Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Изолированные гепатопиты крыс в качестве модели для изучения токсических и гипотоксических нарушений клеточного метаболизма

ДЕИ "¡ч1н РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ФАРМАКОЛОГИИ

На прагах рукописи

ДУДЧЕНКО БАЛЕРИН ВАЛЕЯТИНОЕНА

ИЗОЛИРОВАННЫЕ ГЕПАГОДНТЫ КРЫС 3 КАЧЕСТБЕ ЙЭДЕДИ ДЛН ИЗУЧЕНИЯ ТОКСИЧЕСКИХ Л ГШОКСИЧЕОКИХ НАРУШЕНИЙ КЛЕТОЧНОГО МЕТАБОЛИЗМА.

14.00.25 - фармакология

■ Автореферат диссертации га соисг^нке ученой степени кандидата медицинских нгуу.

Москва - 1994

Работа выполнена в лаборатории биоэнергетики НИИ фармакологии РАМН (руководитель лаборатории - чл-корр. РАМН, доктор биологических наук, профессор Л. Д. Лукьянова) .

Научный руководитель: член-корреспондент. РАШ, доктор биологических наук, профессор Л. Д. Лукьянова • '

' Официальные оппоненты: член-корреспондент РАШ, доктор медицинские наук, профессор Е. И. Любимов

член-корреспондент РАШ, доктор медицинских наук, профессор Л. Ф. Панче нко

Ведущая организация - Российский государственный медицинский университет. ■ _ 1

Зашита состоится " " _ 1995 года

на заседании специализированного ученого совета Д. 001. 25. 01 при НИИ фармакологии Российской АМН по адресу: 125315, Москва, ул. Балтийская, д. 8. *

С ' диссертацией можно ознакомиться в Ученой части 'НИИ фармакологии РАШ.

Автореферат разослан " " 1994 года.

Ученый секретарь специализированного соЕета доктор медицинских наук

А. Е. Яворский

ОЕЦАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА PASOTE

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ.

Ь практике биологических экспериментальных исследований широко используются модели in vitrc. Среди них з последнее десятилетие одно из первых мест зант/гит изолированные гепатоциты, сох-ранкшЕ длительное время после выделения широкий спектр функцис-Еалькс-метгоелпческж: свойств, характерных для печени m vivo. 3 связи с гтим гепатоциты успеино применяются не только для пгз-че-як.э интимных механизмов функционирования печени, ко я для решения многих обпсг вопросов нормальной и патологической физиологии, биохимии, фармакологии и т. д.

Все это делает перспективным расширение использования изолированны:-: гепатопитов в качестве экспериментальных )^оделей, создание еь ic: ссноЕе ковш: тест-спстем. В фармакологических исследованиях существует два чрезвычайно актуальных направления для. ко-* '.орых применение изолированных гепатоцитоз в качестве модехьныой системы моагт быть особенно перспективны.;. сто экспресс-оценка гепатстоксичности веществ и изучение механизмов действия гипоксии, связанные с поиском анткгиясксантсв.

Б токсикологических исследованиях, наряду о экспериментами, провод;:;,ими на синешлм уровне, зироко иепользутхгся способы испытания химических соединений на субклеточных, оргвяеллах и на ¿-ерменткых препарата:-: в условиях m vitro. Такие исследования, позволяешь установить субклеточные механизмы токсического начала, тем не менее не Есегда даете возможность выявить его мндени, составить представление о токсичности вешества. Они не нес;,™ такие информации о скрытой токсичности, которая появляется только з процессе метаболизма ксенобиотиков за счет образования более опасных продуктов. В таком аспекте наиболее привлекательны клеточные суспензии, и 2 частности, изолированные гепатоциты, сохраняющие интактныыи метаболические система, способные к активной биотрансформацни чужеродных соединений, доступные для исследования стандаотными биохимическими методами.

Имеется обкирная литература по этим вопроса.1.:, где показано использование различных морфологических и бяохкмических показателей в клчестве критериев токсичности вещества (Thurnan, 1979; Síes, 1982; Sato, 1984). Среди них наиболее часто используется измерения состояний плегматичеосс-: мембран, активности ПОЛ, знер-

гетичееюсго обмена, ионного обмена и др., однако срдашсгеглУЛ анализ прогностической ценности этих ызтодсз на проводился.

Гипоксичэскио явления сопровождают бсдышаютзо патогоги-ческих процессов, непосредственно или опосредованно влияющих г.а | поступление Оз к клеткам органоз и тканей. Нарушение бшлоги-

чзского окисления вследствие недостатка кислорода дзмкт в ■ осйозс-ыехакиэма ряда заболевании сердечно-сосудистой аисте!,к, легка:, печени , почек, мозга и др. 4

Изучение гипоксии вшшо не только с точки зрения понимания механизмов разЕития того или. иного патологического состояния. Имеет значение и другой аспект, связанный с фармакотерапией больного организма. Хаи, не всегда известно, щк в условиях недостаточного обеспечения Оа будут Еести себя лекарственные препа-г.та, т.к. при гипоксии могут значительно изменяться . йлрмаколох и токсические аффекты лекарств вследствие изменений их фчрмакоки-нетики ( Грек, ■ 1984; Бгуаоп, 1982). Существует ряд фармзкологи-ческих препаратов, способных: в условиях гипоксии превратиться е I токсичные, которые и используют для лечения, например, медленно ~

растущих опухолей, метки которых находятся, в условиях Оа-не-достаточкости и устойчивых к химиотерапии и обдучеюзэ (Jor.es, 1С85) Известно, что индивидуальные различия в реакции на гипоксии • - проявляются, как да уровне целого .организма, т.ак и на органном

• . уровне (изолированное сокращающееся сердце, срезы мозга). Однако I . до сих пор отсутствуют систематические исследования. чуэствитедь-I ности к дефициту такого высокоаэробкого органа, как печень.

