Автореферат и диссертация по медицине (14.00.41) на тему:Использование мезенхимальных стволовых и прогениторных клеток костного мозга для разработки новых биотехнологий в трансплантологии

ДИССЕРТАЦИЯ
Использование мезенхимальных стволовых и прогениторных клеток костного мозга для разработки новых биотехнологий в трансплантологии - диссертация, тема по медицине
АВТОРЕФЕРАТ
Использование мезенхимальных стволовых и прогениторных клеток костного мозга для разработки новых биотехнологий в трансплантологии - тема автореферата по медицине
Крашенинников, Михаил Евгеньевич Москва 2006 г.
Ученая степень
кандидата биологических наук
ВАК РФ
14.00.41
 
 

Автореферат диссертации по медицине на тему Использование мезенхимальных стволовых и прогениторных клеток костного мозга для разработки новых биотехнологий в трансплантологии

На правах рукописи

Крашенинников Михаил Евгеньевич

«Использование мезенхимальных стволовых и прогениторных клеток костного мозга для разработки новых биотехнологий в трансплантологии»

(экспериментальное исследование)

14.00.41.- Трансплантология и искусственные органы 14.00.16.- Патологическая физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 2006 г.

Работа выполнена в ФГУ "Научно-исследовательском институте Трансплантологии и искусственных органов Росздрава"

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ: Академик РАН и РАМН,

доктор медицинских наук, профессор Валерий Иванович Шумаков

Доктор медицинских наук, профессор

Нина Андреевна Онищенко

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Чл. корр. РАМН, Доктор химических наук,

профессор

Доктор медицинских наук, профессор

Сергей Евгеньевич Северин

Николай Николаевич Скалецкий

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

ФГУ "Научно-исследовательский институт физико-химической медицины Росздрава"

диссертационного совета Д.208.055.01. при ФГУ "НИИ Трансплантологии и искусственных органов Росздрава" по адресу: 123182, Москва, ул. Щукинская, Д.1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ "НИИ Трансплантологии и искусственных органов Росздрава" Автореферат разослан «_»_2006 года.

Ученый секретарь диссертационного совета Д.208.055.01.

доктор медицинских наук, профессор Ольга Павловна Шевченко

Защита диссертации состоится «_ 2006 года в 14 часов на заседании

Актуальность темы

В последние десятилетия в России, также как и во всем мире стали отчетливо проявляться тревожные тенденции старения населения, роста хронических заболеваний и инвалидизации людей трудоспособного возраста (отчет ВОЗ за 2002 год). Затраты на лечение, реабилитацию и социальную поддержку такого контингента больных ложатся тяжелым бременем на государственный бюджет и поглощают значительную часть средств, ежегодно выделяемых на здравоохранение. Указанные обстоятельства настоятельно требуют освоения и внедрения в клиническую практику новых более эффективных и доступных методов восстановительного лечения больных.

Современное развитие биотехнологии, молекулярной и клеточной биологии позволяет рассматривать клетку не только как главный объект лечебного воздействия, но и как средство лечения многих заболеваний. Так для лечения сахарного диабета успешно используется трансплантация аллогенных феталь-ных и неонатальных ксеногенных культур островковых клеток поджелудочной железы (В.И.Шумаков, Н.Н.Скалецкий, 1998), для лечения различных форм печеночной недостаточности применяется экстракорпоральное подключение ксеногенных гепатоцитов и спленоцитов (DerneIrion et.al. 1995, Н.А.Онищенко и др. 1995, В.И.Шумаков и др. 1998), терапия аллогенными фетальными клетками используется для лечения ожогов (Д.С.Саркисов, 1995), миодистрофии Дюшена (В.С.Репин, Г.Т.Сухих 1998) и т.д.

Острый дефицит фетального аллогенного материала, обладающего высокой биологической активностью, и существование биоэтических проблем его использования (Ю.М.Лопухин, 2002), а также высокая антигенность ксеногенных клеток и опасность инфицирования при их использовании обусловили в последние пять лет пробуждение повышенного интереса исследователей всего мира к проблеме использования в медицине аутологичпых мезенхимальных стволовых и прогениторных клеток костного мозга (КМ) (Periii et.al. 2003; Assmus et. al.2002; Hess et.al. 2002; Iversen et.al. 2000; Strauer, Kornowski 2003).

Приступив в 2000 году к изучению возможности применения мезенхимальных стволовых и прогениторных клеток КМ в восстановительной медицине, мы убедились в том, что биологические возможности клеточной терапии

этими клетками вообще остаются мало изученными и поэтому нереализованными. В частности в литературе отсутствовали четкие представления о механизмах и путях реализации терапевтических эффектов клеточных технологий, не были отработаны режимы предифференцировки мезенхимальных стромаль-ных клеток (МСК) в различные типы клеток (в частности в кардиомиоцитопо-добные (КМЦП) клетки) и не использовались широко тканеспецифические маркеры предифференцировки для контроля оптимизации сроков дифференци-ровки МСК перед трансплантацией, не была отработана техника идентификации продифференцированных прогениторных клеток КМ в соответствующих тканях после трансплантации, а также не проводилась количественная оценка воздействия аутологичных прогениторных клеток стромального и гемопоэтиче-ского ряда на восстановление структуры и функции соответствующих пораженных органов. Отсутствие таких данных позволило нам сформулировать цели и задачи настоящего исследования.

Цель работы.

Оптимизировать технологические режимы культивирования прогениторных клеток КМ и предифференцировки МСК в кардиомиоцито-, остеобла-сто- и фибробластоподобные клетки, а также изучить влияние этих клеток на восстановление структуры и функции соответствующих пораженных органов.

Задачи работы.

1. Отработать методику раздельного выделения из костного мозга ге-мопоэтических и МСК и изучить влияние процесса культивирования на функциональную активность этих клеток.

2. Отработать режимы культивирования и предифференцировки МСК костного мозга в кардиомиоцитоподобные, остеобластоподобные и фибробластоподобные клетки in vitro и подтвердить состоявшуюся кардиогенную и ос-теогенную предифференцировку клеток.

3. Отработать методику маркирования клеток для выявления их в соответствующих мягких тканях после трансплантации.

4. Количественно оценить регенерацию поврежденных органов (сердце) и тканей (кожа, сосуды) при трансплантации в поврежденные зоны пре-культивированных аутологичных прогениторных клеток костного мозга стро-

мального и гемопоэтического ряда и сравнить эффективность лечения с результатами трансплантации аллогенных фетальных клеток в модельных опытах на животных с криодеструкцией миокарда, с глубоким ожогом кожи и с дислипи-догенным гепатозом и микроангиопатией.

5. Разработать технологию восстановления целостности длинных трубчатых костей с помощью иммобилизованных аутологичных клеток костного мозга в модельных опытах с резекцией кости.

Выполнение работы осуществлялось в рамках программы «Клеточные технологии медицине» по заданию Росздрава России (регистрационные №01.2.00 305441 и 01.2.00 305442).

Научная новизна.

Установлено, что в процессе культивирования гемопоэтических и МСК костного мозга активизируются функциональные потенции этих клеток, в результате чего процедуру культивирования аутологичных клеток костного мозга следует рассматривать как необходимый этап для осуществления успешной клеточной терапии. При культивировании гемопоэтической фракции клеток костного мозга это выражается изменением фенотипического состава клеток и продукции цитокинов, для фракции стромальных клеток - их дифференциров-кой и продукцией цитокинов (IL-10, G-CSF и TGFP).

В опытах in vitro отработана технология направленной дифференциров-ки МСК в остеобластоподобные, кардиомиоцитоподобные и колониеобразую-щие фибробластоподобные клетки путём создания адекватного состава культу-ральной среды. При дифференцировке МСК в КМЦП к концу 3-й недели в культуре появляются клетки (1-2%), обладающие способностью спонтанно и ритмично сокращаться. К 4-ой неделе культивирования количество кардиомио-цитоподобных клеток достигает своего максимума - 35-40% от общего количе-. ства клеток в культуре.

Проведена идентификация кардиомиоцитоподобных клеток по окраске на тропонин I, фибробластоподобных клеток - на коллаген I типа, виментин и CD133, а остеобластоподобных клеток - на коллаген I типа, на щелочную фос-фатазу и остеопонтин. Глубокая дифференцировка клеток в культуре тормозит

процесс пролиферации и понижает их жизнеспособность, делая их непригодными для трансплантации. кшмбо О'ИЖ

На моделях острого повреждения тааней у животных: кожи, сердца и трубчатых костей, а также при моделировании дислипидемии с хроническим повреждением стенки сосудов, установлены "позитивные терапевтические эффекты применения прогениторных клеток,костного мозга после культивирования. Показано, что трансплантация фибробластоподобных мезенхимальных стволовых клеток ауто- и аллогенного КМ' на" ожоговую поверхность кожи ускоряет процесс заживления кожныХ ра№более интенсивно, чем трансплантация фетальных фибробластов. /г'г'зжрщг^яггу. --

Было установлено, что КЖЩ . клетки аутологичного КМ, повышают систолическую функцию левого желудйчка- как при воздействии на него нагрузки объемом, так и при воздейй~вйй-нагрузки сопротивлением.

Показано, что дополнительная1 иммобилизация МСК из аутологичного КМ на аллогенном деминерализованном 'костном имплантате ускоряет процесс остеогенеза и сокращает сроки репаратйвной регенерации трубчатых костей.

Показано, что для коррекции Дислипидемии и ранних проявлений атеро-генеза могут использоваться как клетки- аллогешюй фетальной печени, так и прогениторные клетки аутологиздШй^;'КМр~6днако эффект последних более пролонгирован по коррекции показателей микроангиопатий.

Практическая значимость работы. Отработаны технологичесййё рёжимй-предифференцировки МСК КМ в колониеобразующие фибробластопйдобные, кардиомиоцитоподобные и остео-бластоподобные клетки. Предложено' для трансплантации продифференцированных клеток использовать относительно "короткие сроки предифференциров-ки (не более 2-х - 3-х недель для 'кардиомиоцито- и остеобластоподобных клеток), т.к. образование 75% моноеЖя'Совпадает с осуществлением начальных стадий дифференцировки в заданном'йагфавЛёнии.

С помощью рекомбинант!й6гй! аденовирусного вектора, содержащего Ьас2-ген Е.соП, внедренного в фатальные клетки (кардиомиоциты, фибробла-

сты) и МСК костного мозга на этапе их культивирования, доказано присутствие

/ЗЩ9Т 5ТООП

и функционирование этих клеток в течение, по крайней мере, 3-4 недель после трансплантации в зону повреждения.

Показана перспективность применения стволовых клеток аутологичного КМ для ускоренного и более эффективного восстановительного лечения поврежденных органов: при ожоговых ранах, при деструктивных процессах в миокарде, при дислипидемическом повреждении сосудов, печени и при нарушениях целостности трубчатых костей. Разработанный метод восстановления целостности трубчатых костей с помощью костных имплантатов, содержащих иммобилизованные аутологичные МСК КМ, внедрен в клиническую практику. На способ восстановления целостности трубчатых костей, предусматривающий дополнительную фиксацию дистальной и проксимальной зоны костного дефекта губчатым матриксом с адгезированными' на нем аутологичными клетками КМ, получен патент РФ № 2240135 от 20 ноября 2004г «Культура клеток, содержащая клетки-предшественники остеогенеза, имплантат на ее основе и его использование для восстановления целостности кости».

Апробация диссертации.

Основные положения диссертации доложены: на П Всероссийском съезде по трансплантологии и искусственным органам, Москва, октябрь, 2002; на I Всероссийской конференции «Стволовые клетки и перспективы их использования в Здравоохранении», Москва, 22 мая, 2003; на ХШ Международной конференции по проблеме "Перфторуглеродные соединения в медицине и биологии", 17-18 июня 2003, Пущино; на 2-й Международной конференции "Патофизиология и современная медицина", Москва, 22-24 апреля 2004; на Ш Российском конгрессе по патофизиологии, Москва, 9-12 ноября 2004; на П1 Всероссийском съезде по трансплантологии и искусственным органам. Москва, 28-30 октября 2005 г; на 12-ом Всемирном конгрессе по заболеваниям сердца (World Congress on Heart Disease «New Trends in Research Diagnosis and Treatment», to be held at the Hyatt Regency Vancouver, in Vancouver, B.C., Canada, July 16-19, 2005).

Апробация работы состоялась на межлабораторной конференции ФГУ НИИ трансплантологии и искусственных органов Росздрава 3 ноября 2005г.

По теме диссертации опубликовано 21 работа, из них 16 в центральной печати, 4 в зарубежной печати и 1 патент'РФ.

Структура и объем диссертации

Работа состоит из введения, обзора литературы, раздела «Материалы и методы исследования», описания результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и практических рекомендаций. Указатель используемой литературы содержит 250 источников, из которых 44 отечественных и 206 иностранных. Работа изложена на 148 страницах, содержит 14 таблиц и 40 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования.

Общая характеристика экспериментального материала. Работа выполнена на 438 животных (306 крыс породы Вистар массой 200-250 г, из которых 214 самцы и 92 - беременные самки; 120 трехцветных морских свинок, из которых 104 - самцы массой 300-400 г. и 16 - беременные самки массой 400500 г., а также 12 беспородных кошек массой 2,0-2,5 кг, из которых 6 - получены от одного помета).

Эксперименты на этих животных проводились по 2-м основным направлениям: по пути отработки технологии культуральных исследований (таблица №1), а также по пути исследования терапевтических возможностей полученных клеточных культур при моделировании повреждения органов (таблица №2). При повреждении миокарда эффекты клеточной терапии изучали на 4 группах животных: группа 1 (п=24) - ложно оперированные крысы; в группах 2, 3 и 4 у животных моделировали сердечную недостаточность методом криодеструкции (КД) и через 7 суток в принекротеческую зону животным 2 группы (п=34) инъецировали р-р Хэнкса (контроль повреждения), животным 3 группы (п=36) взвесь аллогенных фетальных кардиомиоцитов (ФКМЦ) (среднее количество 1,15±0,59 млн. клеток в р-ре Хэнкса), животным 4-ой группы (п=30) аутологич-ные МСК КМ, предифференцированные в кардиомиоцитарном направлении (ПМСК) (1,49±0,93 млн. клеток в р-ре Хэнкса, р=0,129 по сравнению со средним количеством ФКМЦ)- Животные в группе 3 после трансплантации получали циклоспорин А в дозе 5 мг/(кг/сут). Выживших животных каждой группы выводили из эксперимента через 4 недели после КД для изучения состояния со-

кратительной функции миокарда и для проведения иммуногистохимического исследования.

Таблица 1.

