Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Использование ингибитора аргиназ L-норвалина для коррекции L-NAME-индуцированного гестоза в эксперименте

На правах^рукописи

Полянская Оксана Сергеевна

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ИНГИБИТОРА АРГИНАЗ Ь-НОРВАЛИНА ДЛЯ КОРРЕКЦИИ Ь^АМЕ-ИНДУЦИРОВАННОГО ГЕСТОЗА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

7 ФЕВ 2013

Старая Купавна -2013

005049478

Работа выполнена в Федеральном государственном автономном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Белгородский государственный национальный исследовательский университет»

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор

Покровский Михаил Владимирович

доктор медицинских наук Иванова Оксана Юрьевна

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор кафедры семейной

медицины Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации Утешев Даниил Борисович

кандидат медицинских наук, доцент, и.о. заведующего кафедрой фармакологии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования Курский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения Российской Федерации Пашин Евгений Николаевич

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится 2Ъ\Ъ года в «/^>^часов

на заседании диссертационного совета Д 217.004.01, созданного на базе ОАО «Всероссийский научный центр по безопасности биологически активных веществ» (ОАО «ВНЦ БАВ», 142450, Московская область, Ногинский район, г. Старая Купавна, ул. Кирова, 23).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ОАО «ВНЦ БАВ».

Автореферат разослан «

еМЛг^Л^ 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

Яснецов Виктор Владимирович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность научного исследования

Гестоз представляет собой острую, актуальную проблему современной акушерско-гинекологической службы, что обусловлено в первую очередь высокой заболеваемостью и наличием осложнений для матери и плода. Несмотря на значительные достижения в диагностике и лечении, гестоз по-прежнему остается грозным заболеванием второй половины беременности. По данным различных авторов, частота его встречаемости колеблется от б до 25% (Колгушки-на Т.Н., 2000; Савельева Г.М., 2003; Крукиер И.И., 2009). В связи с тем, что этиология и патогенез гестоза в настоящее время остаются до конца не выясненными, актуальной проблемой до сих пор является поиск эффективных методов лечения этого осложнения беременности.

Многочисленные факты свидетельствуют о том, что клинические проявления гестоза обусловлены развитием патологических изменений в эндотелии кровеносных сосудов, которые связаны с нарушением регуляции их тонуса и реологических свойств крови (Климов В.А., 2006; Марков Х.М., 2005; Boger R.H., 2009). В последние годы обнаружено, что пусковым моментом развития данной патологии может являться повышение концентрации в материнской плазме метилированных аналогов L-аргинина асимметричного диметилар-гинина (ADMA) и монометиларгинина (L-NMMA) (Fliser D., 2005; Perticone F., 2009; Pope A.J., 2009) , являющихся эндогенными ингибиторами эндотелиаль-ной NO-синтазы (eNOS).

Сегодня принципы терапии гестоза заключаются в создании лечебно-охранительного режима, восстановлении функции жизненно важных органов, быстром и бережном родоразрешении. Восстановление функции жизненно важных органов наряду с гипотензивной (сульфат магния, антагонисты кальция, p-блокаторы, центральные адреномиметики, спазмолитические препараты), инфузионно-трансфузионной и дезинтоксикационной терапией, нормализацией водно-солевого обмена, реологических и коагуляционных свойств крови, улучшением маточно-плацентарного кровотока включает в себя нормализацию структурно-функциональных свойств клеточных мембран (Савельева Г.М., 2010). Однако существующие принципы терапии гестоза формировались без учета целенаправленной коррекции NO-продуцирующей функции эндотелия.

С учетом того, что в настоящее время ключевую роль в патогенезе гестоза отводят эндотелиальной дисфункции, перспективным направлением воздействия на фармакологическую мишень «ADMA-eNOS» является использование ингибиторов аргиназ. Механизм действия данных веществ заключается в блокировании фермента аргиназы, а следовательно, в нарушении превращения L-аргинина в орнитин и мочевину. Таким образом, большее количество L-аргинина расщепляется под действием NO-синтазы с образованием оксида азота. В конечном итоге механизм действия сводится к восстановлению NO-синтезирующей функции и уменьшению дисфункции эндотелия (Ming X.F., 2009).

Среди фармакологических агентов, планируемых к комплексному изучению в контексте вышеизложенного, предполагается исследование эффективно-

сти ингибитора аргиназы Ь-норвалина (производства "\VIRUD Лт^Н", Гамбург), центрального а-адреномиметика метилдопы («Допегит», производства Ея^э, Венгрия) и блокатора кальциевых каналов амлодипина («Амлотоп», производства «Макизфарма», Россия), а также их сочетанного применения.

Работа выполнена по инициативному плану, включена в программу «Разработка и совершенствование методов ранней диагностики, лечения и профилактики сердечно-сосудистых заболеваний с целью улучшения качества и увеличения продолжительности жизни больных» на 2007-2012 гг., номер госрегистрации 0120.0710379. Исследование поддержано Грантом на поддержку научных исследований в рамках реализации федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 годы», соглашение № 14.132.21.1337.

Цель исследования: провести комплексное сравнительное изучение влияния ингибитора аргиназ Ь-норвалина, метилдопы и амлодипина и их сочетанного использования на течение экспериментального Ь-ЫАМЕ-индуцированного гестоза.

Задачи исследования:

1. Оценить развитие экспериментального Ь-ЫАМЕ-индуцированного гестоза с использованием результатов функциональных проб, оценки плацентарной микроциркуляции, биохимических маркеров и результатов морфологических исследований.

2. Изучить влияние метилдопы на течение экспериментального Ь-ЫАМЕ-индуцированного гестоза с использованием результатов функциональных проб, оценки плацентарной микроциркуляции, биохимических маркеров и результатов морфологических исследований.

3. Изучить влияние амлодипина на течение экспериментального Ь-ЫАМЕ-индуцированного гестоза с использованием результатов функциональных проб, оценки плацентарной микроциркуляции, биохимических маркеров и результатов морфологических исследований.

4. Изучить влияние ингибитора аргиназ Ь-норвалина на течение экспериментального Ь-ЫАМЕ-индуцированного гестоза с использованием результатов функциональных проб, оценки плацентарной микроциркуляции, биохимических маркеров и результатов морфологических исследований.

5.. Изучить влияние комбинированного применения ингибитора аргиназ Ь-норвалина с метилдопой на течение экспериментального Ь-ЫАМЕ-индуцированного гестоза с использованием результатов функциональных проб, оценки плацентарной микроциркуляции, биохимических маркеров и результатов морфологических исследований.

6. Изучить влияние комбинированного применения ингибитора аргиназ Ь-норвалина с амлодипином на течение экспериментального Ь-ЫАМЕ-индуцированного гестоза с использованием результатов функциональных проб, оценки плацентарной микроциркуляции, биохимических маркеров и результатов морфологических исследований.

Научная новизна исследования

В работе впервые разработан комплекс методических подходов для оценки морфофункциональных нарушений, возникающих при моделировании экспериментального L-NAME-индуцированного гестоза, соответствующего ADMA-подобной патологии у беременных женщин. Показано, что экспериментальный L-NAME-индуцированный гестоз у животных характеризуется развитием выраженной артериальной гипертензии, нарушениями плацентарной микроциркуляции, деструктивными изменениями в плаценте, протеинурией и морфологическими гипертензивно обусловленными изменениями в почечной ткани. Параллельно развивается комплекс изменений, характерных для эндотели-альной дисфункции, выражающейся в изменении соотношений сосудистых реакций на ацетилхолин (АХ) (эндотелийзависимая вазодилатация) и нитропрус-сид (НП) (эндотелийнезависимая вазодилатация) с увеличением коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД) в 2,4 раза, выраженным спазмом мелких артерий в плаценте и почках и резким снижением показателей биохимических маркеров (Total NO, экспрессия eNOS).

Препараты, входящие в стандартную гипотензивную терапию гестоза (центральный а2-адреномиметик метилдопа и блокатор кальциевых каналов амлодипин), уменьшают морфофункциональные нарушения при коррекции L-NAME-индуцированного гестоза у крыс, однако выраженность этого эффекта не достигает целевого уровня.

В работе впервые показано, что ингибитор аргиназ L-норвалин в дозе 10 мг/кг/сут, вводимый однократно внутрижелудочно с 14 по 20 сутки беременности, оказывает выраженное протективное действие при коррекции экспериментального L-NAME-индуцированного гестоза у крыс, заключающееся в нормализации плацентарной миркоциркуляции и КЭД, предотвращении про-теинурии, в восстановлении в полной мере содержания нитрит-ионов NOx и экспрессии eNOS, улучшении морфологической картины в плаценте и почках.

Комбинация ингибитора аргиназ L-норвалина с препаратами, входящими в стандартную гипотензивную терапию гестоза, при коррекции морфофункциональных нарушений у крыс с экспериментальным L-NAME-индуцированным гестозом, оказывает наиболее выраженный эффект за счет воздействия на различные звенья патогенеза.

Научно-практическая значимость

В работе обоснована эффективность применения ингибитора аргиназ L-норвалина в качестве монотерапии и в сочетании с метилдопой и амлодипином при экспериментальном L-NAME-индуцированном гестозе. Показано, что использование L-норвалина позволяет нормализовать плацентарную микроциркуляцию, предотвратить альбуминурию, а также восстановить регуляцию сосудистого тонуса, предотвратить снижение N0-продуцирующей функции эндотелия. Полученные данные позволяют рекомендовать целенаправленные клинические испытания L-норвалина для профилактики и лечения гестоза как в монотерапии, так и в сочетании с препаратами стандартной гипотензивной терапии.

Внедрение результатов научных исследований

На основании данных диссертационного исследования запланировано проведение целенаправленных клинических исследований ингибитора аргиназ Ь-норвалина, а также его комбинаций с препаратами, входящими в стандартную гипотензивую терапию гестоза.

Материалы диссертационного исследования, касающиеся эндотелиопро-тективной активности Ь-норвалина, включены в состав документов для промышленного выпуска нового оригинального препарата, содержащего в своём составе Ь-аргинин и Ь-норвапин (ООО «Новосибхимфарм»).