Практически нет данных о нарупениях функционально-энергетических : • параметров в ней в условиях дефицита у высокоусточивых (ЕУ) и

: ниэкоустойчиЕЫХ (НУ) животных. Распространенность заболеваний пе-

| чени, е • патогенезе которых как обязательней фактор всегда

• присутствует кислородная, недостаточность, делает необходимым поиск фармакологических средств,- повыпаящих' резистентность этого

] органа к'дефициту 02, либо устраняющих его последствия.

] Есе это определило 1Ц£ЛЬ данного исследования, которая зак-

1 лючалаоь в разработке на основе суспензии изолированных гепатоци-

тов модельных систеи для оценки гепатотоксичзского действия чу»неродных соединений и для' изучэши особенностей нарупеЕия меточного мэтаболзлма в условиях дефицита кислорода.

В соответствии с поставленной целью определены следухир-з ЗАД&ЧК ксиэдованЕЖ

.1. Получение сусиекз:щ язганеспоссбназ гепатсцитоз, -лояранякпрк длительное время комплекс функционально-метьболичеек:::: свойств, ■ характерный для печени in vivo. ■ ...... • •

2. Поиск ёункггокипно-.четаболичесгак критериев для оцекм: ге-ггтотокигчноотя ксеяосзптгиоэ на модели изолированна гепатспотсв. •

3. Изучение действия различных концентраций кислорода на кэш-лекс сиуницгокахьхо-метаболических параметров изолированных гела-тсцитоз, получениях UT згкзотных с разной резистентностью к гипоксии.

•1. Еклвлекие наиболее чувствительных критериев для 'сценки гн-поксических наруаений а гепатсцитах. —

Е. Проверка работоспособности цредложнных тест-систем на пргале-ре негаторьк производных оксипириднна.

НАУЧНАЯ KGHffiHA исследования. Впервые при исследовании гепа-тстоксичггости кс-знобиотиков ез модели изолированных клеток печени 73 условиях in vitro использован комплексный подход оценки знер-госинтеэирундэй и знергсшотребляичей функций, а тииз интенсивности перекисного окисления и структурной целостности плазматической мембранн клеток, позволявший выявить наиболее чувствительное звено в клеточном метаболизме для повреждающего де£стзия■препаратов.

Разработана клеточная 'модель на первичной' суспензии изолированных гепатошггоь для исследования действия гипоксии нарастающей тяжести. Установлено, что наиболее чувствительные! параметрами, ревгпрутщая на Оз-недостаточность, являются знгергоскнтевврухщая и зкергопотреблЕнгая функции.

Епергые изучены фуЕкционалт-.но-метаболические папаметрн изолированных гепатецкгев, получеяньк: от иивоткык с различной резистентностью к О^-недостаточности, при разном содернгнии кислорода. Впервые доказано, что изолз.-рованнке гепатоциты, подученные • ст крыс с разной чувствительностью к ккслородаой недостаточности, сохраняют способность по-р&еному реагировать в условиям гипоксии.

Установлена область пшоксическкх условий, ведуг?5х к нарушения энергетического обмена и знергозавнеимнх процессов в клет- . ке. Определена роль церекксного окисления в развитии нарушений б7НкциональЕО-1.ктаболкческих показателей изолированных гепе.тоци-той з условиях разной-.степени тяжести и продс.емительности ГОНОКОКК.

Установлено, что оптимальными условиями для инкубецик коом;-рсазнных гепатоцитоэ в условиях in vitro является среда, содер,\-л-.идя 100-200 wii 03. . Показано, .что гшгакспчэские условия для изолированных клеток печени еоэнккэет в области кош.еырацнй 02 50-S0 мкМ и менее, гарактериэушциеся нарушением фут'кционелъно-мэ-табодическиг параметров. Установлена область'-р05 (менее 2 мкМ Оа в среде)', з которой начинаются тяжелые деструкт:£аные изменения и исчезают индивидуальные различия клеточного метаболизма.

Показано, что исследованные производные оксширидкна. обладают антигипоксическим действием на изолированных клеткам; печени, а время•проявления защитного эффекта зависит от исходной чувствительности гэпатацитов к дефициту кислорода.

Установлено, что оухдеств'^е'71 корреляции м-*'? чэсккм и ^нтио^сидантнн!' действием сучцнкатссе нсго окоитградна — мексидола в oycTi*-v5HiT

Показано, что гепатотсксичные свойства Г5-53В и Г2-Е12, обусловленные наличием карбамоильной группы, могут усиливаться при длительной инкубации клеток печешь

НАУЧЕ>ЕРАК11РВСКйЯ значимость работы. Предлоканнзя , модель комплексной регистрашш функционально-метаболических параметров изолированных гепзтоцитов для изучения токсичности ксенобиотиков позволяет достаточно быстро выявлять токсический эффект, более глубоко исследовать механизм его.развития, и может быть успепно использована в сочетании с - другими методами определения общей токсичности химических соединений.

Впервые установленные различия клеточного метаболизма в ге-патоцктах НУ и НУ крыс подтверждает существование индивидуальной чувствительности к кислородной недостаточности и на клеточном уровне и открывает; •новыо возможности для пониманий механизмов, осуществляющих защиту организма от повреждающего действия ги~ покоического фактора.

Показана прогностическая ценность и перспективность■использования модели изолированных гепатоцитоэ .для изучения антаги-поксических свойств и особенностей метаболизма ксенобиотиков б условиях гипоксии.

