Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Функциональные особенности антигенпрезентирующих клеток и активированных лимфоцитов у больных апластической анемией

На правах рукописи

Арчуадзе Шорена Зурабовна

ункциональные особенности антигенпрезентирующих клеток и активированных лимфоцитов у больных апластической анемией»

14 00 29 - Гематология и переливание крови

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

0031Т6158

Москва 2007

003176158

Работа выполнена в Государственном учреждении Гематологический Научный Центр Российской Академии Медицинских Наук

Научный руководитель

Ведущий научный сотрудник ГНЦ РАМН, доктор медицинских наук Михайлова Е А

Официальные оппоненты

Доктор медицинских наук, профессор А А. Масчая

Заслуженный деятель науки, доктор медицинских наук, профессор Булычева Т И

Ведущее научное учреждение

Московский областной научно-исследовательский клинический институт им М Ф Владимирского

Защита состоится « ¿Г» 2007г в /У час

На заседании Диссертационного' Совета Д 001 042 01 при Государственном учреждении Гематологический Научный Центр Российской Академии Медицинских Наук по адресу 125167 Москва, Новозыковский проезд, д 4а

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного учреждения Гематологический Научный Центр Российской Академии Медицинских Наук

Автореферат разослан « $ » Мо.9еС^?<!>' 2007 года

Ученый секретарь Диссертационного Совета

кандидат медицинских наук ЕЕ Зыбунова

Актуальность проблемы

Результаты программной иммуносупрессивной терапии (ИСТ) при апластической анемии (АА), особенно, при рефрактерной форме заболевания требуют улучшения. Общепринятая классификация АА характеризует состояние гемопоэтической системы в момент установки диагноза, но не отражает глубину нарушений механизмов иммунорегуляцни, приводящих к аплазии кроветворения Следовательно, существующая классификация не позволяет выявить благоприятные или неблагоприятные факторы риска у больных АА при манифестации заболевания н разработать дифференцированный подход к иммуносупрессивному лечению конкретных больных с целью достижения оптимального ответа на терапию Остаются неизученными вопросы, касающиеся необходимого объема и длительности иммуносупрессии в зависимости от выраженности иммунологических нарушений

Mathe и соавт 30 лет назад высказали предположение об иммунологических механизмах развития апластической анемии Одним из подтверждений этой гипотезы является доказанная эффективность иммуносупрессивной терапии при данном заболевании Кроме того, результаты изучения гипервариабельных регионов Т-клеточных рецепторов показали олигоклональность Т-клеточного ответа. В настоящее время считается доказанным, что у больных апластической анемией имеет место повышение соотношения активированных CD4+ Т-хелперов I и II типа (Thl/Th2), гиперпродукция миелосупрессивных цитокинов (интерферона-?, фактора некроза опухоли-а) периферическими мононуклеарными клетками, а также дефицит иммунорегуляторных цитокинов, подавляющих продукцию миелосупрессивных цитокинов активированными Т хелперами и Т-цитотоксическими клетками I типа.

Однако, механизмы, определяющие развитие иммунной агрессии, приводящей к развитию апластической анемии, а именно, роль антигенпрезентирующих (АПК) клеток остаются неизученными.

Антигенпрезентирующие клетки, в частности, дендритные клетки (ДК) способны путем продукции иммуномодуляторных цитокинов - интерлейкина (ИЛ) -10 и ИЛ-12, определить направленность иммунного ответа. Показано, что именно дендритные клетки способствуют активации HLA-DR2 специфической Т клеточной популяции при апластической анемии Однако, работы по функциональной характеристике АПК при АА не проводились.

В связи с вышесказанным, изучение функциональных способностей (секреторных и иммунофенотипических особенностей) АПК и активированных лимфоцитов больных АА при манифестации заболевания, на разных этапах ИСТ и в период ремиссии, а также выявление факторов риска с целью разработки дифференцированного подхода к лечению и оптимизации программной иммуносупрессивной терапии представляет большой интерес Данные нерешенные вопросы послужили поводом для проведения настоящего исследования

Цель исследования:

Изучить иммунофенотипические особенности, а также ИЛ-10 и ИЛ-12 продуцирующие способности дендритных клеток больных апластической анемией и определить прогностическую значимость функциональных свойств АПК и активированных лимфоцитов при АА

Задачи исследования:

1 Изучить иммунофенотипические особенности дендритных клеток, полученных из моноцитов периферической крови больных АА до начала иммуносупрессивной терапии

2 Оценить способность культивированных дендритных клеток к продукции ИЛ-10 и ИЛ-12

3 Оценить способность активированных лимфоцитов больных апластической анемией к секреции ИЛ-10

4 Определить прогностическую значимость уровня продукции ИЛ-10 и ИЛ-12 в культурах ДК больных апластической анемией

5 Разработать практические рекомендации по анализу функциональных особенностей ДК, полученных in vitro (частота проведения исследования, особенности культивации дендритных клеток)

Научная новизна

В процессе исследования антигенпрезентируюпщх клеток, полученных из периферической крови больных АА впервые

• Получены ДК в in vitro условиях из моноцитов периферической крови больных АА

• Изучена экспрессия костимуляторных молекул (CD40, CD80 и CD86) и специфического маркера зрелых ДК (CD83) на поверхности культивированных дендритных клеток больных АА

• Изучена способность культивированных дендритных клеток больных апластической анемией к продукции интерлейкина-10 и интерлейкина-12

• Определена прогностическая значимость ИЛ-10 и ИЛ-12 продуцирующей способности дендритных клеток, полученных in vitro, у больных АА

Научно-практическая ценность:

- Отработана методика культивации дендритных клеток из моноцитов периферической крови больных АА, позволяющая изучить функциональные особенности культивированных ДК

- Определены неблагоприятные факторы риска для больных АА, позволяющие разработать дафферецированный подход к терапии больных апластической анемией

- Разработаны практические рекомендации по анализу функциональных особенностей ДК, полученных ш уйго (время и частота проведения исследования), в зависимости от предшествующего неадекватного лечения или от этапа программной ИСТ

Положения, выносимые на защиту

1 До начала программной иммуносупессивной терапии значительно повышенный уровень продукции ИЛ-12 культивируемыми дендритными клетками выявляется у 70,8% больных алластической анемией, а низкая способность культивированных дендритных клеток к продукции ИЛ-10 отмечается у 61,6% больных алластической анемией

2 Программная иммуносупрессивная терапия у 66,7% больных алластической анемией способствует снижению уровня секреции ИЛ-12 культивированными дендритными клетками, а также повышению продукции ИЛ-10 культивированными дендритными клетками у 64,8% больных АА Изменения функциональных особенностей дендритных клеток на фоне ИСТ коррелируют с клиническими результатами терапии

3 Выявление высокой ИЛ-12 и низкой ИЛ-10 продуцирующей способности культивированных дендритных клеток больных алластической анемией до начала адекватного лечения или на ранних этапах терапии является показанием для более интенсивной и длительной (не менее двух лет) иммуносупрессивной терапии

4 Отсутствие продукции интерлейкина-10 ФГА стимулированными лимфоцитами больных алластической анемией на фоне адекватной иммуносупрессивной терапии ассоциируется с крайне неблагоприятным клиническим ответом на лечение

5 Морфологические характеристики культивированных дендритных клеток больных алластической анемией и здоровых доноров существенно не отличаются

Публикации:

По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ Апробация диссертации

Основные положения работы доложены на Международной Гематологической Школе «Лейкозы и лимфомы Терапия и фундаментальные исследования» (Москва, в 2004г, 2005г и 2007г ), на 25-ом Ежегодном Конгрессе Британского Общества Иммунологии (Великобритания, 2003г ), на 9-ом Конгрессе Европейской Гематологической Ассоциации (Женева, Швейцария, 2004)

Объем и структура работы

Диссертация изложена на 164 страницах, состоит из введения, обзора литературы, главы «Методы и материалы», главы собственных результатов, заключения, выводов, практических рекоммендаций и указателя литературы Работа иллюстрирована 60 рисунками и 24 таблицами Диссертация выполнена в отделении высокодозной химиотреапии гемобластозов и трансплантации костного мозга ГНЦ РАМН (директор НИИ МГ и ТКМ, член-корреспондент РАМН, профессор В Г Савченко, Зав отд высокодозной химиотерапии гемобластозов и ТКМ, к м н Б Н Устинова), в условиях лаборатории отделения высокодозной химиотерапии гемобластозов и трансплантации костного мозга, а в дальнейшем в лаборатории генной инженерии ГНЦ РАМН (зав лаб к б н AB Мисюрин), при участии отделения экстракорпорального очищения крови {Зав. отд, д.м н Калинин H.H.), лаборатории физиологии кроветворения (зав лаб. д.б.н. Дризе Н И.)> стационара дневного пребывания ГНЦ РАМН (зав отд. к м и. И И. Цыба), клинической лаборатории ГНЦ РАМН (Зав лаб, к.м.н Тихонова Л Ю ) и патологоанатомической лаборатории ГНЦ РАМН (Руководитель отд., член-корр РАМН, д м н, профессор Г А Франк), лаборатории функциональной морфологии гемобластозов (Зав лабораторией, д б н, профессор И А Воробьев)

Соавторами работ, опубликованных по теме диссертации, являются сотрудники ГНЦ РАМН-дм н ЕА Михайлова, к.б.н СадовниковаЕЮ , член-корр. РАМН В Г Савченко, дмн Е Н. Паровичникова, к.м н ЕЛ Устинова, к м н В Н Ядрыхииская, Г П Саркисян, к м н А.В Кохно, к.мн К И Данишян, ЕМ. Штырева, ктн, СМ Куликов, JIJI Головкина, Т Л. Вахрушева, O.A. Фадеев, Н.Н Калинин, Н В Гайдамака.

Содержание работы

Характеричтика больных

В исследование были включены 30 больных (14 муж, 16 жен) апластической анемией, которые лечились в отделении высокодозной химиотерапии гемобластозов и трансплантации костного мозга (директор НИИ МГ и ТКМ, член-корреспондент РАМН, профессор, д м н В Г Савченко, заведующая отд высокодозной химиотерапии гемобластозов и ТКМ, к.мн ЕН Устинова) Гематологического Научного Центра РАМН (директор академик А.И Воробьев) с декабря 2002г. по декабрь 2005г. На момент включения в исследование медиана возраста составила 23,5 (15-65) года, а медиана давности заболевания - 4 (1-168) месяца.

Обследование, классификация, лечение и оценка результатов терапии осуществлялись в соответствии с действующим протоколом комбинированной терапии взрослых больных АА

Из 30 пациентов, включенных в данную работу, у 23 больных впервые была диагностирована АА, у четырех имел место рецидив АА, а у троих - рефрактерная форма

заболевания, которая оказалась нечувствительной к предшествующей адекватной ИСТ 9 больным из 23 первичных пациентов по месту жительства проводилась только заместительная гемокомпонентная терапия Остальные 14 больных получали неадекватную иммуносупрессивную терапию, включающую преднизолон (к=8) и/или циклоспорин-А (п=10) Из четырех больных, страдающих рецидивом АА, у двоих больных отмечался первый, а у остальных пациентов -второй рецидив Три больных рефрактерной формой заболевания уже получали программную иммуносупрессивную терапию, однако, на момент включения в исследование у пациентов сохранялась зависимость от заместительной гемокомпонентной терапии

В дебюте заболевания анемический синдром преобладал у 93,3% (28/30) больных Манифестация болезни сопровождалась инфекционными осложнениями у 36,67% (11/30) больных Геморрагический синдром отмечался у 66,67% (20/30) больных.

Только один этап ИСТ был выполнен 50% (15/30) больных АА, включая 8 пациентов с нетяжелой и 7 больных с тяжелой формой заболевания 26,67% (8 из 30) больных АА (1-НАА, 7-ТАА) были выполнены 2 этапа (СЭ+АТГАМ - 6 больных, 2 курса АТГАМ - 1 и АТГАМ + сеансы лимфоцитафереза — 1 пациент) программного лечения апластической анемии В связи с рефрактерностъю заболевания 23,33% (7/30) больных (3-НАА, 4-ТАА) были проведены 3 этапа (2 курса АТГ/АЛГ - 6 больных, 1 курс АТГ, СЭ и сеансы лимфоцитафереза - 1 больная) иммуносупрессивного лечения Эффективность ИСТ оценивалась через 3,6, 9, 12, 18,24 месяца и далее ежегодно.

Так как иммуносупрессивные препараты, применяемые при лечении больных апластической анемией, влияют на функциональные свойства АПК, в период обработки результатов исследования функциональных особенностей ДК и активированных лимфоцитов больных распределяли в следующие три подгруппы по признаку предшествующего лечения. 1-я подгруппа - нелеченные больные (п=9; 6 жен, 3 муж, медиана возраста - 27 (16-46) лет, 8 - ТАА, 1 НАА), 2-я подгрппа- адекватно леченные больные (п=7, 3 жен, 7 муж, медиана возраста 29 (1945) лет, 2 — ТАА, 5 - НАА), 3-я подгруппа - неадекватно леченные больные (п=14; 8 жен, 6 муж, медиана возраста 20 (15-65) лет, 6 - НАА, 8 - ТАА)

Контрольную группу составили 10 здоровых доноров Лейкоконцентраты, полеченные из крови здоровых кадровых доноров путем отделения плазмы, а также тромбоцигарной и эритроцитарной фракций на аппарате СЭ-ЗООО, были предоставлены Станцией Переливания Крови ГНЦ РАМН (заведующая СПК Г К Орлова)

Методы исследования

Изучение функциональных особенностей ДК и активированных лимфоцитов больных АА проводились до начала программной ИСТ, после выполнения I этапа лечения и при достижении

ремиссии заболевания Пациентам, страдающим рефрактерной АА, исследования выполнялись дополнительно на 11 и 111 этапах иммуносупрессивной терапии

С целью исключения влияния инфекционных осложнений и/или гормональной терапии на исследуемые показатели функциональных особенностей ДК, исследования проводились через 710 дней после купирования инфекционного процесса и/или после отмены преднизолона.

