Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Экспериментальное изучение фармакокинетики и метаболизма оригинального селективного анксиолитика афобазола

ДИССЕРТАЦИЯ
Экспериментальное изучение фармакокинетики и метаболизма оригинального селективного анксиолитика афобазола - диссертация, тема по медицине
АВТОРЕФЕРАТ
Экспериментальное изучение фармакокинетики и метаболизма оригинального селективного анксиолитика афобазола - тема автореферата по медицине
Виглинская, Анастасия Олеговна Москва 2007 г.
Ученая степень
кандидата медицинских наук
ВАК РФ
14.00.25
 
 

Автореферат диссертации по медицине на тему Экспериментальное изучение фармакокинетики и метаболизма оригинального селективного анксиолитика афобазола

ВИГЛИНСКАЯ АНАСТАСИЯ ОЛЕГОВНА

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ФАРМАКОКИНЕТИКИ И МЕТАБОЛИЗМА ОРИГИНАЛЬНОГО СЕЛЕКТИВНОГО АНКСИОЛИТИКА АФОБАЗОЛА

14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 2007

003062356

Работа выполнена в ГУ НИИ фармакологии

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН

доктор биологических наук

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

доктор биологических наук

имени В.В. Закусова РАМН

Середенин Сергей Борисович Колыванов Геннадий Борисович

Воронина Татьяна Александровна Соколов Андрей Владимирович

Ведущая организация: ГОУ ВПО "Московский государственный медико-стоматологический университет" Росздрава

Защита диссертации состоится « ¿¿У» мая 2007г. в /Ц, час на заседании диссертационного совета Д. 001.024.01 в ГУ НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН по адресу: 125315, Москва, ул. Балтийская, д.8.

С диссертацией можно ознакомиться в ученой части ГУ НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН по адресу: 125315, Москва, ул. Балгайская, д.8.

Автореферат разослан «_ » ОИ^ЛлЛД^ 2007г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

Е.А. Вальдман

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Проблема создания селективных анксиолитиков, сходных по противотревожным свойствам с бензодиазепинами, но не обладающих их гипноседативными, миорелаксантными, амнестическими эффектами, не вызывающих зависимости и синдрома отмены, является центральной в современной психофармакологии (Середенин С.Б. с соавт., 1998; Briley М., Nutt D., 2000).

Фундаментальные исследования генетических различий в действии типичных транквилизаторов и анализ механизмов диссоциации их анксиолитического и седативного влияния показали, что анксиоселективный эффект может быть достигнут при коррекции изменений в ГАМКд рецепторе, развивающихся при эмоционально-стрессовой реакции и приводящих к снижению связывающей способности бензодиазепинового участка (Середенин С.Б. с соавт., 1989; Середенин С.Б.с соавт., 1998; Seredenin S.B., 2003).

Итогом этих работ явился целенаправленный синтез, выполненный под руководством B.JI. Савельева, и фармакологическое изучение соединения 5-этокси-2-[2-(морфолино)-этилтио]-бензимидазола дигидрохлорида, получившего название афобазол. Установлено, что афобазол предотвращает стресс индуцированное падение бензодиазепиновой рецепции в нейрональных мембранах и обладает селективными анксиолитическими свойствами (Середенин С.Б. с соавт., 1998; Seredenin S.B., 2003). Экспериментальные результаты подтверждены в клинических исследованиях (Незнамов Г.Г. с соавт., 2001). Препарат зарегистрирован в РФ в качестве селективного анксиолитика 3 ноября 2005г, № ЛС - 000861.

Необходимым этапом разработки оригинального лекарственного средства является экспериментальное изучение его фармахокинетики и метаболизма. При этом выясняется, в каком количестве от введенной дозы препарат всасывается из места введения и поступает в системный кровоток и, соответственно, к месту его биологического действия. При введении внутрь важно знать, какая часть препарата подвергается биотрансформации, а какая попадает в системный кровоток в неизмененном виде. Необходимо изучить основные пути метаболизма исследуемого соединения с идентификацией и дальнейшим изучением фармакологической активности метаболитов.

Другой задачей фармакокинетических исследований является изучение абсолютной и тканевой биодоступности соединений, что помогает выбрать оптимальный

путь введения препарата и оценить интенсивность его проникновения в орган-мишень (Жердев В.П., Литвин А.А., 2005).

Диссертация выполнена в соответствии с плановой темой НИР ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН "Изучение механизмов эндо и экзогенной регуляции функций ЦНС, разработка новых оригинальных нейропсихотропных средств". (№ госрегистрации 01.2006 06601).

Целью работы явилось экспериментальное изучение фармакокинетики афобазола и его метаболитов. Для ее достижения были поставлены следующие задачи:

1. Разработать аналитический метод количественного определения афобазола и его метаболитов в биологическом материале с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии.

2. Провести идентификацию метаболитов афобазола на основе высокоэффективной жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии.

3. Изучить фармакокинетику неизмененного афобазола и его основных метаболитов в плазме крови и органах крыс после однократного внутрибрюшинного введения.

4. Изучить фармакокинетику афобазола и его основных метаболитов в плазме крови крыс после однократного перорального введения.

5. Определить абсолютную биологическую доступность афобазола.

6. Изучить экскрецию неизмененного препарата и его метаболитов с мочой и калом в эксперименте.

7. На основании результатов проведенных исследований выработать рекомендации по фармакологическому изучению метаболитов афобазола.

Научная новизна работы. Впервые изучена биотрансформация и фармакокинетика нового селективного анксиолитика афобазола у крыс, определены стандартные фармакокинетические параметры. Установлено, что при различных путях введения афобазол подвергается интенсивной биотрансформации, и уже в первые минуты в плазме крови и органах крыс регистрируются значительные концентрации его метаболитов. По данным масс-спектральных характеристик и встречного химического синтеза были идентифицированы 5 метаболитов афобазола. Установлено, что основными продуктами биотрансформации афобазола являются: метаболит М-3 (гидроксилированный по ароматическому кольцу бензимидазольного цикла) и метаболит 11 (окисленный по морфолиновому кольцу).

Афобазол и его метаболиты определяются в плазме крови и органах животных в течение 3-х часов. В результате проведенного исследования установлено, что для

афобазола характерна средняя степень проникновения в орган-мишень мозг и высокая абсолютная биодоступность.

Практическая значимость работы. На основании данных исследований методом высокоэффективной жидкостной хроматографии идентифицированы метаболиты афобазола. Синтезирован метаболит М-11, который предложен для дальнейшего фармакологического изучения. Перспектива создания лекарственных форм для орального применения афобазола подтверждена его высокой степенью абсолютной биодоступности в эксперименте. Фармакокинетические параметры, установленные в настоящей работе, использованы для разработки схем применения афобазола в клинике, для проведения работ по оценке безвредности препарата.

Совокупность данных диссертационного исследования вошла в комплект документов, представленных для регистрации афобазола в качестве лекарственного средства в Министерство здравоохранения и социального развития РФ. Апробация работы. Основные результаты работы доложены на IV Международной конференции "Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам" (Москва, 2006г), XV Международном конгрессе по фармакологии "Pharmacology in the 21st Century: A Bridge between the Past and the New Molecular Frontiers" (Пекин, 2006г), научно-практической конференции "Новая технологическая платформа биомсдицинских исследований (биология, здравоохранение, фармация)" (Ростов-на-Дону, 2006г), XIV Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 2007г), на лабораторной конференции лаборатории фармакокинетики ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН (Москва, 2007г).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи и 4 тезисов. Объем и структура диссертации. Диссертация содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, 3 главы результатов собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы, практические рекомендации, библиографический указатель, включающий работы на русском (23) и иностранных языках (105), 27 таблиц, 31 рисунок. Диссертация изложена на 123 страницах машинописного текста.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ АФобазол - 2-(2-морфолиноэтилтао)-5-этоксибензилимидазола дигидрохлорид. М.м. 380,35. Белый кристаллический порошок, хорошо растворим в воде, умеренно в спирте. В работе использовалась субстанция препарата сер. 0804001Р производства Erregierre SpA., Италия. В отделе химии ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН были синтезированы метаболиты афобазола1: М-3 - 2-(2-морфолиноэтилтио)-5-гидроксибензимидазол; М-6 - 2-(2-оксиэтилтио)-5-этоксибензимидазол; М-7 - 2-(2-морфолиноэтилсульфинил)-5-этоксибензимидазол; М-11 - 2-[2-(3-оксоморфолин-4-ил)этилгао]-5-этоксибензимидазол; М-14 - 2,3-дигадро-6(7)-этокситиазоло[3,2-а]бензимидазол.

Экспериментальные животные. Фармакокииетику афобазола и его метаболитов после внутрибрюшинного, внутривенного и перорального введения изучали на беспородных крысах (самцы массой 200±20г). Животным однократно внутрибрюшинно, перорально и внутривенно вводили водный раствор афобазола в дозе 25 мг/кг. Образцы крови и органов получали после декапитации животных в дискретные интервалы времени: 0,017; 0,042; 0,083; 0,25; 0,5; 0,75; I; 1,5; 2,0 и 3,0 ч. На каждый интервал времени использовали по 8 животных.

Изучение экскреции проводили на 20-ти крысах-самцах массой 180-200г. Животные были разбиты на 2 группы по 10 особей в каждой (2 контрольных и 8 опытных). Животным первой группы вводили афобазол внутрибрюшинно, второй -перорально в дозе 25 мг/кг. У каждой крысы первой группы собирали суточную мочу и кал, у крыс второй группы собирали суточный кал.

Масс-спектрометрический анализ афобазола и его метаболитов в плазме крови крыс. Масс-спектры метаболитов определяли, используя жидкостной хроматограф Agilent Technologies модели 1100 с масс-спектрометрическим и диодноматричным детекторами со следующими техническими характеристиками: дегазатором модели G1322A, насосом модели G1311A, скоростью потока 0,7 мл/мин. Детектирование проводили в режиме как позитивной, так и негативной ионизации по полному ионному току, при этом напряжение на фрагменторе составило 70В, температура азота - 350 °С,

1 Синтез осуществлен_

| канд. хим. наук В.Л. Савельевым | и канд. хим. наук Т.Я. Можаевой

расход - 11 мл/мин, давление небулайзера - 240 кПа, напряжение на капилляре -3500В2.

Метод количественного определения афобазола и его метаболитов в плазме крови, гомогенатах органов, тканей и экскрементов крыс с применением ВЭЖХ. Анализ биологических образцов крыс, содержащих афобазол и его метаболиты, проводили с использованием метода высокоэффективной жидкостной хроматографии на хроматографе "Perkin Elmer" (США), состоящем из изократической помпы - «РЕ-290», УФ-детектора - «РЕ-230» и компьютера с соответствующим пакетом программ для обсчета хроматограмм.

Условия хроматографирования: аналитическая колонка Luna С-18 (2) "Phenomenex" (4,6x250 мм; 5 мкм); подвижная фаза - 0,1 М глициновый буфер (рН 3,4): ацетонитрил (100:25); скорость подвижной фазы - 1,5 мл/мин; детектирование -300 нм. Количество афобазола и его метаболитов в хроматографических фракциях определяли методом нормализации по данным калибровки с внешним стандартом. В изучаемом диапазоне 0,125-5,0 мкг/мл концентраций отмечена линейная зависимость между концентрациями анализируемых соединений и соответствующих площадей пиков, которые описывались следующими уравнениями: для афобазола - S=-25,04+350,84хС (г=0,9998); для М-6 - S = -3,83+228,ОЗхС (г=0,999б); для М-7 - S = -14,04+571,49хС (г=0,9999) и для М-11 - S -18,51+283,81хС (г=0,9994), где S - площадь хроматографического пика афобазола/метаболита. В этих условиях времена удерживания составили, соответственно, для афобазола - 5,3 мин, М-6 - 3,25 мин, М-7 - 4,15 мин и М-11 - 7,20 мин. Предел обнаружения разработанного метода для неизмененного препарата, М-6 и М-11 составляет 100нг/мл, для М-7-70нг/мл.

