Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Иммунологические аспекты ожоговой болезни в клинике и эксперименте

003484081

На правах рукописи

/

Тарасов Алексей Евгеньевич

Иммунологические аспекты ожоговой болезни в клинике и эксперименте

14.00.36 - Аллергология и иммунология Автореферат

диссертации на соискание ученой степени ^ д НОЯ кандидата медицинских наук ' ;

Владивосток - 2009

003484081

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Владивостокский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию», Федеральном государственном учреждении «Дальневосточный окружной медицинский центр Федерального медико-биологического агентства»

Научный руководитель:

Доктор медицинских наук, профессор Маркелова Елена Владимировна Научный консультант:

Доктор медицинских наук, доцент Усов Виктор Васильевич Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, доцент Скляр Лидия Федоровна - доцент кафедры инфекционных болезней ГОУ ВПО «ВГМУ Росздрава».

Кандидат медицинских наук, доцент Васильева Маргарита Михайловна - заведующая краевым центром клинической иммунологии и аллергологии ГУЗ ККБ № 1, главный аллерголог-иммунолог министерства здравоохранения Хабаровского края, заведующая кафедрой гастроэнтерологии и клинической лабораторной диагностики ГОУ ВПО и ИПКСЗ министерства здравоохранения Хабаровского края г.Хабаровска.

Ведущая организация:

ГОУ ВПО «Омская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита состоится « ^¿^-о сД-л 2009 г. в /о часов на заседании диссертационного совета ДМ.20$.007.02 при ГОУ ВПО «ВГМУ Росздрава» по адресу: 690002, г. Владивосток, ГСП, проспект Острякова, 2 (главный корпус)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «ВГМУ Росздрава» по тому же адресу (корпус 3)

автореферат разослан «_ Г А 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, // л доктор медицинских наук, доцент

Шаркова В.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность работы: Проблема ожоговой травмы актуальна как для мирного, так и для военного времени. По данным ВОЗ термические поражения занимают 3 место среди прочих травм, в России на их долю приходится 10-11%. По длительности и тяжести течения ожоговая болезнь лидирует среди различных вариантов травматической болезни. Огромны материальные затраты на лечение больных, высок процент инвалидизации. Обращает внимание увеличение числа тяжелых термических травм с 35,7% 1990 г до 41,4% 2003 г (Колизец Г.П. с соавт., 2003). Подобная закономерность отмечается и в Приморском крае (Горшеев А.Н., 2007).

Считается, что ожоговая травма с поражениями более 10-15% поверхности тела сопровождается развитием ожоговой болезни (ОБ) и неспецифического синдрома воспалительного ответа, которые часто приводят к синдрому полиорганной недостаточности (Клигуненко E.H. с соавт., 2005; Спиридонова Т.Г., 2007; Mythu, Kuzhali et. al., 2008). Разрушающее термическое действие на ткани с поражением нервной системы приводит к шоку с последующим развитием комплекса патологических процессов (Кузин М.И., 2000; M.Bertin-Maghit, 2000; Venakatachalapathy T.S., 2007). Летальность при острой ожоговой токсемии может достигать 40-55%, а в стадию септикотоксемии - 45-65% (Медников Р.В., 2002).

В то же время, ОБ следует рассматривать как иммунодефицитное заболевание, при котором отмечается раннее и продолжительное снижение показателей врожденного и приобретенного иммунитета (Черешнев В.А. с соавт., 2008; D'Arpa N. et.al., 2007). Необходимо учитывать, что иммунный ответ у тяжело-обожженных развивается на фоне острейшего дефицита энергетических и пластических ресурсов (Смирнов B.C., 2000).

Иммунный статус больных с тяжелой термической травмой формируется на фоне большого числа иммуносупрессивных факторов: обширного повреждения кожи как иммунного органа, стресса во время травмы, воздействия огромного количества токсинов обожженных тканей, усиления пероксидации липи-дов и нарушения структуры мембранных систем клеток, воздействия антибио-тикотерапии, многократных наркозов во время перевязок и операций аутодер-мопластики (Колизец Г.П. с соавт., 2003; Обыденникова Т.Н. с соавт., 2003; Усов В.В. с соавт., 2005).

Нарушение цитокинового баланса организма рассматривается в последнее время как важный механизм развития гнойной инфекции и сепсиса (Гординская H.A., 2004; Симбирцев A.C., 2009; KiddP., 2003).

На сегодняшний день имеется незначительное число работ, посвященных комплексному изучению состояния иммунной системы у обожженных и роли их нарушений в патогенезе ОБ и ее осложнений. Дальнейшее изучение имму-нопатогенеза, изменений в системе цитокинов - важнейших факторов врожденного иммунитета при ожоговой травме является одним из актуальных и перспективных направлений в комбустиологии. Понимание последовательности и выраженности иммунных нарушений, происходящих в организме больных с

ожоговой болезнью, позволит оптимизировать патогенетическую терапию, снизить количество осложнений и летальность в поздние периоды ОБ. Цель исследования: выявить закономерности цитокиновой регуляции на разных стадиях ожоговой болезни в клинике и на экспериментальных животных, и дать экспериментальное обоснование иммунотропной терапии. Задачи исследования:

1. Определить уровни цитокинов ИЛ-2, 3, 8, 12(р70, р40), 10, ИФНу, ФНОа, гранулацитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) и растворимых рецепторов I типа ФНОа и рр ИЛ-2 в сыворотке крови обследуемых.

2. Определить уровни острофазных белков (С-реактивного белка, а1-кислого гликопротеина, а 1-антитрипсина) в зависимости от тяжести и периода ОБ в клинике.

3. Разработать дополнительные иммуно-биохимические критерии определения тяжести и предикторы неблагоприятного прогноза у ожоговых больных.

4. Смоделировать ожоговую болезнь на экспериментальных животных и определить качественно-количественные показатели фагоцитоза (ФИ, ФЧ) и состояние кислородзависимых механизмов бактерицидности лейкоцитов (НСТ-тест).

5. Определить уровни цитокинов (ИФНу и ИЛ-10) в сыворотке крови мышей и уровни продуктов ПОЛ (первичных - диеновых конъюгатов, и вторичных -триенкетонов) и супероксиддисмутазы в динамике болезни в эксперименте.

6. Оценить иммунологическую эффективность иммуномодулятора пептидной природы (ганглиина) при ожоговой болезни в эксперименте.

Научная новизна исследований:

Расширены представления о патогенетической роли иммунных нарушений у обожженных. Определены наиболее информативные иммунологические маркеры воспаления, которые можно использовать в диагностике, прогнозе и оценке эффективности терапии.

Установлено недостаточное включение противовоспалительной защиты на фоне системной воспалительной реакции (стабильный уровень ИЛ-10 на уровне контроля) и недостаточная активация защитно-приспособительных реакций (а1-АТ, особенно, в группе тяжелообожженных к концу 3 недели).

Дано экспериментальное обоснование иммуномодулирующей терапии ганглиином в ранние периоды ОБ. Отмечено позитивное влияние ганглиина на показатели фагоцитоза за счет усиления функциональной активности фагоцитов. Применение ганглиина не защищает от окислительного стресса, но оказывает модулирующее действие уже в раннем периоде, обеспечивая одновременное увеличение как первичных так и вторичных продуктов ПОЛ. Практическая значимость работы: Проведенный комплексный анализ цито-кинового профиля и острофазного ответа выявил различия и закономерности иммунного ответа в зависимости от тяжести и периода ОБ. Дефицит ИЛ-2 в первые периоды ожоговой болезни (1-3,10-14 сутки) на фоне увеличения рр ИЛ-2 приводит к снижению активации ТЫ типа и усилению активационно-ин-дуцированного апоптоза. Длительное и значительное повышение СРБ также

способствует превалированию ТЬ2 типа иммунного ответа, что не является целесообразным защитно-приспособительным механизмом.

Разработаны дополнительные диагностические и прогностические критерии характера течения ожоговой болезни. Дефицит ИФНу и, как следствие, усугубление дефекта Т-хелперов 1 типа является прогностическим предиктором развития гнойно-септических осложнений и сепсиса (х2=4,86). СРБ > 50г/л является дополнительным критерием тяжести больного на 10-14 и 21 сутки. Установлена сопряженность высокой степени низкого содержания ГМ-КСФ < 5 пг/мл (х2=14,726) и ИЛ-12р70 < 2пг/мл (%2=17,769) в 1-3 сутки, и высокого уровня ИЛ-8 >300 пг/мл (% =7,957) на 21 сутки и СРБ > 100 г/л у тяжелообож-женных на 10-14 сутки (х2=4,126) с неблагоприятным прогнозом.

Установлена прямая корреляционная связь между СРБ и ФНОа (г =0,6), СРБ и ИЛ-8 (г =0,8), а также отрицательная зависимость СРБ и ИЛ-2 (г=-0,58) и СРБ и ИНФу (г=-0,53), что свидетельствует о длительном некомпенсированном системном воспалительном ответе у тяжелообожженных.

На основе результатов исследования разработаны и внедрены в учебный процесс ГОУ ВПО «ВГМУ Росздрава» (г. Владивосток), ГОУ ВПО «ДВГМУ Росздрава» (г. Хабаровск) методические рекомендации: «Дополнительные диагностические критерии тяжести и прогноза течения ожоговой болезни». В лечебно-диагностический процесс краевого ожогового отделения ФГУ «ДВОМЦ ФМБА России» (г. Владивосток) внедрены методы диагностики и рекомендовано включение иммуномодулирующей терапии у больных с ожоговой болезнью.

Апробация материалов работы:

Основные положения диссертации были представлены на конгрессах и конференциях международного, российского и регионального уровня:

- Международный форум молодых ученых и студентов.Турция,г.Анталия, 2004;

- III конференция «Фундаментальные и прикладные исследования в медицине». Греция, г. Лутраки, 2005;

- III научная конференция с международным участием «Приоритетные направления развития науки, технологий и техники». Египет, г. Хургада, 2005;

- XII российский национальный кошресс «Человек и лекарство». Москва, 2005;

- V Конференция молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины», Москва, 2008;

- II съезд комбустиологов России, Москва, 2008;

- VI, VII и IX Тихоокеанской научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием. Владивосток, 2005,2006, 2008. Публикации: По материалам диссертации опубликовано 16 научных работ, в том числе 1 статья в изданиях, рекомендованных ВАК; 1 методические рекомендации.

Структура н объем диссертации:

Диссертационная работа изложена на 141 странице компьютерного текста, иллюстрирована 22 таблицами и 5 рисунками.

Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 3 глав, содержащих результаты собственных исследова-

ний, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающего 160 источников отечественной и 57 зарубежных авторов. Основные положения, выносимые на защиту:

1. Ожоговая болезнь характеризуется развитием выраженного системного воспалительного ответа. Динамика провоспалительных и колониестиму-лирующих цитокинов при ОБ свидетельствует о гиперактивации фагоцитирующих клеток и вовлечении в иммунный ответ эпителиальных и эн-дотелиальных клеток.

2. У тяжелообожженных не происходит адекватного включения противовоспалительной защиты и недостаточна активация защитно-приспособительных реакций. Длительная гиперпродукция СРБ при тяжелом течении ожоговой болезни способствует превалированию ТЬ2 типа иммунного ответа и свидетельствует о длительном некомпенсированном системном воспалительном ответе.

3. На модели ОБ в эксперименте показано, что применение ганглиина не защищает животных от окислительного стресса, но оказывает модулирующее действие на процессы ПОЛ и фагоцитоза, влияя на уровень ИЛ-10, обладающего выраженными противовоспалительными свойствами.

Личный вклад автора в проведённое исследование. Лично диссертантом был разработан план и проведена серия экспериментов по воспроизведению ОБ, выполнена оценка фагоцитарной активности нейтрофилов, кислородзави-симых механизмов бактерицидности и функциональных возможностей лейкоцитов, определен уровень содержания продуктов ПОЛ и уровень СОД, проведена оценка эффективности применения ганглиина в эксперименте.

В клинике диссертант непосредственно участвовал в обследовании и лечении большинства пострадавших, включенных в исследование, самостоятельно провел аналитический обзор отечественной и зарубежной литературы по изучаемой проблеме, составил программу исследования, разработал карты обработки медицинских документов, сбор и анализ данных, статистическую обработку материалов, оформление диссертации. Количественная оценка цитокинов проводилась в лаборатории неинфекционного иммунитета ТИБОХ ДВО РАН под контролем к.х.н., с.н.с. Чикаловец И.В.

СОДЕРЖАНИЕ, РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы: Экспериментальная часть нашей работы выполнена на 100 самцах мышей-гибридов линии (СВАхС57В4)Р1 массой 18-20 грамм. Животных содержали в виварии в соответствии с «Санитарными правилами по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник». Кормили в соответствии с нормами, утвержденными приказом МЗ РФ от 10.03.1996 г. №163. Исследовали животных в соответствии с Правилами проведения работ и использования экспериментальных животных (Приложение к приказу МЗ СССР №755 от 12.08.1977).

Все экспериментальные и клинические исследования проведены с разрешения комитета по биомедицинской этике ГОУ ВПО «ВГМУ Росздрава» (протокол № 8 дело № 61 от 21.05.2007).

Для моделирования ожоговой болезни мышам наносили глубокий ожог. Под эфирным наркозом с участков кожи спины и боковых поверхностей туловища выбривали шерсть, депилировали, обмывали теплым физиологическим раствором и вытирали насухо. Далее наносили термический ожог контактным методом. Получали ожоговую рану площадью 30% поверхности тела, глубиной ЗБ степени. Площадь рассчитывали по формуле Мее-Рубнера (Кочетыгов Н.И., 1973): S=K« W273, где S - поверхность тела в квадратных сантиметрах, К - коэффициент для мышей 11,4, W - вес животного в граммах.