ДК культивировали из фракции периферических мононуклеаров, обогащенной моноцитами, методом клеточных культур in vitro в условиях лаборатории отделения высокодозной химиотерапии гемобластозов и трансплантации костного мозга, а в дальнейшем в лаборатории генной инженерии ГНЦ РАМН (зав лаб к.б н А В Мисюрин)

Выделение мононуклеаров - Мононуклеарные клетки периферической крови (ПМНК) больных АА получали в результате сеансов лимфоцятафереза на аппарате CS-3000 (лечебный лимфоцитаферез) или на центрифугах ЦОП 3-3,5 и ЦРЛ6-01 ручным методом (диагностический лимфоцитаферез) в отделении «Экстракопорального очищения крови» (Зав отд, д м н Калинин H.H.) Каждый сеанс лечебного лимфоцятафереза позволял получить 50-70мл лейконцентрата, из которого в дальнейшем выделяли 1010 - 11485х 106 (медиана - 1875x10е) ПМНК Сеансы диагностического лимфоцитафереза выполнялись на центрифугах ЦОП 3-3,5 и ЦРЛб-01 ручным методом После сеансов диагностического лейкафереза получали лейкоконцентратъг в объеме от 30 до 110 мл (медиана - 60мл), которые содержали 0,75 - 12,5 х 108 (2,2 х 108) ПМНК

Для выделения ПМНК больных АА, достигнувших клинико-гематояогическое улучшение (КГУ) или ремиссию заболевания, в амбулаторных условиях отбирали 40-50мл крови во флаконы с гепарином (в расчёте 50 ед/мл) (Sigma) Из данного количества периферической крови выделялись 4,07х107 (1,56-18,75х107) моноиуклеарных клеток

Мононуклеары выделяли в градиенте плотности фикола путем центрифугирования в течение 20 минут при температуре 20°С со скоростью 2000оборотов/мин Клетки во фракции на границе двух фаз собирали и отмывали средой аМЕМ 2 раза.

Получение культур дендритных клеток больных АА и здоровых доноров - Во время каждого эксперимента клетки культивировали в двух матрасах площадью 25см2 ПМНК суспендировали по 8х107 клеток на 5мл среды роста, содержащего RPMI 1640, 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2мМ L-глютамина, 2х10"5М 2-меркаптоэтанола и 0,025мл антибиотиков, помещали в матрас и инкубировали при 37°С и 5% СОг в течение 1,5 ч

Путем адгезии отделяли фракции моноцитов и лимфоцитов Нами показано, что 90-95% адгезивных клеток представлены CD14+ моноцитами, а 93% неприкрепленных клеток -экспрессируют CD3, что соответствует литературным данным В дальнейшем, для 1фаткосш, прикрепленную фракцию клеток, богатую моноцитами, будем называть «моноцитами», а неадгезивную фракцию клеток, обогащенную лимфоцитами - «лимфоцитами»

Таким образом, после окончания инкубации в матрасах с моноцитами, заменяли среду на свежую, добавляли ростовые факторы - 1000 ед/мл гранулоцитарно-макрофагальный - колоние-стимулирующий фактор (ГМ-КСФ) и 800 ед/мл ИЛ-4- и культивировали при е 37°С и атмосфере 5% С02 в общей сложности 5 суток Через 48-72 часов культивации половину среды обновляли Стимуляцию клеток проводили либо в присутствии липополисахарида (ЛПС), либо - CD40L

Стимуляция кулыур липополисахаридом - В матрас с культурой клеток добавляли липополисахарид (ЛПС) в концентрации 10 мкг/мл и также инкубировали в течение 48 часов в условиях 37°С и 5% СОг Через 48 часов из матраса собирали кондиционированную клетками среду Клетки осаждали центрифугированием в течение 5 минут при 1500 об/мин Надосадочную среду замораживали при - 20 "С В матрас добавляли 1 мл трипсина и в течение 2 минут матрас оставляли в инкубатор. Отделенные от дна матраса и осажденные ДК объединяли и подсчитывали в камере Горяева (Жизнеспособные влепи определяли с помощью трипанового синего)

Стимуляция культур клетками линии мышиных фибробластов ЗТЗ- CD40L -Полученные жизнеспособные клетки с целью окончательного созревания ДК помещали в лунки плоскодонного 96 - луночного планшета (из расчета 4*104 ДК на 100 мкл среды роста, т е на 1 лунку) (минимум по 3 лунки на 1 образец) В каждую лунку добавляли клетки линии мышиных фибробластов ЗТЗ (любезно предоставленные Schulze, NIH, USA), экспрессирующие на своей поверхности СШО-лиганд человека (из расчета 5*104 ЗТЗ на 1 лунку) Совместные культуры ДК и ЗТЗ фибробластов инкубировали в течение 48 часов в условиях 37°С и 5% СОг Через 48 часов из каждой лунки собирали кондиционированную среду, центрифугировали и супернатант замораживали при - 20°С для дальнейшего определения концентрации ИЛ-12

Культивация лимфоцитов с целью оценки ИЛ-10 продуцирующей способности лимфоцитов больных АА - Лимфоцитов (фракция неадгезивных клеток) осаждали путем центрифугирования, подсчитывали в камере Горяева и в количестве 2x10б кл/2мл среды роста RPM с добавками помещали в двух лунках 24-луночного планшета. В одну из 2-х лунок добавляли 1мкг/мл фитогемаглютинин (ФГА) и инкубировали при 37°С и 5% СОг в течение 48 часов После инкубации содержимое лунок собирали, центрифугировали и супернатант замораживали при - 20 "С с целью определения концентрации ИЛ-10

Изучение уровня продукции ИЛ-12 ДК, а также ИЛ-10 ДК и лимфоцитами больных АА - Уровни продукции ИЛ-10 и ИЛ-12 ДК и лимфоцитами больных АА и здоровых доноров определялся в среде, кондиционированной этими клетками, методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) набором реактивов OptEIA, Human IL-10 Set (каталогочный номер 555157, BD PharMingen) и OptEIA, Human IL-12 (p70) Set (каталогочный номер 555183, PharMingen), соответственно, по инструкции фирмы производителя набора реактивов Оптическую плотность растворов измеряли при длине волны 450 нм и 540 нм на

спектрофотометре вертикального сканирования в лаборатории Физиологии Кроветворения (зав лаб дбн Дризе НИ.). Перед каждой реакцией ИФА готовили растворы рекомбинаятного человеческого ИЛ-10 (BD Pharmmgen, IL-10, каталогочный номер 554611) и ИЛ-12 (BD Pharmmgen, IL-12 (р70), каталогочный номер 554613) известных концентраций (273пг/мл, 182пг/ш1, 121,3пг/мл, 81пг/мл, 54пг/мл, Збпг/мл, 24пг/мл, 16пг/мл, 11пг/мл) По известной концентрации стандартных растворов и соответствующим значениям оптической плотности строили график и составляли формулу, по которой считали концентрацию цитокинов в исследуемых образцах Как описывали выше, для стимуляции ДК фибробластами мышиной линии, а также для культивации лимфоцитов использовали стандартные количества клеток и стандартные объемы среды роста. Концентрацию ИЛ-12 и ИЛ-10, соответственно считали в единицах пг/мл Так как, в культурах после стимуляции ЛПС количество ДК отличалось при стандартных объемах среды роста, при оценке концентрации ИЛ-10 в культуральной среде учитывали число стимулированных ДК - пг/xl О6 ДК

Изучение иммунофенотипических особенностей проводилось в лаборатории отделения высокодозной химиотерапии гемобластозов и ТКМ, с последующей проточной цитометрией (Becton Dickenson) в лаборатории кардиологического научно-производственного комплекса Министерства Здравоохранения России Использовалась панель, состоящая из 9 моноклональных антител (мкАТ), конъюгированных с одним из двух флюорохромов FITC и фикоэритрин (РЕ) С целью предотвращения неспецифического связывания антител, ДК в течение 20 минут инкубировались с иммуноглобулином G1 класса (100мкл IgGl / 2х106 ДК), после чего окрашивались методами прямой (ПРИФ) или непрямой (НРИФ) иммунофлюоресценции С целью отрицательного контроля, полученные клетки метили мышиными антителами IgGl класса, конъгированными с FITC В качестве положительного контроля использовали антитела против HLAI класса человека антитела - НВ95 (Imperial College Medical School London)

Для оценки антигенного профиля с помощью электронного окна выделяли популяцию клеток В каждом образце анализировали 5000-10000 событий Флюоресцентные параметры снимали в логарифмическом масштабе Результаты распечатывали в виде DotPlot изображений. Примесь лимфоцитов и моноцитов в полученной культуре клеток оценивали по экспрессии CD3 и CD14, соответственно Содержание ДК определяли по экспрессии СТШ-специфического маркера зрелых ДК Отдельно проводили количественную оценку клеток, экспрессирующих CD40, CD80 и CD86 костимуляторн ые молекулы, в выделенной популяции клеток и сравнивали с аналогичными показателями здоровых доноров

Статистический анализ выполнен в лаборатории биостатистики информационных систем (зав к т н Куликов С М) с помощью статистических пакетов SAS JMP методами описательной статистики, анализа сопряженности таблиц, анализа корреляции данных и событийного анализа

Основные понятия

Нелечеяные больные АА — Больные апластической анемией, у которых имела место первая манифестация заболевания, и которым специфическое иммуносупрессивное лечение не проводилось до включения в исследование

Неадекватно леченные больные АА - больные апластической анемией, которым до включения в исследование проводилось ИСТ, включающее преднизолоя и/или циклоспорин-А Таким больным исследования проводились через 7-10 дней после отмены преднизолона Циклоспорин-А не отменяли перед исследованием, однако, он будет учтен при интерпретации результатов

Адекватная (программная иммуносупрессивиая терапия) - ИСТ, соответствующая действующему протоколу лечения апластической анемии

Полная и частичная ремиссия - Полная или частичная нормализация показателей гемограммы, включая лейкоцитарную формулу

Клинико-гематологическое улучшение - улучшение показателей гемограммы (гемоглобин - более 80г/л, гранулоциты - более 1,0х109/л (для ТАА >0,5х109/л), тромбоциты -более 30,0x109/л), исчезновение или значительное уменьшение зависимости от трансфузий компонентов крови

Рефрактерность - Отсутствие улучшения показателей периферической крови и сохранение зависимости от гемотрансфузий в течение б месяцев от начала ИСТ

Культивированные ДК здоровых доноров - ДК, полученные путем культивации СО 14+ адгезивной фракции ПМНК доноров в присутствии ГМ-КСФ и ИЛ-4 в течение 5 суток и стимуляции в присутствии ЛПС или мышиных фибробластов С040Ь-ЗТЗ линии Получение ДК подтверждали экспрессией СБ83, и костимуляторных молекул С080, СБ86 и СБ40

Культивированные ДК больных АА - ДК, полученные путем культивации СБ 14-позитивной адгезивной фракции ПМНК больных АА а присутствии ГМ-КСФ и ИЛ-4 в течение 5 суток и стимуляции ЛПС или в присутствии мышиных С0401*-ЗТЗ фибробластов Получение ДК подтверждали экспрессией СБ83, и костимуляторных молекул СР80, СБ86 и СШО

Продукция ИЛ-10 культивированными ДК (пг/х10бДК) - концентрация ИЛ-10 в культуральной среде (5 мл), кондиционированной 106 ДК в присутствии ЛПС в течение 48 часов

Продукция ИЛ-12 культивированными ДК (пг/мя) - концентрация ИЛ-12 в культуральной среде (стандартный объем - ЗООмкл), кондиционированной 1,6х105 ДК в присутствии 2x105 С040Ь-ЗТЗ-фибробластов, экспрессирующих СВ40-лиганд в течение 48 часов Продукция ИЛ-10 лимфоцитами (пг/мл) - концентрация ИЛ-10 в культуральной среде (2мл), кондиционированной 2x106 неадгезивных клеток в присутствии ФГА или без него (48 ч)

Высокая продукция ИЛ-12 культивированными ДК (>60пг/мл) - продукция ИЛ-12 считалась высокой, если показатель концентрации ИЛ-12, превышал показатель верхней границы колебания концентрации ИЛ-12 в среде роста в культурах ДК, культивированных из ПМНК доноров н активированных СМО-лигандом, и в то же время, превышал показатель концентрации ИЛ-12 в среде роста в культурах ДК, культивированных из моноцитов больных АА в ремиссии

