении нейтрофилов. Для этого через 45, 90 и 180 минут после введения BCG выделяли КПЗ мышей линий СВА и CBA/N с последующим выделением РНК. После этого ставили реакцию ПЦР в реальном времени для определения динамики экспрессии генов этих факторов. За ноль был принят уровень экспрессии генов этих факторов в КПЗ интактных мышей СВА. На рис.9 показано, что у мышей СВА и CBA/N различается исходный уровень экспрессии генов всех исследуемых факторов. У мышей CBA/N исходный уровень экспрессии генов G-CSF, хсг1 и КС ниже, а уровень экспрессии гена MIP-2 такой же, как у мышей СВА. Через 45 минут после введения в ПП BCG у мышей линии CBA/N наблюдается резкое увеличение уровня экспрессии G-CSF, хсг1 и КС (рис. 9 а, б, в). Вместе с тем у мышей линии СВА на этот срок наблюдается противоположная картина. Несмотря на исходно более высокий уровень экспрессии этих факторов, через 45 минут после введения BCG, их экспрессия падает. Тем не менее, к истечению трех часов после введения BCG, уровень экспрессии генов всех перечисленных факторов в клетках мышей обеих линий становится примерно одинаковым. Экспрессия этих факторов коррелирует с динамикой притока нейтрофилов в ПП мышей линий СВА и CBA/N в ответ на введение BCG.

а)

б)

20 -

G-CSF

12 8

Xcrt

200

-15

время после введения BCG, минуты

-16 J

время после введения BCG, минуты

В)

Г)

15 т КС

MIP7

эи iUu тли

J время после введения 8CG, минуты

10 i.

100 150 200

-«- CBA/N

СБА

О 50 100 150 200

время после введения BCG, минуты

Рис.10. Экспрессия различных цитокинов и хемокинов клетками перитонеального эксудата мышей линий СВА и CBA/N.

9. Эффект удаления нейтрофилов у мышей CBA/N к моменту вакцинации BCG на последующее заражение М. tuberculosis.

Считается, что нейтрофилы крайне необходимы для борьбы с инфекцией на ранних сроках, т.к. они фагоцитируют микобактерии, а затем индуцируют воспалительную реакцию. Однако существуют различные мнения относительно того, способствует ли это защите от инфекции [Fulton S.A., et al., 2000]. Мы показали, что нейтрофилы мышей CBA/N быстрее мигрируют в ответ на введение бактерий BCG. В связи с этим возникло предположение, что более быстрый приток нейтрофилов при вакцинации BCG мышей CBA/N может способствовать снижению эффективности вакцинации. Нейтрофилы фагоцитируют бактерии BCG, но не являются профессиональными АПК. Таким образом, больший приток нейтрофилов в место введения BCG у мышей CBA/N в первые часы после вакцинации может приводить к захватыванию значительного количества антигена и, следовательно, изоляции его от профессиональных АПК. В связи с этим мы решили поставить следующий эксперимент.

Мы предположили, что кратковременное удаление нейтрофилов к моменту вакцинации у мышей СВАЛ\1 может способствовать более эффективному взаимодействию профессиональных АПК с ВСв и формированию иммунного ответа и клеток памяти. Для этого за 1 сутки до вакцинации мышам СВА/М в/б вводили по 100 мкг антител к Ьубв (изотипический контроль - антитела 1дС2Ь к вирусу картофеля). Такое воздействие приводит к элиминации нейтрофилов к моменту введения ВСй на 99% (данные не приведены). Вакцинацию и заражение мышей проводили стандартным способом. Влияние удаления нейтрофилов на эффективность вакцинации оценивали по бактериальной нагрузке в легких и селезенке через 3 недели после заражения. На рис. 10 показано, что у мышей СВА/М, у которых удалили нейтрофилы к моменту вакцинации (группа 1_у60) снижается число КОЕ в легких (рис. 10а) и селезенке (рис. 106) через 3 недели после заражения.

Таким образом, в данном разделе работы мы показали, что кратковременное удаление нейтрофилов к моменту введения ВСй приводит тому, что у мышей СВА/М восстанавливается способность к вакцинации.

