Автореферат и диссертация по медицине (14.01.14) на тему:Изменение микрофлоры полости рта на ранних стадиях ортодонтического лечения на несъемной аппаратуре

4848470

На правах рукописи

ЛЕВКОВИЧ ДАРЬЯ ВЛАДИМИРОВНА

ИЗМЕНЕНИЕ МИКРОФЛОРЫ ПОЛОСТИ РТА НА РАННИХ СТАДИЯХ ОРТОДОНТИЧЕСКОГО ЛЕЧЕНИЯ НА НЕСЪЕМНОЙ АППАРАТУРЕ

14.01.14 - СТОМАТОЛОГИЯ 03.00.07 - МИКРОБИОЛОГИЯ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 ИЮН 2011

Санкт-Петербург - 2011

4848470

Работа выполнена на кафедре пропедевтики стоматологических заболеваний и на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии ГОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор

_Бобров Анатолий Петрович

акад. РАЕН, доктор медицинских наук, профессор Тец Виктор Вениаминович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Фадеев Роман Александрович

доктор медицинских наук, профессор Савичева Алевтина Михайловна

Ведущее учреждение: Военно-медицинская академия им.С.М.Кирова

Защита диссертации состоится « » июня 2011 года в «часов на заседании диссертационного совета Д 208.090.04 при ГОУ ВПО «Санкт-Петербургский Государственный медицинский университет им. академика И.П. Павлова Федерального Агентства по здравоохранению и социальному развитию РФ» по адресу: 197022, Санкт-Петербург, ул. Льва Толстого, 6/8, главное здание, зал заседаний Ученого сове-

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГОУ В ПО «Санкт-Петербургский Государственный медицинский университет им. академика И.П. Павлова Федерального Агентства по здравоохранению и социальному^азвихию РФ».

Автореферат разослан

/Л с <£acZ .2011 года.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук,

профессор

В.В. Дискаленко

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Наличие в полости рта ортодонтического аппарата ухудшает условия для ее самоочищения, осложняет уход за зубами и создает условия, благоприятствующие отложению мягкого зубного налета. В связи с этим отмечается высокое микробное обсеменение поверхностей зубов и ортодонтических аппаратов с покрытием их обширным мягким налетом [Хамитова Н.Х., 1986; Горонкина С.М., 1996; Sukontapatipark W. et al., 2001], что, в свою очередь, ухудшает процессы реминерализации эмали и ведет к нарушению ее структуры. Кроме этого наблюдается значительное изменение состава микрофлоры полости рта, которое проявляется увеличением числа патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, явлениями дисбактериоза [Ростокина Е.Б., 1979; Карницкая И.В., 1999]. Перечисленные факторы способствуют повышению распространенности кариеса зубов и воспалительных заболеваний пародонта [Перова Е.Г., 2000; Арсенина О.И. и др., 2005; Perinetti G. et al., 2004; Sallum E.J. et al., 2004; Speer C„ 2004].

Несмотря на очевидную актуальность, проблема распространения условно-патогенных и патогенных микроорганизмов при лечении зубочелюстых аномалий на несъемной ортодонтической аппаратуре остается недостаточно изученной. Современные генетические исследования показали, что 95-99% нормальной микрофлоры пока неизвестны и не поддаются культивированию. Кроме бактерий, в полости рта находятся археи, грибы, простейшие и различные вирусы [Samaranayake L.P, 2006; Quivey R.G. Jr., 2006]. Особенности существования микроорганизмов в различных биотопах полости рта тесно связаны с их способностью образовывать стойкие микробные сообщества, получившие название биопленки. Биопленка является идеальной нишей для обмена генетической информацией между бактериями. Передача генов в биопленках наблюдается в 10-500 раз чаще, чем в планктонных клетках [Li Y.H. et al., 2001; Wuertz S„ 1999; Roberts A.P. et al., 1999; Ghigo J. M„ 2001]. В биопленке происходит ускоренный горизонтальный перенос генетического материала и она становится совершенной средой для появления микроорганизмов с новыми патогенными свойствами, устойчивостью к антимикробным препаратам и способностью к выживанию в различных условиях. Перераспределение генов в микробных биопленках полости рта приводит к формированию штаммов, устойчивых к антисеп-тикам/дезинфектантам и антибиотикам [Stewart P.S., 2002; Keren Т., Shah D., Spoering D„ Kaldalu N„ and Lewis K„ 2004].

Свойства бактерий биопленок объясняют, почему стандартная терапия часто не способна справиться с бактериями, в результате чего после завершения курса лечения они способны размножаться и вновь диссеминировать, приводя к формированию обострений и хронизации инфекции.

Особенности действия антимикробных препаратов на бактерии биопленок, формирующихся при ортодонтическом лечении несъемной аппаратурой, остаются практически не изученными. Профилактика распространения инфекции в полости рта

и борьба с колонизацией бактериями, способными вызывать воспалительные заболевания полости рта и соматическую патологию, остаются чрезвычайно актуальными.

Цель исследования

Повысить эффективность мер профилактики распространения патогенных и условно-патогенных микроорганизмов у пациентов с зубочелюстными аномалиями при ортодонтическом лечении несъемной аппаратурой.

Задачи исследования:

1. Изучить микрофлору зубодесневой борозды у пациентов с различными формами зубочелюстных аномалий до установки ортодонтической аппаратуры и в ходе лечения. Дать характеристику биологических свойств микроорганизмов.

2. Выявить встречающиеся устойчивые микробные биопленки. Определить строение возбудителей стабильных микробных биопленок, выявленных у пациентов при использовании несъёмной ортодонтической аппаратуры.

3. Провести сравнительную оценку клинической эффективности антимикробных препаратов в условиях эксперимента.

4. Предложить схемы профилактики и антимикробной терапии с учетом анализа данных исследования микробных биопленок.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Формирование микробного пейзажа полости рта анаэробными и аэробными микроорганизмами до начала лечения на несъемной ортодонтической аппаратуре и выявление устойчивых микробных биопленок на ранних стадиях ортодонтического лечения на поверхности несъемной ортодонтической аппаратуры.

2. Качественная и количественная оценка возбудителей стабильных микробных биопленок, способных изолироваться от внешней среды, выделенных с поверхности несъемной аппаратуры у пациентов, проходящих ортодонтическое лечение.

3. Антимикробные препараты, содержащие ДНКазу, способные проникать внутрь микробных биопленок. Профилактические и лечебные схемы этиотропного воздействия, позволяющие учитывать индивидуальную чувствительность бактерий и дающие возможность уменьшить количество осложнений и улучшить результаты лечения.

Научная новизна исследования

Воздействие на внеклеточную ДНК матрикса микробных биопленок приводит к изменению их свойств. Создаются условия для повышения эффективности антимикробной терапии воспалительных процессов полости рта у пациентов, проходящих лечение на несъемной ортодонтической аппаратуре. С особенностями выживания бактерий в биопленках в значительной степени связана неэффективность антимик-

робной терапии и хронизация инфекции в стоматологической практике. Результатом низкой эффективности уничтожения микробных биопленок является их длительное существование в организме, в том числе в полости рта, и, как следствие, возможность оказывать постоянное влияние на состояние здоровья человека. Таким образом, немногочисленные сообщения в литературе о роли применения антимикробных препаратов, проникающих в микробные биопленки, послужили основанием для проведения клинических исследований.

Практическая значимость

Полученные данные об образовании устойчивых микробных биопленок на поверхности слизистой оболочки полости рта и несъемной аппаратуре (брекетах) у пациентов с зубочелюстными аномалиями послужили основанием для разработки эффективных схем применения антимикробных препаратов. Включение в комплекс профилактических и лечебных мероприятий методов этиотропного лечения, разработанных на основе чувствительности бактерий биопленок, позволяет уменьшить количество осложнений и улучшить результаты лечения.