Низкая продукция ИЛ-12 культивированными ДК (<бОпг/мл) - концентрация ИЛ-12 меньше нижней границы или соответствующая границам колебания концентрации ИЛ-12 в среде роста в культурах ДК, культивированных из моноцитов доноров Больных с низким уровнем продукции ИЛ-12 и с уровнем, соответствующим с показателями доноров, не разделяли в связи с малочисленностью (6 больных) группы

Высокая продукция ИЛ-10 культивированными ДК (>100пг/х106ДК) - концентрация ИЛ-10, превышающая показатель верхней границы колебания концентрации ИЛ-10 в среде роста в культурах ДК, полученных из моноцитов доноров и активированных ЛПС

Нормальный уровень продукции ИЛ-10 культивированными ДК (30-100ш7х106ДК) -концентрация ИЛ-10, соответствующая границам колебания концентрации ИЛ-10 в среде роста в культурах ДК, полученных из моноцитов здоровых доноров

Низкая продукция ИЛ-10 культивированными дендритными клетками (<30/х10бДК) - концентрация ИЛ-10 вдвое меньше нижней границы колебания концентрации ИЛ-10 в среде роста в культурах ДК, полученных из моноцитов здоровых доноров

Результаты

В результате культивации большинство клеток приобретали характерную для ДК морфологию с длинными отростками Количество живых клеток, полученных из моноцитов больных АА, составило 1,25 хЮ6 (0,225-4,7х106) На основании иммунофенотипического исследования культивированных клеток, проведенного у 10 больных, выявлено, что 49% (11,89 — 75%) клеток, полученных in vitro из моноцитов больных АА, экспрессировали специфический маркер зрелых ДК - CD83 Число CD40, CD80 или CD86 экспрессирующих клеток достигало 81,8% (63,7-95%), 88,9% (12,1-97%) и 82,5% (47-94,4%), соответственно, в культурах ДК больных и существенно не отличались от показателей доноров По данным параметрам не было найдено отличий между больными тяжелой (ТАА) и нетяжелой (НАА) формами апластической анемии или зависимости от предшествующего исследованию лечения

На основании морфологических признаков и результатов иммунофенотипического исследования культивированных клеток можно утверждать, что метод культивации является эффективными для получения ДК из моноцитов больных АА

Примесь CD3+ лимфоцитов в оцениваемой популяции культивированных клеток составила 9,36% (3-38,1%). У двух больных в культуре клеток примесь CD14+ макрофагов достигала 11,6% и 20%. Следует отметить, что продукция интерлейкина-12 является исключительно функциональной особенностью АПК, лимфоциты его не выделяют. Кроме того, нами было показано, что лимфоциты больных АА даже при стимуляции ФГА не продуцируют ИЛ-10. Таким образом, содержание в культурах лимфоцитов не могло значительно повлиять на показатели ИЛ-12 и ИЛ-10 продуцирующей способности дендритных клеток, полученных in vitro.

Способность культивированных дендритных клеток больных апластической анемией к продукции ИЛ-12

Культивированные ДК больных АА стимулировали мышиными 3T3-CD40L фибробластами и в культуральной среде измеряли концентрацию ИЛ-12 (пг/мл).

Проведенный анализ данных выявил, что способность секреции ИЛ-12 культивированных ДК у 70,8% (17/24) больных АА значительно превышает способность ДК доноров (Табл. №1). Более того, разница между ИЛ-12 продуцирующей способности культивированных ДК больных и здоровых доноров имела статистически достоверный характер (р=0,02).

Таблица № 1

Уровень продукции ИЛ-12 культивированными ДК больных АА и доноров

ИЛ-12 ДК, пг/мл ДК больных АА (п=24) ДК доноров (п-7) Р значение

Среднее значение 142,5 37,8 р=0,02

Стандартная ошибка, ±ш ±41,2 ±4,5

Уже после проведения одного этапа ИСТ у 67% больных АА отмечалось снижение уровня продукции ИЛ-12 культивированными ДК. Более того, уровень продукции ИЛ-12 ДК больных АА на фоне ИСТ достоверно коррелировал (коэффициент корреляции Спирмена составил 0,79) с частотой достижения клинико-гематологического улучшения, основным критерием которого является независимость от гемотрансфузий (см. Рисунок 1).

226,2

P=0,003 КГУ-12,5% Rs=0.79

4 142,9

КГУ-91,7%

Г т 38,5 t,20'6 16,1 --)-Uvi-I---1

Высокий Низкий уровень Доноры уровень ИЛ-12 ИЛ-12

Рисунок № 1. Корреляция частоты достижения клинико-гематологического

улучшения с уровнем продукции ИЛ-12 ДК больных АА

Таким образом, частота достижения независимости от трансфузий компонентов крови не превышало 12,5% в группе больных, культивированные ДК которых на фоне ИСТ сохраняли высокую ИЛ-12 продуцирующую способность. С другой стороны, низкий уровень продукции ИЛ-12 ДК больных АА на фоне программной ИСТ ассоциировался с достижением независимости от трансфузий в 91,7% случаев.

Уровень продукции ИЛ-12 ДК больных АА в зависимости от тяжести заболевания до начала программной ИСТ - При сравнительном анализе уровня продукции ИЛ-12 ДК больных тяжелой или нетяжелой АА и культивированными ДК здоровых доноров было обнаружено, что у 73,3% больных ТАА уровень секреции ИЛ-12 превышал, а у остальных 26,7% пациентов с ТАА уровень секреции ИЛ-12 был ниже уровня продукции ИЛ-12 культивированными ДК доноров. В группе больных НАА существенных отличий не выявлено (Р=0,38): в 66,7% случаев уровень секреции ИЛ-12 оказался выше, а в 33,3% случаев - ниже показателя контрольной группы.

В результате исследования продукции ИЛ-12 культивированными ДК больных АА, и ДК доноров выявлено, что как медиана, так и среднее значение уровня продукции ИЛ-12 культивированными дендритными клетками больных НАА (154,7±43,9пг/мл, р=0,04) и ТАА (135,2±25,3пг\мл, р=0,02), достоверно превышает соответствующий показатель контрольной группы (37,8±4,5пг/мл). Следует подчеркнуть, что ДК больных тяжелой и нетяжелой формой АА по средним значениям продукции ИЛ-12 не отличались (135,2±25,3пг\мл и 154,7±43,9пг/мл, соответственно, р=0,6).

После проведения первого этапа иммуносупрессивной терапии уровень секреции ИЛ-12 культивированными ДК 45,45% больных ТАА и 33,33% больных НАА оставался высоким. Следует подчеркнуть, что число больных, ДК которых характеризовались высокой ИЛ-12 продуцирующей способностью, несколько преобладало при ТАА.

200

■с

5 150 С СЧ

^ 100

50

Рисунок 2. Продукция ИЛ-12 ДК больных ТАА или НАА и число больных, достигших клинико-гематологическое улучшение на фоне ИСТ

На фоне проводимой ИСТ медиана продукции ИЛ-12 культивированными ДК больных ТАА - 41,5пг/мл (3,14-177,96пг/мл) была сопоставима с аналогичными показателями больных НАА

226,2

177,9

КГУ-54.5% КГУ-6(1.7%

1 52,Я

•41,5 < 3.1 •41,2 А 38,4 1 16,1 3.3

ТАА НАА Доноры

- 41,16пг/мл (3,9-226,2пг/мл) и статистического отличия получено не было (р=0,74) При этом, медианы длительности программной ИСТ с момента включения в исследование были практически одинаковыми (1,5 мес -НААи2,25мес -ТАА)

Оценивали частоту достижения клинико-гематолошческого улучшения в зависимости от уровня продукции ИЛ-12 культивированными ДК Выявлено, что частота достижения клинико-гематологического улучшения к моменту второго этапа исследования в результате программной ИСТ, была несколько выше у больных НАА (66,67%), чем у больных ТАА (54,5%) (Рисунок № 2)

Уровень продукции ИЛ-12 ДК больных АА в зависимости от предшествующего лечения

- Было проведено сравнение ИЛ-12 продуцирующей способности культивированных ДК больных АА следующих подгрупп, выделенных в зависимости от этапа лечения и ответа больного на лечение 1-я подгруппа - без предшествующей терапии, 2-я подгруппа - больных рефрактерной формой заболевания после адекватной иммуносупрессивной терапии и 3-я подгруппа - после неадекватного и неэффективного лечения.

В первой подгруппе у 55,56% (5/9) больных АА уровень продукции ИЛ-12 ДК преобладал над аналогичным показателем культивированных ДК контрольной группы В 2-й и 3-й подгруппах существенно не отличалось (р=0,29) число больных, ДК которых характеризовались высоким уровнем секреции ИЛ-12 - 83,3% (5/6) и 77,78% (7/9), соответственно

Медиана значений уровня ИЛ-12 не отличалась у больных АА без предшествующего лечения и у больных рефрактерной формой АА (1-я и 2-я подгруппы медиана - 79,7 (2,12-252,6) пг/мл и 79,85 (55,16-301,4) пг/мл, р=0,41), но превышала аналогичный показатель контрольной группы (38,4 (16-52,8) пг/мл, р=0,1) В отличие от данных подгрупп, медиана уровня продукции ИЛ-12 культивированными ДК в 3-й подгруппе больных АА после неадекватной ИСТ оказалась значительно выше по сравнению с аналогичными показателями ДК здоровых доноров (220,06 (3302,7) пг/мл и 38,4 (16-52,8) пг/мл, соответственно, р=0,006)

Таким образом, показано, что после неадекватной ИСТ преобладает количество больных АА, ДК которых способны, продуцировать иммуностимуляторный цитокин - ИЛ-12 в значительно большем количестве, по сравнению с нелеченными больными АА и с больными рефрактерной АА После проведения первого ИСТ - сравнение уровня продукции ИЛ-12 культивированными ДК больных вышеописанных подгрупп не позволило выявить значительного отличия (Р=0,95) В 43% случаев в 1-й подгруппе больных АА, которым до включения в исследование (те до начала программной ИСТ) лечение не проводилось, на фоне ИСТ культивированные ДК сохраняли высокую способность к продукции ИЛ-12 В подгруппе неадекватно леченных больных (3-я подгруппа) высокий уровень продукции ИЛ-12 сохранялся в 44,4% случаев

[

В отличие от 1-й и 3-й подгрупп, ДК всех больных 2-й подгруппы, т.е. подгруппы больных рефрактерной АА, на данном этапе исследования продуцировали ИЛ-12 на низком уровне, преимущественно сопоставимом с аналогичными показателями доноров (27,32 (33,24-7,6) пг/мл; 38,35 (52,75 - 16,1) пг/мл; соответственно (р=0,19). Более того, у 100% больных данной подгруппы было получено клинико-гематологическое улучшение. При этом, медиана длительности программной ИСТ в данных подгруппах с момента включения в исследование также отличалась несущественно: 1-я подгруппа - 3 (2-6) месяца, 2-я подгруппа - 0,875 (колебания 0,75 - 1,5) месяцев, 3-я подгруппа - 2 (колебания 1-12) месяца. Однако, больные второй подгруппы до включения в исследование уже получали адекватное лечение и вероятнее всего, такая высокая клинико-гематологическая эффективность связана с большим общим объемом ИСТ у данной категории больных АА. Медиана продукции ИЛ-12 культивированными ДК больных трех подгрупп, показаны на рисунке №3.

250

200

2 150 с. сч

С 100

50 0

1-я подгруппа 2-я подгруппа 3-я подгруппа доноры

Рисунок № 3. Медиана продукции ИЛ-12 ДК больных из данных подгрупп и здоровых доноров и ответ на лечение

Выявлено, что медиана продукции ИЛ-12 ДК больных первой (60,6пг/мл) и третьей (41,5пг/мл) подгрупп на фоне программной ИСТ существенно не отличается (р=0,72). Разница между медианой ИЛ-12 продукции ДК, полученными из моноцитов больных 1-й и 3-й подгрупп, была более выражена до начала программной ИСТ - 79,7пг/мл и 220,06пг/мл, соответственно (р=0,08). Вероятнее всего, исчезновение отличия между медианами 1-й и 3-й подгрупп является результатом эффективной терапии, вследствие которой получено снижение ИЛ-12 продуцирующей способности культивированных ДК, при этом в 28,6% случаев 1-й подгруппы и у 66,7% больных 3-й подгруппы достигнуто клинико-гематологическое улучшение.

С целью определения прогностической значимости исходного '/ровня продукции ИЛ-12 культивированными ДК больных АА, сравнивали продолжительность ИСТ до достижения

226,2

174,6

КГУ- КГУ-28,6% 100% КГУ-66,7%

- 60,6

1 42,5 ♦ 27,3 3 9 1 7.6 '41,5 +38,4 I 16,1 * 1 1

клинико-гематологического улучшения и полной ремиссии в зависимости от ИЛ-12 продуцирующей способности ДК у больных АА. Выявлено, что продолжительность лечения до достижения клинико-гематологического улучшения и полной ремиссии были значительно выше у тех больных, ДК которых был свойственен высокий уровень продукции ИЛ-12 до начала ИСТ (18 и 24 месяцев, соответственно), по сравнению с больными, ДК которых продуцировали ИЛ-12 в небольшом количестве (2 и 8 месяцев, соответственно).