а) б)

без антител иэотиП№тешй amrn-Ly6G без антител roomtweciuw aHm-Ly6G

KOHTpOJb контротъ

Рис. 11. Удаление нейтрофилов у мышей CBA/N к моменту введения BCG приводит к эффективной вакцинации.

Выводы.

1. Многократные отличия между мышами СВА и CBA/N по количеству продуцентов IFN-y в легких появляются только после заражения М. tuberculosis животных, но не на фазе вакцинации BCG.

2. Отсутствие ответа на вакцинацию BCG мышей линии CBA/N зависит преимущественно от функционирования клеток иммунной системы, поскольку перенос клеток костного мозга СВА облученным мышам

CBA/N восстанавливает их ответ на вакцинацию BCG. Перенос клеток эмбриональной печени - предшественников В-лимфоцитов - от мышей СВА необлученным мышам CBA/N также компенсирует дефект вакцинации.

3. Макрофаги, полученные от мышей линий СВА и CBA/N, с одинаковой эффективностью фагоцитируют бактерии BCG. Различия между носителями аллелей мутантного и дикого типа не связаны с фагоцитозом.

4. В отличие от живой вакцины BCG, мыши CBA/N эффективно вакцинируются растворимыми антигенами микобактерий (соникатом), введенными с адъювантом.

5. При использовании в качестве АПК клеток перитонеапьного экссудата, нагруженных in vivo BCG, клетки мышей СВА эффективно представляют антигены микобактерий Т-клеткам, тогда как АПК от мышей CBA/N - нет.

6. При исследовании динамики миграции клеток в перитонеальную полость после введения BCG оказалось, что нейтрофилы мышей линии CBA/N-xid мигрируют быстрее и в большем количестве по сравнению с нейтрофилами СВА. Эти данные подтверждены в системе Transwell.

7. Перенос клеток перитонеальной полости от мышей СВА мышам CBA/N приводит к полному выравниванию скорости миграции нейтрофилов после введения BCG.

8. Динамика экспрессии ключевых хемокинов G-CSF, хсг1 и КС, участвующих в привлечении нейтрофилов, у мышей СВА и CBA/N носит разнонаправленный характер и коррелирует с динамикой миграции нейтрофилов.

9. Удаление нейтрофилов у мышей CBA/N с помощью специфических антител за 1 сутки до введения BCG приводит к достоверному повышению эффективности вакцинации.

РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Батурина И.А., 2006. «Восстановление способности к вакцинации BCG у

мышей CBA/N xid», тезисы доклада на конференции «Актуальные вопросы

клинической и экспериментальной медицины». Санкт-Петербург.

2. Батурина И.А., Кондратьева Т.К., Апт А.С., 2006. «Роль лимфоцитов В-1 при вакцинации BCG мышей СВА/N-XID», доклад на конференции «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге».

3. Кондратьева Т. К., Рубакова Э. И., Линге И.А., Апт А.С., 2007. «Введение вакцины BCG PER OS в сочетании с ревакцинацией ДНК-вакцинами: новый подход противотуберкулезной вакцинации», тезисы доклада на конференции «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге»

4. Линге И .А., Петровская С. Н., Рубакова Э. И., Апт А.С., Кондратьева Т. К., 2007. «Оценка влияния мутации xid мышей CBA/N на фагоцитирующую способность макрофагов». Новейшие технологии в эпидемиологии, диагностике, профилактике и лечении больных туберкулезом и других заболеваний легких, Сборник материалов научно-практической конференции молодых ученых, посвященный Всемирному дню борьбы с туберкулезом, 2007, стр.:61-64.

5. Линге И.А., Рубакова Э. И., Апт А.С., Кондратьева Т. К., 2007. «Почему мутация В-клеточной тирозинкиназы Btk отменяет Т-зависимый эффект вакцины BCG: исследование механизмов», тезисы доклада на конференции «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге»

6. Е. I. Rubakova, S. N. Petrovskaya, А. V. Pichugin, V. S. Khlebnikov, D. N. McMurray, E. V. Kondratieva, Baturina I А, Т. K. Kondratieva and Alexander S. Apt, 2007. «Specificity and efficacy of dendritic cell-based vaccination against tuberculosis with complex mycobacterial antigens in a mouse model», Tuberculosis, 87:134-144.

