Автореферат и диссертация по медицине (14.00.53) на тему:Геропротекторное и регуляторное действие пептидов на клетки тимуса

ДИССЕРТАЦИЯ
Геропротекторное и регуляторное действие пептидов на клетки тимуса - диссертация, тема по медицине
АВТОРЕФЕРАТ
Геропротекторное и регуляторное действие пептидов на клетки тимуса - тема автореферата по медицине
Полякова, Виктория Олеговна Санкт-Петербург 2003 г.
Ученая степень
кандидата биологических наук
ВАК РФ
14.00.53
 
 

Автореферат диссертации по медицине на тему Геропротекторное и регуляторное действие пептидов на клетки тимуса

На правах рукописи

ПОЛЯКОВА Виктория Олеговна

ГЕРОПРОТЕКТОРНОЕ И РЕГУЛЯТОРНОЕ ДЕЙСТВИЕ ПЕПТИДОВ НА КЛЕТКИ ТИМУСА

14.00.53 - геронтология и гериатрия

I

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург - 2003

Работа выполнена в Санкт-Петербургском институте биорегуляции я геронтологии Северо-Западного отделения РАМН

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Кветной Игорь Моисеевич

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАМН, заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Аничков Николай Мильевич

доктор биологических наук Степанов Михаил Григорьевич

Ведущее учреждение: Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН

Защита состоится 2003 г. в а часов на заседании

диссертационного Совета Д601.001.01 при Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН по адресу: 197110 Санкт-Петербург, пр.Динамо, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН (197110 Санкт-Петербург, пр.Динамо, 3).

Автореферат разослан

¿>4

■^А^- 2003 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета кандидат биологических наук

Козина Л.С.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Известно, что возрастные изменения тимуса играют ключевую роль в ослаблении системы клеточного и гуморального иммунитета у лиц пожилого и старческого возраста [Goya R.G., Bolognani F., 1999]. Инволюция тимуса сопровождается глубокими изменениями морфологии клеток микроокружения и недостаточной выработкой нейропептидов, цитокинов и гормонов, регулирующих функциональную активность органов иммунной системы и созревание Т-лимфоцитов [Ярилин A.A., 1999]. Ускоренное старение тимуса, протекающее с подобной картиной, наблюдается также на фоне химиотерапевтического лечения, жесткого радиационного облучения и в условиях длительного стресса [Berthiaume F., Aparicio C.L., 1999]. Поиск и исследование пептидов с высокой биологической активностью, способных регулировать и восстанавливать адаптационные реакции организма является приоритетным направлением современной биологии.

Участие нейрогуморальных пептидных факторов, вырабатываемых клетками тимусного микроокружения в процессах гемопоэза и формировании иммунного ответа, послужило предпосылкой к созданию на их основе лекарственных препаратов нового поколения. На основе аминокислотного анализа природных препаратов тимуса и эпифиза в Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН были сконструированы синтетические пептиды вилон (Lys-Glu) и эпиталон (Ala-Glu-Asp-Gly), обладающие выраженными иммуномодулирующими свойствами [Морозов В.Г. и др.,

Сравнительное изучение действия вилона и эпиталона на эпителиальные клетки тимуса и Т-лимфоциты в процессе их дифференцировки и старения позволит более глубоко понять механизмы функционирования и возрастной инволюции тимуса, а также разработать подходы к пептидергической регуляции иммунных и эндокринных функций железы в процессе старения организма.

Цель и задачи исследования

Целью диссертационного исследования является сравнительное изучение действия вилона и эпиталона на эпителиальные клетки тимуса и Т-лимфоциты в процессе их дифференцировки и старения.

Для достижения указанной цели были поставлены и последовательно решены следующие задачи:

1. изучить действие пептидов на дифференцировку тимоцитов;

2. исследовать влияние вилона и эпиталона на пролиферацию и апоптоз Т-лимфоцитов;

3. определить эффекты действия вилона и эпиталона на экспрессию маркеров

2000].

активации и на секреторную активность эпите

библиотека

ггербург V »

ЗДО3 »w /j

4. оценить влияние пептидов на синтез внутриклеточных цитокинов;

5. изучить влияние пептидов на пролиферативный потенциал ТЭК при старении культур;

6. изучить функциональную морфологию тимуса крыс в радиационной модели ускоренного старений;

7. оценить геропротекторпые свойства изучаемых пептидов - вилона и эпиталона.

Научная новизна работы

В работе впервые получены данные о роли пептидов (вилона и эпиталона) в регуляции функций эпителиальных клеток тимуса и Т-лимфоцитов при старении. Установлены внутриклеточные пептидергические механизмы, участвующие в процессах пролиферации, дифференцировки и старения клеток тимуса. Проведен анализ морфо-функциональных изменений в тимусе при ускоренном старении. Выявлено 1еропротекторное и регуляторное действие вилона и эпиталона по отношению к клеткам тимуса.

Практическая значимость работы

Полученные результаты позволяют расширить представления о влиянии пептидов на развитие и функционирование клеток иммунной системы, в первую очередь Т-лимфоцитов и эпителиальных клеток тимуса. Установленное геропротекторное и регуляторное действие вилона и эпиталона на клетки тимуса открывают перспективы для детального изучения возможности применения пептидов в гериатрической практике для коррекции функций, нарушенных при старении организма.

Положения выносимые на защиту

1. Вилон и эпиталон обладают регуляторным действием на клетки тимуса in vitro, изменяя экспрессию активационных антигенов CD54, HLA-DR, CD69 на их поверхности.

2. Вилон и эпиталон проявляют геропротекторные свойства при старении культур клеток тимуса человека, ослабляя апоптоз и усиливая пролиферацию ТЭК.

3. Вилон стимулирует репаративные процессы в тимусе крыс при ускоренном (радиационном) старении.

4. Вилон и эпиталон могут рассматриваться как потенциальные иммуно- и геропротекторы.

Связь с научно - исследовательской работой Института

Диссертационная работа является темой, выполняемой по основному плану НИР Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, 7 глав, выводов и указателя литературы. Глава 1 (обзор литературы) представляет собой анализ данных литературы по функциональной морфологии тимуса и роли пептидов в регуляции иммунных и эндокринных функций железы. Глава 2 посвящена описанию материалов и методов, используемых в данном исследовании. Главы 3-6 представляют собственные экспериментальные данные изучения эффектов действия пептидов на ТЭК, тимоциты, периферические Т-лимфоциты и на структурно-функциональную организацию тимуса в модели преждевременного старения in vivo. В главе 7 обсуждаются полученные результаты. Текст диссертации изложен на 119 страницах, содержит 15 таблиц, иллюстрирован 26 рисунками. Список литературы содержит 129 источников, из которых отечественных - 82.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ.

Апробация и реализация диссертации

Материалы диссертации доложены на Четвертой Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2001); II Российской конференции молодых ученых «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2001); V научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2001» (Санкт-Петербург, 2001); научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы коррекционной психологии, психотерапии, медицины» (Санкт-Петербург, 2001); Пятой Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2002); второй научной конференции с международным участием, посвященной 80-летию со дня рождения профессора М.Г. Колпакова «Эндокринная регуляция физиологических функций в норме и патологии» (Новосибирск, 2002); Седьмой Санкт-Петербургской ассамблее молодых ученых и специалистов (Санкт-Петербург, 2002).

Результаты диссертации используются в научно-практической работе в Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН, Санкт-Петербургском Государственном университете, Санкт-Петербургской академии последипломного образования МЗ РФ. Исследования, проводимые в рамках диссертационной работы поддержаны грантом РФФИ 02-04-49873 и 1рантом для студентов, аспирантов и молодых специалистов Администрации Санкт-Петербурга и Российской академии наук в 2002 г.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

ИССЛЕДОВАНИЯ IN VITRO

Исследования in vitro проводились в культуре клеток тимуса и мононуклеаров периферической крови человека. Тимоциты выделяли из фрагментов тимуса эмбрионов человека около 20-недельного срока развития, полученных из абортного материала. В качестве тимусных эпителиальных клегок (ТЭК) использовали клетки суспензионной линии VTEC2.H/S, ранее полученной путем трансформации ТЭК эмбрионального тимуса человека материалом, содержащим вирус SV40 и последующего клонирования трансформированных клеток в отделе клеточной иммунологии ГНЦ - Института иммунологии МЗ РФ. Автор выражает глубокую благодарность руководителю отдела профессору A.A. Ярилину за консультацию и помощь при проведении экспериментов in vitro. Мононуклеары выделяли из венозной крови доноров общепринятым методом (центрифугированием над слоем фиколла-верографина).

Клетки тимуса культивировали 1 сутки, а мононуклеары крови 3 суток как без стимуляции, так и в условиях стимуляции. Для этого тимоциты и ТЭК культивировали не только порознь (в монокультурах), но и совместно (в ко-культурах с соотношением ТЭК:тимоциты, равном 1:10). Мононуклеары стимулировали митогеном ФГА. который избирательно стимулирует Т-лимфоциты. Пептиды (вилон и эпиталон) вводили в культуры в концентрациях 2,20 и 200 нг/мл.