Для выполнения поставленных задач было поставлено 2 серии опытов по 40 особей в каждой: 1 серия - животные получали термический ожог 30% поверхности тела, после чего внутрибрюшинно получали 0,5 мл 0,9% NaCl (группа сравнения);

2 серия - животные получали термический ожог 30% поверхности тела, после чего внутрибрюшинно им вводили ганглиин из расчета 0,1 мг/кг массы тела в 0,5 мл 0,9% NaCl (опыт или основная группа).

3 группа животных (20 особей) - служила контролем.

В эксперименте использовалась биологически активная добавка ганглиин, применяемая в ветеринарии (соответствует биологически активной добавке «Тинростим-СТ», Эпштейн Л.М. с соавт., Пат. 2222337,2004).

Ганглиин вводили внутрибрюшинно из расчета 0,1 мг/кг массы тела. Стандартизация дозы препарата, равноэффективной для мышей, в зависимости от массы тела и относительной площади его поверхности рассчитывали по формуле Мее-Рубнера (Кочетыгов Н.И., 1973).

Защитный эффект тинростима изучали по интегральным показателям, характеризующим состояние факторов врожденного иммунитета: выживаемости мышей, получивших ожог и средней продолжительности жизни. Процент (%) выживаемости, вычисляли по формуле: (число выживших мышей /суммарное число выживших и погибших мышей) х100%; среднюю продолжительность жизни (СПЖ) по формуле: сумма продолжительности жизни всех мышей/число мышей в группе.

В крови проводили исследование: фагоцитарной активности нейтрофилов (Караулов A.B. с соавт., 1999) с помощью полистерольного латекса (определяли индекс Гамбургера (ИГ) — процент фагоцитирующих нейтрофилов и индекс Райта (ИР) - среднее число частиц фагоцитированных каждым нейтрофилом), оценку кислородзависимых механизмов бактерицидности и функциональных резервных возможностей нейтрофилов (НСТ-тест) (Хаитов P.M. с соавт., 1995), содержание продуктов перекисного окисления липидов определяли по методу И.А. Волчегорского (1989), состояние антиоксидантной системы оценивали, определяя супероксиддисмутазу (СОД) в эритроцитах по методу Е.В. Макаренко (1988), уровень продукции ИНФ-у и ИЛ-10 определяли с помощью специфических реактивов для мышей фирмы «R&D Diagnostics Inc.» (mouse duoset, USA), методом сендвич-варианта твердофазного ИФА, на иммунофер-ментном анализаторе Multiscan RS "Labsystems" (Финляндия) согласно прилагаемой инструкции.

Клинические и лабораторные данные исследованы у 84 больных с ожоговой травмой и развившейся ожоговой болезнью в возрасте от 19 до 58 лет. Средний возраст больных составил 38,3±1,2 года. Большая часть обследованных была представлена лицами мужского пола (62чел/73,8%). Женщины составляли 26,2% (22чел). Все пострадавшие, согласно классификации ВОЗ, были распределены на 2 возрастные группы: от 18 до 44 лет (46чел/54,8%) и от 45 до 60 лет (38чел/45,2%). При диагностике глубины ожогов использовали принятую в России четырехстепенную классификацию, при этом учитывали комплекс данных, при расспросе пострадавших, при осмотре (цвет кожи и обнаженной дермы, наличие пузырей; наличие струпа, его цвет, плотность и подвижность), а также при проведении диагностических проб.

При определении площади ожогов использовали «правило девяток», «правило ладони», таблицы Г.Д. Вилявина. Критериями тяжести термической травмы были общая площадь поражения, глубина ожогов (I, II, IIIA, ШБ, IV), наличие или отсутствие термоингаляционной травмы. Тяжесть ожоговой травмы оценивали по индексу Франка (ИФ), где 1% поверхности ожога I-IIIA степени - 1 единица, а 1% - ШБ, IV - 3 единицы. При сочетании травмы с поражением дыхательных путей, ИФ увеличивали на 15-30ед. Согласно индексу Франка все больные были распределены на 2 группы: ИФ от 30 до 59 ед. - с сомнительным прогнозом (23чел/27,4%) и ИФ свыше 60 ед. - с неблагоприятным прогнозом - 61 чел/72,6%.

Дополнительно в динамике оценивали состояние больных по клиническим данным, тяжесть течения ожоговой болезни, наличие осложнений. Состояние больных оценивали исходя из клинико-лабораторных стандартов принятых в краевом ожоговом отделении ФГУ «ДВОМЦ ФМБА России» (физикальные методы, клинический и биохимический анализы крови, исследование системы гемостаза, электрокардиография, рентгенография органов грудной клетки).

Исходя из особенностей течения ожоговой болезни, забор крови производили на 3, 10-14 и 21 сутки. На каждого больного заполняли карту информированного согласия о включении в обследование (утверждено этическим комитетом ГОУ ВПО «ВГМУ Росздрава» (протокол № 8 дело № 61 от 21.05.2007)). Для иммунологических исследований использовали периферическую кровь больных, забор крови проводили в равных условиях (утром, натощак).

В комплекс лабораторного обследования больных помимо выше перечисленных общеклинических методов, включали оценку показателей цитокино-вого профиля (ФНОа, ИЛ-2, 3, 8, 10, 12 (р70, р40), ГМ-КСФ, ИФНу, а также растворимые рецепторы (рр I ФНОа и рр ИЛ-2)) и уровня острофазных белков (СРБ, al-КГП, al-AT).

Концентрацию цитокинов (ФНОа, ИЛ-2, 3, 8, 10, 12 (р70, р40), ГМ-КСФ, ИФНу, а также растворимые рецепторы (рр I ФНОа и рр ИЛ-2)) в сыворотке крови больных и людей контрольной группы определяли методом твердофазного ИФА с использованием коммерческих тест-систем «R&D Diagnostics Inc.» (США), на Multiscan RC «Labsystems», в соответствии с инструкцией.

Определение концентрации СРБ и а 1-антитрипсина проводилось с использованием реактивов «Sentinel Diagnostics» (Германия) спектрофотометрически

при длине волны 340 нм микрометодом в нашей модификации (рационализаторское предложение ВГМУ № 2380 от 5.06.2000).

Определение концентрации а1-КГП проводили методом ИФА по методике, описанной Т. ЕгщуаП на тест-системах фирмы «Рупа1есЬ» (Германия), измеряли на спектрофотометре фирмы «МиШзсап» (Финляндия), в соответствии с прилагаемой инструкцией.

Для статистической обработки полученных данных проводили оценку параметрических ^-критерий Стьюдента) и непараметрических (\У-критерий Вилкоксона, г-критерий Манна-Уитни) показателей, для определения направления и формы связи между отдельными качественными признаками, использовали метод кроме того, определяли коэффициент корреляции Пирсона и непараметрический коэффициент ранговой корреляции Спирмена с помощью программы «Биостат» (версия 4.03).

Динамика цнтокинового профиля у больных с ожоговой болезнью.

В опубликованных различными авторами результатах исследований представлены неоднозначные данные по уровню и динамике про- и противовоспалительных цитокинов после ожоговой травмы и чаще использована оценка ограниченного количества параметров цитокинового статуса (Конненков В.И. с соавт., 2007). Производя отбор параметров цитокинового статуса нами было учтено, что при «классическом» воспалении основным источником цитокинов являются лейкоциты и макрофаги воспалительного инфильтрата, а при системном воспалении (СВР), лежащим в основе ожоговой болезни, - активированные эндотелиоциты и сосудистые макрофаги, что определяет более высокий уровень цитокинемии и требует исследования комплекса параметров, отражающих процессы активации разных клеток-мишеней. Для этих целей при СВР Е.Ю. Гусев с соавт. (2008) предлагали анализировать ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10 и ФНОа. Мы посчитали целесообразным расширить этот спектр и включили в настоящее исследование определение ФНОа, ИЛ-3, ГМ-КСФ, ИЛ-8, ИЛ-2, ИФНу, ИЛ12(р70 ир40) иИЛ-10.

Полученные нами данные свидетельствуют о существенном увеличении ранних провоспалительных цитокинов в крови больных. Нами выявлено увеличение ФНОа от 3 до 100 раз, 3-4 кратное нарастание его растворимого рецептора I типа и 5-20 кратное повышение уровня ИЛ-8. Значительно возрастало также содержание ГМ-КСФ. Это свидетельствует о гиперактивации фагоцитирующих клеток и вовлечении в иммунный ответ эпителиальных и эндотели-альных клеток. Остальные исследованные медиаторы изменялись мало. Можно лишь отметить тенденцию к снижению содержания ИЛ-2 и, напротив, к увеличению его растворимого рецептора. Нами не выявлено существенного различия показателей цитокинового профиля у мужчин и женщин (таблица 1).

Как указывалось нами, все пациенты были распределены по тяжести состояния на 2 группы: средняя тяжесть (с ИФ от 30 до 59) и тяжелообожженные (с ИФ от 60 и выше). Оценка цитокинового профиля больных этих групп в динамике, соответствующей разным периодам ожоговой болезни, позволила выявить целый ряд особенностей. Оказалось, что больные с ожогами ИФ 30-59 в ранний период имели повышение ФНОа в 1,5-2 раза меньше, чем тяжело-

обожженные (19,00±5,21 пг/мл против 43,61±16,32 пг/мл, р>0,05) с постепенным снижением уровня этого цитокина в динамике. А на 21 сутки уровень ФНОа, хотя и оставался повышенным по сравнению с контрольной группой, но был статистически значимо ниже, чем у тяжелообожженных (6,18±2,10 пг/мл против 0,59±0,32 пг/мл и 34,78±14,60 пг/мл). В то же время уровень растворимого рецептора ФНОа I типа у больных с ИФ 30-59 был достоверно выше не только по сравнению с контрольной группой, но и с группой тяжелообожженных больных в период ожогового шока и острой ожоговой токсемии и только на 21 сутки содержание рр I ФНОа снижалось, статистически не отличаясь от группы тяжелообожженных, но в 2-2,5 раза превышая контрольные значения. Вероятно, это один из важных механизмов ограничивающих функциональную активность ФНОа на фоне гиперпродукции последнего.

Таблица 1

Уровень цитокинов и их растворимых рецепторов у больных в ранний период ОБ

Исследуемые показатели Г руппы обследованных (М±т, пг/мл) Статиста ческая цостовер иость раз пичий р1

Контрольная группа п=50 Больные с ожоговой гравмой п=84 Группа мужчин п=62 Группа женщин п=22

ФНОа 0,59±0,32 30,64±10,26** 48,56±15,80*** 28,64±12,00** >0,05

рр1ФНОа 390,11±38,04 1096,34±43,21*** 1194,30±30,60*** 996,15±80,22** <0,05

ИЛ-3 4,83±0,27 5,24±0,88 4,99±1,10 5,62±0,95 >0,05

ГМ-КСФ 10,85±2,75 20,42±3,16* 22,20±4,35* 20,83±3,15* >0,05

ИЛ-8 5,47±1,49 89,47±27,11** 96,78±30,82** 86,00±36,92* >0,05

ИЛ12р7С 7,29±1,98 20,63±2,76*** 24,18±4,12*** 18,64±3,05** >0,05

ИЛ12р4С 151,84±39,23 168,17±20,34 158,32±15,00 186,39±36,40 >0,05

Кр70/40 0,05±0,01 0,13±0,02** 0,14±0,02*** 0,12±0,03* >0,05

ИЛ-2 1,85±0,56 0,8±0,3 0,62±0,09 1,00±0,40 >0,05

ррИЛ-2 559,18±12,18 728,64±79,06* 698,15±40,36*** 824,82±124,50* >0,05

ИФНу 17,67±2,63 24,68±8,15 20,86±7,14 28,52±10,61 >0,05

ИЛ-10 16,64±2,09 24,81±5,12 22,81±4,06 26,17±8,82 >0,05

Примечание: статистическая достоверность различий с контрольной группой: р<0,05 - *, р<0,01 - **, р<0,001 - ***, р1 - статистическая достоврность различий между мужчинами и женщинами

Содержание и динамика исследованных колониестимулирующих факторов (ИЛ-3 и ГМ-КСФ) также было различным у обожженных двух групп. У больных со средней степенью тяжести их уровень в 1-3 сутки был статистически значимо повышен, превышая контрольные значения в среднем в два раза с последующим умеренным (в 1,5-2,5 раза) увеличением к 10-14 суткам и таким же снижением к 21 суткам. Уровень ИЛ-8 в ранний период после термической травмы у пациентов с ИФ 30-59 был статистически значимо повышен, с последующей стабильной динамикой на 10-14 сутки и снижением на 21 сутки.

В 1-3 сутки ОБ зарегистрировано также повышение важного цитокина макрофагального происхождения ИЛ-12р70 (38,42±15,00 пг/мл против 7,29±1,98 пг/мл в контроле, р<0,05) тогда как уровень ИЛ-12р40 практически не отличался от референсных величин (188,34±30,46 пг/мл против 151,84±39,23

пг/мл; р>0,05), что обеспечивало существенное увеличение коэффициента соотношения ИЛ-12р70 к ИЛ-12р40. В последующем определялось снижение уровня ИЛ-12р70 и регуляторного коэффициента. Как отмечено в работах И.С. Фрейдлин (2001, 2007) подобная динамика характерна для острых инфекций и травмы, в том числе термической.

Важным было оценить уровень и динамику цитокинов, отражающих активацию и функцию ТЫ и ТЬ2 типа. У больных с термической травмой с ИФ 3059 в ранние сроки установлена тенденция к снижению ИЛ-2, статистически значимое снижение уровня растворимого рецептора ИЛ-2 в сыворотке крови. Последнее нами расценено как компенсаторный механизм на фоне относительной недостаточности ИЛ-2 - важного ростового фактора Т-лимфоцитов. На этом фоне значение ТЫ маркерного цитокина (ИФНу) мало отличалось от контрольных показателей. В динамике на 10-14 сутки зафиксировано только статистически значимое двукратное повышение уровня ИЛ-10 (48,69±7,24 пг/мл против 20,47±9,16 пг/мл; р<0,05). А к концу третьей недели его количество снижалось, не достигая, однако, уровня контрольной группы.

