Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Изучение биологической активности иммунорегуляторных факторов печени

министерство здравоохранения и мелиш1нскор промышленности

российской федерации

ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГНЧЕСКОП АКТИВНОСТИ ИКНУНОРЕГУЛЯТОРНЬК ФАКТОРОВ ПЕЧЕНИ

14.00.36 - Аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ИНСТИТУТ ИММУНОЛОГИИ

€

На правах рукописи

КАЗАНСКИЙ

Дмитрий Борисович

Москза, 1994

Работа выполнена а Институте иимунологнн Иинздравиедпрома РФ

Научный руководитель: член-корреспондент АЕН, доктор медицинских наук, и[.офессор

Н.Г.АР1ШИ0ВИЧ

Официальные оппоненты: академик АЕН, дохтор медицинских наук» профессор А.А.ЯРИЛИН

член-корреспондент АЕН, доктор биологических наук, профессор

В.Я.АРИОН

Ведущая организация: Институт Оиоорганическоп химии им. И.И.Пемякина н 0.А.Овчинникова

на заседании диссертационного совета Д 071.09.01 при Институте иммунологии Минздравмедпроиа РФ по адресу: 115478 г. Москва, Каширское шоссе д.24 к.2-

С диссертацией мохно ознакомиться а библиотеке Института иммунологии Минздравмедпроиа РФ.

Автореферат разослан м "__1994 г.

Заоита состоится

час

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

Л.С.Сеславнна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблеиа

В деятельности иммунной системы участвуют различные регуляторные процессы, в которые вовлекаются клетки и структурные компонента различны,; органов и тканей. Печень - комплесныя орган с • очень пироким функционально метаболическим npoi. тем - также связана с неспецифическими биологичес-ими и специфическими икмунными защитными реакциями организма. Это вытекает из следующих положения.

1. В пренатальном и раннем постнатальном онтогенезе печень выполняет гемопоэтические функции, что поззоляет ..редположить сохранение некоторых из них у взрослого организма и их взаимосвязь р процессами иммуногенеза, такими, как. внетимусная дифференцировка Т-клеток (Metealf О., Moore И.А.S., 1971; Miltner I. et al., 1986);

2. В состав печени, помимо гепатоцитов, входят макрофаги, или купферовские клетки, способные выполнять антигенпрезенткрующую Функцию и продуцировать ряд иммунорегуляторных цитокинов и медиаторов Hotz М. et al., 1989); 3, Структурные элементы печени -гепатоциты - способны про-уцировать медиаторы воспаления и иммунитета, участвующие в регуляции адгезии лимфоцитов, неятросилоз и моноцитов на эндотелии и их трансэндотелиальноя миграции в лимфоидные органы и очаги воспаления; 4. Под влиянием медиаторов воспаления и иммунитета (ИЛ-1, ИЛ-б, опухолевый некротический фактор - ОНФ и др. I гепатоциты продуцируют белки острой фазы воспаления (ОФБ), которые являются факторами высококомплексноя гоыеостатическоя реакции организма, направленной на его защиту от патогенных агентов и различных чужеродных компонентов (Ganapathl M.K. et al,, 1968); 5. При* различных заболеваниях печени, а также в условиях экспериментальных воздействия на орган (искусственная ишемия, частичная гепатэктомия, отравление гепатотропными ядами) наблюдаются скоординированные изменения иммунного статуса организма {Cerella G. et al., 1988); б. Аллотрансплантация печени редко приводив к. острому отторжению органа, а при слабых различиях по МНС часто наблюдается индукция специфической толерантности !Kamada N., 1985); 7. В 1968 году' Н.Г.Арцимович и H.H.Настоящей выявлена возможность индукции специфической толерантности, при введении экспериментальным животным водно-солевых экстрактов и частично очищенных антигенов печени (Н.Г.Арцимович и др., 1969; Н.Г.Арцимович и др., 1992). Этот ЭФфект может быть связан с продукцией в печени ряда иммуносупрессорных медиаторов.

ыли могут быть как уже известные кммуносупрессорные- медиаторы, такие как паратмшзин-а„ аргиназа и TGF р. IHaritos A.A. et al.» 1965; Wang S.R. et al.» 1990:, Kingsley D-.M... 199-4> так и не идентифицированные ране? иммунорегуляторные шлекуды Ш.Ни Настоящая* и др., 1976; Л-Б. Казанский и др., 1994; Kazansky et al.» 1992 >

Таким образом. целью настоящего исследования является выделение, изучение биологической активности к идентификация конкретных биологически активных молекул; печени» игравших роль о иммунорегуляции.

Основные задачи исследованиям

1. Изучение биологической активности комплекса водорастворишх иммунорегуляторных факторов печени в иммунологических тестах 1 уровня. Выявление адекватных методов -тестирования биологической активности.

2. Получение, определение молекулярной массы, и комплексное изучение биологической активности фракция, содержащих эндогенные-иммунорегуляторные факторы печени.

3. Очистка и физико-химическая. характеристика нов их иммунорегуляторных биологически активных молекул: лечен». Получение к ним поликлональных антител.

Научна» новизна

впервые установлено, что иммуносупрессорные фзкторы. пачек», подавляющие развитие локальной РТПХ у шаей» локализуются do Фракциях с молекулярной массой 70 и 10 кДа.

