Автореферат и диссертация по медицине (14.00.31) на тему:Генетический контроль резистентности к аминогликозидным антибиотикам штаммов Salmonella spp. и Serratia marcescens

ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР ПО АНТИБИОТИКАМ

на правах рукописи УЖ 615. 33: 577.182. 75]. 012. 6

Колганов Алексей Николаевич

ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ РЕЗИСТЕНТНОСТИ К АШН0ГЛИК03ИДНЫМ АНТИБИОТИКАМ ШТАММОВ Salmonella spp. И Serratia marcescens

14.00. 31 - химиотерапия и антибиотики

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 1992

Работа выполнена во Всесоюзном научном центре по антибиотикам

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: доктор биологических наук, старший научный сотрудник

С. Б. Вакуленко

НАУЧНЫЙ КОНСУЛЬТАНТ: доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН

С. Ы. Навашин

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: доктор биологических наук старший научный сотрудник

ЕЕ Даниленко

кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник

Л. Е. Бодункова ■

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков Российской Академии медицинских наук, Москва

Защита состоится " 11 "11 ^1992 г. в /У часов на заседании Специализированного Совета Д 098. 03. 01 во Всесоюзном научном центре по антибиотикам по адресу: 113105, г. Москва, ул. Нагатинская, За

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНЦА Автореферат разослан "7 " ллОЛ г.

Ученый секретарь Специализированного Совета Д 098.03.01

кандидат медицинских наук С. М. Кузнецова

i'.r;,-;;; ; СБЦЙЯ ЙДРЛКШЕСПЗЙ РЛЕОТИ

дкссе-рт^ц:..', j

Ъ

Актуальность прзблгш. Несмотря на большое разнообразие антимикробных агентов, используемых в практической медицине, уровень заболеваемости инфекциями желудочно-кишечного тракта не снижается. Существенный вклад в общую картину заболеваемости вносят при этом микроорганизмы рода Salmonella, часто выделяющиеся при вспышках острых кишечных инфекций у людей, сельскохозяйственных животных и птиц, и представители рода Serratia, вызывающие кишечные инфекции.

Следует отметить, что за последнее десятилетие неуклонно повышается роль штаммов серраций и сальмонелл и как возбудителей тяжелых внутрибольничных инфекций различной локализации. Для лечения больных с инфекционными процессами, вызванными штаммами сальмонелл, в ряде случаев используются аминогликозидные антибиотики, являющиеся в то же время' препаратами первоочередного выбора при заболеваниях, обусловленных штаммами серраций.

Однако в последние годы отмечается заметное возрастание числа резистентных к аминогликозидным антибиотикам изолятов сальмонелл и серраций, вызванное распространением в них генов аминогликозиди-нактивирукщих ферментов.

Исходя из вышеизложенного, большое значение приобретают работы по изучению как эпидемиологии, так и молекулярных и биохимических механизмов устойчивости штатов сальмонелл и серраций к аминогликозидным антибиотикам. Такие исследования позволят не только получить данные по структуре генов амнногликозидрезистентности и кодируемых ими ферментов, проследить пути их эволюции и распространения, но и разработать ряд практических рекомендаций с последуп^м их внедрением в клиническую практику. Эти рекомендации могут касаться как стратегии и тактики проводимой химиотерапии, так и стратегии и масштабов производства тех или иных антибиотиков. Более того, фундаментальные данные по структуре генов необходимы для создания перспективных систем экспресс-диагностики антибиотикоре-зистентности, которые позволили бы эффективно и с высокой степенью достоверности осуществлять контроль за лекарственной устойчивостью микроорганизмов.

Цо.-з и вздута rzozszpzsszzi. Целью работы являлось определение спектров и уровней устойчивости к аминогликозидным антибиотикам, типов ш.агасгликозидинактивирувцих ферментов и плазмидного профиля штаммов сальмонелл и серраций, а также создание специфичного ДНК-зонда для детекции гена aadB в микрио^.-иг^чах на основании данных по его нуклеотидной последовательное::;..

-ч-

0С1ЮВНЫЕ ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1. Определить спектры и уровни резистентности к аминогликозидным антибиотикам штаммов Salmonella spp., выделенных из различных источников, и клинических штаммов Serratia marcescens.

2. Охарактеризовать плазмидные профили резистентных к аминогли-козидам штаммов и проанализировать их на наличие конъюгативных R плазмид.

3. Определить типы аминогликозидинактивируюших ферментов в резистентных к аминогликозидным антибиотикам штаммах Salmonella spp. И S. marcescens.

4. Клонировать ген aadB, кодирующий резистентность к гентачици-ну, сизомицину, тобрамицину и канамицину и определить его нуклео-тидную последовательность.

5. Определить, с использованием различных ДНК-зондов, наличие в иташах Salmonella spp. и S. marcescens генов, кодирующих аминогли-козидинактивирующие ферменты.

Работа выполнена в рамках НИР Всесоюзного научного центра по антибиотикам, тема "Разработка систем экспресс-диагностики антиби-отккорезистентности микроорганизмов".

Ездчкая новизна.Установлено, что в штаммах Salmonella spp., выделенных в пределах одного региона (Санкт-Петербург и область) из разных источников, преобладают ферменты трех типов: АРН(3')~1 (86%), AAC(3)-V (62%) и ANT( 2") (14%). Ацетилтрансфераза AAC(3)-V всегда находилась в комбинации с фосфотрансферазой АРН( 3*)-1, что обеспечивало микроорганизмам устойчивость к таким антибиотикам, как гентамицин, сизомицин, тобрамицин и канамицин.

Показано, что все штаммы Serratia marcescens содержат ген ами-ногликозидацетилтрансферазы ААС(6')-1с, отсутствующий у знтеробак-терий других видов. Дополнительно штаммы содержали гены ферментов следующих типов: AAC(3)-V (55%), ААС(3)-1 (13%), АРН(3')-1 (42%) и ANT(2") (23%).

Впервые из штамма Salmonella Oranienburg осуществлено клонирование гена aadB, кодирующего резистентность к гентамицину, сизомицину, тобрамицину и канамицину. Обнаружено несколько нуклеотидных замен в пределах гена и граничащих с ним фрагментов ДНК и установлено, что ген aadB входит в состав интегрона

Создан высокоспецифичный ДНК-зонд для детекции гена aadB. В экспериментах по ДНК-ДНК гибридизации с использованием различных

ДНК-зондов установлено, что-некоторые штаммы S. marcescens содержат неэкспрессирующиеся гены ферментов ААС(6')-1с и AAC(3)-V.

¡¡аучют-щзагазяеская зтачзгязеть галучега&к результатов. Создана коллекция резистентных к аминогликозидным антибиотикам штаммов Salmonella spp. и Serratia marcescens, продуцирующих охарактеризованные по типам аминогдикозидинактивирущие ферменты. Эти штампы могут использоваться в качестве контролей при поиске и характеристике различных соединений аминогликозидного ряда, а также в качестве объектов для наработки аминогликозидинактивирующих фэрмрнтов различных типов.

Показано, что при определении типов продуцируемых микроорганизмами аминогликозидинактивирующих ферментов наиболее достоверны результаты, получаемые при использовании метода ДНК-ДНК гибридизации (метод позволяет детектировать любые гены, в том числе молчащие и слабоэкспрессирующиеся); при проведении клинических анализов одновременно со скрининговым методом AGRP (aminoglycoside resistance patterns) целесообразно применять метод ДНК-ДНК-гибридизации.

Клонирован ген aadB и определена его нуклеотидная последовательность. Фрагменты гена могут быть использованы в качестве ДНК-зонда для детекции близкородственных генов в микроорганизмах, а тага® для конструирования различных векторных молекул. Данные по структуре гена и окружающих фрагментов ДНК могут использоваться при изучении структуры и эволюции детерминант лекарственной устойчивости.

