Автореферат и диссертация по медицине (14.01.01) на тему:Функциональное состояние клеток с цитотоксической активностью у женщин с наружным генитальным эндометриозом

На правах рукописи

АЛЕКСИНСКАЯ ЕВГЕНИЯ СЕРГЕЕВНА

ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ КЛЕТОК С ЦИТОТОКСИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ У ЖЕНЩИН С НАРУЖНЫМ ГЕН ШАЛЬНЫМ ЭНДОМЕТРИОЗОМ

14.01.01 - акушерство и гинекология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 8 НОЯ 2013

Иваново 2013

У

005541313

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учрежден! «Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства имени В. Городкова» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор ГБОУ ВПО «Нижегородская государственная медицинская академия» Минздрава России

доктор медицинских паук, профессор ГБУЗ МО "Московский областной научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии"

Посисеева Любовь Валентиновна Назаров Сергей Борисович

Качалина Татьяна Симоновна, Попов Александр Анатольевич,

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высше профессионального образования «Московский государственный медико-стоматологическ университет имени А. И. Евдокимова» Министерства здравоохранения Российск Федерации.

Защита диссертации состоится «__» декабря 2013 года в «_» часов

заседании диссертационного совета Д208.028.01 при Федеральном государственн бюджетном учреждении «Ивановский научно-исследовательский институт материнства детства имени В.Н. Городкова» Министерства здравоохранения Российской Федерации I адресу: 153045, Россия, г. Иваново, ул. Победы, 20.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Ив НИИ М и имени В.Н. Городкова» Минздрава России.

Автореферат разослан « » ноября 2013 года.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор медицинских наук И. А. Панова

Актуальность исследования

В структуре гинекологической патологии эндометриоз занимает 3-е место после воспалительных заболеваний и миомы матки, однако до настоящего времени нет чёткого понимания этиологии и патофизиологии данпого заболевания. Согласно последним данным, во всём мире эпдометриозом страдает каждая десятая женщина репродуктивного возраста (Адамян JI.B., 2013; Линде В. А., 2012; Качалина Т.С., 2010; Giudice L.C., 2010).

Эндометриоз, характеризующийся эктопическим ростом эпдометриальной ткани вне мест ее нормального расположения, часто сравнивают с доброкачественной опухолью (Bernadete Trovó de Marqui А., 2012; Ярмолинская М. И., 2007). Определение роли иммунных нарушений в патогенетических механизмах развития эндометриоза приобретает особое значение, поскольку поддержание тканевого гомеостаза и противоопухолевая защота в организме реализуются через иммунную систему (Ярилин А. А., 2006). Существует мнение, что развитие эндометриоза непосредственно ассоциировано с угнетением активности реакций клеточной цитотоксичности (Анциферова Ю.С., 2007; Gazvani R., 2002). Особый интерес представляет уникальная популяция ЕК-Т клеток, экспрессирующих TCRy5 рецептор. Изучение механизмов реализации цитотоксического ответа у5Т-лимфоцитами показало, что при активации TCR5y+ лимфоциты приобретают фенотип CD16+ и способность к быстрому высвобождению провоспалительных цитокинов, например TNFa. Активированные TCR5y+ лимфоциты способны к эффективной деструкции клеток-мишеней, что определяет их важную роль в развитии противоопухолевого иммунного ответа (Нижегородова Д. Б., 2009; Rincon-Orozco В., 2005). Доказано, что в периферической крови женщин с эндометриозом увеличивается содержание этой популяции Т-лимфоцитов (Малышкина А.И., Шаалали Ю.С., 2010). Однако роль TCRy8+ лимфоцитов в патогенезе эндометриоза во многом не ясна. В литературе отсутствуют данные об

уровне активации этой уникальной популяции Т-лимфоцитов при наружном эндометриозе.

Изучение патогенеза наружного эндометриоза у человека имеет ря ограничений. Так, у женщины сложно проследить самые первые этапь образования эктопического эндометрия. К тому же, нежелательно проведени повторных лапароскопических исследований у пациентки для наблюдений з динамикой очагов эвдометриоза в перитонеальной полости. Поэтому новы возможности изучения этого заболевания открываются при использовани моделей у животных (Шарабанова И.Ю., 2002).

За рубежом и в нашей стране хирургический метод лечения генитальног эвдометриоза был и остается единственным, позволяющим удалит морфологический субстрат эвдометриоза (Попов А.А., 2011). Однако д настоящего времени ни одна из предложенных стратегий лечения эндометриоза н привела к полному его излечению и не позволила избежать рецидивов, чт обусловлено множественными полисистемными нарушениями, лежащими в основ его этиопатогенеза (Л. В. Адамян, Е. Н. Андреева, 2013). Иммунна патофизиология эндометриоза предполагает эффективность иммунологическог подхода к лечению этого заболевания (Ярмолинская М. И., 2007).

Таким образом, определение функционального состояния клеток цитотокснческой активностью у женщин с наружным эндометриозом являете актуальной проблемой гинекологии.

Цель исследования:

Установить новые механизмы развития паружного эндометриоза н основании оценки функционального состояния клеток с цитотоксическо" активностью на системном и локальном уровнях для разработки новых критериев диагностики данного заболевания у женщин и обоснования использования иммуномодулирующей терапии.

Задачи исследования:

1. Дать характеристику соматического и репродуктивного здоровья женщин с наружным эндометриозом.