В группе тяжелообожженных больных (ИФ 60 и выше) в период ожогового шока выявлено увеличение уровня ФНОа - основного медиатора системной воспалительной реакции, а также его растворимого рецептора, через который опосредуется и усиливается апоптоз ТЫ типа, что вероятно, приводит к иммунодефициту, связанному с нарушением клеточного иммунитета и антителооб-разования. Одновременно фиксировали повышение уровня и ИЛ-8, избыточная продукция которого стимулирует гиперактивность нейтрофилов. Свойства ИЛ-8 вызывать миграцию клеток и способность их к адгезии, определяют его как активного участника острой воспалительной реакции. Ферменты, высвобождающиеся из погибших нейтрофилов, вызывают повреждение тканей, что является дополнительным фактором утяжеления интоксикации и развития синдрома полиорганной недостаточности. Установлена прямая корреляционная связь между уровнем ИЛ-8 и лейкоцитарным индексом интоксикации (1=0,6; р<0,05). В то же время выявлен дефицит ИЛ-2, что ведет к снижению активации ТЫ типа и усилению их апоптоза. Значения других исследованных медиаторов мало отличались от контрольных величин.

На 10-14 сутки после травмы зафиксировано усугубление дефекта ТЫ, характеризующегося дефицитом ИФНу, что является прогностическим предиктором развития гнойно-септических осложнений и сепсиса (%2=4,86, р<0,01). Отмечена гиперпродукция ФНОа и рр I типа ФНОа, ИЛ-8. На фоне сохраняющегося дефицита ИЛ-2 выявлено достоверное увеличение содержания рр ИЛ-2. Таким образом, происходит нарушение передачи сигнала, опосредованного ИЛ-2, как вследствие избыточного связывания ИЛ-2 с растворимыми рецепторами, так и формирования индуцированной анергии из-за потери ТЬ этих рецепторов. Таким образом, в стадию острой ожоговой токсемии формируется глубокий количественный и функциональный иммунодефицит Т-клеточного звена иммунитета.

К концу третьей недели определили сохраняющуюся гиперпродукцию провоспалительных цитокинов: ФНОа, ИЛ-8, растворимых рецепторов рр I

ФНОа, ррИЛ-2 и дефицит ИЛ-2. Повторный подъем уровня ИЛ-8 у тяжело-обожженных больных можно объяснить присоединением вторичных инфекций и развитием септикотоксемии. Выявленный дефицит ИЛ-3 свидетельствует о глубоком угнетении пролиферации всех клеток кроветворения, в том числе красного кровяного ростка. При проведении корреляционного анализа в этот период установлена прямая корреляционная связь средней силы (г=0,53; р<0,05) между ИЛ-3 и количеством эритроцитоа О тенденции к восстановлению функции ТЫ свидетельствует некоторое увеличение содержание в крови ИФНу.

Содержание противовоспалительного цитокина - ИЛ-10 у пациентов этой группы на протяжении всего периода исследований было стабильным (27,57±7,31 пг/мл - 24,40±7,85 пг/мл) и статистически значимо не отличалось от контрольной группы, что свидетельствует о том, что на фоне активации системной воспалительной реакции не происходит включения системы противовоспалительной защиты у больных с тяжелым течением ОБ.

Среди обследованных нами людей с термической травмой умерли 6 человек (летальность - 7,14%). Все с ИФ>60, следовательно, в группе тяжелообож-женных летальность 9,84%. Для анализа сопряженности нарушений в системе цитокинов и летального исхода нами был применен метод Учитывая, что одним из ведущих медиаторов воспалительного ответа большинством авторов признается ФНОа, мы ретроспективно оценили его уровень в группах выживших и умерших с тяжелой ожоговой травмой на 1-3 сутки. Проведенный анализ не выявил сопряженности высокого уровня ФНОа и летального исхода (%2=0,946, р=0,33). Оценка коэффициента сопряженности в 1-3 сутки после ожога уровня ИЛ-8 и летального исхода также не выявила их взаимосвязи (Х2=0,037, р=0,646). Оценивая медиаторы, усиливающие функцию, преимущественно, клеток макрофагального происхождения - ГМ-КСФ и ИЛ-12р70 установили сопряженность низкого уровня этих цитокинов в ранний период после ожоговой травмы с неблагоприятным исходом. Степень сопряженности высокая и статистически значимая (ГМ-КСФ %2=14,726, р=0,0001 и ИЛ-12р70 Х2=17,769, р=0,00001). Учитывая изменения значений ИЛ-8, нами проведена оценка сопряженности его высоко уровня и летального исхода в динамике. Полученные данные позволяют констатировать сопряженность высокого уровня ИЛ-8 (>300пг/мл) у больных ожоговой болезнью на 21 сутки исследования с неблагоприятным исходом (х2=7,957, р=0,005).

Характеристика острофазного ответа у больных с ожоговой болезнью.

Для анализа из большой группы реактантов острой фазы было выбрано 3 протеина. Из класса I - СРБ и а1-кислый гликопротеин, первый из которых относится в норме к группе минорных (у здоровых людей практически не определяется), а при воспалении - к группе сильных белков. А второй - к группе белков средней силы. Гены белков этого класса регулируются ФНОа, ИЛ-1 и ИЛ-6. Из класса II определяли а 1-антитрипсин, относящийся к группе средних белков, индуцируемых ИЛ-6, но не ИЛ-1.

Выявлено существенное увеличение (в 500 раз) количества СРБ в ранний период ожоговой болезни. Его содержание снижалось у больных к 10-14 суткам почти в 3 раза и оставалось на близком уровне до 21 суток. При этом и к 21 дню

значения оставались в 200 раз выше, чем у здоровых людей. СРБ относится к факторам врожденного иммунитета и благодаря сродству к фосфолипидам мембран участвует в элиминации поврежденных клеток из организма. При этом его цитотропная активность распространяется на клетки, участвующие в ранних реакциях защиты (нейтрофилы, моноциты) и на лимфоциты.

Анализ изменений СРБ проведен у больных с разной степенью тяжести ОБ. В ранний период установлена однотипная реакция в обеих группах: резкое повышение (184,83±39,31 г/л и 202,17±22,06 г/л против 0,32±0,07 г/л). В дальнейшем у обожженных средней степени тяжести СРБ снижался к 10-14 суткам (более чем в 5 раз) и продолжал снижаться к 21 суткам. У тяжелообожженных СРБ к 10-14 суткам снижался лишь в 2 раза, а на 21 день зафиксирована тенденция к повторному повышению. При этом его уровень был в сотни раз выше, чем в контрольной группе и в десять раз превышал уровень у пациентов средней степени тяжести (рис.1). Несмотря на многочисленные позитивные механизмы действия СРБ, длительная (3 недели) его гиперпродукция у больных с тяжелой ОБ способствует превалированию ТЪ2 типа иммунного ответа, что нельзя считать целесообразным защитно-приспособительным механизмом, особенно в период септикотоксемии. Это также подтверждается корреляционными взаимосвязями в данном периоде: прямая средней силы связь между уровнем СРБ и ФНОа (г=0,6, <0,05), сильная связь между СРБ и ИЛ-8 (г=0,82, <0,01) и отрицательная зависимость с ИЛ-2 (г=-0,58, <0,05) и ИФНу (г=-0,53, <0,05). Полученные данные свидетельствуют о длительном некомпенсированном системном воспалительном ответе у тяжелообожженных больных, что позволяет считать высокий уровень СРБ одним из дополнительных критериев тяжести больного с ожоговой травмой: на 10-14 и 21 сутки СРБ>50 пг/мл (%2=6,42, р<0,002, при 2 степенях свободы).

202.17

36,31

92,42

ж

100,82

10,92 ,,. ВВ8ВВ

И И Ф 30-59 □ И Ф>60

1-3 сутки 10-14 сутки 21 сутки

Рис. 1. Динамика СРБ (г/л) у больных с разной степенью тяжести ОБ.

Основными биологическими эффектами al-кислого гликопротеина (al-КГП) являются: способность связывать гистамин, ингибировать агрегацию тромбоцитов, взаимодействовать с фосфолипидами мембран. Он обладает также иммунокоррегирующими свойствами: предотвращает агрегацию нейтро-филов, снижает активность NK-клеток, нарушает киллинг поверхностных иммуноглобулинов, уменьшает образование супероксидных радикалов, in vitro стимулирует пролиферацию клеток. Это позволяет считать, что al-КГП обладает широким спектром биологических свойств, способных ограничивать патологический процесс. По данным литературы пик концентрации al-КГП (при

механической травме и ожогах) отмечается не ранее 3-4 суток (Соломатин В.В., 1992). По нашим данным, двукратное увеличение концентрации а1-КГП определяется уже на 1-3 сутки и нарастает к 10-14 в 1,5 раза, оставаясь на близком уровне к 21 дню. При этом в ранний период после травмы значения а1-КГП увеличиваются в обеих группах ожоговых больных, хотя у тяжелообожженных существенно выше (2,15±0,03 г/л против 0,89±0,15 г/л, р<0,001 в группе ИФ>60; 1,77±0,32 г/л против 0,89±0,15 г/л р<0,001 в группе ИФ 30-59). Эти различия сохраняются и к 10-14 суткам (2,91±0,33 г/л против 1,84±0,21 г/л) и только к 21 суткам уровень острофазного белка становится практически равным, в обеих основных группах, превышая значения контроля в 2 и более раз. Таким образом, оценка содержания а1-КГП в сыворотке крови больных ОБ (на 10-14 сутки) с уровнем превышающим 2,1 г/л служит дополнительным признаком тяжести состояния больного (рис. 2).

а 1-антитрипсин (а1-АТ)-гликопротеид, относится к а 1-глобулинам, составляя около 90% их фракции, и дает около 90% антитрипсиновой активности сыворотки крови. Для начальных стадий острого воспаления обычно характерно снижение а1-АТ, вслед за этим происходит повышение концентрации, связанное с увеличением синтеза этих белков, характер изменений не зависит от локализации процесса, а обусловлен тяжестью его течения (Назаров ПП, 2001).

По нашим данным, у больных в ранний период ОБ количество а1-АТ повышается, но незначительно (2,40±0,12 г/л против 2,0±0,25 г/л в контроле). Существенное повышение отмечалось к 10-14 суткам (3,86±0,10 г/л против 2,40±0,12 г/л в 1-3 сутки, р<0,001), что соответствует нормальному течению защитно-приспособительных реакций и, в целом, отражает адекватное участие антипротеаз при ОБ в период токсемии. Однако к 21 суткам зафиксировано существенное снижение уровня а1-АТ (2,10±0,09 г/л против 3,86±0,10 г/л на 1014 сутки, р<0,001). Его уровень стал не только в 2 раза ниже, чем в предыдущем периоде, но и статистически ниже, чем в ранний период ОБ (2,10±0,09 г/л против 2,40±0,12 г/л в 1-3 сутки, р<0,05), достигая уровня контрольной группы. Такая динамика не соответствует тяжелому состоянию многих больных. Поэтому проведен анализ уровня этого белка отдельно в группах средней степени тяжести и в группе с тяжелым течением ОБ. У больных средней степени тяжести динамика изменений а1-АТ соответствовала выше изложенной, тогда как у тяжелообожженных уровень к 10-14 суткам практически не изменился по сравнению с ранним периодом (2,46±0,14 г/л против 2,57±0,25 г/л, р>0,05), а к 21 суткам снизился до уровня контрольных значений (1,79±0,15 г/л против 2,0±0,25 г/л в контроле) (рис. 2). Весьма вероятно, что относительно низкий уровень а1-АТ отражает процесс его активного потребления при массивном повреждении тканей и, в то же время, свидетельствует о недостаточной активации этого важного защитно-приспособительного механизма, особенно в группе тяжелобольных. Нам не удалось обнаружить статистически значимых взаимосвязей а1-АТ с анализируемыми параметрами цитокинового профиля.

Проведя ретроспективный анализ уровня СРБ, а1-КГП и а1-АТ в крови умерших с ОБ, на 1-3 сутки после ожоговой травмы нами не было выявлено статистически значимых различий по сравнению с группой выживших больных

с ИФ более 60. Тогда как на 10-14 сутки уровень СРБ>100 г/л сопряжен с неблагоприятным исходом в группе больных с ИФ>60 4,126; р=0,001, при 1 степени свободы).

3,43 |

Рис.2.Динамика а1-КГП и а 1-АТ (г/л) у больных с разной степенью тяжести ОБ. Экспериментальное моделирование ОБ и механизмы клинико-иммуноло-гичекой эффективности иммуномодулятора пептидной природы.

Учитывая уже установленные механизмы действия тинростима в зависимости от исходного состояния клеток (норма, иммунодепрессия, активация) (Запорожец Т.С., 2006) и его клинико-иммунологической эффективности при ожогах средней степени тяжести (Горшеев А.Н., 2006), представлялось важным провести экспериментальные исследования, которые позволили бы нивелировать влияние других терапевтических стратегий и определить, либо уточнить клеточные и молекулярные механизмы действия иммуномодулятора пептидной природы на модели ожоговой болезни.

Анализ показателей фагоцитарной активности лейкоцитов крови мышей экспериментальных групп выявил значимую депрессию количественных показателей фагоцитоза (индекса Гамбургера (иГ) и индекса Райта (иР)). В первые сутки после травмы у мышей обеих групп (основной и сравнения) значения иГ были в 2 раза ниже, чем в контрольной группе. Фагоцитарное число также статистически значимо было снижено. На третьи сутки после травмы в опытных группах выявлена разнонаправленная динамика: у мышей основной группы увеличился уровень фагоцитарной активности и фагоцитарное число, достигая уровня показателей контрольной группы. К 10 суткам происходит значительное увеличение удельного веса фагоцитирующих клеток, тогда как фагоцитарное число изменялось мало. В группе сравнения выявлено усугубление депрессии активности фагоцитирующих клеток по показателю иГ на 3 сутки. К 10 суткам зафиксировано повышение значений фагоцитарной активности и по иГ, и по иР. Однако удельный вес фагоцитирующих лейкоцитов был существенно ниже как по сравнению с контрольной группой, так и с основной.