Пролиферацию оценивали радиометрически по включению 3Н-тимидина. Проточную цитофлуорометрию осуществляли на1 проточном цитометре FACSCalibur (Becton Dickinson). Апоптоз оценивали Цитофлуорометрически путем определения процента гиподиплоидных клеток с предварительной окраской фиксированных клеток йодидом пропидия. Экспрессию мембранных молекул (CD69, HLA-DR и CD54), которую использовали для оценки активации клеток, определяли с использованием набора моноклональных антител фирмы Caltag.

Секрецию тимулина и цитокинов оценивали путем определения содержания в кульгуральных супернатантах исследуемых субстанций методом ELISA с использованием тест - наборов фирмы «Протеивовый контур». Все пробы ставились в триплетах.

Аргирофильныс белки областей ядрышковых организаторов (ОЯОР) выявляли в клетках с помощью нитрата серебра. Учитывая различную экспрессию аргирофильных белков ОЯОР в тимоцитах и эийтелиальных клетках тимуса было подобрано оптимальное время инкубации для выявления аргирофильных белков, которое составляло для тимоцитов 15 минут, а для эпителиальных клеток -10 минут.

Интенсивность экспрессии аргирофильных белков оценивали по количеству гранул серебра, образующихся в результате реакции. Для этого проводили морфомстрические исследования с использованием системы компьютерного анализа микроскопических изображений Nikon и лицензионной программы Videotest. Подсчет гранул проводили в 100 клетках при увеличении хЮОО и рассчитывали среднее число гранул серебра на I ядро тимоцита и эпителиальной клетки, определяя среднее количество гранул в каждой исследованной группе. Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы Statistika 5.0 (Statsofl).

ИССЛЕДОВАНИЯ IN VIVO

Эксперименты in vivo выполнены на 40 самцах белых крыс линии Вистар в возрасте 2-х месяцев, имеющих массу тела 180-200 г. Животные содержались в обычных условиях вивария при дневном освещении и сбалансированном рационе питания. Для моделирования преждевременного старения использовали гамма-облучение, на аппарате ЛУЧ-1 (источник 60Со; мощность дозы 17,166x1o"4 Гр/с). Животные получали ежедневную дозу 6 Гр в течение 5 дней. Все животные были разделены на 8 групп (табл. 1): 1 и 1а интактные крысы; 2 и 2а - облученные крысы; 3 и За - облученные животные, которым вводился вилон; 4 и 4а - крысы, которым вводился вилон (без облучения). Вилон вводили через 24 часа после первого сеанса облучения по 0,5 мкг (в 0,5 мл физиологического раствора) в течение 10 дней подкожно животным 3, За, 4, 4а групп. Животным 2 и 2а групп вводилось эквивалентное количество физиологического раствора по той же схеме.

Эвтаназию животных проводили с соблюдением общепринятых правил. Забой животных и выделение тимуса проводили под нембуталовым наркозом (50 мг/кг). Тимус у животных 1-4 групп брали на 14 сутки от начала эксперимента, а у 1а-4а групп - на 21 сутки от начала эксперимента. Автор выражает глубокую благодарность кандидату медицинских наук В.В. Южакову за методическую помощь при проведении облучения животных.

Распределение животных по группам и срокам взятия материала

Группы Сроки эксперимента Всего животных

14 сутки от начала эксперимента 21 сутки от начала эксперимента

1 - контроль 5 - 5

1а-контроль - 5 5

2 - облучение + физ. р-р 5 - 5

2а - облучение + физ. р-р - 5 5

3 - облучение + вилон 5 : 5

За - облучение + вилон - 5 5

4 - введение вилона 5 - 5

4а - введение вилона - 5 5

Для свето-микроскопических исследований кусочки тимуса фиксировали в течение 24 ч в кислой жидкости Буэпа. Обезвоживание материала и заливка в парафин проводились по общепринятым методикам. Парафиновые срезы (7 мкм) помещали на предметные стекла, покрытые пленкой из поли-Ь-лизина (Sigma). Общегистологическое и иммуногистохимическое изучение проводили с использованием микроскопа Jenamed-2 (Zeiss). Обзорную окраску препаратов осуществляли гематоксилином - эозином. Тучные клетки селективно окрашивали 1% раствором толуидинового синего (Fluka) в 0,5М HCl при pH 0,5.

Для электронной микроскопии кусочки тимуса фиксировали по Карновскому. Обезвоживание материала и заливку в смесь эпонов проводили по общепринятым методикам. Ультратонкие срезы (100 нм), приготовленные на ультрамикротоме LKB-7A (LKB) контрастировали уранил-ацетатом и цитратом свинца. Электронно-микроскопическое исследование осуществляли в электронном микроскопе JEM-1 OOS (Jeol).

Для изучения пролиферативной активности клеток использовали мышиные моноклональные антитела к пролиферативному клеточному ядерному антигену

(proliferative cell nuclear antigen - PCNA, клон PC10, Calbiochem, титр 1:50). Визуализацию иммуногистохимической реакции проводили авидин-биотин-пероксидазным методом с использованием набора для выявления мышиных иммуноглобулинов (ABP-kit, Vectastain).

Морфометрические исследования выполнены с помощью системы компьютерного анализа микроскопических изображений Imstar с применением пакета лицензионных программ Morphostar и Colquant-2, согласно основным принципам стереологии и морфометрии. Для каждого животного подсчет соответствующих структур проводили в 10 визуальных полях зрения по трем срезам. Тестовая площадь включала не менее 10000 ядер тимоцитов. Тучные клетки в тимусе измеряли на площади не менее 5 мм2. Индекс пролиферативной активности (I pcna) вычисляли по формуле:

Ipcna(%)-N pcna/N ядер х 100 Для статистической обработки полученных результатов использовали t-критерий Стьюдента и непараметрический U-критерий Манн-Уитни.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Действие вилона и эпиталона на эпителиальные клетки тимуса (ТЭК)

Экспрессия маркеров активации

Проведенные исследования показали разнонаправленное действие пептидов на экспрессию СБ69 с одной стороны и НЬА- ВЯ и С054 - с другой. В отношении С054 и Ш..А-1Ж проявлялся сходный эффект вилона и эпиталона, состоящий в подавлении экспрессии этих маркеров активации (табл. 2). По отношению к обоим маркерам эффект вилона был выражен сильнее, чем эпиталона. В то же время направленность действия вилона и эпиталона на экспрессию раннего активационного антигена С069 на ТЭК противоположна: вилон усиливает, а эпиталон подавляет ее. Эффекты действия пептидов зависят от дозы, дозовые кривые реципрокны друг другу.

Влияние вилона и эпиталона на экспрессию молекул активации на поверхности тимоцитов и ТЭК1

Пептид Доза, нг/мл 'Гимоциты ТЭК

С069 СБ54 НЬД-РЯ СР69 С054 НЬД-ОЯ

Контроль 0 43,6±7,5 36,2±2,7 34,2*5,0 7,2+0,6 92,2±10,5 74,3+9,7

Вилон 2 36,5+6,2 69,3+3,9* 36,3±4,3 11,5+0,9 69,8+7,5 42,5+6,5*

20 38,9±4,9 64,4+2,9* 38,6+6,1 15,3*1,1» 70,9+9,2* 41,5+7,2*

200 38,5±5,7 52,7+5,2* 41,4+2,7 10,2±0,6 67,5+8,7* 29,9+3,6*

Эпиталон 2 43,0±3,8 52,8+4,3* 43,3+3,5 5,2+1,1 79,9*11,6 50,6+8,2*

20 37,7+6,1* 51,4±4,2* 52,5+4,5* 1,5±0,07* 84,0+17,5 51,8+7,8*

200 38,5+6,0 46,5+3,7* 44,0±5,1 1,8±0,09* 72,9+15,6* 48,9+9,1*

1 Представлены процентное содержание клеток, несущих указанные маркеры. В скобках представлены данные о влиянии пептидов на экспрессию С069 на тимоцитах в их совместной куль+уре с ТЭК.

*- различия достоверно отличаются от контроля (р< 0,05)

Секреторная функция

Обнаружено,' что вилон и эпиталон не влияют на спонтанную выработку тимулина, но полностью отменяют ее усиление, вызванное контактом ТЭК с тимоцитами.

Напротив, оба пептида существенно усиливают выработку ИЛ-1Р и ИЛ-7 в монокультуре ТЭК (рис. 1): При анализе секреции этих цитокинов в ко-культуре ТЭК и тимоцитов, было выявлено, что ингибирующее действие в этих системах проявлял лишь эпиталон.

а)

5Е *

а <в

а. х

Ь о.

X ф

а с

=г >.

I о

о. «

б)

0,4

0,3

0,2

0,1

-г-

I

Спонтанная

Индуцированная

с ь

>ч I

5 „-

г >•

I

Спонтанная

Индуцированная

□ Контроль 0 Вилон ■ Эпиталон

Рис 1 ВлияниепептидовнасекрециюИЛ-1Р(а)иИЛ-7 (б)-спонтанную (в

монокультуре ТЭК) и индуцированную (в ко-культуре ТЭК и тимоцитов). * - различия достоверно отличаются от контроля (р<0, 05)

Пролиферативная активность при старении культур

Оценивали пролиферацию ТЭК, прошедших 1, 4 и 7 пассажей (табл. 3) в присутствии пептидов и без них. Существенного влияния на включение метки в 1-суточные культуры ТЭК 1-го и 4-го пассажей не наблюдалось. При действии эпиталона на пролиферацию ТЭК 7-го пассажа тенденция к усилению пролиферации была зарегистрирована при дозах эпиталона 20 нг/мл.