2. Установить особенности изменения содержания и функционального состояния клеток с цитотоксической активностью (СБ 16+, СБЗ+СВ1б+, ТС11у5+ лимфоцитов) на системном и локальном уровнях у женщин с наружным эндометриозом.

3. В экспериментальной модели эндометриоза на лабораторных животных определить содержание и функциональное состояние перитонеальных ТСКу5+ лимфоцитов и оценить эффективность использования иммуномодулирующей терапии по показателям их репродуктивной функции.

4. Разработать новые критерии диагностики наружного эндометриоза у женщин.

Научная новизна исследования

Впервые установлено, что развитие наружного генитального эндометриоза связано с усилением внутриклеточной продукции ЮТсН- в популяции СБ 16+ лимфоцитов, в общей популяции лимфоцитов в периферической крови и в перитонеалыюй жидкости, снижением перитонеальных СБЗ+ лимфоцитов, а в эутопическом и эктопическом эндометрии - СБ 16+ клеток и СБЗ+СБ16+ лимфоцитов, увеличением в периферической крови, перитонеальной жидкости и эктопических очагах эндометриоза уровня ТСЯу5+ лимфоцитов и функционально активных ТС11у5+ТЫЕа+ лимфоцитов, снижением в пуле ТС11у5+ лимфоцитов на локальном уровне количества функционально активных ТСЫу5+СБ16+ и дабл-позитивных ТСКу5+СБ16+'ШРа+ клеток, уменьшением уровня ТС11у5+ТМРа+ лимфоцитов в эутопическом и эктопическом эндометрии.

Впервые установлено, что на ра1ших этапах роста эктопического очага экспериментального эндометриоза в перитонеальной полости крыс отмечается увеличение содержания ТСЯу5+ меток, а также высоко активной популяции ТС11у5+'ШРа+ лимфоцитов.

Практическая значимость исследования

Разработаны новые диагностические критерии наружного эндометриоза _ женщин, связанные с определением в периферической крови - ТИРа СБ 16+ СБ 16+, ТОРа+ ТСКу5+, ТСКу8+, Т№а+ лимфоцитов.

Положения, выносимые иа защиту

Развитие наружного гепитального эндометриоза у женщин связано увеличением общего содержания и функциональной активности клеток обладающих цитотоксическим потенциалом, в периферической крови и перитонеальной жидкости, и снижением функциональной активности ЕК-Т клето непосредственно в пуле ТС11у5+ лимфоцитов в перитонеальной жидкости, эутопическом и эктопическом эндометрии женщин.

На ранних этапах роста эктопического очага экспериментальног эндометриоза в перитонеальной полости крыс отмечается увеличение общег содержания и функциональной активности у5-Т лимфоцитов.

Апробация работы

Основные результаты исследований но теме диссертации докладывалис и обсуждались на: итоговой конференции научного общества студентов молодых ученых «Неделя науки - 2007», Иваново, 2007; конференции молоды ученых, посвященной 75-летию со дня рождения В.Н. Городкова, Иваново, 2007 научно-практической конференции «Неделя науки-2009», Иваново, 2009; научно практической конференции «Неделя науки-2010», Иваново, 2010; 92-ой ежегодно" итоговой научно-практической конференции студентов и молодых учень «Неделя науки - 2012», посвященной 110-летию профессора С.Д. Носова (ИГМА), Иваново, 2012; V Всероссийской конференции «Иммунология репродукции. Теоретические и клинические аспекты», Иваново, 2012; конференции молодых ученых, Иваново, 2012; конференции молодых ученых, Иваново, 2013; 93-ей ежегодной научной конференции студентов и молодых ученых с международным

участием «Неделя науки - 2013», Иваново, 2013; XIV Всероссийском научном форуме «Мать и дитя», Москва, 2013.

Внедрение результатов в практику

Разработанные дополнительные критерии диагностики наружного эндометриоза прошли предрегистрационное испытание в клинико-диагностической поликлинике Федерального государственного бюджетного учреждения "Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства имени В.Н. Городкова" Министерства здравоохранения РФ.

Личное участие автора

Самостоятельно проводились отбор пациенток в группы, согласно критериям включения и исключения, обследование и лечение пациенток. Принимала участие в проведении иммупологических исследований и постаповке эксперимента. Была проведена систематизация, статистическая обработка, анализ и описание полученных результатов.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ, из них 4 - в журналах и изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Объём и структура диссертации

Диссертация изложена на 147 страницах машинописного текста, содержит введение, обзор литературы, 4 главы собственных исследований, обсуждение полученных результатов, выводы и практические рекомендации. Библиографический указатель включает 207 источников, в том числе 78 отечественных и 129 иностранных источников. Работа иллюстрирована 36 таблицами и 16 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Клиническая часть работы выполнена на базе Федерального бюджетного государственного учреждения «Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства имени В.Н.Городкова» Министерства здравоохранения

Российской Федерации (директор д.м.н. А.И.Малышкина). Исследования проводились в гинекологической клинике (эндоскопическом отделении — зав. к.м.н. В.Н. Романов), в лаборатории клинической иммунологии (зав. д.м.н. проф. Н.Ю. Сотникова).