Впервые установлено, что иммунорегуляторные факторы печени с молекулярной массой 70 кДа стимулируют антителообразованиа la vivo, стимулирует дифференцировку пре-Т клеток костного шзга lo vitro; регулирует пролиферацию, созревание, ыигр-чию и гибель, внутритимусных Т-лимфоцитов; подавляют реакцию Т-кдетоа на митогены; индуцируют кратковременное (в течение 2-6 часов) перераспределение форменных элементов крови, выражающееся в снижении числа Thy 1~ лимфоцитов и в увеличении числа неитрофшаэв; а также вызывают гибель клеток тимомы EL-i in vitro.

Впервые выделены и охарактеризованы два мммунорегулятосшлх Фактора печени - ИСФ-70 и ИСФад. Оба фактора отличаются.- адеau at.

Яруга по органяоя локализации. термос чбильности, хроматографическим характеристикам и антигенным эпитопам. По структуре - это полипептидные гетеродимеры, отличающиеся от ' описанных воспалительных и ингибиторнык цитокикоз, хемоаттрактивных медиаторов и ингибиторных полипе ггмдов печени.

Практическая значимость: Полученные результаты соответствуют концепции о функциональной ьзаимосвязи печени с иимунноя системой, а такжэ свидетельствуют об участии имчунорегулягорннх факторов печени в регуляции пролиферации, созревания, миграции и внутритимусноя селекции Т-лимфоцитов. Выделение и характеристика биологических эффектов двух новых форм иммунорегулягорных факторов печени открывает перспективы исследования новых механизмов регуляции адгезионных взаимодействия клеток иммунной системы, а также программированной клеточной гибели трансфоршрб,. анных клонов Т-лимфоцитов. Выделение и возможность и }.wyi ю хи ми ч е с кои идентификации отде >ных полипептняных цепей обоих факторов создают прочную основу, для определения N-концевых последовательностей аминокислот, скрининга библиотек кДНК, клонирования• генов и получения этих Факторов в форме рекомбиналтних продуктов.

Положения, викоеммке на завитуг

1. В печени мьшея присутствуют эндогенные водорастворимые икмунорегуляторные факторы.

2. Иммуносупрессорные факторы печени, подавляющие локальную РТПХ > мышей, локализуются во Фракциях с Мг 70 и 10 кДа.

3.. Иммунорегуляторные факторы печени мышей с Мг 70 кДа действуют н£ целыяч ряд процессов иммуногенеза, включая антителообразоваиие, дифференцировку . пре-Т-клеток костного мозга; пролиферации, созревание, миграцию и гибель внутритимусных Т-лимфоцитов; миграция лимфоцитов и неятрофилов, а так-® вызывают апоптот клеток чмоча EL-4 in vitro.

4. Выделены и охарактеризованы два. иммунорегуляторных фактор?

печени с Мг 70 кДа - ИСФ-70 и ИСФ-нп. К ним получены поликлональные антитела. Оба фактора отличаются друг от друга по органноя локализации, термостабильности, хроматографическим хаг-ктеристикам и антигенным эпитопам По своей структуре оба выделенных фактора отличатся от описанных воспалительных и ингибиторных цитокинов, хемоаттрактивных медиаторов и ингибиторных полипептидов печени.

Апробация работы: Материалы работы были доложены и обсуждены на конкурсах райот молодых ученых Института иммунологии МЗ СССР (Москва, 1990 и 1991 гг.), 1 Всесоюзном съезде иммунологов (Сочи, 1959 г.), 1 Съезде иммунологов Белоруссии (Минск, 1990 г.), 1 Международном конгрессе неяроиммунологов (Иерусалим, 1991 г.), Всероссийской съезде хирургов (Ростов-на-Дону, 1991 г.), 1 Съезде иммунологов России (Новосибирск, 1992 г.), заседании Ученого совета НИИ канцерогенеза ОНЦ РАМН (Москва, 1994 г.), заседании секции Ученого совета Института иммунологии МЗ РФ (Москва, 1994 г.>

Публикации:

По теме диссертации опубликовано 11 работ, в том числе б -статьи в рецензируемых научных журналах.

Объем и структура диссертации: Диссертация изложена на 204 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, главы, посвяценноя описание материалов и методов исследования. А глав собственных исследования, сопровожденных заключениями, выводов и указателя литературы. Библиография включает 176 источников, в том числе 47 отечественных и 129 зарубежных. Работа содержит 46 таблиц и 14 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материг^ы и методы исследования Исследования проведены на 3000 мышей линий СБА, С57В1/6, (СБА х С37В1){^ , "АКН разведения питомников <Рёутово> и «Столбовая». В работе также использованы

мыши С57В1/6 и их мутанты по молекуле гистосовместимости 2 класса bml2 разведения вивария ОНЦ РАМН (любезно предоставлены лабораторией механизмов регуляции иммунитета НИИ канцерогенеза ОНИ РАМН, .зав. лаб. профессор Б.Д-Брондз). Ти. эктомированные мыши С57В1/6 любезно предоставлены лабораторией молекулярной иммунологии НИИ физико-химической медицины (зав. лаб., чл.-корр. РАЕН В.Я.Арион). Для получения поликлональных антисывороток и отбора комплемента с . низкой спонтанной цитолитическоя активностью использовано, 65 кроликов породы «Шиншилла».

Для получения биологически активных фракция печени использованы стандартные методы ультрацентрифугирования, t-ель-фильтрации на сефадексах G-100 и G-200, ионообменной Хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе и КМ-сефадексе и гидр-, ^бноя хроматографии на Toyopearl HV-60 в обратном градиенте сульфата аммония.. С целью определения степени гетерогенности полученных препаратов и иммунохиммческся идентификации иммунорегуляторных Ьолипептидов печени к ним получали поликлональные кроличьи антитела. На заключительных стадиях очистки использовали йммуноаффинную хроматографию на Сефароэе CL-6B с иммобилизованной Иериодатным методом IgG-фракцией иммунных сывороток.