Подтвервдено антигипокскческое действие производных окскпи-ридкна на изодированЕьсс гепатоцктЕХ и показана целесообразность

- Б -

-римененкя этик соединений с цель» коррекции (^якц'.хнально-метаболических параметров клеток печени при |:да.>--_реда.

■ 1Н основании дакнчх о рр-нюкмготн • антиггавгечтсесузгг эффектег »огенных производных о!«:ширкдияа от индивидуала'-:-.^ регистокт-;;ротц сргает.-;я к. кчлгородной .гедсстзго'ЕОст:; ::редсггв."£-гся -кропектйгнмм paspF-OPT1^ ofoonor-лнкв г акт пни копо£ьгоь2:-:п.: гн-.•¡„•кпокзгнтов -рк г::~с.

С23& SASA4 С ПРОБЛЕМНЫМ ПЛАНОМ ¡ЕЯИЗЕСЫТС äÜK

PsC-ота выполнена в pai.c--.sx ГНГП "Согданке лекарственных средотз методами химического и биологического синтеза", направление 05 "Сармаксккнеткческие и биофармацевтические принципы совершенствования лекарственны:': препаратов", темз "Создание новых лекарственных препаратов на основе изучения взаимодействия химк- v ческой структура,, бистрвнсформгции, фермакокяяетики к фармакологической активности", регистрационный номер 01.'9. 20 003242..

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Основные результаты диссертации дслокены ка конференциях "Фармакологическая коррекция ггагаксическкх состояний" Москва, 19ВЗ; "Оценка фармакологической активности химических соединений: принципы и подходы" Москва, 1989; "Сизиология и биоэнергетика гипоксии" Путанно, 1930; "-Фармакологическая коррекция гкпоксических состояний" Гродно, 1S91; ''"Антипгаокоанты и актопротекторьв итоги -и перспективы"-Саякт-Пегербург, 1994; "Здо- • ровье и болезни человека ка рубеже XXI века" Москва, 1994, а так-у.э апробированы на межлабораторном семинаре Института фармакологии Российской АМН 6 июля 1994.

ПУБЛИКАЦИИ. По материала)^! диссертации опубликовано 9 печат- . них работ и сдано в печать 2 статьи.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация содержит следующие разделы; Введение, Обзор литературы, ¡Материалы и. методы исследования, Экспериментальная часть, состоящая та 4 глав,.0бс?е заключение, Выводы к Библиографический указатель, включающий работы на русском (_) и иностранном (_) языках. Диссертащм изложена на _ страницах машинописного текста, иллюстрирована_

таблицами и ■' рисункам!. .... ... .

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Эксперименты проводили на беспородных крысах-самцах массой 160-220 г, предварительно разделенных в барокамере по их ре-

зистентности к острой гипоксии (Pursnottam and Chosh, 1972; а мо-диф. Чернобаевой и др., 1SS3). В опшах использовали ВУ к НУ крыс.

. . Изолированные гепатоциты крыс получали методом Мольдеуса (1978) в навей модификации. Еа заключительном этапе очистки клеточной суспензии кспользоЕали центрифугирование в градиенте плотности фиколла, что позволяет стабильно получать изолированные гепатоциты с высокой жизнеспособностью. Выживаемость клеток определяли методом окрашивания тршшноЕым синим (Seglen, 1976). В эксперименте использовали суспензию, содержащую £5% и выше жизнеспособных клеток в концентрации - 1-2х10еклеток/мл. ИзолироЕан-ные гепатоцксы инкубировали в стеклянных колбах. Эрленмейера при достоянном орбитальном перемепиванки с частотой колебаний 125/шн при t-37 С.

В работе были использованы две экспериментальные модели:

1) для изучения токсического действия химичеслее соединений -изолированные гепатоциты инкубировали в течение 30 мин в атмосфере карбогена с различными концентраций! ксенобиотиков;

2) для изучения действия гипоксии - нзолированные гепатоциты инкубировали в течение 2-х часов в средах, содержащих 900,"' 200, 100, БО, 30, 10, б и 2 мкМ Oj, пропуская газовые смеси с разным р02. Точное содержание 02 контролировали полярографически с помощью платинового электрода Кларка.

Для инициации синтеза мочевины в суспензии гепатоцитоа вносили HHi,Cl (2.5 пАС и L-орнктин (Б niM). Кндукцшо системы моно-оксигеназ проводили с помощью фенобарбитала (в/б введение з дозе 80 мг/кг в течение 5 дней).

Изучение антигипоксических свойств производных оксгашридина (мексидол, ГБ-288 и ГБ-212) проводили ка модели изолированных ге-патоцитов, инкубируемых при S00, 10 и 6 мкЫ в среде.

Для изучения токсического действия ксенобиотиков и влияния гипоксии на функционально-метаболические параметры изолированных гепатоцитов из суспензии кавдые 20 мин отбирали аликвоты. Оценивали состояние плазматических мембран по еыходу ЛДГ из клеток в среду инкубации (Kfcideuз, 1978) д содержание цитохромз Р-4Б0 (Jones, 1S80). ■ В нейтрализованных кислых экстрактах определяла ■ содержание АТФ лщггферин-лющхфзрааным методом (Атауллаханов, 1981); содержание мочевины спекгрофотометрически, по образовать цветного комплекса с диацетштьиноксимом (Рубин, i960) е нашей модификации ; содержание лактата па ¡.¡этоду Hchorsta (1970); актив-

ность процессов перэкисного окисления лткдоз (ГОД) по скорости образования ТБК-РП (Wills, 1965).

Статистическую обработку.полученных результатов проводили с использованием ;сритер;:я Стыодента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Гтвкшгаквльно-мет^боличесгае характеристики первичной суспензии изолированных клеток печени крыс.