Таблица 3

Влияние пептидов на пролиферацию ТЭК, подвергшихся 1,4 и 7 пассажам

Пептид Доза, нг/мл 1 пассаж 4 пассаж 7 пассаж

Контроль 0 1560193 715+54 523+32

2 1480+89 730154 705146*

Вилон 20 1585+95 680148 680±41*

200 1530191 760158 795±49*

2 1540193 695148 653±39*

Эпиталон 20 1674198 675145 614+35*

200 1525190 710152 538±34

* - различия достоверно отличаются от контроля (р<0,05)

В то же время, все три испытанные дозы вилона (2, 20, 200 нг/мл) существенно усиливали пролиферацию ТЭК, особенно в 7 пассаже, причем наиболее выраженным был эффект вилона в дозе 200 нг/мл. Полученные данные свидетельствуют, как о способности вилона усиливать пролиферацию ТЭК в старых культурах, так и о тканеспецифичности эффекта пептидов.

Экспрессия белков ядрышковых организаторов

В ТЭК контрольных препаратов при инкубации в растворе серебра в течение 10 мину! среднее число аргирофильных гранул на 1 ядро составляло 22,7±0,47. При инкубации препаратов в течение 15 мин реакция в ТЭК была более интенсивная и гранулы серебра в ядрах эпителиальных клеток сливались в отдельные глыбки.

При действии всех концентраций вилона в эпителиальных клетках наблюдалось повышение содержания гранул серебра. При этом наибольшие изменения отмечались при концентрации вилона 20 нг/мл и 200 нг/мл. При концентрации вилона 2 нг/мл среднее число гранул серебра на 1 ядро эпителиальной клетки составляло 24,9±0,41, что достоверно превышало контрольные значения на 9,6% (Р<0,01). При концентрации вилона 20 нг/мл среднее число гранул серебра на 1 ядро составляло 27,8±0,91, а при

концентрации 200 нг/мл - 28,8+0,59 гранул на 1 ядро. Эта* показатели достоверно превышали контрот>ные значения соответственно на 22% (Р<0,001) и 26% (Р<0,001). '

При действии эпиталона во всех концентрациях в ТЭК наблюдалось снижение количества гранул серебра. При концентрации эпиталона 2 нг/мл среднее число гранул серебра на 1 ядро эпителиальной клетки составляло 20,5±0,51, что достоверно было ниже контрольных значений на 10% (Р<0,001). При концентрации эпиталона 20 нг/мл среднее число гранул серебра на 1 ядро эпителиальной клетки составляло 20,7±0,51, а при концентрации 200 нг/мл - 20,9±0,56, что было достоверно ниже контрольных значений соответственно на 9,6% и 8,6% (Р<0,01 и Р<0,02 соответственно).

Действие вилона и эпиталона на тимоциты

Экспрессия маркеров активации на тимоцитах

Действие вилона и эпиталона на тимоциты было конкордатным. Оба пептида усиливали экспрессию на тимоцитах двух молекул активации - НЬА-ЛЖ и СБ54 и ослабляли экспрессию раннего активационного антигена С069. Действие вилона на экспрессию С1Э54 выражено сильнее, а его действие на СБ69 проявляется в более широком диапазоне доз. Наоборот, более выраженным эффектом на экспрессию молекул главного комплекса гистосовместимости класса П, НЬА-ОЯ обладает эпиталон. При действии в ко-культуре тимоцитов и ТЭК вилон в дозе 200 нг/мл усиливает экспрессию СЕ>69 на тимоцитах.

Апоптоз тимоцитов

Вилон и эпиталон ослабляли апоптоз тимоцитов, индуцированный контактом с ТЭК. Наиболее выраженное антиапоптотическое действие проявил эпиталон в дозах 20 и 200 нг/мл.

Экспрессия белков ядрышковых организаторов

В контроле тимоциты представляли однородную популяцию клеток,

характеризующихся небольшими размерами и содержащих ядра с плотной структурой хроматина. В тимоцитах при инкубации в растворе серебра в течение 15 минут отмечалось невысокое содержание гранул серебра. В среднем число гранул на 1 ядро составляло 3,15±0,08. При инкубации в течение 10 мин реакция в тимоцитах практически отсутствовала.

При введении в культуральную среду вилона в концентрации 2 нг/мл существенных изменений со стороны тимоцитов зарегистрировано не было. В тимоцитах

13

отмечалось лишь незначительное повышение числа гранул серебра по сравнению с контрольными значениями. Среднее число гранул серебра на 1 ядро в этих условиях составляло 3,3±0,13, что недостоверно превышало контрольные значения на 4% (Р<0,5).

Увеличение в культуральной среде концентрации вилона до 20 и 200 нг/мл приводило к заметному повышению числа гранул серебра в тимоцитах. При концентрации вилона 20 нг/мл количество гранул серебра составляло в среднем 3,73+0,12 на 1 ядро; при концентрации 200 нг/мл среднее число гранул серебра на 1 ядро тимоцитов составляло 3,9310,10. Эти показатели досюверно превышали контрольные значения соответственно на 18% и 24% (Р<0,001).

Эпиталон подавлял экспрессию аргирофильных белков в тимоцитах. При этом действие препарата не зависело от его концентрации. Регистрируемые различия в содержании гранул серебра в тимоцитах в зависимости от концентрации эпитапона недостоверны (Р<0,5).

Действие вилона и эпиталона на периферические Т-лимфоциты

Пролиферация и апоптоз лимфоцитов

Вилон и эпиталон не оказывали значимого влияния ни на спонтанную, ни на индуцированную пролиферацию клеток. Отклонения от средних значений при использовании различных доз препаратов носили разнонаправленный характер. Отсутствие ко-стимулирующего эффекта пептидов, возможно, связано с использованием высоких концентраций ФГА (10 мкг/мл) для стимуляции Т-клеток.

Таблица 4

Влияние пептидов на пролиферацию и апоптоз лимфоцитов крови человека

Пептид Доза, нг/мл Пролиферация, имп/мин х10"3 Апоптоз, %

спонтанная индуцированная спонтанная индуцированная

Контроль 0 7,2+2,1 149,1+56,3 12,0+1,2 20,3+3,6

Вилон 2 8,5+2,6 144,5+48,0 11,6+1,1 17,9±2,2

20 7,813,0 156,5+62,3 12,2+1,3 16,0±2,1

200 8,0+2,7 153,5+54,7 13,9+1,5 21,1+3,4

Эпиталон 2 8,6+4,0 143,0+42,3 14,1+1,6 17,5+3,3 ,

20 6,5+4.1 140,1+46,2 14,4+0,9 27,6+3,8*

200 7,7+4,0 163,9+61,0 15.6И,3 22,3+3,0

* - значение достоверно отличное от контроля (р<0,05)

Пептиды не влияют на клеточный цикл покоящихся мононуклеаров. Значимые эффекты отсутствуют и в отношении ФГА активированных клеток, однако при высоких дозах обоих пептидов намечается тенденция к повышению доли клеток, находящихся в фазах G2/M. Хотя статистически значимого влияния пептидов на апоптоз стимулированных Т-клеток не отмечено (кроме эпиталона в дозе 20 нг/мл), при использовании этого пептида проявлялась четкая тенденция к усилению апоптоза мононуклеаров, как нестимулированных, так и стимулированных ФГА.

Внутриклеточный синтез цшпокинов

Изученные пептиды оказывают влияние на экспрессию внутриклеточных цитокинов в активированных Т-клетках. Так обнаружено ослабление экспрессии ИЛ-4 при действии низких доз вилона и эпиталона. Вилон не оказывал влияния на экспрессию ИФНу в мононуклеарах и активированных Т-клетках. В то же время высокие дозы эпиталона снижали число Т-клеток, экспрессирующих ИФНу. Установлено, что повышение соотношения ИФНу+ и ИЛ-4+ клеток закономерно проявляется при использовании малых и промежуточных доз обоих пептидов.

Влияние вилона на клетки тимуса при радиационном старении in vivo

Световая микроскопия

На гистологических срезах, окрашенных гематоксилином-эозином, тимус контрольных животных имеет дольчатое строение. Форма и размеры долек вариабельны. Между дольками видны тонкие прослойки соединительной ткани, содержащие мелкие кровеносные сосуды. В дольках отчетливо различаются расположенное снаружи корковое вещество и центрально расположенное мозговое вещество. - • .

Внутри коркового слоя находятся, главным образом, неделящиеся малые тимусные лимфоциты, расположенные между эпителиальными клетками коры. Эпителиальные клетки немногочисленны, имеют звездчатую форму за счет длинных и тонких цитоплазматических отростков, которые соединяясь друг С другом образуют сеть, в которой располагаются тимоциты коркового вещества. Тимоциты имеют округлое хорошо окрашенное ядро с ядрышками. В мозговом веществе количество лимфоцитов существенно меньше, чем в корковом, а клеточный состав представлен, в основном, эпителиальными клетками.

На 14-е и 21-е сутки после облучения (2, 2а групны) на гистологических срезах, окрашенных гематоксилин-эозином, отмечается йарушенйе структурной организации

тимуса, выражающееся, прежде всего в атрофических изменениях. Количество долек и их размеры значительно уменьшены. Деление на корковое и мозговое вещество стирается, граница между слоями фактически исчезает. В мозговом веществе незначительно увеличено содержание лимфоцитов. Соотношение между паренхимой и стромой нарушено в сторону увеличения последней. Кортикальные тимоциты представлены преимущественно большими и средними лимфоцитами. В тельцах Гассаля отмечается распад и дегенерация клеток.