Внедрение результатов исследования в практику

Разработанные лечебно-профилактические мероприятия по снижению образования устойчивых микробных биопленок на поверхности слизистой полости рта и несъемной аппаратуры у пациентов с зубочелюстными аномалиями внедрены в практику стоматологической клиники «Стомус» г. Санкт-Петербурга, а также используются при проведений лекций и семинаров для врачей и интернов на кафедре пропедевтики стоматологических заболеваний, кафедре терапевтической стоматологии СПбГМУ им. академика И.П. Павлова; при проведении научных исследований на кафедре челюстно-лицевой хирургии СПбГМУ им. академика И.П. Павлова.

Апробация материалов диссертации

Материалы диссертации доложены: на II Международном молодежном медицинском Конгрессе «Санкт-Петербургские научные чтения» (Санкт-Петербург, 2007), III Международном медицинском Конгрессе «Санкт-Петербургские научные чтения» (Санкт-Петербург, 2009), LXVIII конференции «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической медицины» (Санкт-Петербург, 2007), Международной конференции «Современные методы диагностики и лечения стоматологических заболеваний» (Воронеж, 2010), Всероссийской стоматологической конференции «Новейшие технологии в стоматологии» (Краснодар, 2010).

По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ, в том числе 3 в журналах рекомендованных ВАК Минобразования РФ.

Личный вклад автора

Автором лично проведен анализ отечественной и зарубежной литературы по изучаемой проблеме. Обследовано 105 пациентов, проведено комплексное лечение выявленных заболеваний пародонта при ортодонтическом лечении на несъемной аппаратуре, проведен анализ результатов микробиологического исследования, статистическая обработка данных, сформированы выводы и практические рекомендации.

Доля автора в проведении микробиологических исследований составляет 80%, а в проведении клинического исследования 100%.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 134 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, главы с изложением результатов собственных исследований, обсуждения полученных данных, заключения, выводов и практических рекомендаций. Библиографический указатель содержит 130 отечественных литературных источников и 167 иностранных. Работа иллюстрирована диаграммами, таблицами и рисунками.

Автор искренне благодарен своим научным руководителям: акад., д.м.н., проф.

Тецу В.В. и д.м.н., профессору |Боброву А.П.| за предоставленную тему, научное руко-

водство и неоценимую помощь в реализации клинической микробиологической частей исследования.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Работа была выполнена на базе кафедры пропедевтики стоматологических заболеваний СПбГМУ им. акад. И.И. Павлова, на базе клиники ООО «Стоматологический центр «Стомус» и на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова в 2007-2009 годах. Исследование проводилось в Центре клинической микробиологии СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова*

Для решения поставленных задач в ходе исследования было обследовано 105 мужчин в возрасте от 19 до 40 лет с различными аномалиями прикуса без видимых признаков воспаления пародонта. Все пациенты были разделены на 3 группы по 37, 35 и 33 человека соответственно в зависимости от применяемой схемы антимикробной терапии.

Пациенты I группы в комплексном лечении применяли гелеобразную композицию на основе антисептика мультицида и вещества, изменяющего свойства матрикса микробных биопленок (состав: антисептик мультицид в концентрации 250 мг/л, дезок-сирибонуклеаза 10 мг/л, карбоксиметилцеллюлоза, дистиллированная вода,

*- хочу выразить благодарность с.н.с. Доморад А. А. и ст.лаб. Яковлевой О.М. за помощь в исследовании в Центре клинической микробиологии СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова.

глицериновое масло, масло мяты). Пациенты II группы использовали раствор на основе антисептика хлоргексидина биглюконата в концентрации 2000 мг/л (состав: хлоргексидин, вода очищенная). Пациентам III группы не проводили специфической терапии.

Композиция с антисептиком (1 группа) апплицировалась массажными движениями на десны самими пациентами по 2 раза в день в течение 7 дней каждый месяц (3 курса).

На одну обработку десен расходовалось около 2,5 мл геля. Гель наносился после чистки зубов. После аппликации пациентам было рекомендовано воздержаться от приема лищи и напитков в течение 1 часа. Раствор хлоргексидина (2 группа) применялся в домашних условиях по заданной схеме: двукратное применение в виде ротовых ванночек (в течение 1 минуты) после еды в течение 7 дней каждый месяц (3 курса).

В комплекс лечебных мероприятий перед установкой несъемной ортодонтической аппаратуры во всех группах обследуемых входила санация полости рта (терапевтическая и хирургическая), проведение профессиональной гигиены полости рта. Обследование пациентов проводили через 2, 4-6, 8-10 и 12 недель после установки несъемной ортодонтической аппаратуры.

Клинические методы исследования. Пациентам всех групп по единому плану проводили комплекс диагностических мероприятий, включавших в себя клинические, рентгенологические и лабораторные методы обследования.

Оценка подвижности зубов определялась по Энтину Д.А.. Определяли гигиенические индексы: индекс Федорова Ю.А. и Володкиной В.В. (1971), упрощенный гигиенический индекс OHI-s (J.C.Green, J.R.Vermillion, 1969), пародонтальные индексы: индекс кровоточивости (ИК) (Miihleman, 1971), папилло-маргинально-альвеолярный индекс (РМА индекс, Massler, Schour 1949, в модификации Parma, 1960).

Для более полного представления о состоянии тканей пародонта проводили рентгенологическое обследование. На ортопантомограмме определяли тип и степень резорбции костной ткани, состояние межальвеолярных перегородок, глубину костных карманов.

Обследование проводили на базе рентгенологического кабинета клиники «Стомус» на оборудовании Orthophos 98.

Статистическая обработка материала выполнялась с использованием стандартного пакета программ прикладного статистического анализа (Statistica for Windows v.6.0). Критический уровень достоверности нулевой статистической гипотезы (об отсутствии значимых различий или факторных влияний) принимали равным 0,05.

Материал для микробиологического исследования. Материал забирали в соответствии со стандартной методикой: три стерильных бумажных штифта N20 погружали на 3 секунды в десневую борозду 14 зуба, избегая соприкосновения штифта с поверхностью зуба и слизистой губ. Бумажные штифты помещали в стерильные пробирки с 1,0 мл транспортной среды Эймса с углем. Предварительно были подготовлены и заполнены карты-анкеты микробиологического обследования стоматологических пациентов. Материал доставляли в лабораторию в течение 24 часов.

Микроорганизмы. Использованные в ходе проведения экспериментальной части исследования, выделенные от пациентов в ходе ортодонтического печения с помощью несъемной аппаратуры: Streptococcus mitis VT1007 и Neisseria subflava VT4007, а также стандартные штаммы бактерий из международных коллекций: Staphylococcus aureus АТСС 29213, Escherichia coli АТСС 25922 и Staphylococcus aureus VT 209 из коллекции кафедры микробиологии СПбГМУ им.акад. И.П.Павлова

Питательные среды. Использованы: мясопептонный бульон (МПБ), мясопеп-тонный агар (МПА), минимальная синтетическая среда МЭ, бульон Мюллер-Хинтон (bioMerieux, Франция), агар Мюллер-Хинтон (bioMerieux, Франция), Шедпер бульон (bioMerieux, Франция), Шедпер агар (bioMerieux, Франция) и трипказосоевый агар (bioMerieux, Франция). Для транспортировки собранного материала от пациентов использовали транспортную среду Эймса (Sarstedt, Германия) и Шедлер бульон (Schad-ler Broth BBI).

Антисептики. В работе использованы синтетические антисептики - хлоргекси-дин биглюконат - 1,6-бис-5 /(пара-хлорфенил) бигуанидо/ -гексан и полигуанидиновый антисептик мультицид.

Диски с антибиотиками для определения чувствительности к антибактериальным препаратам. В работе использованы: азитромицин (НИЦФ РФ), амокси-циллин-клавуланат (20/10 мкг) (HiMedia, Индия), ампициллин (Юмкг) (HiMedia), лево-флоксацин (10мкг) (НИЦФ РФ), клиндамицин (2мкг) (HiMedia), метронидазол (5шг) (HiMedia), оксациллин (1мкг) (HiMedia), цефаклор (ЗОмкг) (HiMedia), эритромицин (15мкг) (НИЦФ РФ).

