Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Экспрессия изоформ сурвивина при немелкоклеточном раке легкого и ее влияние на свойства неопластических клеток

На правах рукописи

КОВАЛЕВА Ольга Владимировна

ЭКСПРЕССИЯ ИЗОФОРМ СУРВИВИНА ПРИ НЕМЕЛКОКЛЕТОЧНОМ РАКЕ ЛЕГКОГО И ЕЕ ВЛИЯНИЕ НА СВОЙСТВА НЕОПЛАСТИЧЕСКИХ КЛЕТОК

Специальность 14.01.12 - онкология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

3 "£« т

Москва 2010

004616229

Работа выполнена в Лаборатории регуляции клеточных и вирусных онкогенов НИИ Канцерогенеза Учреждения Российской академии медицинских наук Российский Онкологический Научный Центр имени Н.Н.Блохина РАМН (директор - академик РАН и РАМН, д.м.н., проф. М.И.Давыдов)

Научный руководитель:

Кандидат биологических наук Зборовская Ирина Борисовна

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук Доктор биологических наук

Мазуренко Наталья Николаевна Народицкий Борис Савельевич

Ведущая организация: Научно-исследовательский институт физико-

химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова

Защита диссертации состоится « 13 »2011 года в часов на заседании диссертационного совета (Д.001.017.01) РОНЦ имени Н.Н.Блохина РАМН по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, 24.

С текстом диссертации можно ознакомиться в библиотеке РОНЦ имени Н.Н.Блохина РАМН

Автореферат разослан « I? » У-Ю-.^^^ 2010 года.

Ученый секретарь диссертационного совета д.м.н., профессор

Ю.В. Шишкин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Изучение молекулярных механизмов опухолевой прогрессии, приводящих к возникновению у клеток метастатического фенотипа - одна из важнейших задач молекулярной онкологии. Метастазирование, как основной этап прогрессии онкологических заболеваний, включает в себя целый ряд сложных процессов, детальные механизмы которых начали проясняться только сейчас.

В последние 10 лет все больше внимания уделяется изучению роли белков семейства ингибиторов апоптоза, и, в частности, сурвивину в процессах опухолевой трансформации и прогрессии. Отличительной особенностью данного белка является характер его экспрессии. Сурвивин экспрессируется, преимущественно, во время эмбриогенеза и практически отсутствует во всех дифференцированных клетках взрослого организма. В опухолевых клетках различных типов экспрессия сур-вивина обычно возобновляется. В связи с этим были предприняты многие попытки использования этого белка в качестве диагностического онкомаркера, а также в качестве маркера течения болезни и мишени противоопухолевой терапии. Совсем недавно появились сведения о возможном участии сурвивина непосредственно в метастазировании, что делает вопрос его изучения еще более актуальным.

Ген сурвивина (BIRC5) подвергается альтернативному сплайсингу с образованием нескольких белковых изоформ, каждая из которых может выполнять различные и, в то же время, пересекающиеся функции. Предполагается, что изоформы сурвивина имеют различную внутриклеточную локализацию и вносят разный вклад в течение заболевания, а значит, имеют разное прогностическое значение. Многие известные онкогены могут активировать экспрессию сурвивина и влиять на уровень содержания данного белка в клетке. Сурвивин может фосфорилироваться киназами Cdkl, Aurora В и РКА, и эти постгрансляционные модификации обеспечивают белковую стабильность сурвивина и контролируют его транспорт между клеточными компартментами. Кроме того, некоторые химические вещества, например никотин, связанный с развитием одного из самых неблагоприятно текущих и сложно поддающихся лечению онкологических заболеваний - рака легкого (PJI), также могут активировать экспрессию и продукцию сурвивина.

Данная работа посвящена изучению путей внутриклеточной передачи сигналов, ассоциированных с сурвивином, на моделях клеточных линий РЛ и сравнению экспрессии данного гена и его изоформ в имеющейся коллекции образцов опухолевой и нормальной ткани легкого в поисках новых потенциальных сурвивин-зависимых маркеров прогноза и течения болезни.

Таким образом, данное исследование представляется чрезвычайно актуальным, поскольку позволяет обнаружить сурвивин-зависимые изменения молекуляр-но-биологических характеристик трансформированных клеток при опухолевой прогрессии и сопоставить эти данные с результатами, полученными при исследовании клинического материала, что в будущем сможет улучшить методологию использования противоопухолевой терапии при PJ1.

Цель и задачи исследования

Целью работы является исследование экспрессии различных изоформ сурви-вина при немелкоклеточном раке легкого (HMPJI) и их влияния на клеточные характеристики, ассоциированные с процессом опухолевой прогрессии.

В соответствии с указанной целью были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Провести анализ уровня экспрессии различных изоформ сурвивина на уровне мРНК и белка в коллекции образцов HMPJI с последующим анализом полученных результатов в отношении клинико-морфологических критериев: гистологической структуры опухоли, ее дифференцировки, наличия регионарных и отдаленных метастазов.

2. Получить производные клеточных линий рака легкого человека, стабильно экспрессирующие сурвивин дикого типа и сурвивин-2а.

3. Изучить влияние экспрессии экзогенного сурвивина дикого типа и сурви-вина-2а на важнейшие свойства трансформированных клеток, ассоциированные с процессом опухолевой прогрессии (уровень пролиферации, подвижность, способность к колониеобразованию в условиях прикрепленного и неприкрепленного роста, инвазия in vitro и др.).

4. Сравнить метастатический потенциал полученных клеточных линий in vivo.

5. Исследовать влияние экзогенного сурвивина дикого типа и сурвивина-2а на экспрессию и функциональную активность белков, потенциально вовлеченных в процесс опухолевой прогрессии.

Научная новизна и практическая значимость исследования Одним из важных результатов данной работы является тот факт, что экспрессия мРНК и белка сурвивина увеличивается в 83% и 70% случаев HMPJI соответственно, что позволяет считать его экспрессию возможным маркером опухолевого роста при раке легкого. Полученные в работе результаты также расширяют представления о роли сурвивина в канцерогенезе. В результате проведенных исследований получены приоритетные данные о влиянии сурвивина дикого типа и его изоформы сурвивина-2а на многие характеристики неопластических клеток. В частности, впервые показано, что экспрессия сурвивина дикого типа стимулирует формирование "агрессивного" фенотипа клеточной линии HMPJI Н1299 и не оказывает такого влияния на клеточные линии А549 и Н322. До сегодняшнего времени исследования влияния сурвивина-2а на процессы опухолевой прогрессии не проводились. Именно поэтому, некоторые полученные в представленной работе данные являются приоритетными.