Полученные результаты используются в учебных программах кафедр фармакологии, клинической фармакологии Курского государственного медицинского университета, кафедры фармакологии Орловского государственного университета и кафедры фармхимии и фармакогнозии, фармакологии и фармацевтических дисциплин, биохимии и фармакологии Белгородского государственного университета, кафедры фармакологии Воронежской медицинской академии.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Моделирование экспериментального Ь-ЫАМЕ-индуцированного гестоза у беременных животных характеризуется морфофункциональными нарушениями, типичными для клинических проявлений гестоза.

2. Введение препаратов, входящих в стандартную гипотензивную терапию гестоза, - метилдопы и амлодипина - животным с экспериментальным гес-тозом приводило к коррекции морфофункциональных нарушений, однако целевого уровня не достигало. Использование ингибитора аргиназ Ь-норвалина оказывало более выраженный протективный эффект в сравнении с препаратами, входящими в стандартную гипотензивную терапию гестоза.

3. Комбинированное использование ингибитора аргиназ Ь-норвалина с препаратами, входящими в стандартную гипотензивную терапию гестоза, оказывает наиболее выраженный эффект в сравнении с применением их в монотерапии за счет воздействия на различные звенья патогенеза.

Апробация работы. Материалы работы доложены на итоговых научных сессиях и конференциях молодых ученых Курского государственного медицинского университета в 2010, 2011 и 2012 гг., XVII национальном конгрессе «Человек и лекарство», II Всероссийской научной конференции студентов и аспирантов с международным участием «Молодая фармация - потенциал будущего», III Всероссийском научно-практическом семинаре «Методологические аспекты экспериментальной и клинической фармакологии» (Волгоград, 2011), X итоговой научно-практической конференции клинических ординаторов, интернов, молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» НИУ БелГУ, конференции «Фундаментальные и прикладные исследования в медицине» (Франция, Париж, 2012), конференции «Фундаментальные и прикладные исследования в медицине» (Россия, Сочи, 2012), IV съезде фармакологов России «Инновации в современной фармакологии» (Казань, 2012). Апробация диссертации проведена на заседании Института последипломного образования Федерального государственного автономного об-

разовательного учреждения высшего профессионального образования «Белгородский государственный национальный исследовательский университет».

Личный вклад автора. Автору принадлежит ведущая роль в выборе направления исследования, постановке цели и поиске путей её достижения. Проанализированы отечественные и зарубежные источники по теме диссертации, на основании чего выдвинуты рабочие гипотезы о возможных фармакотерапевтических стратегиях и биологических моделях для исследования эндотелиопротективной активности выбранных веществ и препаратов. Вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования. Доля личного участия 90%.

В опубликованных работах, выполненных в соавторстве, автором лично проведена разработка дизайна и протокола исследования, определены ключевые критерии оценки морфофункциональных нарушений при моделировании исследуемой патологии и оценки эффективности вводимых тестируемых препаратов. При непосредственном участии автора проводилось выведение животных из эксперимента с регистрацией физиологических показателей и проведением функциональных проб on-line с помощью программного комплекса "AcqKnowledge версии 3.8.1", забор тканей и органов для биохимического и морфологического исследований, биохимические и морфологические исследования, статистическая обработка полученных данных, научное обоснование, обобщение и представление полученных результатов.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 23 печатных работы, из них 9 в российских рецензируемых научных журналах, включённых в перечень изданий, рекомендованных ВАК для публикаций результатов диссертаций. В работах полностью отражено содержание диссертации. Получено 3 патента РФ на изобретения.

Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 173 источника, из них 47 отечественных и 126 зарубежных авторов. Диссертация изложена на 129 страницах машинописного текста, содержит 14 таблиц, 44 рисунка.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Моделирование L-NAME-индуцированного гестоза Эксперимент выполнен на 350 белых крысах-самках линии Wistar массой 250-300 г. Для исследования взяты крысы без внешних признаков заболевания, прошедшие карантинный режим вивария Белгородского государственного университета. В ходе эксперимента животные содержались в условиях стандартной экспериментальной биологически чистой комнаты, температура воздуха составляла 22-24°С, освещение - 12 ч/12 ч светлый/темный цикл, все крысы получали гранулированный корм и фильтрованную водопроводную воду. Все исследования проводили в одно и то же время суток во второй половине дня с соблюдением принципов, изложенных в «Конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей»

(Страсбург, 1986). Для формирования групп беременных животных с заданными сроками, находящимся на раздельном содержании самкам (3 животных) подсаживали самцов (2 животных) на 24 часа. Затем животных рассаживали и через 14 суток в условии эфирного сна пальпаторно определяли наличие беременности. В наших экспериментах беременность наступала в 30-40%. АОМА-подобный агент - неселективный блокатор МО-синтазы Ы-нитро-Ь-аргинин-метиловый эфир (Ь-ЫАМЕ) вводили внутрибрюшинно в дозе 25 мг/кг/суг в течение семи дней (14-20 сутки беременности). По данным литературы, такой умеренно пролонгированный среднедозовый режим введения Ь-ЫАМЕ вызывает блокаду >Ю-синтазы в эндотелии плацентарных сосудов, что приводит к деструктивным изменениям в тканях плаценты, артериальной гипертензии и про-теинурии.

Оценка степени развития эндотелиальной дисфункции при моделировании патологии

Развитие эндотелиальной дисфункции у экспериментальных животных, а также степень ее коррекции исследуемыми препаратами и их комбинациями оценивали по расчетному коэффициенту эндотелиальной дисфункции (КЭД). Формула расчета коэффициента эндотелиальной дисфункции впервые предложена в лаборатории кардиофармакологии НИИ экологической медицины коллективом авторов под руководством профессора М.В. Покровского.

Предложенный коэффициент эндотелиальной дисфункции является отношением площади треугольника над кривой восстановления АД в ответ на введение НП (30 мкг/кг) (8нп) к площади треугольника над кривой восстановления АД в ответ на введение АХ (40 мкг/кг) (Бах)'-

Оценка плацентарной микроциркуляции

Для получения данных о состоянии микроциркуляции в плаценте на 21 сутки беременности, под наркозом, в 5 точках измеряли уровень микроциркуляции на расстоянии 1 мм от края плацентарного диска. Для получения данных о состоянии микроциркуляции в плаценте использовали оборудование производства компании "Віорасзузіегш": полиграф МР100 с модулем лазерной допплеровской флоуметрии (ЛДФ) 1ЛЭР100С и инвазивным игольчатым датчиком Т50144, который устанавливался непосредственно на проекцию плацентарного диска. Регистрация и обработка результатов ЛДФ производились с помощью программы "АсяКпо\у1е<^е версии 3.8.1"; значения микроциркуляции выражались в перфузионных единицах (ПЕд) - среднее из 5 измерений.

Исследование протеинурии

Сбор мочи у интактных и опытных групп крыс проводился с использованием специальных метаболических клеток. Животное помещалось в клетку на 12 часов с обеспечением свободного доступа к воде.

Определение биохимических маркеров эндотелиальной дисфункции

Использована модификация метода определения стабильных метаболитов N0, позволяющая после депротеинизации сыворотки крови проводить одно-этапное количественное определение суммарных нитратов и нитритов (Метель-

екая В.А., Туманова Н.Г., 2005). Принцип метода заключается в одновременном восстановлении нитратов в нитриты в присутствии хлористого ванадия и реакции диазотирования с последующим развитием окраски. Уровень экспрессии эндотелиальной синтазы оксида азота (e-NOS) определяли в клеточном лизате по методу Хендриксона (Метельская В.А., Туманова Н.Г., 2002).

Морфологические методы оценки изменений в плаценте и почках при моделировании L-NAME-индуцированного гестоза

Для морфологического подтверждения развития моделируемых патологических процессов и комплексной оценки эффективности препаратов проведено гистологическое исследование (во всех сериях эксперимента), почек и плаценты. Материал фиксирован в 10% формалине с последующей заливкой в парафин. Срезы почек производили перпендикулярно основной оси органа через лоханку. Гистологические срезы плаценты производили в строго вертикальном направлении через середину плацентарного диска с захватом всех слоев плаценты и стенки рога матки. Изучение микропрепаратов, фотопротоколирование и морфометрию проводили на микроскопе Leica DM4000B с системой видеорегистрации и обработки изображений. При всех морфологических исследованиях использовали окраску гематоксилином и эозином. Для возможности сравнения морфологические изменения оценивали в рангах. Иммуногисто-химическим исследованием определяли экспрессию эндотелиальной NO-синтазы (eNOS).

Обоснование доз исследуемых фармакологических агентов и дазайн эксперимента

В рамках данной работы проведено исследование эндотелиопротективной активности ряда фармакологических агентов.

Метилдопа («Допегит», производства Egis, Венгрия) вводился в дозе 0,043 г/кг х2 р/сут внутрь с 14 по 20 сутки беременности. Доза соответствует суточной дозировке для человека 1000 мг/сут, пересчитана с учётом соотношения поверхности тела биологического объекта к его массе по общепринятой формуле межвидового переноса доз И.П. Улановой.

Амлодипин («Амлотоп», производства «Макизфарма», Россия) вводили в дозе 0,5 мг/кг/сут однократно внутрь с 14 по 20 сутки беременности. Доза выбрана в соответствии с литературными данными, где описано эффективное гипотензивное и кардиопротективное действие препарата в экспериментах, ранее проведённых в нашей лаборатории.

L-норвалин ("WIRUD JmgH", Гамбург) вводился в дозе 10 мг/кг/сут внутрь однократно с 14 по 20 сутки беременности. Согласно данным современных исследователей, именно начиная с этой дозировки L-норвалин способен ингибировать фермент аргиназу (Ming X.F., 2009).

При комбинированном применении препаратов использовались те же дозы, пути и продолжительность введения.

Дизайн эксперимента состоит из следующих блоков:

1. Контрольная группа (животные с пероральным введением NaCl в эквивалентных дозах с 14 по 20 сутки беременности).

2. Моделирование экспериментального L-NAME-индуцированного гесто-за (животные с внутрибрюшинным введением L-NAME в дозе 25 мг/кг/сут с 14 по 20 сутки беременности).