Всего было обследовано 87 женщин. Основную группу составили 55 женщин с наружным эндометриозом. Контрольную группу составили 32 женщины, у которых при лапароскопии не было выявлено наружного эндометриоза. Этим женщинам проводилась лапароскопия с целью хирургической стерилизации (п=28), по социальным показаниям согласно федеральному закону «Об основах охраны здоровья граждан в Российской Федерации» от 21 ноября 2011 года, № 323-ф3. Также в эту группу вошли пациентки с бесплодием в браке (п=4), которым при лапароскопии был исключен диагноз наружный эндометриоз и хронический сальпингит (мужской фактор бесплодия, послеоперационный спаечный процесс). На каждую пациентку заполнялась специально разработанная «индивидуальная карта обследования», в которую вносились данные анамнеза, результаты обследования из истории болезни. Обследование женщин проводилось однократно при поступлении в клинику.

Материалом для исследования служили: периферическая венозная кровь, перитонеальная жидкость, эутопический эндометрий и эктопические очаги эндометриоза. Периферическая венозная кровь объёмом 5 мл забиралась в день операции, непосредственно перед проведением оперативного вмешательства. Перитонеальная жидкость для исследования аспирировалась в момент лапароскопии. В это же время производилась биопсия эндометрия и очагов эндометриоза. Образцы исследуемого материала помещались в стерильные пробирки с физиологическим раствором. Исследованию подвергались нативные образцы перитонеальной жидкости, биоптаты эутопического и эктопического эндометрия в физиологическом растворе и «гепаринизированные» образцы вепозной крови. Взятие материала осуществлялось в I фазу менструального цикла.

Клинические методы

Сбор анамнеза, общий и гинекологический осмотр, общеклшгаческое обследование, необходимое для выполнения оперативного вмешательства.

Иммунологические методы

Процедура выделения популяции мононуклеарных клеток (МНК) крови, перитонеалыюй жидкости и эндометрия

Фракцию мопонуклеарных клеток (МНК) периферической крови женщин и перитонеалыюй жидкости женщин и крыс получали стандартным методом скоростного центрифугировапия в градиенте плотности фиколл-урографина (d= 1,078). Для выделения фракции эндометриальных МНК фрагменты эндометриальной ткани механически измельчали, фильтровали через стальное сито и отмывали в среде RPMI 1640 для удаления клеточного дебриса. Полученную взвесь клеток центрифугировали в градиенте плотности фиколл-урографина (d= 1,060, d=l,078) и отбирали для исследования кольцо клеток в интерфазе фиколл-урографин (d=l,078) - RPMI 1640.

Оценка функционального состояния лимфоцитов методом проточной цитометрии

Определение экспрессии мембранных рецепторов лимфоцитами крови, перитонеальной жидкости и эндометрия проводили с помощью моноклональных антител методом трехцветной проточной цитометрии на приборе FACScan (Becton Dickinson, USA). В качестве флюорохромной метки использовали флюоресцеин изотиоционат (FITC), фикоэритрин (РЕ) или РЕ-Су 5. Процедуру окрашивания и фиксации клеток проводили стандартным способом в соответствии с указаниями фирмы-разработчика. При проведении проточной цитометрии клетки использовали в конечной концентрации 1х106.

К 50 мкл суспензии клеток в концентрации 1х106 клеток/мл добавляли 5 мкл мАТ, меченных FITC, РЕ и РЕ-Су5, инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 30 минут, затем клетки отмывали в 1 мл фосфатного буфера

(PBS), содержащего 0,1% азид натрия, и фиксировали в соответствии со стандартной процедурой.

Внутриклеточную процедуру окрашивания проводили в соответствии с инструкциями фирмы-производителя, используя коммерческий набор Intra Prep ™ (Becman Coulter, France) для пермеабилизации клеточной мембраны. При поведении процедуры окрашивания клетки сначала фиксировали в течение 15 мин в 100 мл реагента 1 из набора Intra Prep ™. Потом клетки инкубировали со 100 мл реагента 2 и с антителами к цитокину TNFa для внутриклеточного окрашивания. При окрашивании лимфоцитов крыс проводили дополнительную процедуру инкубации клеток с FITC-коныогированньми вторичными антителами (Anti-Armenian and Syrian hamster IgG). Для апализа неспецифического окрашивания использовали Simultest Control (мышиные IgGl-FITC + IgG2a-PE) ("Becton Dickinson", USA). Анализ клеток проводили в лимфоцитарном гейте и в гейте TCR у/5+ лимфоцитов. 10000 клеток анализировалось в каждом образце. Анализ результатов проводили в программе "CellQuest Pro" (Becton Dickinson, USA).

Экспериментальные методы

Эксперименты выполнены на 115 половозрелых белых крысах-самках линии Wistar массой 200-250 г. Животные содержались в условиях вивария ИГМА на стандартном рационе питания, имели свободный доступ к воде.

Экспериментальная модель наружного эндометриоза воспроизведена у 100 крыс путем подшивания фрагментов маточного рога к внутренней поверхности брюшной стенки (Vernon М. W., 1985). Эта модель ранее была достаточно хорошо охарактеризована и подтверждена морфологическими исследованиями (Шарабанова И.Ю., 2002). При хирургическом вмешательстве использовались викриловые нити.

Для иммунологического исследования у 25 крыс проводился забор псритонеальной жидкости во время операции, а также через 7, 14 и 21 день после оперативного вмешательства.