Расход животных и биологического материала на отработку технологии получения, предифференцировки и идентификации клеточных культур.

Группа исследований Объект исследований

Животные * Костный мозг человека

1 Получение: - фетальных кардиомиоцитов (ФКМЦ), Крысы (беременные) (75) 200 мл

- фетальных фибробластов (ФФ) Крысы (беременные) (17)

- фетальных клеток печени (КФП) Морские свинки (беремехшые) (б)

2 Получение и культивирование стволовых и прогениторных клеток КМ (главным образом гемопоэтических). Морские свинки (самцы)(6)

3 Получение, ведение первичных культур МСК и предифференцировка МСК:' - фибробластоподобные (ФМСК) Крысы (самцы) (21)

- кардиомиоцитоподобные (КМЦП) Крысы (самцы) (33)

- остеобластоподобные клетки (ОБПК) Кошки (самцы) (6)

Общий расход животных 164

*- в скобках указано количество животных

При повреждении кожи эффекты клеточной терапии изучали на 4-х группах крыс, в каждой из которых на коже создавали глубокие ожоговые раны методом термодеструкции (ТД). В 1-ой группе (п= 10) после термического ожога выполняли трансплантацию аллогенных фетальных фибробластов (ФФ); во 2-ой группе (п=10) трансплантацию фибробластоподобных МСК (ФМСК) алло-генного КМ; в 3-ей группе (п=10) трансплантацию аллогенных ФМСК, предва-

рительно иммобилизованных на биодеградируемой мембране "ЭластоПОБ"; в 4-ю группу было включено 10 крыс с глубоким термическим ожогом без применения клеточной терапии (контрольная группа). Суспензию ФФ и ФМСК в 1-й и 2-й группах наносили на поверхность ожоговой раны пипеткой в количестве по 2х106 клеток на 2-е сутки после ТД кожи и иссечения образовавшегося некротического струпа. После трансплантации клеток, ожоговую поверхность закрывали марлевой салфеткой, смоченной физиологическим раствором с ген-тамицином. В Зй группе аллогенные ФМСК, предварительно иммобилизованные на биополимере, также наносили на 2-е сутки после ТД. Неподвижность мембраны создавали путем подшивания ее к краям раны, а для плотного прилегания накладывали марлевую повязку.

Таблица 2.

Характеристика экспериментальных серий и расход животных при иссле-

довании терапевтических эффектов клеточной трансплантации.

Название экспериментальных серий Вид животных Количество животных

Трансплантация ФКМЦ и аутологичных ПМСК КМ в принекротическую зону миокарда после моделирования повреждения сердца методом КД. Крысы - самцы породы Вистар 124

Трансплантация ФФ и аллогенных ФМСК КМ на поверхность ожоговых ран, моделированных методом ТД. Крысы - самцы породы Вистар 40

Трансплантация КФП и аутологичных ККМ для коррекции липидного обмена в организме после моделирования хронической дислипидемии и раннего атерогенеза. Трехцветные морские свинки - самцы 104

Трансплантация имплантата с иммобилизованными предифференцированными МСК аутологично-го КМ после резекции лучевой кости. Однопомет-ные беспородные кошки 6

Всего 274 голов

Контроль эффективности клеточной терапии осуществляли 1, 3, 7, 15,30 сутки после трансплантации клеток на ожоговую поверхность.

При дислипидемии и на ранних стадиях атерогенеза эффекты клеточной терапии изучали в 2-х группах опытов на 104 морских свинках, из которых 10 - беременные самки - доноры клеток фетальной печени (КФП).

В 1-й группе изучали терапевтический эффект свежевыделенных КФП у морских свинок на фоне атерогенной диеты (АТД) (п=20) и на фоне молочной диеты (контроль) (п=1б). Во 2-й группе изучали эффект смешанной культуры стволовых и прогениторных клеток аутологичного КМ у морских свинок на фоне АТД (п=20) и на фоне молочной диеты (п=16). Для обеих групп опытов контролем служили морские свинки, которым на фоне АТД вводили физиологический раствор (п=22). Хроническая алиментарная дислипидемия и ранние стадии атерогенеза поддерживались в течение б месяцев.

Суспензию КФП и смешанную культуру стволовых клеток аутологичного КМ (преимущественно фракцию мононуклеарных стволовых клеток) вводили однократно в нижний полюс паренхимы селезенки в количестве 20 млн. клеток в 1 мл. физ. раствора через 2 месяца пребывания животных на АТД; причем действие введенных клеток исследовалось на фоне продолжающегося получения животными АТД (еще 4 месяца).

Контроль терапевтической эффективности клеточных трансплантаций при дислипидемии и на ранних стадиях атерогенеза оценивали в течение 4-х месяцев после введения клеток.

При дефиците костной ткани эффект клеточной терапии изучали на 6 беспородных кошках, которым создавали модель дефицита лучевой кости. Всего было выполнено 3 группы опытов. В 1-й группе - животным (п=2) имплантировали в зону дефекта лучевой кости деминерализованную кость с собственными иммобилизованными МСК (плотность посадки не менее 2-4 х 104 клеток/см2 и 30 х 104 клеток/см3), а имплантат закрывали надкостницей; во 2-ой группе животным (п=2) также имплантировали деминерализованную кость с собственными МСК, но закрывали мышцей; в третьей группе животным (п=2) имплантировали деминерализованную кость без МСК и имплантат закрывали надкостницей. Общий срок наблюдения после операции составил 12 недель, в течение которых животные сохраняли опороспособность на переднюю оперированную конечность за счет сохранения целостности локтевой кости.

Получение культур Детальных клеток и отдельных фракций клеток из КМ.

Работа по выделению и культивированию клеток проводилась в соответствии с общими принципами культуральных исследований.

Культуры фетальных кардиомиоцитов (ФКМЦ) получали ферментативным методом, описанным Li, (1993) из сердец плодов беременных крыс линии Вистар. Для одной трансплантации использовали 2-дневную культуру ФКМЦ, полученную из 2-3 эмбриональных сердец.

Клетки фетальной печени (КФП) выделяли из печени плодов морских свинок на 17-22 дни гестации ферментативным методом с использованием 0,05% раствора коллагеназы, промыванием измельченных кусочков ткани и продавливанием через сито со средой DMEM с 3% фетальной телячьей сывороткой. Терапевтическую дозу КФП получали из печени 1 эмбриона.

Культуры фетальных фибробластов (ФФ) - получали из легкого плодов крыс на 17-21 сутки гестации по методике Д.С.Саркисова и соавт. (1991). Материал для одной трансплантации ФФ получали от 2-3 плодов.

Культуры клеток костного мозга (ККМ) получали из аспирата костного мозга животных и человека.

Аспират КМ обрабатывали лизирующим раствором (114 mM NH4CI; 7,5 тМ КНС03; 100 мкМ EDTA) при комнатной t°=(22°C) в течение 3 мин с последующим отмыванием и центрифугированием. Осадок мононуклеарных клеток, ресуспендировали в ростовой среде IMDM (Gibco, USA) с добавками и высевали на кулиуральный пластик.

Культуры гемопоэтических клеток, не прикрепившиеся к пластику, получали через 7 суток культивирования.

Культуры мезенхимальных стромальных (прогениторных) клеток (МСК) получали из очищенного аспирата КМ путем адгезии клеток к культу-ральному пластику после смыва не прикрепившихся клеток (гемопоэтических) через 7 суток культивирования. При культивировании смену среды производили через каждые 3 суток.

Методы предифференцировки мезенхимальных (стромальных) стволовых и прогениторных клеток костного мозга.

Кардиомиоцитоподобные клетки (КМЦП) из МСК получали по методике Caplan 1991, предусматривающей временное добавление в культуральную среду 5-азацитидина (Sigma, USA) в концентрации 3-бмкМ.

Фибробласто-подобные клетки (ФМСК) получали из очищенной суспензии МСК, с временной инкубацией клеток в среде с 5-азацитидином и заменой на среду с добавкой основного фактора роста фибробластов (bFGF) 20нг/мл (Sigma, USA). Через 2-3 недели клеточный материал был готов для трансплантации. О состоявшейся дифференцировке МСК в фибробластоподобные клетки судили через 3-4 недели культивирования.

Остеобластоподобные клетки (ОБПК) получали из суспензии МСК КМ, которую ресуспендировали в среде IMDM со специальными добавками на различных подложках. Оптимальный срок культивирования составлял 2-3 недели. Удлинение срока культивирования предпринимали для выявления состоявшейся предифференцировки МСК в ОБПК.

При достижении 75% монослоя и при положительной окраске МСК на маркеры соответствующей дифференцировки (КМЦП, ФМСК, ОБПК), полученные культуры клеток считались готовыми для применения. Жизнеспособность клеток перед трансплантацией составляла 95±2%, по окрашиванию три-пановым синим.

Для трансплантации ФМСК в части опытов использовали биоконструкцию, состоящую из биодеградируемой мембраны ЭластоПОБ с иммобилизованными на ней клетками. Мембраны ЭластоПОБ были изготовлены в Центре по исследованию биоматериалов ФГУ НИИТиИО Росздрава (рук. Центра проф. Севастьянов В.И). Для трансплантации ОБПК использовали имплантаты из деминерализованных костей человека и губчатые матриксы с адгезированными на них клетками. Для клинического применения, такие имплантаты дополнительно фиксировали губчатым матриксом с адгезированными аутологичными клетками КМ (патент на изобретение №2240135 от 20 ноября 2004г).

' Методы идентификации специфичности клеток в культуре и активности их в тканях после трансплантапии.

Идентификация кардиоспецифичности клеток осуществлялась по выявлению в них - кардиоспецифичного тропонина I, иммуногистохимическим методом с использованием мышиных моноклональных антител к тропонину-1.

Идентификацию МСК и фибробластоподобных МСК осуществляли методом непрямой иммунофлуоресценции, используя моноклональные антитела (МАТ) к маркерам - виментину, поверхностному антигену CD133, а также коллагену I типа (А. Лейси, 1992).

Идентификацию остеобластоподобной дифференцировки МСК осуществляли по выявлению в клетках коллагена I типа, по окрашиванию их на активность щелочной фосфатазы и остеопонтин (А. Лейси, 1992).

Для идентификации трансплантированных клеток в тканях после трансплантации использовали метод Wakitani (1995), прижизненного введения кодирующей метки в клеточную культуру. Введение метки в культивируемые клетки осуществляли с помощью рекомбинантного делецированного аденовируса, содержащего ген LacZ из E.coli, кодирующего бактериальную ß-галактозидазу. Активность ß-галактозидазы выявляли гистохимически по сине-зеленому окрашиванию при добавлении субстрата X-Gal.

Фазово-контрастную и флуоресцентную микроскопию клеточных культур проводили на микроскопах "Axiovert-25" (Karl Zeiss, Германия), Laborux" ("Leika", Германия). Для фотографирования использовали цифровую фотокамеру "Axiocam color" (Karl Zeiss, Германия).

Определение фенотипического состава клеток гемопоэтической фракции КМ проводили на проточном цитофлуориметре FAScan фирмы Becton Dickinson (USA) с использованием комбинации МАТ к дифференцировочным и активационным маркерам (НПЦ-«МедБиоСпектр» и «Сорбент»), меченных FITC и фикоэритрином (РЕ).

Цитокины в культуралъной среде-. IL-10, G-CSF, TGF-ß определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с помощью отечественных наборов (ООО «Цитокин», Санкт-Петербург).

Техника моделирования повреждения органов и тканей.

Повреждение миокарда создавали у крыс методом КД под наркозом (кетамин 50 мг/кг и ксилазолин 10 мг/кг) в условиях искусственной вентиляции легких после торакотомии и перикардотомии. Для этого к переднебоковой стенке левого желудочка на 30 с. прикладывали металлический стержень (Д-6 мм), охлажденный в жидком азоте. Криовоздействие повторяли 14 раз.

Ожоговые повреждения кожи моделировали в хирургическую стадию эфирного наркоза (50 мг/кг подкожно) методом ТД. Для этого к коже спины прикладывали металлическую пластинку, нагретую до 97,7°С на 8 сек. Площадь пластины составляла 18-20% общей поверхности кожи крысы. При указанных режимах экспозиции достигалось повреждение всех слоев кожи.

Дефицит костной ткани моделировали у кошек путем резекции лучевой кости. Для этого под внутривенным наркозом резицировали фрагмент лучевой кости длиной 1,5 см в средней трети. В образовавшийся дефект помещали костный имплантат без клеток (контроль), либо с иммобилизованными на нем аутологичными МСК. Рану послойно и наглухо закрывали, дополнительной фиксации имплантата не проводили.

Дислипидемическую ангиопатин) и жировую дистрофию печени моделировали в хронических опытах на морских свинках назначением АТД (0,1 г холестерина на молоке/1 ООг веса животного в сутки в течение 6 месяцев). В контрольных группах животные получали молочную диету - свежее цельное молоко -1 контроль, или стандартную диету вивария - П контроль.

Методы изучения Функции органов.

Насосную функцию сердца в опытах с КД миокарда изучали через 3 недели после трансплантации ФКМЦ и продифференцированных МСК (т.е. через 4 недели после КД миокарда) в стендовых условиях по модифицированной методике Ыее1у (1967 г). Методика позволяет регистрировать показатели насосной функции левого желудочка сердца в условиях последовательной смены 8 режимов нагрузок.

Участие печени в липидном обмене в опытах с моделированием дис-липидемии и ранних стадий атерогенеза изучали путем определения общего

холестерина (ХС), холестерина липопротеидов низкой, очень низкой и высокой плотностей (ЛПНП, ЛПОНП, ЛПВП), и триглицеридов (ТГ).

Темп восстановления кожных половое при моделировании термических ожогов оценивали планиметрическим методом по скорости сокращения раневой поверхности.

Регенерацию костной ткани оценивали рентгенологически по появлению оссифицированных тканей в области трансплантатов.

Гистологические методы исследования.

Для исследования регенерации поврежденной кожи или кости получали биопташ из зон повреждения и готовили либо криостатные, либо парафиновые срезы, которые окрашивали гематоксилином и эозином.

Морфологические изменения в печени и аорте при моделировании дис-липидемии и ранних стадий атерогенеза изучали на криосрезах, окрашенных на жир по Гольдману. Состояние микроциркуляторного русла оценивали на тотальных пленочных препаратах брыжейки тонкой кишки, импрегнированной азотнокислым серебром (по Куприянову В.В., 1975). Морфометрию микрососудов проводили на полуавтоматической системе анализа изображения "Leitz-ASM" (Германия).

Методы статистической обработки.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием методов вариационной статистики в программе EXCEL пакеты MS Office и Biostat 4.03. Для сравнения количественных показаний использовали t-критерий Стьюдента с поправкой Бонферрони для множественных сравнений с контрольной группой. Межгрупповые отличия считали достоверными при р<0,05.