3. Оценка эффективности коррекции морфофункциональных нарушений с использованием метилдопы (0,086 г/кг/сут), амлодипина (0,5 мг/кг).

4. Оценка эффективности коррекции морфофункциональных нарушений с использованием ингибитора аргиназ L-норвалина (10 мг/кг).

5. Оценка эффективности коррекции морфофункциональных нарушений с использованием комбинации ингибитора аргиназ L-норвалина (10 мг/кг) с ме-тилдопой (0,086 г/кг/сут) и амлодипином (0,5 мг/кг)

Протокол эксперимента состоит из следующих разделов:

1. Спаривание животных и пальпаторное определение факта беременности на 14 сутки.

2. Моделирование L-NAME-индуцированного гестоза у беременных крыс (с 14 по 20 сутки) и его коррекция с помощью метилдопы, амлодипина, L-норвалина, и их сочетаний в течение 7 суток.

3. Помещение животных на 20 сутки в метаболическую клетку и сбор суточной мочи с последующим определением протеинурии.

4. На 21 сутки беременности в условиях наркоза хлоралгидратом вскрытие брюшной полости и оценка плацентарной микроциркуляции.

5. Оценка эндотелийзависимых и эндотелийнезависимых реакций артериального давления на внутривенное одномоментное введение ацетилхолина и нитропруссида натрия.

6. Взятие венозной крови, грудного отдела аорты для определения биохимических маркеров. Взятие почек и плаценты для патоморфологических исследований.

Статистическая обработка результатов исследования

Цифровые данные обрабатывали методами вариационной статистики: вариационные ряды проверяли на нормальность распределения, при его соблюдении количественные величины характеризовали средней арифметической (М) и ошибкой средней (т), статистическую значимость количественных величин оценивали по критерию Стьюдента (t); полуколичественные величины выражали медианой (Me), а статистическую значимость различий между ними характеризовали с помощью непараметрического критерия Хи-квадрат (х )• Все расчеты выполнены с помощью пакета статистических программ Microsoft Excel 7.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование динамики функциональных, биохимических и морфологических показателей при моделировании L-NAME-индуцированного гестоза

Введение ADMA-подобного агента - L-NAME небеременным самкам не приводило к статистически значимым изменениям (рис. 1).

При введении L-NAME беременным самкам наблюдались морфофунк-циональные изменения, по своим проявлениям соответствующие критериям

клинической картины гестоза у женщин. Блокада МО-синтазы, вызванная 7-дневным введением Ь^АМЕ беременным крысам, приводила к статистически значимому (р<0,05) повышению систолического и диастолического АД с 125,0±6,3 мм рт.ст. и 82,0±5,8 мм рт. ст. до 183,1±9,4 мм рт.ст. и 136,7±7,4 мм рт.ст. соответственно (рис. 1), нарушению взаимоотношений ва-зодилатирующих и вазоконстрикторных механизмов регуляции сосудистого тонуса, о чем свидетельствуют результаты сосудистых проб на эндотелийзави-симое (ацетилхолин) и эндотелийнезависимое (нитропруссид натрия) расслабление и увеличение КЭД с 1,28±0,23 у интактных беременных животных до 3,06±0,32 (р<0,05).

Моделирование гестоза приводило к значительному снижению показателя микроциркуляции в плаценте с 425,90±39,55 до 237,50±38,18 ПЕд (р<0,05).

Рис. 1. Значения АД, КЭД, микроциркуляции в плаценте и протеинурии при моделировании L-NAME-индуцированного гестоза (М±т; п=10). Примечание: *- р<0,05 в сравнении с интактными беременными крысами; у- р<0,05 в сравнении с беременными крысами с L-NAME.

У интактных беременных крыс 12-часовой диурез составил 5,6±1,2 мл, что соответствовало нормальным показателям у животных массой 250300 г при незначительной протеинурии, значения которой соответствовали 0,90±0,10 г/л, т.е. до 1,0 г/л. Моделирование Ь^АМЕ-индуцированного гестоза не оказывало существенного влияния на суточный диурез. Однако при анализе мочи обнаружено умеренно выраженное увеличение протеинурии со значением 1,88±0,19 г/л (р<0,05) (рис. 1).

ТчЮ-продуцирующая функция эндотелия исследована на основании данных увеличения экспрессии еТМОБ (в процентах от контроля) и содержания нитрит-ионов МОх в сыворотке крови. Обнаружено, что моделирование Ь-ЫАМЕ-

индуцированного гестоза приводило к резкому снижению экспрессии еЫОБ и содержания нитрит-ионов (>Юх), соответственно в 1,9 и 1,8 раза (рис. 2).

Рис. 2. Концентрация NOx в сыворотке крови и экспрессия eNOS при моделировании L-NAME-индуцированного гестоза. (М±ш; п=10).

Примечание: *- р<0,05 в сравнении с интактными беременными крысами; у- р<0,05 в сравнении с беременными крысами с L-NAME.

Гистологическая картина почек у интактных беременных крыс (21 сутки беременности) была следующей: клубочки умеренно полнокровны, базальная мембрана не утолщена, воспалительные изменения в интерстиции клубочков и пирамид отсутствуют; спастические и гипертрофические изменения мелких артерий и артериол не обнаружены (рис. 3).

Рис. 3. Структура почки интактных животных.

Примечание: А - мелкая артерия в корковом веществе без признаков гипертрофии стенок, её эндотелий не поврежден; Б - базальная мембрана капилляров клубочка не утолщена, клеточная воспалительная реакция отсутствует. Окраска гематоксилином и эозином X 280.

У крыс с экспериментальным гестозом в клубочках почек выявлены признаки ишемического повреждения в виде их малокровия, а также дистрофические изменения базальной мембраны капилляров клубочков с её утолщением в виде проволочных петель (рис. 4).

Морфологическая картина плаценты при Ь-ЫАМЕ-индуцированном гес-тозе проявлялась в виде ишемии ворсин и интервиллезных пространств и

Рис. 5. Структура плаценты интактных животных.

Примечание: А - спонгиозный (ворсинчатый) слой; Б - слой гигантоклеточного гро-фобласта. Окр. гематоксилином и эозином. Микрофото. X 200.

Рис. 4. Почка беременной крысы с гестозом (21 сутки беременности): А, Б - спазм арте-риолы; В - плазматическая ар-териола; Г - клубочек с гипертрофированным темным пятном; Д - клубочки малокровны, базальные мембраны капилляров резко утолщены и имеют вид проволочных петель (мем-бранозная гломерулопатия). Окраска гематоксилином и эозином. Х280.

При гистологическом исследовании плаценты интактных беременных крыс отмечается равномерное кровенаполнение капилляров ворсин и межкапиллярных пространств, относительно мономорфная структура трофобласта, непрерывность перехода от ворсинчатого слоя в трофобластический слой (рис. 5). Экспрессия еМ08 в плаценте у интактных животных выявляется в капиллярах ворсин, преимущественно на низком и среднем уровнях, а также в мелких сосудах трофобластического и децидуального слоев. По результатам количественного анализа удельная площадь иммунореактивного вещества при реакции на еЫОБ составила 5,4+0,2%.

слущиванием эндотелия в сосудах плаценты (рис. 6). В отдельных случаях это приводило к появлению очагов некроза децидуапьных клеток в ткани плаценты. На внешней поверхности плаценты наблюдали массивные отложения фибрина. При иммуногистохимическом исследовании в данной серии экспрессия е!чЮ8 в эндотелии капилляров практически не выявлялась.

Рис. 6. Патоморфологические изменения плаценты при моделировании геетоза: А - дилатация и неравномерное кровенаполнение сосудов на границе ворсинчатых структур и трофобластического слоя, децидуального слоя, отек, Б - очаги мукоидных изменений тро-фобластического слоя, дистрофические изменения трофобласта. Окр. гематоксилином и эозином. Микрофото. X 200.

Интегральная характеристика балльной оценки изменения морфологических показателей при моделировании Ь-ЫАМЕ-индуцированного геетоза представлена в табл. 1.

Таблица 1

Комплексная оценка патоморфологических изменений в сосудах почек и плаценты при моделировании Ь^АМЕ-индуцированного геетоза

(Баллы 0-6; п=10)

Серия экспериментов Комплексная оценка в баллах

Интактные беременные самки 0-1

Ь-ЫАМЕ 5-6* _ .. ______ і

Примечание. * - р<0,05 в сравнении с интактными беременными самками, по критерию х •

Таким образом, вышеизложенное свидетельствует о том, что внутрибрю-шинное введение Ь-ЫАМЕ с 14 по 20 сутки беременности в дозе 25 мг/кг вызывает у крыс комплекс функциональных, биохимических и морфологических изменений, связанных с развитием дефицита N0 вследствие блокады N0-синтазы. На 21 беременности сутки развивалась выраженная артериальная ги-пертензия и эндотелиальная дисфункция, резко уменьшался уровень нитрит-ионов и экспрессия ТчЮ-синтазы. При лазердопплерфлоуметрическом исследовании обнаружены нарушения плацентарной микроциркуляции, сопровождавшиеся протеинурией. Морфологически обнаруживались признаки ишемиче-ских повреждений почек и плаценты. Описанный симптомокомплекс соответствует патофизиологическим нарушениям, возникающим при развитии геетоза у беременных женщин.

Исследование влияния метилдопы (0,086 г/кг/сут) и амлодипина (0,5 мг/кг) на течение экспериментального Ь^АМЕ-индуцированного гестоза

Введение метилдопы в суточной дозе 0,086 г/кг приводило к снижению артериального давления, значение которого было близко к целевому (р<0,05), но на соотношение реакций эндотелийзависимой и эндотелийнезависимой ва-зодилатации существенного влияния не оказывало (табл. 2).