Для сравнительной оценки эффективности разных методов лечения при экспериментальном эндометриозе использованы 90 крыс, которые были разделены на 6 групп: 1-я группа контрольная (п = 15) - ложнооперированные крысы, которым проводилось удаление левого маточного рога; 2-я группа (п = 15) - крысы с экспериментальным эндометриозом без лечения; 3-я группа (п = 15) - крысы с экспериментальным эндометриозом и коагуляцией эндометриоидного очага; 4-я группа (п = 15) - крысы с экспериментальным эндометриозом, которым после операции ежедневно в течение 7 дней подкожно вводили иммуномодулятор Вилон в дозе 10 мкг/кг в 1 мл физиологического раствора; 5-я группа (п = 15) - животные с коагуляцией гетеротопий и внутрибрюшшшым однократным введением Вилона в дозе 10 мкг/кг в 1 мл физиологического раствора (п = 15); 6-я группа - крысы, с коагуляцией эндометриоидного очага и подкожным введением Вилона в течение 7 дней в вышеуказанной дозе.

Диатермокоагуляцшо эндометриоидных очагов проводили в пределах видимой здоровой ткани с помощью электроприбора ЭБД - 25/220 " Контур " при мощности 25 Вт., температуре насадки 190°С в течение 5-10 секунд.

Препарат Вилон является иммуномодулятором, разработанным в Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии Северо-Западного отделения РАМН. Синтетический тимомиметик дипептид (Lys-Glu) Вилон получен путем направленного химического синтеза на основании аминокислотного анализа комплексного препарата тимуса - тималина, иммунобиологических и физико-химических свойств аминокислот. Препарат рекомендован Фармакологическим государственным комитетом Минздрава РФ для клинических испыташш (разрешение на проведение клинических испытаний Минздрава РФ от 19.02.02) (Князькип И. В., 2002; Назарова А.О., 2006).

Для оценки репродуктивной функции у крыс исследовали длительность эстралыюго цикла и его фаз. С этой целью у крыс в утренние часы при помощи пипетки и физиологического раствора получали влагалищные мазки, которые

исследовали после окраски по Романовскому. О фазе цикла судили по соотношению различных типов клеток в мазке.

Для сравнительной оценки эффективности методов лечения при экспериментальном эндометриозе через 6 недель после начала эксперимента мы изучали: продолжительность эстрального цикла, частоту наступления беременности, продолжительность беременности, количество крысят в помёте и массу помёта. Для получения животных с датированным сроком беременности использовался метод вагинальных мазков (Дыбан А. П., 1975). Самок в фазу проэструс или ранний эструс помещали в одну клетку с самцами (4 самки и 1 самец). Каждое утро производился анализ микроскопического содержимого вагинальных мазков на наличие сперматозоидов. Сперматозоиды выявляли в неокрашенных препаратах с помощью светового микроскопа под малым увеличением. День обнаружения сперматозоидов в вагинальном мазке считался как первый день беременности. При рождении потомства производился подсчёт количества крысят в помёте и их взвешивание.

Статистическая обработка данных

Статистическая обработка результатов исследования проводилась по общепринятым методам вариационной статистики после проверки рядов данных на нормальность распределения. В зависимости от типа распределения данных оценивали достоверность различий между показателями независимых выборок по непараметрическому критерию U Манна-Уитни или по t-критершо Стьюдента (М±т). Для оценки факторов риска рассчитывался относительный риск (RR) с 95% доверительным интервалом (ДИ - 95%). Статистический анализ осуществлялся в пакете прикладных лицензионных программ «Statistica 6.0», «Microsoft Office 2007», «GenStat» и «Open Epi». Для оценки диагностической значимости новых иммунологических показателей применялись интерактивные диаграммы и ROC-анализ с использованием программы «MedCalk».

Результаты исследования и их обсуждение

Дня изучения клинических особенностей течения заболевания проведено обследование 87 женщин в возрасте от 18 до 44 лет. Средний возраст женщин контрольной группы составил 33,19±1,15 года, и был выше, чем средний возраст женщин основной группы - 30,76x0,64 года (р=0,039). В контрольной группе наиболее часто встречались женщины в возрасте старше 35 лет - 40,6%, в то время как в основной группе чаще наблюдались пациентки в возрасте от 26 до 30 лет -36,4%. По характеру менструальной функции пациентки с наружным эндометриозом в 80,0% случаев отмечали дисменорею, что достоверно больше (р<0,001), чем женщины контрольной группы - 15,6%. Установлено, что при паличии у женщины дисменореи частота выявления наружного эндометриоза повышается в 21,6 раза. Согласно результатам исследований в разных странах, распространённость дисменореи варьируется от 16,8 до 81% (Адамян JI. В., 2013). Достоверные различия групп были получены при изучении репродуктивной функции обследованных женщин. Пациентки основной группы реже имели в анамнезе роды по сравнению с женщинами контрольной группы (контрольная группа - 56,3%, основная группа -10,9%, р<0,001). В основной группе первичное бесплодие отмечалось у 49,1% пациенток основной группы, а вторичное бесплодие у 29,1%, пациенток (р=0,0001 и р=0,013 соответственно). Согласно нашим данным, при наличии у женщины бесплодия частота выявления наружного эндометриоза увеличивается в 3,1 раза. Полученные нами данные подтверждают мнение большинства отечественных и зарубежных авторов о взаимосвязи наружного эндометриоза с бесплодием (Адамян JI.B., 2013; Марченко JI. А., 2007; Hansen К. А., 2006; Кузьмичёв Л. Н., 2001).

При анализе применяемых методов контрацепции в обеих исследуемых группах было обнаружено, что женщины основной группы значительно реже использовали внутриматочную (р=0,023) и барьерную контрацепцию (р=0,011) по сравнению с женщинами группы контроля.