При микроскопическом анализе препаратов тимуса животных, которым после первого сеанса облучения вводился вилон (3, За группы) отмечались менее выраженные инволютиввые изменения по сравнению со 2 и 2а группами.

У животных, которым вводился вилон (4 группа), гистоструктура тимуса сохраняется, но в отличие от контроля имеет некоторые особенности. Дольки значительно крупнее, чем у животных контрольной группы. Корковое вещество широкое, благодаря активной пролиферации кортикальных тимоцитов. Эпителиальные клетки значительно гиперплазированы. Тельца Гассаля многочисленны и в большинстве случаев формируются клетками с хорошо окрашенными ядрами.

Результаты злектронно-м икроскоп и ческого изучения

Электронно-микроскопическое изучение тимуса животных контрольных групп показало, что в корковом веществе долек тимоциты образуют скопления, состоящие из клеток, имеющих сходные размеры и морфологическую структуру. Эти клетки имеют крупные ядра с конденсированным по периферии хроматином, одним-двумя ядрышками крупного размера, и узкий ободок цитоплазмы, содержащий небольшое число митохондрий и полирибосом. Среди этих клеток встречаются крупные тимоциты, имеющие более широкий ободок цитоплазмы и содержащие большое число митохондрий, так называемые активированные лимфоциты.

Тучные клетки встречаются в междольковой соединительной ткани, вблизи кровеносных сосудов. Ретикуло-эпителиальные клетки, которые чаще хорошо видны в мозговом веществе долек, имеют отростчатую форму, рыхлое ядро неправильной формы и цитоплазму, богатую канальцами эндоплазматического ретикулума.

При радиационном старении у животных группы 2 среди наиболее выраженных изменений в тимусе отмечены следующие: отслоение участков наружной ядерной мембраны, нарушение тесных контактов между отдельными тимоцитами. Однако, облучение не уменьшает числа делящихся тимоцитов, находящихся на разных стадиях митоза.

Среди тучных клеток наблюдаются различия в реакции на облучение. Так, одни клетки не отличаются по своей структуре от мастощгГОв контрольных животных, тогда как в других наблюдается образование обширных вакуолей, в которых одновременно может находиться до десятка секреторных гранул различной степени электронной плотности, отражающей разные стадии лизиса секреторного материала. В ретикуло-эпителиальных клетках наблюдается заметное отслоение наружной мембраны, расширение мембран эндоплазматического ретикулума, появление многочисленных мелких вакуолей, набухание и лизис крист митохондрий.

На 21 день после начала эксперимента у животных при радиационном старении (группа 2а) в корковом веществе долек тимуса не наблюдается выраженных изменений по сравнению с группой 2.

У животных, которым вводился вилон, в модели радиационного старения на 14 сутки от начала облучения выраженных изменений со стороны тимоцитов не отмечено. В корковом веществе тимуса они располагаются, тесно прилегая друг к другу, имеют относительно одинаковые по размеру ядра с одним - двумя ядрышками. Ободок цитоплазмы очень тонкий, встречаются единичные митохондрии, в которых хорошо просматриваются кристы. В ретикуло-эпителиальных клетках наблюдается слабо выраженное отслоение кариолеммы и уменьшение вакуолизации цитоплазмы.

На 21 сутки после облучения у животных, получавших вилон (группа За) обращает на себя внимание скопление тучных клеток не только в междольковой соединительной ткани, но и в корковом веществе долек тимуса. При электронно-микроскопическом исследовании тимуса облученных животных, получавших вилон, в корковом веществе появляются гранулярные лейкоциты, а также плазматические клетки, располагающиеся небольшими группами. Ретикуло-эпителиальные клетки не обнаруживают выраженных морфологических изменений, по количество секреторных гранул в их цитоплазме снижается.

Таким образом, проведенные исследования показали, что после фракционированного облучения в диапазоне сублетальных доз, моделирующего преждевременное старение, в тимусе животных, получавших вилон, выявляются особенности структурно-функциональной организации, проявляющиеся, в основном, на ультраструктурном уровне. Инфильтрация коркового вещества зернистыми лейкоцитами и плазматическими клетками при этом, возможно, связана именно с интенсификацией репаративных процессов, так как известно, что гранулоциты чувствительны к активации различными гуморальными и клеточными факторами. Скопление тучных клеток в

корковом веществе может быть вызвано тем, что для окончательной дифференцировки мастоцитов требуется присутствие ИЛ-3, продуцируемого Т-лимфоцитами.

Компьютерный анализ микроскопических изображений

Контрольная группа (I группа). Основная популяция пролифсрирующих клеток в тимусе интактных животных (1рсна=26%) располагается в корковом веществе с тенденцией концентрироваться в периферической зоне долек, контурированных соединительно-тканными перегородками. В тимусе животных контрольной группы тучные клетки составляют относительно небольшую фракцию клеток (16±2 на 1мм2) и сосредоточены в виде характерных цепочек в тонких соединительнотканных перегородках.

Действие ионизирующей радиации - преждевременное старение (2 группа).

PCNA-пoзитивныe ядра сосредоточены преимущественно в периферической зоне редуцированных долек. Обращает внимание увеличение числа тучных клеток в соединительно-тканных перегородках (27±3). Высокий Гром, и гиперплазия тучных клеток свидетельствуют о начавшемся периоде пострадиационного восстановления тимуса.

Сочетанное действие радиации и вилона (3 группа). В тимусе регистрируется активизация восстановительных процессов по индексам пролиферации. 1рсма достигает 55%. Пролиферативная активность в экстрамедуллярных зонах кроветворения. Обращает на себя внимание увеличение числа тучных клеток в тимусе облученных животных после введения вилона (32±5).

Действие вилона (4 группа). В группе необлученных животных после введения вилона наиболее существенный эффеи регистрируется по изменению пролиферативной активности клеток в тимусе. 1роч1а достигает 37%. Все остальные изученные параметры в тимусе ос1анпся в пределах варьирования морфо-функциональных показателей у контрольных животных.

Результаты проведенного компьютерного анализа микроскопических изображений показали, что у облученных животных, получавших вилон, усиливается пролиферативный потенциал клеток. Эти данные позволяют предположить, что вилон может оказывать положительное влияние на купирование отдаленных последствий облучения и, тем самым, оказывать I ероиротекторное действие в радиационной модели преждевременного старения.

выводы

1. Вилон и эпиталон усиливают экспрессию активационных антигенов CD54, HLA-DR на поверхности тимоцитов человека и ослабляют ее на поверхности ТЭК. Оба пептида ослабляют экспрессию раннего активационного антигена CD69 на поверхности тимоцитов. Вилон усиливает, а эпиталон ослабляет экспрессию CD69 на поверхности ТЭК.

2. Вилон и эпиталон ослабляют апоптоз тимоцитов. Эпиталон усиливает апоптоз периферических лимфоцитов, особенно активационный апоптоз 'Г-клеток. Вилон усиливает пролиферацию ТЭК человека, сниженную в результате длительных их пассажей, т.е. при старении in vitro культур ТЭК.

3. Вилон и эпиталон усиливают секрецию цитокинов ТЭК человека и ослабляют индуцированную секрецию этими клетками тимулина. При действии на активированные Т-клетки вилон и эпиталон ослабляют выработку ИЛ-4, практически не влияя на выработку ИФНу.

4. Вилон стимулирует репаративные процессы в вилочковой железе крыс при преждевременном (радиационном) старении, что связано со специфическим восстановлением микроокружения и межклеточного взаимодействия в органе.

5. Вилон обладает выраженным стимулирующим влиянием на гуморальный и клеточный иммунитет, усиливает пролиферативную активность тимоцитов ускоряя дифференцировку Т- и В- лимфоцитов и усиливая миграцию лейкоцитов. Эти эффекты особенно выражены при преждевременном (радиационном) старении тимуса.

6. Полученные данные позволяют рассматривать вилон, и эпиталон как потенциальные иммуно- и геропротекторы, усиливающие пролиферативные, репаративные и компенсаторно-адаптационные процессы в основном органе иммунной системы - тимусе.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Влияние вилона и эпиталона на секреторную активность тимусных эпителиальных клеток и дифференцировку тимоцитов/ В.Х. Хавинсон, A.A. Ярилин, Н.С. Синицкая, И.М. Кветной, В.О. Полякова, Н.И. Шарова // Новые данные о редких и распространенных заболеваниях. Сборник научных трудов под редакцией член-корреспондента РАМН, заслуженного деятеля науки РФ, профессора Н.М. Аничкова. Санкт-Петербург, 2003.- С.211-218.

2. Зезюлин H.H. Изучение пролиферативного эффектов эпиталона на эпителиальные клетки тимуса в процессе дифференцировки и старения in vitro // П.Н. Зезюлин,

B.О. Полякова // Материалы научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы коррекционной психологии, психотерапии, медицины» 20 октября 2001г. -СПб.:МИРВЧ.- 2001г.- С.15.

3. Князькин И.В. Действие вилона на тимус и селезенку в радиационной модели преждевременного старения/ И.В. Князькин, В.О. Полякова // Успехи геронтол.-2002,-Вып. 9,- С. 105-109.