Лпро&щпя. Материалы диссертационной работы докладывались на Международной конференции молодых ученых "Получение, исследование, применение антибиотиков и биологически активных веществ.", Москва,

1990 г., на 17 Международном конгрессе химиотерапевтов, Берлин,

1991 г. , на Всесоюзной конференции "Актуальные проблемы химиотерапии бактериальных инфекций.", Москва, 1991 г., на семинарах лаборатории экспериментальной химиотерапии.

Пубдкшсп!. По материалам выполненных исследований опубликовано 8 работ.

Структура pz&mi Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования и обсуждения результатов исследования, выводов, списка литературы, содержащего UM литературных источников. Диссертация включает If рисунков и Ютаблиц.

-6-

IL'iTEPÎÎAEÎ II КЗГОЙЯ

Штаты, использованные в работе. 50 штаммов сальмонелл, резистентных к гентамицину и (или) канамицину любезно предоставлены Козловой ЕС. (Санкт-Петербургский санитарно-гигиенический медицинский институт). Штаммы были отобраны из более чем 1500 изоля-тов, выделенных на территории г. Санк-Петербурга и области во второй половине восьмидесятых годов. Источники выделения: больные люди ( 32 штамма), объекты окружающей среды ( 13 штаммов), сельскохозяйственные лывотные и птицы ( 5 штаммов).

31 резистентный к гентамицину и ( или) канамицину штамм Serratia marcescens. Штаммы выделены в клиниках г. Москвы в середине восьмидесятых годов.

Конъюгационную передачу R плазмид осуществляли в штамм Е. coli С600 rifR ( F-, thi-1, thr-1, leuES, IakYl, tonA21, supE44, A-). Для плазмидной и фаговой трансформации в качестве реципиентного штамма использовали Е. coli JM101 ( supE, thi, . ( lac-pro AB), F'traD36, pro AB, lac Г, ZAM15).

Вгкторные плазмиды и фаги. В качестве плазмидных векторов для клонирования генов использовали pUC18 и pUC19. Субклонирование осуществляли в фаги серии М13: шр18 и тр19.

Среды. Для • выращивания изолятов использовали жидкую среду LB. Используемый в генноинженерных экспериментах штамм J Ml 01 выращивали на жидкой или агаризованной среде ТУЕ, а такая на минимальной среде МЗ. Среды готовили из сухих компонентов (Difco, США).

В экспериментах по определению аыиногликозидинактивирующих ферментов использовали агар Mueller Hinton (Oxoid, Великобритания).

Определение уровней антлбиотикорезистент кости. Определяли методом двукратных серийных разведений на питательном агаре Mueller Hinton при помощи штампа - репликатора; величина микробной нагрузки составляла 10' КОЕ/мл.

Конъюгация. Конъюгационную передачу R плазмид в реципиентный штамм Е. coli С600 проводили, как описано ранее [Вакуленко с соавт, 1978].

Выделение ДНК низ ко юле куля рных плазмид. Проводили по известной методике Birnboim и Doly [1979].

Выделение ДНК высокомолекулярных плазмид. Использовали модифицированную методику Kado и Liu [19811 и методику Eckhardt [19781 с некоторыми модификациями.

Расщепление ДНК эндонуклоазами рестрикции. Для генноинженерных экспериментов в работе использовали следующие рестриктирующие эн-донуклеазы: Bar-HI, Clal, EcoRI, EcoRV, HíndIII, Kpnl, Nrul, PstI, PvuII, Sail, Smal, Xhol (НПО "Биопол") ; AccI, Sau3A, TaqI (Boehringer Mannheim). Реакции проводили с использованием буферов и при условиях, рекомендованных фирмами-изготовителями.

Выделение фрагмента ДНК из агарозного геля. Разделение фрагментов ДНК проводили в агарозном геле концентрацией от 0. 7Z до 1Z ( в зависимости от величены фрагментов), приготовленном на трис-борат-ном буфере. Визуализировали гель на трансиллюминаторе и вырезали скальпелем полоску геля, в которой располагался нужный фрагмент ДНК, пометали ее в диализный мешок и проводили электроэллюцию в трис-ацетатном буфере.

Приготовление компетентных клеток. Для приготовления компетентных клеток пользовались методикой, описанной в руководстве Гловера С19881.

Трансформация компетентных клеток рекомбинантными плазмидти. Трансформацию компетентных клеток плазмидной ДНК проводили как описано в руководстве Маниатиса и соавт. [1984].

Фаговая трансформация и выделение однонитеюй фаговой ДНК. Проводили по методикам, описанным в руководстве фирмы Amersham С1984].

Слот-гибридизация. Гибридизацию проводили с использованием по-лиэтиленгликоля по методике Richard fA Arasiпо С19851.

Определение типов аминогшкозидинактивирующих ферментов № то до и дисков и m то до м серийных разведений. Для определения типов аии-ногликозидинактивирующих ферментов пользовались ранее предложенной Miller с соавт. методикой [1980].

Определение нуклеотидной последовательности ДНК. Первичнуя структуру ДНК определяли по методу Sanger [1977].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУНДЕШЕ

Ггглгл 1. Г!зу:он::э тгтгоз с; Сзр^ггоз

птазгзз киаикгалл и ~ гж кс.-7гр}тг;:х :а rano л.

1.1. Спектры и уровни резистентности к амшоглккозщнш антибиотикам отзмшв сальмонелл, выделенных из раздтиых источников.

Результаты исследования спектров антибиотикорезистентноети

штаммов сальмонелл суммированы в таблице 1. Из представленных результатов видно, что все изученные возбудители чувствительны к амикацину (значения ЫПК <1 мкг/мл). К гентамицину .и тобрамицину оказались резистентными по 38 изолятов сальмонелл , а к сизомицину

- 39 штаммов. Все изоляты были устойчивы к канамицину. К неомицину и мономицину резистентными оказались 43 штамма , а к стрептомицину

- 46 изолятов сальмонелл. Дополнительно определена чувствительность штаммов еще к девяти ашногликозидньы производным, что позволило по спектрам резистентности определить типы аминогликозиди-нактивируюших ферментов. В зависимости от типов инактивируюцих аыиногликозиды ферментов изученные нами штаммы сальмонелл был:! подразделены на пять групп (табл.2).

К первой группе отнесены штаммы, спектр резистентности которых кожэг свидетельствовать о продукции ими модифицирующих ачиноглико-знды ферментов двух типов: ацетилтрансферазы MC(3)-V и фосфотран-сферазы АРН(3')-1. Эта группа представлена 31 штаммом и включает практически все виды изученных сальмонелл.

Вторая по численности группа состоит из 12 изолятов. В нее вошли 10 штаммов S. typhiirurium и по одному представителю S. kisangani и S. Oranienburg. Перечисленные микроорганизмы устойчивы к Km, Nm, i.ín и Lm. Такой фенотип моясет обеспечиваться ферментом аминоглико-зидфосфотрансферазой АРН(3')-1. Дополнительно штаммы были резистентны к стрептомицину.

Третья группа включает в себя 4 птакка сальмонелл, относящихся к различным вида),í: S. enteritidis, S. Oranienburg, S. nigeria и S.virchov. Спектр их ацтибыотикорезистентности ограничивался устойчивостью только к Gm, Тш, Ss, Km, что дает основание предполагать наличие в штаммах аминогликозиднуклеотидилтрансферазы ANT(2").

В спектре резистентности двух штаммов S. Oranienburg, в отличие от возбудителей предыдущей группы, дополнительно присутствовал стрептомицин, что позволило вынести их в самостоятельную группу; однако инактивация первых четырех антибиотиков происходит, вероятно. за счет аминогликозиднуклеотидилтрансферазы ANT(2").