Диагностические диски. В работе использованы: бацитрацин (10ЕД) (НИЦФ РФ), ванкомицин (5мкг) (HiMedia), генциан-виолет (1:10000) (НИЦФ РФ), желчь (25мг) (НИЦФ РФ), канамицин (ЮООмкг) (НИЦФ РФ), колистин (5мкг) (HiMedia), неомицин (ЮООмкг) (НИЦФ РФ), оптохин (НИЦФ РФ) пенициллин (2ЕД) (НИЦФ РФ), рифампи-цин (15мкг) (НИЦФ РФ), сапонин (НИЦФ) (НИЦФ РФ), эритромицин (60мкг) (НИЦФ РФ).

Ферментные препараты. Использованы дезоксирибонуклеаза-ДНКаза1 (ООО «Самсон», Россия), папаин (Loba Chemie).

Методы бактериологического исследования. Определение жизнеспособности бактерий, количественное определение микроорганизмов в клиническом материале, определение чувствительности к антимикробным агентам, определение минимальной подавляющей концентрации антибиотиков, получение биопленок в стеклянных флаконах, в чашках Петри, в пластиковых планшетах.

Культивирование аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов. Аэробные и факультативно-анаэробные бактерии выращивали на бруцелла и трипказосоевом агаре (bioMerieux, Франция) с добавлением 5% дефибринированной крови человека. Посевы инкубировали в течение 18-24 часов при температуре 35°С в атмосфере с повышенным содержанием СОг

Культивирование анаэробных микроорганизмов. Анаэробные микроорганизмы культивировали на 5% кровяном Шедлер или бруцелла агарах (bioMerieux, Франция) с инкубацией в течение 48 часов при температуре 35°С в газогенераторных пакетах GENbag апаег (bioMerieux, Франция).

Количественное определение микроорганизмов в клиническом материале. Для количественной оценки жизнеспособности бактерий определяли число коло-ниеобразующих единиц (КОЕ) методом серийных разведений. Для этого готовили последовательные десятикратные разведения в изотоническом растворе хлорида натрия и по 0,1 мл высевали на агаризованную среду, после чего инкубировали 24 часа при Т= 37°С и подсчитывали количество выросших колоний.

Идентификация выделенных микроорганизмов. Идентификацию выделенных культур осуществляли общепринятыми методами, с учетом тинкториальных, морфологических, культуральных и биохимических свойств (Bergey, 1998).

Определение чувствительности к антимикробным препаратам. Чувствительность бактерий к антибиотикам определяли на плотной питательной среде диско-диффузионным методом. На поверхность плотной питательной среды (агар Мюллер-Хинтон), засевали тест-микроб (бактериальную суспензию вносили в количестве, соответствующем стандарту мутности 0,5 по McFaiiand) и накладывали стандартные диски, содержащие различные антибиотики. Результат учитывали после 24-48 часовой инкубации по общепринятому методу с использованием соответствующих таблиц для оценки эффективности действия препарата.

Определение минимальной подавляющей концентрации антибиотиков. Минимальную подавляющую концентрацию (МПК) антибиотиков определяли на жидкой и плотной питательных средах, используя метод серийных разведений.

Получение микробных биопленок в пластиковых планшетах. Микробные биопленки получали в пластиковых 96-ти луночных планшетах (Sarstedt, Германия) используя метод, описанный O'Toole G.A. и Kolter R. [O'Toole G.A., Kolter R., 1998]. Получение внеклеточного матрикса. После удаления среды с бактериями, растущими планктонно, микробные биопленки промывали фосфатным буфером, смывали или соскабливали с поверхности в минимальном объеме дистиллированной воды или изотонического раствора хлорида натрия. Полученную суспензию центрифугировали для разделения на фракции клеток и внеклеточного матрикса.

Выявление генов 16S рибосомальной ДНК в межклеточном матриксе. Внеклеточную ДНК из матрикса микробных биопленок выделяли фенол-хлороформным методом. Для поиска 16S рибосомальной ДНК нами была выбрана следующая пара олигонуклеотидных праймеров:

5-TCCTACGGGAGGCAGCAGT-3' и 5,-GGACTACCAGGGTATCTMTCCTGTT-3' с длиной ампли-кона равной 466 нуклеотидов (Бласт). Праймеры были синтезированы в ООО "Син-тол". Исследование проводили в присутствии 0,2% тМ каждого из дезоксинуклеотид-трифосфатов 2,5 mM MgCI2, 30 тМ Трис-HCI (рН 8,5 при +250С), 16 mM (NH4)2S04, 0,1% Nonidet Р40 ("Sigma"), по 0,5 мкл олигонуклеотидных праймеров и 2,5 Ед Dia Taq ДНК полимеразы (Россия) на амплификаторе "Teche" (Англия). Условия проведения ПЦР: 95°С 3 мин 30 сек; затем 94°С 15 сек, 58°С 30сек; 72°С 45 сек- 37 циклов; затем 72°С 7 минут 35 секунд. ПЦР фрагменты анализировали электрофорезом в 2% ага-розном геле окрашиванием бромистым этидием. С помощью маркера молекулярной массы (100 bp DNA Ladder BioLabs 500 мкг/мл) подтверждали соответствующие размеры интересующего фрагмента искомого ампликона. В качестве положительного

контроля использовали 2,5 мкл бактериальной культуры E.coli АТСС 25922 в концентрации 105 клеток/мл. Негативный контроль отражал наличие контаминации ПЦР реактивов бактериальной ДНК. Для этого, вместо опытных образцов, к ПЦР реактивам добавляли 2,5 мкл стерильной воды для инъекций (Микроген, Россия).

Электрофорез в агарозном геле. Для идентификации фрагментов ДНК проводили электрофорез в 0,7-2,0% агарозном геле (Serva, Германия). В качестве буфера использовали 50мМ трис-ацетатный буфер (0,04 М пятидесятикратного трис-ацетата, 0,002 М ЭДТА, вода), рН 7,5. Окраску фрагментов ДНК производили флуоресцирующим красителем - бромистым этидием (Serva, Германия).

Результаты исследования

Всего под наблюдением находилось 105 человек с различными аномалиями прикуса без видимых признаков воспаления тканей пародонта. Случайным распределением было сформировано 3 группы пациентов для осуществления запланированных лечебно - профилактических мероприятий с использованием геля на основе мультици-да и ДНК-азы1 (I группа - 37 человек), раствора хпоргексидина (II группа - 35 человек) и не получающих специального антибактериального лечения (III группа - 33 человека).

По результатам анкетирования было выявлено, что обследованные пациенты имели хороший уровень гигиены полости рта. 84 пациента (80%) проводили индивидуальную гигиену полости рта 2 раза в день, 21 опрошенный (20%) -1 раз в день, притом отдавали предпочтение утреннему сеансу чистки зубов. 86 обследованных (82%) использовали дополнительные средства гигиены полости рта. 58 пациентов (55%) не были информированы о необходимости очищать от налета поверхность языка. Профессиональную гигиену полости рта проводили все 105 (100%) обследованных. 38 (36%) проводили ее регулярно, не реже 1 раза в 3 месяца, 40 (38%) - не реже 1 раза в 6 месяцев и 22 (26%) - не реже 1 раза в год.

На основании статистической обработки результатов анкетирования различий между группами не было выявлено.

Жалоб со стороны слизистой полости рта пациенты на первичном приеме не предъявляли.

При осмотре полости рта у 105 (100%) обследованных, слизистая десневого края была бледно-розовая, плотная. Ретракции десневого края, кровоточивости, па-родонтальных карманов, подвижности, пародонтальных абсцессов, гнойного отделяемого ни у кого из обследованных обнаружено не было. У части обследованных 74 (70,4%) определялся мягкий зубной налет, у 36 (34,3%) - пигментированный зубной налет, минералированных поддесневых и наддесневых зубных отложений не было выявлено. Гигиенические и пародонтальные индексы в различных группах до лечения представлены в таблице 1.