4. Полякова В.О. Влияние пептидного биорегулятора «вилона» на структурно-функциональную организацию вилочковой железы и других органов после общего гамма - облучения // Материалы II Российской конференции молодых ученых "Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины". Москва.- 2001.-

C.396-397.

5. Полякова В.О. Влияние пептидного биорегулятора вилона на структурно-функциональную организацию тимуса крыс при радиационном повреждении // Седьмая Санкт-Петербургская ассамблея молодых ученых и специалистов, Санкт-Петербург, 2002,- С.58.

6. Полякова В.О. Действие вилона на синтез внутриклеточных цитокинов // Материалы Пятой Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье».- СПб, 2002.-С. 201-202.

7. Полякова В.О. Иммуноцитохимическая идентификация пептидов в эпителиальных клетках тимуса человека // Материалы второй научной конференции с международным участием, посвященная 80-летию со дня рождения профессора М.Г. Колпакова «Эндокринная регуляция физиологических функций в норме и патологии»,- Новосибирск, 2002,- С. 124.

8. Полякова В.О. Функциональная морфология тимуса при действии синтетического пептидного биорегулятора "вилона // Материалы Четвертой Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье». - СПб.-2001.-С.214.

9. Репаративпое действие "вилона" на функциональную морфологию тимуса и других органов после общего у-облучения / В.О. Полякова, В.В. Южаков, В.В. Попучиев, С.С. Коновалов // Материалы V научной конференции с международным участием "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге -2001*. СПб.- 2001.-Т. 3. -As 2.-С. 334.

10. Тимус и старение/ В.О. Полякова, И.М. Кветной, В.Х. Хавинсон, А.Т. Марьянович, С.С. Коновалов // Успехи геронтол,- 2001.- Вып. 8,- С. 50-57.

11. Tisssue-specific effects of peptides on differentiation and aging of thymic epithelial cells in vitro/ V. Polyakova, S. Konovalov, O. Barykina // Environment and Human Health, St.Petersburg, 2003.-P.534.

Полякова В.О. Геропротекторное и регуляторное действие пептидов на клетки тимуса // Автореф. дис....канд. биол. наук: 14.00.53. - СПб., 2003. - 20 с.

Формат 60 х84 1/8, Объем Усл. Печ. Л. 1.0. Тираж 100 экз. Зак. .Бесплатно. Подписано к печати 30.06.03.

Отпечатано с готового оригинал-макета ЧП свид. 104990 ИТД-13 от 19.07.98

ИИ391?

1Jfif

 
 

Оглавление диссертации Полякова, Виктория Олеговна :: 2003 :: Санкт-Петербург

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1. МОЛЕКУЛЯРНО-КЛЕТОЧНЫЕ МЕХАНИЗМЫ РАЗВИТИЯ, ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ И СТАРЕНИЯ ТИМУСА.

1.1. Биология развития и анатомия тимуса.

1.2. Типы клеток и гормоны тимуса.

1.3. Дифференцировка клеток тимуса и их иммуноцито-химический фенотип.

1.4. Нейроэндокринная регуляция функционирования тимуса.

1.5. Тимус и старение.

1.6. Вилон и эпиталон: роль и значение в нейроиммуно-эндокринной регуляции.;.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Глава 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Исследования in vitro.

2.2. Исследования in vivo.

Глава 3. ДЕЙСТВИЕ ВИЛОНА И ЭПИТАЛОНА НА ЭПИТЕЛИАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ ТИМУСА.

3.1. Экспрессия маркеров активации

3.2. Секреторная функция.

3.3. Пролиферативная активность при старении культур.

3.4. Экспрессия белков ядрышковых организаторов

Глава 4. ДЕЙСТВИЕ ВИЛОНА И ЭПИТАЛОНА НА ТИМОЦИТЫ.

4.1. Экспрессия маркеров активации.;.

4.2. Апоптоз

4.3. Экспрессия белков ядрышковых организаторов.

Глава 5. ДЕЙСТВИЕ ВИЛОНА И ЭПИТАЛОНА НА ПЕРИФЕРИЧЕСКИЕ Т-ЛИМФОЦИТЫ.

5.1. Пролиферация и апоптоз лимфоцитов.

5.2. Внутриклеточный синтез цитокинов.

Глава 6. ВЛИЯНИЕ ВИЛОНА НА МОРФО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ

СОСТОЯНИЕ ТИМУСА ПРИ ПРЕЖДЕВРЕМЕННОМ

РАДИАЦИОННОМ) СТАРЕНИИ.

6.1. Световая микроскопия.

6.2. Электронная микроскопия.

6.3. Иммуногистохимические и гистохимические исследования.

Компьютерный анализ микроскопических изображений.

6.3.1. Контрольная группа (1 группа).

6.3.2. Преждевременное старение (действие ионизирующей радиации (2 группа)).

6.3.3. Сочетанное действие радиации и вилона (3 группа).

6.3.4. Действие вилона (4 группа).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

Глава 7. ОСОБЕННОСТИ ДЕЙСТВИЯ ПЕПТИДОВ НА КЛЕТКИ

ТИМУСА В ПРОЦЕССЕ ИХ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ И

СТАРЕНИЯ.

ВЫВОДЫ.

УКАЗАТЕЛЬ ЛИТЕРАТУРЫ

АБП метод

Г-КСФ

ГМ-КСФ

Кон А

М-КСФ стг тк

ТЭК ФГА Ф

ФИО ФРК

IpCiNA

Список сокращений: иммуногистохимический метод авидин - биотин -пероксидазного комплекса аденокортикотропный гормон колониестимулирующий фактор гранулоцитов гранулоцитарный и моноцитарный колониестимулирующий фактор дендритные клетки интерлейкин интерферон конкавалин А колониестимулирующие факторы макрофаги колониестимулирующий фактор макрофагов области ядрышковых организаторов предшественники Т-лимфоцитов соматотропный гормон тучные клетки эпителиальные клетки тимуса фитогемагглютинин фибробласты фактор некроза опухолей физиологический раствор Кунса эпителиальные клетки внутриклеточные молекулы адгезии иммуноглобулины иммунофенотип индекс PCNA (%)= Npcna / No6uieMyx главный комплекс гистосовместимости транспортный белок манозный рецептор число тучных клеток на 1 mm2 площади среза пролиферативный клеточный ядерный антиген Т-клеточный рецептор

 
 

Введение диссертации по теме "Геронтология и гериатрия", Полякова, Виктория Олеговна, автореферат

Актуальность темы

Известно, что возрастные изменения тимуса играют ключевую роль в ослаблении системы клеточного и гуморального иммунитета у лиц пожилого и старческого возраста [103]. Инволюция тимуса сопровождается глубокими изменениями морфологии клеток микроокружения и недостаточной выработкой нейропептидов, цитокинов и гормонов, регулирующих функциональную активность органов иммунной системы и созревание Т-лимфоцитов [80]. Ускоренное старение тимуса, протекающее с подобной картиной, наблюдается также на фоне химиотерапевтического лечения, жесткого радиационного облучения и в условиях длительного стресса [87]. Поиск и исследование пептидов с высокой биологической активностью, способных регулировать и восстанавливать адаптационные реакции организма является приоритетным направлением современной биологии.

Участие нейрогуморальных пептидных факторов, вырабатываемых клетками тимусного микроокружения в процессах гемопоэза и формировании иммунного ответа, послужило предпосылкой к созданию на их основе лекарственных препаратов нового поколения. На основе аминокислотного анализа природных препаратов тимуса и эпифиза в Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН были сконструированы синтетические пептиды вилон (Lys-Glu) и эпиталон (Ala-Glu-Asp-Gly), обладающие выраженными иммуномодулирующими свойствами [46].

Сравнительное изучение действия вилона и эпиталона на эпителиальные клетки тимуса и Т-лимфоциты в процессе их дифференцировки и старения позволит более глубоко понять механизмы функционирования и возрастной инволюции тимуса, а также разработать подходы к пептидергической регуляции иммунных и эндокринных функций железы в процессе старения организма.

Цель и задачи исследования

Целью диссертационного исследования является сравнительное изучение действия вилона и эпиталона на эпителиальные клетки тимуса и Т-лимфоциты в процессе их дифференцировки и старения.

Для достижения указанной цели были поставлены и последовательно решены следующие задачи:

1. изучить действие пептидов на дифференцировку тимоцитов;

2. исследовать влияние вилона и эпиталона на пролиферацию и апоптоз Т-лимфоцитов;

3. определить эффекты действия вилона и эпиталона на экспрессию маркеров активации и на секреторную активность эпителиальных клеток тимуса (ТЭК);

4. оценить влияние пептидов на синтез внутриклеточных цитокинов;

5. изучить влияние пептидов на пролиферативный потенциал ТЭК при старении культур;

6. изучить функциональную морфологию тимуса крыс в радиационной модели ускоренного старения;

7. оценить геропротекторные свойства изучаемых пептидов - вилона и эпиталона.

Научная новизна работы

В работе впервые получены данные о роли пептидов (вилона и эпиталона) в регуляции функций эпителиальных клеток тимуса и Т-лимфоцитов при старении. Установлены внутриклеточные пептидергические механизмы, участвующие в процессах пролиферации и дифференцировки и старения клеток тимуса. Проведен анализ морфо-функциональных изменений в тимусе при ускоренном старении. Выявлено геропротекторное и регуляторное действие вилона и эпиталона по отношению к клеткам тимуса.