К пятой группе отнесен только один штага,! S. Oranienburg, имеющий отличный от всех предшествующих штаммов фенотип антибиотикорезис-тентности: Gm, Tm, Ss, Km, 2Nt, 6Nt и Sm. Данный фенотип не позволил определить тип продуцируемого возбудителем фермента

Таблица 1 Определение величин МПК аминогликозидов в отношении штаммов сальмонелл

1 - ■ I АМИКАЦИН 1 1 1 ГЕНТАМИЦИН ..... ТОБРАМИЦИН ........ сизомицин 1 1 КАНАШЦИН 1 1 неомицин 1 I шношцин 1 1 - 1 I СТРЕПТОМИЦИН|

1 1 I к-ция,|кол-1мкг/млI во 1 1 |к-ция, |кол-Iмкг/мл|во 1 к-ция, |кол-мкг/мл|во 1 к-ция, |кол-мкг/мл|во I к-ция, 1мкг/мл кол-во 1 1 Iк-ция, |кол-|МКГ/МЛ |БО 1 1 1 1 |К-ция, |кол-|МКГ/МЛI во 1 1 1 |к-ция, |кол-| |МКГ/МЛ |во | 1 1 1

1 1 1 <1 | 50 1 1 1 <1 | 12 1 1 <1 12 1 1-2 | 1 11 1 32-64 7 1 1 | <1 | 7 1 1 1 1 1 <1 1 7 1 | 1 1 1 | <1-8 | 4 | 1 1 I

1 1 1 1 1 1 1 8-16 | 4 8-16 5 1 4-16 | 1 7 |512->1024 43 1 1 I 128-512| 43 1 | 1 1 | >10241 43 1 1 1 1 1 | 32-2561 46 |

1 I 1 1 1 1 1 1 |32-256| 34 1 1 32-64 33 1 32-5121 I 32 I 1 1 1 1 I 1 1 1 1 1 1 1 ! 1 1 1 1 1 1 1 1

Примечания. X резистентных штаммов: к амикацину ( МПК >„16 мкг/мл) - 0%; к гентамицину ( ШШ >х 4 мкг/мл)

- 75 % ( 38 штаммом ); к тобрамицину ( МПК >- 4 ыкг/мл) - 76 %( 38 штаммов); к сизомицину ( 1ШК ^ 4 мкг/мл)

- 78 % ( 39 штаммов); к канамицину ( МПК >„ 16 мкг/мл) - 100 %( 50 штаммов); к неомицину ( МПК >, 16 мкг/мл)

- 86 % ( 43 штаммов);к мономицину( МПК 16 мкг/мл) - 86 %( 43 штаммов);к стрептомицину( ¡ШК >,. 16 мкг/мл)

- 92 X ( 46 штаммов); в скобках указаны пограничные концентрации.

Таблица 2 Фенотипы антибиотикорезистентности и соответствующие им ачиногликозидинактивирухщие ферменты штаммов сальмонелл.

1 ■ 1 1 ФЕНОТИП ФЕРМЕНТЫ ВИД ВОЗБУДИТЕЛЯ i КОЛ-ВО i ВСЕГО|

1 |йп, Tm, Ss, Nt, AAC( 3) -V, APH( 3') -1 S. half a 18

|2Nt, 6Nt, Sm S. kisangani 4

IKm, Nm, tóm, S. fúlica 3

|Sm S. typhi muri um 1

1 S.enteritidis 1 31 I

1 S. newport 1

1 S. bispebjerg 1

1 S. he Idelberg- 1

1 S. Stanley 1

1 IKlVl, Mm, Nm, Lm, APH( 3') -1, Sm S. typhimurium 10

|Sm S. kisangani 1 12 |

1 S. Oranienburg 1

L |6m, Tm, Ss, Km ANT(2") S. enteritidis 1

1 S. Oranienburg 1 4 I

1 S. nigeria 1

1 i S. virchov 1

1 |Em, Tm, Ss, Km, ANT( 2"), Sm S.Oranienburg 2 2 I

|Sm i

1 1&П, Tm, Ss, Km, ?, Sm S. Oranienburg 1 1 1

|2Nt, > 6Nt, Sm 1

Сокращения: Gm- гентамицин, Тт- тобрамицин, Ss- сизомицин, Km- канамицин, Nm- неомицин, Mm- мономицин, Sm- стрептомицин, Nt- нетилмицин, 2Nt- 2'- этилнетилмицин, 6Nt- 6'- этилнетил-мицин, Lm- ливидомицин, ? - не определенный по фенотипу ами-ногликозидинактивируадий фермент.

1.2. Определение плазтдного профиля штаммов сальмонелл, выделенных из различных источников.

Распространение среди различных видов сальмонелл, выделенных в разное время из различных источников, одинаковых аминогликозиди-нактивирующих ферментов позволяет предположить наличие в этих штаммах плаз ми д.

С целью обнаружения в исследованных штаммах экстрахромосомной ДНК были проведены эксперименты по ее выделению различными способами. На рис. 1 представлена электрофореграмма плазмидных ДНК некоторых штаммов сальмонелл.

Проведенный анализ позволил выявить экстрахромосомную ДНК во всех изученных изолятах (суммарные данные предстазлены в табл. 3).

В штаммах, продуцирующих одновременно ферменты двух типов: ААС(З)-V и АРН(3')-1, обнаружено по одной или две плазмиды размером около 85, 100 или 150 т. п. н.

Вторая группа микроорганизмов, продуцирующих нуклеотидилтранс-феразу ANT(2"), содержала только по одной плазмиде размером более 150 т. п. н.

Представители третьей группы, продуцирующие фосфотрансферазу АРН( 3') -1, содержали плазмиды размером около 10, 100, и 150 т. п. н.

Таким образом, анализ плазмидного профиля использованных в работе штаммов сальмонелл свидетельствует о наличии плазмид во всех из них. При этом абсолютно все штаммы содержали высокомолекулярные плазмиды (размером более 80 т. п. н.) и только в четырех из них дополнительно присутствовали низкомолекулярные плазмиды. Интересно отметить, что во всех нсследованных штаммах, за исключением 7 продуцирующих нуклеотидилтрансфэразу ANT(2"), обнаружена плазмида размером около 150 т. п. н.

Данные, приведенные в табл. 3, позволяют выделить несколько групп микроорганизмов, которые включают штаммы одного вида, выделенные из одного источника, продуцирующие одни и те мэ амикоглико-зидинактивирующие ферменты и имеющие идентичные плазшдные профили.

К таким группам, в частности, моп-ю отнести: 1) 13 из 15 штаммов S. haifa, содергащ5х по одной плазмиде размером около 150 т. п. н.; 2) 3 штамма S. kisangani, имеющих плазмиды размером 85 и 150 т. п. н. 4) 6 штаммов S. typhimurium, содержащих плазмиды размером 100 и 150 т. п. н.; 5) 4 стамма S. typhi murium, характеризующихся идентичными плазмидкь&ш профилями (по 3 плазмиды размером около 10, 100 и 150 т. п. н.').

-а-

i 2 $4 5678 9 iO

г.

Рис. I Зле к? pa форе г раша плазмидных и хромосомных ДНК штаммов сальмонелл, разделенных в вертикальном агарозном геле. 1 - S. haifa 4319; 2 - S. haifa 329; 3 - S. haifa 685; 4 -S. haifa 675; 5 - плазмида Rp4 (размер 60 т. п. н.); 6 -S.stanley 1925; 7 - S.bispebjerg 2609 ; 8 - S. haifa 688; 9 -S. haifa 510; 10 - плазмида R1 drd 19 (размер 95 т. п. н). Стрелкой указана фракция хромосомной ДНК.