Работа имеет в первую очередь фундаментальное теоретическое значение. Полученные данные о роли сурвивина в опухолевой прогрессии могут быть использованы при дальнейшем его изучении, как на модельных системах, так и в клинических исследованиях, в частности, при поиске адекватных мишеней генотера-пии опухолей.

Публикации и апробация работы

Диссертация апробирована и рекомендована к защите 18 октября 2010 года на совместной научной конференции лабораторий регуляции клеточных и вирусных онкогенов, молекулярной биологии вирусов, вирусного канцерогенеза, молекулярной эндокринологии и механизмов прогрессии эпителиальных опухолей НИИ Канцерогенеза РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН. Материалы работы докладывались на конференциях: Международный симпозиум в рамках Сибирско-Тайваньского Форума «Опыт и перспективы развития сотрудничества между российскими и тайваньскими учеными в области изучения молекулярно-генетических механизмов развития злокачественных новообразований и использования результатов фунда-

ментальных исследований в онкологии» в 2009 г. (Томск, Россия); Beatson international cancer conference "Microenvironment, motility and metastasis" в 2009 г. (Глазго, Шотландия). По результатам диссертационной работы опубликованы 3 научные статьи и 5 тезисов докладов.

Структура и объём диссертации Диссертация изложена на 117 страницах машинописного текста, содержит 53 рисунка, 5 таблиц. Состоит из глав: «Ведение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение», «Выводы», «Список использованной литературы». Список литературы содержит 126 источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы В работе использованы следующие методы исследования: трансформация бактериальных клеток, выделение плазмидной ДНК из бактериальных клеток, электрофорез нуклеиновых кислот, молекулярное клонирование, полимеразная цепная реакция (ПЦР), трансфекция эукариотических клеток, инфицирование клеток ретровирусными векторами, анализ количества мРНК методом ОТ-ПЦР, выделение и анализ белковых фракций с помощью вестерн-блот гибридизации, анализ ферментативной активности протеиназ внеклеточного матрикса (субстрат-специфическая зимография в ПААГ), анализ динамики роста клеток, анализ «зарастания раны» in vitro (wound healing assay), тест на образование колоний в условиях разреженной популяции (клоногенность), тест на образование колоний в полужидкой среде, тест на миграцию клеток по градиенту концентраций факторов роста, тест на инвазию in vitro, определение экспериментальной метастатической активности (ЭМА) .клеток на лабораторных животных, а также статистическая обработка данных.

Результаты исследования и обсуяедение 1. Анализ экспрессии изоформ сурвивина в образцах HMPJI

Известно, что сурвивин экспрессируется в большинстве новообразований человека. Его экспрессия в опухолях коррелирует со снижением выживаемости пациентов, увеличением числа рецидивов и количества регионарных и отдаленных метастазов. Кроме того, экспрессия сурвивина придает опухолевым клеткам устойчивость к лучевой и химиотерапии.

В данной работе проведен анализ экспрессии мРНК сурвивина дикого типа, сурвивина-АЕхЗ и сурвивина-2В в первичных опухолях HMPJT методом ОТ-ПЦР, а также экспрессии белка сурвивина методом Вестерн-блот анализа. Исследование проводилось на одних и тех же образцах HMPJI с целью проверки возможных корреляций в изменении экспрессии данных белков и мРНК между собой.

Образцы тканей двух основных типов НМРЛ: ПКРЛ (плоскоклеточный рак легкого) (29 образцов) и АК (аденокарцинома) (24 образца), а также прилегающих к опухолям морфологически нормальных тканей, т.н. «условных норм», были получены от пациентов, оперированных в 2005-2008 гг. по поводу рака легкого в НИИ КО РОНЦ им H.H. Блохина РАМН.

Первичный анализ экспрессии сурвивина на выборке из 30 образцов методом ОТ-ПЦР показал, что экспрессия мРНК сурвивина увеличивается в 83% опухолевых образцов по сравнению с «условной нормой» (см. рис. 1). Возможно, увеличение экспрессии мРНК сурвивина в опухолевых образцах по сравнению с «условной нормой» при НМРЛ может служить потенциальным маркером заболевания, однако, для подтверждения этого факта требуется дальнейшее расширение анализируемой выборки.

Рисунок 1. Анализ экспрессии мРНК сурвивина тМ, сурвивина-2В и сурвивина -Д&З в опухолевой и нормальной ткани легкого методом ОТ-ПЦР.

Н - "условная норма", О - опухолевый образец.

Праймеры ОАРОН использовались в качестве контроля.

Хотя статистически значимых корреляций между проанализированными характеристиками опухолей и экспрессией изоформ сурвивина выявить не удалось, был зафиксирован ряд интересных закономерностей.

Так, увеличение экспрессии сурвивина-АЕхЗ в опухолевой ткани по сравнению с нормальной наблюдалось в 44% (13/30) исследованных образцов, причем чаще фиксировалось в группе аденокарцином (в 50% (10/20) случаев), чем в группе ПКРЛ (в 30% (3/10) случаев). Интересным оказался тот факт, что экспрессия сурви-вина-АЕхЗ увеличивалась в низкодифференцированных опухолях в 67% (6/9), в то

время как в умеренно дифференцированных такое увеличение фиксировалось только в 34% (7/21). Данная тенденция, безусловно, заслуживает внимания.

При анализе уровня экспрессии белка сурвивина в тех же образцах оказалось, что количество белка не коррелировало с экспрессией мРНК сурвивина. Исследуемая выборка была расширена, и изменение экспрессии белка сурвивина проанализировано в 53 образцах НМРЛ с целью поиска возможных корреляций с основными гистологическими типами НМРЛ (АК и ПКРЛ), стадией заболевания, степенью дифференцировки опухоли и наличием регионарных метастазов в лимфатические узлы на момент оперативного вмешательства (см. рис. 2).

аденокарциномы плоскоклеточный РЛ

НОН О Н 0 ; НОН О Н О Н 0_

; ф т ^ сурдин^ - Л

Рисунок 2. Анализ экспрессии сурвивина в опухолевой и нормальной ткани легкого методом Вестерн-блот анализа. Н - "условная норма", О - опухолевый образец.

Антитела к р-актину использовались в качестве контроля.