<5т71кц1!01?алько-метзболич9скиэ характеристики кзоли-?ов»йяьк геиагсцитов ¡tpvíj - выживаемость, скорость 'днгаккя и содержание ATO близки к значениям, пскзяаннда для печени in vive, и практически не могяется в течение S-x часов инкубации (рис.1). Е только " к концу третьего часа инкубации почти з 2 раза снижается ч скорость синтеза мочевины, что может быть связано с избыточным ее накоплением з среде инкубации и ингибированием ферментативного процесса конечным продуктом.

Содержание цитсхрома Р-450 эз 2 часа снимается на 20-30%, а к концу 3-го часа почти в два раза, что может быть вызвано спонтанной деградацией цитохрома Р-450 в изолированные клетках печени, инкубируемых в минимально солевой среде. На протяжении 2-х часов для первичной суспензии гёдатоцитов характерна достаточно высокая интенсивность накопления ТЕК-РЯ (рис.1).

Таким образом, изолированные гепатоциты, кжубируемые з атмосфере карбогена (37°С), сохраняют способность стабильно поддерживать наиболее важные функционально-метаболические параметры на протяжении 2-х часов, что позволяет использовать их в качестве модельной системы з этом временном интервале.

Разработка системы оценки гепатотоксичносм ксенобиотиков на изолированных клетках печени крыс.

Предлагаемая система оценки гепатотоксичности ксенобиотиков на модели изолированных клеток печени Еклнчает комплексное исследование иг влияния па фун!щионально-метабслические параметры: содержание ATO, скорость синтеза мочевины, состояние проницаемости плазматических мембран и активность процессов ПОЛ. Исследованы различные ксенобиотики с известным механизмом токсического действия.

.(С

Я

о □

МИН

Ргс.'1. Функционально-метаболические характеристики изолированных гепатоцитов крыс, инкубированных в атмосфера карбогена в течение трех часов1 / в % к исходному/.

I - содергание АТФ; 2 - процент неокрашенных клеток трипаяозым синим; 3 - содержание цнтохрома Р-450; 4 - скорость синтеза мочевины; 5 - "скорость синтеза ТЕК-РП; '6 - выход ЛДГ.

Показано, что асе исследованные соединения ингибируют■содержание АТС и особенно синтез мочевины. Расчитаны значения Ш'50 ( ингибирувп^я концентрация вещества, при которой скорость синтеза мочевины или содержание АТФ падают на БОХ) (табл.1). Наибольшей токсичность!); для синтеза мочевины обладают дыхательные яды - КСМ, амитал и гепатотропный яд - тетрахлормэтан (ССЦ), минимальной -ДЖО, используемый в качестве растворителя для труднорастзоримых в воде веществ (табл.1).

Сравнение значений Юви показывает, что основная часть соединений оказывает токсическое влияние на содержание АТО в значительно большие концентрациях, некели на с!штез мочевины. Еероятно это связано с тем, что уровень обкэклеточного АТО отрамает не только состояние энергетического метаболизма митохондрий, но и цктозольных процессов. Следовательно, синтез мочевины является более чувствительным критерием при оценке токсичности веществ.

Оценка состояенд плазматических мембран в качестве критерии токсичности значительно уступает в чувствительности двум предыду-

Таблица 1. Концентрации веществ, при которых происходит снижение скорости синтеза мочешгны и содержания АТФ на EOS.

Вещество Содержание АТФ Скорость скктега мочевины

-3 -'1

КС» 2x10 М 10 M

-3 -и

Aj.cn ал 2x10 Н 5x10 м

-1/ ■Ji и

СС14 4xi0 Ц 7rlO

J.-нафтол 2х103 Н 103 и

■ Нафталин 1,5x1 О*3 М 10"J ц

Азид Na 8x10"3 М 2x10"3 -м

-3 -3 м

Аьинопирин 1,5x10 М 4x10

-3 м

р-нитроаякэол 6x10 М 8x10

щим параметрам. Изменения проницаемости плазматических мембран гепатонитов выявлены только для нафталина и ч^-нафтола в концентрации 10 М, что монет быть обусловлено их мембранотропным эффектом.

Ни одно из исследованных соединений существенно не влияет на скорость накопления ТБЕ-РП, за исключением СС1 проявляющего выраженные прсоксидентные свойства, что обусловлено образованием в процессе его метаболизма высокоактивных свободнораднкальных продуктов (Владимиров и др., 1972; Rscknagel et al. , 1989). Показано, что при концентрации СС1<( 6x10 U скорость накопления ТКК-РП возрастает только в 1,6 раза, тогда как синтез мочевины и содержание АТФ снижаются в 10 раз. Это свидетельствует о том, что энергосинтезирукщая и анергопотребляющая функции наруиахзтся рань-' ше и в большей степени, чем процесс ПОД V

Таким образом, изменения параметров (синтеза мочевины и содержания АТФ) яздяигся более чувствительными тестами, чем оценка проницаемости плазматических мембран и ПОЛ Комплексная оценка всех исследованных параметров позволяет выявлять наиболее чувствительное звено клеточного метаболизма для токсического действия ксенобиотиков и .дать сравнительную оценку их возможной гепато-" токсичности.

Использование ингибиторного анализа системы биотрансформации е гепатопитах позволило дифференцировать токсические эффекты сусбтратов и продуктов метаболизма ксенобиотиков.

Нафталин и я<-нафтол (токсичный продукт гкдрокяилкрозакия нафталина) примерно одинаково сшыазт содержание АТФ и скорость синтеза -мочевины. Гепатотоксичность нафталина занисгг" с*1 актив— ности систеш биотрансформзции: уменыгаетсп при ингибирозенгс* ци-тохрома Р-4Б0 oC-нвфюфлавоном и увеличивается при его индукции фенобарбиталом (рис.2), что выражается в изменении значений 1С so. 3 отличие от нафталина, токические эффекты с^-нафтола не зависят от интенсивности микросомального окисления (рис.2).