При изучении гинекологических заболеваний в анамнезе пациенток достоверных различий основной группы от контрольной вьивлено не было. Однако 18% женщин основной группы в анамнезе уже перенесли оперативное вмешательство по поводу наружного эндометриоза, что подтверждает литературные данные о частоте рецидивов эндометриоза после хирургического лечения (Багйа М., 2012; Агщют 8., 2010). По частоте перенесённых соматических заболеваний разных нозологических форм достоверных отличий между контрольной и основной группами выявлено не было. Однако отсутствие какой-либо экстрагениталыюй патологии достоверно чаще наблюдалось у женщин контрольной группы - 21,8%, в основной группе - 7,3% (р=0,049). Пациентки с наружным эндометриозом чаще болели простудными заболеваниями - 40%, женщины контрольной группы -12,5% (р=0,008). Установлено, что высокая частота простудных заболеваний ассоциирована с увеличением в 4,7 раза риска развития наружного эндометриоза.

По степени распространения эндометриоидпого процесса основная группа разделилась следующим образом: I стадия отмечена у 7% женщин, II стадия у 35%, III стадия у 11% и IV стадия у 47% пациенток.

Пациентки основной группы в 65% случаев отмечали болевой синдром, в 13% случаев диспареунию. Установлено, что при наличии у женщины нециклических тазовых болей частота выявления наружного эндометриоза повышается в 2,6 раза. Во время лапароскопии у 40% женщин основной группы обнаружены эндометриомы. Ретроцервикалышй эндометриоз наблюдался в 22% случаев, экстрагенитальный — в 25% случаев. При лапароскопии в основной группе спаечный процесс органов малого таза был обнаружен у 22% пациенток. Установлено, что при наружном эндометриозе в 8,7 раза повышается риск формирования спаечного процесса в малом тазу.

Существует мнение, что развитие эндометриоза непосредственно ассоциировано с угнетением активности реакций клеточной цитотоксичности (Оагуат II., 2002). Было установлено, что общее содержание СБ 16+ лимфоцитов в

периферической крови при наружном эндометриозе было повышено (25,54±1,51%) по сравнению с аналогичным показателем контрольной группой (14,21±0,96%, р=0,005), а также выявлено усиление внутриклеточной продукции Т№а+ СБ 16+ лимфоцитами (3,17±0,23%) по сравнению группой контроля (1,78±0,30; р=0,002) и усиление внутриклеточной продукции "ШРа+ в общей популяции периферических лимфоцитов (13,24±0,73%) по сравнению с аналогичным показателем контрольной группы (8,31±0,60%; р=0,0002).

Несмотря па несомненную важность оценки системных факторов иммунитета, наибольший интерес представляет изучение процессов, происходящих местно, в брюшной полости (Посисеева Л.В. 2009). Существует гипотеза о том, что в норме эндометриоидные клетки должны распознаваться перитонеальными ЕК, но нарушение элиминации эктопического эндометрия за счёт изменения активности ЕК приводит к развитию эндометриоза (вагуаш К., 2002). Оценка характера иммунного ответа на локальном уровне выявила другие закономерности изменения содержания и функционального состояния различных популяций цитотоксических лимфоцитов. Нами было установлено, что в перитонеальной жидкости женщин с наружным эндометриозом содержание СБЗ+лимфоцитов было значительно ниже (61,43±1,91%) такового в контрольной группе (71,55±4,00%, р=0,034). Но при этом в основной группе отмечалось повышение уровня перитонеальных лимфоцитов с фенотипом СО 16+ЮТа (2,80±0,19%) относительно показателя контрольной группы (1,53±0,21, р-0,002), а также усиление внутриклеточной продукции Т№а+ в общей популяции перитонеальных лимфоцитов (15,67±0,66%) по сравнению с группой контроля (9,93±0,76%; р=0,00003).

Существует гипотеза о том, что наружный эндометриоз является заболеванием преимущественно эндометрия. При этом, в эктопическом эндометрии женщин с наружным эндометриозом секретируется ряд растворимых факторов, оказывающих ингибирующее действие на функциональную активность ЕК (Ушаиег Б., 2000). В эутопическом и эктопическом эндометрии при наружном

эндометриозе имело место снижение количества СБ16+ лимфоцитов (13,33±0,80%; 12,09±0,74% соответственно) по сравнению с аналогичным показателем контрольной группы (18,50±2,20%; р=0,01; р=0,004 соответственно), а также отмечалось снижение количества СВЗ+СБ16+ лимфоцитов (3,65±0,41%; 4,48±0,42%) относительно данного показателя в эндометрии женщин группы контроля (11,56±2,17%; р=0,001; р=0,003 соответственно).

Ранее проведенные исследования показали, что при эндометриозе в периферической крови повышено общее содержания у8-Т клеток (Шишков Д.Н., 2006). Однако особенности активации и функциональной активности ТС115у+ лимфоцитов при наружном эндометриозе до настоящего времени остаются практически не изученными. Анализ данных о характере функционирования лимфоцитов с фенотипом ЕК-Т, экспрессирующих ТХЖуб рецептор, показал, что общее содержание ТС11у5+ лимфоцитов в периферической крови женщин с наружным эндометриозом повышено (7,36±0,86%) по сравнению с аналогичным показателем в контрольной группе (3,50±0,27%; р=0,0002). У женщин с эндометриозом также достоверно повышалось содержание периферических ТСЯу8+ТОРа+ лимфоцитов (1,29±0,14%) по сравнению с показателем контрольной группы (0,55±0,09%; р=0,0002).