В образцах условно нормальной ткани легкого наблюдалось практически полное отсутствие белка сурвивина, тогда как в опухолях НМРЛ различного генеза в 70% случаев выявлялся значительный уровень экспрессии этого белка. По результатам, полученным на данной выборке, можно сказать, что увеличение экспрессии сурвивина на уровне белка в ПКРЛ фиксируется несколько чаще, чем в АК (76% и 63% соответственно). Во всех образцах, в которых увеличивается продукция белка, также наблюдалось повышение экспрессии мРНК сурвивина. Однако ее уровень также увеличивается в опухолевой ткани по сравнению с нормальной и в тех образцах, где увеличения продукции белка не наблюдается. Можно предположить, что регуляция синтеза белка сурвивина осуществляется на посттранскрипционном уровне.

Так как увеличение экспрессии мРНК и белка сурвивина наблюдалось в большинстве исследованных образцов (83% и 70% соответственно), можно сказать, что при НМРЛ увеличение экспрессии сурвивина в опухолевых образцах по сравнению с «условной нормой» может служить маркером опухолевого роста при раке легкого.

2. Клеточные линии, использованные в работе

Для изучения влияния сурвивина на характеристики трансформированных клеток получена панель стабильных клеточных линий аденокарцином легкого, экспрессирующих последовательности основной полноразмерной изоформы сурвивина (именуемой в литературе сурвивином дикого типа) и сурвивина-2а в составе ретровирусного вектора pLXSN.

Было получено 7 стабильных поликлональных клеточных линий:

-HI299 pLXSN (линия с «пустым» вектором, далее использовавшаяся в качестве контрольной); Н1299 Survivin wt; Н1299 Survivin-2a;

-А549 pLXSN; A549 Survivin wt;

-H322 pLXSN; H322 Survivin wt;

Полученные клеточные линии далее были использованы в in vitro и in vivo экспериментах для сравнения влияния сурвивина на изменение отдельных характеристик злокачественных клеток.

HI 299 Н1299 А549 А.Ч9 Н322 AÍ49 pLXSN Sure pI-^SN surv pLXSN Sure

сурвивин

Рисунок 3. Вестерн-блот анализ экспрессии экзогенного сурвивина в клеточных линиях HMPJ1. Антитела к р-актину использовались в качестве контроля.

3. Фенотипирование полученных клеточных линий in vitro и in vivo

Одной из основных характеристик трансформированных клеток является повышенная скорость деления.

Рисунок 4. Динамика роста исследованных клеточных линий При исследовании влияния сурвивина дикого типа на пролиферацию клеток НМРЛ оказалось, что экспрессия экзогенного сурвивина ускоряют скорость деле-

ния клеток линии HI299 и не влияет на скорость пролиферации клеток линий А549 и Н322 (см. рис.4).

Одной из характеристик агрессивных культур трансформированных клеток от vitro является способность формировать колонии без стимуляции окружающими клетками (клоногенность), которая, помимо разницы в пролиферации, отражает зависимость клеток от микроокружения. При проведении теста на клоногенность оказалось, что среднее количество колоний не менялось во всех линиях, экспресси-рующих сурвивин дикого типа по сравнению с контрольными линиями (см. рис. 5).

Рисунок 5. Анализ клоногенносги полученных клеточных линий.

Звездочка - статистически достоверное отличие от контрольной линии (р<0,05) В то же время в клеточной линии Н1299, экспрессирующей экзогенный сурвивин, было обнаружено статистически значимое увеличение (р<0.05) размера образовавшихся колоний, что также отражает увеличение скорости пролиферации данной линии при суперпродукции сурвивина. Для клеточной линии Н322 проведение подобного эксперимента оказалось невозможным ввиду ее неспособности к росту в условиях разреженной популяции.

Также в данной работе проведено исследование влияние экспрессии экзогенного сурвивина на рост клеток НМРЛ в неприкрепленных условиях. Оказалось, что суперэкспрессия сурвивина дикого типа оказывает универсальный эффект на данную клеточную характеристику. Во всех исследуемых линиях суперэкспрессия сурвивина дикого типа значительно снижает количество образующихся колоний (рис. 6).

5 ж

8

S ж

★ s 100

с

J

5 150-

Рисунок 6. Среднее количество и размер колоний исследованных линий, сформировавшихся в условиях неприкрепленного роста.

Звездочка - статистически достоверное отличие от контрольной линии (р<0.05).

Другой важнейшей характеристикой клеток, часто ассоциированной с более агрессивным фенотипом, является способность к миграции. Способность к миграции in vitro исследуется в тесте на зарастание «раны», когда клетки прикреплены к подложке и зарастают «рану» в монослое, а также в камерах Бойдена, когда исследуется способность к направленной миграции сквозь поры мембраны по градиенту ростовых факторов. Исследование влияния сурвивина на миграционную активность клеток проводилось с использованием обоих тестов (см. рис. 7,8).

'1 * lot

★

Ж

Рисунок 7. Миграция клеток в рану среде с 10% содержанием сыворотки с добавлением Митомицина С (1,5 мкг/мл).

Звездочка - статистически достоверное отличие от контрольной линии (р<0,05) При исследовании подвижности клеток в тесте на зарастание "раны" оказалось, что экспрессия экзогенного сурвивина оказывает значимый, но противоположный эффект на различные клеточные линии РЛ, т.е. приводит к увеличению подвижности клеток линии Н1299 и снижению миграционной способности клеток линий А549 и Н322.

Рисунок 8. Миграция клеток по градиенту сыворотки в камере Бойдена.

Звездочка - статистически достоверное отличие от контрольной линии (р<0,05) Как видно из рисунка 8, экспрессия экзогенного сурвивина стимулирует направленную миграцию клеток линии НМРЛ Н1299 в камерах Бойдена и этот результат совпадает с результатом теста на зарастание «раны». Таким образм по результатам обоих тестов можно утверждать, что сурвивин стимулирует подвижность клеток HI299.

Как видно из графиков, экспрессия экзогенного сурвивина в клеточных линиях А549 и Н322 снижает миграционную способность клеток, как в тесте на зарастание «раны», так и в тесте на направленную миграцию.

Способность трансформированных клеток in vivo проникать из опухоли в окружающую ткань является одной из основных характеристик, определяющих злокачественный фенотип опухолей. Для оценки инвазивных свойств клеток в культуре используется тест на инвазию in vitro с помощью камер Бойдена, дно которых покрыто матригелем, имитирующим внеклеточный матрикс. В данном тесте моделируется ситуация, при которой трансформированные клетки оказываются в состоянии голодания по факторам роста, и для их получения клеткам необходимо преодолеть барьер (матригель). Такой тест отражаег способность клеток к инвазии в целом, а также характеризует направленное движение и разрушение внеклеточного матрикса.