Для определения степени гетерогенности полученных фракция попользовали методы двойной иммунодиффузии по Оухтерлони, Мммуноэлектрофореза» СДС-злектроФореза и последующего Иммуноферментного окрааивания блотов . на мембранах из нитроцеллюлозы. Для определения концентраций белка в исследуемых Фракциях использовали биуретоаыя метод и метод Бредооряа.

Моноклинальные антитела к дифференцировочным антигенам Т-лимфоцитов мыеи использовали в виде супернатантов гибридом G4DI (антитела к Thy 3.2 антигену, IgG 2а), GK 1.5 (антитела к L3/T4 антигену, IgG 2а) и Н 35-17-2 (антитела к Lyt 2 антигену, IgG 2а) любезно предоставлены лабораторией механизмов регуляции иммунитета НИИ канцерогенеза ОНЦ РАМН (зав. лаб. профессор Б.Д.Брондз).

Возмоязюсть для проведения эксперимзнтов с клеточными линиями Т-лимфоцитов EL-4, BV 5147 и миело-моноцитарной линией WEHI-3

любезно предоставлена профессором Б.Д.Брондзом.

• Для культивирования димфоцитов in vitro использовали среду RPMI-1640 с добавлением 10S сыворотки плода коровы, 4 мМ L-глутамина, 20 мМ HEF~3 и 5 х 10"3М 2-меркаптоэтанола.

качестве методов тестирования биологической активности Фракции использовали: 1 )локальную РТПХ, индуцированную введением 1-2 х 107 спленоцитов мышей родительской линии мышам (СБА х С57В1/6)Ft в стопу; 2) определение формулы крови у мыкея через 4-6 часов после введения препаратов; 3) определение пролиферации и жизнеспособности клеток тимомы EL-4 в тесте с МТТ-тетразолием через 24 часа инкубации с исследуемыми фракциями.

С целью исследования спектра иммунорегуляторкых Эффектов биологически активных' фракция использовали определение клеточности лимфоидных органов и Формулы крови швеи, оценку числа АОК в селезенке и реакций ГЗТ в ответе на эритроциты барана (2 х 10°) у интактных мышея, а также на фоне вторичного иммунодефицита, вызванного введением циклофосфашда. Распределение лимфоцитов тимуса по плавучей плотности оценивали изопикническим Фракционированием в градиенте фиколла. Влияние факторов на интенсивность пролиферации свежевыделенных лимфоцитов оценивали по импульсному (2-4 часа! включению эН-тимидина In vitro. Оценку митогенного, комитогенного и антипролиферативного эффектов различных доз исследуемых Фракций на Т-лимфоциты проводили in vitro в ответе тимоцитов и спленоцитов на Т-клеточные митогены СТА (5 и 20 мет/мл). Кон А (4 ыкг/ш!!. а также Кон А 14 мкг/мл) в присутствии рекомбинантного ИЛ-2 (100 ЕД/rn) с оценкой Эффекта по включению 3Н~тимидина через 72 часа после начала культивирования. Для изучения влияния иимунорегуляторних Факторов на пролиферацию и жизнеспособность аллореактивных клонов Т-лимфоцитов' CD4* использовали первичную и вторичную СКЛ в от-эте на мутантную молекулу ИНС 2 класса- Для определения влияния фракций направление миграции тимоцитов, клетки метили 5*Сг и вводили кипам внутривенно в орбитальный синус и через 4 и 24 часа определяли Г-эмиссию в. тимусе, селезенке, ыезентериальиых и паховых

лимфатических узлах и в печени. Субпопуляции Т-лимфошг ч?, несущих поверхностные антигены Thy 1, L3/T4 <CD4> и Lyt 2 (CDS) определяли методой комплементзависимого цитолиза. Лизис клеток-мишенея под воздействием Факторов оценивали по освобождение 31 Сг в культуральную среду. Для выявле1..»я олигонуклеосомной деградации ЛНК в тимоцитах и клетках EL-4 использовали электрофорез ДНК в 1,5« геле агарозы с окраливанием бромистым этидием.

Достоверность полученных результатов оценивали с помоеью г.-критерия Стыодента.

Результаты работы

Предварительное исследование иммунорегуляторных свойств водно-солевого экстракта печени было проведено методами первичного тестирования имнунотропных препаратов. Оно показало, что:

1. Водно-солевоя экстракт пече.ш обладает иммунотрспной активностью при введении до антигенного стимула.

2. Четырехкратное ежедневное введение экстракта печени мышам в дозах от 40 мкг до 4 ш* приводит к 1,5-2 кратному подавлению "-(ела AQK в селезенке и к 1,5-2 кратной стимуляции ГЗТ в ответе на оптимальную дозу ЭБ (2 х 10°).

3. Экстракт печени не оказывает влияния на системную РТПХ, но подавляет локальную РТПХ, индуцированную в системе родитель - Fj, при введении донорам родительских клеток, при кратковременной (3-4 часа! инкубации с родительскими клетками In vitro, а также при одновременном введении с родительскими клетками реципиентам F1.

4. Иммунор' ^уляторные' эффекты экстракта печени не обусловлены цитотоксическим действием на лимфоциты и не связаны с иммунизацией растворимыми антигенами гистосовместимости.