7. Kondratieva Т.К., E. I. Rubakova, Linge I A, Majorov K.B., Apt A.S., 2008. "Xid-mutation in CBA/N mice leads to alteration in neutrophil/macrophage migration and abrogates protectivity of BCG vaccination", доклад на международном симпозиуме "Emerging trends in tuberculosis research: biomarkers, drugs & vacines".

8. Линге И .А., Рубакова Э.И., Шепелькова Г.С., Апт А.С., Кондратьева Т.К., 2009. «Исследование роли В-клеток в формировании противотуберкулезного иммунитета». Проблемы туберкулеза и болезни легких (Москва), 2: 62-64.

Подписано в печать:

25.02.2009

Заказ № 1629 Тираж - 80 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Актуальность проблемы.

Туберкулез (ТБ) до сих пор является одним из самых распространенных инфекционных заболеваний и остается одной из основных причин гибели людей в мире, что делает проблему его изучения очень актуальной. При соблюдении баланса между собственными защитными реакциями и иммунным ответом хозяина Mycobacterium tuberculosis может, не вызывая реальной болезни, сохранять состояние латентности на протяжении всей жизни инфицированного индивида, что и происходит в 90% случаев [Kaufmann S. Н. Е. 2001, Russell D. G. 2007]. С другой стороны, у 10% инфицированных лиц рано или поздно происходит реактивация латентного туберкулеза. Считается, что возобновление активного размножения микобактерий происходит на фоне снижения иммунитета хозяина. Поскольку реактивация туберкулезного процесса часто сопровождается деструкцией легочной ткани и прорывом очагов в бронхи [Condos R., et al., 1998], возникают условия для воздушно-капельной передачи микобактерий новым хозяевам, что имеет первостепенное значение для выживания популяции возбудителя. Эволюционная стратегия паразитизма микобактерий, по-видимому, сочетает медленно текущий инфекционный процесс (обеспечивает длительную жизнь каждой отдельной бактериальной популяции) и неизбежную реактивацию некоторой небольшой доли латентных популяций (обеспечивает горизонтальную передачу). На сегодняшний момент такое сочетание представляет собой неразрешимую в медицинском аспекте проблему.

Основными средствами борьбы с туберкулезом является его профилактика и применение эффективных терапевтических препаратов. Несмотря на массовую вакцинацию детей В CG и тот факт, что в основном устранен дефицит противотуберкулезных препаратов первого ряда, по данным ВОЗ за 2004 г. в мире зарегистрировано 14,6 млн. больных ТБ, в том числе 8,9 млн. новых случаев. Смертность от ТБ составляет 1,5 - 2 млн. в год [WHO, 2004, Frieden T.R., et al., 2003]. Можно выделить три основные группы факторов, оказывающих неблагоприятное влияние либо на эпидемическую обстановку, либо на частоту перехода латентной инфекции в активную форму, либо сразу на оба параметра.

Во-первых, это социально-экономические факторы, среди которых выделяются существенное увеличение частоты миграции из неблагополучных по ТБ регионов, недостаток белкового питания, алкоголизм, бездомность и лекарственная иммуносупрессия [Corbett L., Raviglione М. 2005]. Во-вторых, - это широкое распространение и постоянно растущее разнообразие штаммов патогенных микобактерий, устойчивых к антибиотикам. К этой категории относятся штаммы, резистентные к одному - двум препаратам, к нескольким препаратам первого ряда (MDR-штаммы) и ко многим препаратам первого и второго ряда (XDR-штаммы) [Espinal М. A., et al., 2001, Migliori G. В., et al., 2007]. Наконец, в-третьих, на частоту ТБ с клиническими проявлениями существенно влияет пандемия ВИЧ-СПИД [Corbett Е. L., et al., 2003]; так, из 1,7 млн. умерших от ТБ в 2004 г. около 250 тыс. человек были инфицированы ВИЧ [WHO, 2004]. Таким образом, неблагоприятное влияние на ситуацию оказывают факторы, связанные как с паразитом, так и с хозяином, и все они имеют глобальное распространение и практически не поддаются эффективному контролю.