Результаты исследования.

I. Культивирование как способ выявления биологических и терапевтических эффектов клеток костного мозга.

Используя различные питательные среды для культивирования стро-мальных ККМ и маркеры идентификации состоявшейся предифференцировки, мы показали, что уже через одну неделю клетки начинают распластываться и формировать монослой. При окрашивании этих клеток на виментин и антиген CD133, мы подтвердили, что через одну неделю все прикрепившиеся клетки

имеют мезенхимальное происхождение, т.к. в 100% клеток выявляется вимен-тин. Окраска на СБ 133 на этом сроке культивирования составила 80%, а по мере увеличения сроков культивирования и формирования монослоя снижалась до 20% к 8 неделе культивирования. Мы полагаем, что снижение в культуре клеток с маркером СБ 133 указывает на снижение молодых клеток, способных дифференцироваться в другие клеточные фенотипы при создании соответствующих условий. В результате исследования было констатировано, что мы применили адекватную методику получения МСК в культуре и что для проведения направленной дифференцировки клеток в заданном направлении нужно использовать МСК только на ранних сроках выделения и культивирования, поскольку именно эти МСК содержат молодые и недифференцированные популяции клеток, обладающие высоким пластическим потенциалом. Далее мы показали, что культура молодых МСК может стать источником для получения клеток нескольких фенотипов, при использовании адекватно подобранных культу-ральных сред и условий для их направленной дифференцировки.

Необходимость разработки технологий предифференцировки МСК по различным направлениям диктовалась намерением трансплантации дифференцированных МСК со свойствами соответствующих прогениторных клеток в различные пораженные органы для восстановительной регенерации.

Нами были отработаны режимы предифференцировки МСК в кардио-миоцитоподобные, фибробластоподобные, остеобластоподобные и адипоцито-подобные клетки.

Адипоцитоподобные клетки, выявляемые по окраске Суданом 1П, образовывались спонтанно при культивировании МСК более двух месяцев в среде с 10% фетальной сывороткой и добавлением в неё только инсулина и дексаме-тазона.

Кардиомиоцитоподобные клетки образовывались из МСК к концу 4-ой недели культивирования в среде, содержащей фетальную сыворотку и специфические добавки. Для предифференцировки МСК в кардиомиоцитоподобные клетки (КМЦП) необходимо было также на третьи сутки культивирования МСК провести инкубацию их (24-48 часов) в среде, содержащей 3 мкМ 5-азацитидин. Мы показали, что к концу 4-ой недели культивирования наблюда-

ется появление структур, напоминающих миотрубочки поверх слоя фибробла-стоподобных клеток. Часть клеток (-1-2%) к концу 5-ой недели содержали от одного до нескольких ядер и спонтанно сокращались.

При пересеве клеток спонтанные сокращения пропадали и появлялись вновь после образования монослоя фибробластоподобных клеток. Эти данные заставили нас предположить, что получить чистую клонированную культуру нетрансформированных клеток, дифференцированных только в одном заданном направлении, не представляется возможным, подобно тому, как это происходит при дифференцировке в нейрональном направлении эмбриональных стволовых клеток (В.С.Репин и др. 2002). Очевидно, в культуре всегда должны присутствовать фидерные элементы, поддерживающие выживание и жизнеспособность дифференцирующихся и уже дифференцированных клеток в специфическом направлении. Для получения прямых доказательств миогенной диф-ференцировки МСК нами было проведено окрашивание клеток в культуре на кардиоспецифический белок - тропонин I крысы, морской свинки и человека. Было установлено, что уже к концу 3-ей недели культивирования в 25-30% клеток животных и человека выявляется кардиоспецифический белок тропонин I; при увеличении сроков культивирования до 5 недель количество клеток, продуцирующих тропонин I, возрастает до 35-40% от общего количества клеток, но при дальнейшем увеличении сроков культивирования МСК процент тропо-нин-позитивных клеток не изменялся. В отличие от тропонина I в кардиомио-цитах быка и кролика, где этот белок был четко структурирован и находился в пространстве между поперечной исчерченностью клеток - тропонин I в МСК из КМ выявлялся в цитоплазме в виде диффузного свечения флуоресцентной метки и не имел четкой структурной локализации. Использование кардиоспецифи-ческой метки на тропонин I позволило нам таким образом не только установить факт дифференцировки клеток в КМЦП, но и установить сроки его запуска (конец 2-ой, начало 3-ей недели).

Остеобластоподобные клетки начинали образовываться из МСК на 710 сутки их культивирования в среде Ькоу'э (ОМЕМ) с добавками - индукторами остеогенной дифференцировки (Шс1у V, Р1оие1 1., 1994; Вае Б.С, et а1. 2001). С помощью маркеров остеогенной дифференцировки в культуре проли-

ферирующих МСК уже на 7-е сутки выявляется коллаген I типа, а на 14-е сутки - высокая активность щелочной фосфатазы и наличие остеопонтина.

Выявление кальций фосфатных кристаллов на 24-е сутки остеогенной дифференцировки является отражением высокой функциональной активности клеток, вошедших в процесс остеогенеза.

Между тем, сроком запуска остеогенной дифференцировки клеток следует, по нашим данным считать начало или конец 2-ой недели культивирования, так как именно к 14 суткам в клетках отмечается высокая активность щелочной фосфатазы и появление остеопонтина.

Фибробластоподобные клетки из МСК образуются постоянно в культуре, как фидерные клетки, вне зависимости от состава среды и обработки 5-азацитидином. Однако, их процентное содержание в культуре зависит от присутствия в среде факторов роста, гормональных и специфических добавок.

На активность дифференцировки МСК в культуре в другие типы клеток оказывает также влияние исходное содержание молодых развивающихся МСК, несущих поверхностный антиген CD133, который характеризует пластические возможности клеток. Кроме того, важным условием дифференцировки и пролиферации клеточных культур является моделирование для них условий микроокружения, которое, по-видимому, играет важную роль в реализации эффекта "homing". Так как МСК являются распластывающимися и прикрепляющимися клетками, то при культивировании КМЦП клеток обычно используют адге-зирующий пластик или коллаген; для фибробластоподобных клеток - адгези-рующий пластик и биодеградируемые пленки; при культивировании остеобла-стоподобных клеток — необходимо использовать трехмерный метрике: коллаге-новую губку и различные типы деминерализованных костей.

Для обоснования оптимальной стадии дифференцировки клеток перед их трансплантацией, нами на коллагенизированную поверхность были посеяны МСК в концентрации 8x103 клеток/см2 в дифференцировочной среде для образования КМЦП клеток. В течение 8 недель в динамике определялись количество жизнеспособных клеток (окраска трипановым синим) и дифференцированных (окраска на тропонин I) клеток без йересева. Было установлено, что начиная с 4-ой недели культивирования МСК начинается отчетливая гибель клеток

в: культуре и резкое нарастание количества дифференцированных клеток, что сопровождается снижением их пролиферативной активности. Проведенные наблюдения позволили прийти к заключению, что для предифференцировки МСК (КМЦП, ОБПК) целесообразно использовать короткие сроки культивирования - не более 3 недель, так как в течение этого срока завершается образование 75% монослоя (т.е. идет активный пролиферативный процесс) и уже начинается реализация процесса клеточной дифференцировки.

Если исходить из того, что регенерационные эффекты МСК и клеток ге-мопоэтической фракции КМ должны реализоваться в том числе за счет продукции ими в окружающую среду широкого спектра регуляторных цитокинов -интерлейкинов и ростовых факторов, то можно думать, что при глубокой степени повреждения органов нарушена не только воспринимающая, индукционная и пролиферативная активность регионарных прогениторных клеток, но и снижена функциональная активность всех прогениторных клеток костного мозга. Для проверки этого предположения нами исследовалась биологическая активность клеток КМ по продукции ими в культуральную среду некоторых цитокинов через 5 суток культивирования; кроме того был изучен фенотип не-прикрепившехся клеток КМ до и после 8 суточного культивирования. Оказалось, что в процессе культивирования клетки начинают активно секретировать цитокины (TGFp, G-CSF и IL-10). Кроме того, в процессе культивирования меняется фенотипический состав клеток: увеличивается доля клеток, несущих рецептор IL-2 (CD25), повышается содержание клеток с поверхностными антигенами CD3, CD4, CD8, CD38, CD54, CD95, CD1 lb.

II. Использование стволовых и прогениторных клеток костного мозга для восстановления структуры и Функции поврежденных органов и

тканей в эксперименте.

Исследования были проведены в острых модельных опытах с повреждением миокарда, кожи и лучевой кости, а так же в опытах с моделированием хронической алиментарной дислипидемии.

Характеристика процесса регенерации миокарда после криодеструк-ции и трансплантации клеток в принекротическую зону.

В 4-х группах опытов были получены ответы на два основных вопроса: уменьшаются ли размеры зоны повреждения левого желудочка после клеточной терапии и существуют ли различия в регенерации миокарда под влиянием аутологичных продифференцированных МСК КМ и аллогенных фетальных кардиомиоцитов.

Исследования показали, что после моделирования сердечной недостаточности методом КД на 30 сутки в зоне повреждения ЛЖ происходило формирование рубцовой ткани округлой формы диаметром 6-7 мм со стороны эпикарда и 3 мм со стороны эндокарда; толщина стенки ЛЖ в центре рубца не превышала 1мм. Нами не было выявлено различий в форме и размерах рубца у животных 2, 3 и 4 групп, но было выявлено достоверное снижение относительной массы миокарда свободной стенки ЛЖ и относительной массы миокарда ЛЖ во 2-й группе с КД по-сравнению с 1-й группой животных с интактными сердцами. Снижение мышечной массы ЛЖ после КД неизбежно дол*но было привести к снижению его сократительной активности.

Исследование насосной функции сердца в стендовых условиях подтвердило, что через 1 месяц после КД (вторая группа опытов) действительно происходит снижение сократительных свойств ЛЖ по сравнению с интактными сердцами (1 группа опытов), однако выявить эти различия удаётся только при последовательном воздействии нагрузок на миокард - сначала объемом перфу-зионного раствора на ЛЖ (т.н. преднагрузка), режимы 1-3 а затем повышением сопротивления на выходе из ЛЖ в аорту (режимы 4-8). Изменения в функциональных показателях миокарда выявлялись как при измерений их абсолютных значений, так и при оценке их относительных изменений, что позволяло нивелировать индивидуальные различия абсолютных значений исследуемых показателей в разных группах.

При исследовании насосной функции сердец 3 и 4 групп, которым в при-некротическую зону трансплантировали клетки, было установлено, что эти сердца при воздействии нагрузочных режимов проявляли более выраженную способность обеспечивать норму функции миокарда на едйницу веса ткани сердца по сравнению с поврежденными сердцами без клеточной терапии (2 группа), приближаясь к значениям исследуемых показателей у интактных сер-

дец (1 группа). Анализ результатов изучения функции миокарда левого желудочка у животных разных групп при воздействии нагрузочных режимов позволил заключить: 1) Исследование насосной функции изолированных интактных и поврежденных сердец на стендовой установке в условиях применения дозированных пред - и постнагрузок на ЛЖ позволяет выявить признаки скрытой ЛЖ-недостаточности в криоповрежденных сердцах и ослабление повреждения миокарда при трансплантации в него ФКМЦ и ПМСК КМ; 2) Через 3 недели после трансплантации ФКМЦ и ПМСК КМ (группы 3 и 4) некоторые показатели насосной функции ЛЖ либо не отличались от аналогичных показателей у интактных сердец (1-я группа), либо были достоверно выше, чем в контроле -при КД (группа 2); 3) ФКМЦ и ПМСК КМ, трансплантированные в миокард, повышают систолическую функцию ЛЖ в режиме последовательного повышения преднагрузок. Трансплантация ПМСК КМ повышает устойчивость миокарда и к воздействию постнагрузок; 4) Повышение функциональной активности поврежденного сердца после трансплантации клеток, связано с длительным присутствием в миокарде (по крайней мере, в течение 3 недель) жизнеспособных аллогенных ФКМЦ и аутологичных ПМСК КМ (данные получены при трансплантации клеток, меченных геном Ьасг из Е.СоИ, кодирующей р-галактозидазу).

Характеристика процесса регенерации кожи после термодеструкции и трансплантации клеток на ожоговую поверхность.

В 4-х группах опытов на крысах с моделированием глубоких ожоговых ран методом ТД и трансплантации аллогенных ФМСК, аутогенных ФМСК и аллогенных ФФ сравнивали динамику заживления ожоговых ран.

Проведенные эксперименты показали, что: 1) Алло- и аутогенные ФМСК, так же как и ФФ, ускоряют темп регенерации глубоких ожоговых ран по сравнению с контролем (спонтанная регенерация) за счет длительного сохранения жизнедеятельности этих клеток в ране после трансплантации (данные получены при трансплантации клеток, меченных геном ЬлсТ. из Е.СоИ, кодирующей р-галактозидазу); 2) Ускорение процесса заживления ран под влиянием трансплантированных клеток по сравнению с контролем сопровождается существенным ускорением темпов разрастания сосудистой сети и формирования

грануляционной ткани в зоне ожоговой поверхности; 3) При выборе клеточного материала предпочтение следует отдавать ФМСК, так как использование ФМСК по сравнению с ФФ характеризуется более высоким темпом регенерации ожоговых ран; 4) Отсутствие достоверных различий в регенерационной активности алло- и ауто-ФМСК указывает на возможность использования алло-генных ФМСК для стимуляции ускоренного заживления ожоговых ран.

Характеристика процесса регенерации трубчатых костей после резекции и применения деминерализованных костных имплантатов с иммобили-зированными предифферевдировагашми МСК КМ.

В 3-х группах опытов у кошек с резекцией лучевой кости имплантировали деминерализованную кость саутологичными МСК и имплантат закрывали надкостницей (I группа) и мышцей (П группа) или имплантировали деминерализованную кость без МСК и имплантат закрывали надкостницей.

В проведенных экспериментах было показано, что: 1) Продифференцированные МСК, иммобилизованные на поверхности деминерализованных имплантатов костной ткани, ускоряют процесс восстановительной регенерации после обширной резекции, трубчатых костей по сравнению с использованием костных имплантатов без, МСК; 2) При восстановительной регенерации костной ткани после обширных резекций трубчатых костей обнаружен процесс эн-хондрального остеогенеза; 3) Процесс энхондрального остеогенеза более выражен при использовании имплантатов без МСК, но при использовании имплантатов с иммобилизованными МСК он также имеет место.