Для разделения и определения молекулярной массы биологически активных компонентов водносолевого экстрата печени использовали метод гель-фильтрации. В П£эдварительных эк шримента: по Фракционированию экстракта на сефадексе G-200 было установлено, что иммуносупрессорные молекулы обладают молекулярной массой менее 60

кДа. В дальнеягшх экспериментах использовали аналитическую колонку с сефадексом G-100, позволяющим разделить глобулярные белки с молекулярной массой менее 150 кДа и точнее определить молекулярную массу выявленного имм>носупрессор'ного фактора. Данные по изучению биологической активности Фракций водно-солевого экстракта в зависимости от молекулярной массы представлены на рис.1. Результату показывают, что максимальной способностью к подавлению локальной РТПХ обладают фракции с молекулярной массой около 70 и 10 кДа. В дальнейших экспериментах по культивированию лимфоцитов in vitro было показано, что иммунодепрессивная активность фракция экстракта печени не связана с прямым цитотоксическим действием на лимфоциты. Супрессия локальной РТПХ наблюдается как при сингенном, так и аплогенном сочетании доноров тестируемых фракций и доноров родительских клеток, что говорит о вовлечении эндогенных иммунорегуляторных факторов в реализацию этого эффекта.

Полученные данные позволили провести предварительное сопоставление выявленных факторов с уже известными факторами печени мыцеи, ингибируюиими иммунные реакции. До настоящего времени в ряде работ иммуносупрессорный фактор печени был идентифицирован как аргиназа, механизм действия которой заключается в превращении аргинина культуральноя среды в мочевину и, вследствие этого, в подавлении пролиферации Т-лимфоцитов в ответе на аллоантигены и митогены In vitro. Тестирование фракций In vivo е локальной РТПХ не позволяет выявить пик активности аргиназы, молекулярная масса которой в нередуцируюиих условиях по разным источникам составляет 105 или 140 кДа. Поскольку сведений об иммунорегуляторном факторе печени мышей с молекулярной массой 70 кДа в литературе не было обнаружено, появились все основания для детального изучения биологической активности фактора . содержащегося во фракции с молекулярной массоя 70 кДа (РФП-70), а так-j его очистки и определения физико-химических свойств.

Резуль-тгы исследования биологической активности иммунорегуляторного фактора, печени с молекулярной массой 70 кДа показывают, что он вызывает и лыя ряд иммунорегуляторных эффектов.

С белка

мг /мл ИД РТПХ

Рис.1 Тестирование биологической активности фракций, получении* фракционированием водно-солевого экстракта печени на колонке с сефалексом С-100. К 1 си* спленоцитов СБА С200 илн/ПлЭ добавляли по 0,3 нл тестируемых фракций. Клетки вводили реципиентам (СВА * С57В1)Р а количестве 10 млн. подкожно в стопу. На 7-й день после инъекции определяли индексы действия СИДЭ РТПХ. В каждой группе использовано по 10 животных. По оси абсцисс - объем элюцин в мл и нолекулирная масса фракц'-Ч, кДд. По оси ординат слева - концентрация белка, иг/ил. По оси ординат справа - ИД. Толстая линия - профиль элюции. столбики - ИД.

К -контроль',. « - достоверные отличия от контроля, Р < 0,03.

отличающихся от эффектов водно-солевого экстракта.

1. Введение Фактора мышам приводит к стимуляции IffW-ответа на эритроциты барана, не оказывая влияния на реакцию гиперчувстаительности : амедленного типа.

2. Введение фактора интактным животным, а также мышам со вторичным иммунодефицитом приводит к увеличению числа лимфоцитов в периферической крови и лимфоидных органах, не оказывая влияния на другие ростки кроветворения. Показано, что увеличение числа лимфоцитов в селезенке интактных мышея происходит за счет Г-лимфоцитов с высокой плотностью Thy 1 антигена, а в селезенке животных со вторичным иммунодефицитом - за счет Т-лимфоцитов с низкой плотностью Thy 1.

3. Обнаружено, что через 2-4 часа после введения РФП-70 в дозе <400 мкг у мышея наблюдается снижение числа тимоцитов в тимусе за счет Т-клеток с промежуточной плавучей плотностью в градиенте фиколла. Введение мышам изопротеренола приводит к такому же результату. Совместное введение обоих препаратов не приводит к аддитивному эффекту, что говорит о том. что внутритимусные Т-лимфоциты, реагирующие на введение РФП-70 несут р-адренорецепторы. Результаты представлены в таблице 1. Оставвиеся в тимусе лимфоциты характеризуются сниженным синтезом ДНК и содержат меньвее количество Т-клеток с высокой плотностью Thy 1 антигена по сравнению с суммарной популяцией тимоцитов интактных швея.

4. На следующие сутки после введения фактора наблюдается восстановление клеточности тимуса за счет «легких» фракций тимоцитов. Результаты представлены в таблице 1. Тестирование направления их миграции после внутривенного введения интактным сингенным штам In vivo показало, что они содержат повышенное количество тимоцитов, мигрирующих в печень и лимфатические узлы, то есть находящихся на терминальной и ме.'-'ллярной стадиях дифференцировки.

Препарат РФП-70 на фоне вторичного иммунодефицита, вызванного введением циклофосфамида, приводит к частичному восстановлению клеточности тимуса у животных на следующий лень после введения.

Таблица 1.

Влияние введения РФП 70 на распределение тимоцитов по плавучей плотности.

