Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Исследование действия вакцин на созревание дендитных клеток новорожденных и взрослых

Федеральное бюджетное учреждение науки

Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени академика И.Н. Блохиной Роспотребнадзора

На правах рукописи

Плеханова Мария Владимировна

Исследование действия вакцин на созревание дендритных клеток

новорожденных и взрослых

14.03.09 - Клиническая иммунология, аллергология

Диссертация

ОФ на соискание ученой степени

^ кандидата биологических наук

<£> со

ю £

^ Научный руководитель

^^ О Доктор медицинских наук, профессор Ефимов Е.И.

СМ ^

Нижний Новгород 2013 г.

Список сокращений

БЦЖ - бацилла Calmette-Guerin - вакцинный штамм Mycobacterium bovis ВГВ - вакцины против гепатита В ДК - дендритные клетки

ДК-ЛПС - ДК, стимулированные ЛПС и ФНО-а

ДК-ЦТК - ДК, стимулированные смесью цитокинов и простагландина Е2

ИЛ - интерлейкин

ИНФ-у - интерферон-у

ЛПС - липополисахарид

ЛУ - лимфатические узлы

МПП - молекулярные паттерны патогенов

нДК - незрелые дендритные клетки

ПГ - простагландин, ПГЕ2 - простагландин Е2

СПИД - синдром приобретенного иммунодефицита

Трег - регуляторные Т-клетки

Тх1 - Т-хелперы первого типа

Тх17 - Т-хелперы-17

Тх2 - Т-хелперы второго типа

ФНО-а - фактор некроз опухолей-а

фТх - фолликулярные Т-хелперы

CCL - хемокины СС-семейства

CCR - рецепторы хемокинов СС-семейства

CXCL - хемокины СХС-семейства

CXCR - рецепторы хемокинов СХС-семейства

gp - гликопротеид (в общепринятых названиях белков с обозначением их молекулярной массы, например gp96) HSP - белок теплового шока

МНС - молекулы главного комплекса гистосовместимости NK - естественные киллеры TLR - толл-подобные рецепторы

Оглавление

Введение.......................................................................................5

1. Обзор литературы...................................................................11

1.1. Общие сведения о дендритных клетках...................................... 11

1.2. Основные типы дендритных клеток.......................................... 12

1.3. Общие сведения о созревании дендритных клеток........................ 14

1.3.1. Особенности созревания и функционирования миелоидных ДК........19

1.3.2. Созревание клеток Лангерганса................................................20

1.3.3. Созревание плазмоцитоидных ДК.............................................22

1.4. Поглощение, процессинг антигена и феномен перекрестной презентации................................................................................24

1.5. Терминальное созревание дендритных клеток............................29

1.6. Миграция дендритных клеток................................................34

1.6.1. Миграция сквозь межклеточный матрикс и базальные мембраны .... 40

1.6.2. Проникновения ДК внутрь лимфатических сосудов....................42

1.6.3. Микроанатомия лимфатического узла.....................................44

1.6.4. Миграция ДК в лимфатическом узле.......................................46

1.7. Взаимодействие ДК и Т-лимфоцитов.......................................48

1.8. Регуляторная роль дендритных клеток....................................58

1.9. Использование ДК для совершенствования вакцин против туберкулеза..............................................................................61

1.10. Вирус гепатита В и вакцина против гепатита В: их взаимодействие с ДК...........................................................................................68

2. Материалы и методы исследований............................................75

3. Результаты исследований.........................................................91

3.1. Получение ДК из моноцитов крови новорожденных детей и взрослых

in vitro.........................................................................................91

3. 2. Действие вакцин на фенотипическое созревание ДК......................101

3.3. Действие вакцин на продукцию цитокинов дендритными клетками ...111

3.4. Действие вакцин на способность ДК стимулировать Т-лимфоциты к

цитокинопродукции....................................................................123

3.5. Экспрессия хемокиновых рецепторов на ДК детей и взрослых.........130

3.6. Действие вакцин на подвижность ДК.........................................141

4. Обсуждение...........................................................................145

Выводы.....................................................................................151

Список литературы.......................................................................153

Введение.