Таблица 2

Результаты коррекции L-NAME-индуцированного гестоза у крыс с использованием метилдопы (0,086 г/кг/сут) и амлодипина

(0,5 мг/кг) (М±т; п=10) _

\ Показа-\ тель Группах \ САД, мМ, рт. ст. ДАд\ мм рт. ст\ КЭД, усл. ед. Микроциркуляция, ПЕд Протеин-урия, г/л Концентрация нитрит-ионов, мкмоль/дл Экспрес-сия eNOS, %

Интакт-ные 125±6,3 1,28±0,23 425,9±39,6 0,90±0,1 2,35±0,21 112,2±6,99

82,0±5,8

L-NAME 183,1±9,4" 3,06±0,32" 210,0±21,Г 1,88±0,19" 1,33±0,09" 61,4±4,46

136,7±7,4"

L-NAME+ метилдопа 135,4±2,8Х 2,8±0,01 242,6±10,9 0,96±0,06х 1,32±0,09 64,5±3,01

101,4±3,8Х

L-NAME+ амлодипин 165,7±6,8 1,48±0,21х 202,8±18,5 0,79±0,11х 1,40±0,09 66,4±3,76

123,5±6,3

Примечание. Здесь и в табл. 4 и 5: САД, ДАД - систолическое и диастолическое артериальное давление (мм рт. ст.); КЭД - коэффициент эндотелиальной дисфункции (у.е.); * - р<0,05 в сравнении с интактными беременными самками, х - р<0,05 в сравнении с группой Ь-ИАМЕ,

у- р<0,05 в сравнении с монотерапией препаратами стандартной терапии гестоза.

В группах животных с использованием амлодипина в дозе 0,5 мг/кг наблюдалась иная динамика исследуемых показателей. Отмечено улучшение взаимоотношений реакций эндотелийзависимой и эндотелийнезависимой вазо-дилатации до уровня, сопоставимого с уровнем в группе интактных животных (КЭД 1,48±0,21). Артериальное давление имело тенденцию к снижению, однако статистически значимого отличия от уровня контрольной группы животных не достигало (табл. 2).

Метилдопа (0,086 г/кг/сут) и амлодипин (0,5 мг/кг) не предотвращали снижения микроциркуляции, вызванного моделированием Ь-МАМЕ-индуцированного гестоза, и ее уровень составил 242,6±10,9 и 202,8±18,47 ПЕд соответственно, что достоверно не отличалось от значений у беременных самок с моделированием гестоза (237,5±38,2 ПЕд) и было существенно ниже значений микроциркуляции у интактных беременных крыс (425,9±39,6 ПЕд) (табл. 2). Обнаружено, что метилдопа и амлодипин не восстанавливают уровень нитрит-ионов и экспрессию еЫОБ, однако приводят к нормализации протеину-рии (табл. 2).

Морфологические исследования обнаружили снижение ишемических изменений в почках и плаценте под влиянием метилдопы и амлодипина. Мелкие артерии коркового вещества почки с умеренными признаками гипертрофии мышечного слоя. Капилляры почечных клубочков полнокровны, базальные мембраны не утолщены, отмечалась некоторая гиперплазия клеток темного пятна. Не наблюдались клиновидные участки некроза, атрофии паренхимы с коллапсом стромы, ее лимфоидной инфильтрацией. Отсутствовали диффузные изменения почечных телец в виде сморщивания, гиалиноза и склероза, гиали-ноз и склероз артерий. Морфологическая картина плаценты при Ь-ЫАМЕ-индуцированном гестозе на фоне применения метилдопы и амлодипина отличалась от таковой в группе контрольных животных менее выраженными некротическими явлениями в плаценте и уменьшением фибринозных отложений на внешней ее поверхности. Интегральная оценка патоморфологических изменений представлена в таблице 6.

Исследование эффективности ингибитора аргиназ Ь-норвалина (10 мг/кг) при Ь^АМЕ-индуцированном гестозе

Обнаружено, что Ь-норвалин в дозе 10 мг/кг не предотвращал развитие артериальной гипертензии при моделировании Ь-ИАМЕ-индуцированного гестоза у крыс (табл. 4), но снижал КЭД до 1,51±0,15, тогда как в группе беременных самок, получавших Ь-ЫАМЕ, он составлял 3,06±0,32. Снижение КЭД на фоне сохранения артериальной гипертензии свидетельствует с одной стороны о том, что КЭД имеет самостоятельное значение, а с другой - о том, что Ь-ЫАМЕ-индуцированный гестоз вовлекает в патогенетический процесс не только нитроергическую систему, но и все элементы гуморального и нейрогенного контуров регуляции системы кровообращения.

Таблица 4

Результаты коррекции Ь^АМЕ-индуцированного гестоза у крыс

с использованием Ь-норвалина (10 мг/кг) (М±т; п=10)

ЧПоказа-тель Группа Чч Ч сад, Ч^м рт.ст дадЧ мм рт.сЧ. КЭД, усл. ед. Микроциркуляция, ПЕд Протеин-урия, г/л Концентрация нитрит-ионов, мкмоль/дл Экспрессия еИОЭ, %

Интакт-ные 125±6,3 1,28±0,23 425,9±39,6 0,90±0,1 2,35±0,21 112,2±6,99

82,0±5,8

Ь-ЫАМЕ 183,1±9,4" 3,06±0,32" 210,0±21,1" 1,88±0,19" 1,33±0,09" б1,4±4,4б"

136,7±7,4"

Ь-норвалин 194,5±8,3 1,51±0,15х 455,7±41,5х 0,90±0,06" 2,10±0,14" 108,9±5,41"

146,4±8,2

Примечание. См. примечание к табл. 2

Введение Ь-норвалина (10 мг/кг) вызывало существенное улучшение уровня микроциркуляции до средних значений 455,7± 41,5 ПЕд, что было достоверно выше, чем у беременных самок с гестозом (р<0,05). Обнаружено, что Ь-норвалин вызывал нормализацию протеинурии, увеличение экспрессии еМОБ (табл. 4) и практически полностью восстанавли-

вал содержание нитрит-ионов (ЫОх) до значений у интактных животных (табл. 4).

При морфологическом исследовании почек и плаценты также обнаружен протективный эффект Ь-норвалина. Мелкие артерии коркового вещества почки без признаков гипертрофии мышечного слоя. Капилляры почечных клубочков полнокровны, базальные мембраны не утолщены, симптом «проволочных петель» отсутствует. При морфологическом исследовании плаценты на внешней поверхности наблюдались слабые отложения фибрина, ворсины и интервиллезные пространства полнокровны. Интегральная характеристика балльной оценки морфологических показателей представлена в таблице б, из которой следует, что Ь-норвалин достоверно снижал интегральную оценку в баллах (2-3) в сравнении с данными при Ь-ЫАМЕ-индуцированном гестозе.

Исследование эффективности комбинированного использования Ь-норвалина (10 мг/кг) с метилдопой (0,086 г/кг/сут) и амлодипином (0,5 мг/кг) при моделировании Ь^АМЕ-индуцированного гестоза

В первую очередь обращает на себя внимание тот факт, что Ь-норвалин (10 мг/кг), не обладая собственным гипотензивным эффектом, в комбинации как с метилдопой (0,086 г/кг/сут), так и в комбинации с амлодипином (0,5 мг/кг), потенцировал их гипотензивные эффекты. В обоих случаях наблюдалось выраженное снижение артериального давления (табл. 5). Следует обратить внимание на то, что наиболее эффективное снижение артериального давления по сравнению со всеми сериями экспериментов наблюдалось при комбинированном использовании Ь-норвалина и метилдопы.

Сочетанное использование Ь-норвалина с препаратами стандартной гипотензивной терапии гестоза, как представлено в табл. 4, оказывало выраженное эндотелиопротективное действие на модели Ь-ЫАМЕ-индуцированного гестоза. С учетом описанных сведений о благоприятном влиянии сочетанного использования Ь-норвалина и метилдопы на значение артериального давления при моделировании Ь-КАМЕ-индуцированного гестоза, возможно предположить, что в основе эффективности предложенной комбинации лежит влияние на два разных патогенетических звена. С одной стороны, ингибитор аргиназ Ь-норвалин компенсирует нарушения выработки N0 в эндотелии, а с другой -центральный а2-адреностимулятор метилдопа стимулирует центральные симпатические ядра, что приводит к уменьшению периферического тонуса сосудов.

Использование Ь-норвалина в комбинации с метилдопой не приводило к изменению КЭД по сравнению с его монотерапией, но оставляло значение КЭД ниже по сравнению с нелечеными животными.

При комбинированном применении Ь-норвалина и препаратов стандартной гипотензивной терапии гестоза амлодипина и метилдопы, которые в монотерапии не улучшали микроциркуляцию в плаценте, наблюдалось потенцирование эффектов, что выразилось в повышении значений показателей микроциркуляции до уровня интактных животных (табл. 5). При этом, в отличие от животных с Ь-ЫАМЕ-индуцированным гестозом, на ЛДФ-кривой в большей сте-

пени проявлялись кардиальные и дыхательные волны, что свидетельствует о нормализации динамической составляющей микроциркуляции и косвенно предполагает улучшение реологической составляющей.

Комбинированное использование Ь-норвалина с метилдопой и амлодипи-ном у животных с моделированием Ь-ЫАМЕ-индуцированного гестоза норма-лизовывало протеинурию, практически полностью восстанавливало концентрацию нитрит-ионов и показатели экспрессии еЫОБ до уровня интактных животных (табл. 5).

При морфологическом исследовании почек и плаценты также обнаружен протективный эффект комбинированного использования Ь-норвалина и препаратов, входящих в стандартную гипотензивную терапию гестоза. Микроскопическое исследование почек у животных, получавших комбинированное лечение, выявило картину, которая резко отличалась от картины в контрольной группе беременных крыс. Мелкие артерии коркового вещества почки без признаков гипертрофии мышечного слоя. Капилляры почечных клубочков полнокровны, базальные мембраны не утолщены, симптом «проволочных петель» отсутствует.