Для гминопирина, метеболиэируиаргося с образованием промзну-точного токсичного продукта формальдегида, таю&е показано уменьшение его токсического действия на содержание ATffi и особенно скорость синтеза мочевины в присутствии =(-нафтофлаэана, когда величина ICfio увеличивается с 4х103 Ы до 7xlQ~3 ii.

Применение ингибиторного анализа е случае использования CCI ц показывает, что тетрахлорметан начиная с концентрации БхЮ"3 а, стимулирует ЮЛ в гепатоцитах в 1,5-2 раза, тогда как в присутствии ингибитора цитохрома Р-4Б0 <Jçнафтофл.чвона скорость накопления ТЕК-РП не превьшает контрольный уровень.

Таким образом, на примере метаболизма нафталина, амикопирина и тетрахлорметана продемонстрирована возможность истгальэованил изолированных гепатоцитов в качестве модели для исследования токсичности продуктов"метаболизма ксенобиотиков. ' "

Гепатоциты как модель для изучения нарушений клеточного метаболизма в условиях гипоксии.

Анализ зависимости исследованных параметров изолированных гепатоцитоз от рО^ позволяет оценить общую резистентность клеток к гипоксии и выделить:

1) область pOj, обеспечивающую оптимальные условия инкубации изолированных гепатоцитов в условиях in vitro;

2) область рОд, характеризующуюся изменениями функционально-метаболических параметров изолированных гепатоцитов.

В диапазоне концентраций кислорода ЭОО-БО мкЫ основные функционально-метаболические показатели изолированных гепатоцитов (содержание АТФ, уровень лактета и мочевины, проницаемость плазматических мембран) поддерливаштся на относительно стационарном уровне е течение 2-х часов инкубации. Резкая активация накопления ТБК-РП з гепатоцитах, инкубируеьш: в среде с содержанием 900 indl

Рис.' 2. Влияние раачичных концентраций нафталана и ©(-нафтола на скорость синтеза мочевины /к/ и содержание АТФ /Б/ при активации и янглбяровакил систеш цитохрома Р-450

. I - нафталин

2 - нафталин на фоне фенобарбитальном индукции

3 - нафталин + о( -нафтофлавон

4 - а{ -нафтол

5 - о( -нафтол на фоне фенобарбитальной индукции

6 - о( -нафтол + с{ нафтофлавон

, Ов, позволяет расценивать ее как гиперокскгепироЕыпгую.

Установлено, что оптимальными условиями для инкубгцин изолированных' renarciprrcB является'среда,■ содержащая 100-200 мкМ О2 > что соответствует уровню оксигенации in vivo (Коваленко, 1972; Jones 1986). ..В этом случае для изолированных, гепатоцитов ВУ и НУ крыс характерен наиболее стабильный и высокий уровень АТФ в клетках, а также низкая скорость образования лактата. Последнее свидетельствует о том, что энергосянтеэирукщая функция гепатоцитов е этом диапазоне'рОзОпределяется не гликолизом, а преимущественно аэробными процессами.

Одновременное снижение интенсивности ПОЛ в среде, содержащей 100-200 мкМ Од свидетельствует о том, что этот процесс не отражается на энергосинтезирущей и энергопотребляющей функциях гепатоцитов.

Глпоксические условия для изолированных гепатоцитов, характеризующиеся снижением АТФ, появляются лишь при уменьшении содержания 0¿ в среде до Б0-30 мкМ и менее. &ги значения критической концентрации. кислорода для знергосинтезирувшрй функции гепатоцитов согласуется с данными, получешшми для печени in situ (Ballard, 1971). Чем меньше pOj, тем раньше наступают и более выражены нарушения анергосинтеэирующей функции.

Значительно позже изменений содержания АТФ "в гепатоцитах активируется гликолиз (10 мкМ 0г и менее): Максимальная активация гликолиза при 2 мкИ Од, одинаково выраженная в гепатоцитах ВУ и НУ крыс, однако не обеспечивает поддержания энергетического гоме-остага изолированных клеток, . т. к. при этом содержание внутриклеточного АТФ сажается более чем в 2 раза.

Снижение содержания . АТФ в диапазоне 60-2 мкЫ 03 сопровождается одновременным подавлением синтеза мочевины. Качественное сходство кривых зависимости САИЯ/СС^] и С мочевина]/ С 0а] демонстрирует, что энергосинтезирующие и энергопотреблящие процессы находятся в тесном взаимодействии. Однако сравнительный анализ значений (концентрация Од, при которой происходит 1ш-гибирование процесса на 502) для содержания АТФ и синтеза мочеви-• ни свидетельствует о том, что при снижении'содержания 0г з среде инкубации в гепатоцитах первой подавляется энергопотреблягиря функция (табл. 2). При длительном воздействии гипоксшг эти нарушения только, усугубляится. -

Структурные изменения плазматических ызмбран в отличие от

Таблица 2. Значения концентрации Ог (мкМ), при которых происходит сужение содержания АТ<5 и синтеза мочеЕшш на 50% (Psо).

Время Ps0 инкубации (мин) для содержания АТФ НУ ВУ .Р50 Для ЕУ синтеза мочевины ЕУ

10 1. 9 1.5 -

30 6.0 4. 8 18.0 16.7

60 1Б. 0 7.0 16.0 12. 0

■ 90 19.0 9.0 13.0 11.0

120 22.0 10.0 10.0 7.0

функциональных _ параметров выявляются лишь в условиях очень тяяе-,. лей гипоксии (2' мкМ 03), когда уже резко нарушены энергосинтези-руюшдя и зкергопотребдагттгя функции гепатоцитов.