Практическая значимость работы

Полученные результаты позволяют расширить представления о влиянии пептидов на развитие и функционирование клеток иммунной системы, в первую очередь Т-лимфоцитов и эпителиальных клеток тимуса. Установленное геропротекторное и регуляторное действие вилона и эпиталона на клетки тимуса открывают перспективы для детального изучения возможности применения пептидов в гериатрической практике для коррекции функций, нарушенных при старении организма.

Положения выносимые на защиту

1. Вилон и эпиталон обладают регуляторным действием на клетки тимуса in vitro, изменяя экспрессию активационных антигенов CD54, HLA-DR, CD69 на их поверхности.

2. Вилон и эпиталон проявляют геропротекторные свойства при старении культур клеток тимуса человека, ослабляя апоптоз и усиливая пролиферацию ТЭК.

3. Вилон стимулирует репаративные процессы в тимусе крыс при ускоренном (радиационном) старении.

4. Вилон и эпиталон могут рассматриваться как потенциальные иммуно- и геропротекторы.

Связь с научно - исследовательской работой Института

Диссертационная работа является темой, выполняемой по основному плану ПИР Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, 7 глав, выводов и указателя литературы. Глава 1 (обзор литературы) представляет собой анализ данных литературы по функциональной морфологии тимуса и роли пептидов в регуляции иммунных и эндокринных функций железы. Глава 2 посвящена описанию материалов и методов, используемых в данном исследовании. Главы 3-6 представляют собственные экспериментальные данные изучения эффектов действия пептидов на ТЭК, тимоциты, периферические Т-лимфоциты и на структурно-функциональную организацию тимуса в модели преждевременного старения in vivo. В главе 7 обсуждаются полученные результаты. Текст диссертации изложен на 119 страницах, содержит 15 таблиц, иллюстрирован 26 рисунками. Список литературы содержит 129 источников, из которых отечественных - 82.

 
 

Заключение диссертационного исследования на тему "Геропротекторное и регуляторное действие пептидов на клетки тимуса"

выводы

Вилон и эпиталон усиливают экспрессию активационных антигенов CD54, HLA-DR на поверхности тимоцитов человека и ослабляют ее на поверхности ТЭК. Оба пептида ослабляют экспрессию раннего активационного антигена CD69 на поверхности тимоцитов. Вилон усиливает, а эпиталон ослабляет экспрессию CD69 на поверхности ТЭК.

Вилон и эпиталон ослабляют апоптоз тимоцитов. Эпиталон усиливает апоптоз периферических лимфоцитов, особенно активационный апоптоз Т-клеток. Вилон усиливает пролиферацию ТЭК человека, сниженную в результате длительных их пассажей, т.е. при старении in vitro культур ТЭК.

Вилон и эпиталон усиливают секрецию цитокинов ТЭК человека и ослабляют индуцированную секрецию этими клетками тимулина. При действии на активированные Т-клетки вилон и эпиталон ослабляют выработку ИЛ-4, практически не влияя на выработку ИФНу.

Вилон стимулирует репаративные процессы в вил очковой железе крыс при преждевременном (радиационном) старении, что связано со специфическим восстановлением микроокружения и межклеточного взаимодействия в органе.

Вилон обладает выраженным стимулирующим влиянием на гуморальный и клеточный иммунитет, усиливает пролиферативную активность тимоцитов ускоряя дифференцировку Т- и В- лимфоцитов и усиливая миграцию лейкоцитов. Эти эффекты особенно выражены при преждевременном (радиационном) старении тимуса.

Полученные данные позволяют рассматривать вилон и эпиталон как потенциальные иммуно- и геропротекторы, усиливающие пролиферативные, репаративные и компенсаторно-адаптационные процессы в основном органе иммунной системы - тимусе.

 
 

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2003 года, Полякова, Виктория Олеговна

1. Автандилов Г.Г. Медицинская морфометрия. Руководство. М.: Медицина, 1990. 384с.

2. Акоев И.Г. Проблемы постлучевого восстановления. М.: Атомиздат, 1970. 250с.

3. Анисимов В.Н., Кветной И.М., Комаров Ф.И. и соавт. Мелатонин в физиологии и патологии желудочно-кишечного тракта. М.: Советский спорт, 2000. 184 с.i

4. Анисимов В.Н., Соловьев М.В. Эволюция концепций в геронтологии. Эскулап, 1999. 129 с.

5. Анисимов В.Н., Хавинсон В.Х., Заварзина Н.Ю. и соавт. Влияние пептида эпифиза на показатели биологического возраста и продолжительности жизни мышей // Рос. физиологический журн. 2001. Т. 87, № 1. С. 125-136.

6. Анисимов В.Н., Хавинсон В.Х., Морозов В.Г. Роль пептидов эпифиза в регуляции гомеостаза: 25-летний опыт исследования // Успехи соврем, биологии. 1993. Т 113, №6. С. 752-762.

7. Бабаева А.Г. Кроветворные и лимфоидные органы. Структурные основы адаптации нарушенных функций: Руководство / Ред. Д.С. Саркисов. М., Медицина. 1987. С. 328-342.

8. Быков В.Л. Частная гистология человека. СПб.: СОТИС, 1997. 207 с.

9. Банков В П;, Петкова Л.Б. Вклочковая железа. М.: Медицина, 1974. 235 с.fc 106

10. Васин М.В., Чернов Г. А., Королева JI.B. и др. К механизму противолучевого действия индралина // Радиац. биология. Радиоэкология.1996. Т. 36, вып. 1.С. 36-48.

11. Войткевич А.А., Полуэктов А.И. Регенерация надпочечной железы. М.: Медицина, 1970. 251 с.

12. Галактионов В.Г. Очерки эволюционной иммунологии. М.: Наука, 1995. 256 с.

13. Гистология / Под ред. Э.Г.Улумбекова, Ю.А.Челышева. М.: Медицина, 1998. 960 с.

14. Гончаренко Е.Н., Кудряшов Ю.Б. Химическая защита от лучевого поражения. М.: МГУ, 1985. 247с.

15. Дедов В.И., Дедов И.И., Степаненко В.Ф. Радиационная эндокринология. М.: Медицина, 1993. 208 с.

16. Зуфаров К. А., Хамидов Д. Д. Нейроэндокринная система при экспериментальных воздействиях на организм. Ташкент, 1971. 330с.

17. Иванов А.А., Клемпарская Н.Н., Шальнова Г.А., и др. Противолучевые щ эффекты иммуноглобулинов. М.:Энергоатомиздат, 1990. 176 с.

18. Иванов А. А., Кузнецов В.П., Уланова A.M. Противолучевые терапевтические свойства лейкинферона // Радиац. биология. Радиоэкология. 1998. Т. 38, вып. 1. С. 3-8.

19. Иванов А.Е., Куршакова Н.Н., Шиходыров В.В. Патологическая анатомия лучевой болезни. М.Медицина, 1981. 303с.т107

20. Кветной И.М., Попучиев В.В. и др. Изучение общерегуляторнош и компенсаторно-адаптационного действия препаратов «эпиталамин» и «эпиген» на клеточный и тканевой гомеостаз после эпифизэктомии (Отчет) // Обнинск. 1998. 59с.

21. Кветной И.М., Южаков В.В. и др. Изучение пептида эпифиза «эпигена» и пептида вилочковой железы «вилона» на клеточную репарацию слизистой оболочки кишечника и других органов после радиационного повреждения (Отчет) // Обнинск. 1998. 64с.

22. Кветной И.М., Южаков В.В. Окрашивание ткани эндокринных желез и элементов АПУД-системы // Микроскопическая техника: Руководство / Ред.: Д.С.Саркисов, Ю.Л.Перов. М.: Медицина, 1996. С. 375-418.

23. Киселева Е.П., Огурцов Р.П., Попова О .Я. и др. Сравнительная характеристика двух пептидных иммуномодуляторов // Иммунология. 1999. Т. 36, №2. С. 23-26.

24. Кмелева 3. Вилочковая железа. М.: Медицина, 1984. 105 с.

25. Клименко Н.А., Павлова Е.А. Реакция тучных клеток на общее облучение // Радиац. биология. Радиоэкология. 1997. Т. 37, вып. 3. С. 395-398.

26. Коноплянников А.Г. Радиобиология стволовых клеток. М.: Энергоатомиздат, 1984. 120 с.

27. Коноплянников А.Г. Молекулярные и клеточные механизмы поздних лучевых повреждений // Радиац. биология. Радиоэкология. 1997. Т. 37, вып. 4. С. 621-628.

28. Корогодин В.И. Проблемы пострадиационного восстановления. М.: Атомиздат, 1966.115 с.

29. Краевский Н.А. Острая лучевая болезнь // Патологическая анатомия радиационных поражений. Кн.2. М.:Медгиз5 1987, С. 17-26.

30. Кудряшов Ю.Б. Лучевое повреждение "критических систем" // Лучевое поражение (острое лучевое поражение, полученное в эксперименте). М.:Изд-во МГУ, 1987. С. 5-72.

31. Кудряшов Ю.Б. О химической защите от ионизирующей радиации низкой интенсивности // Радиац. биология. Радиоэкология. 1997. Т. 37, вып. 4. С. 673-675.