Получено статитически достоверное (р<0.05) отличие по продолжительности ИСТ до достижения ремиссии АА в зависимости от уровня продукции ИЛ-12 ДК больных АА в дебюте заболевания (Рисунок №4): у больных с исходно высоким уровнем продукции ИЛ-12 продолжительность терапии до достижения ремиссии составила 24-25 месяцев, а больные с исходно низким уровнем продукции ИЛ-12 ДК достигали ремиссию через 12 месяцев лечения.

Рисунок № 4. Продолжительность ИСТ до достижения ремиссии у больных АА в зависимости от ИЛ-12 продуцирующей способности ДК в дебюте заболевания: (а) низкий уровень продукции ИЛ-12, (б) низкий уровень продукции ИЛ-12

Таким образом, при выявлении высокого уровня продукции ИЛ-12 ДК больных с манифестацией АА, можно предположить, что стандартная программная ИСТ позволит достичь клинико-гематологическое улучшение только через 18 (10-24) месяцев. Поэтому, данные больные могут быть рассмотрены в качестве кандидатов на более интенсивную ИСТ.

Способность культивированных дендритных клеток больных апластической анемией к продукции ИЛ-10.

Уровень продукции ИЛ-10 культивированными ДК изучали у больных АА до начала лечения в дебюте заболевания и при рефрактерном течении АА. Выявлено, что ДК 27% (7/26) больных АА не продуцировали данный цитокин. В 34,6% (9-26) случаев уровень секреции ИЛ-10 был значительно ниже (Р=0,003), а в 15,4% (4/26) случаев - выше аналогичного показателя контрольной группы. У остальных 23% (6/26) больных АА уровень продукции ИЛ-10 не отличался

от соответствующего показателя донорской группы (9пг/х106 ДК и 4б,6пг/х106ДК, соответственно; р=0,80).

После проведения первого этапа ИСТ в 14,3% (3/22) случаев дендритные клетки больных АА не продуцировали ИЛ-10. У 23,8% (5/22) больных уровень продукции ИЛ-10 культивированными ДК был достоверно ниже (6,Зпг/х106ДК; от 0,29 до 20,5пг/х106ДК, р=0,03), а у 28,6% больных - сопоставим (55,825пг/х106ДК; от 25 до 93,54пг/хЮ6ДК, р=0,78) с аналогичным показателем доноров. У 33,3% больных АА на фоне лечения отмечается высокий (274,17пг/х 106ДК; от 103,47 до 700,63пг/х 106ДК, р=0,002) уровень продукции ИЛ-10 ДК.

Независимо от тяжести АА, выявлена корреляция между достижением клинических результатов в результате проводимой ИСТ и уровнем ИЛ-10 продуцирующей способности ДК в культурах. У всех больных АА, ДК которых в культурах продуцировали ИЛ-10 в большом количестве (медиана 274,17пг/х106ДК), отмечалось клинико-гематологическое улучшение. В тех случаях, когда культивированные ДК больных АА секретировали ИЛ-10 на уровне (55,8пг/х106ДК), сопоставимом с аналогичным показателем ДК контрольной группы, частота достижения клинико-гематологическое улучшение на фоне программной иммуносупрессивной терапии составила 66,7%. Клиническая эффективность не превышала 40% у тех больных, ДК которых сохраняли низкую ИЛ-10 продуцирующую способность (Рисунок № 5).

800

700

| 600

I 500 £

^ 400 о 300 С 200 100 0

Рисунок № 5. Уровень продукции ИЛ-10 культивированными ДК больных АА после первого этапа ИСТ и частота достижения клшшко-гсматологического улучшения

Проведенный анализ клинико-лабораторных данных больных АА подтвердил, что лучшие клинические результаты на фоне программного иммуносупрессивного лечения достигается в тех случаях, когда на фоне терапии отмечается существенное повышение уровня продукции ИЛ-10 культивированными ДК больных АА (11з=0,65).

Уровень продукции ИЛ-10 культивированными дендритными клетками в зависимости от тяжести заболевания - Анализ уровня продукции ИЛ-10 культивированными ДК больных ТАА показал, что культивированные дендритные клетки 31,25% (5/26) больных

100% -КГУ

1

40%-КТУ 66,7%-КГУ > 274,2

93,5

Низкая продукция Нормальная Высокая продукция Доноры

ИЛ-10 продукцая ИЛ-10 ИЛ-10

тяжелой АА не продуцировали ИЛ-10, а в 37,50% случаев - секретировали данный цитокин в значительно меньшем количестве по сравнению с ДК доноров У 12,5% (2/26) больных ТАА уровень секреции ИЛ-10 был выше аналогичного показателя контрольной группы Остальные 18,75% (3/26) больных ТАА не отличались от доноров по уровню секреции ИЛ-10 ДК

При нетяжелой АА культивированные ДК в 20% случаев не продуцировали ИЛ-10, в 30% -выделяли данный иммунорегуляторный цитокин в меньшем, а в 20% случаев - в большем количестве по сравнению с контрольным показателем Уровень секреции ИЛ-10 дендритными клетками 30% больных нетяжелой АА не отличался от уровня дендритных клеток здоровых доноров. Таким образом, оказалось, что в подгруппе больных нетяжелой формой заболевания несколько выше число тех больных, ДК которых сохраняли способность к продукции ИЛ-10 на уровне, равном или выше, здоровых доноров, по сравнению с больными ТАА Однако, следует отметить, что это - не значительное и статистически не достоверное (р=0,86) отличие

Сравнительный анализ способности к секреции ИЛ-10 культивированных ДК больных тяжелой или нетяжелей АА и здоровых доноров, выявил, что медиана уровней продукции ИЛ-10 ДК больных тяжелой АА и НАА значительно ниже по сравнению с контрольной группой (8,5пг/х106ДК, 17,Зпг/х106ДК и 46,6пг/х106ДК, соответственно р=0,003) При этом, больные ТАА и НАА, практически, не отличаются по данному показателю (р=0,38)

После проведения первого этапа иммуносупрессивной терапии ДК 20% больных ТАА и 9 % больных НАА не продуцировали ИЛ-10 В 18% случаев уровень продукции ИЛ-10 ДК, культивированными из моноцитов больных НАА на фоне лечения оставался низким — 4,821пг/мл (3,342-6,Зпг/мл), а у 36,5% больных НАА дендритные клетки в культурах секретировали ИЛ-10 на уровне - 55,8пг/мл (25-93,5пг/мл), сопоставимом с контрольным показателем - 46,6пг/мл (32,4-100пг/мл). Число (30%) больных ТАА с низким уровнем - 15пг/мл (0,29 - 20,6пг/мл) продукции ИЛ-10 несколько выше, чем у больных НАА (18%) Нормальный уровень - 58,6пг/мл (38,1-79,2пг/мл) продукции ИЛ-10 в культурах был свойственен ДК 20% больных ТАА

У 36,5% больных НАА и у 30% больных ТАА уровень продукции ИЛ-10 (медиана -347,42пг/мл и медиана - 175,73пг/мл, соответственно) дендритными клетками, полученными in vitro, значительно превышал уровень секреции ИЛ-10 ДК здоровых доноров

Отсутствие продукции ИЛ-10 дендритными клетками, полученными из моноцитов больных АА на фоне ИСТ, не сопровождалось достижением клинико-гематологического улучшения в ответ на терапию, независимо от тяжести заболевания И наоборот, ИЛ-10 продуцирующая способность ДК в культурах (медиана 347,42пг/х106ДК), значительно превышающая аналогичный показатель культивированных ДК доноров, в 100% случаев НАА и ТАА ассоциировалась с достижением клинико-гематологического улучшения.

Уровень продукции ИЛ-10 ДК больных АА в зависимости от предшествующего лечения - Сравнивали уровень продукции ИЛ-10 культивированных ДК больных разных подгрупп, разделенных по характеру предшествующего лечения, и ДК доноров. Показано, что во всех трех подгруппах преобладают больные АА, ДК которых не продуцировали или продуцировали ИЛ-10 на низком уровне. Статистически достоверного отличия не было (р=0,63) найдено между тремя подгруппами по количеству больных, культивированные ДК которых характеризовались низким, нормальным или высоким уровнем продукции ИЛ-10.

Медиана уровня продукции ИЛ-10 культивированными ДК составила 9,6пг/х10бДК у тех больных АА, которые не получали ИСТ (р=0,42), 13,2пг/х106ДК - у больных АА после неадекватной иммуносупрессивной терапии (р=0,58) и 7пг/х106ДК - у больных рефрактерной АА (р=0,07). Приведенные значения существенно ниже, чем аналогичные показатели (46,6пг/х106ДК) культивированных ДК доноров (Рис. № 6).

Пг/х106ДК

169

75,4 | - 146,6

1 >v* , „г . +32Д ,

300 250 200 150 100 50 0

Не леченные Больные Больные

больные АА неадекватно рефрактерной АА леченные

Доноры

Рисунок № б. Уровень продукции ИЛ-10 дендритными клетками разных подгрупп больпых апластической анемией и доноров

После первого этапа иммуносупрессивной терапии ИЛ-10 продуцирующая способность ДК, полученных in vitro, а также частота достижения клинического ответа на данном этапе ИСТ выше у больных третей подгруппы (63%) по сравнению с аналогичными показателем ДК больных первой подгруппы (43%). При этом, длительность программной терапии с момента включения в исследования не отличалась у первой и третей (медиана 2 мес) подгрупп. Выявленную разницу можно объяснить тем, что 71,4% (5/7) больных первой подгруппы был установлен диагноз ТАА, тогда как в третей подгруппе преобладали больные НАА (54,5%).

Следует обратить внимание на тот факт, что, несмотря на относительно низкий уровень продукции ИЛ-10 в культурах ДК, не превышающей показатели ДК, полученных из моноцитов доноров, у всех больных 2-й подгруппы на фоне иммуносупрессивного лечения было достигнуто

кливико-гематологическое улучшение Как уже отмечали, такая клиническая эффективность связана с большим общим объемом проведенной адекватной ИСТ у больных рефрактерной АА

С целью определения прогностической значимости исходного уровня продукции ИЛ-10 ДК больных АА сравнивали необходимый объем ИСТ до достижения клинических результатов у больных, ДК которых отличались уровнем продукции ИЛ-10 в ш vitro условиях Выявлено, что длительность ИСТ до достижения клинико-гематологического улучшения и ремиссии было значительно ниже в подгруппе больных, ДК которых был свойственен высокий уровень продукции ИЛ-10 на фоне ИСТ (3 и 8 месяцев, соответственно), по сравнению с больными, ДК которых продуцировали ИЛ-10 в небольшом количестве (12,5 и 21 месяцев, соответственно) Однако, статистический анализ этих данных достоверной зависимости длительности и необходимого объема ИСТ от исходного уровня продукции ИЛ-10 культивированными дендритными клетками больных АА не выявило

Сопоставление показателен секреции ИЛ-10 и ИЛ-12 дендритными клетками, полученными в ш vitro условиях из моноцитов периферической крови больных апдастической анемией на фойе программной иммуносупрессивной терапии

Динамическая оценка способности ДК к продукции иммунорегуляторных цитокинов ш vitro до и на фоне программной ИСТ позволил выделить следующие подгруппы больных 1 подгруппа - 4 больных, у которых вследствие проведенной терапии медиана продукции ИЛ-12 дендритными клетками незначительно снизился (с 224,09пг/мл до 126,88пг/мл), при этом ДК как до лечения, так и на фоне ИСТ не продуцировали ИЛ-10 Ни в одном случае данной подгруппы не был получен клинический ответ на адекватное лечение (Рисунок №7А), 2 подгруппа - 3 больных, у которых ИСТ вызвала существенное снижение медианы продукции ИЛ-12 (302,7пг/мл - 17,3 пг/мл) дендритными клетками в условиях in vitro Однако, секреция ИЛ-10 дендритными клетками на фоне лечения оставалась ниже аналогичного показателя культивированных ДК доноров У 66,67% больных данной подгруппы был достигнут умеренный клинический эффект показатели гемограммы увеличились, но, сохранялась зависимость от гемотрансфузий (Рисунок №7Б), 3 подгруппа - 3 больных, у которых способность ДК, полученных щ vitro, к продукции ИЛ-12 на обоих этапах исследования оставалась низкой (медиана- до лечения - Зпг/мл, на фоне ИСТ - 3,9пг/мл), но в результате программной ИСТ отмечалось существенное увеличение продукции ИЛ-10 дендритными клетками (медианы с 26пг/х106ДК до 175,73 пг/х106ДК) У всех пациентов на фоне лечения была достигнута независимость от трансфузий (Рисунок №7В), 4 подгруппа - 4 больных, у которых до начала ИСТ уровень продукции ИЛ-12 ДК (медиана 65,455пг/мл) в культурах соответствовал верхней ¡границе колебаний аналогичного показателя ДК доноров, тогда как уровень секреции ИЛ-10 ДК больных АА (медиана 3,35 Пг/х106ДК) был ниже уровня ДК

контрольной группы. На фоне лечения уровни продукции обоих иммунорегуляторных цитокинов изменились не существенно: медиана продукции ИЛ-12 ДК снизился до 29,62пг/мл, а медиана секреции ИЛ-10 в in vitro условиях повысился до 55,825 пг/х106ДК. Такая «незначительная» динамика ИЛ-12 и ИЛ-10 продуцирующей способности дендритных клеток больных четвертой подгруппы сопровождалось достижением клинико-гематологического улучшения в 100% случаев (Рисунок № 7Г).