-ß-

Таблица 3. Плазшдньа проф:ш> птвимов садьшнелд

1 АШЮИИКОЗВДИШТИШ- 1РУХЕЩЕ С2Р121ГШ Е!Д ВОЗБУДИТЕЛЯ И ЕГО Ю152Р РАЗМЕР ПЛА35Щ | ЧИСЛО ШГАШ0В т. п. и. |

1 Ацетилтрансфераза I AAC(3)-V 1 Сосфотранофераза 1 АРН(3')-1 S. haifa 165,171, 637 100, 150 | 3

S. haifa 170,329, 510,525,53-1.672, 673,674,675,634, 685,687,688,4,310, 4337 150 | 15 1 1 1 1

S. typhi mirium 38 100, 150 1 1 1

S.kisanzani 2508, 2514,2523 85, 150 3

s.kisar>zanl 4295 150 1

S.ontoritidis 716 100, 150 1

S.fulica 1855, 1864,1900 150 3

S. r&vport 253 150 1

S. blspsbjorg 2609 100, 150 1

S. haidolbors 2603 100, 150 1

5. Stanley 1925 150 1

I Аденнгилтрапефзраза 1 ANT(2") S. Oranienburg 277,1376,2471, 2275 >150 4

S. enteritidis 525 >150 1

S nigeria 1533 >150 1

S. virchov 2213 >150 1

I Оэс^отрансфэраза 1 АРН(3')-1 I S. typhimrium-27, 28,29,30,47,55, 100, 150 G

5. typhi mrlum 147,159,370,761 10, 100, 150 4

S.kisanssni 2512 150 I 1

S. Oranienburg 243 100, 150 | 1

Наличие таких групп идентичных по всем показателям штаммов может свидетельствовать о распространении одного и того же штамма в пределах группы или о распространении идентичных плазмид между различными штаммами. Дополнительным критерием при характеристике таких групп штаммов могут служить данные по наличию в них конъюга-тивных R плазмид.

1. 3. Конъюгативные R плазмиды штаммов сальмонелл.

С целью обнаружения в исследованных штаммах Salmonella spp. ко-нъюгативных плазмид лекарственной устойчивости были проведены эксперименты по конъюгационной передаче экстрахромосомной ДНК в реци-пиентный штамм Е. coli. В результате проведенного анализа было установлено, что в процессе конъюгации детерминанты аминогликозидре-зистентности передавались только из 21 (42 %) штамма сальмонелл ( табл. 4).

Из 18 штаммов S. haifa только 4 передавали маркеры резистентности при конъюгации. Причем передавались все плазмиды, присутсвовав-шие в донорах.

.Интересно отметить, что все одиннадцать исследованных штаммов S. typhi muri um содержали конъюгативные R плазмиды. При этом в процессе конъюгации передавалась лишь одна плазыида размером около 150 т. п. н., в составе которой находился ген, кодирующий фосфотран-сферазу АРН(3')-1.

Высокомолекулярная плазмида размером около 150 т. п. н. передавалась в процессе конъюгации из всех остальных штаммов сальмонелл различных видов. Некоторые из них дополнительно передавали плазми-ду размером 100 т. п. н.

Интересно отметить, что ген, кодирующий фермент ANT(2"), в составе конъюгативных плазмид не обнаружен. Другой особенностью явилось то, что у всех трансконъюгантов уровни резистентности к антибиотикам были на 2 -3 разведения ниже, чем у доноров. При электрофорезе ДНК в некоторых трансконъюгантах наряду с плазмидами, идентичными по подвижности плазмидам доноров, обнаруживались дополнительные полосы экстрахромосомной ДНК меньшей интенсивности и подвижности. Эти результаты могут свидетельствовать о некоторой нестабильности высокомолекулярных плазмид сальмонелл в новом хозяине - Е.coli.

Таблица 4. Характеристика конъюгативних плазмид

(ВИД ВОЗБУДИТЕЛЯ |И ЕГО НОМЕР ФЕНОТИП АНТИБИОТИКО-РЕЗИСТЕНГН0СТИ РАЗМЕР ПЛАЗШД т. П. н. ФЕНОТИП АНГИБИОТИКО-| РАЗМЕР ЕЛАЗМИД РЕЗИСТЕНТНОСТИ Т/К | т. п. н.

| |S. haifa 170 1 Gm, Tm, Ss, Nt, 2Nt, 6Nt, Km, Nm, btn, Sm, 150 Gm, Tm, Ss, Nt, 2Nt, | 150 6Nt, Km, Nm, to, Sm |

I |S. haifa 165,171, 1637 l Gm, Tm, Ss, Nt, 2Nt, 6Nt, Km, Nía, Un, Sm 100, 150 Gm, Tm, Ss, Nt, 2Nt, | 100, 150 6Nt, Km, Nm, Mm, Sm | i

1 IS. typhimurium 38 1 i Gm, Tm, Ss, Nt, 2Nt, 6Nt, Km, Nm, Sm 100, 150 Km, Nm, Mm, Lm, Sm | 150 1

1 |S. typhimurium 27, |28, 29, 30, 47, 56 i Km, Nm, tón, Lm, Sm 100, 150 Km, Nm, Mm, Lm, Sm | 150 1

1 |S. typhimurium 147, 1159, 370, 761 l Km, Nm, Ib, Lm, Sm 10, 100, 150 1 Km, Nm, Mm, Lm, Sm j 150 1

1 |S. kisansjani 2508, 12514,2523 i Gm, Tm, Ss, Nt, 2Ht, 6¡¡t, Km, Nm, f.ín, Sm 85, 150 Gm, Tm, Ss, Nt, 2Nt, | 150 6Nt, Km, Nm, Mu, Sm |

1 |S.oranienburg 243 Km, Nm, Mm, Lm, Sm 100, 150 Km, Nm, Mm, Lm, Sm | 150 I

1 |S. enteritidis 716 1 i Gm, Tm, Ss, Nt, 2Nt, 6Nt, Km, Nm, Mm, Sm 100, 150 Gm, Tm, Ss, Nt, 2Nt, | 100, 150 6Nt, Km, Nm, I.tn, Sm | i

i ¡S. heidelberg 2603 1 i Gm, Tm, Ss, Nt, 2Nt, 6Nt, Km, Nm, Ш, Sm 100, 150 Gm, Tm, Ss, Nt, 2Nt, | 100, 150 6Nt, Km, Nm, Mmt Sm | i

Обозначения: Gm- гентаыицш.Тт- тобрамицин.Зз- сизошцин, Nt- нетилмщин,2}^- 2'-зтилнетил-мицин, 6Ht- 6'- зтилнетилмицкн, Km- канамицин, Nm- неомищш, to- ыономицин, Lm- ливидомицин, Sm- стрепто:.;;щйн; т/к - транскснъютант.

-151.4. Детекция генов ашногликоайдреаистентности в шташах сальмонелл методом ЛНК-ДНК гибридизации.

Для обнаружения генов, кодирующих аминогликозидинактивирующие ферменты, а также для подтверждения результатов, полученных при определении типов ферментов по фенотипу антибиотикорезистентности, были проведены эксперименты по ДНК-ДНК гибридизации с использованием в качестве ДНК-зондов внутренних фрагментов генов, кодирующих ферменты AAC(3)-V, АРН(З)-1 и ANT(2").

Результаты гибридизации подтвердили данные о том, что штаммы сальмонелл, выделенные из различных источников, содержат гены, кодирующие аминоногликозидинактивирующие ферменты трех типов: ами-ногликозидацетилтрансферазу ААС( 3)-V; аминогликозидфосфотрансфера-зу АРН(3')-1 и аминогликозиднуклеотидилтрансферазу ANT(2"). При этом полностью (за одним исключением) совпадали данные по ДНК-ДНК гибридизации и определению типов ферментов по профилю резистентности штаммов к 17 аминогликозидным производным. Исключение составил один изолят S. Oranienburg 277, у которого не удалось определить тип фермента методом AGRP, а методом ДНК-ДНК гибридизации было показано, что штамм содержит ген фермента ANT(2").

В табл. 5 представлены данные по определению типов аминогликози-динактивирукяцих ферментов у различных видов сальмонелл, выделенных из трех источников. Как видно из таблицы, все штаммы S. haifa, выделенные из двух источников, продуцировали одновременно два фермента- AAC(3)-V и АРН(3')-1.

Выделенные только от больных людей штаммы S. typhinurium продуцировали, за одним исключением, только аминогликозидфосфотрансфе-разу АРН(3')-1, а штаммы S.oranienburg; выделенные из трех различных источников, продуцировали преимущественно фермент ANT(2").