32. Легеза В.И., Владимиров В.Г. Новая классификация профилактических противолучевых средств // Радиац. биология. Радиоэкология. 1998. Т. 38, вып. 3. С. 416-425.

33. Лобанок Л.М., Малыхина А.П. Эффекты пролонгированного гамма-облучения и гипоксии на биоэлектрическую активность клеток миокарда //Радиац. биология. Радиоэкология. 1998. Т. 38, вып. 2. С. 201-206.

34. Мамаев Н.Н., Мамаева С.Е., Либуркина И.Л., Козлова Т.В., Медведева Н.В., Макаркина Г.Н. Активность ядрышковых организаторов нормальных и лейкозных клеток костного мозга человека // Цитология. 1984. Т. 26, №1. С. 46-51.

35. Мамаев Н.Н., Мамаева С.Е. Структура и функция ядрышкообразующихрайонов хромосом: молекулярные, цитологические и клинические аспекты // Цитология. 1992. Т. 34, №10. С. 3-25.

36. Мамаева С.Е. Закономерности кариотипической эволюции в культуре // Цитология. 1996. Т. 38, №8. С. 787-814.щ 39. Мороз Б.Б., Кендыш И.Н. Радиобиологический эффект и эндокринныефакторы. М.: Атомиздат, 1975. 230 с.

37. Морозов В.Г., Хавинсон В.Х. Влияние экстракта из тимуса на процессы заживления ожоговых ран в эксперименте // Эксперим. Хирургия и анестезиология. 1974. № 2. С.49-51.

38. Морозов В.Г., Хавинсон В.Х. Влияние экстрактов из гипоталамуса и эпифиза на некоторые функции организма / Матер, научн. конф.щ 109

39. Слушателей Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова. Л., 1971. -С.127-128

40. Морозов В.Г., Хавинсон В.Х. Вьщеление из костного мозга, лимфоцитов и тимуса полипептидов, регулирующих процессы межклеточной кооперации в системе иммунитета // Докл. АН СССР. 1981. Т.261, №1. С. 235-239.

41. Морозов В.Г., Хавинсон В.Х. Молекулярные механизмы биорегуляции генетической активности и клеточного метаболизма // Тез. докл. XVIII Всесоюз. съезда терапевтов. М.: Медицина, 1981. Т. 1. С. 78-80.

42. Морозов В.Г., Хавинсон В.Х. Новый класс биологических регуляторов многоклеточных систем цитомедины // Успехи соврем, биологии. 1983. Т. 96, № 3. С. 339-346.

43. Морозов В.Г., Хавинсон В.Х. Роль клеточных медиаторов (цитомединов) в регуляции генетической активности // Изв. АН СССР. Сер. биол. 1985. № 4. С.581-587.

44. Морозов В.Г., Хавинсон В.Х., Малинин В.В. Пептидные тимомиметики. С-Пб: Наука, 2000. 158 с.

45. Москалев Ю.И. Отдаленные последствия воздействия ионизирующих излучений. М.: Медицина, 1991. 464 с.

46. Ноздрачев А. Д., Баженов Ю. И., Баранникова И. А., Батуев А. С. и др. Начала физиологии: Учебник для вузов / Под ред. акад. А. Д. Ноздрачева. СПб.: Издательство «Лань», 2001. 1088 с.

47. Никонова М.Ф., Литвина М.М., Варфоломеева М.И. и др. Апоптоз и пролиферация как альтернативные формы ответа Т-лимфоцитов на стимуляцию //Иммунология. 1999. №2. С.20-23.

48. Полак Дж., Ван Норден С. Введение в иммуноцитохимию: современные методы и проблемы. М.: Мир, 1987. 74с.Ш110

49. Попучиев В.В., Яковлева Н.Д., Кита К. и др. Ультраструктура тимуса после у-облучения в условиях ингибирования стероидогенеза //Архив патологии. 2000. № 5. С. 39-43.

50. Райхлин Н.Т., Букаева И.А., Пробатова Н.А., Смирнова Е.А., Тупицын Н.Н., Шолохова Е.Н. Ядрышковый организатор как маркер степени злокачественности и прогноза неходжкинских злокачественных лимфом // Архив патологии. 1996. Т. 58, № 4, С. 22-28.

51. Ромейс Б. Микроскопическая техника. М.: Медицина, 1954. 212 с.

52. Савина Н.П. Иммунноэндокринный гомеостаз у мышей после локального облучения органов иммунной и эндокринной систем // Радиац. биология. Радиоэкология. 1996. Т. 36, вып. 1. С. 68-77.

53. Савина Н.П. Ярилин А.А. Влияние локального облучения областей тимуса, гипоталамуса, гипофиза и гонад мышей на клеточность аутологичного и трансплантированного тимуса // Радиац. биология. Радиоэкология. 1995. Т. 35, вып. 4. С. 486-493.

54. Самбур М.Б., Калиповская Л.П., Мельников О.Ф. и др. Морфологическая характеристика центральных и периферических органов системыиммунитета крыс в динамике адаптации к внешнему гамма-облучению //

55. Радиац. биология. Радиоэкология. 1998. Т. 38, вып. 3. С. 191-200.1. Ь.

56. Саркисов Д.С., Аруин Л.И. Обновление структур организма // Структурные основы адаптации и компенсации нарушенных функций: Руководство / Ред. Д.С. Саркисов М.: Медицина, 1987. С. 20-36.

57. Смирнов B.C., Хавинсон В.Х., Яковлев Г.М., Новиков B.C. Коррекцияррадиационных иммунодефицитов.Спб.: Наука, 1992. 32с.

58. Степанова Е.Н. Надпочечники // Структурные основы адаптации, нарушенных функций: Руководство / Ред. Д.С. Саркисов М.: Медицина, 1987. С. 310-319.

59. Стрелин Г.С., Ярмоненко С.П. Процессы восстановления в облученном организме // Пострадиационная репарация. М.: Атомиздат, 1970. С. 214313.

60. Стручко Г.Ю., Меркулова Л.М., Сергеева В.Е., Стоменская И.С. Реакция биоаминсодержащих структур тимуса у крыс на экспериментальное удаление селезенки // Иммунология. 2000. №2. С.13-16.

61. Турдыев А.А., Александров В.В., Усманов Р.Б. и др. Гемо- ииммунностимулирующий эффект экстракта клеток крови среднеазиатской черепахи // Радиац. биология. Радиоэкология. 1998. Т. 38, вып. 2. С. 206209.

62. Тяжелова В.Г. Кинетический принцип в межвидовых экстраполяциях. М.: Наука, 1988. 194 с.

63. Хавинсон В.Х., Морозов В.Г. Пептиды эпифиза и тимуса в регуляции старения. СПб: Фолиант, 2001.158 с.

64. Хавинсон В.Х., Анисимов В.Н. Синтетический пептид эпифиза увеличивает продолжительность жизни и угнетает развитие спонтанных опухолей у мышей // Докл. АН. 2000. Т.373, № 4. С.567-569.

65. Хавинсон В.Х. // Выделение из эпифиза физиологически активных веществ и изучение их влияния на перевиваемые опухоли и некоторые функции организма.- Автореф. Дис. кмн, JL, 1978, 24с.

66. Хавинсон В.Х., Мыльников С.В. Влияние тетрапептида эпифиза на состояние антиоксидантной защиты у Drosophila melanogaster // Бюлл. экспер. биол. и медицины. 2000. Т. 129, №4. С.420-422.

67. Хавинсон В.Х., Рыбалкина Е.Г., Малинин В.В., Пиванович И.Ю., Шанин С.Н., Корнева Е.А. Влияние коротких пептидов на реакцию бласттрансформации тимоцитов и процесс сигнальной трансфункции по сфингомиелиновому пути // БЭБиМ. 2002. №5. С. 574-578.

68. Хавинсон В.Х., Чалисова Н.И., Морозов В.Г. Малинин В.В. Роль пептидов тимуса в регуляции рака лимфоидной ткани у крыс разного возраста // Докл. АН. 1999. Т. 369, № 5. С. 701-703.

69. Чалисова Н.И., Хавинсон В.Х., Пеннияйнен В.А., Григорьев Е.И. Влияние полипептидных фракций тимуса на развитие органотипической культуры вилочковой железы и селезенки крысы // Цитология. 1999. Т. 41, № 10. С. 889-894.

70. Шехтер А.Б. Окрашивание соединительной и мышечной тканей // Микроскопическая техника: Руководство / Ред.: Д.С.Саркисов, Ю.Л.Перов. М.: Медицина, 1996. С. 419-445.

71. Шехтер А.Б., Серов В.В. Воспаление и регенерация // Воспаление. Руководство для врачей / Ред.: Серов В.В. М.: Медицина, 1995. С. 152173.

72. Шурлыгина А.В., Ковшик И.Г., Вербицкая JI.B., Труфакин В.А. Хронозависимое влияние введения ИЛ-2 на соотношение субпопуляций клеток тимуса и селезенки мышей // Иммунология. 2000. №1.С.21-24.

73. Южаков В.В., Кветной ИМ. APUD-механизм в эндокринных и неэндокринных клетках. Возможное значение биогенных аминов в патогенезе пострадиационных дисфункций // Хирургия эндокринных желез. СПб, 1995. С. 211-213.