Рисунок № 7А. Рисунок № 7Б.

-КГУ

66.67%

До лечения

На фоне лечения

До лечения

17,3 20,в

На фоне лечения

¡аил-12 вил-ю

й ИЛ-12 ■ ИЛ-10

Рисунок № 7В 200 ЕЗ 180

Рисунок № 7Г.

До лечения

На фоне лечения

До лечения На фоне лечения

0ИП-12 ■ ИЛ-10

i И ИЛ-12 ЩИЛ-10

Рисунок 7. Динамика показателей продукции ИЛ-12 и ИЛ10 дендритными клетками больных апластической анемией до лечения и на фоне иммуносупрессивной терапии

Проведенный анализ изменений способности ДК к продукции иммунорегуляторных цитокинов в условиях in vitro на фоне программной ИСТ демонстрирует глубину и разнообразие нарушений механизмов иммунорегуляции у больных АА. В основном это выражается в «иммуностимуляторном преобладании», т.е. в повышенной способности АПК, в частности, дендритных клеток, полученных из ПМНК больных АА, продуцировать иммуностимуляторный цитокин - ИЛ-12, и наоборот, в существенно ограниченной in vitro способности ДК к продукции ИЛ 10 - цитокина, способствующего подавлению нежелательного иммунного ответа. Коррекция

нарушений иммунорегуляторных механизмов и возобновление баланса между иммуностимуляторными и иммуносупрессивными механизмами, с некоторым преобладанием последнего, в результате программной иммуносупресснвной терапии может способствовать достижению благоприятных клинических результатов в ответ на адекватное лечение больных АА. Для получения более точной картины, отражающей динамику функциональных особенностей культивированных ДК, оценивали зависимость уровней продукции ИЛ-12 и ИЛ-10 дендритными клетками больных рефрактерной формой АА от длительности программной ИСТ.

Выявлена, что (Рисунок 8) несмотря на адекватную ИСТ, в течение 18 месяцев у больных рефрактерной АА сохранялся низкий уровень продукции ИЛ-10 ДК, полученными in vitro тогда, когда способность ДК к продукции ИЛ-12 колеблется от низких до высоких значений. Подобный дисбаланс иммунорегуляторных способностей дендритных клеток, полученных in vitro, отражался на клинических результатах лечения, а именно, в большинстве случаев состояние больных оставался без улучшения. С 18 до 25 месяцев ИСТ отмечалось существенное повышение ИЛ-10 продуцирующей способности ДК в культурах и уровень продукции ИЛ-12 дендритными клетками, полученными in vitro, стабильно снижалась. За данный период времени у части больных было достигнуто клинико-гематояогическое улучшение.

300 -

I

1 250

5В

g 200 -

§ 150 -х

* 100 -£ С

° 50

с;

s

О -

Рисунок № 8. Уровни продукции ИЛ-10 и ИЛ-12 ДК больных рефрактерной формой АА и эффективность ИСТ в зависимости от длительности ИСТ

После 25-26 месяцев ИСТ уровень продукции ИЛ-10 культивированными ДК больных рефрактерной АА значительно (3-4 раза) преобладал над аналогичным показателем ДК доноров, а уровень продукции ИЛ-12 соответствовал верхней границе колебаний уровня продукции ИЛ-12 культивированными ДК доноров. При этом, у данных больных наблюдалась нормализация показателей гемограммы. Таким образом, на ранних этапах ИСТ необходимо, достичь существенного снижения продукции ИЛ-12 культивированными ДК. Учитывая обратную связь

♦ -ИЛ-10 •

•ИЛ-12

21 31 36 38 39

Длительность ИСТ, месяцы

между ИЛ-12 и ИЛ-10 продуцирующими способностями ДК, снижение продукции иммуностимуляторного цитокина в результате проведенной ИСТ создает благоприятные условия для проявления иммуносупрессивных качеств ДК, в частности, для продукции ИЛ-10 Смена иммунорегуляторных свойств ДК способствует поляризации иммунного ответа, а именно, подавляется ТЫ-хелперный ответ и активируются иммуиосупрессивные субпопуляции Т-лимфоцитов Преимущество иммуносупрессивных механизмов, вероятнее всего, способствует подавлению нежелательного иммунного ответа, приводящего к аплазии кроветворения

В заключении можно отметить, что выявление высокого уровня продукции ИЛ-12 н небольшая ИЛ-10 продуцирующая способность ДК, полученных из моноцитов больных на поздних этапах ИСТ, свидетельствуют о недостаточном иммуносупрессивном эффекте проводимого лечения, что подтверждается неблагоприятным клиническим состоянием больных Выявлено, что способность к продукции ИЛ-10 дендритных клеток, полученных из периферических мононуклеаров, выше у больных АА, ответивших на ИСТ (медиана -157,64пг/х106ДК) по сравнению с аналогичными данными в подгруппе больных рефрактерной формой заболевания (медиана - 72,87пг/х106ДК) У больных АА после достижения полной ремиссии отмечается высокий уровень продукции ИЛ-10 ДК, а способность ДК к продукции ИЛ-12 соответствует верхней границе колебаний аналогичных показателей ДК здоровых доноров

Способность активированных лимфоцитов больных апластической анемией к продукции интерлейкина-10. Изучение ИЛ-10 продуцирующей способности неактивированных лимфоцитов и лимфоцитов после стимуляции ФГА до начала программной ИСТ и на фоне адекватного лечения выявило, что в отличие от доноров, лимфоциты больных АА без стимуляции не продуцировали интерлейкин-10, а стимуляция ФГА способствовала секреции данного цитокина в незначительном количестве. Более того, в результате проведения начальных этапов программной иммуносупрессивкой терапии у части больных АА отмечалось незначительное повышение уровня продукции ИЛ-10 лимфоцитами, как без стимуляции, так и после стимуляции. Разница между полученными результатами для клеток доноров и больных АА можно объяснить тем, что при апластической анемии как относительное, так и абсолютное число лимфоцитов, способных к продукции интерлейкина-10, резко снижено Отсутствие продукции ИЛ-10 ФГА стимулированными лимфоцитами больных АА, независимо от тяжести заболевания, на фоне адекватной ИСТ, ассоциируется с крайне неблагоприятным клиническим ответом на лечение

Заключение

Современная программная ИСТ позволяет достичь ремиссию заболевания у большинства больных АА Однако, длительность и объем ИСТ, необходимые дня достижения благоприятных клинических результатов, варируются с 2 до 37 месяцев и с 1 до 4 и более этапов ИСТ,

соответственно Это объясняется сложностью в разнообразием иммунорегуляторных механизмов, участвующих в патогенезе заболевания Роль антигенпрезентирующих клеток, а в частности, дендритных клеток в возникновении антиген-специфических цитотоксических Т-клеток, способных к подавлению кроветворения, остается неизученным

Изучение способности культивированных ДК, полученных из моноцитов периферической крови больных АА на разных этапах лечения, продуцировать ИЛ-12 и ИЛ-10, а также определение прогностической значимости полученных показателей стали целью данной работы

Способность культивированных ДК отвечать на стимуляцию С040-лигандом продукцией ИЛ-12 и на стимуляцию ЛПС выработкой ИЛ-10 оценивали у 30 больных апластической анемией Выявлено, что до начала программной иммуносупессивной терапии у преобладающего большинства (70,8%) больных АА способность ДК, полученных m vitro, к секреции ИЛ-12 значительно превышает аналогичный показатель ДК доноров

Повторное исследование (второй этап исследования) функциональных особенностей ДК проводили через 2 (0,75-12) месяцев адекватной ИСТ Выявлено, что проводимое лечение у 40% (6/15) больных способствовало значительному, а в 26,67% (4/15) случаев - несущественному снижению уровня секреции ИЛ-12 культивированными ДК Показана прямая зависимость частоты достижения клинико-гематологического улучшения от уровня секреции ИЛ-12 дендритными клетками на фоне ИСТ 100% больных, ДК которых была свойственна низкая продукция ИЛ-12 до лечения и на фоне проводимой ИСТ, достигли клинико-гематологического улучшения, в 66,67% (4/6) случаев значительного снижения продукции ИЛ-12 дендритными клетками на фоне ИСТ было получено клинико-гематологическое улучшение. Состояние больных с незначительным снижением уровня продукции ИЛ-12 оставалось без улучшения

Показатели ИЛ-12 продуцирующей способности ДК, полученных in vitro, существенно не отличались у больных ТАА и НАА Однако, на всех этапах ИСТ отмечалась определенная тенденция - число больных, дендритные клетки которых на фоне ИСТ продуцировали ИЛ-12 на уровне, превышающем показатели культивированных ДК здоровых доноров, было несколько выше при тяжелой апластической анемии (73,3% - до ИСТ, 45,45% - на фоне программной ИСТ), чем при НАА (66,7% - до ИСТ, 33,33% - на фоне программной ИСТ) Кроме того, число больных ТАА, достигших клинико-гематологического улучшения через 2 месяца ИСТ было несколько меньше (54,5%), по сравнению с аналогичным показателем больных НАА (66,7%) Однако, выявленные несущественные отличия между больными ТАА и НАА не позволяют рассматривать тяжесть заболевания в качестве основного фактора риска, определяющего тактику лечения

Медиана показателей продукции ИЛ-12 культивированными ДК выше у 7 из 9 неадекватно леченных больных (3-я подгруппа), по сравнению с нелеченными и адекватно леченными больными АА Поскольку, высокий уровень секреции ИЛ-12 культивированных ДК можно

рассматривать как показатель тяжести нарушений иммунорегуляторных механизмов, приводящих к развитию яппячии костного мозга, неадекватно леченные больные АА, независимо от показателей гемограммы и миелограммы, могут быть отнесены к наиболее неблагоприятной прогностической труппе

Более того, длительное наблюдение за больными выявило, что полная ремиссия достигнута только у 46,1% (6/13) больных, у которых до начала адекватной ИСТ отмечался высокий уровень продукции ИЛ-12 дендритными клетками в культурах, у двух из 13 больных клинико-гематологическое улучшение не было получено, а смертность составила 38,5% (5/13) С другой стороны, все больные, дендритные клетки которых до лечения характеризовались низкой ИЛ-12 се!фетирующей способностью, достигли полной ремиссии

Длительность ИСТ, необходимой для достижения клинико-гематологического улучшения и ремиссии было значительно выше у тех больных, ДК которых до ИСТ характеризовались высоким уровнем продукции ИЛ-12 в культурах, по сравнению с больными, ДК которых ИЛ-12 продуцировали в небольшом количестве На основании результатов изучения прогностической значимости ИЛ-12 продуцирующей способности ДК больных АА можно сделать вывод, что высокая ИЛ-12 продуцирующая способность культивированных дендритных клеток больных АА до начала адекватной ИСТ является неблагоприятным прогностическим фактором и диктует необходимость проведения более интенсивной и длительной иммуносупрессивной терапии

Способность культивированных ДК к продукции ИЛ-10 у 61,6% больных апластической анемией существенно ниже (включая 27% больных, у которых продукция ИЛ-10 отсутствовала в культурах ДК) по сравнению с дендритными клетками здоровых доноров В раде случаев высокая продукция ИЛ-10 дендритными клетками, вероятнее всего, связана с предшествующей неадекватной ИСТ

Выявлено, что адекватная иммуносупрессивная терапия в 64,8% случаев способствует повышению продукции ИЛ-10 дендритными клетками, полученными из моноцитов больных АА На фоне иммуносупрессивной терапии дендритные клетки, полученные in vitro, в 14,3% (3/22) случаев не продуцировали ИЛ-10. У 23,8% (5/22) больных уровень продукции ИЛ-10 культивированными ДК был ниже, а у 28,6% (6/22) больных - сопоставим с аналогичным показателем культивированных ДК доноров У 33,3% (7/22) больных апластической анемией на фоне лечения отмечается высокий уровень продукции ИЛ-10 дендритными клетками

Более того, выявлена прямая зависимость частоты достижения клинических результатов от уровня ИЛ-10 продуцирующей способности дендритных клеток в культурах У всех больных АА, ДК которых в культурах продуцировали ИЛ-10 в большом количестве (медиана 274,17пг/х106ДК), отмечалось клинико-гематологическое улучшение В тех случаях, когда культивированные ДК больных АА секретировали ИЛ-10 на уровне, сопоставимом с аналогичным показателем ДК

контрольной группы, частота достижения клинико-гематологического улучшения на фоне программной иммуносупрессивной терапии составила 66,7% Клиническая эффективность не превышала 40% у тех больных, ДК которых сохраняли низкую ИЛ-10 продуцирующую способность в культурах

Изучение прогностической значимости ИЛ-10 продуцирующей способности культивированных ДК выявило, что низкий уровень продукции ИЛ-10 дендритными клетками, полученными ш vitro, как до лечения, так на фоне программного ИСТ, ассоциируется с неблагоприятными клиническими результатами. Частота достижения ремиссии, отсутствия клинического эффекта и смертность составила 68,75%, 12,5% и 18,75%, соответственно, у тех больных, дендритные клетки которых до начала программной ИСТ продуцировали ИЛ-10 в небольшом количестве или на уровне сопоставимом с показателями ДК доноров