На способ восстановления целостности трубчатых костей, предусматривающий дополнительную фиксацию дистальной и проксимальной зоны костного дефекта губчатым, матриксом с адгезированными на нем аутологичными клетками костного мозга получен патент РФ №2240135 от 20.11. 2004 г.

Коррекция хронической дислипидемии и ранних стадий атерогенеза путем однократного применения аллогенных клеток фетальной печени и моно-нуклеарной фракции кчеток аутологичного костного мозга.

В 4-х группах опытов на морских свинках: у интакгных животных, морских свинок на атерогенной диеяге (АТД), у морских свинок на АТД и терапии клетками фетальной печени (КФП), а также у морских свинок на АТД и тера-

пии клетками мононуклеарной фракции ККМ - исследовали состояние липид-ного обмена, проводили морфометрию микрососудов, а также морфологические исследования состояния печени. Было обнаружено, что: 1) Трансплантация прекультивированных аутологичных ККМ и свежевыделенных аллогенных КФП обеспечивает коррекцию ранних проявлений хронической ДЛП и атерогенеза. Даже в условиях продолжающейся АТД на фоне применения клеточной терапии: ослабляются морфологические признаки дислипидогенной микроан-гиопатии (снижается выраженность сужения сосудов приносящего звена, уменьшаются спазмы артериол и дилятация венул), уменьшаются признаки неспецифического воспаления и жировой дистрофии печени, которые возникают при моделировании хронической ДЛП и атерогенеза. 2) Корригирующий эффект при аутотрансплантации ККМ животным с ДЛП и ранними проявлениями атерогенеза более выражен и более пролонгирован, чем при аллотранспланта-цииКФП.

Выводы.

1. Отработана методика раздельного выделения и культивирования гемопоэтических и мезенхимальных (стромальных) стволовых и прогенитор-ных клеток костного мозга, что подтверждено фенотипическими и иммуноги-стохимическими исследованиями.

2. Отработаны режимы предифференцировки МСК костного мозга в кардиомиоцитоподобные, фибробластоподобные и остеобластоподобные клетки, что подтверждено иммуногистохимическими методами.

3. Маркирование клеток с помощью рекомбинантного вируса, несущего ген Е.соИ Ьас-г 1Ас1-8\г40- рСа1], позволяет выявлять жизнеспособные клетки после трансплантации их в мягкие ткани до 1,5 месяцев.

4. Трансплантация аутологических ПМСК костного мозга, продифференцированных в кардиомиоцитоподобные клетки, более эффективно стимулирует процессы восстановительной регенерации миокарда после криодеструк-ции, чем трансплантация фетальных аллогенных кардиомиоцитов.

5. Трансплантация ауго- и аллогенных фибробластоподобных МСК обеспечивает более быстрое и эффективное заживление глубоких ожоговых ран после термодеструкции, чем фетальные фибробласты. Предифференцирован-

ные МСК, также как и фетальные фибробласты способствуют заживлению ран путем ускорения разрастания сосудистой сети и формирования грануляционной ткани.

6. Применение аллогенных деминерализованных костных имплантатов с иммобилизованными на них аутологичными остеобластоподобными клетками, предифференцированными из МСК костного мозга, достоверно ускоряет процесс восстановительной регенерации костной ткани после резекции трубчатых костей.

7. Трансплантация аутологических прекультивированных клеток костного мозга обеспечивает коррекцию ранних проявлений атеросклероза и ослабление морфологических признаков микроангиопатий и жировой дистрофии печени при моделировании хронической алиментарной дислипидемии более эффективно и более длительно, чем при трансплантации клеток фетальной печени.

Практические рекомендации

1. Для проведения клеточной терапии аутологичными прогениторны-ми клетками КМ целесообразно использовать предварительное культивирование.

2. Для трансплантации продифференцированных МСК (кардиомиоци-то- и остеобластоподобных) следует использовать короткие сроки дифферен-цировки (не более 3 недель), когда образуется 75% монослой и начинает осуществляться дифференцировка клеток в заданном направлении.

3. Регенераторные свойства стволовых и прогениторных клеток ауто-логичного костного мозга могут успешно применяться при различных острых патологиях (резекция кости, ожоговые раны, острый инфаркт миокарда). При хронических патологиях применение клеточной терапии следует рекомендовать после предварительного выявления в используемых клетках регенераторных (функциональных) резервов. При отсутствии достаточного резерва - клеточная терапия может оказаться малоэффективной.

4. Для оптимизации условий трансплантации остеобластоподобных и фибробластоподобных клеток следует использовать не клеточные суспензии, а биоконструкции, состоящие из биодеградируемых материалов (типа Эласто-

ПОБ) или матриксов с иммобилизованными на них продифференцированными МСК.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Потапов И.В, Онищенко Н.А, Крашенинников М.Е. «Клеточная кардиомио-лластика». Вестник трансплантологии и иск. органов. 2001. №2. с. 54-62.

2. Берсенёв A.B., Крашенинников М.Е., Оншценко А.Н.. «Клеточная терапия дислипидемии и атеросклероза.» Вестник трансплантологии и иск. органов. 2001. №2. с. 47-53.

3. М.Ф. Расулов, М.Е.Крашенинников, Н.А.Оншценко «Применение аллоген-ных эмбриональных фибробластов и мезенхимальных стволовых клеток костного мозга для биопластических операций при обширных ожогах.» Вестник трансплантологии и иск. органов. 2002. №3. с. 90-91.

4. Шумаков В.И., Онищенко H.A., Крашенинников М.Е. и др. «Костный мозг как источник получения мезенхимальных клеток для восстановительной терапии поврежденных органов.» Вестник трансплантации и иск. органов 2002. N4. с. 3-6.

5. В.И. Шумаков, М.Ф. Расулов, М.Е.Крашенинников и др. «Сравнительная оценка эффективности применения аллогенных эмбриональных фибробластов и мезенхимальных стволовых клеток костного мозга для терапии глубоких ожоговых ран.» Вестник трансплантологии и иск. органов. 2002. №4. с. 711.

6. В.И.Шумаков, Н.А.Оншценко, М.Е.Крашенинников и др. «Дифференци-ровка стромальных стволовых клеток костного мозга в кардиомиоцито-подобные клетки у различных видов млекопитающих.» Бюлл.эксперим.биол.мед. 2003. N4. с. 461-465.

7. Шумаков В.И., Казаков Э.Н., Онищенко H.A., Гуреев С.В., Остроумов Е.Н.,Честухин В.В., Крашенинников М.Е. и др. «Первый опыт клинического применения аутологичных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга для восстановления сократительной функции миокарда.» Российский кардиологический журнал 2003. №5. с. 42-50.

8. В.И.Шумаков, Н.А.Оншценко, М.Ф.Расулов, М.Е.Крашенинников и др. «Мезенхимальные стволовые клетки костного мозга эффективнее эмбриональных фибробластов стимулируют регенерацию глубоких ожоговых ран.» Бюлл. эксперим. биол. мед. 2003, т. 136. № 8. с. 220-223.

9. -В.И. Шумаков, H.A.Онищенко М.Ф. Расулов, М.Е. Крашенинников и др.

«Использование предифференцированных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга для лечения глубоких ожоговых ран.». Вестник хирургии им И.И. Грекова. 2003. т. 162. № 4. с. 38-41.

Ю.Расулов М.Ф., Онищенко H.A., Крашенинников М.Е. и др. «Фибробласто-подобные мезенхимальные стволовые клетки костного мозга подобно эмбриональным фибробластам стимулируют заживление поверхностных ожоговых ран.» Вестник трансплантологии и иск.органов. 2003. №4. с. 7-11.

11.B.JI. Зорин, М.Е. Крашенинников, В.И. Фролов, Н.А.Оншценко и др. «Использование иммобилизованных предифференцированных мезенхимальных

стволовых клеток костного мозга для регенерации трубчатых костей при обширных резекциях.» Вестник трансплантологии и искусственных органов 2004. №1. с. 37-40.

12.Н.АОншценко, И.В.Потапов, Л.В.Башкина, М.Б.Крашенинников и др. «Восстановление сократительной функции криоповрежденного миокарда крыс после трансплантации фетальных кардиомиоцитов и продифференцированных стромальных стволовых клеток костного мозга.» Бюлл.эксперим.биол.мед. 2004. N10. Т. 138. с. 403-407.

13. Долгих М.С., Григорьева А.Ю., Жигулин А.О.,Зайденов В.А., Расулов М.Ф., Потапов И.В., Крашенинников М.Е., Онищенко Н.А. «Применение реком-бинантной аденовирусной конструкции ADSV-40|B- Gal для мониторинга трансплантированных клеток.» Клеточные технологии в биологии и медицине. 2005. т.51. N3.

14.Е.Н.Остроумов, М.Е.Крашенинников, С.В.Гуреев и др. «Визуализация распределения в миокарде аутолошчных стволовых клеток костного мозга при их интракоронарном или интрамиокардиальном введении больным ИБС.» Вестник трансплантологии и иск. органов. 2004. N1. с.26-29.

15.Н.А.Онищенко, М.Е.Крашенинников. «Современные представления о био- . логии стволовых клеток костного мозга и крови в аспекте их клинического применения.» Вестник трансплантологии и иск.органов. 2004. N3. с.50-57.

16.1Пумаков В.И., Онищенко Н.А., Крашенинников М.Е., Быстрое В.А., Бриль А.Г., Абалмасов К.Г. Патент РФ № 2240135 от 20 ноября 2004г «Культура клеток, содержащая клетки-предшественники остеогенеза, имплантат на ее основе и его использование для восстановления целостности кости».

17.М.Ф.Расулов, А.В.Васильченков, Н.А.Онищенко, М.Е.Крашенинников и др. «Первый опыт применения мезенхимальных стволовых клеток костного мозга для лечения больной с глубокими ожоговыми ранами кожи.» Клеточные технологии в биологии и медицине. 2005. №. 1. с.42-46.

18.N.A. Onischenko, М.Е. Krasheninnikov, M.F.Rasulov et. al.«Tissue Engineering approaches for treatment of organ disfunction, by bone marrow-derived mesenchimal stem cells.» Tissue Engineering. 2003. N 9(4). p. 788.

19.N.A. Onischenko, M.E. Krasheninnikov, M.F.Rasulov, LV.Potapov et al. «Experimental models and technological approach for the estimation of therapeutic efficiency of organ dysfunction, by marrow-derived mesenchimal stem cells.» Int.J.Artif.Organs. 2003. N.26 (7). p. 563.

20.Egorova V.A.,Nemets E.A., Krasheninnikov M.E.,Onischenko N.A et. al. «Matrix on the basis of polyhydroxybutyrate copolymers for bioartificial tissues.» Mac-romolecular Approaches to Advanced Biomaterials Engineering Systems. 2003, p. 8-11.

21.V.I.Shumakov, E.N.Kazakov, S.V.Gureev, N.A.Onischenko, E.N.Ostroumov, A.A.Temnov, M.E.Krasheninnikov et al. «Aortoconorary bypass grafting and autologous bone marrow stem-cell transplantation in the treatment of the ishaemic heart failure.» 12th World Congress on He'art Disease- New Trends in Research Diagnosis and Treatment, to be held at the Hyatt Regency Vancouver, in Vancouver,B.C.,Canada, 2005, p. 16-19.

Заказ №638. Объем 1 пл. Тираж 100 экз.

Отпечатано в ООО «Петроруш». г. Москва, ул. Палиха-2а, тел. 250-92-06 www.postator.ru

 
 

Оглавление диссертации Крашенинников, Михаил Евгеньевич :: 2006 :: Москва

Введение.

Глава I. Обзор литературы. Современные представления о возможностях применения стволовых и прогениторных клеток для восстановительного лечения поврежденных органов.

1.1. Стволовые и прогениторпые клетки как биорезерв для развития клеточных технологий.

1.2. Биологическая характеристика популяционного состава клеток костного мозга.

Глава II. Материалы и методы исследования.

2.1. Общая характеристика экспериментального материала.

2.2. Технология получения и ведения клеточных культур.

2.3. Техника моделирования повреждения органов и тканей.

2.4. Методы исследования, используемые в организме после трансплантации клеток.

2.5. Методы статистической обработки.

Глава III. Культивирование как способ выявления и реализации биологических и терапевтических эффектов клеток костного мозга

3.1. Изучение возможности предифференцировки мезенхимальных (стромальных) прогениторных клеток костного мозга.

3.2. Исследование продукции цитокинов и фенотипа клеток костного мозга человека.

Глава IV. Использование клеток костного мозга для восстановления структуры и функции поврежденных органов и тканей в эксперименте.

4.1. Характеристика функционального и морфологического состояния сердца после криодеструкции и трансплантации клеток в принекротическую зону.

4.2. Характеристика процесса регенерации кожи после термодеструкции и трансплантации клеток на ожоговую поверхность.

4.3. Характеристика процесса регенерации трубчатых костей после обширных резекций и применения имплантантов с иммобилизованными мезенхимальными прогениторными клетками костного мозга.

4.4. Использование аллогенных клеток фетальной печени и ядросодержащей фракции клеток аутологичного костного мозга для коррекции дислипидемии и ранних стадий атеросклероза.

 
 

Введение диссертации по теме "Трансплантология и искусственные органы", Крашенинников, Михаил Евгеньевич, автореферат

В последние 20-30 лет в России, также как и во всем мире стали отчетливо проявляться тревожные тенденции старения населения, неуклонного роста хронических заболеваний и инвалидизации людей трудоспособного возраста (отчет ВОЗ за 2002 год). Затраты на лечение, реабилитацию и социальную поддержку такого контингента больных ложатся тяжелым бременем на государственный бюджет и поглощают значительную часть средств, ежегодно выделяемых на здравоохранение.

Указанные обстоятельства настоятельно требуют совершенствования современной системы терапии, которая в значительной степени может быть достигнута благодаря освоению и внедрению в клиническую практику новых более эффективных и доступных методов восстановительного лечения больных.

Современное развитие биотехнологии, молекулярной и клеточной биологии сделали клетку не только главным объектом лечебного воздействия, но и средством лечения многих заболеваний. Так для лечения сахарного диабета успешно используется трансплантация аллогенных фетальных и неонатальных ксеногенных культур островковых клеток поджелудочной железы (В.И.Шумаков, Н.Н.Скалецкий, 1998), для лечения различных форм печеночной недостаточности применяется экстракорпоральное подключение к протоку органа ксеногенных гепатоцитов и спленоцитов (Demetriou et.al. 1995, Н.А.Онищенко и др. 1995, В.И.Шумаков и др. 1998), терапия аллогенными фетальными клетками используется для лечения ожогов (Д.С.Саркисов, 1995), миодистрофии Дюшена (В.С.Репин, Г.Т.Сухих 1998) и др.