Большой интерес представляют перитонеальные ТСКу2+ лимфоциты, поскольку именно этот пул клеток обладает специфической цитотоксичностью в отношении аутологичных эндометриальных клеток, попадающих в перитонеальную полость при менструации (Оагуат Я., 2002). В перитонеальной жидкости общее содержание ТСЯу8+ лимфоцитов в основной группе было повышено (8,32±0,51%) по сравнению с группой контроля (5,28±0,55%; р=0,005), а также отмечалось увеличение количества ТСР1у5+ТЫРа+ лимфоцитов (1,97±0,18%) относительно аналогичного показателя контрольной группы (1,22±0,22%; р=0,018).

В эктопических очагах выявлено значительное повышение общего содержания ТСЯу5+ лимфоцитов (8,45±0,77%) по сравнению с эутопическим

эндометрием женщин с эндометриозом (6,22±0,60%; р=0,021), а также по сравнению с эндометрием женщин контрольной группы (4,88±0,45%; р=0,007). При наружном эндометриозе отмечено более высокое содержание TCRy5+TNFa+ клеток в ткани очага эндометриоза (4,20±0,97%) по сравнению с эутопическим эндометрием женщин основной группы (2,04±0,25%; р=0,02 ).

Для уточнения характера активации TCRyS+ лимфоцитов мы провели анализ экспрессии CD 16 молекул и внутриклеточной продукции TNFa непосредственно в пуле TCRy5+ клеток. В перитонеальной жидкости женщин с наружным эндометриозом наблюдалось достоверное снижение функционально активных CD16+ лимфоцитов (23,96±2,11%) и даблпозитивных CD16+TNFa+ лимфоцитов (10,85±1,44%) по сравнению с группой контроля (42,51±7%, р=0,009 и 26,53±5,82%, р=0,003 соответственно).

В ткани эутопического и эктопического эндометрия пациенток с наружным эндометриозом выявлено снижение содержания CD 16+ клеток в пуле TCRy5+ лимфоцитов (37,91±3,12%; 33,12±2,70%, соответственно) по сравнению с аналогичным показателем эндометрия женщин контрольной группы (62,37±4,05%; р=0,036; р=0,007, соответственно). Кроме того, в пуле TCRy5+ лимфоцитов было снижено количество функционально активных лимфоцитов, продуцирующих внутриклеточно TNFa, (33,77±2,82%; 38,70±3,10, соответствешю) по сравнешпо с группой контроля (55,17±4,58%; р=0,02; р=0,049, соответственно). Уровень даблпозитивных CD1 б+ТЫРа+лкмфоцотов в популяции TCRy5+ клеток в эктопическом и эутопическом эндометрии пациегггок с эндометриозом был также значительно снижен (17,81±2,26%; 23,68±2,19%, соответственно) по сравнешпо с аналогичным показателем в контрольной группе (40,20±0,69%; р=0,01; р=0,009, соответственно).

По результатам ROC - анализа иммунологических показателей периферической крови жешцин с наружным эндометриозом были выбраны 5 из них, которые могут использоваться в качестве дополнительных критериев диагностики данного заболевания (табл. 1).

Таблица 1

Результаты ЛОС — анализа иммунологических показателей периферической крови

Показатели (лимфоциты) Диагностический показатель в периф. крови (%) Точность метода (%) Чувствительность Специфичность Площ-подШЭ криво"

СБ 16+ >19,1 76 69,2 94,7 0,870

ТСЯу5+ >4,4 76 72,0 88,9 0,803

ТС11у5+ЮТа+ >0,6 74 72,3 77,8 0,799

Т№?а+СВ16+ >1,4 85 94,0 63,2 0,798

Т№а+ >10,1 72 70,0 78,9 0,792

О наличии у женщины наружного эндометриоза может свидетельствовать: выявление в периферической крови Т№сс+С016+ лимфоцитов более 1,4 %; СБ 16+ лимфоцитов более 19,1%; ТСЛу5+ более 4,4%; ТСИу5+ТНРа+ более 0,6% и ЮТа+ более 10,1%.

Для уточнения роли цитотоксических ТСКу8+ лимфоцитов в механизмах развития эндометриоидного очага, мы оценили динамику изменения содержания функционально активной популяции ЕК-Т лимфоцитов с фенотипом ТС11у8+ЮТа+ в перитонеальной полости у крыс на различных этапах формирования очага экспериментального эндометриоза: до индукции эндометриоза (0 день), па 7, 14 и 21 день после проведения операции. Анализ данных показал, что на самых ранних этапах развития эндометриоидного очага в перитонеальной полости у крыс (на 7 день) происходит резкое увеличение общего содержании ТСЯу8+ лимфоцитов (9,05±0,82%) и пула функционально активных ТС11у8+Т№а+ лимфоцитов (3,7б±0,48%), по сравнению с аналогичными показателями у крыс до операции (4,67±0,20%; р=0,0008; 2,01±0,17%; р=0,007). На 14 день после моделирования экспериментального эндометриоза достоверно возрастает продукция ТОТа в общей популяции перитонеальных лимфоцитов (28,64±4,21%) по сравнению с аналогичными показателями у крыс до операции (18,56±1,7%; р=0,047). Следует отметить, что полученные результаты у крыс с

экспериментальным эндометриозом хорошо согласуются с изменениями этих же показателей в перитонеалыюй жидкости женщин с наружным эндометриозом.