Обязательным условием эффективной защиты от инфекционных агентов является способность иммунной системы распознавать микроорганизмы. Иммунная система человека использует два различных принципа такого распознавания. Клетки системы врожденного иммунитета первыми контактируют с инфекцией и самостоятельно, без помощи антител, распознают лишь ограниченное количество наиболее типичных для микроорганизмов молекул - т.н. молекулярных паттернов патогенов (М1111). Распознавание МПП осуществляют рецепторы, гены которых не изменяются в ходе онтогенеза.

Другой, принцип поиска реализуют клетки адаптивной иммунной системы - Т- и В-лимфоциты. Они распознают антигены, т.е. любые макромолекулы, кодируемые чужим геномом. Распознавание осуществляют антигенспецифические рецепторы, гены которых подвергаются глубоким и разнообразным перестройкам в ходе созревания лимфоцитов. Поскольку количество создаваемых при перестройке вариантов рецепторов чрезвычайно велико, организм получает инструменты для распознавания практически любых макромолекул, существующих в природе или еще не созданных эволюцией. Однако, Т-лимфоциты не способны к самостоятельному распознаванию антигенов. Для этого им необходимо провзаимодействовать с антигенпрезентирующими клетками системы врожденного иммунитета. Это взаимодействие активирует лимфоциты и ведет к запуску адаптивного иммунного ответа, после завершения которого остается значительное количество функционально зрелых антигенспецифических Т- и В-лимфоцитов, которые будут обеспечивать иммунологическую память. Очевидно, что эффективная вакцинация, как модель иммунной реакции на инфекцию, должна запускать все этапы реакции, от активации антиген-презентирующих клеток до формирования клеток иммунологической памяти, однако возрастные особенности реакции различных групп клеток

иммунной системы на вакцины и их компоненты до сих пор недостаточно изучены. Данная работа посвящена изучению действия вакцин на самые активные антигенпрезентирующие клетки - дендритные клетки (ДК), у новорожденных детей и у взрослых. При этом исследовались возрастные особенности действия вакцин на созревание ДК, способность к продукции цитокинов и поляризации иммунного ответа, а также на их миграционные свойства.

Актуальность проблемы

Работа направлена на изучение неизвестных аспектов действия вакцин на клетки иммунной системы. Как известно, вакцины являются одним из основных средств борьбы с наиболее значимыми инфекциями в мире.

В рамках данной работы исследовалось действие туберкулезной вакцины БЦЖ и вакцин против гепатита В (ВГВ) на ДК новорожденных и взрослых. Туберкулез является хроническим инфекционным заболеванием, которое продолжает убивать около 3 миллионов человек в год в мире. Каждый год возникает 8 миллионов новых случаев заболевания, и их количество продолжает увеличиваться. Приблизительно одна треть населения мира инфицирована М. tuberculosis. Появление СПИДа реактивировало туберкулез у миллионов индивидуумов со скрытой инфекцией, вызвав резкое увеличение числа случаев заболевания.

Гепатит В является вирусной инфекцией, вызывающей как острое, так и хроническое поражение печени. Этим вирусом инфицировано около 2 миллиардов человек в мире, 350 миллионов человек имеют хроническую инфекцию и 600 ООО людей ежегодно умирают от острой или хронической формы гепатита В. Около 25% взрослых людей, с приобретенной в детстве хронической инфекцией, позднее умирают от рака или цирроза печени.

Как известно, вакцины являются одними из наиболее важных средств

профилактики этих тяжелых и социально значимых заболеваний. Новые

знания о действии вакцин на клетки иммунной системы необходимы для

6

дальнейшего совершенствования этих мощных средств борьбы с инфекционными заболеваниями. Это обуславливает актуальность и социально-экономическую значимость работы.

Цель исследования

Исследовать действие вакцин на дендритные клетки новорожденных и взрослых, их созревание, иммуностимулирующие и миграционные свойства.

Задачи исследования

1. Разработать экспериментальную модель исследования действия вакцин на функциональное состояние дендритных клеток взрослых и новорожденных in vitro.

2. Оценить способность живой вакцины БЦЖ и рекомбинантных вакцин против гепатита В вызывать созревание дендритных клеток по экспрессии мембранных молекул - маркеров созревания.

3. Изучить влияния вакцины БЦЖ и вакцин против гепатита В на продукцию цитокинов дендритными клетками новорожденных и взрослых.