Высокий уровень продукции ИЛ-10 ДК до начала адекватной ИСТ у большинства больных обусловлен предшествующим неадекватным лечением, включающим преднизолон и/или циклоспорин-А Следовательно, высокая ИЛ-10 продуцирующая способность дендритных клеток, полученных из моноцитов больных АА до начала адекватной ИСТ, лишена прогностической значимости и поэтому, больным АА, которые получали неадекватную иммуносупрессивную терапию, оценку ИЛ-10 продуцирующей способности культивированных ДК следует проводить после первого этапа программной ИСТ

Высокий уровень секреции ИЛ-10 дендритными клетками, полученными из моноцитов периферической крови больных АА на фоне ИСТ, был выявлен у 47% (8/17) больных У всех была достигнута полная ремиссия При этом 6 больных ответили на 1 этап ИСТ, а в двух случаях были проведены два этапа ИСТ

Выявлено, что длительность лечения до достижения клинико-гематологического улучшения и ремиссии было значительно ниже в подгруппе больных, ДК которых был свойственен высокий уровень продукции ИЛ-10 на фоне ИСТ, по сравнению с больными, ДК которых продуцировали ИЛ-10 в небольшом количестве

Практические рекомендации

Настоящее исследование позволило выявить корреляцию функциональных

особенностей, в частности, способности дендритных клеток, полученных из моноцитов периферической крови больных АА, с течением и клиническими результатами программной иммуносупрессивной терапии На основании полученных результатов представляется целесообразным, в протокол обследования больных АА включить оценку продукции иммунорегуляторных цитокинов дендритными клетками, полученными in vitro

1. До начала ИСТ оценка продукции ИЛ-12 и особенно, ИЛ-10 следует проводить исключительно тем больным, которым иммуносупрессивную терапию не проводили Остальным больным изучение исследования могут выполняться после начальных этапов ИСТ

- Больным, девдритным клеткам которых до или на фоне начальных этапов ИСТ свойственны высокий уровень секреции ИЛ-10 и/или низкий уровень продукции ИЛ-12, показано выполнение стандартной программной терапии,

- Больным, дендритным клеткам которых до или на фоне начальных этапов ИСТ характерны высокий уровень секреции ИЛ-12 и низкий уровень продукции ИЛ-10, целесообразна интенсификация иммуносупрессивной терапии (проведение повторных курсов АТГ и спленэктомии в более короткие сроки, использование более высоких доз АТГ и/или ЦС-А)

2 Больным рефрактерной формой заболевания изучение функциональных способностей ДК может проводиться повторно во время плановых клинических обследований

- При выявлении прогностически неблагоприятных показателей, т е повышение уровня

продукции ИЛ-12 и наоборот, снижение ИЛ-10 продуцирующей способности ДК, следует обсудить вопрос об интенсификации лечения (повышение дозы ЦС-А, применение альтернативных методов ИСТ на более ранних сроках лечения и т д)

3. Больным в полной ремиссии заболевания определение ИЛ-12 и ИЛ-10 секретирующей способностей ДК, полученных из моноцитов, целесообразно при принятии решения об отмене иммуносупрессивной терапии

- Высокий уровень секреции ИЛ-10 (>200пг/х10б ДК) в сочетании с низким уровнем продукции ИЛ-12 (<55-60пг/мл) дендритными клетками может послужить показанием для отмены циклоспорина-А

4 Больным в состоянии полной ремиссии апластичекой анемии изучение функциональных способностей ДК может проводиться повторно в каждые 3-4 месяца во время плановых клинических обследований и при выявлении неблагоприятных изменений, т е повышения уровня продукции ИЛ-12 и снижения ИЛ-10 продуцирующей способности ДК, следует обсудить вопрос о возобновлении иммуносупрессивной терапии

Выводы:

1 Функциональные особенности дендритных клеток, полученных из моноцитов периферической крови больных апластической анемией, отличаются от аналогичных свойств культивируемых дендритных клеток здоровых доноров по способности отвечать на стимуляцию С040-лигаядом продукцией ИЛ-12 и на стимуляцию липополисахаридом

выработкой ИЛ-10 Морфологические характеристики культивированных дендритных клеток больных апластической анемией и здоровых доноров существенно не отличаются

2 Обнаружено, что у больных апластической анемией до начала программной иммуносупесснвной терапии способность культивированных дендритных клеток к секреции ИЛ-12 в 70,8% случаев достоверно повышена, а продукция ИЛ-10 в 61,6% случаев достоверно снижена по сравнению с культивированными дендритными клетками здоровых доноров

3 Программное иммуносупрессивное лечение у 66,7% больных апластической анемией способствует снижению уровня секреции ИЛ-12, а в 64,8% случаев - повышению продукции ШГ-10 культивированными дендритными клетками больных АА

4 Культивированные дендритные клетки больных в состоянии полной ремиссии апластической анемии после отмены иммуносупрессивной терапии, характеризуются низким уровнем продукции ИЛ-12, а ИЛ-10 продуцирующая способность достоверно превышает аналогичный показатель культивированных дендритных клеток здоровых доноров

5 Обнаружено, что высокая ИЛ-12 и низкая ИЛ-10 продуцирующая способность культивированных дендритных клеток больных апластической анемией до начала адекватного лечения или на ранних этапах иммуносупрессивной терапии является неблагоприятным прогностическим фактором и диктует необходимость проведения более интенсивной и длительной иммуносупрессивной терапии

6 Выявлено, что у больных рефрактерной апластической анемией снижение ИЛ-12 продуцирующей и повышение ИЛ-10 секретируклцей способности культивированных дендритных клеток отмечается через 18-26 месяцев от начала программной иммуносупрессивной терапии, что совпадает с медианой достижения полной ремиссии Данное наблюдение подтверждает необходимость проведения длительной иммуносупрессивной терапии не менее двух лет

7 В дебюте заболевания лимфоциты больных апластической анемией в отличие от лимфоцитов здоровых доноров при культивировании без стимуляции не продуцируют интерлейкин-10, а стимуляция фитогемаглютинином индуцирует секрецию данного цитокина в незначительном количестве Отсутствие продукции ИЛ-10 ФГА стимулированными лимфоцитами больных АА на фоне адекватной ИСТ ассоциируется с крайне неблагоприятным клиническим ответом на лечение

Список опубликованных работ по теме диссертации:

1 Е A Mikhailova, Е N. Ushnova, S.Z. Archuadze, A.V Kokhno, K.I Damsian, E.M Shtiiyova, IV Shitareva, SM. Kulikov, V.G. Savchenko. Program of combined Immunosuppressive therapy of adults with aplastic anemia. 8th Annual Congress of European Hematology Association, Abstract book, 2003

2 Sh Archuadze, E Sadovnikova, E.A. Mikhailova, EN Parovichmkova, VG. Savchenko Functional characteristics of dendritic cells (DC) and activated lymphocytes in aplastic anemia (AA) patients Abstract Book of the 25th Annual Congress of British Society for Immunology, 15 December, 2003, Harrogate, UK,, Abst # 13 18, p 51

3 Sh Archuadze, E Sadovnikova, E.A Mikhailova, EN Parovichmkova, VG Savchenko. Functional characteristics of dendritic cells (DC) and activated lymphocytes in aplastic anemia (AA) patients Abstract Book of the 9th Annual Congress of European Haematology Association, 10-13 June, 2004, Geneva, Switzerland,, Abst # 563, p S193

4 Михайлова E А., Саркисян Г П Арчуадае Ш.З., Булычева Т И Иммунофенотип лимфоцитов периферической крови больных апластической анемией в период иммуносупрессивной терапии Проблемы гематологии и переливания крови 2002, No 1, с 60

5 Арчуадае Ш 3., Михайлова Е А, Штырева Е М., Головкина Л Л, Вахрушева Т Л, Фадеев OA, Калинин Н Н, Савченко В Г Применение сеансов плазмафереза в период лечения апластической анемии Книга тезисов llro ежегодного конгресса Московского Общества Афереза, 2003, р 8-9

6 Михайлова Е А, Арчуадае Ш 3, Штырева Е М, Гайдамака Н В, Калинин Н Н, Савченко В Г Применение сеансов лимфоцитафереза для профилактики развития аллергической реакции во время лечения антитимоцитарным глобулином больных апластической анемией Книга тезисов 13го ежегодного конгресса Московского Общества Афереза, 2005, с 116-117

7 Арчуадае Ш.З, Михайлова Е А, Савченко В Г Иммунологические аспекты патогенеза апластической анемии Проблемы гематологии и переливания крови 2005, No 1, с 16-25

8 S Archuadze, ЕА Mikhailova, Е Sadovnikova, EN Parovichmkova, V.G Savchenko IL-12 and IL-10 production by dendritic cells (DC) from patients with aplastic anemia (AA) Haematologica / The hematology journal, Vol 91 (si), June 2006, p 455

Подписано в печать 30 10 2007 г

Формат 60/84 1x16 Бумага офсетная Печать офсетная Уел п л 1 5 Тираж 100 экз Заказ № П-634

Типография «Телер» 127299, Москва, ул Космонавта Волкова, 12 Тел (495) 937-8664, 156-4084

Актуальность проблемы

Результаты программной иммуносупрессивной терапии (ИСТ) при апластической анемии (АА), особенно, при рефрактерной форме заболевания требуют улучшения. Общепринятая, устаревшая, классификация апластической анемии, характеризует состояние гемопоэтической системы в момент установки диагноза, но не отражает глубину нарушений механизмов иммунорегуляции, приводящих к аплазии кроветворения. Следовательно, существующая классификация не позволяет выявить благоприятные или неблагоприятные факторы риска у больных апластической анемией при манифестации заболевания и разработать дифференцированный подход к иммуносупрессивному лечению конкретных больных с целью достижения оптимального ответа на терапию. Остаются неизученными вопросы, касающиеся необходимого объема и длительности иммуносупрессии в зависимости от выраженности иммунологических нарушений.

Mathe и соавт. 30 лет тому назад высказали предположение иммунологического механизма развития апластической анемии. Одним из подтверждений этой гипотезы является доказанная эффективность иммуносупрессивной терапии при АА. Кроме того, результаты изучения гипервариабельных регионов Т-клеточных рецепторов показали олигоклональность Т-клеточного ответа. В настоящее время считается доказанным, что у больных апластической анемией имеет место повышение соотношения активированных CD4+Т-хелперов I и II типа (Thl/Th2), гиперпродукция миелосупрессивных цитокинов (интерферона-у, фактора некроза опухоли-а) периферическими мононуклеарными клетками, а также дефицит иммунорегуляторных цитокинов, подавляющих продукцию миелосупрессивных цитокинов активированными Т хелперами и Т-цитотоксическими клетками I типа.

Однако, механизмы, определяющие развитие иммунной агрессии, приводящей к развитию апластической анемии, а именно, роль антигенпрезентирующих клеток остаются неизученными.

Антигенпрезентирующие клетки, в частности, дендритные клетки способны путем продукции иммуномодуляторных цитокинов - интерлейкина-10 и интерлейкина-12, определить направленность иммунного ответа. Показано, что именно дендритные клетки способствуют активации HLA-DR2 специфической Т клеточной популяции при апластической анемии. Однако, работы по функциональной характеристике АПК при АА не проводились.

В связи с вышесказанным, изучение функциональных способностей (иммунофенотипических и секреторных особенностей) Антигенпрезентирующих клеток и активированных лимфоцитов больных апластической анемией при манифестации заболевания, на разных этапах ИСТ и в период ремиссии, а также выявление факторов риска с целью разработки дифференцированного подхода к лечению и оптимизации программной иммуносупрессивной терапии представляет большой интерес.

Данные нерешенные вопросы послужили поводом для проведения настоящего исследования.

Цель исследования:

Изучить иммунофенотипические особенности, а также интерлейкин-10 и интерлейкин-12 продуцирующие способности дендритных клеток больных апластической анемией и определить прогностическую значимость функциональных свойств антигенпрезентирующих клеток и активированных лимфоцитов при апластической анемии.

Задачи исследования:

1. Изучить иммунофенотипические особенности дендритных клеток, полученных из моноцитов периферической крови больных АА до начала иммуносупрессивной терапии.

2. Оценить способность культивированных дендритных клеток к продукции интерлейкина-10 и интерлейкина-12.

3. Оценить способность активированных лимфоцитов больных апластической анемией к секреции интерлейкина-10.

4. Определить прогностическую значимость уровня продукции интерлейкина-10 и интерлейкина-12 в культурах дендритных клеток больных апластической анемией.

5. Разработать практические рекомендации по анализу функциональных особенностей дендритных клеток, полученных in vitro (частота проведения исследования, особенности культивирования дендритных клеток).

Научная новизна

В процессе исследования антигенпрезентирующих клеток, полученных из периферической крови больных АА впервые:

• Получены дендритные клетки в in vitro условиях из моноцитов периферической крови больных апластической анемией.

• Изучена экспрессия костимуляторных молекул (CD40, CD80, CD86) и специфического маркера (CD 83) зрелых ДК на поверхности культивированных дендритных клеток больных АА.

• Изучена способность культивированных дендритных клеток больных апластической анемией к продукции интерлейкина-10 и интерлейкина-12 до начала иммуносупрессивной терапии и на разных этапах лечения.

• Определена прогностическая значимость интерлейкин-10 и интерлейкин-12 продуцирующей способности дендритных клеток, полученных in vitro у больных апластической анемией.