Для повышения эффективности борьбы с туберкулезом ведется работа в двух основных направлениях. Во-первых, разрабатываются новые лекарственные средства. Во-вторых, продолжаются попытки создать новые вакцины, которые могли бы снизить частоту заболеваемости туберкулезом. Тем не менее, вакцина BCG до сих пор остается единственной используемой на практике противотуберкулезной вакциной. Считается, что вакцинация BCG наиболее эффективна против туберкулезного менингита и детских форм милиарного туберкулеза. Важно отметить, что способность отвечать на вакцинацию BCG в различных популяциях людей неодинакова. Так, исследования, проведенные в Индии, показали, что массовая вакцинация детей BCG в одном из штатов была неэффективна

Bloom B.R., Fine P.E.M., 1994]. По-видимому, одной из важных возможных причин высокой вариабельности ответа на вакцинацию BCG могут быть генетически детерминированные различия ответа на вакцинацию в разных популяциях и у разных индивидов, но этот вопрос никогда подробно не изучался. Более того, до недавнего времени не было описано надежных экспериментальных моделей генетических вариаций ответа на вакцину BCG.

Первая подобная модель была предложена нашей лабораторией. Ранее было показано, что мыши линии CBA/N, наряду с некоторыми другими инбредными линиями, включая мышей СВА, имеют промежуточную чувствительность к туберкулезной инфекции [Niconenko B.V., et al., 1991]. Однако, у мышей CBA/N, в отличие от мышей СВА, после вакцинации BCG не возникает защиты против последующего заражения вирулентным штаммом М. tuberculosis H37Rv: среднее время выживания после заражения вакцинированных и невакцинированных мышей CBA/N одинаково [Niconenko B.V., et al., 1996]. Эти данные позволяют рассматривать мышей линии CBA/N как одну из возможных экспериментальных моделей для изучения генетических вариаций ответа на вакцину BGG. Мыши линии CBA/N отличаются от мышей СВА лишь точковой мутацией xid в гене btk, приводящей в первую очередь, к нарушению дифференцировки В-лимфоцитов. Однако эти данные не давали ответа на вопрос о том, какие именно клеточные механизмы, влияющие на Т-зависимый ответ на вакцину, нарушаются при мутации с преимущественной экспрессией в B-лимфоцитах. В связи с этим изучение роли В-лимфоцитов в вакцинном процессе с одной стороны и исследование влияния генетических дефектов B-клеток на формирование Т-клеточного противотуберкулезного иммунитета является актуальной проблемой.

Цель исследования: Изучить особенности иммунного ответа и миграции лимфоидных клеток у мутантных мышей CBA/N и мышей конгенной линии СВА на моделях вакцинации BCG и последующего заражения М. tuberculosis.

Задачи:

1. Охарактеризовать соотношение клеток иммунной системы и продукцию цитокинов при вакцинации BCG и экспериментальной туберкулезной инфекции у мышей CBA/N и СВА.

2. Доказать в экспериментах in vivo наличие связи между функционированием клеток иммунной системы и эффективностью вакцинации BCG методами адоптивного переноса.

3. Исследовать функциональную активность фагоцитов мышей линий CBA/N и СВА in vivo и in vitro.

4. Оценить роль лимфоцитов В-1 в иммунном ответе на BCG и индукции протективного противотуберкулезного иммунитета.

5. Исследовать роль нейтрофилов в индукции специфического иммунного ответа при вакцинации BCG мышей CBA/N.

Новизна.

1. Методом переноса клеток костного мозга мышей линии СВА облученным мышам CBA/N впервые показано, что отсутствие способности к вакцинации BCG мышей CBA/N-xid является следствием дефекта клеток иммунной системы.

2. Впервые выявлено, что у мышей CBA/N нарушено формирование Т-клеток с фенотипом CD4+, продуцирующих IFNy — основной эффекторный цитокин, активирующий бактерицидную активность макрофагов.

3. В опытах ш vivo впервые показано, что xid-мутация мышей CBA/N способствует тому, что в ответ на введение бактерий BCG нейтрофилы xid мигрируют быстрее и в большем количестве, чем нейтрофилы СВА.