Относительная ошибка метода для афобазола не превышала - 9,09%, для М-6 -8,47%, для М-7 - 9,35% и для М-11 - 8,33%.

Обработка биологических проб, экстракция афобазола и его метаболитов из биологических образцов. Афобазол и его метаболиты экстрагировали из плазмы крови, гомогенатов органов (тканей) и экскрементов диэтиловым эфиром. К опытным образцам добавляли 20-ти кратный объем диэтилового эфира и экстрагировали в течение 15 мин на электрическом встряхивателе. Экстракцию проводили дважды.

2 Масс-спектрометрический анализ метаболитов афобазола проведен на базе Государственного научного центра по антибиотикам Министерства промышленности, науки и технологий РФ

Эфирные экстракты объединяли и упаривали в токе азота. Сухой остаток растворяли в 0,3-1 мл подвижной фазы, 50 мкл полученного раствора вводили в петлю инжектора хроматографа. Процент экстракции афобазола составил 90,10 ± 2,04; М-б - 89,9 ± 2,43; М-7 - 91,0 ± 3,10 и М-11 - 91,9 ± 2,23 (среднее из трех определений на точку).

Глюкуроноконъгогированные фракции метаболитов афобазола определяли в моче после ее предварительной инкубации с добавлением фермента ß-глюкуронидазы в количестве 3000 ед на 1,0 мл при температуре 23°С в течение 24 часов. Затем добавляли 20-кратный объем диэтилового эфира и встряхивали в течение 15 минут. Дальнейшая процедура соответствовала извлечению изучаемых соединений из плазмы крови, гомогенатов органов (тканей) и экскрементов.

Фармакокинетические параметры. используемые для интерпретации экспериментальных данных. Основные фармакокинетические параметры рассчитаны модельно-независимым методом (программа "M-IND") (Агафонов A.A., Пиотровский В.К., 1991):

- AUCo-ю (мкг/млхч) - площадь под фармакокинетической кривой (площадь под кривой концентрация лекарственного вещества - время) после внутривенного и перорального введения крысам. AUCo«, рассчитывается от момента введения до бесконечности времени;

- Со (мкг/мл) - концентрация препарата в плазме крови после внутривенного введения в нулевой момент времени;

- Тщах (ч) - время достижения максимальной концентрации препарата в плазме крови после перорального введения;

- Ста* (мкг/мл) - максимальная концентрация лекарственного вещества (ЛВ) в плазме крови после перорального введения;

- Cmax/AUC (ч"1)- параметр, характеризующий скорость всасывания препарата в системный кровоток;

- MRT (ч) - среднее время пребывания JIB в организме;

- Kei (ч"1) - константа элиминации, параметр, характеризующий скорость выведения препарата из организма;

- ti/2ei (ч) - период, за который выводится половина введенной и всосавшейся дозы ЛВ.

- fT - тканевая доступность, рассчитывается по формуле: fT = AUCT о-ш / AUCP о-ю, где AUQ о«D - AUC в ткани, AUCP о-ю- AUC в плазме крови;

- firms - степень превращения фармакологического вещества в метаболит, выражающаяся отношением AUCmo^/AUC 0-о> , где AUCmo-» - площадь под фармакокинетической кривой метаболита; AUCo - площадь под фармакокинетической кривой исходного соединения;

- f„ - абсолютная биодоступность, рассчитывалась по формуле:

fa = AUCp0o-«/AUC,vo^jxlOO%, где AUCpoo-oo- AUC в плазме крови после перорального введения препарата, AUClvo-<» - AUC в плазме крови после внутривенного введения препарата.

Статистическая обработка полученных результатов. Полученные экспериментальные данные были подвергнуты математической статистической обработке с помощью программы "Excel v.7.0". В таблицах представлены средние арифметические значения величин (*), стандартные отклонения (SD), стандартная ошибка среднего арифметического (S х ), коэффициент вариации (C.V.) Достоверность различий для сравниваемых концентраций исследуемых соединений оценивали с помощью критерия Стьюдента (программа "Statistica 5.0") (Сергиенко В.И., Бондарева И.Б., 2001).

Поскольку на каждую временную точку использовали по 8 животных, результирующая фармакокинетическая кривая была построена по усредненным концентрациям, поэтому при расчетах фармакокинетических параметров отсутствует статистическая обработка результатов.

Рисунки были выполнены с использованием графического редактора "Origin

v.7.0"

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Биотрансформация афобазола у крыс

Исследование метаболизма афобазола с применением масс-спектрометрического анализа позволило обнаружить наряду с неизмененным препаратом 17 продуктов его биотрансформации. Метаболиты нумеровались в соответствии с их временами удерживания на аналитической колонке. В результате сравнительного анализа хроматографических и масс-спектральных свойств соединений 3, 6, 7, 11, 14 и синтезированных стандартов установлена их полная идентичность. Другие метаболиты, для которых в настоящее время нет соответствующих стандартов, были

охарактеризованы только по значениям молекулярных ионов (Колыванов Г.Б. с соавт., 2006). В качестве основного идентифицирован метаболит - М-11.

На рисунке 1 представлена схема биотрансформации афобазола, составленная на основе данных, полученных при определении афобазола и его биопроизводных в плазме крови, моче и кале крыс. Как видно из схемы, основными путями метаболизма афобазола являются окислительные процессы.

Анализ идентифицированных метаболитов показал, что в наибольших количествах в плазме крови животных регистрируются метаболит М-3 (продукт гидроксилирования бензольного кольца в 5-ом положении бензимидазольного цикла) и метаболит М-11 (продукт окисления 3-го атома углерода морфолинового кольца). В значительно меньших количествах в плазме крови обнаружены метаболиты М-6 (продукт окисления гетероатома серы), М-7 (отщепление морфолинового фрагмента с последующим гидроксилированнем алифатического радикала) и М-14 (отщепление морфолинового фрагмента с последующей циклизацией).

О

ОН

¡.^Б-СН г-СНуМ^З3 й глюкуронид

й о

сульфон афобазола

1

М-6 й о (Згу8-сн2-снтмЗ>

М-3 А

он

афобазол

С 2 н 5-0 -^^Ч^з _сн 2—с н 2

э—СН 2—СН 2ОН \

М-3

С9Н

2П 5

м

°10г;«-снгснгМэ н М-11 |

М -14 ^

н2

Рис.1. Схема биотрансформации афобазола на основании данных масс-спектрометрического анализа плазмы крови, мочи и кала крыс и встречного химического синтеза.

Образование метаболита М-14, являющегося смесью двух трициклических изомеров, можно рассматривать как результат процесса разрыва связи СНг-N с отщеплением морфолинового фрагмента и дальнейшей циклизацией по атомам азота. Второй путь - взаимодействие с молекулой Н2О, приводит к образованию оксиэтильного производного афобазола метаболита М-7. Возможность образования метаболита М-14 из М-7 не опровергается.

Таким образом, основные направления биотрансформации афобазола у крыс заключаются в образовании метаболитов - гидроксилированных по ароматическому кольцу бензимидазольного цикла и окисленных по морфолиновому кольцу. Реакции гидроксилирования бензимидазольного фрагмента подтверждаются литературными источниками по биотрансформации таких производных бензимидазола как ланзопразол, омепразол, пантопразол, альбендазол и др. (Karol M.D. et al., 1995; Pearce R.E. et al., 1996; Andersson T. et al., 1993; Cederberg C. et al., 1989; Gyurik R.J. et al., 1981; Huber R. et al., 1995).

В моче и кале животных, как показали проведенные исследования, основным метаболитом афобазола является М-3 (гидроксилированная форма по 5-му положению бензимидазольного цикла). Кроме того, в моче крыс обнаружена глюкуроноконъюгированная форма метаболита М-3.

В моче и кале крыс также идентифицированы метаболиты афобазола: М-6, М-7, М-11 и сульфон афобазола. По-видимому, метаболит М-6 (сульфоксид афобазола) подвергается вторичной необратимой реакции окисления, в результате которой образуется сульфон афобазола.

Циклизованная форма метаболита М-7, присутствующая в плазме крови, в моче и кале крыс не обнаружена даже в следовых количествах.

Интересно отметить, что М-11, являясь основным метаболитом в плазме крови крыс, в моче определяется в весьма незначительных количествах. Скорее всего, это связано с тем, что он подвергается вторичной биотрансформации в виде реакции гидроксилирования по 5-му углеродному атому бензимидазольного цикла. На опытных хроматограммах в значительных количествах регистрировались дополнительные пики, отсутствовавшие в контроле. Возможно, один из таких пиков принадлежит гидроксилированной форме метаболита М-11. Из литературных источников известно, что обнаруживаемые в плазме крови основные первичные

метаболиты омепразола - 5-гидроксиомепразол и сульфон омепразола вторично биотрансформируются в гидроксисульфон (Andersson Т., Miners J.O. et al., 1994). Основной метаболит альбендазола - сульфон в дальнейшем превращается в два гидроксилированных метаболита по алифатической цепи: 2-гидроксипропилсульфон и 3-гидроксипропилсульфон (Gyurik R.J., Chow A.W. et al., 1981).

Таким образом, основные направления биотрансформации афобазола заключаются в образовании метаболита М-11, а также конъюгированных и неконъюгированных форм метаболита М-3. Незначительная часть от введенной дозы препарата выводится в виде метаболитов М-6, М-7 и сульфона афобазола. Остальные метаболиты регистрируются в чрезвычайно малых количествах.

Фармакокинетика афобазола и его основных метаболитов у крыс

Фармакокинетика афобазола и его основных метаболитов после внутрибрюшинного введения крысам в дозе 25 мг/кг

После внутрибрюшинного введения афобазола уже в первые минуты в плазме крови и органах крыс регистрируются значительные концентрации его метаболитов 6,7 и 11 (М-6, М-7, М-11). Афобазол и метаболиты определяются в плазме крови и органах животных в течение 3-х часов. Снижение концентраций препарата и его метаболитов носят ярко выраженный двухфазный характер (рис.2).

время (час)

Рис.2. Фармакокинетические кривые афобазола и его метаболитов в плазме крови крыс после однократного внутрибрюшинного введения в дозе 25 мг/кг.

Фармакокинетические параметры афобазола и его метаболитов в плазме крови крыс после однократного внутрибрюшинного введения представлены в таблице 1.

Таблица 1. Фармакокинетические параметры афобазола и его метаболитов в плазме крови крыс после однократного внутрибрюшинного введения в дозе 25 мг/кг.

Исходное соединение, метаболиты Фармакокинетические параметры

AUCo-ш, мкг/мл-ч Ттах, Ч Стал, мкг/мл Стах/ AUC ч-1 С1, л/ч-кг Ке,, ч-1 Ti/2 el, Ч MRT, ч Vd, л/кг

Афобазол 1,66 0,04 5,35 3,23 15,04 2,12 0,33 0,35 7,11

М-6 0,24 0,25 0,41 1,57 0,44 0,57

М-7 0,10 0,25 0,19 1,73 0,40 0,53

М-11 0,42 0,25 0,65 1,72 0,40 0,58

Как видно из табл.1, время достижения максимальной концентрации (Ттах) афобазола в плазме крови составило 0,04 часа (2,5 мин), а ее величина - 5,35 мкг/мл. Максимальные концентрации (Стах) метаболитов наблюдались через 15 мин после введения препарата. Анализ параметров кинетики позволяет заключить, что афобазол и его метаболиты быстро выводятся из организма, на что указывают значения констант скорости элиминации из плазмы крови (K«i), которые составили для афобазола - 2,12 ч" 1 и для метаболитов -1,57-1,73 ч"1, соответственно.