Таблица 5

Результаты исследования эффективности комбинированного использования Ь-норвалина (10 мг/кг) с метилдопой (0,086 г/кг/сут) и амлодипином (0,5 мг/кг)

при моделировании ЬЖАМЕ-индуцированного гестоза (М±т; п=10)

^■Показатель Группа N. \ САД, \мм рт.ст. ДАД, мм рт.ст. N КЭД, усл. ед. Микроциркуляция, ПЕд Протеин-урия, (г/л) Концентрация нитрит-ионов, мкмоль/дл Экспрессия еИОБ, %

Интактные 125±6,3 1,28±0,23 425,9±39,6 0,90±0,1 2,35±0,21 112,2±6,99

82,0±5,8

Ь-ЫАМЕ 183,1 ±9,4" 3,06±0,32* 210,0±21,Г 1,88±0,19* 1,33±0,09* 61,4±4,4б"

136,7±7,4"

Ь-ЫАМЕ+ метилдопа 135,4±2,8Х 2,8±0,01 242,6±10,9 0,96±0,06* 1,32±0,09 64,5±3,01

101,4±3,8Х

Ь-ЫАМЕ+ амлодипин 165,7±6,8 1,48±0,21х 202,8±18,5 0,79±0,1 Iх 1,40±0,09 66,4±3,76

123,5±б,3

Ь-ЫАМЕ + Ь-норвалин 194,5±8,3 1,51±0,15" 455,7±41,5х 0,90±0,06х 2,10±0,14х 108,9±5,4Г

146,4±8,2

Ь-ЫАМЕ + метилдопа+ Ь-норвалин 120,1 ±2,9" 1,50±0,25ху 394,2±25,8ху 1,04±0,04х 2,19±0,17ху 112,6±4,57ху

92,4±3,3Х

Ь-ЫАМЕ + амлодипин Ь-норвалин 156,3±2,0*у 1,69±0,07х 398,6±18,4ху 0,98±0,1 Iх 2,11±0,17ху 116,1±5,77*у

108,9±4,6Х)'

Примечание. См. примечание к табл. 2

В плаценте отмечали мономорфную структуру слоев без очаговых изменений, умеренное кровенаполнение спонгиозного слоя. На внешней поверхности плаценты наблюдались лишь следы отложения фибрина.

Интегральная оценка - 1-2 балла, что явилось лучшим значением в нашем исследовании (табл. 6). Удельная площадь иммунореактивного вещества при реакции на еЫОБ в серии комбинированного использования Ь-норвалина и метилдопы не отличалась от площади интактного уровня и составила 5,1+0,1%.

Таким образом, при морфологическом исследовании почек и плаценты обнаружено выраженное протективное действие сочетанного использования Ь-норвалина и препаратов, входящих в стандартную гипотензивную терапию гестоза, заключающееся в приближении морфологической картины к таковой у интактных беременных животных.

Таблица 6

Влияние комбинированного использования Ь-норвалина (10 мг/кг) с метилдопой (0,086 г/кг/сут) и амлодипином (0,5 мг/кг) на комплекс _пато,морфологических изменений (баллы 0-6)_

Серия экспериментов Комплексная

оценка в баллах

Интактные беременные самки 0-1

Ь-ЫАМЕ 5-6*

Ь-ЫАМЕ + метилдопа 3х

Ь-ЫАМЕ + амлодипин 3-4"

Ь-ЫАМЕ + Ь-норвалин 2-3"

Ь-ЫАМЕ + метилдопа + Ь-норвалин 1-2ху

Ь-ЫАМЕ + амлодипин + Ь-норвалин - 2Х>

Примечание: * - р<0,05 в сравнении с интактными беременными самками, * - р<0,05 в сравнении с группой Ь-ЫАМЕ, у - р<0,05 в сравнении с монотерапией препаратами стандартной гипотензивной терапии гестоза, по критерию х2-

ВЫВОДЫ

1. Моделирование экспериментального Ь-ЫАМЕ-индуцированного гестоза у крыс самок путем введения в течение с 14 по 20 сутки беременности Ы-нитро-Ь-аргинин-метилового эфира (Ь-ЫАМЕ) в дозе 25 мг/кг/сут характеризуется комплексом нарушений, соответствующих клиническому проявлению гестоза, с развитием выраженной артериальной гипертензии, протеинурии и снижением уровня микроциркуляции в плаценте в 2 раза, с увеличением коэффициента эндотелиальной дисфункции в 2,4 раза, уменьшением уровня стабильных метаболитов оксида азота в 1,8 раза, экспрессии е>Ю8 в 1,9 раза. Морфологически обнаруживались комплексные изменения в плаценте и почках.

2. Метилдопа в дозе 0,086 г/кг/сутки на модели гестоза оказывал выраженное гипотензивное действие и способствовал нормализации протеинурии. Однако в полной мере не предотвращал развитие деструктивных изменений в плаценте, эндотелиальной дисфункции, снижения концентрации стабильных метаболитов N0 и экспрессии еТ^ОБ.

3. Амлодипин в дозе 0,5 мг/кг/сут не проявлял гипотензивного действия при экспериментальном гестозе, предотвращал повышение КЭД. При этом микроциркуляция в плаценте, концентрация стабильных метаблитов N0, экспрессия еМОБ и морфологическая картина патологических изменений плаценты и почек существенно не менялись.

4. Ингибитор аргиназ L-норвалин в дозе 10 мг/кг оказывал значительное эндотелиопротективное действие на модели L-NAME-индуцированного гесто-за, что выражалось в восстановлении эндотелийзависимого расслабления сосудов и снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции почти до уровня интактных животных, улучшении плацентарной микроциркуляции, а также в восстановлении в полной мере содержания нитрит-ионов NOx и экспрессии eNOS, нормализации протеинурии. Морфологические исследования обнаружили предотвращение под влиянием L-норвалина развития нарушений в сосудистом эпителии почечных артерий и изменений ишемического генеза в плаценте. Однако монотерапия L-норвалином не приводила к снижению артериального давления.

5. Комбинированное использование L-норвалина (10 мг/кг) и метилдопы (0,086 г/кг/сут) приводило к полному предотвращению развития артериальной гипертензии, эндотелиальной дисфункции (снижение значений КЭД, восстановление NOx и экспрессии eNOS), нарушения микроциркуляции в плаценте и протеинурии и к существенной нормализации морфологической картины в плаценте и почках.

6. Комбинированное использование L-норвалина (10 мг/кг) с амлодипи-ном (0,5 мг/кг) также обладало протективным действием на модели экспериментального гестоза, выраженность которого сопоставима с комбинацией L-норвалина с метилдопой.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Фармакологическая коррекция L-аргинином «ADMA-ENOS-ассоциированных мишеней» при экспериментальной преэклампсии / М.В. Покровский, Т.Г. Покровская, В.В. Гуреев [и др.] // Кубанский научный медицинский вестник.- 2010. -№ 1. - С. 85-92.

2. Реалии и перспективы фармакологической коррекции ADMA-eNOS-ассоциированных путей при преэклампсии / М.В. Покровский, Н.Г. Филиппенко, В.В. Гуреев [и др.] // Рациональная фармакотерапия в кардиологии. - 2010. -Ха 6 (6). - С. 882-887.

3. Пути коррекции NO-дефицитного состояния при патологии беременных в эксперименте / В.В. Гуреев, М.В. Покровский, О.С. Полянская [и др.] // Научные ведомости Белгородского государственного университета. Сер. Медицина. Фармация. - 2011. - № 4 (99), вып. 13/2. - С. 40-43.

4. Фармакологическая коррекция ADMA-eNOS-ассоциированных мишеней при преэклампсии / М.В. Покровский, Т.Г. Покровская, В.В. Гуреев [и др.] // Акушерство и гинекология.-2011.-№ 2.-С. 16-20.

5. Влияние l-аргинина, витамина В6 и фолиевой кислоты на показатели эндотелиальной дисфункции и микроциркуляции в плаценте при моделировании l-name-индуцированного дефицита оксида азота / М.В. Покровский, О.О. Новиков, В.В. Гуреев [и др.] // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -2011.-Т. 152,№7.-С. 77-80.

6. Использование L-аргинина в коррекции эндотелиальной дисфункции при экспериментальной преэклампсии / М.В. Покровский, Т.Г. Покровская, В.В. Гуреев

[и др.] //Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2012. - Т. 75, № 2. -С. 14-16.

7. Коррекция экспериментального гестоза тадалафилом / М.В. Покровский, В.В. Гуреев, A.A. Должиков [и др.] // Научные ведомости Белгородского государственного университета. Сер.: Медицина. Фармация. - 2012. - № 10 (129), вып. 18/2. -С. 146-151

8. Коррекция ADMA-подобного гестоза в эксперименте с помощью ингибитора аргиназы L-норвалина и препаратов, входящих в стандартную схему лечения / В.В. Гуреев, О.С. Полянская, A.A. Должиков // Курский научно-практический вестник «Человек и его здоровье». - 2012. - № 2. - С. 14-20.

9. Полянская, О.С. Перспективы фармакологической коррекции L-NAME-индуцированного гестоза в эксперименте с помощью ингибитора аргиназ L-норвалина и ингибитора фосфодиэстеразы 5 тадалафила / О.С. Полянская // Фундаментальные исследования. - 2012. - № 10. - С. 96-98.

10. L-NAME-индуцированный гестоз у крыс / A.A. Барсук, В.В. Гуреев, М.В. Покровский [и др.] // XVII Рос. нац. конгр. «Человек и лекарство»: сб. материалов конгр.; тез. докл. (Москва, 12-16 апр. 2010 г.). - М., 2010. - С. 575-576.

11. L-аргинин в профилактике развития L-NAME-индуцированного гестоза у крыс / В.В. Гуреев, A.A. Барсук, Е.В. Проскурякова [и др.] // XVII Рос. нац. конгр. «Человек и лекарство»: сб. материалов конгр.; тез. докл. (Москва, 12-16 апр. 2010 г.). -М„ 2010.-С. 601-602.

12. Сочетанное использование L-аргинина и амлодипина в коррекции L-NAME-ндуцированного гестоза в эксперименте / М.В. Покровский, Г.А. Лазарева, A.A. Барсук, Е.В. Проскурякова, В.В. Гуреев [и др.] // XVII Рос. нац. конгр. «Человек и лекарство»: сб. материалов конгр.; тез. докл. (Москва, 12-16 апр. 2010 г.). -М„ 2010.-С. 704.