Экспериментальные XX к числу тимоцитов во Фракциях в контроле

группы1' й 1,06 й 1,07 <1 1,08 (1 1,09

Контроль 1 частота) 100(12,9) 100(13,2) 100(38,4) 100(33,3)

РФП-70(-2 часа) 93.6 69,7 71,4 97.6

Изопротеренол( -2 ч) 64,5 61,2 58,9 93,4

РФП-70+Изопротере-нол (-2 часа) 98,4 70,4 61,7 94,3

РФП-70(-24 часа) 137,8 90,8 81,1 96,4

Цф (-46 часов) 119,5 86,2 31,8 23,1

ЦФ(~48ч> «• РФП-70(-24 часа) 122 114,9 50,7 ' 34,6

Старые мыши2' 122 101,1 23 6,2

Старые мыни+ РФП-70(-24 часа) 218,3 180,5 86,3 23,4

1> - Представлены репреэетгтапгмвньге результата 3-х экспериментов. В кажаоя экспериментальной группе использовано по б мышея (СБА х С57В1/6.

- Результаты одного эксперимента, проведенного на мышах возрастом 24 месяца.

ЦФ- циклофосфамид. 4 мг на одно животное. Изопротеренол - 5 иг не яивотй<зе. РФП-70 - 0,4 мг белка на животное. В скобках -распределение тимоцитов~во"фракциях, млн/1 тимус.

Время инкубации (час.)

Рис.2 Изучение влияния РФП-70 на синтез ДНК в тимоцитах пывей лп *Нго. Свежевыделенные тмноикты нишей (СВА к 09781/6)^ СХ или/илО инкубировали » лунках 96-луночного круглодонного планшета о присутствии различных концентраций РФП-70. Через различима сроки после начала инкубации тестировали синтез ДНК по иипульснону Се течение 2 часов) включению 'н-тинидии«. Представлены репрезентативные данные трех экспериментов. По оси абсцисс -интервалы времени инкубации, в течение которых проводили импульсное мочение аН-тниидинои Счас.Э. По оси ординат - интенсивность включения изотопа в тияоциты Стыс. СРЮ.

* - достоверны^ ртличия от контроля СР < 0.015.

Сходный, и даже более выраженный эффект наблюдался у мышея с тимусом, подвергшимся оэрастной инволюции.

Исследование влияния РФП-70 на пролиферацию тимоцитов показало, что фактор в высоких дозах подавляет, а в низких -стимулирует G^/S переход в свежввыделенных тимоцитах (рис.2). Наиболее эффективная стимуляция синтеза ДНК наблюдалась при использовании тимоцитов старых животных. Впоследствии было обнаружено, что связывание антигенов CD8 и Thy 1 с моноклональными антителами к этим антигенам усиливает подавление пролиферации, "вызванное РФП-70. Таким образом, антигены CD6 и Thy 1 Функционально связаны с сигнальной системой, опосредующей ингибиторный эффект РФП-70.

Тестирование митогенного и комитогенного эффекта РФП-70 в 3-х суточной культуре тимоцитов показало, что он оказывает слабый комитогенный Эффект на пролиферацию тимоцитов в ответ на ФГА и Кон •А. но эффективно блокирует ИЛ-2-зависимую пролиферацию тимоцитов (таблица 2).

Исследование влияния РФП-70 на жизнеспособность тимоцитов In vitro показало, что фактор в зависимости от дозы способен вызывать как ускорение гибели, так и увеличение жизнеспособности кортикальных тимоцитов, подвергающихся спонтанной гибели в культуре (рис. 3 1. Показано» что изопротеренол вызывает сходное увеличение числа жизнеспособных тимоцитов в культуре, In vitro, а также, что субпопуляции тимоцитов, реагирующих на оба агента, совпадают. Получены доказательства того, что основной мипенью РФП-70 являются кортизончувствительные кортикальные тимоциты CD4*CD8+. Двумя наиболее убедительными механизмами, предложенными для объяснения причин гибели кортикальных тимоцитов, являются активация кальция-магнийзависимоя эндонуклеазы, приводящей к межнуклеосомной деградации хроматина, а также увеличение токсических концентрации пуринов вследствие прекращения функционирования терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы в тимоцитах, получивших сигнал к дифференцировке (Willie А.Н., I960; Ыа D.D.F. et. al., 1983; Cohen J.J,, Duke R.С., 1984) . Таким образом, приобретение тимоцитами

лблица 2.

аучение митогенноя и хомитогенной активности РФП-70.

Обработка тимоцитов СРИ Индекс стимуляций

Контроль 168+/-10'

Кон А, 4 мкг/мл 164+/-22 0,9в

ИЛ-2. 100 ед/мл 327+/-14 1,95

Кон А ♦ ИЛ-2 2290+/-202 13.6»

РФП-70, 0,01 ыг/мл 197+/-25 1.17

РФП-70, 0,05 мг/мл 270+/-16 1,61

РФП-70, 0,2 мг/мл 404+/-142 2,4

Кон А, 4 мкг/мл ♦

♦РФП-70, 0,01 мг/мл 360+/-109 27Й5

♦РФП-70, 0,05 мг/мл 264+/-62 1,57

♦РФП-70. 0,2 мг/мл 271+/-56 1,61

Кон А, 4 мкг/мл+ ♦ИЛ-2, 100 ед/мл ♦

♦РФП-70, 0.01 мг/мл 2022+/-300 12,0"

♦РФП-70, 0,05 ыг/мЛ 119>/-а 0,71«

♦РФП-70, 0,2 мг/мл 190+/-25 1,13**

Представлены репрезентативные, данные трех экспериментов. Тимоциты мышей С57В1/6 инкубировали в 9б-луночном планшете в течение трех суток в присутствии указанных реагентов.' после чего оценивали пролиферацию по 16-часовому включению 9Н-тишдина. * - достоверное отличие от контроля (Р < 0,001) »» - достоверное отличие от контроля с Кон А + ИЛ-2 (Р < 0,001 )•