Интегральная оценка кислородзависимых механизмов бактерицидности лейкоцитов экспериментальных животных в НСТ-тесте выявила значимые изменения показателей. В основной группе показатели спонтанного НСТ-теста (НСТ-спонт) в первые сутки после травмы превышали значения контрольной группы в 1,8 раза (55,3±2,6 ОДхЮ"3 против 32,0±1,2 ОДхЮ"3, р<0,001) и были в 2 раза выше, чем в группе сравнения (55,3±2,6 ОДхЮ"3 против 27,0±1,0 ОДхЮ"3,

р<0,001). Показатели индуцированного НСТ-теста (НСТ-индуц) мало отличались от контрольной группы, но были выше, чем у мышей группы сравнения. Фагоцитарный резерв (ФР) у мышей основной группы значительно снизился в 1 сутки (0,82±0,04 против 1,23±0,1 в контроле, р<0,001). На 3 сутки за счет снижения показателей НСТ-спонт (29,7±1,7 ОДхЮ"3 против 55,3±2,6 ОДхЮ'3, р<0,001) и менее значимого снижения НСТ-индуц - ФР повысился до нормальных величин (1,17±0,08 против 0,82±0,04 в 1 сутки, р<0,01). К 10 суткам увеличение показателей НСТ-индуц определяют тенденцию к увеличению ФР, что, по нашему мнению, отражает влияние ганглиина на процессы метаболической активности нейтрофилов и макрофагов. В группе сравнения показатели НСТ-индуц были снижены в 1 сутки как по сравнению с контрольной, так и основной группами. Но значения ФР остались в норме, так как снизился и НСТ-спонт. В последующем (3 и 10 сутки) зафиксирована тенденция к снижению уровня ФР за счет снижения НСТ-индуц, и сохранения НСТ-спонт практически на том же уровне. В результате показатели ФР в группе сравнения к 10 суткам стали статистически значимо ниже, чем в основной группе (0,9±0,02 против 1,35±0,06, р<0,001) и контроле (0,9±0,02 против 1,23±0,1, р<0,001).

При многих заболеваниях наблюдается активация перекисного окисления липидов, в том числе и при ОБ (Герасимова Л.И., 2000; Перетягин С.П., 2001).

Сравнительное исследование продуктов ПОЛ в липидных экстрактах крови экспериментальных животных с ОБ, получавших и не получавших иммуно-тропную терапию, и животных контрольной группы показало существенное нарастание как первичных, так и вторичных продуктов ПОЛ в 1 сутки после нанесения ожоговой травмы в крови животных обеих экспериментальных групп. Однако, в основной группе (получавших ганглиин), зафиксировано статистически значимое увеличение уровня диеновых конъюгатов (р<0,001) и триенкето-нов (р<0,001), тогда как в группе сравнения статистически значимо увеличилось содержание только первичных продуктов ПОЛ (р<0,001)(рис. 3 и 4).

В динамике экспериментальной ОБ в основной группе содержание первичных продуктов ПОЛ в липидных экстрактах крови снижалось (1,53±0,21 отн. ед. против 1,96±0,16 отн. ед., р>0,05) и было статистически значимо ниже, чем в группе сравнения (2Д4±0,25 отн. ед.; р0,05), а вторичных продуктов ПОЛ, напротив, увеличивалось (1,14±0,12 отн. ед. против 0,89Н),02 отн. ед.;р<0,05), превышая уровень в группе животных, не получавших иммунотропной терапии (р<0,01).

На 10 сутки после ожога в обеих экспериментальных группах зарегистрировано снижение уровня первичных продуктов ПОЛ. В основной экспериментальной группе снижалось также и содержание вторичных продуктов ПОЛ, тогда как в группе сравнения их уровень оставался стабильно высоким и не достигал показателей контрольной группы.

Таким образом, в группе животных, получавших терапию иммуномодуля-тором пептидной природы после ожога, выявлено более быстрое восстановление процессов перекисного окисления липидов.

Активация процессов ПОЛ при ожогах может быть не только результатом усиленного образования кислородных радикалов, но и следствием нарушения функционирования ферментативных механизмов антирадикальной защиты

клетки с участием супероксиддисмутазы и каталазы (Агаева Р.К., 2003). Определение активности СОД позволяет оценить степень защиты организма от свободно-радикального окисления (Хасина М.А., 2004).

В нашем эксперименте выявлено, что ожоговая травма приводит к изменению уровня супероксиддисмутазы в эритроцитах экспериментальных животных. В первые сутки после ожоговой травмы в основной опытной группе зарегистрировано статистически значимое снижение этого фермента (23,53±2,76% против 30,7±3,70% в контроле), тогда как в группе сравнения, напротив, - существенное увеличение его количества (45,28±2,67%, р<0,05). На 3 сутки после ожоговой травмы в обеих группах выявляли высокий и практически равный уровень СОД, с последующим снижением к 10 суткам, более выраженном в группе мышей, получавших ганглиин (29,5±3,51% против 38,8±2,6%, р<0,05) (рис. 3 и 4).

2,5 2 1,5 1

0,5 0

0,4 "

О сутки

1 сутки

3 сутки

10 сутки

—-диеновые конъюгаты отн.ед - -♦- -триенкетоны отн.ед—л—СОД %

Рис. 3. Динамика продуктов ПОЛ и СОД у экспериментальных животных с ожоговой травмой, получавших ганглиин (опытная группа).

отн.ед

50

-Д 38,8 40

•И 1,54 30

20

10

П

0 сутки 1 сутки 3 сутки 10 сутки

—- диеновые конъюгаты отн.ед - - триенкетоны отн.ед—а—ССД(!

%

Рис. 4. Динамика продуктов ПОЛ и СОД у экспериментальных животных с ОБ (группа сравнения).

Нами сопоставлена динамика показателей ПОЛ и СОД в двух группах экспериментальных животных (рис. 3 и 4). Как представлено на рисунках, у животных с ОБ (группа сравнения) уже в первые сутки более чем в 2 раза возрастало содержание первичных продуктов ПОЛ в липидных экстрактах крови и их уровень снижался только к 10 суткам после травмы.

Уровень вторичных продуктов ПОЛ увеличивался в 1 сутки незначительно, их количество статистически значимо повышалось только к 3 суткам,

оставаясь на таком уровне и на 10 сутки. Уровень СОД изменялся аналогично динамике первичных продуктов ПОЛ.

У животных основной группы, получивших иммуномодулятор пептидной природы, в 1 сутки после ожога в 1,7 раза возрастал уровень первичных продуктов ПОЛ и одновременно в 2 раза увеличивалось содержание вторичных продуктов ПОЛ, тогда как количество СОД, напротив, снижалось. На 3 сутки после ожога значительно снижался уровень первичных продуктов ПОЛ, тогда как содержание СОД и вторичных продуктов ПОЛ - возрастало, с последующим снижением до уровня контрольных величин к 10 суткам после ожога.

Полученные данные подтверждают важную роль активации ПОЛ и окислительного стресса в патогенезе ожоговой болезни. Применение иммуномоду-лятора пептидной природы не защищает животных от окислительного стресса, но оказывает модулирующее действие уже в раннем периоде после термической травмы, обеспечивая одновременное увеличение как первичных так и вторичных продуктов ПОЛ. Низкий уровень СОД в этот период, вероятно, связан с ее потреблением и отражает напряжение компенсаторных механизмов.

Исследования цитокинов (ИЛ-10 и ИНФу) в эксперименте позволяют констатировать, что ожоговая болезнь приводит к глубокой депрессии ТЫ типа, практически не влияя на уровень медиатора, продуцируемого ТЬ2 клетками. Применение иммуномодулятора пептидной природы влияет в большей степени на уровень ИЛ-10, обладающего выраженными противовоспалительными свойствами и усиливающим гуморальный иммунитет. Данные об уровнях исследуемых цитокинов представлены на рис. 5 и 6.

о 1а 2.29 ИНФУ

□ ганглиин ш сравнение

0,4 О.34 п , 0,47 0.42

0,28

до ожога 1 сутки 3 сутки 10 сутки

Рис.5.Уровень ИНФу в сыворотке крови мышейдоожогаивразные периоды ОБ.

до ожога 1 сутки 3 сутки 10 сутки

Рис.б.Уровень ИЛ-10 в сыворотке крови мышей до ожогаивразные периоды ОБ.

Установлена прямая корреляционная связь между уровнем ИЛ-10 и содержанием вторичных продуктов ПОЛ на 1 и 3 сутки эксперимента у мышей основной группы (г =0,56 и 0,64, р<0,05).

Таким образом, экспериментальные исследования позволили на модели ожоговой болезни установить иммуномодулирующий эффект иммуно-модулятора пептидной природы - ганглиина. Его применение обеспечивает усиление выработки ИЛ-10 и, в меньшей мере, ИФНу, что в совокупности усиливает фагоцитарную активность лейкоцитов, уменьшая при этом выраженность оксидативного стресса. Выводы:

1. Выявлено развитие выраженного системного воспалительного ответа у больных в ранний период ОБ с гиперпродукцией ФНОа, ГМ-КСФ, ИЛ-8, ИЛ-12р70 и существенным усилением шеддинга растворимого рецептора I типа ФНОа. Дефицит ИФНу на 10-14 сутки после ожоговой травмы является прогностическим предиктором развития гнойно-септических осложнений и сепсиса.

2. Разработаны дополнительные иммунологические критерии неблагоприятного прогноза у больных ОБ тяжелой степени: низкий уровень ГМ-КСФ (<5 пг/мл) и ИЛ-12р70 (<2 пг/мл) в 1-3 сутки и повышение ИЛ-8 (>300 пг/мл) на 21 сутки после ожоговой травмы.

3. Установлено, что у больных с ожоговой травмой в ранний период существенно увеличивается уровень СРБ и а1-КГП. Увеличение СРБ более 50 г/л на 10-14 и 21 сутки ОБ является дополнительным диагностическим признаком тяжести состояния больного. Степень увеличения а1-КГТ1 на 1-3 и 10-14 сутки у тяжелообожженных в 1,5 раза выше, чем у пациентов средней степени тяжести. Выявлен относительно более низкий уровень а1-АТ в крови больных с тяжелой ожоговой травмой на 10-14 и 21 сутки, что говорит в пользу недостаточной активации защитно-приспособительных реакций. Уровень СРБ выше 100 г/л на 10-14 сутки после ожога сопряжен с неблагоприятным исходом.

4. На экспериментальной модели ОБ у мышей отмечается депрессия количественных показателей фагоцитоза Ганглиин оказывает позитивное влияние, увеличивая фагоцитарную активность, фагоцитарное число и фагоцитарный резерв.

5. Подтверждена важная роль активации ПОЛ и окислительного стресса в патогенезе ОБ. Применение иммуномодулятора - ганглиина не защищает животных от окислительного стресса, но оказывает модулирующее действие уже в раннем периоде после термической травмы, обеспечивая одновременное увеличение как первичных так и вторичных продуктов ПОЛ и более быстрое восстановление процессов ПОЛ. Низкий уровень СОД связан с ее потреблением и отражает напряжение компенсаторных механизмов.

6. Ганглиин усиливает выработку противовоспалительного медиатора - ИЛ-10, коррелирующего с содержанием вторичных продуктов ПОЛ. РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ ВНЕДРЕНИЯ В МЕДИЦИНСКУЮ НАУКУ И ПРАКТИКУ

Результаты проведенных исследований, рекомендуемые для внедрения: 1. Разработаны дополнительные иммунологические критерии неблагоприятного прогноза у больных ОБ тяжелой степени: низкий уровень ГМ-КСФ (<5 пг/мл) и

ИЛ-12р70 (<2 пг/мл) в 1-3 сутки и повышение ИЛ-8 (>300 пг/мл) на 21 сутки после ожоговой травмы.

2. Необходимо проводить мониторирование СРБ. Его уровень более 50 г/л на 10-14 и 21 сутки ОБ является дополнительным диагностическим признаком тяжести состояния больного. Уровень СРБ выше 100 г/л на 10-14 сутки после ожога сопряжен с неблагоприятным исходом. Динамика изменений al-AT при ожоговой болезни средней степени тяжести соответствует нормальному течению защитно-приспособительных реакций, однако, у тяжелообожженных отмечается его относительный дефицит.

3. Экспериментальные исследования позволили установить иммуномодули-рующий эффект иммуномодулятора пептидной природы - ганглиина. Его применение обеспечивает усиление выработки ИЛ-10 и, в меньшей мере, ИФНу, что в совокупности усиливает фагоцитарную активность лейкоцитов, уменьшая при этом выраженность оксидативного стресса.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Оценка состояния иммунного статуса у тяжелообожженных / В.В. Усов, Т.Н. Обыденникова, А.Е. Тарасов, А.Н. Горшеев // Тихоокеан. мед. журн. - 2008. -№ 1. - С. 53-55.

2. Тарасов, А.Е. Состояние фагоцитарной активности нейтрофилов мышей при экспериментальной ожоговой травме / А.Е. Тарасов, М.О. Яременко, B.C. Григорян // Фундаментальные исследования.- 2004. - № 4. - С. 86.

3. Тарасов, А.Е. Состояние процессов перекисного окисления липидов при ожоговой болезни на фоне применения иммуномодулятора «тинростим» / А.Е. Тарасов, М.О. Яременко // Тюменский мед. журн. - 2004. - № 2. - С. 42-43.

4. Яременко, М.О. Влияние ожоговой болезни на активность фагоцитарно-клеточной защиты организма в эксперименте / М.О. Яременко, А.Е. Тарасов, B.C. Григорян // Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины: тезисы докл. VI-й Тихоокеан. научн.-практ. конф. студентов и молодых ученых с международ, участием.- Владивосток, 2005. - С. 42.