Быстрое исчезновение препарата из организма характеризуется также величинами фармакокинетических параметров: среднее время удерживания препарата в организме (MRT) - 0,35 ч для афобазола и 0,53 - 0,58 ч для его метаболитов, период полувыведения препарата из организма (tia ы) составил 0,33 ч для афобазола и 0,40-0,44 для метаболитов.

В то же время быстрое снижение концентраций неизмененного афобазола в плазме крови обуславливает небольшую величину площади под фармакокинетической кривой (AUC=1,66 мкг/ч'мл) и, соответственно, высокий показатель общего клиренса (С1=15,04 л/ч«кг). Величина кажущегося объема распределения (Vd=7,ll л/кг) в 11 раз превышает общий объем жидкости в организме крысы - 0,67 л/кг (Davies В., Morris Т., 1993), что свидетельствует о выраженной способности препарата интенсивно проникать в органы и ткани животных.

Тканевая доступность афобазола и его основных метаболитов у крыс

Распределение афобазола и его метаболитов изучали в органах и тканях, отличавшихся друг от друга различной степенью кровоснабжения, а также в органах, обеспечивающих элиминацию и в органе - зоне потенциального действия: сильно васкуляризованные ткани - селезенка; умеренно васкуляризованные ткани - мышцы; слабо васкуляризованные ткани - сальник; органы, обеспечивающие элиминацию -

печень, почки; зона потенциального действия - мозг. Следует отметить, что печень и почки являются сильно васкуляризованными органами, Афобазол и его метаболиты регистрируются во всех исследуемых органах и тканях, причем в распределении препарата прослеживается значительная гетерогенность.

Абсолютные величины тканевой доступности представлены на рис.3-5.

щ ш.

ДОХ

*■ 1 4

гфобшп М-11

печень селезенка почки

Рис.3. Тканевая доступность (Гг) афобазола и его метаболитов в сильно васку.таризиро ванных органах крыс после однократного внутри брюшин но го введения в дозе 25 мг/кг.

"*1 н

0,50,6 л

Р1

•• 4

мышцы брыжейка

Рис.4. Тканевая доступность (й) афобазола и его метаболитов в умеренно и слабо васкуляризир о ванных органах крыс после однократного внутрибрю шинного введения в дозе 25 мг/кг.

мозг

Рис.5. Тканевая доступность (йг) афобазола к его метаболитов в органе-мишени мозге крыс после однократного внутрибрюшинного введения в дозе 25 мг/кг.

Анализ абсолютных величин тканевой доступности афобазола и его метаболитов показал, что исследуемые соединения интенсивно распределяются в сильно васкуляризированных тканях органов - печени, селезенке и почках (рис.3). Тканевая доступность афобазола и М-7 в системе «печень - плазма крови» характеризируется величинами 2,5 и 2,2; «селезенка - плазма крови» - 1,5 и 1,6; «почки - плазма крови» -1,5 и 3,3, соответственно. Тканевая доступность М-6 В' сильно васкуляризированных тканях составляет 1,4-1,8. Тканевая доступность М-11 в системе «печень - плазма крови» характеризируется величиной 5,8; «селезенка - плазма крови» - 3,3; «почки -плазма крови» - 3,4.

В то же время содержание исследуемых соединений в умеренно и слабо васкуляризированных тканях (мышца, брыжейка) - значительно ниже (рис.4). Так, тканевая доступность афобазола и М-11 в системе «мышцы - плазма крови» - 0,7 и 1.3; «брыжейка - плазма крови» - 0,2 и 0,6, соответственно. Для М-6 величина тканевой доступности в мышцах составила 1,1, а для М-7- 0,8. В брыжейке величины тканевой доступности как для М-6, так и для М-7 являются весьма низкими и составляют 0,6 для М-6, и 0,5 для М-7.

Из полученных данных следует, что афобазол обладает средней интенсивностью проникновения в орган-мишень - мозг. Величина тканевой доступности М-11 в мозге (орган-мишень) составила 0,8, в то время как (£) афобазола в мозге составила 0,6 (рис.5). Это свидетельствует о более интенсивном проникновении М-11 в мозг по сравнению с исходным соединением. Основываясь на полученных данных, можно предположить, что в случае наличия фармакологической активности у метаболита И, данное соединение внесет соответствующий вклад в реализацию фармакологических эффектов афобазола.

Фармакокинетика афобазола и его основных метаболитов после перорального введения крысам в дозе 25 мг/кг

После перорального введения афобазол быстро всасывается в системный кровоток, интенсивно биотрансформируется, и уже в первые минуты в плазме крови и органах крыс регистрируются значительные концентрации его метаболитов М-6, М-7 и М-11. Афобазол и его метаболиты определяются в плазме крови животных в течение 3-х часов. Снижение концентраций препарата и его метаболитов носят ярко выраженный двухфазный характер (рис.6).

Время (час)

Рис.6. Фармакокинетические кривые афобазола и его метаболитов в плазме крови крыс после однократного перорального введения в дозе 25 мг/кг.

Фармакокинетические параметры афобазола и его метаболитов представлены в таблице 2.

Таблица 2. Фармакокинетические параметры афобазола и его метаболитов в плазме крови крыс после однократного перорального введения в дозе 25 мг/кг.

Исходное Фармакокинетические параметры

соединение, АиСо-ю, Ттах, Стах, Стах/ С1, Ке1, ^1/2 с!, МЯТ, Vd,

метаболиты мкг/мл-ч ч мкг/мл АиС ч1 л/ч-кг ч-' Ч ч л/кг

Афобазол 0,81 0,08 1,28 1,59 30,9 1,31 0,53 0,66 23,5

М-6 0,12 0,25 0,15 1,35 0,51 0,85

М-7 0,04 0,25 0,04 1,30 0,53 0,85

М-11 0,55 0,25 0,96 1,45 0,48 0,59

Как видно из таблицы, время достижения максимальной концентрации (Ттах) афобазола в плазме крови составило 0,08 часа (5 мин), а ее величина - 1,28 мкг/мл. Максимальные концентрации (Стах) метаболитов наблюдались через 15 мин после введения препарата.

Анализ параметров кинетики позволяет заключить, что афобазол и его метаболиты быстро выводятся из организма, на что указывают значения констант скорости элиминации из плазмы крови (КеО, которые составили для афобазола - 1,31 ч"1 и для метаболитов: М-6 -1,35 ч"1, М-7 - 1,30 ч'1 и М-11 - 1,45 ч'1, соответственно.

Быстрое исчезновение препарата из организма характеризуется также величинами фармакокинетических параметров: среднее время удерживания препарата в организме (МЯТ) - 0,66 ч для афобазола и для его метаболитов: М-6 - 0,85 ч, М-7 - 0,85 ч и М-11 - 0,59ч и период полувыведения препарата из организма (^д ы) - 0,53 ч для афобазола и для метаболитов: М-6-0,51 ч, М-7-0,53 ч и М-11 -0,48 ч. Фармакокинетика афобазола после его перорального введения крысам существенно отличается от кинетики внутрибрюшинного введения, прежде всего более низкими концентрациями неизмененного препарата и абсолютной величиной площади под фармакокинетической кривой. А11С афобазола после перорального введения в 2 раза меньше, чем после внутрибрюшинного.

Сравнительный анализ величин степеней превращения афобазола в основные метаболиты показал, что препарат интенсивнее метаболизируется в биопродукт М-11 при пероральном введении (0,680), чем при внутрибрюшинном (0,253). Таким образом, в данном случае очевиден эффект первого прохождения через печень при пероральном введении афобазола. В то же время величины степеней превращения афобазола в метаболиты М-6 и М-7 после перорального и внутрибрюшинного способов введения характеризуются приблизительно одинаковыми величинами. Для биопродукта М-6 величина степени превращения составляет при пероральном введении - 0,153, при внутрибрюшинном введении - 0,145. Для метаболита М-7 аналогичный параметр составляет при пероральном введении - 0,044, при внутрибрюшинном введении -0,066. Из этого следует, что эффект первого прохождения афобазола через печень практически не влияет на интенсивность образования метаболитов М-6 и М-7.

Высокие величины степеней превращения афобазола в метаболит М-11 свидетельствуют о том, что один из основных путей биотрансформации препарата заключается в окислении морфолинового кольца.

Абсолютная биодоступность афобазола у крыс

На рис.7 представлены данные по определению абсолютной биодоступности афобазола на основании величин АиС при внутривенном и пероральном введении.

время (час}

Рис.7, Фармакокинетаческие кривые афобазола и AUC (м кг/мл «час) в плазме крови крыс после однократного внутривенного (в/в) и пероральйОго (и/о) введения препарата в дозе 25 мг/кг (n=8; хер ±SD)

Абсолютная биодоступность афобазола после пероральнога введения составляет 43,64%, что указывает на значительную мембранотропноетъ препарата.

Вероятно, после перорального введения афобазол полностью всасывается из желудочно-кишечного тракта крыс в портальный кровоток, затем подвергается эффекту первого прохождения, в результате чего в системный кровоток поступает более 40% от введенной дозы. Таким образом, афобазол интенсивно метаболизируется в организме, при этом небольшая часть от введенной дозы вещества выводится в неизмененном виде. Подобные закономерности характерны для целого ряда производных бензимидазола: астемизола, этомерзола. бемитила, омепраэола, тиабендазола, тиазолобензимидазола и др. (Бойко С.С. и др., 1987, Косолапое В.А. и др., 1996; Dareer S.M. et al.t 1993; Du Souich Р. et al., 2000; Kaiser H.B., 1990; Yasuda S. et al„ 1995).

Важно отметить, что несмотря на эффект первого прохождения через печень при пероральном способе введения, для афобазола характерна высокая степень абсолютной биодоступностн. По-видимому, это связано с тем, что афобазол обладает выраженными мембран отрогшьми свойствами и, независимо от способа введения, интенсивно проникает в органы, в том числе, и метаболижрующие (печень. легкие, селезенка), где подвергается тканевому метаболизму. Площадь иод фармакокинетической кривой афобазола в плазме крови при внутривенном введении характеризуется величиной 1,85 мкг/млхч. При внутрибрюшинном введении - 1,66 мкг/млхч и 0,81 мкг/млхч при пероральном способе введения. Учитывая, что препарат полностью всасывается из ЖКТ в системный кровоток, можно сделать заключение, что афобазол при

гсероральном введении всего лишь в 2,3 раза интенсивнее б иотран сформируется по сравнению с внутривенным введением и в 2,0 раза с внутри брюшинным введением. Полученные результаты полностью подтверждаются литературными данными о высокой степени абсолютной биодоступности большинства соединений бензим ид мольного ряда, которая варьируют и пределах 20-70% (Бойко С,С, и др„ 1987; Косолапое В Л. и др., 1996; Pue M. A. et al., 1993; Regardh C.G. et al., 1990; Regardh C.G., 1986).

Экскреция афобаюла и его метаболитов с мочой и калом кпые

Анализируя данные гго выведению афобазола с мочой после внутри брюшинного введения и с калом после внутрибрюшинного и перорального введения необходимо отметить, что исходное соединение определяется в чрезвычайно малых количествах (содержание в суточной моче в среднем не превышает 0,07% от введенной дозы; в суточном кале после янутрибрюшииного введения определяется не более 0,05% и после перорального введения - не более 0,01%).

Рис. 8. Содержание афобазола в суточной моче и кале после различных способов введения препарата (в/б - внутрибрюшинное введение; п/о - пероральное введение).