Жизнеспособные клетки

Рис. 3 Дина «inca изменений жэнеспособностн тиноцитов пах воздействие* РвП-70 в культуре vj ira. Тикоциты иыаей (СВА >

СЭ701)F4 С1 млнхнлЭ инкубировали в среде RPMJ-1640 с 10S эмбриональной телячьей сыворотки и стандартный» добавканн с присутствии различных концентраций РФП-70. Клетки а 6-ти повторны] пробах инкубировали в круглодокных 96-луночных планшетах при Э7°С i атмосфере с Зх СО . Через различные сроки после начала инкубаци> определяли число гмзнеспособных клеток ■ в культурах методо! окракивания эозиноп. По оси абсцисс - время культивирования, час. по оси ординат - количество жизнеспособных клеток в культурах выраженное в процентах к исходному. В начале культивирования дол: жизнеспособных клеток составляла 98*. Сплошная линия - контроль пунктир - инкубация с РФП-70. 0,2 Mrv-нл; линия из точек - инк, баци с РФП-70, 0.05 пгупл. * - достоверные отличия от контроля. Р О,Ol.

стабильности с культивированию in vitro под воздействием РФП-70 может быть следствием быстрого и стабильного изменения спектра экспрессии ферментов, ответственных за активацию эндонуклеаз, а также, возможно, индукции экспрессии пуриннуклеотидфосфорилазы, приводящей к снижению токсических концентраций пуринов.

В системе in vitro показано, что фактор печени, подобно иммунорегуляторным пептидам тимуса, индуцирует дифференцировку пре-Т-клеток костного мозга. Его воздействие на тимоциты приводит к усилению экспрессии антигена CD8 и, в меньшей степени CD4, не оказывая существенного влияния на плотность антигена Thy 1. Фактор вызывает подавление миграции тимоцитов в мезентериальные лимфатические узлы, не оказывая судественного влияния на миграцию их в селезенку и печень. Возможно, что именно этот эффект является ключевым в механизме подавления локальной РТПХ фактором печени и обусловлен неспособностью аллореактивных Т-клеток к связыванию с высоким эндотелием лимфатических узлов, дренирующих место инъекций.

Через 4 часа после введения фактора в ^ крови у мышей наблюдается временная лимфопения, вызванная снижением числа Thy I"-лимфоцитов, а также, частично, Thy 1нн-лимфэцитов. Вгчлне вероятно, что этот эффект обусловлен повышением адгезивности В-клеток под воздействием РФП-70, и может быть ключевым в механизме стимуляции антителообразования путем усиленного вовлечения предшественников АОК в межклеточные взаимодействия. Этот эффект сопровождается увеличением числа рециркулируюших неятрофилов о кровотоке. Результаты представлены на рис. 4. При этом не наблюдалось какого-либо увеличения числа незрелых Форм, что указывает на то, что его причиной являются процессы перераспределения и миграции, а не выход предшественников из костного мозга.

Оппозитные эффекты РФП-70 на жизнеспособность тимоцитов в культуре in vitro определили необходимость смоделировать их, используя хороио охарактеризованные трансформированные линии тимом. С этой целью использовали клетки кортизонрезистентной тимомы EL-4 и кортизончувствительной тимомы BW 5147. Определение жизнеспособности

Рис.4 Динамика изменений количества ликфоцитов и не^трофилов е крови у пьшей после введения РФП-70. Мьшам СЭ7В1/6. вводили виутркбркшинно РФП-70 в дезе 0.4 иг белка на одно животно™. Через различные сроки после введения определяли ' абсолютное количество лимфоцитов и нейтрофилов на 1 икл крови экспериментальных и, параллельно, контрольны* животных, чтобы учесть циркадные колебания численности этих форменных элементов при оценке конечного эффекта препарата. Мыли в контроле получали инъекцию буфера СО.15 М ЫаС1, 2 пМ трис-НС1, рН в,2Э. в котором был растворен РФП-70. По оси абсцисс - время после введения, час.. по оси ординат - изменения числа лимфоцитов С сплошная линияЭ и нейтрофилов СпунктирЭ. выраженные в процентах к соответствующему контролю. * - достоверные отличия от контроля, Р < 0,01.

Подавление жиэнесг >собности

в %% к контролю во

Û.4

ал

-В- m 5147 ЧГЕШ-З

0.2

0.1

0.05 0.025 0.013 0.000

Концентрация РФП-70 в иг/мл

Рнс.5 Влияние РФП-70 на жизнеспособность клеток тимон EL-"»« BW 5147 м ииело-ноноцитарной линии WEH1-3 в культуре in vitre. Клетки спухолавых линий СО,5 илих'илЭ культивировали в среде RPMI-1640 с 10Я эмбриональной телячьей сыооротки в присутствии различных концентраций РФП-70. Клетки в 4-sc повторных пробах культивировали в плоскодонных 96-луночных планшетах при 37°С в атпас{ ре с 3ii СО р течение 20 часов, поело чего жизнеспособность клеток оценивали » МТТ-тесте. По оси абсцисс - концентрация РФП-70, по оси ординат процент подавления включения МТТ в слетки по отношению к контролю для каждой линии. SEM для каядого значения не превышала 10% среднего.

клеток в культурах с различными дозами РФП-70 проводили с помощью МТТ-теста, Было обн. уяюно, что РФП-70 дозозависимо подавляет пролиферацию и жизнеспособность клеток трансформированных линия тимом и не оказывает существенного .влияния на жизнеспособность клеток шело-моноцитарноя линии WEHI-3. Результаты представлены на рис. 5. Впоследствии было показано, что РФП-70 вызывает гибель клеток EL-4 по механизму алоптоза, но не вызывает гибели клеток BW 3147.