Таблица 1

Гигиенические и пародонтальные индексы в различных ___группах до лечения_

Группа Значение индексов

ИГФВ (баллы) OHI-s (баллы) РМА (%) ИК (баллы)

1 группа (37 человек) 1,41±0,01 0,91±0,01 0%±0,01 0±0,02

2 группа (35 человек) 1,37±0,01 0,89±0,12 0%±0,02 0±0,01

3 группа (33 человека) 1,28±0,06 0,92±0,11 0%±0,01 0±0,03

При рентгенологическом обследовании у 105 обследованных (100%) не было выявлено признаков резорбции костной ткани.

У всех 100% обследованных, включенных в исследовательские группы, отсутствовали видимые признаки воспаления тканей пародонта. Использование пациентами I и II группы назначенных антисептических препаратов хлоргенсидина и композиции мультицида и ДНКазьИ через 4-6 недель привело к достоверному снижению индексов гигиены (ИГФВ, OHI-s) по сравнению с началом лечения. Пародонтальные индексы (РМА ИК) в этих группах остались без изменений. В III группе мы наблюдали увеличение как гигиенических индексов, так и пародонтальных. Через 8-10 недель после установки ортодонтической аппаратуры в 1 группе наблюдалось дальнейшее снижение гигиенических индексов, во II группе после незначительного увеличения на сроке 4-6 недель гигиенические индексы вернулись к первоначальным показателям. Индексы РМА и ИК в I и во II группе остались на прежнем уровне. В III группе на этих сроках лечения произошло увеличение, как гигиенических, так и пародонтальных индексов, что соответствует начальной стадии воспаления тканей пародонта. Через 12 недель после установки ортодонтической аппаратуры в 1 и II группе значения гигиенических индексов (ИГФВ и OHI-s) оставались на уровне соответствующих «хорошей гигиене полости рта», пародонтальные индексы (РМА и ИК) оставались неизменны по сравнению с первоначальными. В 111 группе индексы гигиены и пародонтальные индексы продолжали увеличиваться, т.е. продолжала нарастать степень воспаления тканей пародонта (табл.2).

При анализе значений гигиенических и пародонтальных индексов на разных этапах лечения нами было выявлено, что снижение значений индексов было достоверно по сравнению с результатами на момент начала наблюдения (р<0,05). Достоверными также оказались отличия значений всех представленных индексов в I и II группе по отношению к III (контрольной). Это свидетельствует о благоприятном клиническом эффекте исследуемых антисептических средств для профилактики воспалительных заболеваний пародонта. По результатам расчета всех гигиенических индексов наиболее значительное улучшение гигиены полости рта произошло в 1 группе пациентов, которые применяли гель на основе мультицида и ДНК-азы1, а низкий результат был получен в III контрольной группе, не получавшей специального лечения.

Редукция значений ИГФВ и индекса OHI-s была наиболее выражена в I группе на всех сроках лечения (рис.1, 2) Во II группе в первые 4 недели после установки несъемной аппаратуры произошло увеличение этих индексов с их последующим восстановлением до исходных значений. В III группе изменения значений данных индексов оказались наиболее неблагоприятными во все сроки наблюдения. Индексы РМА и ИК возросли только в III контрольной группе (рисунки 3,4)

Таблица 2

Динамика изменения пародонтальных и гигиенических индексов

в течение 12 недель после установки ортодонтической аппаратуры

Группы Сроки наблюдения ИГФВ (баллы) OHI-s (баллы) РМА (%) ИК (баллы)

1 группа 37человек 2 недели 1,43+0,2 0,97±0,01 0%±0,01 0,0+0,02

4-6 недель 1,28±0,01#* 0,81±0,02#* 0%± 0,03#* 0,0+0,02#*

8-10 недель 1,12±0,1#* 0,41±0,04#* 0%±0,01#* 0,0±0,01#*

12 недель и > 1,05±0,02#* 0,21±0,02#* 0%±0,02#* 0,0+0,01#*

2 группа 35человек 2 недели 1,37±0,01#* 0,89+0,17#* 0%±0,01#* 0,0±0,02#*

4-6 недель 1,56±0,02#* 0,97±0,08#* 0%±0,02#* 0,0±0,01#*

8-10 недель 1,35±0,04#* 0,78±0,08#* 0%±0,03#* 0,0±0,01#*

12 недель и > 1,34±0,03#* 0,61±0,03#* 0%±0,02#* 0,0±0,03#*

3 группа ЗЗчеловека 2 недели 1,29±0,03#* 0,99±0,06#* 0%±0,03#* 0,0±0,02#*

4-6 недель 1,49±0,03* 1,41+0,06* 2,209%±0,08* 0,135+0,05*

8-10 недель 1,87+0,04* 1,79+0,11* 3,378%±0,06* 0,366+0,08*

12 недель и > 1,99+0,03* 1,87+0,04* 3,738%±0,17* 0,399+0,07*

# - р<0,05 различия достоверны по отношению к контрольной группе(3 груп-

па) (межгрупповой анализ)

* - р<0,05 различия достоверны по отношению к группе до лечения (внутри групповой анализ)

2 недели 4 — 6 недель 8 -10 недель 12 недель и >

EJ1 группа <х 2 трупа ВЗ группа

Рис.1 Изменение ИГФВ в группах в течение 12 недель после установки ортодонтической аппаратуры

Рис.2 Изменение OHf-s в группах в течение 12 недель после установки ортодонтической аппаратуры

2 недели 4 — 6 недель 8 10 недель 12 недель и > S3 1 группа О 2 група И 3 группа

0,97

3- 2

о 1

о. 1 с

О

3.378%

3.738%

2,209% 0% 0% 0% 0% 0%

2 недели 4-6 недель 8 -10 12 недель и недель >

в 1 группа » 2 група « 3 группа

Рис.3 Изменение РМА в группах в течение 12 недель после установки ортодонтической аппаратуры

0,500

2 недели 4-6 недель

8-10 недель

12 недель и >

Ш1 группа 0 2 група □ 3 группа

Рис.4 Изменение индекса кровоточивости в группах в течение 12 недель после установки ортодонтической аппаратуры

Изменение микрофлоры полости рта при ортодонтическом лечении.

До установки ортодонтической аппаратуры в десневой борозде у пациентов, не имеющих видимых признаков воспаления слизистой оболочки полости рта, были обнаружены различные аэробные и анаэробные микроорганизмы. Среди выделенных аэробов 49% составляли грамположительные кокки (Stomatococcus mucilaginosus, Streptococcus spp., Staphylococcus epidermidis, Enterococcus spp.), 25% -грамотрицательные кокки (Neisseria spp.), 4% - грамотрицательные палочки (Alcali-genes spp.) и 22% - грамположительные палочки (Corynebacterium spp.).

Анаэробные микроорганизмы у исследованных нами пациентов в 25 % случаев были представлены грамположительными кокками (Peptostreptococcus spp., Рер-tococcus niger, Staphylococcus asaccharolyticus), грамположительными палочками -всего 27% (Lactobacillus spp., Propionibacterium spp., Actinomyces spp., Bifidobacterium spp.), грамотрицательными папочками - 13 % (Fusobacterium spp.), грамотрицатель-ными кокками - 32% (Veilonella spp.) и извитыми формами - 3% (Leptotrichia buccalis).

Представители родов Fusobacterium spp., Streptoccoccus spp., Corynebacterium spp., Veilonella spp., Neisseria spp. и Staphylococcus spp., которые, как установлено, могут вызвать заболевания пародонта, а также поражения различных органов, обнаружены в десневой борозде у 13 % пациентов, проходящих лечение на несъемной аппаратуре.