Di

1

§ loco-

J

Рисунок 9. Инвазия клеток через матригель в камере Бойдена. Звездочка - статистически достоверное отличие от контрольной линии (р<0,05).

Клеточная линия HI299, экспрессирующая экзогенный сурвивин, проявляла большую способность к инвазии, чем клетки контрольной линии. Клеточные линии HMPJI А549 и Н322, экспрессирующие экзогенный сурвивин, показали снижение своих инвазивных свойств.

Таблипа 1. Влияние экзогенного сурвивина на изменение клеточных характеристик в культурах in vitro.

Клеточные Н1299 А549 Н322

характеристики Surv Surv Surv

Пролиферация + = =

Миграция в "рану" + - -

Миграция в камере Бойдена + = -

Инвазия + - -

Неприкрепленный рост , - - -

Клоногенность = = =

"+" - усиление признака по сравнению с контрольной линией - ослабление признака по сравнению с контрольной линией "=" — отсутствие изменений по сравнению с контрольной линией

Таким образом, при анализе характеристик роста полученных клеточных линий в культуре in vitro, можно сделать основной вывод о том, что сурвивин оказывает влияние на весь комплекс основных свойств, характеризующих опухолевую прогрессию, однако его суперэкспрессия оказывает принципиально различное действие на клеточные линии HMPJI (табл. 1). Так, для клеточной линии Н1299 наблюдается увеличение скорости пролиферации, стимуляция миграционной и инва-зивной способности клеток. Ддя двух других исследованных клеточных линий наблюдался противоположный эффект. Единственным общим эффектом экзогенного Сурвивина, наблюдаемого на всех исследуемых клеточных линиях, является снижение способности клеток к формированию колоний в условиях неприкрепленного роста.

В связи с тем, что экспрессия экзогенного сурвивина оказала значительное влияние на усиление агрессивного фенотипа клеточной линии HI 299 in vitro, следующей задачей данной работы было выявление возможного влияния сурвивина дикого типа на метастатический потенциал клеток in vivo. Определение экспериментальной метастатической активности клеток проводилось спустя 2 недели после их внутривенного введения (1-106 клеток) бестимусным мышам линии D2xJ. При анализе уровня экспериментальной метастатической активности исследован-

ной линии оказалось, что сурвивин усиливает экспериментальную метастатическую активность данной линии, но эти изменения, возможно, ввиду небольших групп исследуемых животных, не достигают статистически значимого уровня (см. рис. 10).

Рисунок 10. Количество гистологически верифицированных метастазов в легких экспериментальных животных спустя 2 недели после внутривенного введения исследованных клеточных линий.

т

Таким образом, усиления агрессивного фенотипа in vitro клеточной линии Н1299 оказалось недостаточно для выраженной стимуляции метастатического потенциала опухолевых клеток in vivo. В целом, при анализе характеристик роста полученных клеточных линий можно сделать следующие выводы: экспрессия экзогенного сурвивина оказывает неоднозначное, а в ряде случаев противоположное влияние на различные клеточные линии НМРЛ. Данный факт может свидетельствовать об участии сурвивина в различных сигнальных путях, приводящих в итоге, в зависимости от клеточного контекста, к разнонаправленному изменению клеточных характеристик.

Поскольку основные различия в поведении клеток, экспрессирующих экзогенный сурвивин, наблюдались преимущественно в миграционной и инвазивной активности, а также пролиферации, далее было проведено исследование влияния экспрессии экзогенного сурвивина на активность секретируемых протеиназ ВКМ, белков фокальной адгезии, а также МАР-киназ, как основных проводников мито-генных сигналов.

4. Исследование влияния сурвивина дикого типа на активность секретируемых протеиназ, ремоделирующих ВКМ

Далее было проведено исследование активности ряда протеиназ, деградирующих компоненты ВКМ, с помощью субстрат-специфической зимографии. При анализе матриксных металлопротеиназ, способных деградировать желатин (ММР-1, -2 и -9) обнаружено, что для клеточной линий HI299 наблюдается снижение ак-

тивности ММР-9, а для клеточной линии Н322 - ММР-2. В клеточной линий А 549 при экспрессии экзогенного сурвивина никаких изменений в активности матрикс-ных металлопротеиназ обнаружено не было (рис. 11).

И1199 ИЩУУ А54У А54У Н.П2 П.* 2 2

Рнсунок 11. Анализ активности ММР в кондиционированных средах, полученных от клеточных линий, экспрессирующих экзогенный сурвивин.

H1299 Н1299 AS49 А549 HM2 Ш22

Рисунок 12. Анализ активности иРА в кондиционированных средах, полученных от клеточных линий, экспрессирующих экзогенный сурвивин. В то же время, исследование активности другой важнейшей протеиназы, урокиназо-подобного активатора плазминогена (иРА), показало, что в клеточной линии Н1299 при экспрессии экзогенного сурвивина активность иРА повышена по сравнению с контрольной линией (рис. 12). Для двух других клеточных линий наблюдался противоположный эффект.

Полученные данные свидетельствуют о том, что усиление инвазивных свойств линии HI299 Surv in vitro коррелирует увеличением протеолитической активности иРА, позволяющей клеткам этой линии более активно расщеплять матри-гель. В то же время, в двух других исследованных клеточных линиях активность секретируемой иРА снижается, что коррелирует со снижением инвазивных свойств клеточных линий А549 Surv и Н322 Surv in vitro.

5. Исследование влияния сурвивина дикого типа на экспрессию белков, вовлеченных в процесс опухолевой прогрессии

Следующим этапом работы был анализ экспрессии и уровня фосфорилиро-вання ряда белков, принимающих участие в процессах адгезии клеток, как одного из возможных механизмов изменения миграционных и инвазивных свойств клеток

iv vitro. Для нормального функционирования клетке нужно прикрепиться к поверхности внеклеточного матрикса посредством образования фокальных контактов. Изменение формирования фокальных контактов может приводить к изменению различных сигнальных путей и клеточных характеристик, ими опосредованных. Предположив, что полученные в нашей работе данные об изменении миграции и инвазии клеток HMPJI при экспрессии экзогенного сурвивина могут быть опосредованы интегрин - зависимыми путями передачи сигнала, задействованными в процессах клеточной адгезии, первоначально был проведен анализ экспрессии ин-тегрина-|31 и фибронектина.