По мере снижения концентрации 02 в среде до Б0 мкМ в изолированных ■ гепатоцитах ингибируется перекисное окисление. Однако начиная с 30 мкМ 0^ при длительней инкубации гепатоцитов происходит резкая (2-х кратная) активация скорости накопления ТБК-РП (рис. 3).

Таким образом, наиболее чувствительными й рано реагирующими показателями реакции изолированных гепатоцитов на моделируемую гипоксия карастага^ей тяжести являются изменения содеряакия~АТФ и мочевины. Достоверные зга изменения интенсивности гликолиза и состояния плазматических мембран возникают лишь в области тяжелой гипоксии, на фоне'глубоких нарушений энергосинтезиругацей и энер-гопотреблявщей функций клеток.

Анализ результатов о влиянии моделируемой гипоксии на исследуемые показатели изолированных гепатоцотов ВУ и - НУ крыс подтверждают полученные ранее данные о сохранении различной индивидуальной чувствительности целого организма к гипоксии на срезах мозга (Чернобаеза, 198Б), изолированном сокралрщэмся сердце (Корнеен, 1365). Показано, что количественные характеристики функционально-метаболических параметров гепатоцитов ЗУ и НУ' крыс в условиях гипоксии суг^ествекно различается.

Индивидуальные различия по показателям внутриклеточного содержания АТФ могут свидетельствовать о наличии у клеток разных

Рис. 3.'Зависимость содержания ТБК-РП от концентрации кислорода /мкЫ/ в среде в разные периоды инкубации 30, 60, 90, 120 мин - время инкубации

механизмов срочной компенсации процессов энергообреэования в зависимости от условий огссигенации среды. Энергетический обмен играет существенную роль л формировали! индивидуальной-чувстэитель- ■ ности ткани к Од-недостаточности. При этом гепатоциты БУ крыс об-.. , лздают больней устойчивостью к воздействии гипоксичесгаго фактора, что убедительно подтверждается при анализе значений Р$0 для содержания АТСл

Для гепатоцитоа ВУ животных, сравнительно с НУ, характерна более высокая скорость гликолиза в карбогенсодержащей среде и более высокая скорость его мобилизации при уменьшении 0^' в диапазоне 200-50 ккЫ. В области низких р02 гепатоциты НУ крыс обладают сниженной сяособкостьв к активации гликолиза. Такие различия в динамике образования лактата в изолированных гепатоцитах 2-х типов животных з диапазоне 900-6 мкМ 02 позволяет предполагать на- ч личке особенностей анаэробного энергетического обмена в печени ЗУ НУ крыс.

При снижении концентрации 03 до 2 мкИ различия в интенспв-_нссти гликолиза а гэпатогнтах ЕУ и НУ животных исчезают, что мо-. жет быть связано с тяжели,¡и ггагаксическими нарушениями, при которых индивидуальные особенности клеточного метаболизма уже не реализуются.

Анализ зависимости СмачеЕины]/С0а3 свидетельствует о том, что а гепатоцитах ЕУ и НУ крыс по-разному осуществляется регуляция системы сйнтеза мочевины, о чем свидетельствует наличие двойной кинетики процесса в гепатоцитах ЕУ крыс в области высоких (900-30 мкМ) и низких концентрациях 02 (10-2 мкМ) (рис.4). Чувствительность синтеза мочевины в гепатоцитах НУ крыс к гипоксии больше, чем у ЕУ (табл.2).

О неодинаковой степени лабилизации мембран в условиях гипоксии свидетельствует наличие в гепатоцитах ЕУ крыс 30-ти минутного лаг-периода для выхода ЛДГ в среду инкубации: Т. е. в клетках • НУ животных нарушение структурной полноценности плазматических мембран при остором дефиците 03 происходит раньше, чем у ЕУ.

С целью проверки возможности использования этой модели, для определения защитных -эффектов .-фармакологических препаратов по предложенным функционально-метаболическим параметрам в условиях гипоксии исследованы 3 производных оксипиридина с известным свойствам!. Ранее для них на рвзлзгаяых объектах (на уровне целого организма, срезах мозга, изолированном сердце) показаны антиги-

Рис.- 4'.' Зависимость содержания мочевины /ыкколь ■ г~ вл. в е са, от концентрации /ыкМ/ в изолированных гепатоцитах ВУ и НУ крыс в двойных обратных координатах

30, 60, 90, 120 - врекя инкубации •■ ■

псксическвнтиокскдантные и ыембраностабилизирушяре свойства. Установлена роль сукцяната в составе мексидола и ГБ-288 а развитии .защитного эфбекта в.условиях гипоксии.

Исследование гепатотоксичностн производных оксипиридина.

На изолированных гепатоцитах с помощью комплексного исследования функционально-метаболических параметров изучена гепато-. токсичность 3-х производных оксипиридика: 1) сукцинат-2-этил-бме-тил-3-океипиридкка (мексидол, \L м. -2ББ; ЛД50-820 мг/кг при в/б введении крысам); 2) сухцинатсодержащего карбамоилпроизводного окзипкридина (ГБ-288, М. м.-534,322;' ЛДБО-162,3 при в/б введении) 3) карбаыоиллроиазодного оксишфидина, не содержап$его янтарнум кислоту (ГЗ-212, it м. -244,73; ЛД50-133 мг/кг при в/б введении).