Проведенное исследование показало, что в составе микрофлоры происходят динамичные качественные и количественные изменения. За время наблюдения в микрофлоре ротовой полости пациентов исчезла часть находившихся бактерий, и появились отсутствовавшие ранее. Так, появились Acinetobacter spp., Micrococcus luteus, Serracia marcensens, и исчезли Corynebacterium spp., Eubacterium limosum, Propionibacterium spp., Lactobacillus spp., Bacteroides spp., Fusobacterium spp., Porphy-romonas spp., Veilonella spp.. Доля анаэробных бактерий через 1 месяц использования брекет систем уменьшилась с 40% до 22%, а через 3 месяца составляла уже 6 % от всех идентифицированных микроорганизмов. Таким образом, у данной группы происходило уменьшение числа анаэробных бактерий, среди которых находится значительное число возбудителей соматических заболеваний. В то же время в составе микрофлоры происходило увеличение количества микроорганизмов, вызывающих воспалительные заболевания слизистой оболочки полости рта, в том числе, кариесо-генной флоры. В ходе проводимого лечения в полости рта наблюдаются значительные изменения резидентной микрофлоры, не сопровождающиеся видимыми воспалительными реакциями.

Колонизация поверхности несъемной аппаратуры в ходе ортодонтиче-ского лечения. Через 4-6 недель после установки аппаратуры зарегистрировано изменение микробного пейзажа. В эти сроки произошла колонизация поверхности несъемной аппаратуры и формирование устойчивых микробных биопленок. В состав этих бактериальных сообществ вошли аэробные и анаэробные микроорганизмы. На поверхности фиксирующих элементов у обследованных идентифицированы Staphy-

lococcus spp. в 62% случаев, Streptococcus spp. в 100%, Neisseria spp. в 50%, Acine-tobacterspp. и грибы рода Candida spp. 10%.

Среди анаэробов на поверхности аппаратуры появились Peptostreptococcus spp. (25%), Eubacterium spp. (12%) и Actinomyces spp. (11%).

После 12 недель наблюдения на поверхности несъемной аппаратуры зарегистрировано прогрессивное увеличение количества и числа наименований микроорганизмов, входящих в биопленки. Это увеличение зарегистрировано для аэробной и анаэробной микрофлоры. Больше всего у обследованных обнаружено стафилококков и Streptococcus spp. (100%), Neisseria spp. (80%), Streptococcus spp. (50%). При этом на поверхности аппаратуры появились и не выявляемые ранее бактерии родов Klebsiella spp., Enterobacter spp., Corynebacterium spp., Propionibacterium spp., Fusobacte-rium spp. и Bifiobacterium spp..

Выявленные нами на поверхности несъемной аппаратуры микроорганизмы являются потенциальными возбудителями поражений пародонта (Peptostreptosoccus spp., Fusobacterium spp., Veillonella spp., Staphylococcus spp., Sreptococcus spp., Neisseria spp., Bifidobacterium spp., Corynebacterium spp.), слизистой оболочки полости рта (Staphylococcus spp., Sreptococcus spp., Neisseria spp., Candida spp.), причиной галитоза (Peptostreptosoccus spp., Fusobacterium spp.), а также ряда соматических заболеваний.

Внеклеточная ДНК в биопленках микробов, выделенных из ротовой полости при лечении несъемной аппаратурой. Объектом исследования служили штаммы бактерий, полученные от пациентов в ходе ортодонтического лечения с помощью несъемной аппаратуры: Streptococcus mitis VT1007 и Neisseria subflava VT4007. Эти штаммы образовывали моно- и смешанные биопленки. Метод электро-форетического разделения в агарозном геле не показал различий в величине фрагментов ДНК матрикса, полученных из биопленок, образованных монокультурой Streptococcus mitis и смешанных сообществ, сформированных Streptococcus mitis и Neisseria subflava. Внеклеточная ДНК, выделенная из смешанных микробных биопленок, при электрофорезе в геле идет единым, не разделенным фронтом, не отличимым от фрагментов, обнаруженных в сообществах, сформированных бактериями одного типа. После обработки ДНКазой наблюдалось полное исчезновение полосы, соответствующей 30 кб, полученной после фенольно-хлороформной экстракции из матрикса, что подтверждает природу данной молекулы как ДНК.

При получении биопленок были использованы устойчивые микробные ассоциации, выделенные с поверхности несъемной аппаратуры. Число КОЕ в 24-х часовых биопленках в присутствии ДНКазы снижалось в среднем в 10 раз. Это снижение зарегистрировано в биопленках аэробных и анаэробных бактерий, а также по отношению к грибам рода Candida spp.

Добавление антисептиков и/или ДНКазы изменяло изученные свойства биопленок исследованных штаммов: Streptococcus mitis VT1007 и Neisseria subflava VT4007. Присутствие мультицида приводило к снижению плотности биопленок относительно контроля на 20%, а ДНКазы 1 на 60%. Использованные антисептики показали высокую активность по отношению к микробным биопленкам и вызывали в них

значительное снижение числа КОЕ. Максимальное снижение числа жизнеспособных бактерий зарегистрировано в присутствии хлоргексидина. При действии данного антисептика число КОЕ в микробных биопленках, образованных Streptococcus mitis или их ассоциаций с Neisseria subflava, снижалось на 6 порядков. Мультицид в этих же условиях снижал число КОЕ на 4 порядка. Вместе с тем, эти данные не позволяют напрямую сравнивать два антисептика между собой, поскольку мультицид был использован в концентрации в 10 раз меньшей, чем хлоргексидин (Рис. 5).

Таким образом, установлено, что бактерии, выделенные у пациентов при ортодонтическом лечении несъемной аппаратурой, в выбранных условиях образуют устойчивые микробные биопленки. При действии на микробные биопленки использованных антисептиков и ДНКазы1 в них происходит уменьшение биомассы и числа КОЕ. Максимальное снижение биомассы происходит в присутствии ДНКазы1. Совместное использование антисептиков и ДНКазы1 приводит к значительному усилению антимикробного действия.

Следовательно, все испытанные микробные биопленки различных бактерий и грибов, обнаруженных на поверхности несъемной аппаратуры, были чувствительны к действию ДНКазьИ. При действии данного фермента происходит снижение числа КОЕ в микробной биопленке примерно в 10 раз. Эти результаты свидетельствуют об универсальной роли внеклеточной ДНК микробных биопленок, обнаруженных в данном исследовании.

Streptococcus Streptococcus mitis mitis+

Neisseria subflava

® контроль в хлоргексидин 3 Мультцид *ДНКаза1

я хлоргексидин+ДНКаза1 ® Мультцид+ДНКаза!

Рис,5 Влияние антисептиков и ДНКазьИ на число КОЕ сформированных биопленок.

ВЫВОДЫ

1. Среди микроорганизмов, обнаруженных в зубодесневой борозде у пациентов с различными зубочелюстными аномалиями без видимых признаков воспаления тканей пародонта, выделены аэробные бактерии Neisseria spp., Corynebacterium spp., Streptococcus spp.,. Staphylococcus spp., Candida spp. -60%, и анаэробные бактерии Peptostreptococcus spp., Fusobacterium spp.,. Veillonella spp., Actinomyces spp. и др. - 40%.. Через 4-6 недель после установки несъемного ортодонтического аппарата на его поверхности доля анаэробных бактерий уменьшилась до 22%, а через 12 недель составила 6% от выделенных микроорганизмов. Количество аэробных микроорганизмов, способных вызывать воспалительные заболевания слизистой оболочки полости рта, через 12 недель после установки возросло до 94%.

2. Выявленные устойчивые смешанные микробные биопленки, включающие: Fusolactobacterium spp., Veillonella spp., Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Neisseria spp., Candida spp., Peptostreptococcus spp., Fusobacterium spp., образующиеся на поверхности несъемной ортодонтической аппаратуры, имеющие классическое строение и включающие в себя микробные организмы и внеклеточный матрикс. В составе последнего, во всех изученных штаммах обнаружена внеклеточная ДНК, участвующая в поддержании структуры и поддержании и передаче генетической информации.

3. Препарат мультицид в концентрации 250 мг/л совместно с ДНКазой1 10 мг/л обладает способностью в 10 раз большей к разрушению биопленок, сформированных на поверхности несъемной ортодонтической аппаратуры и превосходит по своей эффективности антисептик - хлоргексидин в общепринятой концентрации (2000 мг/л).