Анализ экспрессии интегрина-(31 показал, что при экспрессии экзогенного сурвивина его продукция усиливается в клеточной линии Н1299 и снижается в клеточной линии А549.

H129S H129S А549 А543 Н322 Н322

pLXSN Suiv pLXSS Surv pLXSN Suiv

Рисунок 13. Вестерн-блот анализ уровня экспрессии интегрина-(31.

Антитела к ¡3-актину использовались в качестве контроля. Уровень экспрессии фибронектина (одного из лигандов интегринового рецептора) изменялся аналогичным образом.

->[ ' . с HI299 HI299 А5-19 А54Э

' : ' ' 1 ■ pLX::'l surv pLXSN Sg —.

инки mtm ¿ша* яцт Фибронектин

ЗЯИЯЯГ fiAlWP 1

. ., ^ Рисунок 14. Вестерн-блот анализ уровня экспрессии фибронектина.

Антитела к (3-актину использовались в качестве контроля. В клеточной линии НМРЛ HI299 наблюдалось увеличение экспрессии фибронектина, в то время как в клеточной линии А549 уровень продукции этого белка снижался. В клеточной линии Н322, содержащей как пустой вектор, так и при наличии экзогенного сурвивина, фибронектин не детектировался. . ,

Известно, что после взаимодействия интегринов со своими лигандами, то есть в процессе клеточной адгезии, к этому комплексу привлекаются различные сигнальные молекулы, в частности нерецелторные тирозинкиназы FAK и Src. В данной работе был проведен анализ влияния экзогенного сурвивина на уровень

фосфорилирования и экспрессии киназы фокальной адгезии (БАК) и Эгс-киназы (рис. 15 и 16).

р-БАК (УЗ 97) «И» р-БАК (У576) « 4м» «ш* -v р-РАК (У925)

«м» щт ~ р-ИАК (У861)

Рисунок 15. Вестерн-блот анализ уровня фосфорилирования и экспрессии БАК.

Проанализировав уровень экспрессии и фосфорилирования РАК, оказалось, что сурвивин действительно меняет уровень фосфорилирования данной киназы, однако это изменение специфично для каждой линии. Так, для клеточной линии Н1299 уровень фосфорилирования БАК по тирозину 397 (сайт аутофосфорилиро-вания) не менялся. Для клеточной линии А549 наблюдалось снижения статуса фосфорилирования БАК по У397, а в клеточной линии Н322 экспрессия такой фосфорилированой формы отсутствовала. Фосфорилирование БАК по последующим сайтам (У576/577, У861 и У925), которые могут осуществляться киназами Эгс семейства, усиливается в клеточной линии Н1299 и снижается в клеточных линиях А549 и Н322. Полученные результаты дали основание предположить возможность сурвивин-зависимой фосфорилирование БАК, посредством активации Бгс-киназы.

р-Бгс (У418) р-Эгс (У529) Эгс

Рисунок 16. Вестерн-блот анализ уровня фосфорилирования и экспрессии Эгс.

Однако, несмотря на обнаружение усиление фосфорилирования РАК-киназы, активирующих фосфорилирования (У418) и дефосфорилирования (У529) Бгс не наблюдалось, что может свидетельствовать об альтернативных механизмах активации РАК, например другими киназами Згс-семейства. Дальнейшее исследование сурвивин-зависимиго пути передачи сигналов от интегринов показало увеличение уровня фосфорилирования партнеров РАК, таких как даксиллин и РЬСу-1 (см. рис. 17а и 166).

А

.VSP р-паксиллин MI паксиллин

Н1299 Н1299 pLXSN Surv

AS 49 pt-XSN

PLCy-1

Рисунок 17. А) Вестерн-блот анализ уровня фосфорилирования (Yl 18) и экспрессии паксиллина. Б) Вестерн-блот анализ уровня фосфорилирования (Y783) и экспрессии PLCy-1 .

В клеточной линии Н1299 было выявлено увеличение уровня фосфорилирования данных белков, а в клеточных линиях А549 и Н322 - снижение. Таким образом, можно сказать, что экспрессия экзогенного сурвивина в линии Н1299 приводит к активации РАК, паксиллина и РЬОу-1, что коррелирует с усилением подвижности данной клеточной линии. В то же время снижение активности исследованных белков в клеточных линиях А549 и Н322 коррелирует со снижением их миграционных свойств.

Помимо способности клеток к миграции и инвазии, еще одним важным аспектом опухолевой прогрессии является повышение скорости пролиферации. При экспрессии экзогенного сурвивина в исследованных клеточных линиях наблюдалось сурвивин - опосредованное повышение пролиферации клеточной линии Н1299. Каким же образом экспрессия экзогенного сурвивина способна оказывать влияние на процесс клеточного деления? Возникло предположение, что одними из возможных кандидатов на роль "активаторов" пролиферации могут служить МАР-киназы. Была проведена проверка уровня активности ЕЛК1/2, р38 и ЖК в полученных клеточных линиях.

Рисунок 18. Вестерн-блот анализ уровня фосфорилирования (Т202+У204/ Т185+У187) и экспрессии ЕЯК1/2

Сравнение уровня фосфорилирования ЕЮС1/2 полученных клеточных линий показало, что экспрессия экзогенного сурвивина приводит к активации Е11К1/2 в клеточной линии Н1299. Однако в клеточной линии А549 наблюдается снижение

Н1299 HI299 А549 А549 Ш22 Н322

pLXSbJ Surv pLXSH Surv pLXSH Suiv

уровня фосфорилирования данной киназы. Для клеточной линии Н322 изменений в уровне фосфорилирования ЕЛК1/2 не наблюдалось. Таким образом, в нашей работе только в клеточной линии Н1299 наблюдается усиление фосфорилирования БАК по тирозину 925, что коррелирует с повышением статуса фосфорилирования ЕКК1/2 и усилением скорости пролиферации данной клеточной линии. Кроме того, наблюдалась корреляция в уровне активности ЕЯК1/2 и иРА для клеточных линий Н1299 и А549 при экспрессии экзогенного сурвивина.

Далее было проведено исследование уровня фосфорилирования и экспрессии МАР-киназ р38 и ШК1. Оказалось, что в клеточной линии Н1299 ни тотальное количество ЖК1, ни уровень ее фосфорилирования не изменяются, в то время как для двух остальных исследованных клеточных линий наблюдалось снижение уровня фосфорилирования данной МАР-киназы (см. рис. 19).