Между тем, острый дефицит фетального аллогенного материала, обладающего высокой биологической активностью, и существование биоэтических проблем его использования (Ю.М.Лопухин, 2002), призыв к ограничению использования ксеногенных источников из-за их более высокой антигенности, опасности заражения прионами и другими инфекциями, а также необходимость стандартизации используемых клеток и приготовления из них клеточных препаратов, обусловили в последние пять лет пробуждение повышенного интереса исследователей всего мира к проблемам стволовых клеток и, в частности, к проблемам использования аутологичных стволовых клеток костного мозга в медицине из-за безопасности их применения и отсутствия необходимости решения при этом этико-правовых проблем (Perin et.al. 2003; Assmus et. al.2002; Hess et.al. 2002; Iversen et.al. 2000; Strauer, Kornowski 2003).

Приступив в 2000 году к изучению возможности применения стволовых клеток костного мозга в восстановительной медицине, мы убедились в том, что биологические возможности клеточной терапии стволовыми клетками остаются мало изученными и поэтому нереализованными, особенно в России, так как исследования в области клеточных биотехнологий в нашей стране тогда находились на самом начальном этапе своего развития. В частности, в литературе отсутствовали четкие представления о механизмах и путях реализации терапевтических эффектов клеточных технологий, не были отработаны методы предифференцировки мезенхимальных стромальных (прогениторных) клеток (МСК) в различные типы клеток (в частности в кардиомиоцетоподобные клетки) и не использовались широко тканеспецифические маркеры предифференцировки для контроля оптимизации сроков диффренцировки МСК перед трансплантацией, не была отработана техника идентификации предифференцированных прогениторных клеток в соответствующих тканях после трансплантации, а также не проводилась количественная оценка воздействия аутологичных прогениторных клеток стромального и гемопоэтического ряда на восстановление структуры и функции соответствующих пораженных органов. Отсутствие таких данных позволило нам сформулировать следующие цели и задачи настоящего исследования.

Цель работы:

Оптимизировать технологические режимы культивирования прогениторных клеток костного мозга и предифференцировки МСК в кардиомиоцито-, остеобласте- и фибробласто-подобные клетки, а также изучить влияние этих клеток на восстановление структуры и функции соответствующих пораженных органов.

Задачи работы.

1. Отработать методику раздельного выделения из костного мозга гемопоэтических и МСК и изучить влияние процесса культивирования на функциональную активность этих клеток.

2. Отработать режимы культивирования и предифференцировки МСК костного мозга в кардиомиоцитоподобные, остеобластоподобные и фибробластоподобные клетки in vitro и подтвердить состоявшуюся кардиогенную и остеогенную предифференцировку клеток.

3. Отработать методику маркирования клеток для выявления их в соответствующих мягких тканях после трансплантации.

4. Количественно оценить регенерацию поврежденных органов (сердце) и тканей (кожа, сосуды) при трансплантации в поврежденные зоны прекультивированных аутологичных прогениторных клеток костного мозга стромального и гемопоэтического ряда и сравнить эффективность лечения с результатами трансплантации аллогенных фетальных клеток в модельных опытах на животных с криодеструкцией миокарда, с глубоким ожогом кожи и с дислипидогенным гепатозом и микроангиопатией.

5. Разработать технологию восстановления целостности длинных трубчатых костей с помощью иммобилизованных аутологичных клеток костного мозга в модельных опытах с резекцией кости.

Выполнение работы осуществлялось в рамках программы «Клеточные технологии медицине» по заданию Росздрава России (регистрационные №№ 01.2.00 305441 и 01.2.00 305442).

Научная новизна.

Установлено, что в процессе культивирования гемопоэтических и МСК костного мозга активизируются функциональные потенции этих клеток, в результате чего процедуру культивирования аутологичных клеток костного мозга следует рассматривать как необходимый этап для осуществления успешной клеточной терапии. При культивировании гемопоэтической фракции клеток костного мозга это выражается изменением фенотипического состава клеток и продукции цитокинов, для фракции стромальных клеток - их дифференцировкой и продукцией цитокинов (IL-10, G-CSF и TGFp).

В опытах in vitro отработана технология направленной дифференцировки МСК в остеобластоподобные, кардиомиоцитоподобные и колониеобразующие фибробластоподобные клетки путём создания адекватного состава культуральной среды. При дифференцировке МСК в кардиомиоцитоподобные клетки к концу 3-й недели в культуре появляются клетки (1-2%), напоминающие миотрубочки, которые обладают способностью спонтанно и ритмично сокращаться. К 4-ой неделе культивирования количество кардиомиоцитоподобных клеток достигает своего максимума - 35-40% от общего количества клеток в культуре.

Проведена идентификация кардиомиоцитоподобных клеток по окраске на тропонин I, фибробластоподобных клеток - на коллаген I типа, виментин и CD133, а остеобластоподобных клеток - на коллаген I типа, на щелочную фосфатазу и остеопонтин. Глубокая дифференцировка клеток в культуре тормозит процесс пролиферации и понижает их жизнеспособность, делая их непригодными для трансплантации.

На моделях острого повреждения тканей у животных: кожи, сердца и трубчатых костей, а также при моделировании дислипидемии с хроническим повреждением стенки сосудов, установлены позитивные терапевтические эффекты применения прогениторных клеток костного мозга после культивирования. Показано, что трансплантация фибробластоподобных мезенхимальных стволовых клеток ауто- и аллогенного костного мозга на ожоговую поверхность кожи ускоряет процесс заживления кожных ран более интенсивно, чем трансплантация фетальных фибробластов.

Было установлено, что, кардиомиоцитоподобные клетки аутологичного костного мозга, повышают систолическую функцию левого желудочка как при воздействии на него нагрузки объемом, так и при воздействии нагрузки сопротивлением.

Показано, что дополнительная иммобилизация МСК из аутологичного костного мозга на аллогенном деминерализованном костном имплантате ускоряет процесс остеогенеза и сокращает сроки репаративной регенерации длинных трубчатых костей.

Показано, что для коррекции дислипидемии и ранних проявлений атерогенеза могут использоваться как клетки аллогенной фетальной печени, так и прогениторные клетки аутологичного костного мозга; однако эффект последних более пролонгирован по коррекции показателей микроангиопатий.

Практическая значимость работы.

Отработаны технологические режимы предифференцировки мезенхимальных (стромальных) прогениторных клеток костного мозга в колониеобразующие фибробластоподобные, кардиомиоцитоподобные и остеобластоподобные клетки. Предложено для трансплантации предифференцированных клеток использовать относительно короткие сроки предифференцировки (не более 2-х - 3-х недель для кардиомиоцито- и остеобластоподобных клеток), учитывая, что образование 75% монослоя совпадает с осуществлением начальных стадий дифференцировки в заданном направлении.

С помощью рекомбинантного аденовирусного вектора, содержащего LacZ-ген E.coli, внедренного в фетальные специализированные клетки (кардиомиоциты, фибробласты) и МСК костного мозга на этапе их культивирования, доказано присутствие и функционирование этих клеток в течение, по-крайней мере, 3-4 недель после трансплантации в зону повреждения.

Показана перспективность применения стволовых клеток аутологичного костного мозга для ускоренного и более эффективного восстановительного лечения поврежденных органов: при ожоговых ранах, при деструктивных процессах в миокарде, при дислипидемическом повреждении сосудов, печени и при нарушениях целостности трубчатых костей. Разработанный метод восстановления целостности трубчатых костей с помощью костных имплантатов, содержащих иммобилизованные аутологичные стволовые клетки костного мозга, внедрен в клиническую практику. На способ восстановления целостности трубчатых костей, предусматривающий дополнительную фиксацию дистальной и проксимальной зоны костного дефекта губчатым матриксом с адгезированными на нем аутологичными клетками костного мозга, получен патент РФ № 2240135 от 20 ноября 2004г «Культура клеток, содержащая клетки-предшественники остеогенеза, имплантат на ее основе и его использование для восстановления целостности кости».

Апробация диссертации.

Основные положения диссертации доложены:

На II Всероссийском съезде по трансплантологии и искусственным органам, Москва, октябрь, 2002.

На I Всероссийской конференции «Стволовые клетки и перспективы их использования в Здравоохранении», Москва, 22 мая, 2003.

На ХШ Международной конференции по проблеме "Перфторуглеродные соединения в медицине и биологии", 17-18 июня 2003, Пущино.

На 2-й Международной конференции "Патофизиология и современная медицина", Москва, 22-24 апреля 2004.

На Ш Российском конгрессе по патофизиологии, Москва, 9-12 ноября 2004.

На Ш Всероссийском съезде по трансплантологии и искуственным органам. Москва, 28-30 октября 2005 г.

На 12-ом Всемирном конгрессе по заболеваниям сердца (World Congress on Heart Disease «New Trends in Research Diagnosis and Treatment», to be held at the Hyatt Regency Vancouver, in Vancouver, B.C., Canada, July 16-19,2005.

Апробация работы состоялась на межлабораторной конференции ФГУ НИИ трансплантологии и искусственных органов 3 ноября 2005 г.

По теме диссертации опубликовано 21 работа, из них 16 в центральной печати, 4 в зарубежной печати и 1 патент РФ.

 
 

Заключение диссертационного исследования на тему "Использование мезенхимальных стволовых и прогениторных клеток костного мозга для разработки новых биотехнологий в трансплантологии"

Выводы.

1. Отработана методика раздельного выделения и культивирования гемопоэтических и мезенхимальных (стромальных) стволовых и прогениторных клеток костного мозга, что подтверждено фенотипическими и иммуногистохимическими исследованиями.

2. Отработаны режимы предифференцировки МСК костного мозга в кардиомиоцитоподобные, фибробластоподобные и остеобластоподобные клетки, что подтверждено иммуногистохимическими методами.

3. Маркирование клеток с помощью рекомбинантного вируса, несущего ген E.coli Lac-Z [Ad-SV40- pGal], позволяет выявлять жизнеспособные клетки после трансплантации их в мягкие ткани до 1,5 месяцев.

4. Трансплантация аутологических ПМСК костного мозга, предифференцированных в кардиомиоцитоподобные клетки, более эффективно стимулирует процессы восстановительной регенерации миокарда после криодеструкции, чем трансплантация фетальных аллогенных кардиомиоцитов.

5. Трансплантация ауто- и аллогенных фибробластоподобных МСК обеспечивает более быстрое и эффективное заживление глубоких ожоговых ран после термодеструкции, чем фетальные фибробласты. Предифференцированные МСК, также как и фетальные фибробласты способствуют заживлению ран путем ускорения разрастания сосудистой сети и формирования грануляционной ткани.

6. Применение аллогенных деминерализованных костных имплантатов с иммобилизованными на них аутологичными остеобластоподобными клетками, предифференцированными из МСК костного мозга, достоверно ускоряет процесс восстановительной регенерации костной ткани после резекции трубчатых костей.

7. Трансплантация аутологических прекультивированных клеток костного мозга обеспечивает коррекцию ранних проявлений атеросклероза и ослабление морфологических признаков микроангиопатий и жировой дистрофии печени при моделировании хронической алиментарной дислипидемии более эффективно и более длительно, чем при трансплантации клеток фетальной печени.

Практические рекомендации.

1. Для проведение клеточной терапии аутологичными прогениторными клетками костного мозга целесообразно использовать предварительное культивирование (составу культуральных сред, сроки культивирования, очистка клеток и д.р.).

2. Для трансплантации предифференцированных мезенхимальных (стромальных) прогениторных клеток (кардиомиоцито- и остеобластоподобных) следует использовать короткие сроки дифференцировки (не более 3-4 недель), когда образуется 75% монослой и начинает осуществляться дифференцировка клеток в заданном направлении.

3. Регенераторные свойства стволовых и прогениторных клеток аутологичного костного мозга могут успешно применяться при различных острых патологиях (резекция кости, ожоговые раны, острый инфаркт миокарда). При хронических патологиях применение клеточной терапии следует рекомендовать после предварительного выявления в используемых клетках регенераторных (функциональных) резервов. При отсутствии достаточного резерва - клеточная терапия может оказаться малоэффективной.

4. Для оптимизации условий трансплантации остеобластоподобных и фибробластоподобных клеток следует использовать не клеточные суспензии, а биоконструкции, состояние из биодеградируемых материалов (типа ЭластоПОБ) или матриксов с иммобилизованными на них предифференцированными мезенхимальными (стромальными) прогениторными клетоками.

 
 

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2006 года, Крашенинников, Михаил Евгеньевич

1. Бабаева А.Г. «Единство и противоположность цитогенетической активности лимфоцитов и их антителообразующей функции при восстановительных процессах в органах». БЭБиМ. 1999, №11, с. 484-490.

2. Бабаева А.Г., Курило Л.Ф., Зотиков Е.А., и др. «Изменение антигенных свойств эритроцитов и численности хромосом метафазных пластинок клеток костного мозга при аллотрансплантации костного мозга в клинике и эксперименте». БЭБиМ. 2003. №1, с. 86-89.

3. Берсенев А.В., Крашенинников М.Е., Онищенко Н.А. «Клеточная терапия дислипидемий и атеросклероза». Вестник трансплантологии и иск. Органов. 2001. №2, 47-53.

4. Вермель А.Е. «Стволовые клетки: общая характеристика и перспективы применения в клинической практике». Клиническая медицина. 2004. №1, с.5-11.

5. Викторов И.В., Сухих Г.Т. «Медико-биологические аспекты: применения стволовых клеток». Вестник РАМН. 2002. №4, с.24-30.

6. Владимирская Е.Б., Румянцев А.Г. «Дифференцировочные потенции стволовых гемопоэтических клеток». Вопросы гематологии, онкологии и иммунопатологии в педиатрии. 2002, N1, с 7-11.

7. Волков М.В., Гудушаури О.Н., Ушакова О.А. «Ошибки и осложнения при лечении переломов костей». М. Медицина, 1970.

8. Волова Т.Г., Севастьянов В.И., Шишацкая Е.И. «Полиоксиалконоаты (ПОА) -биодеградируемые полимеры для медицины». Новосибирск, изд. СОР АН, 2003, с. 330.

9. Зотиков Е.А. «Возможен ли обмен генами между клетками донора и реципиента при аллогенной трансплантации костного мозга HLA-идентичных сибсов». Клиническая Лабораторная Диагностика. 2000. №3, с.46-47.

10. Зотиков Е.А., Бабаева А.Г., Порешина Л.П. «Клеточный хнмеризм и химернзм клетки при трансплантации костного мозга». Москва. Изд. Хризостом, 2003, с. ПО.

11. Кветной И.М., Южаков В.В., Хавинсон В.Х. «Пептидергическая регуляция гомеостаза». Изд. «Наука», Санкт-Петербург, 2003, с. 195.