4. Использование пациентами, проходящими лечение на несъемной ортодонтической аппаратуре, геля на основе антисептика мультицид и ДНКазьИ способствует улучшению гигиены полости рта, снижению воспалительных заболеваний полости рта, снижению микробной обсемененности зубов, что связано со способностью ДНКазы1 воздействовать на внеклеточную ДНК матрикса микробных биопленок, образующихся на поверхности несъемной ортодонтической аппаратуры.

РЕКОМЕНДАЦИИ ПРАКТИЧЕСКОМУ ЗДРАВООХРАНЕНИЮ

1. Для профилактики осложнений заболеваний твердых и мягких тканей полости рта перед началом ортодонтического лечения у пациентов с зубочелюстными аномалиями необходима санация полости рта, а также проведение профессиональной гигиены полости рта перед установкой несъемной аппаратуры и 1 раз в три месяца на всех этапах ортодонтического лечения.

2. При лечении с помощью несъемной ортодонтической аппаратуры рекомендовано использование индивидуальных средств гигиены с периодическим

микробиологическим контролем качественного и количественного состава микрофлоры полости рта, один раз в три месяца.

3. В качестве антимикробной терапии рекомендовано назначать использование мультицида 250мг/л в сочетании с ДНКазой1 10 мг/л в форме геля начиная со второй недели ортодонтического лечения на несъемной ортодонтической аппаратуре, и 1 или 2 раза в день после чистки зубов без последующего ополаскивания полости рта, курсом 7 дней (один раз в три месяца).

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Тец В.В., Орехова Л.Ю., Доморад А.А., Яковлева О.М, Щербакова Д.С., Румянцева O.K., .Левкович Д.В. Распространение возбудителей соматических заболеваний в нормальной микрофлоре ротовой полости II Пародонто-логия, -2007.-№4(45).- С.9-12.

2. Щербакова Д.С., Левкович Д.В., Томсон Н.В. Распространенность бактерий -возбудителей соматических заболеваний в ротовой полости здоровых людей// Тезисы доклада на медицинском конгрессе «Санкт-Петербургские научные чтения 2007». -Санкт-Петербург.- 2007.-С.170.

3. Тец В.В., Бобров А.П, Орехова Л.Ю, Левкович Д.В., Д.С. Щербакова Д.С., Тец Г.В., Доморад А.А., О.М. Яковлева О.М. Эффективность действия антисептиков и ДНКазы на биопленки бактерий нормальной микрофлоры, образующиеся при ортодонтическом печении несъемной аппаратурой.// Вестник Санкт-Петербургской государственной медицинской академии им. И.И.Мечникова.-2008.- №3.-С.175-179.

4. Левкович Д.В., Д.С. Щербакова, А.А. Доморад, О.М. Яковлева, А.П. Бобров, Тец В.В. Условно-патогенные микроорганизмы при лечении несъемной аппаратурой. //Материалы конференции «Новые технологии в стоматологии и имплантологии». - Саратов,- 2008. С. 281-284.

5. Левкович Д.В. Новые аспекты в изучении патогенной микрофлоры полости рта и методы борьбы с возбудителями воспалительных заболеваний слизистой оболочки полости ртаII Вестник Авиценны. - Душанбе,- 2011.- №1,-С.71-76.

ЛP №020365

Подписано в печать 18.04.2011 г. Заказ № 1836 Формат бумаги 60x84 1/16. Тираж 100. Усл. печ. л. 1,0.

Санкт-Петербургская государственная медицинская академия им. И.И. Мечникова

Типография ООО «КАРО» Санкт-Петербург, Красногвардейская пл., д. 3

Актуальность темы.

Наличие в полости рта ортодонтического аппарата ухудшает условия для ее самоочищения, осложняет уход за зубами и создает условия, благоприятствующие отложению мягкого зубного налета. В связи с этим отмечается высокое микробное обсеменение поверхностей зубов и ортодонтических аппаратов с покрытием их обширным мягким налетом [Хамитова Н.Х., 1986; Горонкина С.М., 1996; Sukontapatipark W. et al., 2001], что, в свою очередь, ухудшает процессы реминерализации эмали и ведет к нарушению ее структуры. Также наблюдается значительное изменение состава микрофлоры полости рта, которое проявляется увеличением числа патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, явлениями дисбактериоза [Ростокина Е.Б., 1979; Карницкая И.В., 1999]. Перечисленные факторы способствуют повышению распространенности кариеса зубов и воспалительных заболеваний пародонта [Перова Е.Г., 2000; Арсенина О.И. и др., 2005; Perinetti G. et al., 2004; Sallum E.J. et al., 2004; Speer C., 2004].

Несмотря на очевидную актуальность, проблема распространения условно-патогенных и патогенных микроорганизмов* при лечении зубочелюстых аномалий на несъемной ортодонтической аппаратуре остается недостаточно изученой. Современные генетические исследования показали, что 95-99% нормальной микрофлоры пока неизвестны и не поддаются культивированию. Кроме бактерий в полости рта находятся археи, грибы, простейшие и различные вирусы [Samaranayake L.P, 2006; Quivey R.G. Jr., 2006]. Особенности существования микроорганизмов в различных биотопах полости рта тесно связанны с их способностью образовывать стойкие микробные сообщества, получившие название биопленки.

Биопленка является^ идеальной нишей для обмена генетической информацией между бактериями. Передача генов в биопленках наблюдается в 10-500 раз чаще, чем в планктонных клетках [Li Y.H. et al., 2001; Wuertz S., 1999; Roberts A.P. et al., 1999; Ghigo J. M., 2001]. В биопленке происходит ускоренный горизонтальный перенос генетического материала и она становится совершенной средой для появления микроорганизмов с новыми патогенными свойствами, устойчивостью к антимикробным препаратам и способностью к выживанию в различных условиях. Перераспределение генов в микробных биопленках полости рта приводит к формированию штаммов устойчивых к антисептикам/дезинфектантам и антибиотикам [Stewart P.S., 2002; Keren T., Shah D., Spoering D., Kaldalu N., and Lewis K., 2004].

Свойства бактерий биопленок объясняют, почему стандартная терапия часто не способна справиться с бактериями, в результате чего после завершения курса лечения они способны размножаться и вновь диссеминировать, приводя к формированию обострений и хронизации инфекции.

Особенности действия антимикробных препаратов на бактерии биопленок, формирующихся при ортодонтическом лечении несъемной аппаратурой, остаются практически не изученными. Профилактика распространения инфекции в полости рта и борьба с колонизацией бактериями, способными вызывать воспалительные заболевания полости рта и соматическую патологию, остается чрезвычайно актуальной.

Цель исследования.

Повысить эффективность мер профилактики распространения патогенных и условно-патогенных микроорганизмов у пациентов с зубочелюстными аномалиями; при ортодонтическом лечении несъемной аппаратурой.

Задачи исследования.

1. Изучить микрофлору зубодесневой борозды у пациентов с различными формами зубочелюстных аномалий до установки ортодонтической аппаратуры и в ходе лечения. Дать характеристику биологических свойств микроорганизмов.

2. Выявить встречающиеся устойчивые микробные биопленки. Определить строение возбудителей стабильных микробных биопленок, выявленных у пациентов при использовании несъёмной ортодонтической аппаратуры.

3: Провести сравнительную оценку клинической эффективности; антимикробных препаратов в условиях эксперимента.

4. Предложить схемы профилактики и антимикробной терапии с учетом анализа данных исследования микробных биопленок.

Научная новизна.

Воздействие на внеклеточную ДНК матрикса микробных биопленок приводит к изменению их свойств. Создаются условия для повышения; эффективности антимикробной терапии воспалительных процессов полости рта у пациентов,, проходящих лечение на несъемной ортодонтической аппаратуре. О особенностями выживания бактерий в биопленках в значительной степени- связана неэффективность антимикробной терапии и хронизация* инфекции в стоматологической практике. Результатом низкой эффективности уничтожения микробных биопленок является их длительное существование в; организме, в том числе в полости рта, и, как следствие, возможность оказывать постоянное влияние на состояние здоровья человека. Таким образом, немногочисленные сообщения в литературе о роли применения антимикробных препаратов, проникающих в микробные биопленки, послужили- основанием для проведения клинических исследований.