13. Амлодипин в коррекции L-NAME-ндуцированного гестоза крыс / Е.В. Проскурякова, A.A. Барсук, В.В. Гуреев [и др.] // XVII Рос. нац. конгр. «Человек и лекарство»: сб. материалов конгр.; тез. докл. (Москва, 12-16 апр. 2010 г.). - М., 2010. - С. 707.

14. Полянская, О.С. Коррекция резвератролом ADMA-подобного гестоза у крыс / О.С. Полянская, В.В. Гуреев, A.A. Барсук [и др.] // Биотехнология и биомедицинская инженерия : материалы III Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием, посвящ. 75-летию Курск, гос. мед. ун-та. - Курск: Изд-во КГМУ, 2010. - С. 219-220.

15. Полянская, О.С. Коррекция эндотелиалыюй дисфункции рекомбинант-ным эритропоэтином при ADMA-подобной модели гестоза / О.С. Полянская, В.В. Гуреев, И.В. Медведев [и др.] // Молодежная наука и современность: материалы 76-й Всерос. науч. конф. студентов и молодых ученых с междунар. участием (Курск, 19-20 апр. 2011 г.). -Курск: Изд-во КГМУ, 2011. - С. 293.

16. Полянская, О.С. Коррекция L-NAME-индуцированного гестоза в эксперименте с помощью L-норвалина / О.С. Полянская, В.В. Гуреев, И.В. Медведев [и др.] // Молодежная наука и современность : материалы 76-й Всерос. науч. конф. студентов и молодых ученых с междунар. участием (Курск, 19-20 апр. 2011 г.). - Курск: Изд-во КГМУ, 2011.-С. 51.

17. Полянская, О.С. Коррекция микроциркуляции в плаценте рекомбинант-ным эритропоэтином при ADMA-подобной модели гестоза / О.С. Полянская, A.A. Барсук, С.В. Жуков [и др.] // Молодежная наука и современность : материалы

76-й Всерос. науч. конф. студентов и молодых ученых с междунар. участием (Курск, 19-20 апр. 2011 г.). - Курск: Изд-во КГМУ, 2011. - С. 51.

18. Полянская, О.С. Использование ингибитора аргиназы Ь-норвалина в коррекции Ь-ЫАМЕ-индуцированного гестоза у крыс / О.С. Полянская, М.В. Покровский, В.В. Гуреев // Вестник ВолгГМУ: приложение (Материалы III Всеросс. науч.-практ. семинара для молодых ученых «Методологические аспекты экспериментальной и клинической фармакологии»). - Волгоград: Изд-во ВолгГМУ, 2011. - С. 69-70.

19. Полянская, О.С. Перспективы использования дистантного прекондицио-нирования в коррекции развития АОМА-подобного гестоза у крыс / О.С. Полянская, Т.В. Корогодина, В.В. Гуреев // Молодая фармация - потенциал будущего : материалы II Всерос. науч. конф. студентов и аспирантов (Санкт-Петербург, 18-19 апр. 2012 г.).-СПб., 2012.-С. 6-7.

20. Сравнительная эндотелиопротективиая активность ингибиторов аргиназ / П.И. Лосенок, И.Н. Ершов, В.А. Куликовская [и др.] // Инновации в современной фармакологии: материалы IV съезда фармакологов России (Казань, 2012 г.). - Казань, 2012.-С. 120.

21. Полянская, О.С. Коррекция экспериментального гестоза с помощью ингибитора аргиназ Ь-норвалина и ингибитора фосфодиэстеразы 5 тадалафила / О.С. Полянская, В.В. Гуреев, О.Ю. Иванова // Успехи современного естествознания. -2012. -№ 10.-С. 90-91.

22. Полянская, О.С. Исследование влияния коротких эпизодов ишемии-реперфузии на течение АОМА-подобного гестоза / О.С. Полянская, В.В. Гуреев, О.Ю.Иванова// Успехи современного естествознания.-2012,- №10.- С. 94.

23. Новые подходы к фармакологической коррекции гестоза : метод, рекомендации / В.В. Гуреев, О.С. Полянская. - Курск: Изд-во КГМУ, 2012. - 96 е.; ил.

Патенты РФ на изобретения

1. Пат. 2449381 Российская Федерация. Способ коррекции эндотелиальной дисфункции Ь-норвалином при АОМА-подобной модели гестоза / М.В. Покровский, В.В. Гуреев, Т.Г. Покровская [и др.]; заявитель и патентообладатель ГОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию». - № 2010144195/14; опубл. 27.04.2012, Бюл. № 12. - 4 с.

2. Пат. 2453000 Российская Федерация. Способ коррекции нарушения микроциркуляции в плаценте при АОМА-подобной модели гестоза / М.В. Покровский, В.В. Гуреев, Т.Г. Покровская [и др.]; заявитель и патентообладатель ГОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию». - № 2010144193/14; опубл. 10.06.2012, Бюл. № 16. - 4 с.

3. Пат. 2449783 Российская Федерация. Способ коррекции Ь-ЫАМЕ индуцированного дефицита оксида азота Ь-норвалином в эксперименте / М.В. Покровский, Т.Г. Покровская, С.А. Цепелева [и др.] ; заявитель и патентообладатель ГОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию». - № 2010132488/15; опубл. 10.05.2012, Бюл. № 13. - 4 с.

Лицензия ЛР № 020862 от 30.04.99 г. Сдано в набор 09.01.2013 г. Подписано в печать 10.01.2013 г. Формат 30x42'/8. Бумага офсетная. Гарнитура Times New Rom. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 228"А". Издательство Курского государственного медицинского университета 305041, г. Курск, ул. К. Маркса, 3.

Гестоз представляет собой острую, актуальную проблему современной акушерско-гинекологической службы, что обусловлено в первую очередь высокой заболеваемостью и наличием осложнений для матери и плода. Несмотря на значительные достижения в диагностике и лечении, гестоз по-прежнему остается грозным заболеванием второй половины беременности. По данным различных авторов, частота его встречаемости колеблется от 6 до 25% [16,18]. В связи с тем, что этиология и патогенез гестоза в настоящее время остаются до конца не выясненными, актуальной проблемой до сих пор является поиск эффективных методов лечения этого осложнения беременности.

Многочисленные факты свидетельствуют о том, что клинические проявления гестоза обусловлены развитием патологических изменений в эндотелии кровеносных сосудов, которые связаны с нарушением регуляции их тонуса и реологических свойств крови [13,21,22,58]. В последние годы обнаружено, что пусковым моментом развития данной патологии может являться повышение концентрации в материнской плазме метилированных аналогов Ь-аргинина ассиметричного диметиларгинина (АЭМА) и монометиларгинина (Ь-№ММА) [69,120,121], являющихся эндогенными ингибиторами эндотелиальной 1МО-синтазы (еМОБ).

Сегодня принципы терапии гестоза заключаются в создании лечебно-охранительного режима, восстановлении функции жизненно важных органов, быстром и бережном родоразрешении. Восстановление Функции жизненно-важных органов наряду с гипотензивной (сульфат магния, антагонисты кальция, (3-блокаторы, центральные адреномиметики, спазмолитические препараты), инфузионно-трансфузионной и дезинтоксикационной терапией, нормализацией водно-солевого обмена, реологических и коагуляционных свойств крови, улучшением маточно-плацентарного кровотока включает в себя нормализацию структурно-функциональных свойств клеточных мембран. Однако существующие принципы терапии гестоза формировались без учета целенаправленной коррекции Ж)-продуцирующей функции эндотелия.

Учитывая, что в настоящее время ключевую роль в патогенезе гестоза отводят эндотелиальной дисфункции, перспективным направлением воздействия на фармакологическую мишень «ADMA-eNOS» является использование ингибиторов аргиназ. Механизм действия данных веществ заключается в блокировании фермента аргиназы, а следовательно, в нарушении превращения L-аргинина в орнитин и мочевину. Таким1 образом, большее количество L-аргинина расщепляется под действием NO-синтазы с образованием оксида азота. В конечном итоге механизм действия сводится к восстановлению NO-синтезирующей функции и уменьшению дисфункции эндотелия [111].

Среди фармакологических агентов, планируемых к комплексному изучению в контексте вышеизложенного, предполагается исследование эффективности ингибитора аргиназы L-норвалина (производства "WIRUD JmgH", Гамбург), центрального а-адреномиметика метилдопы («Допегит», производства Egis, Венгрия) и блокатора кальциевых каналов амлодипина («Амлотоп», производства «Макизфарма», Россия), а также их сочетанного применения.

Работа выполнена по инициативному плану, включена в программу «Разработка и совершенствование методов ранней диагностики, лечения и профилактики сердечно-сосудистых заболеваний с целью улучшения качества и увеличения продолжительности жизни больных» на 2007-2012 гг., номер госрегистрации 0120.0710379. Исследование поддержано Грантом на поддержку научных исследований в рамках реализации федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 годы», соглашение № 14.132.21.1337.

Цель исследования: провести комплексное сравнительное изучение влияния ингибитора аргиназ L-норвалина, метилдопы и амлодипина и их сочетанного использования на течение экспериментального L-NAME-индуцированного гестоза.

Задачи исследования:

1. Оценить развитие экспериментального Ь-КАМЕ-ипдуцированного гестоза с использованием результатов функциональных проб, оценки плацентарной микроциркуляции, биохимических маркеров и результатов морфологических исследований.

2. Изучить влияние метилдопы на течение экспериментального Ь-КАМЕ-индуцированного гестоза с использованием результатов функциональных проб и оценки плацентарной микроциркуляции, биохимических маркеров и морфометрических показателей.

3. Изучить влияние амлодипина на течение экспериментального Ь-КАМЕ-индуцированного гестоза с использованием результаюв функциональных проб и оценки плацентарной микроциркуляции, биохимических маркеров и морфометрических показателей.

4. Изучить влияние ингибитора аргиназ Ь-норвалина на течение экспериментального Ь-ЫАМЕ-индуцированного гестоза с использованием результатов функциональных проб и оценки плацентарной микроциркуляции, биохимических маркеров и морфометрических показателей.