Поскольку после внутрибрюшинного введения количество афобазола в кале в 5 раз выше, чем после перорального введения, можно сделать вывод, что препарат полностью всасывается из желудочно-кишечного тракта в системный кровоток (рис.8).

Кроме афобазола в моче и кале крыс регистрировались продукты его биотрансформации. По синтезированным стандартам-свидетелям идентифицированы пять метаболитов: М-3, М-6, М-7, М-11 и сульфон афобазола (рис.9, 10).

» 01 в&елен-

нейлозы

Рис. 9. Содержание афобазола и его метаболитов в суточной моче после внутрибрюшинного введения препарата.

Рис. 10. Содержание афобазола и его метаболитов в суточном кале после внутрибрюшинного и перорального введения препарата.

На хроматограммах мочи крыс в значительных количествах присутствовали пики неизвестных метаболитов. Данные пики отсутствовали на хроматограммах контрольной мочи.

Основным метаболитом афобазола в моче и кале животных является М-3, причем содержание его в моче превышает содержание в кале в 17 раз (рис. 9,10). После добавления к пробам мочи Р-глкжуронидазы и проведения гидролиза количество М-3 увеличилось в 2,4 раза. Таким образом, в суточной моче содержание М-3 в неконъюгированной форме составило 16,7% от введенной дозы афобазола и в конъюгированной форме - 23,2%. В значительных количествах по сравнению с афобазолом и метаболитом М-6 в моче регистрировались М-7 и сульфон афобазола. В то же время метаболиты М-6, М-11 в суточной моче, а также М-6, М-7, М-11 и сульфон афобазола в суточном кале определялись в чрезвычайно малых количествах (рис.9,10).

Полученные нами результаты подтверждают тот факт, что выведение производных бензимидазола в большей степени происходит за счет образования гидроксилированных метаболитов по ароматическому кольцу как в коньюгированных, так и в неконъюгированных формах (Andersson Т. et al., 1994; Cederberg С. et al., 1989; Hongo M. et al., 1992).

Интересно отметить, что метаболит М-7, имеющий гидроксил в алифатическом радикале бензимидазольного цикла не образует глюкуроноконъюгаты. Количественное содержание М-7 в моче до гидролиза с p-глюкуронидазой и после гидролиза характеризовалось одними и теми же величинами. Из литературных источников известно, что реакции сульфоокисления и гидроксилирования производных бензимидазола катализируются ферментами суперсемейства цитохромов Р-450, как CYP3A4 и CYP2C19. Abelo et al. (2000) на примере родственного по химической структуре афобазолу соединения омепразола было показано, что его основными обнаруживаемыми в плазме метаболитами являются гидрокси-омепразол и сульфон омепразола. При этом образование гидроксилированной формы омепразола катализируется CYP2C19, тогда как в образование сульфона в основном вовлечен CYP3A4. Скорее всего, в метаболизме афобазола принимают участие те же изоформы цитохромов.

Следует также отметить, что за одни сутки от введенной дозы препарата с мочой выводится 40% идентифицированных метаболитов, тогда как с калом не многим более 1,3%. Полученные нами результаты в целом подтверждаются литературными данными по изучению экскреции производных бензимидазола. Показано, что 80% метаболитов от введенной дозы омепразола экскретируются с мочой и лишь небольшая часть с калом (Regardh C.G. et al., 1990). После однократного перорального введения ланзопразола приблизительно 20% выводится с мочой в виде коньюгированных и неконъюгированных метаболитов (Hongo М. et al., 1992). Пантопразол подвергается интенсивной биотрансформации с образованием метаболитов, которые на 80% выводятся с мочой. Оставшаяся часть от введенной дозы подвергается желчной экскреции и выводится в виде метаболитов с калом (Steinijans V.W. et al., 1994).

Оценивая в целом результаты изучения экскреции афобазола и его метаболитов с мочой и калом крыс, необходимо отметить следующее. Во-первых, за одни сутки после внутрибрюшинного и перорального введения афобазола с мочой и калом крыс

выводится не более 0,1% неизмененного соединения от введенной дозы препарата. Это указывает на то, что элиминация афобазола из организма крыс происходит почти исключительно за счет биотрансформации препарата в печени.

Во-вторых, суммарное выведение метаболитов с мочой крыс за сутки в среднем в 30 раз превышает выход за то же время метаболитов с калом.

В-третьих, одним из основных направлений биотрансформации препарата является образование гидроксилированных по ароматическому кольцу бензимидазольного цикла метаболитов афобазола.

На основании проведенных фармакокинетических исследований, а также сопоставления полученных результатов с литературными данными, вследствие высокой абсолютной биодоступности афобазола можно рекомендовать применение его пероральных лекарственных форм.

Полученные результаты по изучению фармакокинетики афобазола и его метаболитов при внутривенном, внутрибрюшинном и пероральном способах введения препарата позволяют заключить, что изученное лекарственное вещество и его биопродукты элиминируют из организма животных с высокой скоростью. Поэтому для поддержания эффективных концентраций афобазола в системном кровотоке рекомендуется применение таблетированной лекарственной формы через короткие временные интервалы и в течение длительного времени. Это не может привести к передозировкам, так как афобазол вследствие особенностей своего химического строения и величин тканевой доступности не способен к кумуляции в органах. В то же время для упрощения режима дозирования афобазола необходима разработка лекарственной формы с пролонгированным действием.

В результате исследования количественного соотношения афобазола и его метаболитов возможна косвенная оценка фенотипа окисления (РМ/ЕМ-фенотип) в клинике.

Наконец, афобазол и его метаболит М-11 характеризуются близкими значениями абсолютных величин тканевой доступности в мозге, поэтому очевидна перспектива изучения фармакологической активности основного продукта биотрансформации афобазола - метаболита 11.

Выводы:

1) На основе ВЭЖХ разработана высокочувствительная и селективная методика количественного определения афобазола и его метаболитов в биологическом материале.

2) В результате анализа масс-спектрометрических характеристик наряду с неизмененным препаратом идентифицировано 17 продуктов его биотрансформации. Встречным химическим синтезом подтверждены структуры следующих 5-ти метаболитов афобазола: гидроксилированного по бензимидазольному циклу, окисленного по гетероатому серы, гидроксилированного по алифатическому радикалу, окисленного по морфолиновому фрагменту и циклизованного по атому азота.

3) Установлены различия в количественном содержании и величинах дозозависимых фармакокинетических параметров афобазола и его метаболитов при разных путях введения. После перорального способа введения отмечена более интенсивная биотрансформация, что связано с выраженным "эффектом первого прохождения" препарата через печеночный барьер.

4) Определены основные пути и параметры выведения афобазола и его идентифицированных встречным химическим синтезом метаболитов. Установлено, что за 24 часа после внутрибрюшинного и перорального введения афобазола с мочой и калом крыс выводится не более 0,1% неизмененного .соединения и 42,1% метаболитов от введенной дозы препарата.

5) На основе анализа структуры метаболитов афобазола в органах, тканях и экскрементах крыс определены основные пути биотрансформации препарата: гидроксшшрование по ароматическому кольцу бензимидазольного цикла и окисление по морфолиновому фрагменту.

6) Целесообразность создания лекарственных форм для орального применения афобазола, в том числе и пролонгированного действия, подтверждена его высокой степенью абсолютной биодоступности в эксперименте (43,6%).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Колыванов Г.Б., Виглинская А.О., Литвин A.A., Кравцова О.Ю., Савельев B.JL, Можаева Т.Я., Авдюнина Н.И., Пятин Б.М., Писарев В.В., Жердев В.П., Середенин С.Б. Биотрансформация нового селективного анксиолитика афобазола.// Тезисы 4-й международной конференции "Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам", Москва, 2006, с. 40-41.

2. Zherdev V.P., Kolyvanov G.B., Litvin A.A., Viglinskaya A.O. The role of pharmacokinetic researches in optimization of new anxiolytics drug formulations. // 15th World Congress of Pharmacology. Vol. 27. Suppl. 1. 2006. Beijing, P. 213.

3. Виглинская A.O., Колыванов Г.Б., Литвин A.A., Жердев В.П. Методика количественного определения афобазола и его метаболитов в биологических образцах с применением высокоэффективной жидкостной хроматографии.// Материалы научно-практической конференции "Новая технологическая платформа биомедицинских исследований (биология, здравоохранение, фармация)", 16-17 октября 2006, Ростов-на-Дону, С.8.

4. А.О. Виглинская, Г.Б. Колыванов, A.A. Литвин, О.Ю. Кравцова, В.П. Жердев, С.Б. Середенин С.Б. Биодоступность нового селективного анксиолитика афобазола у крыс.// Клиническая фармакокинетика (приложение к журналу "Качественная клиническая практика").-2007.- Т.4. - №3. -с. ¿ 4~с1Ъ

5. С.Б. Середенин, А.О. Виглинская, Г.Б. Колыванов, A.A. Литвин, О.Ю. Кравцова,

B.П. Жердев. Фармакокинетика афобазола у крыс.// Экспериментальная и клиническая фармакология.-2007.- Т.70. - №2. -с. 69-74.

6. А.О. Виглинская, Г.Б. Колыванов, A.A. Литвин, О.Ю. Кравцова, В.П. Жердев,

C.Б. Середенин С.Б. Тканевая доступность афобазола и его основных метаболитов у крыс. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.-2007.- Т.142. -№5. -с.

7. Виглинская А.О., Колыванов Г.Б., Литвин A.A., Кравцова О.Ю., Жердев В.П., Середенин С.Б. Метаболизм и фармакокинетика нового селективного анксиолитика афобазола у крыс.// Сборник тезисов XIV Российского национального конгресса "Человек и лекарство". Москва, 16-20 апреля 2007, С.

Подписано в печать!?,04.07 г. Формат 60x84/16. Тираж 100 экз. Заказ Х° 1?? Отпечатано в службе множительной техники ГУ РОНЦ РАМН им. H.H. Блохина РАМН 115478, Москва, Каширское го., 24

 
 

Оглавление диссертации Виглинская, Анастасия Олеговна :: 2007 :: Москва

Общая характеристика работы.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Биотрансформация и фармакокинетика производных бензимидазола.

1.1 .Фармакологические свойства производных бензимидазола.

1.2.Ферментные системы метаболизма производных бензимидазола.

1.3.Основные направления биотрансформации производных бензимидазола.

1.4.Фармакокинетика производных бензимидазола.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Объекты исследования.

2.2. Реактивы.

2.3. Экспериментальные животные.

2.4. Методы.

2.4.1. Способ отбора крови.

2.4.2. Масс-спектрометрический анализ афобазола и его метаболитов в плазме крови крыс.

2.4.3. Метод количественного определения афобазола и его метаболитов в плазме крови и органах животных с применением ВЭЖХ.

2.4.4. Обработка биологических проб, экстракция афобазола и его метаболитов из биологических образцов.

2.4.5. Построение калибровочных кривых.

2.4.6. Метрологическая характеристика методик определения афобазола и его основных метаболитов.

2.4.7. Фармакокинетические параметры, используемые для интерпретации экспериментальных данных.

2.4.8. Статистическая обработка полученных результатов.

Глава 3. БИОТРАНСФОРМАЦИЯ АФОБАЗОЛА У КРЫС.

Глава 4. ФАРМАКОКИНЕТИКА АФОБАЗОЛА И ЕГО МЕТАБОЛИТОВ У КРЫС

4.1. Фармакокинетика афобазола после его внутрибрюшинного введения крысам в дозе 25 мг/кг.

4.1.1. Фармакокинетика афобазола и его метаболитов М-6 и М-7 после внутрибрюшинного введения препарата.