Показано, что все три исследованных соединения в концентра-ши:с 10 - 10 Ы не влияет на исследованные параметры. 3 отличии от мекслдола, который л з концентрации 10 Ц остается индиферентнкм дл- клеток, Г3^238 и Г.^-212 в концентрации 10 М проявляют токсзгч-нае свойства. Они ингибируют синтез мочевины, снижают содержание АТФ, активируют ПОЛ и увеличивает: проницаемость плазматических

Полученные данные позволили выбрать для дальнейшей экспери-. . ментальной работы с гипоксичеекой моделью нетоксичные для изолированных гепатоцитов концентрации производных оксипиридина -ЮМ и 10VH.

Исследование влияния производных оксипиридина на функционально-, метаболические параметры изолированных гепатоцитов при разных р02'.

Мексидол в области низких pOg повышает содержание ATS. При •втом -его защитный эффект развивается бысто в гепатоцитах.ЕУ животные, а у НУ только при длительной инкубации. На фоне повышения уроаня ATФ мексидол практически не влияет на синтез мочевины в гепатоцитах ЕУ крыс, тогда как у НУ угнетает его в первый час инкубации н , затем повьпсает активность процесса во второй час. 3 условных гипоксии мексидол не влияет на проницаемость мембран изолированных гепатоцитов и обладает выраженным антиоксидантным эффектом особенно в клетках НУ животных.

Г3-223, также как и мексидол, обладает антигнпаксической ак-

тизностью, более выраженной в гепатоцитах ЕУ животных, т. к. одно-направленно повышает содержание АТФ и систеэ мочевины. В гепатоцитах ЕУ. крыс ГЕ-288 в концентрации 10 М погашает только срдержа-нке АТФ в 1,5-2 раза при Б мкЫ 0а ("рис. 5) и обладает мембраноста-билизирующим действием в отличие от клеток ВУ. Эффекты на ШЛ в условиях гипоксии у ГБ-288 носят сложный характер. В гепатоцитах ЕУ крыс ГБ-2В8 стимулирует ПОЛ максимально в 2-3 раза при 5 мкМ-0'¿. В гепатоцитах ЕУ преобладает антиоксидантвая е-гаивкость, максимально выраженная при 10 мкМ 03. '

■ ГЕ-212 е. условиях гипоксии оказывает защитное действие на функционально-метаболические параметры изолированных гепатоцитов преимущественно НУ крыс: повышает содержание ATO и активность иштеза мочевины, проявляет тенденцию к сккжгнив выходе. ДЦГ. Е метках же ЕУ швотных РВ-212 в небольшой степени повышает содержание АТФ и только при 6 -mkIÍ 0¿. На активность ЮЛ ГЕ-212 действует 2-х фезнс: в течение перЕого часа оказывая проокскдант-ный аффект, а е течение второго, наоборот, антиоксидантный (рис.6). Это может быть связано с тем, что гидроксклъная группа, ответственная за ¿ктиоксидантпую еютиеность, у ГЕ-212 ' закрыта карбамоилом и для ее освобождения необходимо время.

Как мы и предполагали на основании ранее полученных данных о слабой токсичности ГБ-283 в концентрации 10 U, эти свойства усиливается при длительной инкубации в карбогенсодержащей среде. Это выражается в снижении содержания АТФ, подавлении синтеза мочевины и увеличении проницаемости плазматических мембран. В условиях гипоксии токсические аффекты ГЕ-"288 усиливается и проявляются преимущественно в гепатоцитах НУ- крыс, что может быть связано или с исходно большей чувствительностью этих клеток к токсическому действия соединения, или с изменением его метаболизма в условиях гипоксии.

Еа основании данных об антигилоксических, мембрано-стабили-зируших и антдаксидвптЕЫх свойствах производных оксипиридина," полученных на изолированных гепатцнтах в условиях гипоксии, шжио сделать закличение, что предлагаемая модель адекватно отвечает на воздействие ксенобиотиков с известными свойствами и позволяет • учитывать индивидуальные особенности клеточного метаболизма.

1.2 3 60 'кия

I 2 3 120 ыпн

Где..5; Влияние ГБ-288 на содержание А1Ф в-изолированных гепатоцитах Б7 и НУ крыс в процентах к содержанию в условяях карбогеяа без вещестга . ...

I - 900 мкМ Ос

2 - 10 мкМ Оо

3 - 6 мкМ 0^

без вещества

У///А - Ю-5 М ГБ-2В8

I 2 I 2

" 10 мкМ_02, - 6 мкМ 02 '

Рис. 6'. Влияние ГБ-212 на скорость синтеза ТЕК-РП в изолированных гегатоцитах ВУ- и ЕУ крыс в процентах к скорости без вещества I - Ю-4 М ГБ-212 2 - Ю-5 М ГБ-212

- без вещества ~ 60 мин инкубации

//////t ~ 120 шн инкубации

- 21 -ЕЫЕОДЫ.

'1. Изолированные гепатоциты, полученные методом о использованием: коллагедазы в модификации автора, сохраняют на протяжкж 2-х часов 1 инкубации в карбогенсодержааей среде высокую жизнеспособность (85-937.), стационарный энергетический статус, специфическую ' для печени фуякцконр.ггънуи активность - синтез мочевины, поддерживают постоянной проницаемость мембран и интенсивность ЮЛ. Это позволяет иопользогать их в качестве модельных тест-систем для оценки геп.=тотокс1гчностн, изучен:« механизмов гипоксии и отбора антигипоксантов.

2. Дгя выявления токсического действия ксенобиотиков на суспензии изолированных гепатоцтгов предлагается комплексное исследование зависимости эффектов от концентрации с использованием v чувствительных критериев - синтеза мочегины и содержания ATO, а Talcs-.- оценки состояния плазматических мембран клеток и пнтенсив-hocti: ШЛ, позволяющее выявлять метаболические мииенн.