Положения, выносимые на защиту:

1. Формирование микробного пейзажа полости рта анаэробными и аэробными микроорганизмами до начала лечения на несъемной ор-тодонтической аппаратуре и выявление устойчивых микробных биопленок на ранних стадиях ортодонтического лечения на поверхности несъемной ортодонтической аппаратуры.

2. Качественная и количественная оценка возбудителей стабильных микробных биопленок, способных изолироваться от внешней среды, выделенных с поверности несъемной аппаратуры у пациентов, проходящих ортодонтиче-ское лечение.

3. Антимикробные препараты, содержащие ДНКАзу, способные проникать внутрь микробных биопленок. Профилактические и лечебные схемы этио-тропного воздействия, позволяющие учитывать индивидуальную чувствительность бактерий и дающие возможность уменьшить количество осложнений и улучшить результаты лечения.

Практическая значимость.

Полученные данные об образовании устойчивых микробных биопленок на поверхности слизистой оболочки полости рта и несъемной аппаратуре (брекетах) ортодонтических пациентов послужили основанием для разработки эффективных схем применения антимикробных препаратов. Включение в комплекс профилактических и лечебных мероприятий методов этиотропного лечения, разработанных на основе чувствительности бактерий биопленок, позволит уменьшить количество осложнений и улучшить результаты лечения. Внедрение в практику.

Разработанные лечебно-профилактические мероприятия по снижению образования устойчивых микробных биопленок на поверхности слизистой полости рта и несъемной аппаратуры у пациентов с зубочелюстными аномалиями внедрены в практику стоматологической клиники «Стомус» г. Санкт-Петербурга, а также используются при проведений лекций и семинаров для врачей и интернов на кафедре пропедевтики стоматологических заболеваний, кафедре терапевтической стоматологии СПбГМУ им. академика И. П. Павлова, При проведении научных исследований на кафедре челюстно-лицевой хирургии СПбГМУ им. академика И.П. Павлова.

Апробация, работы.

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на:

• II Международный молодежный медицинский Конгресс «Санкт-Петербургские научные . чтения» (Санкт-Петербург, 2007);

• III Международный медицинский Конгресс «Санкт-Петербургские научные чтения» (Санкт-Петербург, 2009);

• ЬХУШ Конференция «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической медицины» (Санкт-Петербург, 2007);

• Международная конференция «Современные методы диагностики и лечения стоматологических заболеваний» (Воронеж, 2010);

• Всероссийская стоматологическая конференция «Новейшие технологии в стоматологии» (Краснодар, 2010).

Объем и структура работы.

По теме диссертации опубликовано 5 научных работ, из них в журналах, рекомендованных ВАК - 3.

Работа изложена на 134 страницах машинописного текста и состоит из 5 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы и приложений. Библиографический список литературы содержит 130 отечественных и 167 иностранных источников. Работа иллюстрирована 15 таблицами и 13 рисунками.

выводы

1. Среди микроорганизмов, обнаруженных в зубодесневой борозде у пациентов с различными зубочелюстными аномалиями без видимых признаков воспаления тканей пародонта, выделены аэробные бактерии Neisseria spp., Corynebacterium spp., Streptococcus spp.,. Staphylococcus spp., Candida spp. — 60%, и анаэробные бактерии Peptostreptococcus spp., Fusobacterium spp.,. Veillonella spp., Actinomyces spp. и др. — 40%. Через 4-6 недель после установки несъемного ортодонтического аппарата на его поверхности доля анаэробных бактерий уменьшилась до 22%, а через 12 недель составила 6% от выделенных микроорганизмов. Количество аэробных микроорганизмов, способных вызывать воспалительные заболевания слизистой оболочки полости рта, через 12 недель после установки возросло до 94%.

2. Выявленные устойчивые смешанные микробные биопленки, включающие: Fusolactobacterium spp., Veillonella spp., Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Neisseria spp., Candida spp., Peptostreptococcus spp., Fusobacterium spp. образующиеся на поверхности несъемной ортодон-тической аппаратуры, имеющие классическое строение и включающие в себя микробные организмы и внеклеточный матрикс. В составе последнего, во всех изученных штаммах обнаружена внеклеточная ДНК, участвующая в поддержании структуры и поддержании и передаче генетической информации.

3. Препарат мультицид в концентрации 250 мг/л совместно с ДНКазой1 10 мг/л обладает способностью в 10 раз большей к разрушению биопленок, сформированных на поверхности несъемной ортодонтической аппаратуры и превосходит по своей эффективности антисептик — хлоргекседин в общепринятой концентрации (2000 мг/л).

4. Использование пациентами, проходящими лечение на несъемной ортодонтической аппаратуре, геля на основе антисептика мультицид и

ДНКазы1 способствует улучшению гигиены полости рта, снижению воспалительных заболеваний полости рта, снижению микробной об-семененности зубов, что связано со способностью ДНКазы1 воздействовать на внеклеточную ДНК матрикса микробных биопленок, образующихся на поверхности несъемной ортодонтической аппаратуры.

РЕКОМЕНДАЦИИ ПРАКТИЧЕСКОМУ ЗДРАВООХРАНЕНИЮ

1. Для профилактики осложнений заболеваний твердых и мягких тканей полости рта перед началом ортодонтического лечения у пациентов с зубочелюстными аномалиями необходима санация полости рта, а также проведение профессиональной гигиены полости рта перед установкой несъемной аппаратуры и 1 раз в три месяца на всех этапах ортодонтического лечения.

2. При лечении с помощью несъемной ортодонтической аппаратуры рекомендовано использование индивидуальных средств гигиены с периодическим микробиологическим контролем качественного и количественного состава микрофлоры полости рта, один раз в три месяца.

3. В качестве антимикробной терапии рекомендовано назначать использование мультицида 250мг/л в сочетании с ДНКазой! 10 мг/л в форме геля начиная со второй недели ортодонтического лечения на несъемной ортодонтической аппаратуре, и 1 или 2 раза в день после чистки зубов без последующего ополаскивания полости рта, курсом 7 дней (один раз в три месяца).

ГЛАВА 6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Ортодонтия, важнейший раздел стоматологии, изучает этиологию и патогенез зубочелюстных аномалий у человека, а также подходы и методы, устраняющие эти патологии в различных возрастных группах. В современной стоматологии ортодонтия стала связующим звеном, краеугольным камнем между многими разделами не только в стоматологии, но и между общедисциплинарными предметами, такими как терапия, хирургия, оториноларингология, общая ортопедия, акушерство и гинекология, педиатрия. Современные подходы к лечению стоматологических пациентов редко обходят своим вниманием ортодонтию. И это легко понять, так как в основе множества стоматологических заболеваний лежат нарушение прикуса и неправильное положение зубов, а также дисфункции ВНЧС. В связи с этим ортодонти-ческая помощь (лечение) стали сегодня актуальны. Следует отметить, что современная ортодонтия располагает различными методами и способами лечения практически всех возрастных групп пациентов, начиная с раннего детства (0-3 года), до лиц преклонного возраста (60 и более лет).

Это стало возможным с развитием высоких технологий при изготовлении ортодонтической аппаратуры как съемной, так и несъемной. Приход цифровых технологий в* рентгене и компьютерной томографии радикально изменил к лучшему диагностику и планирование лечения в ортодонтии.

На сегодняшний день не представляется возможным качественно проведенное лечение пародонтологических и ортопедических пациентов без участия врача-ортодонта, обладающего современными взглядами и знаниями, работающего авангардными методами и аппаратурой. Исходя из этого понятна актуальность проведенного исследования. Количество пациентов, проходящих лечение на несъемной аппаратуре (брекет-системах) возрастает с каждым годом.