К322

р- ЖК1 ЖК1

Рисунок 19. Вестерн-блот анализ уровня фосфорилирования (Т183) и экспрессии ЛМКЛ.

Известно, что ЛЖ1, находясь в фосфорилированном состоянии, может принимать участие в активации протеаз, ремоделирующих ВКМ. Полученные в работе результаты показали, что снижение фосфорилирования киназы ЖК1 в клеточных линиях А549 и Н322 коррелирует со снижением активности иРА в данных клеточных линиях.

Н1299 Н1299 ЛБ49 А549 Н322 Н322

ДВЙ- Шт чштт. Р- р38

Рисунок 20. Вестерн-блот анализ уровня фосфорилирования (Т180+У182) и экспрессии р38.

Анализ активности р38 показал, что количество тотальной р38 не изменяется в исследованных клеточных линиях, тогда как степень фосфорилирования данного белка при экспрессии экзогенного сурвивина различается между линиями НМРЛ (см. рис.20). Так, уровень фосфорилирования р38 значимо снижается в линиях Н1299 и Н322 и в меньшей степени - в линии А549.

Подводя итого, можно сказать, что сурвивин дикого типа принципиально по-разному влияет на различные клеточные линии аденокарцином легкого. Так, для

клеточной линии HI299 наблюдается усиление "агрессивного" фенотипа, в то время как для остальных двух исследованных линий наблюдается обратный эффект.

6. Исследование влияния сурвивина-2а на клеточные характеристики и экспрессию белков, вовлеченных в процесс опухолевой прогрессии В настоящее время известно 5 изоформ сурвивина, образующихся в результате альтернативного сплайсинга. Самой малоохаракгеризованной изоформой сурвивина является сурвивин-2а. Показано, что суперэкспрессия сурвивина-2а делает опухолевые клетки более чувствительными к апоптотическим стимулам, что свидетельствует о том, что сурвивин-2а может действовать как природный антагонист сурвивина дикого типа. Никаких исследований возможного участия сурвивина-2а в процессах, ассоциированных с метастазированием, ранее не проводилось, поэтому заключительная часть данной работы посвящена именно этой изоформе. Для работы была выбрана клеточная линия HI299, в которой наблюдались наиболее выраженные изменения клеточных характеристик и усиление "агрессивных" свойств при экспрессии экзогенного сурвивина дикого типа. После получения политональной клеточной линии, экспрессирующей сурвивин-2а, было проведено ее фе-нотипирование in vitro.

Анализ динамики пролиферации клеточной линии Н1299, экспрессирующей экзогенный сурвивин-2а, показал снижение скорости роста (рис. 21), в то время как для сурвивина дикого типа наблюдался противоположный эффект (см. рис. 4).

t

5 600000.0 S

S

I 400000.»

- Н12Э9 pLXSN • Н1299 Sirv2alpha

Рисунок 21. Динамика роста клеточных линий НМРЛ с экспрессией экзогенного сурвивина-2а.

Анализ способности клеточной линии, экспрессирующей экзогенный сурви-вин-2а, к формированию колоний в условиях "бедного" микроокружения не выявил различий (рис.22). Схожие результаты наблюдались и в клеточных линиях, экспрессирующих сурвивин дикого типа.

Рисунок 22. Анализ клоногенности полученных клеточных линий.

Анализ способности к колониеобразованию в условиях неприкрепленного роста показал, что экспрессия сурвивина-2а приводит к увеличению количества колоний и снижению их размера. Это согласуется с полученными ранее данными о снижении скорости пролиферации при экспрессии сурвивина-2а (см. рис. 23).

/

У

Рисунок 23. Среднее количество и размер колоний, сформировавшихся в условиях неприкрепленного роста. Звездочка - статистически достоверное отличие от контрольной линии (р<0,05). Таким образом, эффект действия данной изоформы на способность к неприкрепленному росту противоположен таковому при суперпродукции сурвивина дикого типа.

/

У

А * Б

Рисунок 24. А. Миграция клеток по градиенту сыворотки в камере Бойдена и Б. миграция клеток в "рану" в среде с содержанием 10% сыворотки и добавлением Митомицина С (1.5 мкг/мл).

Звездочка - статистически достоверное отличие от контрольной линии (р<0,05).

Влияния сурвивит-2а на способность клеток к миграции по градиенту сыворотки, также оказало действие противоположное сурвивину дикого типа.

Полученные данные свидетельствовали в пользу того, что сурвивин-2а по своему воздействию на опухолевые клетки действительно может являться антаго-

нистом сурвивина дикого типа. Однако дальнейшие результаты опровергли данное предположение. Так, суперэкспрессия сурвивина-2а приводила к увеличению ин-вазивной способности клеток in vitro (рис. 25), как и экспрессия экзогенного сурвивина дикого типа.

т5г

Рисунок 25. Инвазия клеток по градиенту сыворотки в камере Бойдена. Звездочка - статистически достоверное отличие от контрольной линии (р<0,05).

Поскольку при экспрессии сурвивина-2а наблюдалось снижение миграции и усиление инвазии клеток, то наиболее вероятным объяснением этого может быть усиление активности протеиназ, ремоделирующих ВКМ. Далее было проведено исследование активности ММР и иРА при экспрессии сурвивина-2а (рис.26).

Анализ активности ММР и иРА показал, что экспрессия сурвивина-2а усиливает активность ММР-9 и иРА, что коррелирует с усилением инвазивной способностью клеточной линии Н1299.

ММР-2 ММР-1

ммр-9 е-:' I

H1299 HI299

ucsm

'' Щ! .....

иРА

Рисунок 26. Анализ активности ММР и иРА в образцах кондиционированных сред полученных от клеточных линий, экспрессирующих сурвивин-2а.

Также исследовано влияние экспрессии сурвивина-2а на уровень продукции некоторых белков, вовлеченных в регуляцию изучаемых свойств. Также как для клеточных линий, экспрессирующих сурвивин дикого типа, проведено исследование экспрессии интегрина-(31, фибронектина, нерецепторной тирозинкиназы фокальной адгезии и ее потенциальных мишеней, а также влияние экспрессии сурви-вина-2а на статус фосфорилирования основных митоген-активируемых киназ.

Н1299 Н129 9 Н1299 Н1299

Фибронектин яг?- ЧВВ «¡¡«ее* 4ННР> Интегрин-(31

Рисунок 27. Вестерн-блот анализ уровня экспрессии фибронектина и интегрина-р1.