В 4 из 5 штаммов S. kisangani идентифицированы ферменту одновременно двух типов: AAC(3)-V и АРН(3')-1, а в одном - фосфотрансфе-раза АРН(3')-1. Два первые фермента продуцировались также тремя штаммами S. fúlica, выделенными из объектов окружающей среды. Остальные виды сальмонелл были представлены только одним штаммом.

Таким образом, проведенное исследование' свидетельствует о незначительном разнообразии типов аминогликозидинактивирующих ферментов у штаммов сальмонелл, выделенных из различных источников. Наиболее часто (в 43 из 50 исследованных штаммов) обнаруживался фермент аминогликозидфосфотрансфераза АРН(3')-1. Два других аминогли-1созидинактивирующих фермента: AAC(3)-V и ANT( 2") были идентифици-

Таблица 5. Типы аминогликозидинактивирующих ферментов штаммов сальмонелл, принадлежащих к различным видам

1 1 1 ВИД 1 ИСТОЧНИКИ 1 I ФЕРМЕНТЫ i | КОЛ- i i |ОБЩЕЕ |

| ВОЗБУДИТЕЛЯ | ВЫДЕЛЕНИЯ I во 1К0Л-В01

| S. half а | Больные люди |MC(3)-V, APH(3*)-I 1 1 16 1 18 |

Объекты окр. ср. 1 2 I

| S. typhimurium| Больные люди" 1АРН( 3')- I 1 | 10 1 11 1

Больные люди |AAC(3)-V, AFH(3')-I 1 1 I

I S. Oranienburg| Больные люди IАРН(3* )-1 1 1 1

Больные люди |ANT(2") 1 1 I 5 |

Объекты окр. ср. I ANT(2") 1 2

С/х животн., пт. I ANT(2") 1 1 I

I S. kisangani | Объекты окр. ср. |APH(3')-I 1 1 1

Объекты окр. ср. |AAC(3)-V, APH(3')-I 1 2 1 5 |

С/х животн. , пт. |AAC(3)-V, APH(3')- I 1 2 1

| S. fulica | Объекты окр. ср. |AAC(3)-V, APH( 3') - I 1 1 3 I 1 3 |

| S. enteritidisl Больные люди |AAC(3)-V, APH(3')-I 1 1 1 ! 1 1

Больные люди |ANT(2") 1 1 1 1 1 1

| S. newport | Больные люди |AAC( 3)-V, APH( 3' ) -1 1 1 1 I 1 1 1

| S. nigeria | Объекты окр. ср. |ANT(2") 1 1 1 1 1 1

I S. virchov | Объекты окр. ср. IANT(2") 1 1 1 I 1 1 1

| S. Stanley | Объекты окр. ср. | AAC(3)-V, APH(3')-I 1 1 1 ' l 1 1 1

| S. bispebjerg | С/х животн. , пт. |MC(3)-V, APH(3*)-I 1 I 1 1 1

| S. hsIdelberg | ■ < С/Х ЗЯ1ВОТИ. , пт. |AAC(3)-V, 1 APH(3')-I 1 1 1 i I 1 1 > 1

рованы соответственно в 31 и 7 штаммах. причем фермент AAC(3)-V во всех штаммах находился в комбинации с фоефотрансферазой АРН(3')-1. Все исследованные штаммы сальмонелл содержали высокомолекулярные плаз мл ды, значительная часть из которых передавалась при конъюгации. Выявлен ряд изолятов сальмонелл, которые можно подразделить на отдельные группы. В каждую из групп отнесены микроорганизмы одного вида, выделенные из одного источника, имеющие идентичные, ферментативный и плазмидный профили и, в случае штаммов некоторых групп, передающие при конъюгации идентичные по размеру и генотипу резистентности R плазмиды. Высока вероятность того, что некоторые из включенных в индивидуальные группы изолятов являются в действительности одним штаммом, распространившимся во время вспышки инфекции. Проведенные эксперименты свидетельствуют о том, что и метод A6RP и метод ДНК-ДНК гибридизации дали, при изучении штаммов сальмонелл, надежные результаты. Однако следует отметить, что все исследованные штаммы продуцировали или один фермент или два фермента, обеспечивающие неперекрывающиеся спектры аминогликозидре-зистентности, что, несомненно, упростило интерпретацию результатов, полученных методом AGRP.

rjEaca 2. Определена типов Емшоглжгавдиншгошфукцзн £эразкхоз JUB2Ei4eciczt Enaisioa S. согсезсепз и apairrе-кодйругзцк: ж reiios.

2.1. Определение спектров и уровней резистентности к аминог-ликозидным антибиотикам клинических штаммов S. marcescens.

Результаты, полученные при определении чувствительности штаммов Serratia marcescens к ряду аминогликозидных антибиотиков, представлены в таблице 6. Как видно из приведенных данных, уровни резистентности микроорганизмов к амикацину варьировали в пределах 0,5-8 мкг/мл.

Резистентными к гентамицину оказались 25 штаммов, к тобрамицину - 27 штаммов, сизомицину - 30 штаммов, канамицину -20, неомицину и мономицину - по 13 штаммов и к стрептомицину -28 штаммов.

2.2. Определение типов аминогликозидинактивируюцих ферментов штаммов S. marcescens методом ASRP.

С целью выявления типов инактивирующх аминогликозиды ферментов, анализировали величины зон подавления роста микроорганизмов вокруг дисков с 12 аминогликозидными антибиотиками (табл.7). Ре-

Таблица 6. Определение величин ¡¿ПК аминогликозидов в отношении изученных штаммов Б. тагсезсепз

1 I АМИКАЦИН 1 | ГЕНГАШЩИН ТОБРАШВДН сизошдан 1 | КАНАШЦИН 1 | НЕОШШН 1 I шношпщн 1 1 |СТРЕПТОМИЦИН|

|к-ция, 1 ЮТ/МЛ кол-во I ' I 1 к-ция, |кол- 1МКГ/МЛ 1 ВО 1 1 к-ция, | мкг/млI кол-во к-ция, мкг/мл 1 I кол-|во | К-ЦИЯ, |МКГ/МЛ кол-во 1 1 Iк-ция, |кол- |МКГ/МЛ I во 1 1 1 1 Iк-ция,|кол-Iмкг/мл|во 1 | 1 1 1 |к-ция, |кол-| |мкг/мл |во | 1 1 1

1 <0.5 10 1 1 I <0.5 | 6 1 <0.5 | 2 2 1 1 1 I <0.5 1 1 1 | <0.5 | 18 1 1 1 1 I <0.5 I 18 1 1 1 I <0.5 | 3 | 1 1 1

I 1-2 4 1 1 | 4-16 | 6 1 2 1 2 4-16 1 1 15 1 1 8 10 1 1 I 16-32 | 6 1 1 | 128 | 1 1 | 1 1 1 | 32-128! 8 I

I 4-8 17 1 1 132-1281 19 1 | 1 4-16| 1 16 32-64 1 1 15 1 1 16 1 1 1 | 64->256| 7 1 1 I >256 | 12 1 | 1 1 1 | >256 | 20 | 1 1 1

| 1 1 1 1 1 1 1 32-641 1 11 1 1 1 164->256 1 19 1 1 1 1 I 1 1 1 1 1 1 I 1 1 1 1 1 1 .1

Примечания. X резистентных штаммов: к амикацину( ЫПК >- 16 мкг/мл) - 0 к гентамицинуС 1ЯК >- 4 мкг/мл)

- 81 X ( 25 штампов); к тобрамицинуС ЫПК V 4 мкг/мл) - 87 % ( 27 штаммов); к сизомидину( МПК V 4 мкг/мл)

- 97 % ( 30 штатов); к канамицину( ЫПК >. 16 ют/мл) - 67 % ( 20 штаммов); к неомицинуС МПК >✓ 16 мкг/мл)

- 43 % ( 13 птамшз);к ыономицину( МПК >.-16 мкг/мл) - 43 ШЗ штаммов);к стрептомицику( МПК ^ 16 мкг/мл)

- 93 % ( 28 штампов); в скобках указаны пограничные концентрации.