Многие факторы окружающей среды влияют на состав, биологическую активность и патогенность микроорганизмов, способных обитать в полости рта человека. Установлено, что различные виды лечения заболеваний полости рта могут сопровождаться распространением патогенных микроорганизмов. Показано также, что использование несъемной аппаратуры значительно затрудняет поддержание нормальной гигиены, способствует образованию зубной бляшки и формированию новых зон ретенции зубного налета, что-предрасполагает к размножению и распространению микроорганизмов. В свою очередь, с увеличением числа зубных бляшек и распространения в них различных микробов, включая грибы рода Candida spp., связывают появление гингивитов и склонность к поражению пародонта. В наших исследованиях показано, что при использовании несъемной аппаратуры в полости рта происходит изменение состава нормальной микрофлоры. В связи с этим, целью настоящего исследования было качественное и количественное изучение состава микроорганизмов, колонизующих использующуюся при ортодонти-ческом лечении несъемную аппаратуру, а также десневую борозду.

В результате изучения микрофлоры при лечении с использованием несъемной аппаратуры установлено, что на протяжении всего срока наблюдения (12 недель) происходит изменение микрофлоры десневой брозды и формирование биопленок на поверхности несъемной аппаратуры. У обследованных выявлено появление в биопленках значительного количества энтеI робактерий и грибов рода' Candida spp. . Подобная1 тенденция совместного распространения грамотрицательных бактерий и одноклеточных грибов наблюдалась и ранее, что свидетельствует о формировании сложных биопленок, включающих неродственные микроорганизмы. Ранее установлено, что ортодонтическое лечение с использованием съемной и несъемной аппаратуры приводит к увеличению числа зубных бляшек и образующих их бактерий. При этом показано, что большие изменения возникают при использовании несъемной аппаратуры. Состав формирующейся микрофлоры, свидетельствует об увеличении опасности развития' у пациентов гингивита и пародон-тита. Выявленные нами на поверхности несъемной аппаратуры и в десневой борозде микроорганизмы являются потенциальными возбудителями поражений пародонта (Peptostreptosoccus spp., Fusobacterium spp., Veillonella spp., Staphylococcus spp., Sreptococcus spp., Neisseria spp., Bifidobacterium spp., Corynebacterium spp.), слизистой оболочки полости рта (Staphylococcus spp., Sreptococcus spp., Neisseria spp., Candida spp.) причиной галитоза (Peptostreptosoccus spp., Fusobacterium spp.), а также ряда соматических заболеваний. Вновь сформированные на поверхности аппаратуры микробные биопленки, как и все микробные сообщества, отличаются от изолированных клеток по эффективности действия на них различных противомикробных препаратов -антисептиков и антибиотиков. Очевидно, что при этом меняется и действие продуктов микробной природы, влияющих на состояние организма человека, в том числе и на вероятность возникновения новых поражений полости рта.

Полученные в настоящей работе данные указывают, что в ходе лечения, в связи с распространением бактерий, образуются новые сложные микробные биопленки и формируются условия для возникновения различных поражений полости рта. Для предотвращения развития новых заболеваний на фоне ортодонтической терапии необходима разработка специальной профилактики для предотвращения усиления микробной колонизации поверхности несъемной аппаратуры и десневой борозды.

Использованные штаммы бактерий, относящиеся к представителям нормальной микрофлоры полости рта, изолированные у пациентов с несъемной аппаратурой при ортодонтическом лечении, образовывали моно- и смешанные биопленки. Следует отметить, что полученный штамм Streptococcus mitis хорошо формировал биопленки в выбранных условиях, в то время как Neisseria subfiava как монокультура росли плохо. В то же время, в присутствии выбранного штамма Streptococcus mitis и Neisseria subfiava формировали устойчивую смешанную биопленку.

В матриксе полученных биопленок была обнаружена внеклеточная ДНК. Во всех изученных пробах матрикса, полученного из моно- и смешанных биопленок, присутствует внеклеточная ДНК с молекулярной массой, примерно, 30 Кб:

Использованный метод электрофоретического разделения в агарозном геле не показал различий в величине фрагментов ДНК матрикса, полученных из микробных биопленок, образованных монокультурой Streptococcus mitis и смешанных сообществ, сформированных Streptococcus mitis и Neisseria sub-flava. Внеклеточная ДНК, выделенная из смешанных биопленок, при электрофорезе в геле идет единым, не разделенным фронтом, не отличимым от фрагментов, обнаруженных в сообществах, сформированных бактериями одного типа. После обработки ДНКазой1 наблюдалось полное исчезновение полосы, соответствующей 30 кб, полученной после фенольно-хлороформной экстракции из матрикса, что подтверждает природу данной молекулы как ДНК.

Добавление антисептиков и/или ДНКазы изменяло изученные свойства биопленок. В экспериментах были использованы хлоргексидин — 2000 мг/л, мультицид - 250 мг/л и ДНКаза1- 10 мг/л. Концентрация хлоргексидина была выбрана как одна из наиболее используемых в стоматологии. Количества мультицида и ДНКазы 1 были заведомо ниже, поскольку препараты находятся в стадии изучения. Снижение биомассы, зафиксированное фотометрически, обнаружено у всех типов биопленок в присутствии мультицида и ДНКазы!. Хлоргексидин обладает собственным поглощением в диапазоне использованных длин волн, что делает невозможным объективную оценку данного показателя. Установлено, что уменьшение количества внеклеточного матрикса указывает на увеличение доступности клеток микробных биопленок по отношению к внешним воздействиям. Представляется, что аналогичная ситуация имеет место и при использовании антисептиков. Обращает на себя внимание, что в пределах использованных концентраций антисептиков и ДНКазы!, максимальное снижение биомассы зарегистрировано в присутствии фермента, действующего на внеклеточную ДНК.

Уровень снижения оптической плотности в присутствии ДНКазы мало различался в биопленках, образованных Streptococcus mitis и смешанной культурой Streptococcus mitis + Neisseria subflava.

Использованные антисептики показали высокую активность по отношению к микробным биопленкам и вызывали в них значительное снижение числа КОЕ. При действии хлоргексидина число КОЕ в биопленках, образованных Streptococcus mitis или их ассоциацией с Neisseria subßava снижалось на 6 порядков. Мультицид в этих же условиях снижал число КОЕ на 4 порядка. Вместе с тем, эти данные не позволяют напрямую сравнивать два антисептика между собой, поскольку мультицид был использован в концентрации в 10 раз меньшей, чем хлоргексидин. Полученные результаты позволяют констатировать эффективное действие испытанных антисептиков на бактерии биопленок использованных штаммов. В присутствии ДНКазы1 также было зарегистрировано незначительное снижение числа КОЕ. Совместное использование антисептиков и ДНКазы1 при действии на сформированные бактериальные биопленки приводило к потенцированию антимикробного действия. Хлоргексидин и ДНКаза1 в использованных концентрациях приводили к эрадикации микробных биопленок. Совместное использование муль-тицида и ДНКазы1 увеличивало антимикробную активность в 10 раз по сравнению с действием одного антисептика.

Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что бактерии, относящиеся к нормальной микрофлоре полости рта, выделенные с поверхности зубов и несъемной аппаратуры при ортодонтическом лечении, в выбранных условиях образуют устойчивые микробные биопленки. В матриксе микробных биопленок, сформированных моно- и смешанными культурами, присутствует внеклеточная ДНК размером около 30 кб. При действии на микробные биопленки использованных антисептиков и ДНКа-зы1, в них происходит уменьшение биомассы и числа КОЕ. Максимальное снижение биомассы происходит в присутствии ДНКазы1. Совместное использование антисептиков и ДНКазы1 приводит к значительному усилению антимикробного действия.

По данным клинических исследований достоверно было обнаружено, что в исследуемой группе, применявшей антисептик мультицид в сочетании с ДНКазой1, по сравнению с контрольной индексы гигиены уменьшались,а пародонтальные индексы не увеличивались. Это дает нам право утверждать, что регулярное применение антисептика мультицид в сочетании с ДНКзой1 у пациентов с несъемной ортодонтической аппаратурой уменьшает риск возникновения заболеваний пародонта и твердых тканей зубов на этапах орто-донтического лечения.