Антитела к Р-актину использовались в качестве контроля.

Результаты Вестерн-блот анализа показали, что в клеточной линии НМРЛ Н1299 5игу-2а происходит увеличение экспрессии фибронектина и |31-интегрина.

Анализ уровня фосфорилирования РАК по различным остаткам тирозина показал, что экспрессия сурвивина-2а приводит к увеличению фосфорилирования по тирозину 397 и 576, в то время как уровень фосфорилирования по тирозина 925 и 861 снижался.

Н1299 Н1299 р1>ЩЫ Энгу 2а1рЬа

р-РАК (У397) р-РАК (У576) р-РАК (У925) р-РАК (У861) РАК

Рисунок 28. Вестерн-блот анализ уровня фосфорилирования и экспрессии РАК.

Уровень фосфорилирования паксиллина в клеточной линии с экспрессией экзогенного сурвивина-2а повышался (рис. 29), что совпадает с результатами, полученными при экспрессии сурвивина дикого типа.

;<1ХЗ!; Эму 2а1рЬе

¡ия81: р-паксиллин паксиллин

Рисунок 29. Вестерн-блот анализ уровня фосфорилирования и экспрессии паксиллина. Исследование основных митоген-активируемых киназ не выявило никаких изменений ни в уровне их экспрессии, ни в статусе фосфорилирования (рис. 29).

Н1299 Н1299 Н1299 Н1299

р-ЕШД ШШ-ШШ ; —Р-ЛЧК1 м»

Ф2УГ:-

Рисунок 30. Вестерн-блот анализ уровня фосфорилирования и экспрессии ЕЯКШ.ЛМК! и р38.

Таким образом, очевидно, что сурвивин дикого типа при его суперэкспрессии вызывает комплексные изменения клеточного фенотипа. Эти изменения могут быть направлены как в сторону усиления, так и в сторону снижения злокачественного фенотипа клеток. Экспрессия сурвивина-2а оказывает разнонаправленное действие на различные клеточные характеристики одной линии, ассоциированные с опухолевой прогрессией, что, безусловно, делает преждевременным его использование в качестве антагониста сурвивина.

Полученные в работе данные о значительном увеличениии экспрессии сурвивина в образцах опухолей человека свидетельствуют, что такой, несомненно, важный, многофункциональный белок, как сурвивин, помимо извесного ранее участия в митозе и апоптозе, обладает дополнительными функциями в трансформированной клетке. В частности, сурвивин принимает участие в регуляции таких важнейших свойств неопластических клеток, как миграционная и инвазивная способности. В зависимости от клеточного контекста сурвивин может оказывать противоположное действие на клетки НМРЛ, меняя в комплексе кластер признаков, ассоциированных с опухолевой прогрессией. Очевидно, что существуют процессы, для которых его роль на данный момент еще не установлена. Только после того, как все механизмы функционирования сурвивина будут известны, можно с уверенностью использовать его ингибиторы в качестве терапевтических агентов. Только при полном понимании сурвивин-зависимых сигнальных путей терапия с его участием будет адекватной и эффективной.

Выводы

1. Экспрессия мРНК и белка сурвивипа увеличивается в 83% и 70% случаев НМРЛ соответственно, что позволяет считать экспрессию сурвивина возможным маркером опухолевого роста при РЛ.

2. Впервые показано, что экспрессия сурвивина дикого типа оказывает комплексное, но разнонаправленное влияние на уровень "агрессивности" фенотипа клеточных линий аденокарцином легкого.

3. Экспрессия сурвивина дикого типа увеличивает подвижность и способность к направленной миграции клеточной линии Н1299, что коррелирует с повышением экспрессии интегрина-р1 и фибронектина, а также статусом фосфорилиро-вания белков фокальных контактов (РАК, паксиллина, РЬСу1).

4. Показано сурвивин - зависимое усиление инвазивного потенциала клеточной линии Н1299, что коррелирует с активацией внеклеточной протеазы иРА.

5. Показано сурвивин - зависимое повышение скорости пролиферации клеточной линии Н1299, что коррелирует с увеличением уровня фосфорилирования ЕКК1/2.

6. Впервые показано влияние экспрессии сурвивиин-2а на инвазивную способность клеток НМРЛ.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. К.Н. Кашкин, Е.А. Мусаткина, А.В. Комельков, И.А. Фаворская, Е.В. Труш-кин, В.А. Шлепцова, Д.А. Сахаров, Т.В. Виноградова, Е.П. Копанцев, М.В. Зиновьева, О.В. Ковалева, И.Б. Зборовская, А.Г. Тоневицкий, Е.Д. Свердлов. Экспрессионное профилирование и предполагаемые механизмы устойчивости к доксорубицину клеток рака легких человека./УДоклады Академии Наук. - 2010 - Т. 430, № 3 - С. 412-415.

2. Книжник А.В., Ковалева О.В., Лактионов К.К., Мочальникова В.В., Зборовская И.Б. Сравнительный анализ экспрессии белков Arf6, RalA и BIRC5 при НМРЛ.//Молекулярная биология. - 2011 - Т. 45, №2

3. Т.А. Богуш, Е.А. Дудко, Е.А. Богуш, В.Ю. Кирсанов, О.В. Ковалева, М.И. Давыдов. Тамоксифен как поливалентный ингибитор множественной лекарственной резистентности опосредованной транспортными белками Pgp, MRP1 и LRP.// Российский Биотерапевтический Журнал. - 2009 - №2- С. 4-5.

4. Kovaleva O.V., Knizhnik A.V., Mochalnikova V.V., Favorskaya I.A., Zborovs-kaya I.B. RalA, Arf6 and Birc5 comparative protein expression analysis in NSCL.// Международный симпозиум в рамках Сибирско-Тайваньского Форума «Опыт и перспективы развития сотрудничества между российскими и тайваньскими учеными в области изучения молекулярно-генетических механизмов развития злокачественных новообразований и использования результатов фундаментальных исследований в онкологии», Томск - 16-17 сентября 2009.

5. Knizhnik A., Rybko V., Kovaleva О., Kainov Y., Komelkov A., Tchevkina E. Arf6-dependent signaling contributes to cancer progression in in vivo animal model and lung cancer.// Beatson international cancer conference "Microenvironment, motility and metastasis", Glasgow, Scotland - 5-8 July 2009.