5. Изучить влияние сочетанного использования ингибитора аргиназ Ь-норвалина с метилдопой на течение экспериментального Ь-ЫАМЕ-индуцированного гестоза с использованием результатов функциональных проб и оценки плацентарной микроциркуляции, биохимических маркеров и морфометрических показателей.

6. Изучить влияние сочетанного использования ингибитора аргиназ Ь-норвалина с амлодипином на течение экспериментального Ь-МАМЕ-индуцированного гестоза с использованием результатов функциональных проб и оценки плацентарной микроциркуляции, биохимических маркеров и морфометрических показателей.

Научная новизна исследования

В работе впервые разработан комплекс методических подходов для оценки морфофункциональных нарушений, возникающих при моделировании экспериментального L-NAME-индуцировашюго гестоза, соответствующего ADMA-подобной патологии у беременных женщин. Показано, что экспериментальный L-NAME-индуцированный гестоз у животных характеризуется развитием выраженной артериальной гипертензии, нарушениями плацентарной микроциркуляции, деструктивными изменения в плаценте, протеинурией и морфологическими гипертензивно обусловленными изменениями в почечной ткани. Параллельно развивается комплекс изменений, характерных для эндотелиальной дисфункции, выражающейся в изменении соотношений сосудистых реакций на ацетилхолин (АХ) (эндотелийзависимая вазодилатация) и нитропруссид (НП) (эндотелийнезависимая вазодилатация) с увеличением коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД) почти в 2,4 раза, выраженным спазмом мелких артерий в плаценте и почках и резким снижением показателей биохимических маркеров (Total NG, экспрессия eNOS).

Препараты, входящие в стандартную гипотензивушо терапию гестоза (центральный а2-адрепомиметик метилдопа блокатор кальциевых каналов амлодипин) уменьшают морфофункциональные нарушения при коррекции ADMA подобной модели патологии у беременных животных, однако выраженность этого эффекта не достигает целевого уровня.

В работе впервые показано, что L-норвалин в дозе 10 мг/кг/сут однократно внутрижелудочно с 14 по 20 день беременности оказывает выраженное протективное действие при коррекции экспериментального L-NAME-индуцированного гестоза у животных, выражающееся в нормализации плацентарной миркоциркуляции и КЭД, предотвращении протеинурии, а также в восстановлении в полной мере содержания нитрит-ионов NOx и экспрессии eNOS, улучшении морфологической картины в плаценте и почках.

Комбинация ингибитора аргиназ L-норвалина с препаратами, входящими в стандартную гипотензивную терапию гастоза, при коррекции морфофункциональных нарушений у животных с экспериментальным L-NAME-индуцированным гестозом оказывает наиболее выраженный эффект за счет воздействия на различные звенья патогенеза.

Научно-практическая значимость

В работе обоснована эффективность применения ингибитора аргиназ Ь-норвалина в качестве монотерапии и в сочетании с метилдопой и амлодипином при экспериментальном Ь-ЫАМЕ-индуцированном гестозе. Показано, что использование Ь-норвалина позволяет нормализовать плацентарную микроциркуляцию, предотвратить альбуминурию, а также восстановить регуляцию сосудистого тонуса, предотвратить снижение МО-продуцирующей функции эндотелия. Полученные данные позволяют рекомендовать целенаправленные клинические испытания Ь-норвалипа для профилактики и лечения гестоза как в монотерапии, так и в сочетании с препаратами стандартной терапии.

Внедрение результатов научных исследований

На основании данных диссертационного исследования запланировано проведение целенаправленных клинических исследований ингибитора аргиназ Ь-норвалина, а также его комбинаций с препаратами, входящими в стандартную антигипертензивуню фармакологическую терапию гестоза.

Материалы диссертационного исследования, касающиеся эндотелиопротективной активности Ь-норвалина включены в состав документов для промышленного выпуска нового оригинального препарата, содержащего в своём составе Ь-аргинин и Ь-норвалин (ООО «Новосибхимфарм»).

Полученные результаты используются в работе учебных программах кафедр фармакологии, клинической фармакологии КГМУ, кафедры фармакологии Орловского государственного университета и кафедры фармхимии и фармакогнозии, фармакологии и фармацевтических дисциплин, биохимии и фармакологии Белгородского государственного университета; кафедры фармакологии Воронежской медицинской академии.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Моделирование экспериментального Ь^АМЕ-индуцированного гестоза у беременных животных характеризуется морфофункциональными нарушениями, типичными для клинических проявлений гестоза.

2. Введение препаратов, входящих в стандартную гипотензивную терапию гестоза, - метилдопы и амлодипина - животным с экспериментальным гестозом приводило к коррекции морфофункциональных нарушений, однако целевого уровня не достигало. Использование ингибитора аргиназ Ь-норвалина оказывало более выраженный протективный эффект в сравнении с препаратами, входящими в стандартную гипотензивную терапию.

3. Комбинированное использование ингибитора аргиназ Ь-норвалина с препаратами, входящими в стандартную гипотензивную терапию, оказывает наиболее выраженный эффект в сравнении с применением их в монотерапии за счет воздействия на различные звенья патогенеза.

Апробация диссертации

Материалы работы доложены на итоговых научных сессиях и конференциях молодых ученых Курского государственного медицинского университета в 2010, 2011 и 2012 гг., XVII национальном конгрессе «Человек и лекарство», II Всероссийской научной конференции студентов и аспирантов с международным участием «Молодая фармация - потенииал будущего», III Всероссийском научно-практическом семинаре «Методологические аспекты экспериментальной и клинической фармакологии» (Волгоград, 2011), X итоговой научно-практической конференции клинических ординаторов, интернов, молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» НИУ БелГУ, конференции «Фундаментальные и прикладные исследования в медицине», (Франция, Париж, 2012), конференции «Фундаментальные и прикладные исследования в медицине», (Россия, Сочи, 2012), IV съезде фармакологов России «Инновации в современной фармакологии», (Казань, 2012). Апробация диссертации проведена на заседании Института последипломного образования

Федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Белгородский государственный национальный исследовательский университет».

Личный вклад автора

Автору принадлежит ведущая роль в выборе направления исследования; постановке цели и поиске путей её достижения". '"'Проанализированы отечественные и зарубежные источники по теме диссертации, на основании чего выдвинуты рабочие гипотезы о возможных фармакотерапевтических стратегиях и биологических моделях для исследования эндотелиопротективной активности выбранных веществ и препаратов. Вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования. Доля личного участия 90%.

В опубликованных работах, выполненных в соавторстве, автором лично проведена разработка дизайна и протокола исследования, определены ключевые критерии оценки морфофункциональных'■. нарушений при моделировании исследуемой патологии и оценки эффективности вводимых тестируемых препаратов. При непосредственном участии автора проводилось выведение животных из эксперимента с регистрацией физиологических показателей и проведением функциональных проб on-line с помощью программного комплекса "AcqKnowledge версии 3.8.1", забор тканей и органов для биохимического и морфологического исследований, биохимические и морфологические исследования, статистическая обработка полученных данных, научное обоснование, обобщение и представление полученных результатов.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 23 печатных работы, из них 9 в российских рецензируемых научных журналах, включённых в перечень изданий, рекомендованных ВАК для публикаций результатов диссертаций. В работах полностью отражено содержание диссертации. Получено 3 патента РФ на изобретения.

Структура и объём работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 173 источника, из них 47 отечественных и 126 зарубежных авторов. Диссертация изложена на 158 страницах машинописного текста, содержит 14 таблиц, 44 рисунка.

ВЫВОДЫ

1. Моделирование экспериментального Ь-ЫАМЕ-индуцированного гестоза у крыс самок путем введения в течение с 14 по 20 сутки беременности 1Ч-нитро-Ь-аргинин-метилового эфира (Ъ-ЫАМЕ) в дозе 25 мг/кг/сут характеризуется комплексом нарушений, соответствующих клиническому проявлению гестоза, с развитием выраженной артериальной гипертензии, протеинурии и снижение уровня микроциркуляции в плаценте в 2 раза, с увеличением коэффициента эндотелиальной дисфункции в 2,4 раза, уменьшением уровня стабильных метаболитов оксида азота в 1,8 раза, экспрессии еЫ08 в 1,9 раза. Морфологически обнаруживались комплексные изменения в плаценте и почках.

2. Метилдопа в дозе 0,086 г/кг/сутки на модели гестоза оказывал выраженное гипотензивное действие и способствовал нормализации протеинурии. Однако не предотвращал развитие деструктивных изменений в плаценте, эндотелиальной дисфункции, снижения концентрации стабильных метаболитов N0 и экспрессии е>Ю8.

3. Амлодипин в дозе 0,5 мг/кг/сут не проявлял гипотензивного действия при экспериментальном гестозе, преводотвращал повышение КЭД. При этом микроциркуляция в плаценте, концентрация стабильных метаблитов N0, экспрессия еЖ)8 и морфологическая картина патологических изменений плаценты и почек существенно не менялись.

4. Ингибитор аргиназ Ь-норвалин в дозе 10 мг/кг оказывал значительное эндотелиопротективное действие на модели Ь-КА>3>индуцированного гестоза, что выражалось в восстановлении эндотелийзависимого расслабления сосудов и снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции почти до уровня интактных животных, улучшении плацентарной микроциркуляции, а также в восстановлении в полной мере содержания нитрит-ионов ЫОх и экспрессии еЫ08, нормализации протеинурии. Морфологические исследования обнаружили предотвращение под влиянием Ь-норвалина развития нарушений в сосудистом эпителии почечных артерий и изменений ишемического генеза в пла-центе. Однако монотерапия L-норвалином не приводила к снижению артери-ального давления.

5. Комбинированное использование L-норвалина (10 мг/кг) и метилдопы (0,086 г/кг/сут) приводило к полному предотвращению развития артериальной гипертензии, эндотелиальной дисфункции (снижение значений КЭД, восстановление NOx и экспрессии eNOS), нарушения микроциркуляции в плаценте и протеинурии и к существенной нормализации морфологической картины в плаценте и почках.