4. Впервые в опытах in vivo продемонстрировано, что лимфоциты В-1, находящиеся в перитонеальной полости мышей СВА, но отсутствующие у мышей CBA/N-xid, тормозят приток нейтрофилов, а не стимулируют его.

5. В опытах in vitro впервые показано, что нейтрофилы мышей CBA/N обладают большей подвижностью, чем нейтрофилы мышей СВА.

6. Впервые исследована динамика экспрессии ключевых хемокинов, участвующих в привлечении нейтрофилов у мышей линии СВА и CBA/N. Показано, что в ответ на введение BCG экспрессия этих факторов носит разнонаправленный характер и коррелирует с динамикой миграции нейтрофилов к месту введения вакцины.

7. Впервые в опытах in vivo показана негативная роль нейтрофилов при вакцинации BCG мышей CBA/N. Элиминация нейтрофилов за сутки до введения BCG восстанавливает способность к вакцинации у мышей CBA/N.

Практическая значимость. Работа носит экспериментальный характер и посвящена фундаментальной проблеме. Учитывая наличие у человека гена гомологичного xid и слабой изученности роли В-клеток в протективном иммунном ответе при туберкулёзе, полученные данные дают новые представления о механизмах формирования протективного противотуберкулезного иммунитета и о роли В-клеток в этом процессе. Материалы диссертации используются в курсе лекций для аспирантов и ординаторов ЦНИИТ РАМН.

выводы.

1. Многократные отлнчня между мышами СВА и CBA/N по количеству продуцентов IFN-y в легких появляются только после заражения М. tuberculosis животных, но не на фазе вакцинации BCG.

2. Отсутствие ответа на вакцинацию BCG мышей линии CBA/N зависит преимущественно от функционирования клеток иммунной системы, поскольку перенос клеток костного мозга СВА облученным мышам CBA/N восстанавливает их ответ на вакцинацию BCG. Перенос клеток эмбриональной печени - предшественников В-лимфоцитов - от мышей СВА необлученным мышам CBA/N также компенсирует дефект вакцинации.

3. Макрофаги, полученные от мышей линий СВА и CBA/N, с одинаковой эффективностью фагоцитируют бактерии BCG. Различия между носителями аллелей мутантного и дикого типа не связаны с фагоцитозом.

4. В отличие от живой вакцины BCG, мыши CBA/N эффективно вакцинируются растворимыми антигенами микобактерий (соникатом), введенными с адъювантом.

5. При использовании в качестве АПК клеток перитонеального экссудата, нагруженных in vivo BCG, клетки мышей СВА эффективно представляют антигены микобактерий Т-клеткам, тогда как АПК от мышей CBA/N — нет.

6. При исследовании динамики миграции клеток в перитонеальную полость после введения BCG оказалось, что нейтрофилы мышей линии CBA/N-xid мигрируют быстрее и в большем количестве по сравнению с нейтрофилами СВА. Эти данные подтверждены в системе Transwcll.

7. Перенос клеток перитонеальной полости от мышей СВА мышам CBA/N приводит к полному выравниванию скорости миграции нсйтрофилов после введения BCG.

8. Динамика экспрессии ключевых хемокинов О-СЭР, хсг1 и КС, участвующих в привлечении нейтрофилов, у мышей СВА и СВАТЫ носит разнонаправленный характер и коррелирует с динамикой миграции нейтрофилов.

9. Удаление нейтрофилов у мышей СВА/Ы с помощью специфических антител за 1 сутки до введения ВСО приводит к достоверному повышению эффективности вакцинации.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Мыши CBA/N-xid отличаются от мышей конгенной линии СВА точечной миссенс-мутацией в гене btk [Berning А.К. et al., 1980]. Мутация приводит к нарушению дифференцировки В-лимфоцитов, снижению их общего числа, полному отсутствию у мутантов популяции клеток В-1, а также к нарушению гуморального иммунного ответа [Satterthwaite А. В., and Witte О. N., 1996, Satterthwaite А. В., et al., 1997]. Помимо В-клеток, киназа Btk синтезируется в макрофагах, нейтрофилах и ДК [Quek L.S. et al., 1998, Setoguchi R., 1998, Mukhopadhyay S., et al., 2002, Mangla A. et al., 2004], но мутация xid не слишком сильно отражается на их функциях. Ранее было показано, что у мышей CBA/N, в отличие от мышей СВА, после вакцинации BCG не возникает защиты против последующего заражения вирулентной М. tuberculosis. Более того, этот дефект не был связан со способностью В-клеток представлять микобактериальные антигены Т-клеткам [Nikonenko et al., 1996], поэтому оставалось непонятным, почему мутация, затрагивающая преимущественно В-клеточиый иммунитет влияет на Т-зависимый иммунный ответ на вакцину BCG. В данной работе мы оценили вклад различных популяций клеток иммунной системы, несущих ген btk, на формирование протективного иммунного ответа против М. tuberculosis после вакцинации BCG.