-гО-

Таблица 7. Вэхичини sob полазхаккя роста Eiaiaos S. marcascans и соответ-ствукдаг ни типы ш^оглтякдакаетиакруквдз Форматов

N ШЕБКОТНН1 С2Р1ЙШЫ

Fin 5NL 2!¡t 5Ss As Ici Ak Тп|ея Ни Ht Ка

046 32 32 16 18 23 21 17 10 23 22 14 16 AAC(6')-Io

3142 33 33 17 19 30 24 19 13 36 24 15 17 ЛАС(6')-1о

9842 34 34 17 19 30 22 18 12 25 24 16 16 AAC(6')-Io

5376 31 31 17 18 29 22 20 12 26 24 15 18 AAC(6')-Io

1101.3 33 34 19 19 29 23 18 12 29 27 17 19 AAÍX6' )-Io

6S8 33 11 12 20 29 23 28 13 6 23 14 18 AAC(3)-Y

048 35 14 8 18 ЭО 23 18 e 6 28 14 17 AAC(6' }-Ic,AAC(3)-V

045 33 12 6 16 23 22 18 6 6 24 11 15 AAC(6')-Io.AAC(3)-V

044 32 20 9 19 29 25 19 10 10 25 13 17 AAC(6')-Ic.AAC(3)-Y

049 33 13 6 17 29 24 19 6 6 24 11 15 AAC(6')-lo,AAC(3)-V

6365 33 12 6 16 27 20 17 e 0 22 10 15 AAC(6')-Ic.AAC(3)-V

2586 33 14 6 16 29 23 19 7 6 23 12 17 AAC(6')-Ic,AAC(3)-Y

101 32 32 11 20 28 20 15 6 10 24 14 10 ААЯб'^с.АЩг")

111 33 33 12 20 28 24 17 6 7 24 14 6 AAC(6')-Ic,AOT(2")

108 30 29 10 16 28 20 17 6 8 22 11 8 AACÍ6')-Io,m(2")

103 33 32 15 22 28 22 18 6 9 24 14 9 AACÍ6' )-Io,ANT(2")

109 35 33 11 17 30 19 16 6 7 23 12 6 AAC(6')-Io,AMT(2")

6260 32 19 17 20 30 25 19 12 25 24 15 16 AAC(6')-Io, ?

8а 33 14 14 20 26 29 27 12 6 12 15 6 AAC( 3) -V, APHi 3' )

1187 33 16 18 21 28 29 23 14 8 13 17 6 АДДЗ)-У.АРН(З')

047 32 23 19 25 29 29 27 17 13 6 21 6 AAC(3)-Y.APH(3')

407 33 15 15 21 28 28 25 13 6 13 16 6 AAC(3)-V,APH(3')

448 35 13 13 20 28 27 26 12 6 12 16 6 AAC( 3) -V, APH( 3' )

4379 32 17 17 22 27 23 28 15 9 15 19 6 AAC(3)-V,APH( 3* )

3368 зо 14 1Б ** 2ß 25 25 13 8 13 16 6 AAC(3)-Y,AFH(3')

8774 33 24 20 25 23 27 27 18 16 9 25 6 AAC(3)-V, АРН(З')

28 11 30 19 22 27 25 21 12 14 11 17 6 AAC(6')-Ic,AAC(3)-I,APH(3' )

29 11 29 16 20 26 24 21 12 14 13 17 6 AACC6')-lo,ААС(З)-I.АРН(3' )

9а 0 29 17 19 26 25 20 6 8 12 16 6 A£C£|;j-Io.AAC(3)-I.ANT(2")

СО 10 31 16 22 29 26 23 6 8 14 Ю 6 АЛС( 6') - 1С. ААС(З) -1, ANT( 2") AFKC3)

Сокраззшк: Fn- Со prias зда, 6Ni- б'-эткдЕепшвадан, 2lit- 2'-зткгнэтиамцин. 5Ss- 5-ОЯ аакпизоащет. Jta>- епрсьсщен, la- кзэшигздия, Ak- иаашдш, ткг тоОракщш, Go- гостгислви. Кл- нзоьаздш, Ht- Еатказзди. Кг>- казасвдш.

зультаты эксперимента позволяют предположить продукцию 21 птаммом Serratia ¡rarcescens фермента ААС(6')-1с, 16 изолятами - ацетилт-рансфзразы AAC(3)-V и 4-мя штаммами -ацетилтрансферазы ААС( 3) -1.

Из других типов ферментов, кодифицирующих аминогликозидные антибиотики, в 7 штаммах была обнаружена нуклеотидилтрансфераза АМТ(2"), а для 13 штаммов получены предварительные данные о продукции фосфотрансферазы типа АРН(З'). Дополнительные данные о чувствительности этих изолятов к ллвидомицину и бутирозину свидетельствуют о продукции ими фермента АРН(3')-1.

Результаты определения фенотипов аминогликозидрезистентности 31 клинического изолята Serratia niarcescens показали, что семь из них продуцировали только по одному ферменту (6 штаммов - AAC(6')-Ic, 1 штамм - AAC(3)-V). Остальные 24 штамма продуцировали следующие сочетания ферментов: шесть штаммоз - AAC(6')-Ic + AAC(3)-V, пять штаммов - AAC(6')-Ic + ANT(2"), девять штаммов - AAC(3)-V + АРНС3*)-1 (причем у одного из них пошюэна проницаемость для ами-ногликозидных антибиотиков), два штамма - ААС(6')-1с + ААС(3)-1 + АРНСЗ*)-1 и два штамма - ААС(6')-1с + ААС(3)-1 + ANTC2") + АРН(3*)-1.

2. 3. Характеристика генов, кодирующих ашшогликозидипактнви-рукуду.е $зр>;.оити штаьп.-юв S. rssvescens.

С долью характеристики генов, кодирующих амлногликозидинактиви-рующие ферменты, были проведены эксперименты по ДНК-ДНК гибридизации с использованием в качестве ДНК - зондов внутренних фрагментов генов следующих ферментов: ANT(2"), AAC(3)-V, APH(3')-I, AHT(4')-I, ANT(4')-II, AAC( 3) -1, AAC(3)-VI, AAC(6')-Ib, AAC(6')-Ic, aPH(3')-II, APH(3')-VI, APH 2"+6\

Результаты проведенных экспериментов представлены в таблице 8. Как видно из приведенных данных, Есе штаммы Serratia rrarcescens содержали ген, кодирующий фермент ААС(6')-1с, 17 птанмов - ацетил-трансферазу AAC(3)-V, 4 штамма - фермент ААС(3)-1, 7 штаммов -нуклеотидилтрансферазу ANT(2") и 13 штаммов - фосфотрансферазу АРН( 3') -1.

Полученные данные свидетельствуют о том, что ген фермента ААС(б*)-1с высокоспецифичен для штаммов Serratia rrarcescens, что позволяет использовать его в качестве ДНК - зонда для идентификации микроорганизмов рода Serratia Следует отметить, что наряду с геном, кодирующим аниногликози-

- ¡га-

Таблица 8. Результаты определения типов ашногликозидинактивируюдах ферментов дгашов Б. вагсазсопз двумя различаььи штодаии

N ФЕРЫЕНТЫ

определены но фэЕОИпу определены ДНК-ДЕК гибридизацией

046 ААС(6')-1с ААС(6')-1с

3142 ААС(6')-1о ААС(6*)-1о

9842 ААС(6')"1о ААСС б')-1о

5376 ААСС6')-1с ААС(6')-1с

11013 ААС(6')-1с ААС(б')-1с

698 ААСС3)-У ААС(6')-1с.ААС(3)-У

048 ААС(6')-1с.ААССЗ)-У МС(б') - 1с, ААСС 3)-У

045 ААС(6')-1о.ААС(3)-У ААС(6')-1о,ААС(3)-У

044 ААС(6')-1с.ААС{3)-У ААСС6' )-1с,ААСС3)-V

049 ААС( б') - 1С, ААС( 3) - V ААС(6')-1с,ААС(3)-У

6365 ААСС6')-1с.ААС(3)-У ААСС б')-1о,ААС(3)-У

2586 ААС(6')-1с,ААС(3)-У ААС(6')-1с,ААССЗ)-У

6260 ААС(6')-1с. ? ААСС б')-1с,ААС(3)-У

101 ААС(6')-1о,А5Я(2") ААС(б*)-1с,АНТ(2")