Практическая ценность:

- Отработана методика культивирования дендритных клеток из моноцитов периферической крови больных апластической анемией, позволяющая изучить функциональные особенности культивированных дендритных клеток.

- Определены неблагоприятные факторы риска для больных апластической анемией, позволяющие разработать дифферецированный подход к терапии больных апластической анемией.

- Разработаны практические рекомендации по анализу функциональных особенностей дендритных клеток, полученных in vitro (время и частота проведения исследования), в зависимости от предшествующего неадекватного лечения или от этапа программной иммуносупрессивной терапии.

Положения, выносимые на защиту:

1. До начала программной иммуносупессивной терапии значительно повышенный уровень продукции ИЛ-12 культивируемыми дендритными клетками выявляется у 70,8% больных апластической анемией, а низкая способность культивированных дендритных клеток к продукции ИЛ-10 отмечается у 61,6% больных апластической анемией.

2. Программная иммуносупрессивная терапия у 66,7% больных апластической анемией способствует снижению уровня секреции ИЛ-12 культивированными дендритными клетками, а также повышению продукции ИЛ-10 культивированными дендритными клетками у 64,8% больных АА. Изменения функциональных особенностей дендритных клеток на фоне ИСТ коррелируют с клиническими результатами терапии.

3. Выявление высокой ИЛ-12 и низкой ИЛ-10 продуцирующей способности культивированных дендритных клеток больных апластической анемией до начала адекватного лечения или на ранних этапах терапии является показанием для более интенсивной и длительной (не менее двух лет) иммуносупрессивной терапии.

4. Отсутствие продукции интерлейкина-10 ФГА стимулированными лимфоцитами больных апластической анемией на фоне адекватной иммуносупрессивной терапии ассоциируется с крайне неблагоприятным клиническим ответом на лечение.

Выводы:

1. Функциональные особенности дендритных клеток, полученных из моноцитов периферической крови больных апластической анемией, отличаются от аналогичных свойств культивируемых дендритных клеток здоровых доноров по способности отвечать на стимуляцию СБ40-лигандом продукцией ИЛ-12 и на стимуляцию липополисахаридом выработкой ИЛ-10. Иммунофенотипичеческие характеристики культивированных дендритных клеток больных апластической анемией и здоровых доноров существенно не отличаются по экспрессии маркера зрелых дендритных клеток - CD83 и костимуляторных молекул - CD40, CD80 и CD86.

2. Обнаружено, что у больных апластической анемией до начала программной иммуносупессивной терапии способность культивированных дендритных клеток к секреции ИЛ-12 в 70,8% случаев достоверно повышена, а продукция ИЛ-10 в 61,6% случаев достоверно снижена по сравнению с культивированными дендритными клетками здоровых доноров.

3. Программное иммуносупрессивное лечение у 66,7% больных апластической анемией способствует снижению уровня секреции ИЛ-12, а в 64,8% случаев -повышению продукции ИЛ-10 культивированными дендритными клетками больных апластической анемией.

4. Культивированные дендритные клетки больных в состоянии полной ремиссии апластической анемии после отмены иммуносупрессивной терапии, характеризуются низким уровнем продукции ИЛ-12, а ИЛ-10 продуцирующая способность достоверно превышает аналогичный показатель культивированных дендритных клеток здоровых доноров.

5. Обнаружено, что высокая ИЛ-12 и низкая ИЛ-10 продуцирующая способность культивированных дендритных клеток больных апластической анемией до начала адекватного лечения или на ранних этапах иммуносупрессивной терапии является неблагоприятным прогностическим фактором и диктует необходимость проведения более интенсивной и длительной иммуносупрессивной терапии.

6. Выявлено, что у больных рефрактерной апластической анемией снижение ИЛ-12 продуцирующей и повышение ИЛ-10 секретирующей способности культивированных дендритных клеток отмечается через 18-26 месяцев от начала программной иммуносупрессивной терапии, что совпадает с медианой достижения полной ремиссии. Данное наблюдение подтверждает необходимость проведения длительной иммуносупрессивной терапии не менее двух лет.

7. В дебюте заболевания лимфоциты больных апластической анемией в отличие от лимфоцитов здоровых доноров при культивировании без стимуляции не продуцируют интерлейкин-10, а стимуляция фитогемаглютинином индуцирует секрецию данного цитокина в незначительном количестве. Отсутствие продукции ИЛ-10 ФГА стимулированными лимфоцитами больных АА на фоне адекватной ИСТ ассоциируется с крайне неблагоприятным клиническим ответом на лечение.

Заключение

Современная программная иммуносупрессивная терапия позволяет достичь частичную или полную ремиссию заболевания у большинства больных апластической анемией. Однако, длительность и объем иммуносупрессивной терапии, необходимые для достижения благоприятных клинических результатов, варируются с 2 до 37 месяцев и с 1 до 4 и более этапов ИСТ, соответственно. Это объясняется сложностью и разнообразием иммунорегуляторных механизмов, участвующих в патогенезе заболевания. Дисбаланс между Thl и Th2, а также Tel и Тс2 субпопуляциями Т-хелперов и Т-цитотоксических клеток, с преобладанием ИФН-у продуцирующих Т-эффекторов (Не Н. 2002) и гиперпродукция провоспалительных и миелосупрессивных цитокинов - ИФН-у, ФНО-а, ИЛ-8 (Zhang Т. 2000; Tripathy NK. 2005; Young 2002) считаются непосредственной причиной, приводящей к аплазии кроветворения. Известно, что дендритные клетки путем продукции иммуностимуляторного цитокина -ИЛ-12 и иммуносупрессивного цитокина - ИЛ-10 способны регулировать поляризацию Т-хелперов и тем самым, определяют Thl или Th2 направленность антиген-специфического иммунного ответа (Xia C.Q. 2003). Однако, роль антиген-презентирующих клеток, а в частности, дендритных клеток в возникновении антиген-специфических цитотоксических Т-клеток, способных к подавлению кроветворения, остается неизученным. Лучшее понимание патогенеза апластической анемии и определение факторов риска, позволит разработать дифференциальный подход к лечению больных апластической анемией.

Изучение функциональных особенностей антиген-презентирующих клеток, а именно способности культивированных дендритных клеток, полученных из моноцитов периферической крови больных АА на разных этапах лечения, экспрессировать костимуляторные молекулы и продуцировать ИЛ-10 и ИЛ-12 под воздействием ростовых факторов и индукторов созревания, а таюке определение прогностической значимости полученных показателей стали целью данной работы.

В исследовании были использованы методы клеточных культур и проточной цитометрии, а таюке иммуноферментный анализ.

Следует подчеркнуть, что в мире не проводилось культивирование и изучение функциональных особенностей дендритных клеток, полученных из моноцитов периферической крови больных АА. Отсутствие таких исследований частично объясняется сложностью получения адекватного количества предшественников дендритных клеток у больных апластической анемией, особенно, в дебюте заболевания и на начальных этапах лечения. Данная проблема в настоящем исследовании была решена путем выполнения сеансов лейкафереза в режиме лечебного или диагностического лимфоцитафереза, которые позволяли получить 10,1-114,85х 108

8 8 8 (медиана - 18,75x10 ) и 0,75-12,5x10° (2,2x10°), соответственно, периферических мононуклеарных клеток с достаточным для исследовательских целей содержанием моноцитарных предшественников ДК.

В состоянии частичной или полной ремиссии у больных забирали 40-50мл периферической крови и выделяли 4,07х107 (1,56-18,75х107) ПМНК.

Дендритные клетки получали культивированием из моноцитов периферической крови больных АА в присутствии ростовых факторов в течение пяти суток. Моноциты получали путем адгезии на пластике фракции периферических мононуклеаров, выделенной на градиенте плотности фикола. Повторные контрольные исследования показали, что 90-95% адгезивных клеток были представлены CD 14+ моноцитами, а 93% неприкрепленных клеток представляли собой лимфоциты, экспрессирующие CD3.

Полученные таким образом клетки обладали характеристиками незрелых дендритных клеток. Их подвергали созреванию в присутствии наиболее хорошо изученных факторов - липополисахарида и С040-лиганда. Липополисахарид, рецепторы которого экспрессируются на поверхности активированных дендритных клеток, макрофагов и активированных В-лимфоцитов, индуцирует экспрессию костимуляторных молекул на поверхности дендритных клеток и продукцию иммунорегуляторных цитокинов, в том числе, интерлейкина-10.

СБ40-лиганд является наиболее эффективным стимулятором экспрессии CD80 и CD86 костимуляторных молекул на дендритных клетках и длительная активация СБ40-лигандом (не менее, чем в течение 12 часов) способствует секреции ИЛ-12р70. Для индукции созревания культивированных ДК С040-лигандом использовали клетки линии мышиных фибробластов CD40L-3T3, которые представляют собой мышиные фибробласты ЗТЗ, трансфецированные геном С040-лиганда человека и геном резистентности к G418. Повторная контрольная оценка экспрессии С040-лиганда на поверхности культивированных клеток линии мышиных фибробластов CD40L-3T3, подтвердило, что более 90-92% CD40L-3T3 фибробластов экспрессировали CD40-лиганд.

Количество живых клеток, полученных из моноцитов больных АА, составило 1,25 хЮ6 (колебания - 0,225-4,7 хЮ6) клеток. В результате культивации большинство клеток приобретали характерную для дендритных клеток морфологию с длинными отростками. Иммунофенотипическое исследование культивированных клеток проводилось у 10 больных и выявлено, что 49% (11,89 - 75%) клеток, полученных in vitro из моноцитов больных апластической анемией, экспрессировали специфический маркер зрелых ДК - CD83. Число CD40, CD80 или CD86 экспрессирующих клеток достигало 81,8% (63,7-95%), 88,9% (12,1-97%) и 82,5% (47-94,4%), соответственно, в культурах ДК больных и существенно не отличались от показателей здоровых доноров. Более того, по данным параметрам не было найдено отличий между больными тяжелой и нетяжелой формами апластической анемии или зависимости от предшествующего исследованию лечения.

На основании морфологических признаков и результатов исследования иммунофенотипических особенностей культивированных клеток можно утверждать, что используемые in vitro условия и метод культивации являются эффективными для получения дендритных клеток из моноцитов больных апластической анемией.

Примесь CD3+ лимфоцитов в оцениваемой популяции культивированных клеток составила 9,36% (3-38,1%). У двух больных в культуре клеток примесь CD14+ макрофагов достигала 11,6% и 20%. Следует отметить, что продукция интерлейкина-12 является исключительно функциональной особенностью антиген-презентирующих клеток, лимфоциты его не выделяют. Кроме того, нами было показано, что лимфоциты больных АА даже при стимуляции фитогемаглютинином не продуцируют интерлейкин-10. Таким образом, содержание в культурах лимфоцитов не могло значительно повлиять на показатели ИЛ-12 и ИЛ-10 продуцирующей способности дендритных клеток, полученных in vitro.

Способность культивированных ДК отвечать на стимуляцию СЭ40-лигандом продукцией ИЛ-12 и на стимуляцию липополисахаридом выработкой ИЛ-10 оценивали у 30 больных апластической анемией. 10 больных до включения в исследование не получали лечения. Шести больным ранее проводилась программная иммуносупрессивная терапия и остальным 14 больным - неадекватное иммуносупрессивное лечение.

Иммуносупрессивные препараты оказывают влияние на функциональные свойства антигенпрезентирующих клеток, подавляя их созревание и продукцию провоспалительных цитокинов, включая интерлейкин-12, а также повышают секрецию иммуносупрессивного цитокина - интерлейкина-10. Следовательно, вопрос предшествующей терапии представлялся крайне важным, так как она могла повлиять на результаты изучения ИЛ-12 и ИЛ-10 продуцирующей способности культивированных дендритных клеток больных апластической анемией. По данным in vivo исследований, уже через 4 часа после приема глюкокортикостероидов в плазме отмечается повышение уровня ИЛ-10 (Mozo L. 2003). In vitro изучение влияния глюкокортикоидов на экспрессию костимуляторных молекул и на продукцию интерлейкина-10 дендритными клетками, культивированными в присутствии дексаметазона из моноцитов здоровых доноров, показал, что дендритные клетки в течение 5 дней после удаления дексаметазона из культуральной среды сохраняли низкий уровень продукции ИЛ-12 и высокую ИЛ-10 продуцирующую способность (Xia С. 2005). Поэтому, больных, которые по месту жительства получали гормональную терапию, включали в исследование через 7-10 дней после её отмены. Так как иммуносупрессивный эффект циклоспорина-А прослеживается длительно после прекращения терапии, ЦС-А не отменяли больным до проведения сеанса лейкафереза. Однако, результаты изучения функциональных особенностей дендритных клеток, полученных in vitro, анализировали в зависимости от предшествующей терапии (1-я подгруппа - нелеченные больные, 2-я подгруппа - адекватно леченные и 3-я подгруппа неадекватно леченные больные АА).

В исследование были включены 18 больных тяжелой формой апластической анемией и 12 больных нетяжелой формой заболевания. Хотелось бы отметить, что тяжесть заболевания, определяемая по существующей классификации, не всегда отражает особенности течения и прогноз заболевания. Поэтому, представлялось важным, анализировать способность культивированных дендритных клеток к продукции иммунорегуляторных цитокинов в зависимости от тяжести заболевания.