4.1.2. Фармакокинетика афобазола и его метаболита М-11 после внутрибрюшинного введения препарата.

4.1.3. Тканевая доступность афобазола и его основных метаболитов у крыс.

4.2. Фармакокинетика афобазола после его перорального введения крысам в дозе 25 мг/кг.

4.3. Абсолютная биодоступность афобазола у крыс.

Глава 5. ЭКСКРЕЦИЯ АФОБАЗОЛА И ЕГО МЕТАБОЛИТОВ С МОЧОЙ И

КАЛОМ КРЫС.

 
 

Введение диссертации по теме "Фармакология, клиническая фармакология", Виглинская, Анастасия Олеговна, автореферат

Актуальность проблемы

Проблема создания селективных анксиолитиков, сходных по противотревожным свойствам с бензодиазепинами, но не обладающих их гипноседативными, миорелаксантными, амнестическими эффектами, не вызывающих зависимости и синдрома отмены, является центральной в современной психофармакологии [19, 44].

Фундаментальные исследования генетических различий в действии типичных транквилизаторов и анализ механизмов диссоциации их анксиолитического и седативного влияния показали, что анксиоселективный эффект может быть достигнут при коррекции изменений в ГАМКд рецепторе, развивающихся при эмоционально-стрессовой реакции и приводящих к снижению связывающей способности бензодиазепинового участка [18,19,111]. Итогом этих работ явился целенаправленный синтез, выполненный под руководством В.Л. Савельева, и фармакологическое изучение соединения 5-этокси-2-[2-(морфолино)-этилтио]-бензимидазола дигидрохлорида, получившего название афобазол. Установлено, что афобазол предотвращает стресс индуцированное падение бензодиазепиновой рецепции в нейрональных мембранах и обладает селективными анксиолитическими свойствами [19,109].

Экспериментальные результаты подтверждены в клинических исследованиях [14]. Препарат зарегистрирован в РФ в качестве селективного анксиолитика 3 ноября 2005г, № ЛС - 000861.

Необходимым этапом разработки оригинального лекарственного средства является экспериментальное изучение его фармакокинетики и метаболизма. При этом выясняется, в каком количестве от введенной дозы препарат всасывается из места введения и поступает в системный кровоток и, соответственно, к месту его биологического действия. При введении внутрь важно знать, какая часть препарата подвергается биотрансформации, а какая попадает в системный кровоток в неизмененном виде. Необходимо изучить основные пути метаболизма исследуемого соединения с идентификацией и дальнейшим изучением фармакологической активности метаболитов. Другой задачей фармакокинетических исследований является изучение абсолютной и тканевой биодоступности соединений, что помогает выбрать оптимальный путь введения препарата и оценить интенсивность его проникновения в орган-мишень [6].

Диссертация выполнена в соответствии с плановой темой НИР ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН "Изучение механизмов эндо-и экзогенной регуляции функций ЦНС, разработка новых оригинальных нейропсихотропных средств" (№ госрегистрации 01.2006 06601).

Целью работы явилось экспериментальное изучение фармакокинетики афобазола и его метаболитов. Для ее достижения были поставлены следующие задачи:

1. Разработать аналитический метод количественного определения афобазола и его метаболитов в биологическом материале с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии.

2. Провести идентификацию метаболитов афобазола на основе высокоэффективной жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии.

3. Изучить фармакокинетику неизмененного афобазола и его основных метаболитов в плазме крови и органах крыс после однократного внутрибрюшинного введения.

4. Изучить фармакокинетику афобазола и его основных метаболитов в плазме крови крыс после однократного перорального введения.

5. Определить абсолютную биологическую доступность афобазола.

6. Изучить экскрецию неизмененного препарата и его метаболитов с мочой и калом в эксперименте.

7. На основании результатов проведенных исследований выработать рекомендации по фармакологическому изучению метаболитов афобазола.

Научная новизна работы Впервые изучена биотрансформация и фармакокинетика нового селективного анксиолитика афобазола у крыс, определены стандартные фармакокинетические параметры. Установлено, что при различных путях введения афобазол подвергается интенсивной биотрансформации, и уже в первые минуты в плазме крови и органах крыс регистрируются значительные концентрации его метаболитов. По данным масс-спектральных характеристик и встречного химического синтеза были идентифицированы 5 метаболитов афобазола. Установлено, что основными продуктами биотрансформации афобазола являются: метаболит М-3 (гидроксилированный по ароматическому кольцу бензимидазольного цикла) и метаболит 11 (окисленный по морфолиновому кольцу). Афобазол и его метаболиты определяются в плазме крови и органах животных в течение 3-х часов. В результате проведенного исследования установлено, что для афобазола характерна средняя степень проникновения в орган-мишень мозг и высокая абсолютная биодоступность.

Практическая значимость работы На основании данных исследований методом высокоэффективной жидкостной хроматографии идентифицированы метаболиты афобазола. Синтезирован метаболит М-11, который предложен для дальнейшего фармакологического изучения. Перспектива создания лекарственных форм для орального применения афобазола подтверждена его высокой степенью абсолютной биодоступности в эксперименте. Фармакокинетические параметры, установленные в настоящей работе, использованы для разработки схем применения афобазола в клинике, для проведения работ по оценке безвредности препарата. Совокупность данных диссертационного исследования вошла в комплект документов, представленных для регистрации афобазола в качестве лекарственного средства в Министерство здравоохранения и социального развития РФ.

Положения, вынесенные на защиту:

1) Разработаны высокочувствительные методы ВЭЖХ и масс-спектрометрии для количественного определения афобазола и его метаболитов в биологических средах.

2) Идентифицированы основные метаболиты афобазола.

3) Установлены фармакокинетические параметры афобазола и его основных метаболитов при внутрибрюшинном и пероральном введении крысам в дозе 25 мг/кг.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на IV Международной конференции "Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам" (Москва, 2006г), XV Международном конгрессе по фармакологии "Pharmacology in the 21st Century: A Bridge between the Past and the New Molecular Frontiers" (Пекин, 2006г), научно-практической конференции "Новая технологическая платформа биомедицинских исследований (биология, здравоохранение, фармация)" (Ростов-на-Дону, 2006г), XIV Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 2007г), на лабораторной конференции лаборатории фармакокинетики ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН (Москва, 2007г).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи и 4 тезисов.

 
 

Заключение диссертационного исследования на тему "Экспериментальное изучение фармакокинетики и метаболизма оригинального селективного анксиолитика афобазола"

Выводы:

1) На основе ВЭЖХ разработана высокочувствительная и селективная методика количественного определения афобазола и его метаболитов в биологическом материале.

2) В результате анализа масс-спектрометрических характеристик наряду с неизмененным препаратом идентифицировано 17 продуктов его биотрансформации. Встречным химическим синтезом подтверждены структуры следующих 5 метаболитов афобазола: гидроксилированного по бензимидазольному циклу, окисленного по гетероатому серы, гидроксилированного по алифатическому радикалу, окисленного по морфолиновому фрагменту и циклизованного по атому азота.

3) Установлены различия в количественном содержании и величинах дозозависимых фармакокинетических параметров афобазола и его метаболитов при разных путях введения. После перорального способа введения отмечена более интенсивная биотрансформация, что связано с выраженным "эффектом первого прохождения" препарата через печеночный барьер.

4) Определены основные пути и параметры выведения афобазола и его идентифицированных встречным химическим синтезом метаболитов. Установлено, что за 24 часа после внутрибрюшинного и перорального введения афобазола с мочой и калом крыс выводится не более 0,1% неизмененного соединения и 42,1% метаболитов от введенной дозы препарата.

5) На основе анализа структуры метаболитов афобазола в органах, тканях и экскрементах крыс определены основные пути биотрансформации препарата: гидроксилирование по ароматическому кольцу бензимидазольного цикла и окисление по морфолиновому фрагменту.

6) Целесообразность создания лекарственных форм для орального применения афобазола, в том числе и пролонгированного действия, подтверждена его высокой степенью абсолютной биодоступности в эксперименте (43,6%).

Ill

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей диссертационной работе изучены биотрансформация и фармакокинетика производного бензимидазола - нового селективного анксиолитика афобазола, разработанного в ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН.

Из анализа литературы следует, что производные бензимидазолов подвергаются интенсивным метаболическим превращениям в организме человека и животных. Так, омепразол полностью метаболизируется в печени, в моче при этом регистрируются 6 метаболитов данного препарата [107,108]. Аналогично, ланзопразол интенсивно метаболизируется в печени, в сыворотке крови регистрируются его 2 основных метаболита [67]. После внутривенного введения 80% от введенной дозы пантопразола подвергается интенсивной биотрансформации с образованием метаболитов, выводимых с мочой [117]. Афобазол в данном случае не является исключением. В результате масс-спектрометрического анализа нами наряду с неизмененным препаратом идентифицировано 17 продуктов его биотрансформации. Ни для одного известного представителя бензимидазольного ряда не обнаружено столь большого числа метаболитов.

По данным масс-спектральных характеристик и встречного химического синтеза были идентифицированы основной метаболит афобазола - 2-[2-(3-оксоморфолин-4-ил)этилтио]-5этоксибензимидазол -М-11, а также метаболиты М-3, М-6, М-7 и М-14.

Следует отметить, что большинство метаболитов относятся к продуктам окисления афобазола. На основании идентифицированных метаболитов в плазме крови крыс очевидно, что основными направлениями биотрансформации афобазола являются гидроксилирование по ароматическому кольцу бензимидазольного цикла и окисление по морфолиновому кольцу. Полученные в данном исследовании результаты по биотрансформации афобазола в плазме крови крыс согласуются с литературными данными. Так, например, ланзопразол и Н259/31 интенсивно метаболизируются в печени с образованием основных гидрокслированных метаболитов вследствие окисления ароматического кольца бензимидазольного цикла [24,75,98].

Из литературных данных известно, что в катализ реакций сульфоокисления и гидроксилирования производных бензимидазола основной вклад вносят такие изоформы цитохромов, как CYP2C19, CYP3A4, CYP1A1 и CYP2C9. Abelo et al. [24] на примере родственного по химической структуре афобазолу соединения омепразола было показано, что образование гидроксилированной формы омепразола катализируется CYP2C19, тогда как в биотрансформацию сульфона омепразола в основном вовлечен CYP3A4, кроме того, омепразол - умеренный конкурентный ингибитор CYP2C9 [80]. Аналогично, реакция образования сульфона ланзопразола катализируется преимущественно изоформой CYP3A4 [98,101], также, показано, что ланзопразол является мощным конкурентным ингибитором CYP2C19 [80]. Для целого ряда производных бензимидазола: омепразола, тиабендазола, ланзопразола, карбендазима показана возможность активации транскрипции гена CYP1A1 [35].

Таким образом, на основании структурного сходства, а также сходства основных направлений биотрансформации афобазола с целым рядом производных бензимидазола, таких как ланзопразол, омепразол, пантопразол, альбендазол, тиабендазол и др., можно предположить, что в катализе реакций гидроксилирования, являющихся основными в метаболизме как афобазола, так и вышеперечисленных препаратов, задействованы те же изоформы цитохромов, а именно CYP2C19, CYP3A4, CYP1A1 и CYP2C9.

Если в ходе дальнейших экспериментов подтвердится данное предположение, то афобазол можно будет целенаправленно назначать совместно с метаболизируемыми системой CYP препаратами, изменяя активность микросомальных монооксигеназ в нужном направлении с целью повышения эффективности проводимой фармакотерапии.

Очень важно отметить, что для изоформ CYP2C9 и CYP2C19 выявлен полиморфизм, то есть распределение в популяции активности этих ферментов не является однородным, а характеризуется наличием двух или более групп, что отразится на эффектах лекарственных средств. Данная проблема межиндивидуальных различий при приеме препаратов, метаболизируемых полиморфными изоформами ферментов, является одной из центральных в клинической фармакологии.