12. Клименко Е.А. «Гиперлипопротеидогенная микроангнопатия в генезе органной патологии и патогенетические подходы к ее коррекции». Автореф. Дне. Докт. Мед. Наук, Москва. 1994.

13. Козуб К.Н. «Лечение ложных суставов костей голени методом чрезкостного комплексно-дистракционного остеосшггеза» в кн. «Восстановительные операции на опорно-двигательной системе.» Кишинев, Штиинца, 1989, с. 34-37.

14. Колокольчикова Е.Г., Будкевич Л.И., Боровников А.Э. и др. «Морфологические изменения ожоговых ран после пересадки аллогенных фибробластов» Бюлл. Экспер. Биол. мед. 2001, т 131, №1, с.107-111.

15. Малайцев В.В., Богданова И.М., Сухих Г.Т. «Современные представления о биологии стволовой клетки». Архив патологии. 2002. №4, с.7-11.

16. Нагорнев В.А., Назаров П.Г., Полевщиков А.В., и др. «Атерогенез и реакция "острой фазы" печени». Арх. Патол. 1998, 6, с. 67-74.

17. Онищенко Н.А., Базиева Ф.Х., Иванова-Смоленская И.А., и др. «Экстракорпоральное подключение систем биоискусственной поддержки печени в комплесном лечении гематоцеребральной дистрофии». Вестник трансплантологии и иск. Органов. 1999. №1, с. 54-59.

18. Оноприенко Г.А. «Васкуляризация костей при переломах и дефектах». М., «Медицина», 1995, с. 224.

19. Отеллин В.А. «Морфологические обоснования применения метода нейротрансплантации в клинике». Обзор. Вопросы нейрохирургии. 1999, №4, с.32-37.

20. Полтавцева Р.А., Ржанинова Р.А., Ревищин А.В., и др. «Развитие in vitro нейральных прогениторных клеток мозга эмбрионов человека». БЭБиМ. 2001, том 132, №9, с. 290-293.

21. Потапов И.В., Крашенинников М.Е., Онищенко Н.А. «Клеточная кардиомиопластика». Вестник трансплантологии и иск. Органов. 2001. №2, с. 54-62.

22. Расулов М.Ф, Хаджибаев А.М, Уразметова М.Д «Применение аллогенных фибробластов при поверхностных термических повреждениях кожи.» Мед. журнал Узбекистана 2001 №5-6, с. 87-88.

23. Расулов М.Ф. «Использование мезенхимальных стволовых клеток костного мозга и эмбриональных фибробластов в лечении ожоговых ран». Тихоокеанский мед. журнал. 2004, №1,(15), с. 7-9.

24. Ревищин А.В., Полтавцева Р. А., Марей М.В., и др. «Структура клеточных кластеров, формирующихся в культурах диссоциированного эмбрионального мозга человека». БЭБиМ. 2001. Том 132, №9, с. 285-289.

25. Репин B.C., Ржанинова А.А., Шеменков Д.А. «Эмбриональные стволовые клетки: Фундаментальная биология и медицина», изд. РеМеТекс, Москва, 2002, с. 220.

26. Репин B.C., Сухих Г.Т. «Медицинская клеточная биология», изд. БЭБиМ. 1998. с. 200.

27. Румянцев А.Г., Масчан А.А., «Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток у детей». Изд. Медицинское информ. Агентство, Москва, 2003, с. 910.

28. Савченко В.Г. «Трансплантация костного мозга при острых лейкозах: аргументы за и против». Тер. Архив. 1993, N7, с. 7-18.

29. Саидгалин Г.З, Салистый П.В, Панова О.В и др. «Аллофиблобласты в лечении глубоких ожогов у детей» в сб. «Комбустология на рубеже веков» Мат. конгресса Москва 2000, с. 166.

30. Саркисов Д.С, Алексеев А.А, Глущенко Е.В и др. «Теоретические и практические аспекты использования культивированных фриблобластов при восстановлении целостности кожных покровов». Вестник РАМН 1996, №6, с. 6-11.

31. Севастьянов В.И., Егорова В.А., Немец Е.А., Перова Н.В., Онищенко Н.А. «Биодеградируемый биополимерный материал ЭластоПОБ™ для клеточной трансплантации». Перспективные материалы, 2004, №3, 35-41.

32. Сухих Г.Т., Малайцев В.В., Богданова И.М., Дубровина И.В. «Мезенхимальные стволовые клетки». Бюлл. Экспер. Б иол и мед. 2002, 133, 2, 124130.

33. Титов В.Н. «Общность атеросклероза и воспаления: специфичность атеросклероза как воспалительного процесса». Рос. Кард иол. Ж. 1999, 5, с. 48-56.

34. Титов В.Н., Осипов С.Г. «Атеросклероз. Роль эндогенного воспаления, белков острой фазы и жирных кислот». Москва, Изд. Фонд "Клиника XXI века"., 2004, с. 279.

35. Туманов В.П., Глушенко Е.В., Морозов С.С., Саркисов Д.С. «Использование культивированных фибробластов при лечении ожоговых ран». Бюл. экспер. биол.-1990, №4, с. 400-402.

36. Угрюмов М.В. «Экспериментальная и клиническая нейротрансплантация современное состояние и перспективы». Наука Долголетия 2001, №1, с. 9-17.

37. Чайлахян Р.К патент №2167662 от 27.07.2000.

38. Шабалин В.Н., Серова Л.Д., Шляпочникова Г.П. «Клеточная гибридизация в этиологии и патогенезе лейкозов». Гематол. и транфузиол. 1987, №8, с. 3-6.

39. Шумаков В.И., Блюмкин В.Н., Скалецкий Н.Н. «Трансплантация островковых клеток поджелудочной железы». М. Канон. 1995, с. 382.

40. Шумаков В.И., Онищенко Н.А., Крашенинников М.Е., и др. «Костный мозг как источник получения мезенхимальных клеток для восстановления терапии поврежденных органов». Вестник трансплантации и иск. органов 2002, 4, с. 3-6.

41. Шумаков В.И., Скалецкий Н.Н. «Регуляция углеводного обмена и коррекция его нарушений при сахарном диабете», в кн. «Очерки по физиологическим проблемам трансплантологии и применения иск. органов», изд. Репроникс, Тула, 1998, с. 93-118.

42. Ailhaud G. "Extracellular factors, signalling pathways and differentiation of adipose precursor cells." Curr. Opin. Cell Biol. 1990, 2: 1043-1049.

43. Akashi K., Traver D., Kondo M., Weissman I.L. "Lymphoid development from hematopoietic stem cells." Int. J. Hematol, 1999, 69, 217-226.

44. Akashi K., Traver D., Miyamoto Т., Weissman I.L. "A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages." Nature, 2000,404, 193-197.

45. Alison M.R., Poulsom R., Jeffery R., Dhillon A.P., Quaglia A., Jacob J., Novelli M., Prentice G., Williamsony and Wright N.A. "Hepatocytes from non-hepatic adult stem cells." Nature, 2000, 406, 257.

46. Alison, M R, Sarraf C. "Hepatic stem cells." J.Hepatol. 1998, 29, 678-683

47. Alvarez-Dolado М., Pardal R., Garcia-Verdugo J., et.al. "Fusion of bone-marrow-derived cells with Purkinje neurons, cardiomyocytes and hepatocytes." Nature 2003, 425, 968-972.

48. Anderson D.F., Gage F.H. and Weissman I.J. "Can stem cells cross lineage boundaries?" Nat. Med. 2001, 7,393-395.

49. Andrews P.W., Przyborski S., Thomson J.A. "Embryonal carcinoma cells as ESC, In: stem cell Biology, (ed, Marshak D.R., Gardner R.L., Gottlieb D.), CSH Lab. Press, 2001, 231-266.

50. Asahara Т., Murohara Т., Sullivan A. et.al. "Isolation of putative progenitor endothelial cells from angiogenesis." Science, 1997, 275, 964-967.

51. Assmus В., Schachinger V., Teupe C., et.al. "Transplantation of Progenitor cells and Regeneration Enhancement in Acute Myocardial Infarction." Circulation 2002, 206,3009-3017.

52. Awad H.A., Butler D.L., Boivin G.P., Smith F.N., Malaviya P., Huibregtse В., Caplan A.I. "Autologous mesenchymal stem cell-mediated repair of tendon." Tissue Eng. 1999, 5: 267-277.

53. Badorf C., Brandes R., Popp R., et.al. "Transdifferentiation of blood derived Human Adult Endothelial Progenitor Cells into functionally active Cardiomyocytes." Circulation, 2003,107, 1024-1032.

54. Badorff C., Brandes R., Popp R., et.al. "Transdifferentiation of blood derived Human Adult endothelial Progenitor cells into functionally active Cardiomyocytes." Circulation 2003,107,1024-1032.

55. Bae SC, Lee KS, Zhang YW, Ito Y. " Intimate relationship between TGF-beta/BMP signaling and runt domain transcription factor, PEBP2/CBF." J Bone Joint Surg Am 2001;83-A Suppl l(Pt l):S48-55

56. Balian et.al. United States Patent №6,082,364 от July 4, 2000;

57. Balsam J., Wagers A., Christensen J. et.al. "Haematopoietic stem cells adopt mature haematopoietic fates in ischemic myocardium." Nature 2004, 428, 668-673.

58. Becker A., Mc Culloch E., Till J.E. "Cytological demonstration of the clonal nature of spleen colonies derived from transplanted mouse marrow cells." Nature 1963, 197, 452-454.

59. Bernard-Beanbois K., Hecquet C., Houcine O., Hayem G., Adolphe M. "culture and characterization of juvenile rabbit tenocytes." Cell Biol. Toxicol. 1997, 13: 103-113.

60. Bjornson С., Rietze R., Reynolds В., Magli M. & Vescvi A. "Turning brain into blood: a hematopoietic fate adopted by adult neural stem cells in vivo." Science 1999, 283, 354-357.

61. Blau H.M., Brazelton T.R., Weimann J.M. "The Evolving Concept of a Stem cells: Entity or Function?" Cell. 2001, 105, 829-841.

62. Bonner-Weir S. "In vitro cultivation of human islets from expanded ductal tissue." Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000, 97, 7999-8004.

63. Boyan B.D., Caplan A.I., Heckman J.D., Lennon D.P., Ehler W., Schwartz Z. "Osteochondral progenitor cells in acute and chronic canine nonunions." J. Orthop. Res. 1999, 17: 246-255.

64. Boyle R.J., Savulecku J. "Ethics of using preimpantation genetic diagnosis to select a stem cell donor for an existing person." BMI., 2001, 323, 1240-1243.

65. Brazelton T.R., Rossi F.M., Keshet G.I. and Blau H.M. "From marrow to brain: expression of neuronal phenotypes in adult mice." Science. 2000, 290. 1775-1779.

66. Broxmeyer H., Douglas G.W., Hangoc G et.al. "Human umbilical cord blood as a potential source of transplantable hematopoietic stem and progenitor cells." Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 3828-3832.

67. Bruant B.J. "Reutilization leukocyte DNA by cells of regenerating liver." Exp. Cell. Res. 1962, 27, 70-79.

68. Bruder S.P., Jaiswal N., Haynesworth S.E. "Growth kinetics, self-renewal and the osteogenic potential of purified human mesenchymal stem cells during extensive subcultivation and following cryopreservation." J. Cell Biochem. 1997, 64, 278-294.

69. Brustle O., Jones K., Lereash R et.al. "Embryonic stem cell derived glial precursors: a source of myelinating transplants." Science, 1999, 285, 754-756.

70. Buckwalter J., Clirncher M., Cooper R. et.al. "Bone biology (part II, formation, form, modelling, remodelling, and regulation of cell function). J. Bone Jt.Surgery 1995, v77-A, № 8, p 1276-1289.

71. Cairo M.S., Wagner J.E. "Placental and/or umbilical cord blood: an alternative source of hematopoietic stem sells for transplantation." Blood 1997, 90: 4665-4678.

72. Caplan A. I. Mesenchymal stem cells. J Orthop Res 1991; 9: 641-650

73. Caplon A.I. "The mesengenic process." Clin. Plast. Surg. 21: 429-435, 1994.

74. Catalin Toma, MD; Mark F. Pittenger, PhD; Kevin S. Cahill, BS.et. al. " Human Mesenchymal Stem Cells Differentiate to a Cardiomyocyte Phenotype in the Adult Murine Heart." Circulation, 2002, Jan l;105(l):93-98.

75. Cheng L, Qasba P, Vanguri P et.al. "Human mesenchymal stem cells support megakaryocyte and pro-platelet formation from CD34+ hematopoietic progenitor cells." J Cell Physiol 2000,184:58-69.

76. Chichester C.O. Fernandez M., Minguell J.J. "Extracellular matriz gene expression by human bone marrow stroma and marrow fibroblast." Cell Adhes. Commun. 1993, 1:93-99.

77. Cibelli J., Stice S.I., RobI J.M. et.al. "Transgenic bovine chimeric off springs produced from somatic cell derived stem-like cells." Nature Biotechnol. 1998, 16, 642646.

78. Clarke D.F., Johansson C.B., Wilbertz J., Veress В., Nilsson E., Karestom H., Fendahi U. and Frisen J. (2000). Generalised potential of adult neural stem cells. Science. 288, 1660-1663.

79. Colter, D. C., Class, R., Digirolamo, С. M., Prockop, D. J. "Rapid expansion of recycling stem cells in cultures of plastic-adherent cells from human bone marrow." Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 2000, 97:3213-3218

80. Conget P.A., Minguell J.J. "Phenotypical and functional properties of human bone marrow mesenchymal progenitor cells." J. Cell Physiol. 1999, 181:67-73,.

81. Dabeva M,. Hwang S.G. Rao G. Vasa et.al. "Differentiation of pancreatic epithelial progenitor cells into hepatocytes following transplantation into rat liver." Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94, 7356- 7361.

82. Dani C., Smith A.G., Dessolin S et.al. "Differentiation of ESC into adipocytes in vitro." J. Cell. Sci., 1997, 110, 1279-1285.

83. Demetriou A.A., Rozga J, Podesta L. et.al. "Early clinical experience with a hybrid bioartificial liver". Scand J. Gastroenterol. 1995, 30, suppl. 208., 111-117.

84. Dennis J.E., Merriam A., Awadallah A et.al. "A quadripotential mesenchymal progenitor cell isolated from the marrow of an adult mouse." J. Bone Miner Res. 1999, 14, 700-709.

85. Doevendans P. A., Kubalak S.W., An R.H. et.al. "Differentiating cardiomyocytes in floating embryoid bodies is comparable to fetal cardiomyocytes." J. Moll. Cell. Cardiol., 2000, 32, 839-851.