Таким образом, разделить больных по четким группам не представлялось возможным. Это потребовало дифференцированного подхода к оценке результатов на каждом этапе исследования, и особую обработку данных.

Выявлено, что до начала программной иммуносупессивной терапии у преобладающего большинства (70,8%) больных апластической анемией способность дендритных клеток, полученных in vitro, к секреции ИЛ-12 значительно превышает аналогичный показатель ДК здоровых доноров.

Медиана показателей продукции ИЛ-12 культивированными дендритными клетками выше у неадекватно леченных больных (3-я подгруппа), по сравнению с нелеченными и адекватно леченными больными АА. Кроме того, сопоставление результатов изучения функциональных особенностей ДК с давностью заболевания показало, что уровень секреции ИЛ-12 дендритными клетками, культивированными из моноцитов нелеченных больных ТАА, выше при давности заболевания более 3-4 месяцев, чем у тех больных ТАА, длительность анамнеза которых не превышала 1-3 месяца. Вероятнее всего длительный анамнез заболевания и отсроченное начало адекватной иммуносупрессивной терапии могут способствовать повышенной способности антигенпрезентирующих клеток продуцировать ИЛ-12, что может влиять на поляризацию Т-хелперного иммунного ответа и активацию других механизмов, приводящих к аплазии кроветворения.

Данное соображение подтверждается клиническими результатами программной иммуносупрессивной терапии. Через 26 (9-39) месяцев ИСТ клинические результаты были несколько хуже у больных, которым до начала адекватной программной ИСТ проводилось неадекватное леченние (3-я подгруппа), несмотря на то, что показатели ИЛ-12 продуцирующей способности ДК в культурах не отличались у больных разных подгрупп (1-я подгруппа - 53,19пг/мл, 2-я подгруппа - 61,55пг/мл, 3-я подгруппа -56,6пг/мл). Таким образом, своевременное (в течение 1-2 месяцев с момента манифестации заболевания) начало адекватной иммуносупрессивной терапии, способствует получению более благоприятного клинического ответа на лечение.

Повторное исследование (второй этап исследования) функциональных особенностей дендритных клеток проводили через 2 (0,75-12) месяца адекватной ИСТ. Выявлено, что проводимое лечение у 40% (6/15) больных способствовало значительному, а в 26,7% (4/15) случаев - несущественному снижению уровня секреции ИЛ-12 культивированными дендритными клетками. У 33,3% (5/15) больных данный показатель оставался на прежнем низком (17пг/мл до лечения, 26пг/мл на фоне лечения) уровне. Показана прямая зависимость частоты достижения клинико-гематологического улучшения у больных АА от уровня секреции ИЛ-12 культивированными дендритными клетками на фоне ИСТ: 100% больных, ДК которых была свойственна низкая продукция ИЛ-12 как до лечения, так и на фоне проводимой иммуносупрессивной терапии, достигли клинико-гематологического улучшения; в 66,7% (4/6) случаев значительного снижения продукции ИЛ-12 дендритными клетками на фоне ИСТ было получено клинико-гематологическое улучшение. Состояние больных с незначительным снижением уровня продукции ИЛ-12 оставалось без улучшения.

Более того, длительное наблюдение (36 (6-50) месяцев) за больными выявило, что полная ремиссия достигнута у 46,1% (6/13) тех больных, у которых до начала адекватной ИСТ отмечался высокий уровень продукции ИЛ-12 дендритными клетками в культурах; у двух больных клинико-гематологическое улучшение не было получено, а смертность составила 38,5% (5/13). С другой стороны, все больные, дендритные клетки которых до лечения характеризовались низкой ИЛ-12 секретирующей способностью, достигли полной ремиссии.

Длительность иммуносупрессивной терапии, необходимой для достижения КГУ и полной ремиссии была значительно выше у тех больных, дендритные клетки которых до ИСТ характеризовались высоким уровнем продукции ИЛ-12 (18 и 24 месяцев, соответственно) в культурах, по сравнению с больными, ДК которых ИЛ-12 продуцировали в небольшом количестве (2 и 8 месяцев, соответственно).

Способность культивированных дендритных клеток к продукции ИЛ-10 у 61,6% больных апластической анемией существенно ниже (включая 27% больных, у которых продукция ИЛ-10 отсутствовала в культурах ДК) по сравнению с дендритными клетками здоровых доноров. В ряде случаев наблюдалась высокая продукция ИЛ-10 дендритными клетками. Вероятнее всего, это связано с предшествующей неадекватной иммуносупрессивной терапией.

Выявлено, что адекватная иммуносупрессивная терапия в 64,8% случаев сопровождается повышением продукции ИЛ-10 дендритными клетками, полученными из моноцитов больных АА. На фоне иммуносупрессивной терапии дендритные клетки, полученные in vitro, в 14,3% (3/22) случаев не продуцировали интерлейкин-10. У 23,8% (5/22) больных уровень продукции ИЛ-10 культивированными ДК был ниже, а у 28,6% (6/22) больных — сопоставим с аналогичным показателем культивированных ДК доноров. У 33,3% (7/22) больных апластической анемией на фоне лечения отмечается высокий уровень продукции ИЛ-10 дендритными клетками.

Более того, выявлена корреляция частоты достижения клинических результатов с уровнем ИЛ-10 продуцирующей способности культивированных дендритных клеток больных АА на фоне лечения. У всех больных АА, ДК которых в культурах продуцировали ИЛ-10 в большом количестве (медиана 274,2пг/х106ДК), отмечалось клинико-гематологическое улучшение. В тех случаях, когда культивированные ДК больных АА секретировали ИЛ-10 на уровне, сопоставимом с аналогичным показателем ДК контрольной группы, частота достижения КГУ на фоне программной иммуносупрессивной терапии составила 66,7%. Клиническая эффективность не превышала 40% у тех больных, ДК которых сохраняли низкую ИЛ-10 продуцирующую способность в культурах.

Изучение прогностической значимости ИЛ-10 продуцирующей способности культивированных дендритных клеток выявило, что низкий уровень продукции ИЛ-10 дендритными клетками, полученными in vitro, как до адекватного лечения, так на фоне программной ИСТ, ассоциируется с неблагоприятными клиническими результатами. Частота достижения полной ремиссии, отсутствия клинического эффекта и смертность составила 68,75%, 12,5% и 18,75%, соответственно, у тех больных, дендритные клетки которых до начала программной ИСТ продуцировали ИЛ-10 в небольшом количестве или на уровне сопоставимом с показателями ДК доноров.

Высокий уровень продукции ИЛ-10 ДК до начала адекватной иммуносупрессивной терапии у большинства больных вероятно, может быть обусловлен предшествующим неадекватным лечением, включающим преднизолон и/или циклоспорин-А. Следовательно, высокая ИЛ-10 продуцирующая способность дендритных клеток, полученных из моноцитов больных апластической анемией до начала адекватной ИСТ, лишена прогностической значимости и поэтому, больным АА, которые получали неадекватную иммуносупрессивную терапшо, оценку ИЛ-10 продуцирующей способности культивированных ДК следует проводить после первого этапа программной иммуносупрессивной терапии.

Высокий уровень секреции ИЛ-10 дендритными клетками, полученными из моноцитов периферической крови больных АА на фоне ИСТ, был выявлен у 47% (8/17) больных. У всех из них была достигнута полная ремиссия. При этом 6 больных ответили на 1 этап ИСТ, а в двух случаях были проведены два этапа ИСТ.

Выявлено, что длительность иммуносупрессивной терапии до достижения клинико-гематологического улучшения и полной ремиссии было значительно меньше в подгруппе больных, дендритным клеткам которых был свойственен высокий уровень продукции ИЛ-10 на фоне ИСТ (3 и 8 месяцев, соответственно), по сравнению с больными, ДК которых продуцировали ИЛ-10 в небольшом количестве (12,5 и 21 месяцев, соответственно).

На основании этих результатов можно утверждать, что уровень продукции ИЛ-12 и ИЛ-10 дендритными клетками, полученными из моноцитов больных апластической анемией, имеет прогностическую значимость - позволяет при манифестации заболевания определить вероятность достижения клинических результатов и объем необходимой иммуносупрессивной терапии, а также разработать оптимальную схему терапии.

Показатели ИЛ-12 и ИЛ-10 продуцирующей способности дендритных клеток, полученных in vitro, существенно не отличались у больных тяжелой и нетяжелой формой заболевания. Следует отметить, что на всех этапах ИСТ отмечалась определенная тенденция - число больных, дендритные клетки которых на фоне ИСТ продуцировали ИЛ-12 на уровне, превышающем показатели культивированных ДК здоровых доноров, было несколько выше при тяжелой апластической анемии (73,3% -до ИСТ; 45,45% - на фоне программной ИСТ), чем при НАА (66,7% - до ИСТ; 33,33% -на фоне программной ИСТ). Кроме того, число больных ТАА, достигших клинико-гематологическое улучшение через 2 месяца ИСТ было несколько меньше (54,5%), по сравнению с аналогичным показателем больных НАА (66,7%). Однако, выявленные несущественные отличия между больными ТАА и НАА не позволяют рассматривать тяжесть заболевания в качестве фактора риска и разработать дифференцированный подход к лечению.

Изучение клинических результатов, а также ИЛ-12 и ИЛ-10 продуцирующих способностей культивированных дендритных клеток больных рефрактерной АА в зависимости от длительности программного иммуносупрессивного лечения выявило, что в течение 18 месяцев у больных рефрактерной апластической анемией сохраняется низкий уровень продукции ИЛ-10 ДК, полученными in vitro, тогда когда способность ДК к продукции ИЛ-12 колеблется от низких до высоких значений. За данный период в большинстве случаев состояние больных остается без улучшения. С 18 до 25 месяцев иммуносупрессивной терапии отмечается повышение ИЛ-10 продуцирующей способности ДК в культурах, а продукция ИЛ-12 дендритными клетками, стимулированными С040-лигандом, стабильно снижается до уровня, соответствующего верхней границе колебаний уровня продукции ИЛ-12 культивированными ДК здоровых доноров. На данном этапе лечения у больных рефрактерной АА достигается клинико-гематологическое улучшение. После 25-26 месяцев ИСТ уровень продукции ИЛ-10 культивированными ДК больных рефрактерной АА значительно (в 3-4 раза) преобладает над аналогичным показателем ДК доноров. У данных больных наблюдается нормализация показателей гемограммы. Представляется важным подчеркнуть, что подобный комплексный анализ клинико-лабораторных данных больных рефрактерной апластической анемией позволил, выявить, что время достижения благоприятных клинических результатов совпадает с моментом снижения иммуностимуляторной способности дендритных клеток и повышения иммуносупрессивной способности ДК в культурах.

У 66,7% больных в состоянии полной ремиссии апластической анемии после отмены иммуносупрессивной терапии ДК характеризовались низким уровнем продукции ИЛ-12 и высокой ИЛ-10 продуцирующей способностью. Показатели остальных больных АА в состоянии полной ремиссии несколько отличались, а именно, уровень продукции ИЛ-12 культивированными дендритными клетками одного больного превышал уровень продукции ИЛ-12 ДК контрольной группы, тогда как ДК данного больного не продуцировали ИЛ-10 в in vitro условиях. Через 4 месяца у больного развился рецидив заболевания. Способность к продукции ИЛ-10 культивированными ДК двух больных соответствовал или был ниже контрольного уровня. При обследовании у данных больных была выявлена реактивация вирусной инфекции.

На примере этих клинических случаев показано, что повышение уровня продукции ИЛ-12 ДК в сочетании со значительным снижением секреции ИЛ-10 дендритными клетками у больных апластической анемией в полной ремиссии может предшествовать развитию рецидива заболевания и требует более тщательного наблюдения за больным. Данное наблюдение требует дальнейшего изучения и подтверждения в более многочисленной группе больных.

Изучение ИЛ-10 продуцирующей способности неактивированных лимфоцитов и лимфоцитов после стимуляции ФГА до начала программной ИСТ и на фоне адекватного лечения выявило, что в отличие от доноров, лимфоциты больных апластической анемией без стимуляции не продуцировали ИЛ-10, а стимуляция фитогемаглютинином способствовала секреции данного цитокина в незначительном количестве. Более того, в результате проведения начальных этапов программной иммуносупрессивной терапии у части больных АА отмечалось незначительное повышение уровня продукции ИЛ-10 лимфоцитами, как без стимуляции, так и после стимуляции. Разницу между полученными результатами для клеток доноров и больных АА можно объяснить тем, что при апластической анемии как относительное, так и абсолютное число лимфоцитов, способных к продукции интерлейкина-10, резко снижено. Отсутствие продукции ИЛ-10 ФГА стимулированными лимфоцитами больных АА, независимо от тяжести заболевания, на фоне адекватной ИСТ, ассоциируется с крайне неблагоприятным клиническим ответом на лечение.

В заключении важно, подчеркнуть, что проведенное исследование функциональных особенностей культивированных дендритных клеток позволило, выявить несколько закономерностей по ИЛ-10 и ИЛ-12 продуцирующим способностям ДК, полученных из периферических мононуклеаров больных АА и стимулированных липополисахаридом или С040-лигандом, соответственно, и по динамике данных показателей на фоне программной иммуносупрессивной терапии, а также способствовало определению прогностической значимости полученных результатов.