4. Изучить действие вакцин на способность дендритных клеток стимулировать Т-лимфоциты.

5. Изучить действие вакцин на миграционные свойства дендритных клеток.

Научная новизна

Показано, что живая вакцина БЦЖ и рекомбинантные вакцины гепатита В одинаково эффективно стимулируют фенотипическое созревание моноцитарных дендритных клеток новорожденных и взрослых в условиях in vitro, но обладают различным действием на способность дендритных клеток продуцировать цитокины и стимулировать лимфоциты к цитокинопродукции.

Установлено, что вакцина БЦЖ in vitro индуцирует продукцию дендритными клетками про- и противовоспалительных цитокинов и значительно усиливает способность дендритных клеток новорожденных и

взрослых стимулировать продукцию интерферона-у лимфоцитами. Впервые показано, что БЦЖ значительно увеличивает способность дендритных клеток взрослых стимулировать продукцию фактора некроза опухолей-а лимфоцитами и слабо влияет на данный параметр у дендритных клеток новорожденных. Впервые выявлено, что БЦЖ слабо, но достоверно усиливает экспрессию хемокинового рецептора CCR7, обеспечивающего миграцию дендритных клеток в Т-клеточные зоны лимфатических узлов.

Впервые показано, что вакцины гепатита В in vitro незначительно увеличивают продукцию провоспалительных цитокинов дендритными клетками детей, вызывают слабое усиление их способности стимулировать продукцию интерферона-у и не влияют на способность дендритных клеток стимулировать продукцию фактора некроза опухолей-а, ИЛ-5 и ИЛ-17 лимфоцитами. Впервые обнаружено, что вакцины гепатита В слабо усиливают экспрессию CCR7, но индуцируют сильную экспрессию CXCR5 на дендритных клетках, что способствует их миграции в фолликулы лимфатических узлов - место индукции гуморального иммунного ответа.

Практическая значимость

Разработка новых методов оценки действия вакцин на клетки иммунной системы и изучение механизмов запускаемых ими иммунных реакций необходимы для совершенствования средств иммунопрофилактики инфекционных заболеваний. В ходе исследования разработаны экспериментальные модели оценки действия вакцин на дендритные клетки человека в условиях in vitro. В дальнейшем эти модели могут быть использованы для поиска компонентов вакцин, способных эффективно стимулировать дендритные клетки, а также для испытания вакцин в процессе их разработки.

Положения, выносимые на защиту

1. Разработан комплекс методов оценки действия вакцин на ДК in vitro. С использованием этих методов показано, что ключевыми свойствами

ДК, определяющими тип иммунного ответа на вакцину, могут быть не только способность к поляризации Т-лимфоцитов, но и особенности хоминга ДК.

2. Вакцина БЦЖ эффективно индуцирует созревание ДК, запускает продукцию ими про- и противовоспалительных цитокинов. Под действием БЦЖ ДК in vitro экспрессируют хемокиновый рецептор CCR7 и приобретают способность мощно стимулировать продукцию ИНФ-у - ключевого цитокина Т-хелперов 1 типа (Txl), что и определяет превалирование клеточного иммунного ответа.

3. Вакцина против гепатита В in vitro индуцирует созревание ДК, но при этом ДК слабо продуцируют цитокины (особенно у новорожденных) и вызывает лишь слабую стимуляцию Txl и не стимулируют Тх2 и Txl7. В то же время обработанные ВГВ ДК экспрессируют хемокиновый рецептор CXCR5, направляющий их в фолликулы лимфатических узлов, что способствует развитию гуморального иммунного ответа.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 20 научных работ, из них 12 статей в отечественных научных журналах списка ВАК и одна статья в иностранном рецензируемом журнале, 4 статьи в сборниках, 3 тезисов докладов.

Основные материалы работы были доложены на:

1. Юбилейной Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 90-летию Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной Роспотребнадзора «Научное обеспечение противоэпидемической защиты населения», г. Н.Новгород, 2009 г.

2. XI международном медицинском форуме "Современные медицинские технологии на службе охраны здоровья россиян» 27-29 апреля 2010 г., г. Н.Новгород.