В литературе, описывающей полиморфизм окисления лекарственных средств, часто употребляются другие характеристики фенотипов. Индивидуумов с недостаточным метаболизмом некоторых препаратов называют "poor metabolizers" (или РМ-фенотип) по сравнению с нормальными - " extensive metabolizers " (или ЕМ-фенотип) (U.A. Meyer, 1996) [92]. Метаболический путь, приводящий к полной элиминации лекарства, имеет большое значение. Если поврежденный метаболический путь является минорным, то другие метаболические пути, вовлекающие различные изоформы цитохрома Р-450, могут компенсировать эти потери, следовательно, больших различий в распределении между фенотипами не будет. Однако, если нарушения ассоциированы с основным путем, между фенотипами возникают существенные различия. Повышение концентрации препарата в плазме у пациентов с недостаточно интенсивным метаболизмом может сопровождаться усилением фармакологического эффекта.

Поэтому, базируясь на нашем предположении о вовлеченности полиморфных изоформ CYP2C9 и CYP2C19 в метаболизм афобазола, в клинике чрезвычайно перспективным является исследование количественного соотношения афобазола и его образующихся метаболитов, что позволит выявить и разделить пациентов на группы, характеризующиеся различной степенью интенсивности метаболизма.

Отсюда косвенно можно судить о фенотипе окисления: РМ-фенотип или ЕМ-фенотип.

Афобазол, как и многие другие производные бензимидазолов, характеризуется выраженными мембранотропными свойствами, поэтому при различных способах введения интенсивно проникает в органы и ткани, в том числе, участвующие в I фазе биотрансформации ксенобиотиков, следствием чего является его выраженная биотрансформация.

При внутрибрюшинном и пероральном введении афобазол, подобно другим производным бензимидазола, быстро всасывается, интенсивно биотрансформируется, распределяется по органам и элиминирует из организма с периодом полувыведения 0,53 ч. Из литературных источников известно, что многие производные бензимидазола с большой скоростью всасываются в системный кровоток, и в то же время характеризуются незначительными периодами полувыведения из организма. Например, элиминация бемитила из крови носит двухфазный характер с периодом полувыведения, составляющим в а-фазе 1,11ч, в Р-фазе - 1,86 ч [4], период полувыведения этомерзола составляет 2,43 ч [2,8], период полувыведения омепразола у здоровых лиц равен в плазме 0,5-1 ч [106,107], период полувыведения пантопразола - 1,9 ч [104].

В ходе настоящего исследования было установлено, что несмотря на эффект первого прохождения через печень, при пероральном способе введения для афобазола характерна высокая степень абсолютной биодоступности, которая составляет 43,6%, что еще раз указывает на значительную мембранотропность препарата. Поэтому перспективным является применение пероральных лекарственных форм селективного анксиолитика афобазола.

Установлено также, что афобазол и его метаболиты обладают средней интенсивностью проникновения в орган-мишень мозг.

Сравнительный анализ величин степеней превращения афобазола в основные метаболиты показал, что препарат интенсивнее метаболизируется в биопродукт М-11 при пероральном введении (0,680), чем при внутрибрюшинном (0,253). Таким образом, в данном случае очевиден эффект первого прохождения через печень при пероральном введении афобазола. В то же время величины степеней превращения афобазола в метаболиты М-6 и М-7 после перорального и внутрибрюшинного способов введения характеризуются приблизительно одинаковыми величинами. Для биопродукта М-6 величина степени превращения составляет при пероральном введении - 0,153, при внутрибрюшинном введении - 0,145. Для метаболита М-7 аналогичный параметр составляет при пероральном введении - 0,044, при внутрибрюшинном введении - 0,066. Из этого следует, что эффект первого прохождения афобазола через печень практически не влияет на интенсивность образования метаболитов М-6 и М-7.

Высокие величины степеней превращения афобазола в метаболит М-11 свидетельствуют о том, что один из основных путей биотрансформации препарата заключается в окислении морфолинового кольца.

Анализ абсолютных величин концентраций афобазола и его метаболита 11 при пероральном способе введения показал, что данные величины имели близкие значения, а в некоторых биологических образцах величины концентраций М-11 превышали таковые исходного соединения. Основываясь на полученных данных, можно предположить, что в случае наличия фармакологической активности у метаболита 11, данное соединение внесет соответствующий вклад в реализацию фармакологических эффектов афобазола.

В моче и кале животных, как показали проведенные исследования, основным метаболитом афобазола является М-3 (гидроксилированная форма по 5-му положению бензимидазольного цикла). Причем, содержание его в моче превышает содержание в кале в 17 раз. Кроме того, в моче крыс обнаружена глюкуроноконъюгированная форма метаболита М-3. Также в значительных количествах по сравнению с исходным соединением и метаболитом М-6 в моче регистрировались М-7 и сульфон афобазола. Метаболит М-6 (сульфоксид афобазола) вторично необратимо окисляется с образованием сульфона афобазола.

Важно отметить, что циклизованная форма метаболита М-7, присутствующая в плазме крови, в моче и кале крыс не обнаружена даже в следовых количествах.

Остальные метаболиты афобазола в суточной моче и кале определялись в чрезвычайно малых количествах, в том числе и метаболит М-11, являющийся основным метаболитом в плазме крови крыс. Связано это, скорее всего с тем, что 5-й атом углерода бензимидазольного цикла подвергается вторичной реакции гидроксилирования. Данное предположение подтверждается литературными примерами образования вторичного метаболита омепразола гидроксисульфона [32], а также двух гидроксилированных по алифатической цепи вторичных метаболитов альбендазола - 2-гидроксипропилсульфона и 3-гидроксипропилсульфона [61].

Таким образом, полученные в исследовании результаты подтверждают тот факт, что выведение производных бензимидазола в большей степени происходит за счет образования гидроксилированных метаболитов по ароматическому кольцу как в конъюгированных, так и в неконъюгированных формах [31, 32, 49, 67].

Следует также отметить, что за одни сутки от введенной дозы препарата с мочой выводится 40% идентифицированных метаболитов, тогда как с калом не многим более 1,3%, что подтверждается рядом литературных данных по изучению экскреции производных бензимидазола. Показано, например, что 80% метаболитов от введенной дозы омепразола экскретируются с мочой и лишь небольшая часть с калом [106]. После однократного перорального введения ланзопразола приблизительно 20% выводится с мочой в виде конъюгированных и неконъюгированных метаболитов [67]. Паитопразол подвергается интенсивной биотрансформации с образованием метаболитов, которые на 80% выводятся с мочой. Оставшаяся часть от введенной дозы подвергается желчной экскреции и выводится в виде метаболитов с калом [117].

Анализируя в целом результаты изучения экскреции афобазола и его метаболитов с мочой и калом крыс, важно отметить, что элиминация афобазола из организма крыс происходит главным образом за счет биотрансформации препарата в печени; суммарное выведение метаболитов с мочой крыс за сутки в среднем в 30 раз превышает выход за то же время метаболитов с калом; одним из главных направлений биотрансформации препарата является образование гидроксилированных по ароматическому кольцу бензимидазольного цикла метаболитов афобазола.

На основании проведенных фармакокинетических исследований, а также сопоставления полученных результатов с литературными данными, вследствие высокой абсолютной биодоступности афобазола можно рекомендовать применение его пероральных лекарственных форм.

Кроме того, подтверждена целесообразность применения афобазола в качестве дневного анксиолитика и средства премедикации, поскольку афобазол характеризуется быстрым всасыванием, распределением (в течение 15 мин) и выведением из организма (после 3-х часов определяются следовые количества в плазме как самого препарата, так и его метаболитов).

Полученные результаты по изучению фармакокинетики афобазола и его метаболитов при внутривенном, внутрибрюшинном и пероральном способах введения препарата позволяют заключить, что лекарственное вещество и его метаболиты элиминируют из организма животных с высокой скоростью. Поэтому для поддержания эффективных концентраций афобазола в системном кровотоке рекомендуется применение таблетированной лекарственной формы через короткие временные интервалы и в течение длительного времени. Это не может привести к передозировкам, так как афобазол вследствие особенностей своего химического строения и величин тканевой доступности не способен к кумуляции в органах. В то же время для упрощения режима дозирования афобазола необходима разработка лекарственной формы с пролонгированным действием.

В результате исследования количественного соотношения афобазола и его метаболитов возможна косвенная оценка фенотипа окисления (РМ/ЕМ-фенотип) в клинике.

Наконец, афобазол и его метаболит М-11 характеризуются близкими значениями абсолютных величин тканевой доступности в мозге, поэтому очевидна перспектива изучения фармакологической активности основного продукта биотрансформации афобазола - метаболита 11.

 
 

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2007 года, Виглинская, Анастасия Олеговна

1. Агафонов А.А., Пиотровский В.К. Программа M-ind системы параметров фармакокинетики модельно-независимым методом статистических моментов.//Хим.-фарм.журн., 1991, № 10,с. 16-19.

2. Александровский Ю.А., Лобастов О.С., Спивак Л.И., Щукин Б.П. Психогении в экстремальных условиях.-//М., 1991.

3. Бойко С.С., Бобков Ю.Г., Жердев В.П. Биодоступность бемитила у крыс.// Фармакология и токсикология, -1987,№5,с.54-56.

4. Бойко С.С., Бобков Ю.Г., Жердев В.П, Дворянинов А.А. Изучение фармакокинетики бемитила в эксперименте у крыс.// Хим.-фарм. журн., -1987,№11,с.1288-1291.

5. Бойко С.С., Бобков Ю.Г., Доброхотова Т.А. и др. Экспериментальные и клинические данные о способности бемитила проникать через гематоэнцефалический барьер.// Фармакология и токсикология, -1987,№3,с.79-81.

6. Жердев В.П., Литвин А.А. Роль и организация фармакокинетических исследований.// Клин.фармакокинетика, 2005, №2, с. 1-3.

7. Косолапов В.А., Островский В.А., Спасов А.А. Защитное действие этомерзола в случае острой гипобарической гипоксии и последующей реконвалесценции.// Экспер. и клин, фармакология, -1996,№6,с.51-53.

8. Кравцова О.Ю. Обоснование применения мексидола для фенотипирования глюкуроноконъюгации у животных и человека)/ Автореф. диссер. к.б.н., М., -2005, С.26.

9. Лакин К.М., Крылов Ю.Ф. Биотрансформация лекарственных веществ. М.: Медицина - 1981 - С.344.

10. Миронова О.П., Зарубина И.В., Шабанов П.Д. Этомерзол как антиоксидантное средство.-// Биомед. химия 2003 - №5, с.434-442.

11. Морозов И.С. Методические рекомендации по применению бемитила в психиатрической практике.-//М., 1987, с. 120.

12. Незнамов Г.Г., Сюняков С.А., Чумаков Д.В. и др. Результаты клинического изучения селективного анксиолитика афобазола.// Экспер. и клин, фармакология 2001- № 2, с. 15-19.

13. Пожарский А.Ф., Гарновский А.Д., Симонов A.M. Успехи химии имидазола.// Успехи химии, 1966, №35, с. 261-281.

14. Приходько А.З., Асташкин Е.И. Изучение влияния лекарственных препаратов имидазола и бензимидазола на ферментативные активности цитохрома Р-450 печени мышей).// Хим.фарм.журнал-1992-№3, С.23-25.

15. Сергиенко В.И., Бондарева И.Б. Математическая статистика в клинических исследованиях. М.:ГЭОТАР-МЕД, 2001, - 256 с.