74. Ярилин А.А., Беляков И.М. Тимус как орган эндокринной системы // Иммунология. 1996. № 1. С. 4-10.

75. Ярилин А.А. Коррекция эндогенной выработки гормонов тимуса. Обоснование нового подхода к иммунореабилитации, иммуннорегуляции // Int. J. on Immunorehabilitation. 1998. № 10. P.8-17.

76. Ярилин А.А., Основы иммунологии. M.: Медицина, 1999. 607с.

77. Ярилин А.А. Радиация и иммунитет. Вмешательство ионизирующих излучений в ключевые иммунные процессы // Радиационная биология. Радиоэкология. 1999. Т. 39, № 1, С. 181-189.

78. Ярмоненко С.П. Радиобиология человека и животных. М.: Высшая школа, 1985. 424 с.• 83. Aspinal R., Andrew D. Thymic atrophy in the mouse is a soluble problem of the thymic environment // J.Vaccine. 2000. Vol 18. P. 1629-1637.

79. Bach M.A., Bach J.F. Studies on the age-related decrease of thymic secretion and its consequences on T-cell function // Gerontology. 1979. Vol. 25. P. 159160.

80. Beetz A., Messer G., Oppel Т., van Beuningen D., Peter R.U., Kind P. Induction of interleukin 6 by ionizing radiation in a human epithelial cell line: control by corticosteroids // Int. J. Radiat. Biol. 1997. Vol. 72, N 1. P. 33-43.

81. Bellamy D. The thymus in relation to problems of cellular growth and aging // Gerontologia. 1973. Vol. 19. P. 162-184.

82. Berthiaume F., Aparicio C.L., Eungdamroung J., Yarmush M.L. Age- and disease-related decline in immune function: an opportunity for "thymus-boosting" therapies // Tissue Eng. 1999. V. 5, № 6. P. 499-514.

83. Bodey В., Bodey B.Jr., Siegel S.E., Kaiser H.E. Involution of the mammalian thymus, on of the leading regulators of aging // In Vivo. 1997. Vol. 11, N 5. P. 421-440.

84. Bodey В., Bodey B.Jr, Siegel S.E., Kaiser H.E. Review of thimic hormones in cancer diagnosis and treatment // Internal J. Immunopharm. 2000. Vol.22. P. 261-273.

85. Bukaeva I., Smimova E., Probatova N., Baronin A., Makanin M., Raikhlin N. Diagnostic value of AgNORs in endocrine tumours: A study a series of thyroid and adrenal cortical tumours // Virchows Archiv. 2001. Vol. 439, N 3. P. 256258.

86. Casarett G,W. Ratiation histopathology // Boca Raton: CRC Press. 1980. Vol. 1. P. 160- 176.

87. Conolly K.M., Bogdanffy M.S. Evaluation of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) as an endogenous marker of cell proliferation in rat liver: a dual-stain comparison with 5-bromo-2'-deoxyuridine // J. Histochem. Cytochem. 1993. Vol. 41, N1. P. 1-6.

88. CrocKer J. Nucleolar organizer regions // Curr. Top. Pathol. 1990. Vol. 82. P. 91-149.

89. Dardenne M. Role of thymic peptides as transmitters between the neuroendocrine and immune systems // J.Ann.Med. 1999. Vol. 31. P. 34-39.

90. Derenzini M. Rationale for the use ofinterphase AgNOR parameters m tumour pathology // Virchows Archiv В. 1995. Vol. 427. P. 331-333.

91. Derenzini M., Pession A., Trere D. Quantity of nucleolar silver-stained proteins is related to proliferating activity m cancer cells // Lab. Invest. 1990. Vol. 63. P. 137-140.

92. Derenzini M., Trere D. Importance of inter phase nucleolar organizer regions m tumor pathology //'Virchows Arch. 1991. Vol. 61. P. 1-8.

93. Derenzini M., Sirri V., Trere D., Ochs R.L. The quantity of nucleolar proteinsif"nucleolin and protein B23 is related to cell doubling time in human cancer cells ~-//Lafc-lnvest. 1995. Vol. 73, N 4. P. 497-502.

94. Feuerstein N., and.Mond J.J. "Numatrin", a nuclear matrix protein associated with induction of proliferation in В lymphoeytes // J. of Biological Chemistry. 1987. Vol. 262, N23. P. 11389-11397.

95. Galand P., Degraef C. Cyclin PCNA immunostaining as an alternative to tritiated thymidine pulse labelling for marking S phase cells in paraffin sections from animal and human tissues // Cell & Tissue Kinetics. 1989.Vol. 22, N5. P. 383-392.

96. Ginaldi L, De Martinis M, D'Ostilio A. et al. The immune system in the elderly: II. Specific cellular immunity // Immunol Res. 1999. Vol. 20, N 2. P. 109-115.

97. Goya RG., Bolognani F. Homeostasis, thymic hormones and aging // Gerontology. 1999. Vol. 45. P. 174-178.

98. Hadden J.W. Thymic endocrinology // Ann N Y Acad Sci. 1998. Vol. 840, N 1. P. 352-358.

99. Hernandez-Verdun D. The nucleolus today // J. Cell Sci. 1991. Vol. 99. P. 465471.

100. Hernandez-Verdun D., Roussel P. Cell biological basis of AgNOR staininy // Virchows Archiv B. 1995. Vol. 427. P. 326-327.

101. Hirokawa K. The thymus and aging.- In: Immunology and aging. // New York; London. 1977. P.51-72.

102. Howell W.M., Black D.A. Controlled silver-staining of nucleolus organizer regions with a protective colloidal developer: a one step method // Experientia. 1980. Vol. 36, N8. P.-1014-1015.

103. Kvetnoy I.M., Yuzhakov V.V., Molotkov A.O., et al. Diffuse neuroendocrine system: structural and functional effects of radiation injury to APUD-cells // Scanning Micr. 1996. Vol.10, N 1. P. 1-12.

104. Morozov V.G., Khavinson V. Kh. Natural and synthetic peptides as therapeutics for immune dysfunction // Int. J. Immunopharmacology. 1997. Vol. 19, N9/10. P. 501-505.

105. Nabarra В., Andrianarison I., Ultrastructural study of thymic microenvironment involution in aging mice // Exp Gerontol. 1996. Vol. 31, N 4. P. 489-506.

106. Oberfield S.E., Nirenberg A., Allen J.C., Cohen H., Donahue В., Prasad V., Schiff R., Pang S., Ghavimi F., David R., Chrousos G., Sklar C. Hypothalamic-pituitary-adrenal function following cranial irradiation // Horm. Res. 1997. Vol. 47, N1. P. 9-16.

107. Ouyang Q., Cicek G., Westendorp R.G.J, et al. Reduced INF-y production in elderly people following in vitro stimulation with influenza vaccine and endotoxin // Mech. Age. Dev. 2000. Vol. 121. P. 131-137.

108. Pawelec G., Effros R.B., Caruso C. et al. T-cells and aging //Frontiers in Bioscience. 1999. Vol. 4. P. 216-269.

109. Perlstein R.S., Mehta N.R., Mougey E.H., Whitnall M.H., Neta R. Whole-body irradiation transiently diminishes the adrenocorticotropin response to recombinant human interleukin-1 alpha // Radiat. Res. 1995. Vol. 141, N3. P. 336-341.

110. Ropke C. Thymic epithelial cell culture // Microsc. Res.& Techn. 1997. Vol. 38, N. 3. P. 276-286.

111. Roussel P., Andre Ch., Comai L., and Hernandez-Verdun D. The r DNA transcription machinery is assembled during mitosis in active NORs and absent in inactive NORs. // J. of Cell Biol. 1996. Vol.133, N 2. P. 235-246.

112. Roussel P., Hemandez-Verdun D. Identification of AgNOR proteins markers of proliferation related to ribosomal gene activity // Exp. Cell Res. 1994. Vol. 214, N 2. P. 465-472.

113. Sirri V., Pession A., Trere D., Montanaro L., Derenzini M. Proportionally constant quantitative transmission of nucleolin and protein B23 in cycling cancer cells // J. Clin. Pathol. 1995. Vol. 48. P. 264-268.

114. Tollervey D. Trans-acting factors in ribosome synthesis I I Exper. Cell. Res. 1996. Vol. 229. P. 226-232.

115. Wachtler F., Ellinger A., Schwarzacher H.G. Nucleolar changes in human phytohaemagglutinin-stimulated lymphocytes // Cell Tissue Res. 1980. Vol. 213. P. 351-360.

116. Wachtler F., Hopman A.H.N., Wiegant J. and Schwarzacher H.G. On the position ofhucleolus organizer regions (NORs) in interphase nuclei. Studies with a new, non-autoradiographic in situ hybridization method // Exp. Cell Res. 1986. Vol. 25. P. 227-240.

117. Wachtler F., and Stahl A. The Nucleolus: a structural and functional interpretation // Micron. 1993. Vol. 24, N 5. P. 473-505.

118. Wang J., Klein J.R. Hormone regulation of murine T cells: potent tissue-specific immunosuppressive effects of thyroxine targeted to gut T cells // Int. Immunol. 1996. Vol. 8, N2. P. 231-235.

119. Wang X., Matsumoto H., Okaichi K., Ohnishi T. p53 accumulation in various organs of rats after whole-body exposure to low-dose X-ray irradiation // Anticancer Res. 1996. Vol. 16, N4A. P. 1671-1674.