86. Eglitis M.A., Mezey E. "Hematopoietic cells differentiate into both microglia and macroglia in the brains of adult mice". Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94, 8: 40804085.

87. Ferrari G, Cusella-De Angeles G., Coletta M., Paolucci E., Stornainolo A., Cossu G., Mavilio F. "Muscle regeneration by bone marrow-derived myogenic progenitors." Science. 1998, 279: 1528-1530.

88. Fibbe W.E. "Mesenchymal stem cells. A potential source for skeletal repair." Ann Reum Dis 2002, 61: II 29-31.

89. Frankel M.S. "In search of stem cell policy." Science 2000,298, 1397.

90. Freedman S.B., Isner J.M. "Therapeutic angiogenesis for coronary artery disease." Ann. Int. Med., 2002, 136, 54-71.

91. Friedenstein A.I., Chailakhjan R.K., Lalykina K.S. "The development of fibroblast colonies in monolayer cultures of guinea-pig bone-marrow and spleen cells." Cell Tissue Kinet., 1970, 3, 393-403.

92. Friedenstein A.I., Piatetzky-Shapiro 1.1., Petrakova K.V. "Osteogenesis in transplants of bone marrow cells." J. Embryol. Exp. Morphol. 1966, 16, 381-390.

93. Friedenstein A.J. "Osteogenic stem cells in the bone marrow. " Bone Min Res 1990, 7:243-272

94. Friedenstein A.J., Gorskaja J.E., Kulagina N.N. "Fibroblast precursors in normal and irradiated mouse hematopoietic organs "Exp. Hematol. 1976, 4: 207-274.

95. Frondoza, Carmelita G. et.al. United States Patent №20010051834 от December 2001, 13.

96. Gage F. "Mammalian CNS" Science, 2000, 287, 1433-1438.

97. Gage F.H., Ray J., and Fisher J.F. "Isolation, characterization and use of stem cells from the CHS." Annu. Rev. Neurosci. 1995, 18, 159-192.

98. Galli R, Borello U, Gritti A et.al. "Skeletal myogenic potential of human and mouse neural stem cell". Nat. Neurosci, 2000, 3,10: 986-991.

99. Galmiche M.C, Koteliansky V.E, Briere J. et.al. "Stromal cells from human long-term marrow cultures are mesenchymal cells that differentiate following a vascular smooth muscle differentiation pathway." Blood 1993, 82:66-76.

100. Geiger H., Sick S., Bonifers C. et.al. "Globin gene expression is reprogrammed in chimeras generated by injecting adult haemopoietic stem cells into mouse blastocytes." Cell, 1998, 93, 1055-1065.

101. Germain J., Noce M., Gourdeau H., and Marcean N. "Promotion of growth and differentiation of rat ductalar oval cells in primary culture." Cancer Res., 1988, 48, 368378.

102. Gluckman E., Broxmeyer H., Auerbach A.D et.al. "Hematopoietic reconstitution in a recipient with Fanconi anemia by means of umbilical cord blood from HLA identical sibling" N. Engl. J. Med. 1989, 321, 174-1189.

103. Gluckman E., Rocha V., Boyer-Chammard A et.al. "Outcome of cord-blood transplantation from related and unrelated donors." N. Engl. J. Med. 1997, 337, 373-381.

104. Gmyr V., Kerr-Conte J., Belaich S. Et.al. "Adult Human Cytokeratin 19-positive cells re-ekspress insulin promoter Factor-1 in vitro." Diabetes 2000, 49, 16711680.

105. Goodwin H., Bicknese A., Chien S et.al. "Multilineage differentiation activity by cells isolated from umbilical cord blood: expression of bone, fat, and neural markers." Biol. Blood Marrow Transplant. 2001, 7(11), 581-588.

106. Goshima J., Goldbery V.M., Caplan A.I. "The origin of bone formed in composite grafts of porous calcium phosphate ceramic loaded with marrow cells." Clin. Orthop. 1991, 269: 274-283.

107. Goto H.,Shuler FD.,Lamsam C. et.al. Transfer of lacZ marker gene to the meniscus.//J.Bone Joint Surg.Am. 1999, V.81. P.918-925.

108. Graf T. "Differentiation plasticity of hematopoietic cells." Blood 2002, 99, 3089-3101

109. Gronthos S, Simmons PJ. "The growth factor requirements of STRO-1-positive human bone marrow stromal precursors under serum-deprived conditions in vitro." Blood 1995, 85:929-940.

110. Guenechea G., Gan O.I., Dorrel C., Dick J.E. "Distinct classes of human stem cells that differ in proliferative and self-renewal potential." Nat. immunol. 2001, 2, 75-82.

111. Gussoni E., Soneoka Y., Strickland C., et.al. "Dystrophin expression in the mdx mouse restored by stem cells transplantation." Nature, 1999,401, 390-394.

112. Haynesworth S.E., Baber M.A., Caplan A.I. "Cytockin expression by hyman marrow-derived mesenchymal progenitor cells in vitro: Effects of dexamethasone and IL-1 alpha." J. Cell Physiol. 1996, 166: 585-592.

113. Haynesworth SE. Baber MA. Caplan A1 "Cell surface antigens on human marrow-denved mesenchymal stem cells are detected by monoclonal antibodies". Bone 1992, 1369.

114. Hill J.M., Zalos G., Halcox J.P et.al. "Circulating endothelial progenitor cells, vascular functions and cardiovascular risk". New. Engl. J.of Medicine., 2003, v 348, p 593-600.

115. Holtmaat AJ.,Hermens WT., Oestreicher AB et.al. "Efficient adenoviral vector-directed expression of a foreign gene to neurons and sustentacular cells in the mouse olfactory neuroepithelium. " Btain Res. Mol. Brain Res. 1996, V.2. P.248.

116. Holtzer H. "Cell lineages, stem cells and the "quantal" cell cycle consent, in Stem cells and tissue homeostasis." Eds. В. I. Lord., C. S. Potten, R. J. Cole (Cambridge, New York, Cambridge University Press), 1978, 1-28.

117. Hunt P., Robertson D., Weiss D et.al. "A single bone-marrow-derived stromal cell type supports the in vitro growth of early lymphoid and myeloid cells." Cell, 1987, 48, 997-1007.

118. Jackson K., Majka S, Wang H., et.al. "Regeneration ischemic cardiac muscle and vascular endothelium by adult a stem cells." J. Clin. Invest, 2001, 107, 1395-1402.

119. Jaiswal R.K., Jaiswal N, Bruder S.P. et.al. "Adult human mesenchymal stem cell differentiation to the osteogenic or adipogenic lineage is regulated by mitogen-activated protein-kinase." J. Biol. Chem. 2000, 275, 13, p 9645-9652.

120. Jiang Y, Jahagirdar BN, Reinhardt RL et al. "Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. " Nature 2002, 418, 41-49.

121. Johanson C.B., Momma S., Clarke D. F., Risling M., Fendahi U., and Frisen J. "Identification of a neural stem cells in the adult mammalian central nervous system." Cell. 1999, 96, 25-34.

122. Juan G., Darzynkilwier Z. "Cell cycle analysis by flow and laser dcanning cytometry." Cell Biol. 1998, 1: 161-274.

123. Juskin M. B. "Restricted proliferation and migration of postnataly generated neurons derived from the forebrain subventrcular zone." Neuron. 1993, 11, 173-189.

124. Kadiyala S., Young R.G., Thiede M.A., Bruder S.P. "Culture expanded canine masenchymal stem cells possess osteochondrogenic potential in vivo and in vitro." Cell Transplant. 1997, 6: 125-134.

125. Kataoka H, Urist M.R. "Transplant of bone marrow and muscle-derived connective tissue cultures in diffusion chambers for biossay of bone marrow orphogenetic ptotein." Clin. Orthop. 1993, 286: 262-270.

126. Kato V., Tani Т., Sotomaru V. et.al. "8 calves cloned from somatic cells of single adult." Science, 1999,288,2095-2098.

127. Kawazaki H., Suemori H., Mizuseku K. et.al. "Generation of DOPA neurons and pigmented epithelia from primate ESC by stromal cell-derived in ducking activating." Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2002, 99 1580-1585.

128. Kehat I., Kenyadin Karsenti D., Snirm et.al. "Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes." J. Clin. Invest., 2001, 108, 407-414.

129. Keller G. "The hemangioblast." Cold Spring Harbon, New York: Cold Spring Harbon Laboratory Press, 2001, p 329-348.

130. Kirshenbaum LA, MacLennanWR,Mazur VV. et.al. "Highly efficient gene transfer into adult ventricular myocytes by recombinant adenovirus." J.Clin.invest. 1993, V.92(l). P.381-387.

131. Kishimoto Т., Kikutani G. "Leukocyte Typing VI white cell differentiation antigens." Garland Publishing Inc. NY. London. 1997.

132. Klein, G, "The extracellular matrix of the hematopoietic microenvironment." Experientia 1995, 51:914-926.

133. Koper G.C., Procop D.J., Phinney.D.G. "Marrow stromal cells migrate throughout forebrain and cerebellum, and they differentiate into astrocytes after injection into neonatal mouse brains." Proc. Nate. Acad. Sci. U.S.A. 1999, 96: 10711-10716.

134. Korbling M, Katz R.L., Khanna A et.al. "Hepatocytes and epithelial cells of donor origin in recipients of peripherial-blood stem cells". N. Engl. J. Med. 2002, 346, 10: 738-746.

135. Kramer J., Hegert C., Guan K. et.al. "ESC derived chondrogenic differentiation in vitro the roll of BMP 2 and BMP 4." Mech. Dev., 2000, 92, 193-205.

136. Krause D.S., Theise N.D., Collector M.J. Henegariu O., Hwang S., Gardner R., Neutzel S., and Shrkis S.J., "Multi-Organ, multi-Lineage engraftment by a single bone marrow-derived stem cells." Cell. 2001, 105, 369-377.

137. Kuznetsov S.A., Friedenstein A.I., Robey P.G. "Factors reguired for bone marrow fibroblast colony formation in vitro." Br. J. Haematolo. 1997,97: 561-570.

138. Kuznetsov S.A., Mankani M.N., Gronthos S. et.al. "Circulating skeletal stem cells." J. Cell Biology 2001, v 153, 5, p 1133-1140.

139. Lafferty K.J. "Islet cell transplantation as a therapy for type 1 diabetes mellitus". Diabetes Nutr. Metab. 1989, 2, p 323-332.

140. Lagasse E., Connors H., A1 Ghalimg M., Aeltsma M., Dohse M., Osborne L., Wang X., Finegold M., Wissman J.L., and Grompe M. "Purified hematopoietic stem cells can differentiate into hepatocytes in vivo." Nat. Med. 2000, 6. 1229-1234.

141. Lazaro C.A., Rhim J.A., Yamada Y., Fausto N. "Generation of hepatocytes from oval cell precursors in culture". Cancer Res. 1998, 58, p 5514-5522.

142. Lee O.K., Kuo Т.К., Chen Weiming et.al. "Isolation of multipotent mesenchymal stem cells from umbilical cord blood." Blood, 2004, V103, N5, p. 16691675.

143. Li RK, Tumiati LC, Weisel RD, Mickle DAG. "Isolation of cardiomyocytes from human myocardium for primary cell cultures." J Tissue Cult Methods. 1993, Vol. 15. P. 147-154.

144. Liechty K.W., Mac-Kenzie Т. C., Shaaban A. et.al. "Human mesenchymal stem cells engraft and demonstrate site-specific differentiation after in utero transplantation in sheep." Nature medicine 2000, 6, 11, p 1282-1286.

145. Liu S., Qu V., Stewart T. J. et.al. "Embryonic stem cells differentiate into oligodendrocytes and myelinate in culture and after spinal cord transplantation." Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000,97, 6126-6131.

146. Lumelsky N., Blondel O., Laeng P. et.al. "Differentiation of Embryonic Stem cells to insulin secreting structures similar to Pancreatic islets." Science. 2001, 292, 1309-1599.

147. Mac Gregor G.R. "Gene Transfer and Expression Protocols." In: Methods in Molecular Biology. ed.Murphy E.J. The Humana Press, Inc. Clofton, N-Y. 1991, V.7. P. 217.

148. Majumdar M.K., Thiede M.A., Mosca J.D., et.al. "Phenotypic and functional comparison of cultures of marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) and stromal cells." J. Cell Physiol. 1998, 176, 57-66.

149. Malouf N.N., Coleman W.B., Grisham W et.al. "Adult derived stem cells from the liver become myocytes in the heart in vivo". Am. J. Pathol. 2001, 158: 19291935.

150. Mareschi K., Biasin E., Piacibello W et.al. "Isolation of human mesenchymal stem cells: bone marrow versus umbilical cord blood." Haematologia, 2001, 86, 10991100.

151. Mc. Kay R. "Stem cells in the central Nervous System." Science, 1997, 276, 66-71.

152. Meyts E.R., Iorgensen N., Muller I., Shakkeback N.E. "Prolonged expression of the c-kit receptor in germ cells of intersex fetal testes." J. Pathol. 1996,178: 166-169,.

153. Mezey E., Chandross K.J., Hazta G et.al. "Turning blood into brain: cells bearing neuronal antigens generated in vivo from bone marrow." Science, 2000, 290, 1779-1782.

154. Midy V, Plouet J. "Vasculotropin/vascular endothelial growth factor induces differentiation in cultured osteoblasts." Biochem Biophys Res Commun 1994, Feb 28;199(l):380-386

155. Minguell J.J. "Is hyaluronic acid the "organizer" of the extracellular matrix in marrow stroma?" Exp. Hematol. 1993, 21: 7-8.

156. Minguell J.J., Erices A., Conget P. "Mesenchymal stem cells". Exp. Biol. Med., 2001, 226(6), 507-520.

157. Morrison S.J., Weissman I.L. "The long-term repopulating subset of hematopoietic stem cells is deterministic and isolable by phenotype." Immunity, 1994, 1, 661-673.

158. Morrison S.J., White P.M., Zockc., and Anderson D.J., "Prospective indentificantion, isolation by flow cytometry and in vivo self- renewal of multipotent mammalian neural crest cells." Cell, 1999, 96, 737-749.

159. Morshead C.M., Reynolds B.A., Craig C.G et.al. "Neural stem cells in the adult mammalian forebrain: a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells." Neuron, 1994, 13,1071-1082.

160. Muramatsu M, Mizutani Y, Ohmori Y, Okumura J-i. "Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo." Biochem.Biophys.Res.Comm. 1997, V.230. P.376-38041(1-2).P.148-156.