6. Комбинированное использование Ь-норвалиг*Ч (10 мг/кг) с амлодипином (0,5 мг/кг) так же обладало протективным действием на модели экспериментального гестоза, выраженность которого сопоставима с комбинацией L-норвалина с метилдопой.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ : '

Изучение возможностей фармакологической ко'^рЬкции нарушений,' возникающих при гестозе в эксперименте, ' требует выбора патофизиологической модели данной патологии, с созданием наиболее5 приближенных условий к клинической ситуации. Принимая этот факт во внимание, установление взаимосвязи фармакологических изысканий с формированием объективной методологии оценки явилось начальным этапом наших исследований, который был посвящен разработке методологических подходов к экспериментальному моделированию гестоза.

Так, в ходе наших исследований, проведенных в эксперименте на белых крысах самках линии был разработан комплекс метоНических подходов,' включающий моделирование гестоза, и последующую оценку его физиологическими, биохимическими и морфологическими методами.

Многочисленные факты свидетельствуют о том, что клинические проявления преэклампсии, изменения реактивности кровеносных сосудов, включая ангиоспазм и мультиорганную патологию, обусловлены развитием патологических изменений в эндотелии кровеносных сосудов[20, 25, 26, 75]. Высказано предположение, что в развитии структурных и функциональных изменений эндотелия кровеносных сосудов наряду- генетическими, иммунологическими и диетическими факторами важйую роль играет окислительный стресс и недостаточность оксида азота. Основным источником факторов, вызывающих дисфункцию эндотелия, является плацента. Гипоксия и окислительный стресс, развившиеся в плаценте, способствуют ее физиологической дисфункции, активации циклооксигеназы (СОХ-2), усиленному образованию простагландинов, тромбоксанов и эндотелина-1 [3]. Эти соединения способны вызвать дисфункцию эндотелия в организме матери, связанную с усиленным образованием вазоконстрикторов (тромбоксана, эндотелина и т. д.), снижением синтеза релаксантов (N0, п^?стациклина, и т.д.) и их стимуляторов - эстрогенов, повреждением эндотелия кровеносных сосудов, развитием ангиоспазма и нарушением ' фегоплацентарного кровообращения. Считается, что дефицит NO обусловлен преобразованием его в пероксинитрит или же снижением активности эндотелиальной NO-синтазы (eNOS). Пусковым моментом патогенеза преэклампсии может служить повышенное содержание в эндотелиальных клетках эндогенного ингибитора NO-синтазы ассиметричного диметиларгинина (ADM/4-/" Асимметричный' диметиларгинин (ADMA) и монометиларгинин (L-NMMA)* конкурируют с L-аргинином, субстратом NOS. В плазме концентрация ADMA более чем в десять раз выше, чем L-NMMA, и поэтому считается биологически более значимым.

Аргиназа конкурирует с NOS за общий субстрат L-аргинин. NOS и аргиназа функционально связаны также и через N '-гидрокси-Ь-аргинин (NOHA), образующийся как промежуточное звено в реакции катализа NOS. Хотя сродство L-аргинина намного более высоко для NOS (Km=2-20jiM), чем для аргиназы (Кт=1-5 тМ), но максимальная активность аргиназы в тысячу раз превышает таковую у NOS. Оба фермента могут реципг^ктно регулировать активность друг друга [32, 38]. В проведенных ранее исследованиях, метаболизма L-аргинина активированными макрофагами было выявлено, что большинство аргинина расходуется для продукции мочевины, а не NO, и что ингибирование аргиназы или дополнение культуральных сред с L-аргинином приводило к увеличению синтеза оксида азота [49]. Кроме того, ингибирование аргиназы стимулирует синтез N0 в эндотелиальных клетках [73]. По данным ряда авторов за счет своей высокой активности и способности блокировать действие NOS аргиназа способствует нарушению продукции оксида [90], что непременно ведет К развитию дисфункции эндотелия. 1 ъ-п

Один из самых мощных ингибиторов аргиназы - L-норвалин (2-аминопентановая кислота), который является неметаболизирующимся аналогом L-валина [109]. Выраженный ингибирующий эффект на аргиназу, биологическая безопасность делает L-норвалин привлекательным для исследования его способности корректировать ADMA-подобное состояние в эксперименте у беременных животных. Можно предположить, что усиление продукции N0 в эндотелии системных сосудов приведет к снижению клинических проявлений гестоза, а при нормализации ЫО-продуцирующей функции в плаценте улучшится микроциркуляция в ее ткани, что приведет к снижению ишемических явлений и продукции гуморальных факторов, в свою очередь влияющих на системную дисфункцию эндотелия.

Эксперименты проводились на беременных самках крыс массой 250-300 г. Для спаривания животных (2 самца и 3 самки) помещали в отдельную клетку на 24 часа, с последующим рассаживанием. Через 14 суток в условии эфирного сна пальпаторно определяли факт беременности. АОМА-иг цобный агент - 14-нитро-Ь-аргинин-метиловый эфир (Ь-КАМЕ) вводили внутрибрюшинно в дозе 25 мг/кг/сут с 14 по 20 сутки беременности. На 21 сутки беременности под наркозом проводили сосудистые пробы на эндотелийзависимую вазодилатацию и эндотелийнезависимую вазодилатацию с расчетом коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД), исследование микроциркуляции в плаценте. Осуществляли забор образцов для определения 1чГО-продуцируюш,ей функции эндотелия и морфологических исследований.

Анализ полученных данных позволяет сделать вывод о том, что внутрибрюшинное введение блокатора ТчЮ-синтазы АМЕ вызывает у беременных самок крыс комплекс изменений, ассоциированных с АЕ)МА-подобным гестозом. На 21 сутки беременности развивалась выраженная гипертензия, в 2,4 раза увеличивался коэффициент эндотелиальной дисфункции, происходило снижение показателей плацентарной микроциркуляции, снижение концентрации стабильных метаболитов N0 в плазме и наблюдались четко выраженные морфологические изменения в плаценте при морфологическом исследовании. Описанный симптомокомплекс можно соотнести с развитием гестоза в клинических условиях.

Использование для коррекции Ь-МАМЕ-индущ'гованного гестоза препаратов, входящих в стандартную гипотензивную схегЛу лечения гестоза:, приводило к некоторой коррекции возникающих патологических изменений-При введении центрального а2-адреномиметика метилдопы происходило эффективное снижение артериального давления как систолического, так и диастолического, уменьшение протеинурии. При морфологическом исследовании плаценты и почек выявлено отсутствие деструктивных повреждений ишемического генеза, которые наблюдались^группе нелеченых животных. Нужно отметить, что механизм действия метйлдопы не является МО-заинтересованным. Это подтверждается отсутствием влияния на N0-продуцирующую функцию эндотелия и взаимоотношение эндотелийзависимой и эндотелийнезависимой вазодилатации. Гипотензивный эффект связан со стимуляцией центральных симпатических ядер, что приводит к уменьшению периферического тонуса сосудов. Это подтверждает утверждение о вовлечении в патологический процесс при Ь-КАМЕ-индуцированном гестозе не только Ж)-синтезирующей системы, но и других нейрогуморальных механизмов регуляции сосудистого тонуса.

Введение пролонгированной формы антагониста Са2+-каналов дигидропиридинового ряда амлодипина приводило к коррекции взаимоотношения эндотелийзависимых и эндотелийнезависимых механизмов вазодилатации, уменьшению протеинурии и устранению деструктивных повреждений в плаценте и почках. Механизм действия амлодипина связан с активированием супероксиддисмутазы в эндотелиальных клетках, что блокирует разрушение N0 [24, 39]. Имеются литературные данные об улучшении эндотелийзависимой вазодилатации за счет увеличения уровня N0 и увеличения уровня эндотелиальной ИО-синтазы г"?0]. Кроме того, антагонисты Са2+ оказывают ангиопротективный эффект, обусловленный снижением тока Са2+ через Е-каналы. ;

Таким образом, введение животным препаратов, входящих в стандартную гипотензивную схему лечения гестоза, для коррекции Ь-КАМЕ-индуцированного гестоза, приводит к улучшению отдельных показателей, но не приводит к достижению целевого уровня. Становится понятным, что дальнейший поиск подходов к коррекции основного патогенетического звена гестоза требует применения фармакологических агентов с доказанной эндотелиопротективной активностью или использования их в сочетании с препаратами, входящими в стандартную терапию гестоза.

Введение животным фармакологического агента, увеличивающего количество субстрата для синтеза N0, ингибитора аргиназ Ь-норвалина приводило к выраженной коррекции патологических изменений при экспериментальном Ь-ЫАМЕ-индуцированном гестозе. Наблюдалось восстановление взаимоотношения эндотелийзависимой и эндотелийнезависимой вазодилатации, улучшение микроциркуляции в плаценте, восстановление ИО-синтезирующей функции эндотелия, уменьшение протеинурии. При морфологическом исследовании гистологическая картина в плацентарной ткани и почках приближалась к таковой в группе интактных животных.

Механизм действия Ь-норвалина объясняется его структурным сходством с орнитином, являющимся одним из продуктов метаболизма цикла мочевины. Ь-норвалин, ингибируя орнитинтранскарбамилазу, приводит к избыточному накоплению орнитина, который, в свою очередь, ингибирует аргиназу [109].

I. арги! \ь\\ I.- Цитрулин

Ь-КММА,

АОМА у

Рис. 44. Схема воздействия ингибитора аргиназ Ь-норвалина на фармакологическую мишень «АЬ)МА-еЫ08»

Вследствие того, что NOS и аргиназа конкурируют за общий субстрат, д.* ri* это приводит к увеличению возможности использования L-аргинина для синтеза N0. Кроме этого, L-норвалин ингибирует аргининосукцинатсинтазу, что приводит к усилению синтеза L-аргинина из цитрулина. В конечном итоге механизм действия сводится к восстановлению NO-синтезирующей функции и уменьшению дисфункции эндотелия (рис. 44).

Более выраженные эффекты при коррекции морфофункциональных нарушений в условии L-NAME-индуцированного экспериментального гестоза фармакологическим агентом с доказанной эндотелиопротективной активностью L-норвалином и препаратами, входящими в стандартную терапию, связаны с различными точками приложения механизма действия препаратов.