5. Тарасов, А.Е. Состояние фагоцитарного звена иммунитета и оксидантной системы организма при ожоговой болезни в клинике и эксперименте при коррекции иммуномодулятором «тинростим» / А.Е Тарасов, М.О. Яременко // Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины: тезисы докл. VI-й Тихоокеан. научн.-практ. конф. студентов и молодых ученых с международ, участием.- Владивосток, 2005.- С. 38-39.

6. Тарасов, А.Е. Фагоцитарно-клеточная защита у больных с ожоговой травмой на фоне применения иммуномодулятора «тинростим» / А.Е. Тарасов, М.О. Яременко // Современные наукоемкие технологии. - 2005. - № 7. - С. 58-59.

7. Тарасов, А.Е. Влияние «Тинростима» на уровень фактора некроза опухоли в крови больных ожоговой болезнью / А.Е. Тарасов, Е.В. Маркелова, М.О. Яременко // XII российский национальный конгресс «Человек и лекарство»: тезисы докл.-М.,2005.-С. 561.

8. Тарасов, А.Е. Влияние «Тинростима» на перекисное окисление липидов и ангиоксидантную систему при ожоговой болезни в эксперименте / А.Е. Тарасов // Современные наукоемкие технологии.-2005. - № 8. - С. 72.

9. Тарасов, А.Е. Влияние иммуномодулятора-Тинростима на перекисное окисление липидов и антиоксидантную систему в патогенезе ожоговой болезни в экс-

перименте / А.Е. Тарасов, Н.И. Михайлова // Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины: тезисы докл. УП-й Тихоокеан. научн.-практ. конф. студентов и молодых ученых с международ, участием. - Владивосток, 2006. - С. 151.

Ю.Маркелова, Е.В. Иммунотерапия в комплексном лечении больных с тяжелой ожоговой травмой /Е.В. Маркелова, А.Е.Тарасов, В.Е.Красников //Веста. Российской военно-медицинской академии.-2008.-№2(22), прилож., 4.II.-C.740-741.

П.Францыско, A.A. Динамика острофазного ответа у больных с тяжелыми ожогами / A.A. Францыско, А.Е. Тарасов // Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины: тезисы докл. IX Тихоокеан. научн.-практ. конф. студентов и молодых ученых с международ, участием. -Владивосток, 2008. - С. 73.

12.Магадова, A.A. Клинико-иммунологические нарушения у хирургических больных / A.A. Магадова, В.А. Лазанович, А.Е. Тарасов // Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины: тезисы докл. IX Тихоокеан. научн.-пракг. конф. студентов и молодых ученых с международ, участием. - Владивосток, 2008. - С. 219.

13.Тарасов, А.Е. Клиническое значение оценки цитокинового статуса у больных с тяжелой ожоговой травмой / А.Е. Тарасов // Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины: тез. докл. V конференции молодых ученых России с международ, участием. - М., 2008. - С. 216-217.

14.Маркелова, Е.В. Содержание IL-2 и растворимого рецептора IL-2 (srIL-2) в сыворотке крови больных в динамике ожоговой болезни / Е.В. Маркелова, А.Е. Тарасов // Российский иммунологический журн.- 2008.- Т. 2(11), № 2-3.- С. 180.

15. Тарасов, А.Е. Динамика цитокинового профиля у тяжелообожженных больных / А.Е. Тарасов, Т.Н. Обыденникова, Е.В. Маркелова // II Съезд комбустиологов России: сб. науч. тр. - М„ 2008. - С. 69-70.

16. Дополнительные диагностические критерии тяжести и прогноза течения ожоговой болезни / Е.В. Маркелова, А.Е. Тарасов, В.В. Усов, Т.Н. Обыденникова, А.Н. Горшеев: метод, рекомендации. - Владивосток, 2009. - 19 с.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ГМ-КСФ - гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор ИЛ - интерлейкин ИФ - индекс Франка ИФА - иммуноферментный анализ ИФН - интерферон

НСТ-тест - тест восстановления нитросинего тетразолия

ОБ - ожоговая болезнь

ПОЛ - перекисное окисление липидов

СОД - супероксидцисмутаза

СРБ - С-реактивный белок

ФНО - фактор некроза опухолей

al-AT - a 1-антитрипсин

al-КГП - a 1-кислый гликопротеин

Thl - Т-хелперы первого типа

Th2 - Т-хелперы второго типа

Тарасов Алексей Евгеньевич

Иммунологические аспекты ожоговой болезни в клинике и эксперименте

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Уч. изд. л. 1,0 Формат 60 х 84Лб

Тираж 100 экз. Заказ №3 78

Отпечатано в типографии РПК МГУ им. адм. Г.И. Невельского 690059 г. Владивосток, ул. Верхнепортовая, 50а

В настоящее время в России летальность от термической травмы возрастает (1990 - 2,1%; 1995 - 3,3%; 2002 - 3,5%) [26, 90]. Обращает внимание увеличение числа тяжелых термических травм с 35,7% в 1981-1990 до 41,4% в 1991-2003 годах [2, 64]. Подобная закономерность отмечается и в Приморском крае [36].

Считается, что ожоговая травма с поражениями более 10-15% поверхности тела сопровождается развитием ожоговой болезни и неспецифического синдрома системного ответа на воспаление - ССВО (SIRS - systemic inflammatory response syndrome), которые часто приводят к синдрому полиорганной недостаточности [129, 134, 202]. Разрушающее термическое действие на ткани с поражением нервной системы приводит к шоку с последующим развитием комплекса патологических процессов [72, 213, 215]. Несмотря на современные, рациональные и патогенетические обоснованные методы лечения, летальность при острой ожоговой токсемии достигает 40-55%, а в стадии септикотоксемии — 45-65% [80].

Ожоговую болезнь следует рассматривать как иммунодефицитное заболевание, при котором отмечается раннее и продолжительное снижение показателей врожденного и приобретенного иммунитета [77, 82, 175, 179]. Необходимо учитывать, что иммунный ответ у тяжелообожженных развивается на фоне острейшего дефицита энергетических и пластических ресурсов [50].

Иммунный статус больных с тяжелой термической травмой, в конечном счете, формируется на фоне большого числа иммуносупрессивных факторов: обширного повреждения кожи как иммунного органа, стресса во время травмы, воздействия огромного количества токсинов обожженных тканей, усиления пероксидации липидов и нарушения структуры мембранных систем клеток, воздействия антибиотикотерапии, гормонотерапии, многократных наркозов во время перевязок и операций аутодермопластики [64, 107, 137]. При тяжелых термических поражениях особенно угнетены клеточные механизмы защиты. Значительное угнетение Т- и В-систем иммунитета приводит к резкому снижению сопротивляемости организма к инфекционным агентам, что может стать предпосылкой для развития как местных, так и общих инфекционных осложнений, вплоть до ожогового сепсиса [110, 151].

Нарушение цитокинового баланса организма рассматривается в последнее время как важный механизм развития тяжелой гнойной инфекции и сепсиса [31, 75, 164, 217].

Однако, на сегодняшний день имеется незначительное число работ, посвященных комплексному изучению острофазного ответа и цитокинового статуса у обожженных и роли их нарушений в патогенезе ожоговой болезни и её осложнений. Дальнейшее изучение патогенеза, изменений в системе ци-токинов — важнейших факторов врожденного иммунитета при ожоговой травме является одним из актуальных и перспективных направлений в ком-бустиологии. Понимание последовательности и выраженности иммунных ' нарушений, происходящих в организме больных с ожоговой болезнью, позволит оптимизировать патогенетическую терапию, снизить количество осложнений и летальность в поздние периоды ожоговой болезни.

Цель работы: выявить закономерности цитокиновой регуляции на разных стадиях ожоговой болезни в клинике и на экспериментальных животных, и дать экспериментальное обоснование иммунотропной терапии.

Задачи:

1. Определить уровни цитокинов интерлейкина-2, 3, 8, 10, 12р70, 12р40, интерферона гамма, фактора некроза опухоли альфа, гранулацитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора и растворимых рецепторов I типа ФНОа и рр ИЛ-2 в сыворотке крови обследуемых.

2. Исследовать уровни острофазных белков (С-реактивного белка, а 1-кислого гликопротеина, а 1-антитрипсина) в зависимости от тяжести и периода ожоговой болезни в клинике.

3. Разработать дополнительные иммуно-биохимические критерии определения тяжести и предикторы неблагоприятного прогноза у данной категории больных.

4. Смоделировать ожоговую болезнь на экспериментальных животных и определить качественно-количественные показатели фагоцитоза (ФИ, ФЧ) и состояние кислородзависимых механизмов бактерицидности лейкоцитов (НСТ-тест).

5. Определить уровни цитокинов (ИФНу и ИЛ-10) в сыворотке крови экспериментальных животных и уровни продуктов перекисного окисления липидов (первичных — диеновых конъюгатов и вторичных — триенке-тонов), и супероксиддисмутазы в динамике болезни в эксперименте.

6. Оценить иммунологическую эффективность иммуномодулятора пептидной природы (ганглиина) на модели ожоговой болезни в эксперименте.

Научная новизна исследований:

Расширены представления о патогенетической роли иммунных нарушений у обожженных. Определены наиболее информативные иммунологические маркеры воспаления, которые можно использовать в диагностике, прогнозе и оценке эффективности терапии.

Впервые установлено недостаточное включение противовоспалительной защиты на фоне системной воспалительной реакции (стабильный уровень ИЛ-10 на уровне контроля) и недостаточная активация защитно-приспособительных реакций (а1-АТ, особенно, в группе тяжелообожженных к концу 3 недели).

Впервые дано экспериментальное обоснование иммуномодулирующей терапии ганглиином в ранние периоды ожоговой болезни. Отмечено по зитивное влияние ганглиина на показатели фагоцитоза за счет усиления функциональной активности фагоцитов. Применение ганглиина не защищает от окислительного стресса, но оказывает модулирующее действие уже в раннем периоде, обеспечивая одновременное увеличение как первичных, так и вторичных продуктов ПОЛ.

Практическая значимость работы:

Проведенный комплексный анализ цитокинового профиля и острофазного ответа выявил различия и закономерности иммунного ответа в зависимости от тяжести и периода ожоговой болезни. Дефицит ИЛ-2 в первые периоды ожоговой болезни (1-3,10-14 сутки) на фоне увеличения рр ИЛ-2 приводит к снижению активации ТЫ типа и усилению активационно-ин-дуцированного апоптоза. Длительное и значительное повышение СРБ также способствует превалированию ТЬ2 типа иммунного ответа, что не является целесообразным защитно-приспособительным механизмом.

Разработаны дополнительные диагностические и прогностические критерии характера течения ожоговой болезни. Дефицит ИФНу и, как следствие, усугубление дефекта Т-хелперов 1 типа является прогностическим предиктором развития гнойно-септических осложнений и сепсиса (%2=4,86). СРБ > 50 г/л является дополнительным критерием тяжести больного на 10-14 и 21 сутки. Установлена сопряженность высокой степени низкого содержания ГМ-КСФ < 5 пг/мл (%2=14,726) и ИЛ-12р70 < 2 пг/мл (х2=17,769) в 1-3 сул тки, и высокого уровня ИЛ-8 >300 пг/мл (% =7,957) на 21 сутки и СРБ >100 г/л у тяжелообожженных на 10-14 сутки (% =4,126) с неблагоприятным прогнозом.

Установлена прямая корреляционная связь между СРБ и ФНОа (г =0,6), СРБ и ИЛ-8 (г =0,8), а также отрицательная зависимость СРБ и ИЛ-2 (г=-0,58) и СРБ и ИФНу (г=-0,53), что свидетельствует о длительном некомпенсированном системном воспалительном ответе у тяжелообожженных.

Настоящее исследование проведено на базе приморского краевого ожогового отделения при ФГУ «ДВОМЦ ФМБА России». Регистрационный номер работы: № 0120.0 800134.

На основе результатов исследования разработаны и внедрены в учебный процесс ГОУ ВПО «ВГМУ Росздрава» (г. Владивосток), ГОУ ВПО «ДВГМУ Росздрава» (г. Хабаровск) методические рекомендации: «Дополнительные диагностические критерии тяжести и прогноза течения ожоговой болезни». В лечебно-диагностический процесс краевого ожогового отделения ФГУ «ДВОМЦ ФМБА России» (г. Владивосток) внедрены методы диагностики и рекомендовано включение иммуномодулирующей терапии у больных с ожоговой болезнью. Апробация материалов работы:

Основные положения диссертации были представлены на конгрессах и конференциях международного, российского и регионального уровня:

- Международном форуме молодых ученых и студентов. (Турция, г. Анталия, 2004);

- III конференции «Фундаментальные и прикладные исследования в медицине». (Греция, г. Лутраки, 2005);

- III научной конференции с международным участием «Приоритетные направления развития науки, технологий и техники». (Египет, г. Хургада, 2005);

- XII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство». (Москва, 2005);

- V конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины». (Москва, 2008);

- на II съезде комбустиологов России. (Москва, 2008);

- на VI, VII и IX Тихоокеанской научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием. (Владивосток, 2005, 2006, 2008).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 16 научных работ, в том числе 3 работы в изданиях, рекомендованных ВАК, из них 1 статья; 1 методические рекомендации. . Структура и объем диссертации:

Диссертационная работа изложена на 141 странице, иллюстрирована 22 таблицами и 15 рисунками.

Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 3 глав, содержащих результаты собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающего 160 источников отечественной литературы и 57 источников зарубежных авторов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Ожоговая болезнь характеризуется развитием выраженного системного воспалительного ответа. Динамика провоспалительных и колониестимулирующих цитокинов при ожоговой болезни свидетельствует о гиперактивации фагоцитирующих клеток и вовлечении в иммунный ответ эпителиальных и эндотелиальных клеток.

2. У тяжелообожженных не происходит адекватного включения противовоспалительной защиты и недостаточна активация защитно-приспособительных реакций. Длительная гиперпродукция СРБ при тяжелом течении ожоговой болезни способствует превалированию ТЬ2 типа иммунного ответа и свидетельствует о длительном некомпенсированном системном воспалительном ответе.