На первом этапе исследования мы проверили, действительно ли между мышами двух линий имеются различия по функциональным показателям, зависящим от активности Т-клеток. Исследование продукции ключевого в противотуберкулезном иммунитете цитокина IFN-y Т-лимфоццтами показало, что многократные отличия между мышами СВА и CBA/N по количеству продуцентов IFN-y в легких появляются только после заражения животных, но не на фазе вакцинации (Рис. 8). Отсюда следует вывод о влиянии мутации на формирование Т-клеточной иммунологической памяти. Дополнительно было показано, что дефект мышей линии CBA/N зависит только от функционирования клеток иммунной системы, а не от элементов стромы, поскольку перенос клеток костного мозга СВА облученным мышам CBA/N-xid восстанавливает их ответ на вакцинацию BCG (Рис. 11). Кроме того, перенос клеток ЭП (предшественников В-лимфоцитов) от мышей СВА необлученным мышам CBA/N также компенсирует дефект (Рис. 13). Таким образом, восстановление популяции В-лимфоцитов у мышей CBA/N приводит к тому, что они приобретают способность отвечать на вакцинацию BCG. Этот факт, однако, не объясняет, какую же роль играют В-клетки в формировании протективного иммунного ответа при вакцинации.

Следующим шагом стало изучение влияния мутации xid на функции других клеток иммунной системы, в частности, макрофагов. Мы установили, что макрофаги, полученные от мышей двух линий, с одинаковой эффективностью фагоцитируют бактерии BCG (Рис. 15). Убедившись, что различия между носителями аллелей мутантного и дикого типа не связаны с фагоцитозом, мы проверили, не отличаются ли макрофаги мышей двух линий по способности представлять микобактериальные антигены Т-клеткам. На этом этапе исследований был получен важный факт. Оказалось, что мыши CBA/N эффективно вакцинируются растворимыми антигенами микобактерий (соникатом), введенными с адъювантом (Рис. 14). Такое отличие между эффектом введения цельных микобактерий и растворимых антигенов, с одной стороны, заставило задуматься над проблемой процессинга BCG, а с другой стороны, потребовало переноса тест-системы в условия in vivo, поскольку опыты in vitro с В-клетками и макрофагами не выявили различий между мышами двух линий [Nikonenko et al., 1996].

Для получения АПК in vivo мышам двух линий вводили BCG в брюшную полость и через 2 часа забирали КПЭ и использовали их в качестве АПК для активации специфичных к соникату линий Т-клеток. Оказалось, что полученные таким методом АПК мышей СВА вполне эффективно представляют антигены микобактерий Т-клеткам, тогда как АПК от мышей CBA/N совершенно не способны их активировать (Рис. 17).

Простая проверка клеток экссудата на жизнеспособность показала, что АПК CBA/N, взятые через 2 часа после введения BCG, практически полностью погибли, тогда как АПК СВА, в основном, живы. Эти данные заставили предположить, что сверх быстро погибающие клетки - это нейтрофилы, которые почему-то преобладают в экссудате мышей CBA/N. Важно отметить, что нейтрофилы - это еще один тип клеток, в которых синтезируется киназа Btk.