111 ААСС6' )-1с,АНТС2") ААССб' )-1с, АЩ 2")

103 ААС(6')-1с.Ш(2") ААСС6' )-1с, АОТС2")

103 ААС(б')-1с,АЩ2") ААСС 6') - 1с, АНТС 2")

109 ААС(6')-1с,Ш(2") ААС(6')-1с,АМТ(2")

8а ААС(3)-У,АРН(3')-1 ААСС 6') -1С, ААСС 3) - V, АРНС 3') -1

1187 ААСС3)-У. АРНС3')-1 ААСС 6') - 1С, ААСС 3) - V, АРНС 3') -1

Ск7 ААССЗ)-У,АРЩЗ')-1 ААСС б') - 1С. ААСС 3) - V, АРНС 3') -1

407 ААС(3)-У.АРК(3')-1 ААСС б') - 1С. ААСС 3) - V, АРЩ 3') -1

448 ААС(З)-V, АР1!( 3*) -1 ААСС б') - 1С, ААСС 3) - V. АРНС 3') -1

4379 ААС(3)-У,АРН(3')-1 ААСС6')-1С.ААСС3)-V.АРНС3')-1

3358 ААС(3)-У.АРК(3')-1 ААСС б' У-1С. ААСС 3)V. АРНС 3') -1

8774 ААСС 3)-У,АРНС 3')-1 ААСС 6') - 1С, ААСС 3) - V. АРНС 3') -1

3131 ААСС 3) -V, АРНС 3') -1. прошщ. А/СС 6') -1С. ААСС 3) - V. ЛИК 3') -1

28 ААСС 6')- 1С, ААСС 3) -1. АРН( 3') -1 ААС(6')-1с,ААС(3)-1,ЛРИ(3')-1

29 ААСС б')-1с, ААСС 3)-1, АРНС 3')-1 ААСС 6') - 1С. ААСС 3) -1, АРНС 3') -1

9а ААС£|;^С.ААС(3)-1.АЭТС2"), АЩ;|-|а,ЛАС(3)-1,АЩ2"),

90 ААС£ || | -1 о. ААСС 3) -1, А,ЧТ( 2") АРн(1')" 1С' АА°( 3) ~1'2 Н)'

дацетилтрансферазу ААС(6')-1с, восемьдесят пять процентов изученных нами штаммов содержат другие гены, кодирующие аминогликозиди-нактивируадие ферменты, что обеспечивает этим штаммам устойчивость к широкому набору аминогликозидных антибиотиков.

При сравнении данных по определению типов аминогликозидинакти-вирующих ферментов методами AGRP и ДНК-ДНК гибридизации было показано, что методом AGRP не удалось выявить в 10 штаммах фермент ААС(6')-1с и в одном штамме фермент AAC(3)-V, тогда как кодирующие эти ферменты гены были идентифицированы при помогай специфичных ДНК-зондов. Причиной несовпадения результатов является, очевидно, отсутствие экспрессии вышеназванных генов в данных микроорганизмах.

Z. 4. Конъюгативные R плазмиды штатов S. marcescens.

Конъюгативные плазмиды, несущие гены резистентности к аминогли-козидным антибиотикам, были выявлены у 8 штаммов. Плазмида размером более 100 т. п. н. с находящимися на ней генами, кодирующими ферменты AAC(3)-V и АРН(3')-1, была обнаружена в итаммах Serratia marcescens 448, 407, 8а. У штаммов 6365, 048, 2586 в составе плазмиды размером около'ЮО т. п. н. передавался ген аминогликозидацетил-трансферазы AAC(3)-V. Более легкая R плазмида ( размер менее 60 т. п. н.), содержащая ген фосфотрансферазы АРН(3')-1* выявлена у двух возбудителей: Serratia marcescens 047 и 8774. При сравнении фенотипов антибиотикорезистентности докорных штаммов и соответствующих им транйконьюгантов было установлено: в составе высокомолекулярных R плазмид из штаммов 448, 407, 8а, 6365, 048, 2Е86 в ре-ципиентный штамм Е. coli С600 передавались все гены резистентности донорного штамма, за исключением гена аминоглккозидацетилтрансфе-разы ААС(6')-1с. Из штаммов 047 и 8774 передавались коньюгативные плазмиды, несущие только ген фосфотрансферазы АРН(3')-1, но не ген, кодирующий ацетилтрансферазу ААС(3')-1.

Таким образом, полученные при помощи различных методов данные свидетельствуют о том, что метод ДНК-ДНК гибридизации надежен при определении генов аминогликозидрезистентности. Он позволяет выявить молчащие гены, которые невозможно определить методом AGRP, а также наличие нескольких генов, обеспечивающих перекрывающиеся спектры антибиотикорезистентности. С другой стороны, метод AGRP позволяет выявлять штаммы, у которых резистентность к аминоглико-зидным антибиотикам обусловлена нарушением проницаемости клеточной

стенки микроорганизмов. Другим преимуществом этого метода является возможность идентифицировать гены, близкие по структуре, но обеспечивающие различающиеся спектры антибиотикорезистентности.

Глава 3. Юакфовгигкэ к опрэ£эяэнз:э вдшзоидаоЯ г.зст.эдэ-Еаггэяыетсти гена aad3 кз сгсаыйа Salcsaslla Oranienburg.

Для клонирования гена aadß был использован штамм S. Oranienburg 1376, резистентный к гентамицину, тобрамицину, сизомицину и кана-мицину, что свидетельствовало о продукции этим штаммом аминоглико-зиднуклеотидилтрансферазы ANT(2").

Выделенную из штамма высокомолекулярную ( приблизительно 150 т. п. н.) плазмидную ДНК гидролизовали различными рестриктазами и встраивали в векторные плазмиды риС18 и риС19. Дотированной ДНК трансформировали компетентные клетки Е.coli JM 101 и проводили отбор трансформантов на агаризоЕанной среде, содержащей гентамицин. В результате были получены т^ансформанты, содержащие BamHI вставку чужеродной ДНК размером около 3. 5 т. п. н. .

С использованием различных эндонуклеаз рестрикции была построена рестрикционная карта клонированного ВалШ фрагмента, содержащего ген aadß.

Следующим этапом работы было определение нуклеотидной последовательности BamHI-Hindlll фрагмента размером окола 2.2 т. п. н. , содержащего ген aadß и окружающие его участки ДНК. Секвенирование ДНК проводили методом Сэнгера (рис. 2).

После стыковки секвенированных участков был определен точный размер клонированного и секвенированного фрагмента, который составил 2075 п. н. Открытая рамка считывания размером 531 п. н. , кодиру-ящая фермент ANT(2"), локализована между нуклеотидами, находящимися в положениях 1295 и 1826. В качестве промоторных последовательностей были предложены: -35 бокс TTGACA и -10 бокс ТАААСТ, расположенные на расстоянии 17 п. н. друг от друга.

Сравнение нуклеогидных последовательностей секвенированного на--ми фрагмента ДНК с данными других авторов позволило выявить лишь несколько нуклеотидиых замен в пределах и за пределами структурной части гена aadß.