3. На модели ожоговой болезни в эксперименте показано, что применение ганглиина не защищает животных от окислительного стресса, но оказывает модулирующее действие на процессы перекисного окисления ли-пидов и фагоцитоза, влияя на уровень ИЛ-10, обладающего выраженными противовоспалительными свойствами.

выводы

1. Выявлено развитие выраженного системного воспалительного ответа у больных в ранний период ожоговой болезни с гиперпродукцией ФНОа, ГМ-КСФ, ИЛ-8, ИЛ-12р70 и существенным усилением шеддинга растворимого рецептора I типа ФНОа. Дефицит ИФНу на 10-14 сутки после ожоговой травмы является прогностическим предиктором развития гнойно-септических осложнений и сепсиса.

2. Разработаны дополнительные иммунологические критерии неблагоприятного прогноза у больных ожоговой болезнью тяжелой степени: низкий уровень ГМ-КСФ (<5 пг/мл) и ИЛ-12р70 (<2 пг/мл) в 1-3 сутки и повышение ИЛ-8 (>300 пг/мл) на 21 сутки после ожоговой травмы.

3. Установлено, что у больных с ожоговой травмой в ранний период существенно увеличивается уровень СРБ и а1-КГП. Увеличение СРБ более 50 г/л на 10-14 и 21 сутки ожоговой болезни является дополнительным диагностическим признаком тяжести состояния больного. Степень увеличения а1-КГП на 1-3 и 10-14 сутки у тяжелообожженных в 1,5 раза выше, чем у пациентов средней степени тяжести. Выявлен относительно более низкий уровень а1-АТ в крови больных с тяжелой ожоговой травмой на 10-14 и 21 сутки, что говорит в пользу недостаточной активации защитно-приспособительных реакций. Уровень СРБ выше 100 г/л на 10-14 сутки после ожога сопряжен с неблагоприятным исходом.

4. На экспериментальной модели ожоговой болезни у мышей отмечается депрессия количественных показателей фагоцитоза. Ганглиин оказывает позитивное влияние, увеличивая фагоцитарную активность, фагоцитарное число и фагоцитарный резерв.

5. Подтверждена важная роль активации ПОЛ и окислительного стресса в патогенезе ожоговой болезни. Применение иммуномодулятора — ганглиина не защищает животных от окислительного стресса, но оказывает модулирующее действие уже в раннем периоде после термической травмы, обеспечивая одновременное увеличение как первичных, так и вторичных продуктов ПОЛ и более быстрое восстановление процессов ПОЛ. Низкий уровень СОД связан с ее потреблением и отражает напряжение компенсаторных механизмов.

6. Ганглиин усиливает выработку противовоспалительного медиатора - ИЛ-10, коррелирующего с содержанием вторичных продуктов ПОЛ.

РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ ВНЕДРЕНИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ В МЕДИЦИНСКУЮ НАУКУ И ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗДРАВООХРАНЕНИЕ

Результаты проведенных исследований, рекомендуемые для внедрения:

1. Разработаны дополнительные иммунологические критерии неблагоприятного прогноза у больных ожоговой болезнью тяжелой степени: низкий уровень ГМ-КСФ (<5 пг/мл) и ИЛ-12р70 (<2 пг/мл) в 1-3 сутки и повышение ИЛ-8 (>300 пг/мл) на 21 сутки после ожоговой травмы.

2. Рекомендуем проводить мониторирование СРБ и а1-АТ. Уровень СРБ более 50 г/л на 10-14 и 21 сутки после термической травмы является дополнительным диагностическим признаком тяжести состояния больного. Уровень СРБ выше 100 г/л на 10-14 сутки после ожога сопряжен с неблагоприятным исходом. Динамика изменений а1-АТ при ожоговой болезни средней степени тяжести соответствует нормальному течению защитно-приспособительных реакций, однако, у тяжелообожженных отмечается его относительный дефицит.

3. Теоретически обосновано включение иммуномодулирующей терапии у больных с ожоговой болезнью, особенно, у тяжелообожженных. Экспериментальные исследования позволили установить иммуномодулирующий эффект иммуномодулятора пептидной природы — ганглиина. Его применение обеспечивает усиление выработки ИЛ-10 и, в меньшей мере, ИФНу, что в совокупности усиливает фагоцитарную активность лейкоцитов, уменьшая при этом выраженность оксидативного стресса.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В России и в Приморском крае увеличивается летальность от термических ожогов (1990 - 2,1%, 1995 - 3,3%, 2002 - 3,5%) [26, 90]. Так же увеличивается число тяжелых термических ожогов с 35,7% в 1981-1990 до 41,4% 2003 [2, 64]. Ожоговая травма с поражениями более 10-15 % поверхности тела сопровождается развитием ожоговой болезни и часто неспецифического синдрома системного воспалительного ответа (ССВО)[129, 134, 202].

Ожоговая болезнь (ОБ) - специфический симптомокомплекс, развивающийся после термической травмы и сопровождающийся повреждением всех саморегулирующихся структур [64]. Для развития ожоговой болезни необходима площадь поверхностного ожога 10-15% поверхности тела, а глубокого - 5-6% [134]. В течение ожоговой болезни выделяют 4 стадии: 1 — ожоговый шок (от нескольких часов до 3 суток), 2 — острая ожоговая токсемия (с 3 по 12 сутки), 3 - септикотоксемия (с 12 суток до восстановления кожных покровов), 4 стадия - реконвалесценция [7].

По данным литературы [113], при ожоговой болезни наблюдается ги- . перактивированное состояние нейтрофилов. Это несет в себе отрицательные моменты: нейтрофилы периферической крови после ожоговой травмы накапливаются и разрушают ткани первично интактных органов вне очага поражения: легких, печени, слизистой желудка [84].

Ожоговая болезнь большинством авторов рассматривается как стойкое иммунодефицитное состояние, связанное с многоуровневыми нарушениями иммунной регуляции в организме больного, на фоне воздействия термического фактора [24, 50, 62, 86, 116]. Воздействие высоких температур ведет к локальному повреждению кожных покровов, как следствие, нарушению защитных функций покровных тканей и интоксикации организма продуктами распада в очаге повреждения. На сегодняшний день доказаны нарушения Т-клеточного иммунитета, за счет абсолютного снижения С04+ клеток [127]. Дисбаланс в системе цитокинов, гиперпродукция медиаторов воспаления и связанные с этим нарушения в системах врожденного и приобретенного иммунитета признаются важными патогенетическими факторами развития ожоговой болезни и ее осложнений.

Уже в раннем периоде после травмы происходит значительное угнетение клеточного иммунитета [63], особенно глубокая депрессия Т-иммун-ного звена, которая проявляется как снижением общего количества Т-лим-фоцитов, так и различных субпопуляций с изменением их функциональной активности.

A.A. Попов и И.П. Назаров считают, что медиаторы класса цитокинов имеют решающее патофизиологическое значение у больных ожоговой болезнью [110]. Среди них ИЛ-1 и ФНОа имеют наибольшее значение в развитии септических осложнений и синдрома полиорганной недостаточности (СПОН) [177]. Об изменении активности генерации NO и его функции при термической травме написан ряд работ [28, 178, 191, 204]. При ожоговой травме наблюдаются усиление генерации NO как тромбоцитами, так и лейкоцитами. Гиперпродукция NO играет важную роль в патогенезе окислительного стресса, который выражается в повреждении клеточных структур, мутациях ДНК и интенсивном апоптозе. Таким образом, большинством авторов выявлены нарушения в системах врожденного и адаптивного иммунитета. Однако, остается много не выясненных вопросов, особенно в функционировании системы цитокинов, в разные периоды ожоговой болезни.

На сегодняшний день имеется незначительное число работ, посвященных комплексному изучению состояния иммунной системы у обожженных и роли их нарушений в патогенезе ожоговой болезни и ее осложнений. Понимание последовательности и выраженности иммунных нарушений, происходящих в организме больных ожоговой болезни, позволит оптимизировать патогенетическую терапию, снизить количество осложнений и летальность в поздние периоды.

В настоящее время лечение обожженных представляет определенные трудности. Ведущими звеньями патогенеза являются интоксикация и развивающийся иммунодефицит [54, 85]. Иммунная недостаточность способствует снижению эффективности проводимой терапии, активации условно-патогенной флоры, следствием чего является затяжное течение ожоговой болезни и развитие осложнений. В связи с этим, иммунокоррекция является неотъемлемой частью комплексной терапии ожоговой болезни.

Для профилактики гнойно-септических осложнений при ожоговой болезни используют ряд препаратов. В частности, полиоксидоний, эффект которого связан с активацией фагоцитирующих клеток с усилением антитело-продукции. Однако, его эффективность в значительной степени зависит от времени введения с момента инфицирования и, как показали исследования, отсутствия дозозависимости эффекта полиоксидония [32]. ИЛ-2 (ронколей-кин) способен восстанавливать иммунологическую реактивность, подавленную глюкокортикоидами, и имеет высокую клинико-иммунологическую эффективность [36, 85, 124].

Немногочисленность исследований, малый спектр изученных цито-кинов в динамике ожоговой болезни не позволяют считать завершенными научные поиски в этом направлении. Дальнейшее изучение иммунопатоге-неза ожоговой болезни, в том числе, в эксперименте, позволят уточнить механизмы ее развития, разработать дополнительные критерии ее тяжести и предикторы неблагоприятного прогноза, а также оптимизировать программы патогенетической терапии.

А.Н. Горшеев провел пилотное исследование включения в программу терапии ожоговой болезни биологически активного вещества, пептидной природы, полученного из оптических ганглиев кальмара (тинро-стима-ст), и установил, что его применение позволяет достоверно улучшить состояние неспецифического и клеточного звеньев иммунитета [36]. Это выражается в снижении степени дефицита клеточного звена иммунитета: достоверное повышение ФИ, ФЧ, ИЗФ, активности миелопероксидазы, НСТ-теста; отмечено достоверное повышение соотношения общего числа лимфоцитов, Т-лимфоцитов, Т-хелперов, В-лимфоцитов. На фоне применения им-мунокорректоров (рекомбинантный ИЛ-2 — ронколейкин и тинростим-ст) отмечено снижение уровня провоспалительных цитокинов (ФНОа, ИЛ-8). Одновременно отмечено возрастание уровня белков острой фазы воспаления (СРБ, фибриноген). Им выявлена нормализация уровня ИЛ-2, ИЛ-12 и его пулов на фоне цитокинотерапии. Клинически это выражалось в улучшении общего состояния больных и в улучшении состояния ожоговой раны. Улучшались результаты оперативного лечения ожоговых ран.

В опубликованных различными авторами результатах исследований представлены неоднозначные данные по уровню и динамике провоспалительных и противовоспалительных цитокинов после ожоговой травмы и чаще использована оценка ограниченного количества параметров цитокинового статуса. Производя отбор параметров цитокинового статуса, мы учли, что при «классическом» воспалении основным источником цитокинов являются лейкоциты и макрофаги воспалительного инфильтрата, а при системном воспалении (СВР), лежащим в основе ожоговой болезни, -активированные эндотелиоциты и сосудистые макрофаги, что определяет более высокий уровень цитокинемии и требует исследования комплекса параметров, отражающих процессы активации клеток-мишеней. Для этих целей при системной воспалительной реакции (СВР) Е.Ю. Гусев с соавт. предлагали анализировать ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10 и ФНОа [82]. Мы посчитали целесообразным расширить этот спектр и включили в настоящее исследование определение ФНОа, ИЛ-3, ГМ-КСФ, ИЛ-8, ИЛ-2, ИФНу, ИЛ12(р70 и р40) и ИЛ-10. ФНОа - это признанный медиатор системной воспалительной реакции (СВР). ИЛ-3 - мультиколониестимулирующий фактор, отражающий процессы пролиферации различных иммуноцитов, а также тучных клеток. ГМ-КСФ — гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор - стимулирует пролиферацию и созревание клеток гранулоцитарного и макрофагального происхождения. ИЛ-8 — мощнейший хемоаттрактант и индуктор активации нейтрофилов. ИЛ-12 (его субтипы р70 и р40) позволяют оценить степень и характер активации макрофагов. ИЛ-2 и ИФНу важнейшие медиаторы иммунного ответа, продуцируемые преимущественно хелперами 1 типа (ТЫ). ИЛ-10 — ведущий противовоспалительный медиатор, продуцируемый макрофагами, ТЪ2 типа и эндотелиоцитами. Дополнительно в крови исследован уровень растворимых рецепторов к ФНОа (рр I ФНОа) и к ИЛ-2 (рр ИЛ-2), что позволило более полно оценить функционирование этих двух медиаторов воспаления и иммунного ответа.

Полученные данные свидетельствуют о существенном увеличении ранних провоспалительных цитокинов в крови больных. Нами выявлено увеличение ФНОа от 3 до 100 раз, трех-четырехкратное нарастание его растворимого рецептора I типа и 5-20 кратное повышение уровня ИЛ-8 (89,74±27,11 пг/мл против 5,47±1,49 пг/мл; р<0,001). Значительно возрастало также содержание ГМ-КСФ. Это свидетельствует о гиперактивации фагоцитирующих клеток и вовлечении в иммунный ответ эпителиальных и эндотелиальных клеток. Остальные исследованные медиаторы изменялись мало. Можно лишь отметить тенденцию к снижению содержания ИЛ-2 и, напротив, к увеличению его растворимого рецептора. Нами не выявлено существенного различия показателей цитокинового профиля у мужчин и женщин.