3. 2-ом международном конгрессе-партнеринге и выставке по биотехнологии и биоэнергетике «Еш^аВю» 13-15 апреля 2010, г. Москва.

4. Научно-практической конференции молодых ученых Роспотребнадзора «Инновационные технологии в противоэпидемической защите населения», посвященной 90-летию со дня рождения академика РАМН И.Н. Блохиной, 2011, г. Н.Новгород.

5. Конференции Роспотребнадзора «Научное обеспечение противоэпидемической защиты населения», 11 апреля 2012 г., г. Н. Новгород,

6. VI Региональной научно-практической конференции «Перспективы использования в медицинской практике новых иммунобиологических препаратов, полученных на основе клеточных культур» 30-31 мая 2012г., г. Екатеринбург.

7. V Российской конференции по иммунологии репродукции 29 мая - 1 июня 2012 г. в г. Иваново.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 176 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, раздела «Материалы и методы», раздела «Результаты исследований», раздела «Обсуждение», выводов и списка цитируемой литературы, который содержит 8 отечественных и 215 зарубежных источника. Диссертация иллюстрирована 33 рисунками и 4 таблицами.

1. Обзор литературы

1.1. Общие сведения о дендритных клетках

Дендритные клетки (ДК) являются наиболее активными антиген-презентирующими клетками иммунной системы [3, 5]. Только эти клетки способны эффективно представлять антиген наивным (не контактировавшим ранее с антигеном) Т-лимфоцитам, обеспечивая запуск адаптивного иммунного ответа на первый контакт организма с инфекцией или вакциной [26, 189, 176, 54]. Эта способность обусловлена специфическими функциональными свойствами ДК, различными у клеток, находящихся на разных стадиях созревания. Так называемые незрелые ДК, рассеянные по различным тканям организма, эффективно осуществляют сбор антигенного материала и процессинг, бережно сохраняющий антигенные детерминанты поглощенных макромолекул. Обнаружение признаков инфекции запускает программу созревания ДК. Результатом созревания могут быть включение синтеза цитокинов, хемокинов и других средств межклеточной коммуникации, экспрессия новых рецепторов на поверхности клетки, изменение подвижности и адгезивных свойств, дифференцировка в т.н. зрелые ДК [2, 74, 146, 212].

Следует отметить, что ДК являются клетками врожденного иммунитета и, в отличие от лимфоцитов, они не способны распознавать все многообразие антигенов инфекционных агентов. Признаками инфекции для ДК является лишь ограниченное количество наиболее типичных для микроорганизмов молекул, т.н. молекулярных паттернов патогенов (MlII1) [95]. Также ДК распознают косвенные признаки инфекции - молекулы собственного организма, свидетельствующие о воспалении (воспалительные цитокины, простагландин Е2) или деструкции ткани (белки теплового шока, белок HMGB1).

Созревая, дендритные клетки многократно увеличивают плотность экспрессии молекул главного комплекса гистосовместимости (МНС), необходимых для представления собранных антигенов, а также мембранных белков и цитокинов, нужных для костимуляции рекрутируемых Т-лимфоцитов [93, 171]. Кроме того, ДК обладают уникальными миграционными характеристиками, которые позволяют одной и той же клетке максимально эффективно собирать антигены внутри различных тканей организма, а затем транспортировать их в Т-клеточные зоны лимфоидных органов, где их путь миграции пересекается с центральным путем рециркуляции наивных Т-лимфоцитов [30, 220]. Все эти свойства определяют ключевую роль ДК в презентации антигенного материала вакцин и запуске адаптивного иммунного ответа на эти антигены.

В течение двух последних десятилетий ДК являются объектом чрезвычайно интенсивных фундаментальных и прикладных исследований и количество научных публикаций, посвященных ДК огромно. Несмотря на это, количество опубликованной информации о действии на ДК вакцин и их потенциальных компонентов до сих пор весьма ограничено.

1.2. Основные типы дендритных клеток

Группа клеток, объединяемых термином «дендритные клетки», не является однородной. По своему происхождению, тканевой локализации и функциональным свойствам ДК подразделяются на, как минимум, 3 основных типа [2, 45, 82, 128, 129, 174, 213, 214]. Это типичные или миелоидные ДК, клетки Лангерганса, а �