При исследовании динамики миграции клеток в перитонеальную полость после введения BCG оказалось, что нейтрофилы мышей линии CBA/N-xid мигрируют быстрее и в большем количестве (Рис. 18). Более того, как раз через 2 часа после введения вакцины межлинейные различия достигают максимальных значений, и в экссудате мышей CBA/N преобладают нейтрофилы, а у мышей СВА — моноциты и лимфоциты. В связи с этим возникло и было проверено предположение, что лимфоциты В-1, которые есть у мышей СВА, но отсутствуют у мышей CBA/N, сами по себе, или взаимодействуя с макрофагами, являются фактором подавления миграции нейтрофилов. На это указывали и результаты опытов in vivo, в которых перенос клеток перитонеальной полости от мышей СВА мышам CBA/N приводил к полному выравниванию скорости миграции нейтрофилов после введения BCG (Рис. 19). В опытах in vitro по миграции нейтрофилов через мембрану в системе Transwell, мы показали, что нейтрофилы с мутацией xid значительно превосходят нейтрофилы дикого типа по скорости миграции (Рис. 20.). Таким образом, нам удалось установить, что разница в составе клеток, мигрирующих к месту введения вакцины BCG, объясняется особой подвижностью мутантных нейтрофилов. Учитывая, что киназа Btk принимает участие в сигнальных путях, связанных с движением клеток [Guinamard R. et al., 1998, Chen F. et al., 2000], наши результаты могут быть напрямую связаны с подобной активностью.

Тем не менее, в системе Transwell нам не удалось воспроизвести эффект подавления миграции нейтрофилов какими-либо клетками мышей СВА. Более того, оказалось, что присутствие в нижней камере тест-системы различных клеток мышей СВА лишь усиливает миграцию нейтрофилов (Рис. 20). Учитывая, что в опытах по переносу in vivo клетки СВА вполне эффективно отменяли ускоренную миграцию нейтрофилов CBA/N (Рис. 19), следует сделать вывод, что макрофаги и (или) лимфоциты дикого типа подавляют миграцию нейтрофилов опосредовано, возможно, воздействуя на клетки эпителия полостей или эндотелия сосудов.

Мы предполагаем, что у мышей CBA/N при вакцинации могут происходить следующие события. При вакцинации BCG к месту введения очень быстро мигрируют нейтрофилы и фагоцитируют значительную часть BCG. Однако сами нейтрофилы не являются эффективными АПК, поэтому создается эффект изоляции бактерий от профессиональных АПК - макрофагов. Это препятствует активации Т-клеток и формированию полноценного иммунного ответа на самых ранних фазах. Напротив, у мышей СВА значительная доля BCG попадает сразу в макрофаги, мигрирующие к месту введения без отставания от нейтрофилов.

Безусловно, и у мышей CBA/N макрофаги могут фагоцитировать нейтрофилы с содержащимися в них бактериями, однако этот путь не приводит к тем же последствиям, что прямой фагоцитоз BCG. Показано, что фагоцитоз апоптотических нейтрофилов, содержащих бактерии BCG, приводит к повышенному синтезу макрофагами PGE2 (простагландин Е2) и TGF-pi (transforming growth factor pi). В свою очередь, эти блокирующие воспаление факторы вызывают снижение собственной бактерицидной активности макрофагов (D'Avilla Н., et al., 2008). Кроме того, повышенный уровень PGE2 приводит к снижению Т-клеточного ответа [Hsueh et al., 1979, Hines et al., 1995]. Таким образом, большое число нейтрофилов, мигрирующих в место введения BCG, может не только изолировать бактерии от АПК, но и мешать активации макрофагов. Ключевым подтверждением отрицательной роли нейтрофилов при формировании ответа на вакцину BCG стали опыты по элиминации нейтрофилов in vivo. Удаление нейтрофилов путем введения блокирующих антител за сутки до вакцинации мышей CBA/N (Рис. 22) привело к достоверному повышению эффективности вакцинации BCG. что выразилось в 7-кратном снижении количества вирулентных микобактерий в легких и селезенке после заражения подопытных животных по сравнению с контрольными животными, которым вводились антитела другой специфичности (рис. 23).

Суммируя полученные результаты, мы можем утверждать, что неоднократно отмечавшаяся отрицательная роль нейтрофильного воспаления при внутриклеточных инфекциях [Eruslanov Е.В., et al., 2005, Keller С., et al., 2006], нашими результатами распространяется и на вакцинацию против этих инфекций.