Исследование экспериментальных моделей наружного эндометриоза открывает широкие возможности в изучении не только патогенеза, но и является весьма перспективным в плане разработки новых методов лечения данного заболевания (Шарабанова И.Ю., 2002; Посисеева Л.В. 2001). Согласно литературным дапным (Назаров С.Б., 2004) и полученным результатам, экспериментальный эндометриоз приводит к снижению фертильности крыс. Установлено, что при моделировании экспериментального эндометриоза и отсутствии лечения, происходит нарушение репродуктивной функции крыс в связи: с удлинением фазы диэструса и эстралыюго цикла в целом, снижением частоты наступления беременности в первый эстралышй цикл, увеличением количества дней и эстральных циклов до наступления беременности, уменьшением среднего количества крысят в помёте и общей массы помёта.

При сравнении разных способов лечения обнаружено, что все они приводили к восстановлению нарушенной фертильности крыс, однако при хирургическом лечении в сочетании с внутрибрюшинным введением вштона восстановление репродуктивной функции крыс-самок происходило наиболее эффективно. Так, длительность диэструса и эстралыюго цикла в целом при данном способе лечения были достоверно меньше (2,67±0,24 дня; 5,77±0,26 дня, соответственно), чем в группе крыс без лечения (4,03±0,36 дня, р=0,004; 7,25±0,37 дня, р=0,003, соответственно). Количество дней и эстральных циклов до наступления беременности при комбинированном лечении с внутрибрюшинным введением вилона максимально приближается к показателям контрольной группы по сравнению с другими методами лечения.

При изучении среднего количества крысят в помёте установлено, что в группе крыс с комбинированным лечением с внутрибрюшинным введением вилона в помёте в среднем было больше крысят (5,60±0,52 крысят), чем при

изолированном оперативном лечении крыс (4,07±0,46 крысят; р=0,037), а также при лечении только иммуномодулятором (4±0,00 крысят; р<0,01).

Общая масса помёта крыс во всех группах с лечением экспериментального эндометриоза была значительно больше, чем в группе крыс с эндометриозом без лечения, однако в группе крыс с комбинированным лечением с внутрибрюшинным введением Вилона общая масса помёта была больше (36,81±3,33г), чем аналогичный показатель крыс с лечением только иммуномодулятором (25,4±0,00г; р<0,01).

Вероятно, эффективность данного способа лечения связана с тем, что наиболее значимые изменения при наружном эндометриозе происходят местно, в перитонеальной полости. Именно на поверхности брюшины разыгрываются наиболее важные события, от которых зависит прогрессирование заболевания или регресс эндометриоидных гетеротопий (Ярмолинская М.И., 2007).

Таким образом, в периферической крови у женщин отмечается увеличение общего содержания и уровня активации клеток с цитотоксической активностью, что, по-видимому, свидетельствует о высоком уровне напряженности системных цитотоксических реакций. Однако на локальном уровне, где происходит формирование и рост очагов эндометриоза, содержание активированных ТСЛуб+клеток, обладающих высоким цитотоксическим потенциалом, напротив, снижается. Эти изменения позволяют говорить об угнетении противоопухолевого иммунного ответа, обусловленного активированными уб Т-клетками, на локальном уровне, что может способствовать выживанию клеток эндометрия при их попадании в перитонеальную полость в результате менструального рефлюкса, определяя возможность развития и роста очагов эндометриоза в перитонеальной полости.

ВЫВОДЫ

1. Наружный гениталышй эндометриоз у жешцин сопровождается дисменореей (ОР-21,6), спаечным процессом органов малого таза (ОР-8,7),

частыми ОРВИ (ОР-4,7), бесплодием (ОР-3,1), нециклическими тазовыми болями (ОР-2,6).

2. У женщин с наружным эндомегриозом в периферической крови отмечается увеличение содержания CD 16+ лимфоцитов и усиление продукции TNFa в популяции CD 16+ лимфоцитов и общей популяции лимфоцитов, в перитонеальной жидкости - снижение CD3+ лимфоцитов при одновременном увеличении продукции TNFa в популяции CD 16+ лимфоцитов и общей популяции лимфоцитов, в эутопическом и эктопическом эндометрии - снижение CD16+ и CD3+CD16+ лимфоцитов.

3. У женщин с наружным эндометриозом в периферической крови, перитонеальной жидкости и эктопическом эндометрии имеет место повышение содержания TCRy5+ лимфоцитов и функционально активных TCRyS+TNFa+ лимфоцитов, в пуле перитонеальных TCRyS+лимфоцитов - снижение уровня функционально активных TCRy5+CD16+ лимфоцитов и даблпозитивных TCRy5+CD16+TNFa+ лимфоцитов, в эутопическом и эктопическом эндометрии -снижение уровня функционально активных TCRy5+TNFa+ лимфоцитов.

4. Развитие экспериментального эндометриоза у крыс сопровождается на раннем этапе - увеличением в перитонеальной полости содержания TCRy5+ клеток и высоко активной популяции ТС^уб+ТОТа+лимфоцитов с последующим их снижением, на позднем этапе - усилением продукции TNFa в общей популяции перитонеальных лимфоцитов.

5. Наиболее эффективным методом лечения наружного эндометриоза в условиях экспериментальной модели на крысах является комбинация хирургического лечения и внутрибргошшшого введения иммуномодулирующего препарата дипепгида Lys-Glu.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Для диагностики наружного эндометриоза рекомендуется использовать дополнительные иммунологические показатели периферической крови.