Все эти данные убедительно показывают, что РФП-70 может играть ' важную роль з процессах пролиферации, дифференцировки и миграции иммунорегуляторных субпопуляция Т-лимфоцитов.

Полученные данные поставили вопрос об идентификации конкретных Компонентов РФП-70, ответственных за ряд полученных эффектов. Учитывая сложность и многообразие компонентов, экспрессируюнихся и подвергающихся посттрансляционныи модификациям в печени, общепринятая подход, основанный на фракционировании исходного препарата и тестировали биологической активности Фракция, был дополнен методами имыунохимического анализа. Для препаративной очистки факторов были использованы ветот гель-фильтрации, ионообменной, гидрофобной и иммуноаффшноп хроматографии. В качестве базовых методов тестирования биологической активности Фракций были избраны« 1. Определение формулы крови через 4 часа после введения ln vivo-, - 2. Озрэделениа пролифеоации и жизнеспособности клеток тимола* EL-4 через 24 часа инкубации In vitro.

Применение- иглунохииичесшт ¡азтолоэ. тестирования- предполагало получение поликлональных антител к сранцшш с последующи исследованием их влияния на вколопгеесяпа Эффект Фактора и использованием катодов двойной к&оюодофзугни. шэдуноэлектросореза и SDS-электрофореза с иммуноблаггкнгои для оаенхм гетерогенности и Физико-химических свойств полученных препаратов. Результаты этой работы показали, что. биодогкчгсадяз Эффекта Фракции водпо-сопевого экстракта печени с швекулярзоя иассоя ТО кДа (РСП-70) обусловлены присутствием в иеп по ишьпея мэра двух иммунорегуляторных

компонентов, газличаодихсй по биологической активности, антигенным эпи^опам, физико-химическим свойствам и органной лок-ишзации.

Один из них - ИСФ-70 - приводит к перераспределению числа лимфоцитов и нептрофилов в крови экспериментальных животных через короткие сроки после введения. Этот фактор представляет собой относительно термостабильный <ö(fC) протеин с казкуцеяся молекулярной массой 70 кДа (по уточненным данным - это димер,. построенный из субъединиц 42 и 44 кЛа), устойчивый в диапазоне pH 4-12, устойчивый к обработке трипсином, химотрипсином,' меркаптозтанолоы и ДТТ, но разрушающийся при обработке проназоя. Он локализован в нелимфоидных органах, но его антигенные эпитопы обнаруживаются также на внутритимусных и периферических Т-клетках, несущих поверхностный антиген CD3. По молекулярной массе ИСФ-70 отличается от известных воспалительных цитокинов? ИЛ-1 (17 кЛа), ОНФ (17 и 26 кДа), г-ИНФ (20-25 кДа), ИЛ-б (21, 26 и 29 кДа) (Haranaka К.et al., 1964, Ganapathl M.K. et al.. 19B8; Elchards C.D. et al., 1992). Этот фактор отличается таххе от других цитокинов и других биологически активных молекул, которые активируют хемотаксис неятрофилов, модулируют активацию и экспрессию адгезионных молекул на клетках эндотелия и лимфоцитах' ИЛ-8 (10 кДа), ГМ-КСФ (22 кДа). анафилотоксинов СЗа (9 кДа) и С5а (15 кДа) (Snyderoan R. et al.. 1969; Isenman D.E., Cooper Н.й., 1981; Oppenhelm J.J. et al., 1991; 4GriffIn J.D. et al., 1990). Нельзя исключить, что ИСФ-70 является каким-либо из высокомолекулярных цитоплазматических предшественников указанных Факторов. Убедительный ответ на этот вопрос можно будет получить после клонирования генов, кодирующих субъединицы ИСФ-70.

Второй Фактор - ИСФнп - обратимо подавляет пролиферацию Т-ли:<фоцитов в ответе на ауто- и аллоантигены в MLC и вызывает апоптоз в клетках кортизонрезистентной, ИЛ-2 продуцирующей тимомы EL-4. Фактор в нативной форме имеет молекулярную массу 70-60 кДа и является димером, состоящим из субъединиц с молекулярной массой 40 и 42 кДа. Этот фактор является термолабильным (70°С) протеином, органоспецифически локализованным в печени. Молекулярная масса

субъединиц ИСФнп отличает его от иммуноингибиторных протеинов печени, обнаруженных i нее! паратимозина-о (12 кДа), ct-Фетопротеина (мономер 70 кДа), нормального иммунодепрессивного протеина (10-15 кДа), мышиной печеночной аргиназы (тример с кажущейся молекулярной массой 105 кДа, построенный из идентичных субъединиц 38 кДа), TGF-fJ (гомодимеры 25 кДа), ИНФ-г 123 кДа), ИЛ-Ю (17-21 кДа) (Nelken D.. Ovadla Н., 1982; Harltos A.A. et al.. 1985; Sporn M.B. et al., 1906; Florentino D.F. et al.. 1989; Vans S.R. et4al., 1990). Окончательный ответ на вопрос можно будет получить после клонирования генов, кодирующих субъединицы ИСФнп. Вполне вероятно, что его физиологическая роль заклочается в супрессии аутореактивных и делеции некоторых трансформированных клонов Т-лимфоцитов.