16. Середенин С.Б., Бадыштов Б.А., Егоров Д.Ю.// Исследование содержания продуктов перекисного окисления липидов у инбредных мышей с различным типом эмоционально-стрессовой реакции. Бюлл. эксп. фармакол. мед.- 1989.-N7.- С. 46-48.

17. Середенин С.Б., Воронина Т.А., Незнамов Г.Г. и др. Фармакогенетическая концепция анксиолитического эффекта.// Вестник РАМН. 1998-№11, С.3-9.

18. Смирнов А.В. Фармакологические средства повышения работоспособности.// Из-во Военно-медицинской академии им. А.В. Кирова, Ленинград-1984-с. 31-35.

19. Смирнова JI.А. Фармакокинетика производных бензимидазола как основа для создания новых лекарственных препаратов и оптимальных схем фармакотерапии./ Диссер. д.б.н., Волгоград, -2004, С.338.

20. Спасов А.А., Иежица И.Н., Бугаева Л.И., Анисимова В.А. Спектр фармакологической активности и токсикологические свойства производных бензимидазола (обзор).// Хим.-фарм. журн., -1999,№5,с.6-17.

21. Спасов А.А., Черников М.В., Анисимова В.А. и др. Поиск антигистаминных веществ среди имидазо- и триазолобензимидазолов. //Хим.-фарм. журн., -2000,№2,с.6-10.

22. Abelo A., Andersson Т.В., Bredberg U. et al. Stereoselective metabolism by human liver CYP enzymes of a substituted benzimidazole./ Drug metabolism and disposition, -2000, Vol. 28, № 1, p. 58-64.

23. Ali D.N., Chick B.F. The effect of an oil formulation on the systemic availability of oxfendazole./ Int. J. Parasitol., -1992, Vol. 22, № 4, p. 541543.

24. Ali D.N., Hennessy D.R. The effect of feed intake on the rate of flow of digesta and the disposition and activity of oxfendazole in sheep./ Int. J. Parasitol., -1993, Vol. 23, № 4, p. 477-484.

25. Alvarez-Bujidos M.L., Ortiz A.I., Negro A. et al. Pharmacokinetics of triclabendazole in rabbits./ Сотр. Biochem. Physiol. C., -1993, Vol. 106, № 3, p. 805-808.

26. Andersson Т., Cederberg C., Edvardsson G. et al. Effect of omeprazole treatment on diazepam plasma levels in slow versus normal rapid metabolizers of omeprazole./ Clin. Pharmacol. Ther./,- 1990, Vol.47, p.79-85.

27. Andersson Т., Holmberg J., Rohss K, Walan A. Pharmacokinetics and effect on caffeine metabolism of the proton pump inhibitors, omeprazole, lansoprazole, and pantoprazole./ Br. J. Clin. Pharmacol., -1998, Vol. 45, p. 369-375.

28. Andersson Т., Lagerstrom P.O., Miners J.O. et al. High-performance liquid chromatographic assay for human liver microsomal omeprazole metabolism./ J. Chromatogr.,- 1993 (a), Vol. 619, p. 291-297.

29. Andersson Т., Miners J.O., Tassaneeyakul W. et al. Identification of human liver cytochrome P450 isoforms mediating omeprazole metabolism./ Br. J. Clin. Pharmacol.,- 1993, Vol.36, p.521-530.

30. Andersson Т., Miners J.O., Veronese M.E., Birkett D.J. Identification of human liver cytochrome P450 isoforms mediating secondary omeprazole metabolism./ Br. J. Clin. Pharmacol.,- 1994, Vol.37, p.597-604.

31. Andersson T. Pharmacokinetics, metabolism and interactions of acid pump inhibitors: focus on omeprazole, lansoprazole and pantoprazole./ Clin. Pharmacol.,- 1996, Vol.31, p. 9-28.

32. Andersson Т., Regardh C.G., Dahl-Puustinen M.L., Bertilsson L. Slow omeprazole metabolizers are also poor S-mephenytoin hydroxylators./ Ther. Drug Monit.,- 1990, Vol.12, p.415-416.

33. Backlund M., Weidolf L., Ingelman-Sundberg M. Structural and mechanistic aspects of transcriptional induction of cytochrome P450 1A1 by benzimidazole derivatives in rat hepatoma H4IIE cells./ Eur. J. Biochem.,-1999, Vol.26 l,p.66-71.

34. Backman J.T., Wang J.S., Wen X. et al. Mibefradil but not isradipine substantially elevates the plasma concentrations of the CYP3A4 substrate triazolam./ Clin. Pharmocol. Ther., -1999, Vol. 66, № 4, p. 401-407.

35. Baro F., Brugmans J., Heykants J.J.P. Absorption, metabolism and excretion of pimozide in man./ Clin. Ther., -1972, Vol. 63, p. 239-249.

36. Barradell L.B., Faulds D., McTavish D. Lansoprazole: a review of its pharmacodynamic and pharmacokinetic properties and its therapeutic efficacy in acid-related disorders./ Drugs,- 1992, Vol.44, p. 225-250.

37. Benet L., Zech K. Pharmacokinetics a relevant factor for the choice of a drug?/ Aliment. Pharmacol. Ther., -1994, Vol. 8, p. 25-32.

38. Bliesath H., Huber R., Hartmann M. et al. Pantoprazole does not influence the steady state pharmacokinetics of nifedipine Abstract./ Gastroenterology,- 1994, Vol.106, A55.

39. Blohme I., Idstrom J.P., Andersson T. A study of the interaction between omeprazole and cyclosporine in renal transplant patients./ Br. J. Clin. Pharmacol.,- 1993, Vol.35, p. 156-160.

40. Blume H., Donath F., Warnke A., Schuq. B.S. Pharmacokinetic drug interaction profiles of proton pump inhibitors./ Drug Saf.,- 2006, Vol.29, p.769-784.

41. Borowski P., Deinert J., Schalinski S. et al. Halogenated benzimidazoles and benzotriazoles as inhibitors of the NTPase/helicase activities of hepatitis С and related viruses./ Eur. J. Biochem., 2003, Vol. 270, № 8, p. 1645-1653.

42. Briley M., Nutt D.(eds.) Anxiolytics Birkhauser Verlag - 2000.- P.181

43. Capece В., Perez В., Castells E. et al. Liquid chromatographic determination of fenbendazole residues in pig tissues after treatment with medicated feed./ J. AOAC Int., -1999, Vol. 82, № 5, p. 1007-1016.

44. Caraco Y., Tateishi Т., Wood A.J. Interethnic difference in omeprazole's inhibition of diazepam metabolism./ Clin. Pharmacol. Ther.,- 1995, Vol.58, p.62-72.

45. Cashman J. Stereoselectivity in S- and N-oxygenation by the mammalian flavin-containing and cytochrome P450 monooxygenases./ Drug Metab. Rev., -1998, Vol. 30, p. 675-707.

46. Cavanaugh J.H., Winters E.P., Cohen A., Braeckman R. Lack of effect of lansoprazole on steady state warfarin metabolism./ Gastroenterology,- 1991, Vol.100, A 40.

47. Cederberg C., Andersson Т., Skanberg I. Omeprazole: pharmacokinetics and metabolism in man./ Skand. J. Gastroenterol.,- 1989, Vol.24, p.33-40.

48. Chen С., Andrade J.D. Pharmacokinetic model for simultaneous determination of drug levels in drug and tissues./ J. Pharm. Sci., -1976, Vol. 65, №5, p. 717-724.

49. Chiba K., Kobayashi K., Manabe K. et al. Oxidative metabolism of omeprazole in human liver microsomes: cosegregation with S-mephenytoin 4^-hydroxylation./ J. Pharmacol. Exp. Ther.,- 1993, Vol.266, p. 52-59.

50. Corsini A., Bellosta S., Baetta R. New insights into the pharmacodynamic and pharmacokinetic properties of statins./ Pharm. Ther., -1999, Vol. 84, p. 413-428.

51. Dareer S.M., Tillery K.F., Rose L.M. et al. Metabolism and disposition of a thiazolobenzimidazole active against human immunodeficiency virus-1./ Drug Metab. Dispos., -1993, Vol. 21, № 2, p. 231-235.

52. Davies В., Morris T. Physiological parameters in laboratory animals and humans./ Pharmaceutical Research, 1993, Vol. 10, № 7, p. 1093-1095.

53. Dipiro J.T., Blouin R.A., Pruemer J.M., Sprvill W.J. Concepts in clinical pharmacokinetics. Bethesda: American Society of Health-System Pharmacists 1996. - 200 p.

54. Domagala F., Ficheux H., Hourin G., Barre J. Pharmacokinetics of tenatoprazole, a newly synthesized proton pump inhibitor, in healthy male caucasian volunteers./ Arzneim. Forsch.,- 2006, Vol.56,№ 1, p.33-39.

55. Du Souich P., Besner J., Clozel J. et al. Nonlinear kinetics and pharmacologic response to tiabendazole./ J. Clin. Pharmacol. Ther., -2000, Vol. 67, № 3, p. 249-257.

56. Evans G. A handbook of bioanalysis and drug metabolism. CRC Press -2004. 390 p.

57. Funk H.B., Nathan H.A. Inhibition of growth of microorganisms by benzimidazoles./ Proc. Soc. Exp. Biol. Med.,- 1958, Vol.99, p. 394-397.

58. Gugler R., Jensen J.C. Omeprazole inhibits oxidative drug metabolism: studies with diazepam and phenytoin in vivo and 7-ethoxycoumarin in vitro./ Gastroenterology,- 1985, Vol.89, p.1235-1241.

59. Gyurik R.J., Chow A.W., Zaber B. et al. Metabolism of albendazole in cattle, sheep, rats and mice./ Drug Metab. Dispos., 1981, Vol.9, p.503-508.

60. Hanauer G., Graf U., Meissner T. In vivo cytochrome P450 interactions of the newly developed H+/K(+)-ATPase inhibitor pantoprazole (BY 1023/SK&F 96022) compared to other antiulcer drugs./ Methods Find. Exp. Clin. Pharmacol.,- 1991, Vol.13, p.63-67.

61. Hartmann M., Bliesath H., Zeck K. et al. Pantoprazole does not influence CYP1A2 activity in man Abstract./ Gastroenterology,- 1995, Vol.108, A109.

62. Hennessy D.R., Ali D.N., Tremain S.A. The partition and fate of soluble and digesta particulate associated oxfendazole and its metabolites in the gastrointestinal tract of sheep./ Parasitol., -1994, Vol. 24, № 3, p. 327-333.

63. Hennessy D., Prichard R., Steel J. Biliary secretion and enterohepatic recycling of fenbendazole metabolites in sheep./ J. Vet. Pharmacol. Ther., -1993, Vol. 16, p. 132-140.

64. Hobrecker F. Uber Peductionsproducte der Nitramidverbindungen./ Ber.Dtsch.Chem.Ges., 1872, № 5, p. 920-924.

65. Hongo M., Ohara S., Hirasawa Y. et al. Effect of lansoprazole on intragastric pH: comparison between morning and evening dosing./ Dig. Dis. Sci., 1992, Vol.37, p. 882-890.

66. Horst A., Wiltshire H., Bullingham R. Clinical pharmacokinetics of mibefradil./ Clin. Pharmacokinet., -1998, Vol. 35, № 6, p. 405-423.

67. Huber R., Kohl В., Sachs G. et al. Review article: the continuing development of proton pump inhibitors with particular reference to pantoprazole./ Aliment. Pharmacol. Ther.,- 1995, Vol.9, p.363-378.

68. Janssen P.A.J., Niemegeers C.J.E., Schellekens K.H.L. et al. Pimozide, a chemically novel, highly potent and orally long-acting neuroleptic drug./ Arzneim. Forsch., -1968, Vol. 18, p. 261-279.