161. Murry CH., Soonpaa M., Reinecke H et.al. "Haematopoietic stem cells do not trans-differentiate into cardiac myocytes in myocardial infarcts." Nature. 2004, 428, 664668.

162. Nygren J., Jovinge S., Breitbach M., et.al. "Bone-marrow-derived hematopoietic cells generate cardiomyocytes at a low frequency through cell fusion, but not trans-differentiation." Nature Medicine 2004, 105, 494-501.

163. Odorico Y. S., Kanfman D. S., Thomson Y. A. "Multilineage differentiation from human ESC lines." Stem Cells. 2001, 19, 193-204.

164. Okamoto R., Yajima Т., Yamazaki M et.al. "Damaged epithelia regenerated by bone marrow derived cells in the human gastrointestinal tract". Nat. Med. 2002, 8, 10111017.

165. Orlic D., Kajstura J., Chimenti S., Jakonjuk J., Anderson S.M., Si В., Pickel J., McKey R, Nadal-Ginard В., Bodine DM., Jere A., and Anversa P. "Bone marrow cells regenerate infarcted myocardium." Nature. 2001, 410, 701-705.

166. Owen M, Friedenstein A. "Stromal stem cells: marrow-derived osteogenic precursors". Cells and Molecular Biology of vertebrate Hard Tissues, Ciba Found Symp. 1988, 136: 42-60

167. Pera M.F. "Human pluripotent stem cells a progress report." Curr. Opin. Genet. Dev., 2001, 11,595-599.

168. Perm E.C., GengY.-J., Willerson J.T. "Adult stem cell therapy in perspective." Circulation 2003,107, 935-938.

169. Phinney D. G., Ropen G., Righter W., Webster S., Tremain , Prockop D. J. "Donor variation in the growth propierties and osteogenic potential of human marrow stromal cells." J. Cell biochem. 1999, 75: 424-436.

170. Pittenger M.F., Mackay A.M., Beck S.C. et.al. "Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells." Science, 1999, 284, p 143-146.

171. Poole T.Y., Finkelstein EB., and Cox CM "The role of FGF and VEGF in angioblast induction and migration during vascular development." Dev. Dyn. 2001, 220, 117.

172. Potten C. "Stem cells in gastrointestinal epithelium: numbers, characteristics and death." Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. 1998, 353, 821-830.

173. Poulsom R., Forbes S.J., Hodivala-Dilke К et.al. "Bone marrow contributes to renal parenchymal turnover and regeneration". Pathology 2001, 195: 229-235.

174. Prockop, D.J. "Marrow stromal cells as stem cells for non-hematopoietic tissues." Science 1997, 276: 71-74,.

175. Reese J.S., Кос O.N., Geson S.L. "Human mesenchymal stem cells provide stromal support for efficient CD34T transduction." J. Hematother Stem Cell. Res. 1999, 8: 515-523.

176. Reinecke H., Minami E., Poppa V., Murry C. "Evidence for fusion between Cardiac and Skeletal Muscle cells." Circul. Res. 2004, 94, 56-60.

177. Reisner et.al. United States Patent 1998, №5, 806,529 от September 15.

178. Reyes M, Lund T, Lenvik T et al. "Purification and ex vivo expansion of postnatal human marrow mesodermal progenitor cells. " Blood 2001, 98, 2615-2625.

179. Reynolds В A., and Weiss S., "Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system." Scence. 1992, 255, 17071710.

180. Richards M., Huibregtse B.A, Caplan А.1., Goulet J.A., Goldstein S.A. "Marrow-derived progenitor cell injections enhance new bone formation during distraction." J. Orthop. Res. 1999, 17: 900-908.

181. Ron Zohar, Jaro Sodek, and Christopher A.G. McCulloch. "Characterization of Stromal Progenitor Cells Enriched by Flow Cytometry". Blood, 1997, Vol. 90, 9 (November 1), 3471-3481.

182. Rust EM, West fall MV, Metzger JM. "Stability of the contractile assembly and Ca2+ activated tension in adenovirus infected adult cardiac myocytes." Moll.Cell Biochem. 1998, V.181(l-2). P.143-155.

183. Salvatori G, Lattanzi L, Coletta M. et.al. "Myogenic conversion of mammalian fibroblasts induced by differentiating muscle cells." J.Cell Sci. 1995, V.108. P.2733-2739.

184. Salven P, Mustjoki S, Alitalo R et. al. "VEGFR-3 and CD133 identify a population of CD34+ lymphatic/vascular endothelial precursor cells." Blood 2003, Jan l;101(l):168-72.

185. Satomura K., Derubeis A.R., Fedarko N.S., Ivaraki-O'Connor K., Kuznetsov S.A., Rowe D.W., Young M.F., Gehron Robey P. "Receptor tyrosine kinase expression in human born marrow stromal cells." J. Cell Physiol. 1998, 177:426-438.

186. Schaison G., Eden O.B., Henze G et.al. "Recommendations on the use of colony-stimulating factors in children: Conducion of European panel." Euro. J. Pediatr. 1998, 157, 955-966.

187. Schultz E. "Satellite cell proliferative Compartments in growing skeletal muscles." Dev. Biol. 1996, 175, 84-94.

188. Seshi В., Kumar S., Selers D. "Human bone marrow stromal cell: coexpression of markers specific for multiple mesenchymal cell lineages." Blood cells, Molecules and Diseases, 2000, 26(3), 234-246.

189. Shaked A, Csete ME, Drazan KE et.al. "Adenovirus -mediated gene transfer in the transplant setting.II.Successful expression of transferred cDNA in syngenic liver grafts." Transplantation. 1994, V.57(10). P.1508-1511.

190. Shamblott M.J., Axelman J. Gaerhart I. D. et.al. "Derivation of pluripotent stem cells from cultured primordial germ cells." Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998, 95, 13726-13731.

191. Shapiro F., Koide S., Glimcher M.J. "Cell origin and differentiation in the repair of full-thickness defects of articular cartilage." J. Bone Joint Surg. Am. 1993, 75: 532-553.

192. Shen J, Taylor N, Duncan L. et.al. "Ex vivo adenovirus mediated gene transfection of human conjunctival epithelium." Br. J.Ophthalmol. 2001, V.85. P.861-867.

193. Shi Q., Rafii S., Wu M. H et.al. "Evidence for circulating bone-marrow-derived endothelial cells." Blood, 1998, 92, 362-367.

194. Simmons PJ, Torok-Storb B. "Identification of stromal cell precursors in human bone marrow by a novel monoclonal antibody, STRO-1." Blood 1991, 78:55-62.

195. Slack J.M. "Stem cells in epithelial tissues." Science 2000, 287, 1431-1433.

196. Soonpaa MH, Koh GY, Klug GM, Field LJ. "Formation of nascent intercalated disks between grafted fetal cardiomyocytes and host myocardium." Scince. 1994, V. 263. P98-101.

197. Soria В., Roche E., Bema G. et.al. "Insulin secreting cells derived from ESC normalize glycemia in diabetic rats." Diabetes, 2000, 49, 157-162.

198. Spradling A., Drummond Barbosa D., Kai Th., 2001. Цит. По В.В.Малайцев, И.М.Богданова, Г.Т.Сухих. "Современные представления о биологии стволовой клетки" Архив патологии 2002, №4, с. 7-11.

199. Stamm С, Westphal В, Kleine HD et. al. "Autologous bone-marrow stem-cell transplantation for myocardial regeneration." Lancet. 2003, Jan 4;361(9351):11-12.

200. Strauer BE., Kornowski R. "Stem cell Therapy in perspective." Ciculation 2003, 107, 929-934.

201. Szmitko P.E., Fedak P.W., Weisel R.D. et.al. "Endothelial progenitor cells: new hope for broken hearts". Citculation, 2003, v 107, p. 3093-3100.

202. Talbot N. C, Carret W. M. "Ultrastructure of ESC the 8 day pig blastocyst before and after manipulation." The Anat. Rec., 2001, 264, 101-113.

203. Temple S., and Alvares-Buylla A. "Stem cells in the adult mammalian central nervous system." Curr. Opin. Neurobio Pathol. 1999, 9, 135-141.

204. Teramoto S.,Ito H.,Ouchi Y. "Variables affecting the transduction efficiency of adenovirus vectors in bovine aortic endothelial cells." Thromb.Res. 1999, V93(l). P.35-42.

205. Theise N.D., Saxena R., Portmann B. et. al. "The canals of Hering and hepatic stem cells in humans." Hepatology, 1999, 30, 1425-1433.

206. Theise ND., Nimmakayaln M., Gardner R., Jllei PB., Morgon G., Teperman F., Henegorin O., and Krause D.S. "Liver from bone marrow in humans." Hepatology. 2000, 32. 11-16.

207. Thomson J.A., Itskovitz-Eldor J., Shapiro S. S. et.al. "Embryonic stem lines derived from human blastocyst." Science, 1998, 282, 1145-1147.

208. Thorgeirsson S.S. "Hepatic stem cells." Am. J. Pathol. 1993, 142, 1331-1333.

209. Till J.E., and McCullough EA. "A direct measurement of the radiation sensitivity of normal mouse bone marrow cells." Radiat. Res. 1961, 19,213-222.

210. Till J.E., Mc.Culloch E. "A direct measurement of the radiation sensitivity of normal mouse bone marrow cells." Radit. Res. 1961, 14, 1419-1430.

211. To L.B., Haylock D.H., Simmons P.J., Juttner C.A. "The biology and clinical used of blood stem cells." Blood, 1997, 89, 2233-2258.

212. Tomita S, Li RK, Jia ZQ et.al. "Bone Marrow Cells Transplanted in a Cardiac Scar Induced Cardiomyogenesis and Angiogenesis and Improved Damaged Heart Function." Circulation. 1999, Vol. 100(suppl I). P1-91-1-92.

213. Toyoda M., Takayama H„ Horignchi N. et.al. "Overexpression of HGFISCF promotes vascularization and granulation tissue formation in vivo." FEBS Letters, 2001, 509, 95-100.

214. Urist M.R., terashima Y, Nakagawa M, Stamos C. "Cartilage tissue differentiation from mesenchymal cells derived from mature muscle in tissue culture." In Vitro. 1978, 14: 697-706.

215. Vamada Т., Voshikava M. et.al. "In vitro Functional Gut Like Organ Formation from Mouse ESC." Stem cells, 2002, 20, 41-49.

216. Vamada Т., Voshikava M.,Kanda S. et.al. "In vitro Differentiation of ESC identified by cellular Uptake of Indocyanin Green." Stem Cells. 2002,20, 146-154.

217. Vasa M., Fichtscherer S., Aicher A et.al. "Number and migratory activity of circulating endothelial progenitor cells inversely correlate with risk factors for CAD". Circ. Res., 2001, v89, p.el-e7.

218. Vassilopolos G., Wang P.-R., Russel D. "Transplanted bone marrow regenerates liver by cell fusion." Nature 2003, 422, 901-904.

219. Verfaillie C.M. "Adhesion receptors as regulators of the hematopoietic process." Blood, 1998, 92, 2609-2612.

220. Vescovi AJ., Gritti A., Galli R., and Parati E.A. "Isolation and intracerebral grafting of nontransformed multipotential embryonic human CNS stem Cells." J. Neurotrauma. 1999,16, 689-693.

221. Wang X., Willenbring H., Akkari Y et.al. "Cell fusion is the principal source of bone-marrow derived hepatocytes." Nature 2003,422, 897-901.

222. Watt E. "Epidermal stem cells: markers pattering and the control of stem cell fate." Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. 1997, 353, 831.

223. Weissman I.L. "Translating stem and progenitor cell biology to the clinic: barrier and opportunities." Science. 2000, 287, 1442-1446.

224. Weissman J.F. "Stem cells: units of development, units of regeneration and units in evolution." Cell. 2000, 100, 157-168.

225. Whitlock C.A, Tidmarsh G.F, Muller-Sieburg C., Weissman I.L. "Bone marrow stromal cell line with lymphopoietic activity express high levels of a pre-B neoplasia-associated molecule." Cell, 1987, 48, 1009-1021.

226. Williams BP., Read J., and Price J. "The generation of neurons and oligodendrocytes from a common precursor cell." Neuron, 1991, 7, 685-693.

227. Williams J.T., Southerland S.S., Souza J., Calcutt A.F., Cartledge R.G. "Cells isolated from adult human skeletal muscle capable of differentiating into multiple mesodermal phenotypes." Am. Surg. 1999, 65: 22-26.

228. Wolf N.S., Kone A., priestley G.V., Bartelmez S.H. "In vivo and in vitro characterization of long-term repopulating primitive hematopoiectic cells isolated by sequential Hoechst 33342-rhodamine 123 FACS selection." Exp. Hematol. 1993, 21: 614622.

229. Wu A., Till J.E., Simonovitch L., Mc Culloch E. "Cytological evidence for a relationship between normal hematopoietic colony-forming cells of the lymphoid system." J. Exp. Med. 1968, 127, 455-467.

230. Xu C., Inokuma M. S., Denham J. Et.al. "Feeder free growth of undifferentiated human ESC." Nature Biotechnol., 2001, 19, 971-974.

231. Yamazaki M., Nakajima F., Ogasawara A., Moriga H., majeska R.J., Einhorn T.A. "Spatial and distribution of CD44 and asteopontin in fracture callus." J. Bone Joint Surg. Br. 1999,81:508-515.

232. Yau T.M., Tomita SH., Weisel RD., et.al. "Beneficial effect of autologous cell Transplantation on infarcted Heart function: comparison between bone marrow sromal cells and Heart Cells." Ann. Thorac. Surg. 2003, 75, 169, 177.

233. Young DC, Kingsley SD, Ryan KA, Dutko FJ. "Selective inactivation of eucariotic beta-galactosidase in assays for inhibitors of HIV-1 TAT using bacterial beta-galactosidase as a reporter enzyme." Analytical Biochemistry. 1993, V.215. N1.P.24-30.

234. Young R.G., Butler D.L., Weber W., Caplan A.I, Gordon S.L, Fnk D.J. "Ise of mesenchymal stem cells in a collagen matrix for Achilles tendon repair." J. Ortho. Res. 1998, 16:406-413.

235. Zandstra P.W, Lauffenburger D.A, Eaves C.Y. "A ligand-receptor signaling threshold model of stem cell differentiation control: a biologically conserved mechanism applicable to hematopoiesis." Blood. 2000, 96, 1215-1222.

236. Ziegelhoeffer T, Fernandez B, Kostin S. et al Bone "Marrow derived Cells do not incorporate into the adult growing Vasculature." Circul. Res. 2004, 94, 230-238.

237. Zuk P.A., Min Zhu, Mizuno H., et.al. "Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies." Tissue Engineering, 2001, V7, N2, 211-228.