Как указывалось нами, все пациенты были распределены нами по тяжести состояния на 2 группы: средняя тяжесть (с ИФ от 30 до 59) и тяжело-обожженные (с ИФ от 60 и выше). Оценка цитокинового профиля больных этих групп в динамике, соответствующей разным периодам ожоговой болезни, позволила выявить целый ряд особенностей. Оказалось, что больные с ожогами ИФ 30-59 в ранний период имели повышение ФНОа в 1,5-2 раза меньше, чем тяжелообожженные (19,00±5,21 пг/мл против 43,61±16,32 пг/мл, р>0,05) с постепенным снижением уровня этого цитокина в динамике. А на 21 сутки уровень ФНОа хотя и оставался повышенным по сравнению с контрольной группой, но был статистически значимо ниже, чем у тяжелообож-женных (6,18±2,10 пг/мл против 0,59±0,32 пг/мл и 34,78±14,60 пг/мл). В то же время уровень растворимого рецептора ФНОа I типа у больных с ИФ 3059 был достоверно выше не только по сравнению с контрольной группой, но и с группой тяжелообожженных больных в период ожогового шока и острой ожоговой токсемии и только на 21 сутки содержание рр I ФНОа снижалось, статистически не отличаясь от группы тяжелообожженных, но в 2-2,5 раза превышая контрольные значения. Вероятно, это один из важных механизмов, ограничивающих функциональную активность ФНОа на фоне гиперпродукции последнего.

Содержание и динамика исследованных колониестимулирующих факторов (ИЛ-3 и ГМ-КСФ) также было различным у обожженных двух групп. У больных со средней степенью тяжести их уровень в 1-3 сутки был статистически значимо повышен, превышая контрольные значения в среднем в два раза с последующим умеренным (в 1,5-2,5 раза) увеличением к 10-14 суткам и таким же снижением к 21 суткам. Уровень ИЛ-8 в ранний период после термической травмы у пациентов с ИФ 30-59 был статистически значимо повышен, с последующей стабильной динамикой на 10-14 сутки и снижением—на 21 сутки.

В 1-3 сутки после травмы зарегистрировано также повышение важного цитокина макрофагального происхождения ИЛ-12р70 (38,42±15,00 пг/мл против 7,29±1,98 пг/мл в контроле, р<0,05) тогда как уровень ИЛ-12р40 практически не отличался от референсных величин (188,34±30,46 пг/мл против 151,84±39,23 пг/мл; р>0,05), что обеспечивало существенное увеличение коэффициента соотношения ИЛ-12р70 к ИЛ-12р40. В последующем определялось снижение уровня ИЛ-12р70 и регуляторного коэффициента.

Как отмечено в работах И.С. Фрейдлин, подобная динамика характерна для острых инфекций и травмы, в том числе термической [141, 142].

Важным было оценить уровень и динамику цитокинов, отражающих активацию и функцию ТЫ и ТЬ2 типа.

У больных с термической травмой с ИФ 30-59 в ранние сроки установлена тенденция к снижению ИЛ-2, статистически значимое снижение уровня растворимого рецептора ИЛ-2 в сыворотке крови. Последнее нами расценено как компенсаторный механизм на фоне относительной недостаточности ИЛ-2 - важного ростового фактора Т-лимфоцитов. На этом фоне значение ТЫ маркерного цитокина (ИФНу) мало отличалось от контрольных показателей. В динамике на 10-14 сутки зафиксировано только статистически значимое двукратное повышение уровня ИЛ-10 (48,69±7,24 пг/мл против 20,47±9,16 пг/мл; р<0,05). А к концу третьей недели его количество снижалось, не достигая, однако, уровня контрольной группы.

В группе тяжелообожженных больных (ИФ 60 и выше) в период ожогового шока выявлено увеличение уровня ФНОа — основного медиатора системной воспалительной реакции, а также его растворимого рецептора, который опосредует и усиливает апоптоз ТЫ типа, что вероятно, приводит к иммунодефициту, связанному с нарушением клеточного иммунитета и антите-лообразования. Одновременно фиксировали повышение уровня и ИЛ-8, избыточная продукция которого стимулирует гиперактивность нейтрофилов. Свойства ИЛ-8 вызывать миграцию клеток и способность их к адгезии, определяют его как активного участника острой воспалительной реакции. Ферменты, высвобождающиеся из погибших нейтрофилов, вызывают повреждение тканей, что является дополнительным фактором утяжеления интоксикации и развития синдрома полиорганной недостаточности (СПОН). Установлена прямая корреляционная связь между уровнем ИЛ-8 и лейкоцитарным индексом интоксикации (г=0,6; р<0,05). В то же время выявлен дефицит ИЛ-2, что ведет к снижению активации ТЫ типа и усилению их апоптоза. Значения других исследованных медиаторов мало отличались от контрольных величин.

На 10-14 сутки после травмы зафиксировано усугубление дефекта Т-лимфоцитов хелперов 1 типа, характеризующегося дефицитом ИФНу, что является прогностическим предиктором развития гнойно-септических осложнений и сепсиса (%=4,86, р<0,01). Отмечена гиперпродукция ФНОа и рр I типа ФНОа, ИЛ-8. На фоне сохраняющегося дефицита ИЛ-2 выявлено достоверное увеличение содержания рр ИЛ-2. Таким образом, происходит нарушение передачи сигнала, опосредованного ИЛ-2, как вследствие избыточного связывания ИЛ-2 с растворимыми рецепторами, так и формирования индуцированной анергии из-за потери ТЬ этих рецепторов. Таким образом, в стадию острой ожоговой токсемии формируется глубокий количественный и функциональный иммунодефицит Т-клеточного звена иммунитета.

К концу третьей недели определили сохраняющуюся гиперпродукцию провоспалительных цитокинов ФНОа, ИЛ-8, растворимых рецепторов ррФНОа, ррИЛ-2 и дефицит ИЛ-2. Повторный подъем уровня ИЛ-8 у тяжелообожженных больных можно объяснить присоединением вторичных инфекций и развитием септикотоксемии. Выявленный дефицит ИЛ-3 свидетельствует о глубоком угнетении пролиферации всех клеток кроветворения, в том числе красного кровяного ростка. При проведении корреляционного анализа в этот период установлена прямая корреляционная связь средней силы (г=0,53; р<0,05) между ИЛ-3 и количеством эритроцитов. О тенденции к восстановлению функции ТЫ свидетельствует некоторое увеличение содержания в крови ИФНу.

Содержание противовоспалительного цитокина — ИЛ-10 на протяжении всего периода исследований было стабильным (27,57±7,31 пг/мл -24,40±7,85 пг/мл) и статистически значимо не отличалось от контрольной группы, что свидетельствует о том, что на фоне активации системной воспалительной реакции не происходит включения системы противовоспалительной защиты у больных с тяжелой ожоговой травмой.

Среди обследованных нами пациентов с термической травмой умерли 6 человек (летальность 7,14%). Все с ИФ>60, следовательно, в группе тяжелообожженных летальность 9,84%. Для анализа сопряженности нарушений в системе цитокинов и летального исхода нами был применен метод Учитывая, что одним из ведущих медиаторов воспалительного ответа большинством авторов признается ФНОа, мы ретроспективно оценили его уровень в группах выживших и умерших с тяжелой ожоговой травмой на 1-3 сутки. Проведенный анализ не выявил сопряженности высокого уровня ФНОа и летального исхода (% =0,946, р=0,33). Оценка коэффициента сопряженности в 1-3 сутки после ожога уровня ИЛ-8 и летального исхода также не выявила их взаимосвязей {% =0,037, р=0,646). Оценивая медиаторы, усиливающие функцию, преимущественно, клеток макрофагального происхождения - ГМ-КСФ и ИЛ-12р70 установили сопряженность низкого уровня этих цитокинов в ранний период после ожоговой травмы с неблагоприятным исходом. Степень сопряженности высокая и статистически значимая (ГМ-КСФ %2= 14,726, р=0,0001 и ИЛ-12р70 %2=17,769, р=0,00001). Учитывая изменения значений ИЛ-8, нами проведена оценка сопряженности его высоко уровня и летального исхода в динамике. Полученные данные позволяют констатировать сопряженность высокого уровня ИЛ-8 (>300пг/мл) у больных ожоговой болезнью на 21 сутки л исследования с неблагоприятным исходом (% =1,951, р=0,005).

Таким образом, нами выявлено развитие выраженного системного воспалительного ответа у больных в ранний период ожоговой болезни с гиперпродукцией ФНОа, ГМ-КСФ, ИЛ-8, ИЛ-12р70 и существенным усилением шеддинга рецептора ФНОа I типа. Распределение пациентов по тяжести ожоговой травмы с оценкой цитокинового статуса в динамике позволило выявить целый ряд закономерностей, отражающих механизмы развития им-мунодефицитного состояния у больных, особенно с тяжелой термической травмой, которые необходимо учитывать при разработке программ их патогенетической терапии. Дефицит ИФНу на 10-14 сутки после ожоговой травмы является прогностическим предиктором развития гнойно-септических осложнений и сепсиса. Разработаны дополнительные иммунологические критерии неблагоприятного прогноза у больных ожоговой болезнью с ИФ>60: низкий уровень ГМ-КСФ (<5 пг/мл) и ИЛ-12р70 (<2 пг/мл) в 1-3 сутки и повышение ИЛ-8 (>300 пг/мл) на 21 сутки после ожоговой травмы.

Для изучения степени воспалительной реакции, у обследованных больных, нами исследован уровень белков острой фазы в сыворотке крови в динамике (на 1-3, 10-14 и 21 сутки) после термической травмы. Для анализа из большой группы реактантов острой фазы было выбрано 3 протеина. Из класса I - С - реактивный белок (СРБ) и а1-кислый гликопротеин, первый из которых относится в норме к группе минорных, а при воспалении — к группе сильных белков. А второй — к группе белков средней силы. Гены белков этого класса регулируются ФНОа, ИЛ-1, 6. Из класса II — определяли а 1-антитрипсин, относящийся к группе средних белков, индуцируемых ИЛ-6, но не ИЛ-1.

Учитывая, что ответ острой фазы характеризуется стадийностью, нами проведена оценка исследуемых белков в разные периоды ожоговой болезни. Выявлено существенное увеличение (в 500 раз) количества СРБ в ранний период ожоговой травмы. Его содержание снижалось у больных к 10-14 суткам почти в 3 раза и оставалось на близком уровне до 21 суток. При этом и к 21 дню значения оставались в 200 раз выше, чем у здоровых людей. СРБ относится к факторам врожденного иммунитета и, благодаря сродству к фос-фолипидам мембран, участвует в элиминации поврежденных клеток из организма. При этом его цитотропная активность распространяется на клетки, участвующие в ранних реакциях защиты (нейтрофилы, моноциты), и на лимфоциты.

Анализ изменений СРБ проведен у больных с разной степенью тяжести ожоговой болезни. В ранний период установлена однотипная реакция в обеих группах: резкое повышение (184,83±39,31 г/л и 202,17±22,06 г/л против 0,32±0,07 г/л). В дальнейшем у обожженных средней степени тяжести СРБ снижался к 10-14 суткам (более чем в 5 раз) и продолжал снижаться к 21 суткам. У тяжелообожженных СРБ к 10-14 суткам снижался лишь в 2 раза, а на 21 день зафиксирована тенденция к повторному повышению. При этом его уровень был в сотни раз выше, чем в контрольной группе и в десять раз превышал уровень у пациентов средней степени тяжести. Несмотря на многочисленные позитивные механизмы действия СРБ, длительная (3 недели) его гиперпродукция у больньгс с тяжелым течением ожоговой болезни способствует превалированию ТЬ2 типа иммунного ответа, что нельзя считать целесообразным защитно-приспособительным механизмом, особенно в период септикотоксемии. Это также подтверждается корреляционными взаимосвязями в данном периоде: .прямая средней силы связь между уровнем СРБ и ФНОа (г=0,6, <0,05), сильная связь между СРБ и ИЛ-8 (г=0,82, <0,01) и отрицательная зависимость с ИЛ-2 (г=-0,58, <0,05) и ИФНу (г=-0,53, <0,05). Полученные данные свидетельствуют о длительном некомпенсированном системном воспалительном ответе у тяжелообожженных больных, что позволяет считать высокий уровень СРБ одним из дополнительных критериев тяжести больного с ожоговой травмой: на 10-14 и 21 сутки СРБ > 50 пг/мл (%2=6,42, р<0,002, при 2 степенях свободы).

Основными биологическими эффектами al-кислого гликопротеина (al-КГП) являются: способность связывать гистамин, ингибировать агрегацию тромбоцитов, взаимодействовать с фосфолипидами мембран. Он обладает также иммунокоррегирующими свойствами: предотвращает агрегацию нейтрофилов, снижает активность NK-клеток, нарушает киллинг поверхностных иммуноглобулинов, уменьшает образование супероксидных радикалов, in vitro стимулирует пролиферацию клеток. Это позволяет считать, что al-КГП обладает широким спектром биологических свойств, способных ограничивать патологический процесс. По данным литературы, пик концентрации al-КГП (при механической травме и ожогах) отмечается не ранее 3-4 суток. По нашим данным, двукратное увеличение концентрации al-КГП определяется уже на 1-3 сутки и нарастает к 10-14 в 1,5 раза, оставаясь на близком уровне к 21 дню. При этом в ранний период после травмы значения al-КГП увеличиваются в обеих группах ожоговых больных, хотя у тяжело-обожженных существенно выше (2,15±0,03 г/л против 0,89±0,15 г/л, р<0,001 в группе ИФ>60; 1,77±0,32 г/л против 0,89±0,15 г/л р<0,001 в группе ИФ 3160). Эти различия сохраняются и к 10-14 суткам (2,91±0,33 г/л против 1,84±0,21 г/л) и только к 21 суткам уровень острофазного белка становится практически равным, в обеих основных группах, превышая значения контроля в 2 и более раз. Таким образом, оценка содержания al-КГП в сыворотке крови больных ОБ (на 10-14 сутки) с уровнем превышающим 2,1 г/л служит дополнительным признаком тяжести состояния больного. а 1-антитрипсин (а1-АТ) — гликопротеид с молекулярным весом 60 ООО, он относится к а 1-глобулинам, составляя около 90% их фракции, и дает около 90% антитрипсиновой активности сыворотки крови. Это один из важнейших антипротеолитических ферментов, физиологическая функция которых состоит в ингибировании активности эластазоподобных и химотрипси-ноподобных протеаз, поступающих из некротизированных тканей и грануло-цитов в воспалительные экссудаты и вызывающих вторичное повреждение тканей. По нашим данным, у больных в ранний период ожоговой болезни количество а1-АТ повышается, но незначительно (2,40±0,12 г/л против 2,0±0,25 г/л в контроле). Существенно (почти в 2 раза) повышение отмечалось к 10-14 суткам (3,86±0,10 г/л против 2,40±0,12 г/л в 1-3 сутки, р<0,001), что соответствует нормальному течению защитно-приспособительных реакций и, в целом, отражает адекватное участие антипротеаз при термической травме в период септикотоксемии. Однако к 21 суткам зафиксировано существенное снижение уровня а1-АТ (2,10±0,09 г/л против 3,86±0,10 г/л на 10-14 сутки, р<0,001). Его уровень стал не только в 2 раза ниже, чем в прошлом периоде, но и статистически ниже, чем в ранний период ожоговой болезни (2,10±0,09 г/л против 2,40±0,12 г/л в 1-3 сутки, р<0,05), достигая уровня контрольной группы. Такая динамика не соответствует тяжелому состоянию многих больных. Поэтому проведен анализ уровня этого белка отдельно в группах средней степени тяжести и в группе с тяжелым течением ожоговой болезни. У больных средней степени тяжести динамика изменений а1-АТ соответствовала выше изложенной, тогда как у тяжелообожженных уровень к 10-14 суткам практически не изменился по сравнению с ранним периодом (2,46±0,14 г/л против 2,57±0,25 г/л, р>0,05), а к 21 суткам снизился до исходного (1,79±0,15 г/л против 2,0±0,25 г/л в контроле). Весьма вероятно, что относительно низкий уровень а1-АТ отражает процесс его активного потребления при массивном повреждении тканей и, в то же время, свидетельствует о недостаточной активации этого важного защитно-приспособительного механизма, особенно в группе тяжелобольных. Нам не удалось обнаружить статистически значимых взаимосвязей а1-АТ с анализируемыми параметрами ци-токинового профиля.