Данные по нуклеотидной последовательности гена aadß позволили сконструировать высокоспецифичный зонд для детекции этого гена в различных микроорганизмах. В качестве такого ДНК -зонда был ис-

-251 ссиссжл cccj.'xcjxs ссстсстссс сссс;я;:с ííísccükí икстпсс cckcccîcc chccmîcs ccscccîiçç сспссссса mi «ftrsîiM кассии гж'.спсс с:?ссг:::: инксмс rcf.tcccccs кскыги гсссегслгс сксгккс гссксмсг ai псжат кскшя ккяеш сд:дскссс гисасск ешсскс «кпсс?«. tctcny.cc cctcccs;cc иссесскс Kl CEf.".c:;.Kt ccccakcïs îccccïcîcs ccsccïîkt смссисст кпстисс; cícstikm ссссссим исяскст шминс

501 BCCCCSfC ¿CCKiCRC ТССЙИЯС CÍICKÍTCC CÏCÎCCItCS ttüKMttt C.V.ÎKCKC ККШССС CCÍCCKCtt ЙДСТТСССС 501 ICÍAtCeCST СЙСШСС ЮССССССВ KCCCCtCCÎ CCtttîCCÏt CftSCCftCC'I CCCCCtPKC CCC.UÏOCÏÎ CTCCCCCMC «KCÎCCCA «1 fCKCJCîCS trf"C'.."i CKCKICCt ÎÎC.'.CCÎCÎT CCCCJCCCCC f.îClî:"TCî KCCttKTC fciiîCCttJ tCCIItf.CCC СЙПСК»

7C1 ксгкгси иссссясс ситксдо сжшсс сссмемк cmccimcc пс«с«у cecac&tct сежсгспс яскссяс со» «eure« {c.?.kcccî есгссгссеа сстспеса rcrcctccc сассссгм тссясега ссяеткес tumcut «сияем

Î01 CCÎAÎCCCÎS iCiiîîCSIS «iC.'XCCííJ ccaccctic ПКССИ.СС CMCMK« ИССйСМ ÎÎCCCÎÎCIÎ ССШ5И1С CCGSEICÍCS

-55 -10

îooi cf.c.'.cccicc tísreacs matent ссмшм cxcam ссшсскд ижш шихт «ccetcscc саскясс hoi «шла ск'.-жи ссякгмс кс5сгяс8 иятпсгт штстта иштт ткксяс ккккк ситссш

Kit

из! ¿cc.vcccw пмссск? c:îcîf.tm latitats cíceccüx свктжс sccicstcts тмссага аваля сссссасс» i:oi еекпе» кесакл китят tckcciccs cc.".*'.tssîï «ггдтстссс сстстсслтс сясесш mcccmks mcstca 1401 сссссвтм cíctc.'.*.«» сюяяш шккся псскгсса сигссскс сгскссля K'jtarfs етсоскс ссмссяс» им тккшт «Kctitccâ nenae» esmsn :cciîî.ciî ecrcces cifcncstî сссгсзсса ссстггелгл кссссскс ¡toi tccccftccc tCKCccc.'.: :"::с;'с::д ссесискс cccccffscc wtccci:; к.-.сг.:ств с.'.га:;:а тс:с;:;.т:л cîiïiaciat

l/Sl ССССМ&'С IfXCltt.WT СШЕОСИ S£'«CKC4 tiCMTCCtt СМССТССИ KttCttCtt ICECICCCCS fiiCtttCM СТСПСССК StW

is« cucïïïcîî иксии! скясгмс utTCCTCM ;:cc«iccc ccncc:r:c cccscn«: tc/.îcîîiï.î mkcîîim tmmn

îsci ccîcîxîscc îjI'-cîmc-'s stcîicîcis cimsna ягггдсся ссгшт'л; ccckxícm атссихя шткга fcccicccii

scot ntcinm îck:.u'.îi tc;c:iccn ticcc.œ.î ccîcotu ни.'.;сси cscitkctí jccit

Pi-:c. 2 Цузиеотидная поеходоваталькость фрггг!;экта ДБК, содер-глцого гон

Шдиорга^ты: -S5 и -10 богссы промотора, старт-кодон (ïbt) и стоп-ко дон (Stop).

пользован Xhol-Nrul фрагмент структурной части гена размером 350 п. и. В экспериментах по ДНК-ДНК гибридизации со штаммами Serratia marcescens и Salmonella spp., описанных в предыдущих главах, была показана высокая специфичность сконструированного ДНК-зонда

Полученные в последние годы данные свидетельствуют о локализации гена ааdB в составе структуры, получившей название интегрон.

Структура интегрона.схематически представлена на рис.3. Характерной особенностью интегрона является наличие двух консервативных участков (называемых также консервативными сегментами или областями): 5' и 3'. Между этими консервативными областями происходит встраивание различных фрагментов ДНК, в том числе и генов лекарственной устойчивости, которые формируют так называемую вариабельную область. Установлено,что последовательность 3'сегмента, имеющего размер около 2 т. п. н. , содержит три открытые рамки считывания, одна из которых кодирует дигидроптероатсинтетазу, обеспечивающую резистентность к сульфонамидам (sull), тогда как функции двух других рамок считывания: 0RF4 и 0RF5 не установлены. Другой консервативный участок интегрона - 5'сегмент - имеет размер около 1.3 т. п. н. и также содержит три рамки считывания, функции двух из которых: 0RF1 и 0RF2 к настоящему времени не определены. Третья рамка считывания: 0RF3 кодирует фермент интегразу, необходимый для встраивания различных генов мевду консервативными сегментами интегрона

Сравнение рестрикционных карт интегрона, содержащего ген aadB, и клонированного нами фрагмента ДНК позволяет сделать вывод о присутствии в пределах этого фрагмента гена aadB, а также всего, за исключением небольшой части, 5' консервативного сегмента и 3'консервативного сегмента интегрона .

Таким образом, проведенные исследования свидетельствуют о высокой степени консервативности гена aadB и окружающих его последовательностей, составляющих единое делое - интегрон. Встраивание в интегрон различных генов, в том числе детерминант антибиотикоре-зистентности, приводит к возникновению самых разных комбинаций генов, что в свою очередь обеспечивает микроорганизмам большие возможности выживания в постоянно изменяющихся селективных условиях внешней среды. Преимущественная же локализация интегронов в составе плазмид и транспозонов способствует широкому распространению генов лекарственной устойчивости как мевду отдельными генетическими структурами, так и между самыми различными микроорганизмами.

I | int (0RF3) В

P

X N H H Ps

В в

0RF1 j 10RF2 | [ aadD j j 0RF4 | sull | |

0RF5

i

JO

-u

I

II

X N H H Ps

В

>d.__iL_____^

3'

Рис.з. I- Схематическое изображение кнгегрона со встроенным геном aadB. I I-Рестрикционная карта клонированного из плазмиды штамма S.oranienburg BamHI фрагмента. Условные обозначения сайтов узнавания рестрикционными эндонуклеазами: В-BamHI; H-HindIII; N-Nrul; P-PvuII; Ps-Pstl; X-Xhol.

-28-выводи

1. Определены спектры и уровни резистентности к аминогликозид-ным антибиотикам 50 резистентных к аминогликозидам штаммов Salmonella spp. , выделенных из различных источников, и 31 резистентного клинического изолята Serratia marcescens.

2. Установлено, что все штаммы сальмонелл содержали одну или две высокомолекулярные плазмиды. В процессе конъюгации R плазмиды, несущие детерминанты резистентности к аминогликозидам, передавались из 21 (42%) штамма сальмонелл. Высокомолекулярные конъюгатив-ные R плазмиды, детерминирующие резистентность к аминогликозидным антибиотикам, обнаружены в 8 из 31 штамма Serratia marcescens.

3. Показано, что изученные штаммы Salmonella spp. продуцируют аминогликозидинактивирующие ферменты трех типов, а штаммы Serratia marcescens - ферменты пяти типов. Есе штаммы Serratia marcescens содержат ген ацетилтрансферазы ААС(6')-1с, отсутствующий у энтеро-бактерий других видов .

4. Из штамма Salmonella Oranienburg клонирован фрагмент плаз-мидной ДНК, содержащий ген aadB. Определена нуклеотидная последовательность клонированного гена aadB и граничащих с ним фрагментов ДНК. Установлено, что ген расположен в составе интегрона.

5. Создан ДНК-зонд для детекции в микроорганизмах гена aadB. В экспериментах по ДНК-ДНК гибридизации показана высокая специфичность созданного ДНК-зонда.