6. Zborovskaya I., Lactionov K.K., Polotsky В., Yudin D., Favorskaya I., Musatkina E., Kochetkova M., Kovaljova O., Mochalnikova V., Arhipova K., Stepanova E., Ahmedov В., Telezhkina A. UNDERLYING MOLECULAR ALTERATIONS IN PROGRESSION OF NSCLC.//Anticancer Research. - 2008 - 28, 5C, 3550-3551.

7. A.C. Дворников, В.А. Рыбко, О.В. Ковалева, А.В. Книжник, К.А. Архипова, Я.А. Каинов, Ю.К. Скрипкин, И.Б. Зборовская. К вопросу о патогенезе и ранней диагностике паранеопластических процессов в дерматологии.//Вестник РГМУ. - 2007 - №6 (59) - С. 50-55.

8. Rybko V., Ukraintsev К., Martinjuk A., Dyakova N., Komelkov A., Kovaleva O. and Tchevkina E. RalA and RalB proteins contribute to metastasis stimulation through-distinct pathways.// 2nd International Congress on "Molecular Staging of Cancer", Mannheim/Heidelberg, -European Journal of Cancer Supplements. -2006 - T.4, №6-C. 31-32.

Подписано в печать: 12.11.2010

Заказ № 4526 Тираж - 75 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Изучение молекулярных механизмов опухолевой прогрессии, приводящих к возникновению у клеток метастатического фенотипа - одна из важнейших задач молекулярной онкологии. Метастазирование, как основной этап прогрессии онкологических заболеваний, включает в себя целый ряд сложных процессов, детальные механизмы которых начали проясняться только сейчас.

В последние 10 лет все больше внимания уделяется изучению роли белков семейства ингибиторов апоптоза, и в частности, сурвивину в процессах опухолевой трансформации и прогрессии. Отличительной особенностью данного белка является характер его экспрессии. Сурвивин экспрессируется, в основном, во время эмбриогенеза и практически отсутствует во всех дифференцированных клетках взрослого организма. В опухолевых клетках различных типов экспрессия сурвивина обычно возобновляется. В связи с этим были предприняты многие попытки использования этого белка в качестве диагностического онкомаркера, а также в качестве маркера течения болезни и мишени противоопухолевой терапии. Совсем недавно начали появляться сведения о возможном участии сурвивина непосредственно в метастазировании, что делает вопрос его изучения еще более актуальным.

Ген сурвивина (BIRC5) интенсивно подвергается альтернативному сплайсингу с образованием нескольких белковых изоформ, каждая из которых может выполнять различные и, в то же время, пересекающиеся функции. Предполагается, что изоформы сурвивина локализуются в нескольких внутриклеточных компартментах и вносят разный вклад в течение заболевания, а значит, имеют различное прогностическое значение. Сурвивин может фосфорилироваться киназами Cdkl, Aurora В и РКА., и эти посттрансляционные механизмы обеспечивают белковую стабильность сурвивина и контролируют его транспорт между клеточными компартментами. Многие известные онкогены могут активировать экспрессию сурвивина и влиять на уровень содержания данного белка. Кроме того, некоторые химические вещества, например никотин (Dasgupta et al., 2006), связанный с возникновением одного из самых неблагоприятно текущих и сложно поддающихся лечению онкологических заболеваний -рака легкого (PJI), также могут активировать экспрессию и продукцию сурвивина.

Данная работа посвящена изучению путей внутриклеточной передачи сигналов, ассоциированных с сурвивином, на моделях клеточных линий PJI в поисках новых потенциальных сурвивин-зависимых маркеров прогноза и течения болезни и сравнительному анализу уровня продукции данного белка в коллекции образцов опухолевой и нормальной ткани легкого.

Целью работы является исследование экспрессии различных изоформ сурвивина при немелкоклеточном раке легкого (HMPJI) и их влияние на клеточные характеристики, ассоциированные с процессом опухолевой прогрессии.

В соответствии с указанной целью предполагается решить следующие экспериментальные задачи:

1. Провести анализ уровня экспрессии различных изоформ сурвивина на уровне мРНК и белка в коллекции образцов HMPJI с последующим анализом полученных результатов в отношении клинико-морфологических критериев: гистологического типа опухоли, ее дифференцировки, наличия регионарных и отдаленных метастазов у пациентов.

2. Получить производные клеточных линий рака легкого человека, стабильно экспрессирующие сурвивин дикого типа и сурвивин-2а.

3. Изучить влияние экспрессии экзогенного сурвивина дикого типа и сурвивина-2а на важнейшие свойства трансформированных клеток, ассоциированные с процессом опухолевой прогрессии (уровень пролиферации, подвижность (тест на «зарастание раны» in vitro), способность к колониеобразованию в условиях прикрепленного и неприкрепленного роста, инвазия in vitro и др.).

4. Сравнить метастатический потенциал полученных клеточных линий in vivo.

5. Исследовать влияние экзогенного сурвивина дикого типа и сурвивина-2а на экспрессию и функциональную активность белков, потенциально вовлеченных в процесс опухолевой прогрессии.

Таким образом, данное исследование представляется чрезвычайно актуальным, поскольку позволяет обнаружить сурвивин-зависимые изменения молекулярно-биологических характеристик трансформированных клеток при опухолевой прогрессии и сопоставить эти данные с результатами, полученными при исследовании клинического материала.

2. Обзор литературы

6. Выводы

1. Экспрессия мРНЕС и белка сурвивина увеличивается в 83% и 70% случаев НМРЛ соответственно, что позволяет считать экспрессию сурвивина возможным маркером опухолевого роста при РЛ.

2. Впервые показано, что экспрессия сурвивина дикого типа оказывает комплексное, но разнонаправленное влияние на уровень "агрессивности" фенотипа клеточных линий аденокарцином легкого.

3. Экспрессия сурвивина дикого типа увеличивает подвижность и способность к направленной миграции клеточной линии Н1299, что коррелирует с повышением экспрессии интегрина-(31 и фибронектина, а также статусом фосфорилирования белков фокальных контактов (БАК, паксиллина, РЬСу1).

3. Показано сурвивин - зависимое усиление инвазивного потенциала клеточной линии Н1299, что коррелирует с активацией внеклеточной протеазы иРА.

4. Показано сурвивин - зависимое повышение скорости пролиферации клеточной линии Н1299, что коррелирует с увеличением уровня фосфорилирования ЕЯК1/2.

6. Впервые показано влияние экспрессии сурвивиин-2а на инвазивную способность клеток НМРЛ.