Таким образом, при оценке уровня важнейших реактантов острой фазы нами установлено: во-первых, у больных с ожоговой травмой в ранний период существенно увеличивается уровень СРБ и а1-КГП, во-вторых, увеличение СРБ более 50 г/л на 10-14 и 21 сутки является дополнительным диагностическим признаком тяжести состояния больного, в третьих, степень увеличение а1-КГП на 1-3 и 10-14 сутки у тяжелообожженных в 1,5 раза выше, чем у пациентов с ИФ 30-59. Выявлен относительно более низкий уровень а1-АТ у больных с тяжелой ожоговой травмой на 10-14 и 21 сутки, по сравнению с группой средней степени тяжести. Уровень СРБ >100 г/л на 10-14 сутки сопряжен с неблагоприятным исходом % =4,126, р=0,001.

Экспериментальное моделирование ожоговой болезни и механизмы клинико-иммунологичекой эффективности иммуномодулятора пептидной природы - ганглиина. Выполнение настоящего раздела нашей работы осуществлялось предварительно на неинбредных мышах. Оценивали отсутствие токсического эффекта разных концентраций используемой в опытах серии препарата ганглиин. Не выявлено различий в поведении, активности, состоянии шерсти, показателях гемодинамики, частоты дыхания в группах мышей, получавших внутрибрюшинно ганглиин в дозах 5-100 мг/кг или получавших внутрибрюшинно физиологический раствор. Далее на экспериментальной модели термической травмы (ожог 30% поверхности тела животного, глубина ЗБ степени) была произведена оценка клинического состояния, фагоцитарной системы (фагоцитарная активность, фагоцитарное число, состояние кислородзависимых механизмов бактерицидности), перекисного окисления липидов, антирадикальной системы и уровня оппозитных цитокинов животных разных групп: 1 группа - основная (опытная) - мыши с экспериментальной ожоговой травмой, получавшие 0,1 мг/кг ганглиина внутрибрюшинно; 2 группа - сравнения - мыши, получавшие аналогичную ожоговую травму и внутрибрюшинно физиологический раствор; 3 группа — контрольная — ин-тактные животные. Не выявлено существенного влияния ганглиина на уровень летальности. Однако, общее состояние мышей, их активность в основной группе на 3 и 10 сутки эксперимента были оценены статистически значимо выше (р<0,05), чем в группе сравнения. При этом активность и общее состояние мышей 1 и 2 групп были ниже, чем в контрольной (р<0,01). Анализ показателей фагоцитарной активности лейкоцитов крови мышей экспериментальных групп выявил значимую депрессию количественных показателей фагоцитоза (индекса Гамбургера, и индекса Райта). В первые сутки после травмы у мышей обеих групп (основной и сравнения) значения индекса Гамбургера были в 2 раза ниже, чем в контрольной группе. Фагоцитарное число также статистически значимо было снижено. На третьи сутки после травмы в опытных группах выявлена разнонаправленная динамика: у мышей основной группы увеличился уровень фагоцитарной активности и фагоцитарное число, достигая уровня показателей контрольной группы. К 10 суткам происходит значительное увеличение удельного веса фагоцитирующих клеток, тогда как фагоцитарное число изменялось мало. При этом значений контрольной группы не было достигнуто и к 10 суткам. В группе сравнения выявлено усугубление депрессии активности фагоцитирующих клеток по показателю индекса Гамбургера на 3 сутки. К 10 суткам зафиксировано повышение значений фагоцитарной активности и по индексу Гамбургера, и по индексу Райта. Однако удельный вес фагоцитирующих лейкоцитов был существенно ниже как по сравнению с контрольной группой, так и с основной.

Интегральная оценка кислородзависимых механизмов бактерицидно-сти лейкоцитов экспериментальных животных в НСТ-тесте выявила значимые изменения показателей. В основной группе показатели спонтанного НСТ-теста в первые сутки после травмы превышали значения контрольной группы в 1,8 раза (55,3±2,б ОДхЮ"3 против 32,0±1,2 ОДхЮ"3, р<0,001) и были в 2 раза выше, чем в группе сравнения (55,3±2,б ОДхЮ"3 против 27,0±1,0

ОДхЮ"3, р<0.001). Показатели индуцированного НСТ-теста мало отличались от контрольной группы, но были выше, чем у мышей группы сравнения. Фагоцитарный резерв (ФР) у мышей основной экспериментальной группы значительно снизился в 1 сутки (0,82±0,04 против 1,23±0,1 в контроле, р<0,001). На 3 сутки за счет снижения показателей спонтанного НСТ-теста (29,7±1,7

2 о

ОДхЮ" против 55,3±2,6 ОДхЮ , р<0,001) и менее значимого снижения индуцированного НСТ-теста — ФР повысился до нормальных величин (1,17±0,08 против 0,82±0,04 в 1 сутки, р<0,01). К 10 суткам увеличение показателей индуцированного НСТ-теста определяют тенденцию к увеличению ФР, что, по нашему мнению, отражает влияние ганглиина на процессы метаболической активности нейтрофилов и макрофагов. В группе сравнения показатели индуцированного НСТ-теста были снижены в 1 сутки как по сравнению с контрольной (34,5±1,1 ОДхЮ"3 против 39,0±0,7 ОДхЮ"3, р<0,01), так и основной группами (34,5±1,1 ОДхЮ"3 против 44,86±1,7 ОДхЮ"3, р<0,001). Но значения фагоцитарного резерва остались в норме, так как снизился и спонтанный НСТ-тест. На 3 сутки зафиксирована тенденция к снижению уровня ФР за счет снижения индуцированного НСТ-теста, и сохранения спонтанного практически на том же уровне. К 10 суткам дисбаланс кислородных механизмов бактерицидности усугубился, в основном за счет повышения спонтанного НСТ-теста (34,0±0,6 ОДхЮ"3 против 28,3±0,9 ОДхЮ"3, р<0,01) и сохранении индуцированного на прежнем уровне, и показатели ФР стали статистически значимо ниже, чем в основной группе (0,9±0,02 против 1,35±0,06, р<0,001) и контроле (0,9±0,02 против 1,23±0,1, р<0,001).

В патогенезе ожоговой болезни важное место занимает развитие циркулярной, гемической, гипоксической и тканевой форм гипоксии, сопровождающейся усилением ПОЛ уже с первых дней после получения травмы. При термических повреждениях клетки кожи и подлежащей ткани становятся мощным источником свободных радикалов, что приводит к избыточному образованию активных форм кислорода и резкой интенсификации процессов ПОЛ во внутренних органах. Происходит избыточное накопление - диеновых конъюгатов и малонового диальдегида в тканях. Токсичность продуктов ПОЛ настолько велика, что ряд исследователей отводит им роль «ожоговых токсинов». Свободные радикалы кислорода вызывают прямое повреждение ДНК, липидов, белков, способствуют образованию пероксидных радикалов и пероксидов, способствуют увеличению потребления фагоцитами кислорода и переводом его в активные формы супероксиданиона или синглетного кислорода, которые инициируют нарушения микроциркуляции со всеми вытекающими последствиями. Сравнительное исследование продуктов ПОЛ в липид-ных экстрактах крови экспериментальных животных с ожогом, получавших и не получавших тинростим, и животных контрольной группы показало, что в основной группе выявлено более быстрое восстановление процессов перекисного окисления липидов.

Активация процессов ПОЛ при ожогах может'быть не только результатом усиленного образования кислородных радикалов, но и следствием нарушения функционирования ферментативных механизмов антирадикальной защиты клетки с участием супероксиддисмутазы (СОД) и каталазы. СОД — фермент, инактивирующий супероксид кислорода, входит в антиокси-дантную систему организма, содержится во всех клетках. Определение активности СОД позволяет оценить степень защиты организма от свободнора-дикального окисления и интенсивность-ПОЛ. Нами было проведено исследование состояния АОС в анализируемых экспериментальных группах. Выявлено, что ожоговая травма приводит к изменению уровня СОД экспериментальных животных. В первые сутки после ожога в основной опытной группе зарегистрировано статистически значимое снижение этого фермента (23,53±2,76% против 30,7±1,86% до ожога, р<0,05), тогда как в группе сравнения, напротив, установлено существенное увеличение его количества (45,28±2,67% против 34,20±2,40%, р<0,01). На 3 сутки в обеих группах выявляли высокий и практически равный уровень СОД, с последующим снижением к 10 суткам, более выраженном в группе мышей, получавших тинростим (29,5±3,51% - опытная группа против 38,80±2,60% - группа сравнения, р<0,05).

Нами сопоставлена динамика показателей ПОЛ и СОД в двух группах экспериментальных животных. У животных группы сравнения, получивших ожог, уже в первые сутки более чем в 2 раза возрастало содержание первичных продуктов ПОЛ в липидных экстрактах крови, и их уровень снижался только к 10 суткам после травмы. Уровень вторичных продуктов ПОЛ увеличивался в 1 сутки незначительно, их количество статистически значимо повышалось только к 3 суткам, оставаясь на таком уровне и на 10 сутки. Уровень СОД изменялся аналогично динамике первичных продуктов ПОЛ. У животных основной группы, получивших тинростим, в 1 сутки после ожога в 1,7 раза возрастал уровень первичных продуктов ПОЛ, и одновременно в 2 раза увеличивалось содержание вторичных продуктов ПОЛ, тогда как количество СОД, напротив, снижалось. На 3 сутки после ожога значительно снижался уровень первичных продуктов ПОЛ, тогда как содержание СОД и вторичных продуктов ПОЛ - возрастало, с последующим снижением до уровня контрольных величин к 10 суткам после ожога. Полученные данные подтверждают важную роль активации ПОЛ и окислительного стресса в патогенезе ожоговой болезни. Применение тинростима не защищает животных от окислительного стресса, но оказывает модулирующее действие уже в раннем периоде после термической травмы, обеспечивая одновременное увеличение вторичных продуктов ПОЛ. Низкий уровень СОД в этот период, вероятно, связан с ее потреблением и отражает напряжение компенсаторных механизмов.

Таким образом, нами подтверждено, что ожоговую болезнь следует рассматривать как иммунодефицитное заболевание, при котором отмечается раннее и продолжительное снижение показателей врожденного иммунитета на фоне острейшего дефицита энергетических и пластических ресурсов. Этому способствуют обширное повреждение кожи как иммунного органа, стресс во время травмы, воздействие огромного количества токсинов обожженных тканей, усиление пероксидации липидов, нарушение мембранных систем клеток, действие антибиотиков, гормонов, многократных наркозов и операций АДП. При тяжелых термических травмах особенно угнетены клеточные механизмы защиты, что, в свою очередь, приводит к резкому снижению сопротивляемости организма к инфекции. Дисбаланс в системе цитоки-нов вносит существенный вклад в патогенез ожоговой болезни.

В эксперименте установлено, что применение иммуномодулятора пептидной природы (ганглиина) способствует быстрому восстановлению показателей фагоцитоза (индекс Гамбургера, индекс Райта). Отмечено позитивное влияние ганглиина и на кислородзависимые механизмы бактерицидности и фагоцитарный резерв, восстановление процессов ПОЛ. Применение ганглиина не защищает от окислительного стресса, но оказывает модулирующее действие уже в раннем периоде, обеспечивая одновременное увеличение вторичных продуктов ПОЛ.

Исследования цитокинов (ИЛ-10 и ИФГГу) в эксперименте позволяют констатировать, что ожоговая травма приводит к глубокой депрессии ТЫ типа, практически не влияя на уровень медиатора, продуцируемого ТЬ2 клетками. Применение иммуномодулятора пептидной природы влияет в большей степени на уровень ИЛ-10, обладающего выраженным противовоспалительными свойствами и усиливающими гуморальный иммунитет.

Таким образом, экспериментальные исследования позволили впервые на модели ожоговой травмы установить иммуномодулирующий эффект иммуномодулятора пептидной природы - ганглиина. Его применение обеспечивает усиление выработки ИЛ-10 и, в меньшей мере, ИФНу, что в совокупности усиливает фагоцитарную активность лейкоцитов, уменьшая при этом выраженность оксидативного стресса.