О наличии у жепщины наружного эндометрноза может свидетельствовать: выявление в периферической крови увеличения продукции TNFa CDI6+ лимфоцитами более 1,4 % (точность метода - 85%), увеличение общего содержания в периферической крови CD 16+ лимфоцитов более 19,1% (точность метода - 76%), увеличение общего содержания TCRy8+ лимфоцитов более 4,4% (точность метода - 76%), увеличение продукции TNFa+ TCRy5+ лимфоцитами более 0,6% (точность метода - 74%), а также увеличение продукции TNFori- в общей популяции лимфоцитов более 10,1% (точность метода - 72%).

Список работ, опубликованных по теме диссертации: Публикации в журналах, включённых в перечень изданий, рекомендованных ВАК РФ:

1. Алексинская Е.С., Посисеева Л.В., Сотникова Н.Ю., Назаров С.Б., Анциферова Ю.С. Особенности функционального состояния TCR у5+ лимфоцитов периферической крови и перитонеальной жидкости у женщин с наружным генитальным эндометриозом // Аллергология и иммунология. - 2009,- Т.10, №2,-С.253.

2. Анциферова Ю.С., Назаров С.Б., Козырина А.А., Алексинская Е.С., Назарова А.О. Изменение активности у5-Т лимфоцитов в перитопеальной жидкости и в эндометрии у крыс на разных стадиях развития очага экспериментального зндометриоза // Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2010,- №2/1(29).- С.89.

3. Алексинская Е.С., Посисеева JI.B., Назаров С.Б. Особенности функционального состояния TCR5y+ лимфоцитов при наружном эндометриозе у женщин // Российский иммунологический журнал. - 2012. - Т.6 (14), №2 (1). - С.20-21.

4. Алексинская Е.С., Назаров С.Б., Посисеева JI.B., Анциферова Ю.С. Изменение активности TCR5y+ лимфоцитов в периферической крови и

перитонеальной жидкости женщин с наружным генитальным эндометриозом // Проблемы репродукции. — Москва. - 2012. - С. 148.

Публикации в журналах, сборниках, материалах конференции и тезисы докладов:

1. Алексинская Е.С., Посисеева Л.В., Назаров С.Б., Назарова А.О. Влияние нового иммуномодулирующего препарата «Вилон» на репродуктивную функцию крыс с экспериментальным эндометриозом // Актуальные проблемы акушерства, гинекологии и перинатологии: сборник научных работ и материалов научно-практической конференции молодых ученых, посвященный 75-летию со дня рождения В.Н.Городкова / Под редакцией Л.В.Посисеевой, С.Б.Назарова.-Иваново: Издательство МИК, 2007. - С.96-98.

2. Сотникова Н.Ю., Анциферова Ю.С., Посисеева Л.В., Назаров С.Б., Алексинская Е.С. Изменение продукции IL-6 клеток и TNF-a различными популяциями клеток врожденного иммунитета в динамике развития очага экспериментального эндометриоза // Омский научный вестник. -№1 (84).- 2009. -С.85-87.

3. Анциферова Ю.С., Назаров С.Б., Козырина A.A., Алексинская Е.С., Назарова А.О. Особенности спонтанной и стимулированной продукции цитокинов лимфоцитами и макрофагами перитонеальной жидкости у крыс с экспериментальным эндометриозом // Журнал теоретической и клинической медицины - 2010,- №5,- С.39-41.

4. Алексинская Е.С. Изменение активности TCRy5+ лимфоцитов в эктопических очагах женщин с наружным генитальным эндометриозом // Бюллетень ФЦСКЭ им. В.А.Алмазова,- СПБ., 2012,- С.78.

5. Алексинская Е.С. Изменение активности TCRy5+ лимфоцитов на системном и локальном уровнях при наружном генитальном эндометриозе. // Неделя науки - 2012: материалы 92-й ежегодной итоговой научно-практической конференции студентов и молодых ученых, посвященной 110-летию профессора С.Д. Носова (ИГМА) - Иваново. - 2012. - С. 24.

s

6. Алексинская E.C. Особенности функционального состояния TCRyS лимфоцитов у женщин с наружным генитальным эндометриозом // Актуальны проблемы, медицинские и организационные технологии охраны репродуктивног здоровья семьи: сборник научных работ. - Иваново: Издательство МИК, 2012. С.180-181.

7. Алексинская Е.С. Нарушение функционирования TCRy8+ лимфоцитов перитонеальной жидкости пациенток с наружным генитальным эпдометриозом / Вестник РГМУ,- 2013. - №2. - С. 169.

8. Алексинская Е.С. Клинико-экспериментальное сравнение активност TCRyS+ лимфоцт'ов при наружном генитальном эндометриозе // Неделя науки 2013: материалы 93-й ежегодной научной конференции студентов и молодь ученых с международным участием - Иваново, 2013.- С. 148.

9. Алексинская Е.С. Изменения функционального состояния TCRyS лимфоцитов при наружном генитальном эндометриозе. // Мать и дитя: материал XIV Всероссийского научного форума - М., 2013.- С.246-247.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ЕК - естественные киллеры

ЕК-Т - естественные киллерпые Т-лимфоциты

CD - молекулы дифференцировки лимфоидных клеток

TCR - Т-клеточный рецептор

TNF - фактор некроза опухоли.