69. Janssens M.M. Astemizole. A nonsedating antihistamine with fast and sustained activity./ Clin. Rev. Allergy, -1993, Vol. 11, p. 35-63.

70. Jung F., Richardson Т.Н., Raucy J.L., Johnson E.F. Diazepam metabolism by cDNA-expressed human 2C P450s: identification of P4502C18 and P4502C19 as low Km diazepam N-demethylases./ Drug Metab. Dispos.,-1997, Vol.25, p.133-139.

71. Kaiser H.B. Hl-receptor antagonist treatment of seasonal allergic rhinitis./ Clin. Immunol., -1990, Vol. 86, № 6, p. 1000-1003.

72. Kamilli I., Gresser U., Zollner N. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of different doses of irtemazole in repeated application./ Z-Rheumatol., -1991, Vol. 50, № l,p. 23-28.

73. Karol M.D., Granneman G.R., Alexander K. Determination of lansoprazole and five metabolites in plasma by high-performance liquid chromatography./ J. Chromatogr.,- 1995, Vol. 668, p. 182-186.

74. Karol M.D., Mukherji D., Cavanaugh J.H. Lack of effect of concomitant multidose lansoprazole on single-dose phenytoin pharmacokinetics in subjects./ Gastroenterology,- 1994, Vol.106, A 103.

75. Katsuki H., Nakamura C., Arimori K. et al. Genetic polymorphism of CYP2C19 and lansoprazole pharmacokinetics in Japanese subjects./ Eur. J. Clin. Pharmacol.,- 1997, Vol.52, p. 391-396.

76. Kelly Т., Doble P., Dawson M. Chiral analysis of methadone and its major metabolites (EDDP and EMDP) by liquid chromatography mass spectrometry./ J. Chromatogr. В Analyt. Technol. Biomed. Life Sci.,- 2005, Vol.814, p. 315-323.

77. Knobloch W., Winkelmann G., Rintelen K. Pharmacological action of benzimidazole. I. 1. 2-Mercaptobenzimidazoles// Arch. Pharmaz., 1958, Vol. 291/63, №3,p.l 13-116.

78. Ко J.W., Sukova N., Thacker D. et al. Evaluation of omeprazole and lansoprazole as inhibitors of cytochrome P-450 isoforms. / Drug Metab. Dispos.,- 1997, Vol.25, p. 853-862.

79. Kolars J., Lown K., Schmiedlin-Ren P. et al. CYP3A gene expression in human gut epithelium./ Pharmacogenetics, -1994, Vol. 4, p. 247-259.

80. Kromer W. Similarities and differences in the properties of substituted benzimidazoles: a comparison between pantoprazole and related compounds./ Digestion, -1995, Vol. 56, № 6, p. 443-454.

81. Krosky P.M., Borysko K.Z., Nassiri M.R. et al. Phosphorylation of beta-D-ribosylbenzimidazoles is not required for activity against human cytomegalovirus./ Antimicrob. Agents Chemother., 2002, Vol. 46, № 2, p. 478-486.

82. Kupfer A., Preisig R. Pharmacogenetics of mephenytoin: a new drug hydroxylation polymorphism in man./ Eur. J. Clin. Pharmacol.,- 1984, Vol.26, p. 753-759.

83. Levron J., Gillardin J., Sabbah A. Astemizole: its pharmacokinetics and pharmacologic properties./ Allerg. Immunol. Paris, -1990, Vol. 22, № 6, p. 233-241.

84. Levy R.H., Thummel K.E., Trager W.F. et al. (eds.). Metabolic drug interactions. Lippincott Williams&Wilkins, 2000. - P.793.

85. Li G., Klotz U. Inhibitory effect of omeprazole on the metabolism of midazolam in vitro./ Arzneimittelforschung,- 1990, Vol.40, p.l 105-1107.

86. Lind Т., Andersson Т., Skanberg I., Olbe L. Biliary excretion of intravenous 14C. omeprazole in humans./ Clin. Pharmacol. Ther.,- 1987, Vol.42, p.504-508.

87. Marinac J.S., Balian J.D., Foxworth J.W. et al. Determination of CYP2C19 phenotype in black Americans with omeprazole: correlation with genotype./ Clin. Pharmacol. Ther.,- 1996, Vol.60, p. 138-144.

88. McCreadie R.G., Heykants J J., Chalmers A., Anderson A.M. Plasma pimozide profiles in chronic schizophrenics./ Br. J. Clin. Pharmacol., 1979, Vol. 7, №5, p. 533-534.

89. McNeil Pharmaceutical. Orap (pimozide) tablets hospital formulary information. -Sprin House PA, London, 1984. P. 500.

90. Meyer U.A. Interaction of proton pump inhibitors with cytochromes P450: consequences for drug interactions. / Yale J. Biol. Med.,- 1996, Vol.69, p. 203-209.

91. Miller J. The imidazoles as immunosuppressive agents./ Transplant. Proc., -1980, Vol. 12, № 2, p. 300-303.

92. Miura M. Enantioselective disposition of lansoprazole and rabeprazole in human plasma./ Yakugaku Zasshi., -2006, Vol. 126, p. 395-402.

93. Murray M., Hudson A., Yassa V. Hepatic microsomal metabolism of the anthelmintic benzimidazole fenbendazole: enhanced inhibition of cytochrome P 450 reactions by oxidized metabolites of the drug./ Chem. Res.Toxicol.,-1992, Vol.5,p.60-66.

94. Paine M., Shen D., Kunze K. et al. First-pass metabolism of midazolam by the human intestine./ Clin. Pharmacol. Ther., -1996, Vol. 60, p. 14-24.

95. Pearce R.E., Rodrigues A.D., Goldstein J.A., Parkinson A. Identification of the human P450 enzymes involved in lansoprazole metabolism./ J. Pharmacol. Exp. Ther.,- 1996, Vol.277, p. 805-816.

96. Pedini M., Bistocchi G.A., De Meo G. New heterocyclic derivatives of benzimidazole with germicidal activity HPLC detection of S-fluoro^-^-nitro-2*-fuiyl)benzimidazole (F-0-N02) in biological samples./ Farmaco., -1991, Vol. 46, № 3, p. 509-520.

97. Physicians Desk Reference. 47th ed. Montvale, NJ: Medical Economics Company, 1997.

98. Pichard L., Curi-Pedrosa R., Bonfils C. et al. Oxidative metabolism of lansoprazole by human liver cytochromes P450./ Mol. Pharmacol.,- 1995, Vol.47, p. 410-418.

99. Pinder R.M., Brogden R.N., Sawyer et al. Clonazepam: a review of its pharmacological properties and therapeutic efficacy in epilepsy./ Drugs, -1976, Vol. 12, № 1, p. 37-40.

100. Plein K., Hots J., Wurzer H. et al. Pantoprazole 20 mg is an effective maintenance therapy for patients with gastro-esophageal reflux disease./ Eur. J. Gastroenterol. Hepatol., -2000, Vol. 12, № 4, p. 425-432.

101. Pue M.A., Laroche J., Meineke I., De Mey C. Pharmacokinetics of pantoprazole following single intravenous and oral administration to healthy mail subjects./ Eur. J. Clin. Pharmacol., -1993, Vol. 44, № 6, p. 575-578.

102. Rawden H., Kokwaro G., Ward S., Edwards G. Relative contribution of cytochromes P450 and flavin-containing monoxygenases to the metabolism of albendazole by human liver microsomes./ Br. J. Clin. Pharmacol., -2000, Vol. 49, p. 313-322.

103. Regardh C.G., Andersson Т., Lagerstrom P.O. et al. The pharmacokinetics of omeprazole in humans: a study of single intravenous and oral doses./ Ther. Drug Monit.,- 1990, Vol.12, p. 163-172.

104. Regardh C.G. Pharmacokinetics and metabolism of omeprazole in man./ Skand. J. Gastroenterol.,- 1986, Vol.21, p.99-104.

105. Renberg L., Simonsson R., Hoffmann K.J. Identification of two main urinary metabolites of 14C. omeprazole in humans./ Drug Metab. Dispos.,-1989, Vol.17, p.69-76.

106. Rosenzweig P., Thebault J.J., Caplain et al. Pharmacodynamics and pharmacokinetics of mizolastine (SL 85.0324), a new nonsedative HI antihistamine./ Ann. Allergy, -1992, Vol. 69, № 2, p. 135-139.

107. Sellersville P.A. Orap (pimozide) prescribing information./ Lemmon Company London, 1988, P. 120.

108. Seredenin S.B. Genetic differences in response to emotional stress and tranquilizers./ Psihofarmakol. Biol. Narkol.,- 2003, Vol.3, № 1-2, p. 494-509.

109. Simon W.A. Pantoprazole which cytochrome P450 isoenzymes are involved in its biotransformation./ Gut,- 1995, Vol. 37(Suppl 2), A135.

110. Simons F.E. Recent advances in HI-receptor antagonist treatment. / Clin. Immunol., -1990, Vol. 86, № 6, p. 995-999.

111. Smith D.A., Ackland M.J., Jones B.C. Properties of cytochrome P450 isoenzymes and their substrates. Part 2: Properties of cytochrome P450 substrates./ Drug Discovery Today, -1997, Vol. 2, p. 479-486.

112. Souhaili-el Amri, H, Fargetton, X, Benoit E. et al. Inducing effect of albendazole on rat liver drug-metabolizing enzymes and metabolite pharmacokinetics./ Toxicol. Appl. Pharmacol,- 1988, Vol. 92, p. 141-149.

113. Steinijans V.W, Huber R, Hartmann M. et al. Lack of pantoprazole drug interactions in man./ Int. J. Clin. Pharmacol. Ther,- 1994, Vol.32, p.385-399.

114. Tateishi T, Graham S.G, Krivoruk Y, Wood A.J. Omeprazole does not affect measured CYP3A4 activity using the erythromycin breath test./ Br. J. Clin. Pharmacol,- 1995, Vol.40, p.411-412.

115. Thummel K, Kunze K, Shen D. Enzyme-catalyzed process of first-pass hepatic and intestinal drug extraction./ Adv. Drug Deliv. Rev, -1997, Vol. 27, p. 99-127.

116. Tucker G.T. The interaction of proton pump inhibitors with cytochromes P450. / Aliment. Pharmacol. Ther,- 1994, Vol.8, p. 33-38.1. О №

117. Tybring G., Bottiger Y., Widen J., Bertilsson L. Enantioselective hydroxylation of omeprazole catalyzed by CYP2C19 in Swedish white subjects./ Clin Pharmacol Ther.,-1997, Vol.62, №2, p.129-137.

118. VandenBranden M., Ring B.J., Binkley S.N., Wrighton S.A. Interaction of human liver cytochromes P450 in vitro with LY307640: a gastric proton pump inhibitor./ Pharmacogenetics,- 1996, Vol.6, p.81-91.

119. Virkel G., Lifschitz A., Sallovitz J. et al. Comparative hepatic and extra hepatic enantioselective sulfoxidation of albendazole and fenbendazole in sheep and cattle./ Drug metabolism and disposition, -2004, Vol. 32, № 5, p. 536-544.

120. Wilson B.V., Knudsen T. Pantoprazole. A new acid pump inhibitor against peptic ulcer and reflux esophagitis./ Ugeskr. Laeger., -1996, Vol. 158, № 12, p. 1695-1697.

121. Woodward J.K. Pharmacology of antihistamines./ J. Allergy Clin. Immunol., -1990, Vol. 86, № 4, p. 606-612.

122. Zimmermann A.E., Katona B.G. Lansoprazole: a comprehensive review. / Pharmacotherapy,- 1997, Vol.17, p. 308-326.