3. Изменения 6ункц;:окал-;но-метабол1Г£еских показателей иэолиро-jaíir^ гепзтоцитоз зависят от степени снижения рОди длительности гипоксического воздействия. Наиболее чувствительными параметрам!, реагирующими .па низкие, концентрации 02. _ являйгея синтез мочевины и содержание АТФ. Увеличение проницаемости плазматических мембран при гипоксии жетупает позже, чем подавление этих 2-х функций. Уменьшение содержания О¿ в среде, инкубации клеток вызывает прогрессивное подавление ПОЛ, ' сменяющееся небольшой его активацией лишь при очень низких значениях р02.

4. Потери АТ<5 в гепатощгтах ii подавление синтеза мочевины, свя- . эанные с гипоксией, не компенсируются активацией гликолиза, т. е. зависят, - вероятно, от нарушений функции дыхетельной цепи.

Б. Нз основании изучения зависимости содержания АТФ и синтеза мочйекны от рС^ для изолированных гепатоцптеэ установлена область оптимальной концентрации кислорода в среде инкубации (100-200 мкУ 02), коррелирующая с оксигенацией в условиях in vivo, и область гипоксического режима (50 мк11 ОэИ менее).

5. Гепатоциты ЕУ крыс характеризуются -более высокой сравнительно с гэпатецитзмк НУ животных резистентностью к гипоксии, оцениваемой по ?зо для АТФ и синтеза мочевины, поваленной способностью гликолиза к активации при низких р02 и меяьЕей лайилизацией мемб-

рал в этих условиях.

7. Проведение комплексного исследования по функциэнально-метабо-лзгческим- критериям -эффектов 3-х производных оксипиридина подтлер- . дило -получеЕЕые . ранее на других объектах их защитное действие в условиях гипоксии. Антигипока:гческий афйает мексидола, сочетающийся с антиоксидантной активностью, и Г3~258 равзивазтся быстрее б гепатоцитах ВУ животных. ГБ-212 вшцяшрет только клетки печени НУ крыс. Для ГЗ-208 в высокой концентрации (10 10 показано проявление токсических свойств, выраженных только в гепатоцитах ЕУ ми-

еотных. . .

8. Антигшгаксические свойства веществ оцениваются по уменьшению под их влиянием ингибируищего действия острой гипоксии ( 10 мкМ ОдИ менее) на содержание АТФ иди синтез мочевина. С этой целью могут быть испольеоЕаны кинетические зависимости САТЯ/СО^З

С мочевина]/[Оа]. Предложенный комплексный подход при исследовании" функционально-метаболических свойств ' изолированных гепатоцитов позволяет изучать механизм' действия ксенобиотиков в норме и а

условиях гипоксии.

Список работ, опубликованных по теме диссертацш-:.

1. Индукция цктохрома Р-450 в гипокслческих условия:; у адаптированных и неадаптированных крыс. / Тезисы докладов I ■Всесоюзной конференции 'Чермакологнческак коррекция гшсксических состояний", Москва, 1S88, с. 42. (Соавт. Дудченко А. М. , Уголэе А.Т.).

2. Влияние эмоционально-болевого стресса на индукции цитохрома. Р-450 в печени крыс. / Бкшют. аксперим. биол. и медиц. , 1989, "том CXI 11, N. 7, с. 43-БО. (Соавт. Уголев А. Т, Дудченко А. М, ЛукьяноЕаЯ. Д.).

3.* Процессы бштраксформации в первичной суспензии гепатоцитов -модель для изучения острой токсичности. / Материалы Всесоюзной конференции "Оценка фармакологической активности химических соединений: принципы и подходы", Москва 1989, частьI, с. 107. (Соавт. Дудченко 'k.M.).

4. Особенности регуляции энергетического обмена в изолированных гепатоцитах при' гзшэкии.'/ Тезисы докладов-Всесоюзного, совещания "Физиология к биоэнергетика гипоксии", Пущино, 1S90, с.15. (Соавт. Дудченко А. Ы. , Лукьянова JL Д. ).

5. Оценка энерготоксическогс действия ьнтигкпоксантов на модели изолированных гепатоцитов крыс. / материалы 2-й Бсесовзкэй кокфе-

рекции "£ега..акологячэская коррекция гштакических состояний", Гродно, 1931, часта I, с. 6-7. (Соавт. Дудченко А. Л). ■ С. Ревкц:к системы бкотраЕсформации в клетках печени - на гипоксия. / 1!зтерпалы 2-Я Ееесокзной конференции "Фармакологическая коррекция гяпоксических состояний"., .Гродно. 1991, с. 95-97. (Соавт. Дудченко А. !£ , Уголев А. Т. , Лукьянова Л.Д.). 7. Соотношение зпергслотребляюднх и энергосинтеэирунцих реакций в гепатоцитах крыс при разных С,д-дефицитных состояниях. /Еэлл. эксперта*. спод. и мед. , 1992, N12, с. 588-590. (Ссавт. Дудченко А. Ы. , Лукьяноза £Д),

' 9. 'Влияние сукшнат-содеркаиих антигшоксантоа на функцкональ-но-метаболические параметры изолированных гепатоцитоз. / Материалы Российской научней конференции "Антигипоксанты и ектспротекторы: i™c.-:t и перспективы1', Сг.:--:т-Петербург, 1994 {Совят. Шепелева С. ¡0. , , Дуд-ленко А. И.).

ч. О ооотношенки енергопотреблахзх'-с и знэргосинтзвкрукязш • реакций в гепатоцитах крыс прл разных С^-дефнкитных состояниях. / Иа-Tep:i2jin ручной конференции молодых ученых России "Згоровье и болезни человека на рубеже XXI зека", Москва, 1994.