Таким образом, из Фракции водно-солевого экстракта печени с молекулярной массой 70 кДа выделено два иммунорегуляторных фактора белковой природы, предположительно ранее неизвестных. Очевидно, что в дальнейшем необходимо провести исследования по секвенированию их N-коицевых последоватепьностеп аминокислот с целью последующего клонирования генов, определения молекулярной структуры, а также получения рекомбинантных продуктов.

ВЫГОДЫ

1. Установлено, что в печени ыышея присутствуют водорастворимые иымунорегуляторные факторы, комплекс которых стимулирует РГЗТ, но подавляет антителообразование в ответе мыией на эритроциты барана. Воздействие указанного комплекса факторов на стадии антигеннезависимоп дифференцировки иимунокомпетентных клеток In vivo и In vitro приводит к антигеннеспецифическому подавлению их способности к индукции локальной РТПХ, не обладая цитотоксическоя активностью In vitro.

2. Впервые установлено, что иммуносупрессорные Факторы печени, подавляюоие локальную РТПХ у ышел. локализуются во фракциях с Мг 70. и 10 кДа.

3. Впервые установлено, что иммунорегуляторные Факторы печени мышей с 70 кДа стимулируют антителообразованир In vivo, стимулируют диФФеренцировку пре-Т-клеток костного мозга in vitro; регулируют пролиферацию, созревание. миграцию и гибель енутритимусных Т-лимфоцитов; подавляют реакцию Т-клеток на митогены; индуцируют кратковременное (в течение 2-6 часов) перераспределение форменных элементов крови, выражающееся в снижении числа Thy i лимфоцитов и в увеличении числа неятрофилов; вызывают гибель клеток тимомы EL-4 in vitro.

4. С помощью комплекса методов биохимического Фракционирования и иммуноаффиннои хроматографии выделены и охарактеризованы два иммунорегуляторных Фактора печени с Мг 70 кДа - ИСФ-70 и ИСФ-нп- К ним получены поликлональные антитела.

5- ИСФ-70 - полипептид, вызьвашшй . кратковременное перераспределение Форменных элементов крови. По структуре - это димер, состоящий из субъединиц с молекулярной массой 42 и 44 кДа.

6. ИСФнп - белок, вызывающий гибель клеток тимомы EL-4 по механизму алоптоза. Он вызывает подавление пролиферации нормальных аллореактивных Т-клеток, но не вызывает их гибели. По структуре -это димэр', состоящий из субъединиц с молекулярной массой 40 и 42 кДа.

7. ИСФ-70 и ИСФнп отличаются друг от друга по органной локализации, термостабильности, хроматографическим характеристикам и антигенным эпитопам. По своей структуре оба выделенных Фактора отличаются от описанных воспалительных и ингибиторных цитокинов, хемоаттрактивных медиаторов и ингибиторных полипептидов печени.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Изучение иммунного ответа мышей линии СБА в постнатальном онтогенезе. - Онтогенез, 1967, Н2, С.169-174 (соавт. Т.А.Фадеева, E-В.Скворцова, Н-Г.Арцимович).

2. Регуляция иммунного ответа растворимыми факторами печени. -Тез. 1-го Всес. съезда иммунологов, Иосква, 1969, С.341 (соаат. Н-Н.Настоящая, М.А.Матвиенко. Е.В.Косарева).

3. Иммунорегуляторная функция новых биологически активных веществ, выделенных i печени. - Тез. 1-го съезда иммунологов Белоруссии, Минск. 19-90, С.9 (соавт. Н.Н.Настоящая. Н.Г.Арцимович>.

4. Печень как оргая иммунобиологической системы гомеостаза. -Сосудистая и общая хирургия, Р/Д, 1991. СЛ69-191 (соавт. Н.Г.Арцимович, Н.Н.Настоящая, ).

5. Liver immunosuppressive factor and Isoproterenol cause similar thymus alterations. - Poster 016 presented at 3rd Int. Congr. of Neurolmmunology, Jerusalem, Israel, Oct.27-Nov.1, 1991. (соавт. Н.Г./. цимович H.H.Настоящая К

б.. Биологически активные молекулы, ассоциированные с клетками печени-. - Успехи совр.биол., 1991, Т.Ill, К 6. С. 931-946. (соавт. Н.Г.Арцимович, М.С.Ломаки«', Н.Н.Настоящая 1.

7. Печень как орган иммунобиологической системы гомеостаза. -Успех« совр.биол.. 1992. Т.112. N 1, С.88-99. (соавт. Н.Г.Арцимович, Н.Н.Настоящая, М.С.Ломакин).

6. Иммунорегуля^орные свойства и физико-химическая характеристика Фактора печени с молекулярной массой 70 кДа. - Тез. докл. 1-го съезда иммунологов России, Новосибирск, 1992, С.190. (соавт. Н.Г.Арцимович Н.Н.НастояиаяI.

9.Immunosuppressive factor from liver and its influence on T cell development. - Immunol. Lett.. 1992, V.33v P.93-93. (соавт. Н.Н'.Настояаая, М.С.Ломакин, Н.Г.Арцимович).

10. Роль печени в иммунобиологической регуляции гомеостаза. -Гематология и трансфузиология, 1993, Т.30, N6, С.42-44. (соазт. Н;Г.Арцимович, Н.Н.Настояиая).

11. Выделение, изучение биологической активности и характеристика иммуносупрессорного фактора печени, вызывающего апоптоэ клеток тимоюы EL-4 in vitro. - Молекулярная биология, 1994, Т.28, N6, ¡соавт. И.М.Агранович. А.А.Штиль. О.Я.Аааша. А.Д.Черныиева, С.Г.Апасоа», Б.Д.Брондз)