Автореферат и диссертация по медицине (14.02.04) на тему:Экспериментальная оценка сочетанного действия психогенного стресса и металлов (на примере алюминия и кадмия) на репродуктивную систему самцов лабораторных крыс

На правах рукописи

МАКУТИНА ВАЛЕРИЯ АНДРЕЕВНА

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОЦЕНКА СОЧЕТАННОГО ДЕЙСТВИЯ ПСИХОГЕННОГО СТРЕССА И МЕТАЛЛОВ

(НА ПРИМЕРЕ АЛЮМИНИЯ И КАДМИЯ) НА РЕПРОДУКТИВНУЮ СИСТЕМУ САМЦОВ ЛАБОРАТОРНЫХ КРЫС

14.02.04 - Медицина труда

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

16 МАЙ 2013

005058495

Москва-2013

005058495

Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Екатеринбургский медицинский-научный центр профилактики и охраны здоровья рабочих промпредприятий» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научный руководитель

Рослый Олег Федорович-доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

Фесенко Марина Александровна - доктор медицинских наук, заведующая лабораторией профилактики нарушений репродуктивного здоровья работников ФГБУ «Научно-исследовательского института медицины труда» РАМН.

Шеина Наталья Ивановна- доктор биологических наук, главный научный сотрудник отдела токсикологии ГБОУ ВПО «Российского национального исследовательского медицинского университета им. Н.И. Пирогова» Минздрава РФ.

Ведущая организация - Федеральное бюджетное учреждение науки «СевероЗападный научный центр гигиены и общественного здоровья»

Защита диссертации состоится « 2013 г. в _ часов на

заседании диссертационного совета Д.001.012.01 при ФГБУ «Научно-исследовательский институт медицины труда» РАМН по адресу: 105275, г. Москва, пр. Буденного, 31.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Научно-исследовательский институт медицины труда» РАМН.

Автореферат разослан «» Ол^С#?^2013 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор

Рубцова Нина Борисовна

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Состояние здоровья человека является интегральной функцией воздействия факторов внешней среды (Галимов Ш.Н. с соавт., 2001). С началом промышленной революции количество неблагоприятных факторов, которые могут оказать влияние на репродуктивную функцию человека, значительно увеличилось. Изменилось также и социокультурное окружение современного человека: интенсивная урбанизация, информационные перегрузки, несоблюдение биологических ритмов приводят к возникновению хронических стрессовых ситуаций. Результатом воздействия совокупности неблагоприятных факторов на репродуктивную систему человека может стать бесплодие, субфертилыюсть, спонтанные прерывания беременности на ранних сроках или появление различных форм патологии у потомства, что является серьезной социально-медицинской проблемой (Рыжаков Д.И. с соавт., 2002). Поскольку качество репродуктивного здоровья во многом определяет демографические перспективы страны, охрана репродуктивного здоровья населения России объявлена важнейшей государственной задачей (Сивочалова О.В., 2008).

По данным ВОЗ, в мире каждая седьмая супружеская пара бесплодна. Частота бесплодных браков в России составляет около 15% среди супружеских пар репродуктивного возраста и имеет тенденцию к росту. В последние годы отмечается увеличение доли мужского фактора в бесплодном браке, которая достигает 30-50% (Галимов Ш.Н. с соавт., 2001). Принято считать, что мужское бесплодие и субфертильность - это патологические состояния репродуктивной системы, которые, при отсутствии врожденных генетических причин, развиваются вследствие суммарных патологических воздействий на организм. Патогенез и структура приобретенного мужского бесплодия продолжают оставаться предметом многочисленных дискуссий в репродуктивной медицине. Так, по данным мониторинга зарубежных криобанков спермы, с середины XX века отмечается стойкая тенденция к снижению качественных и количественных показателей эякулята мужчин, проживающих в технологически развитых странах (CarlsenE., 1992). Предполагается, что это явление служит отражением возрастающего влияния на организм человека сочетаний вредных факторов различной природы, встречающихся в окружающей среде и на производстве.

стрессовых ситуаций (Тер-Аванесов Г.В. с соавт., 2004). Необходимо отметить, что в условиях производства, в том числе при производстве алюминия, многие авторы выделяют широкий спектр вредных факторов, способных оказывать влияние на здоровье работающих: пылевые аэрозоли сложного химического состава, электромагнитные поля, вибрации, психо-эмоциональное перенапряжение и т.д. (Рослый О.В. с соавт., 2012; Калинина O.JI. с соавт., 2012). В связи с вышеизложенным, изучение эффектов сочетанного действия химических токсичных веществ и психогенного стресса является актуальной задачей медицины труда и репродуктивной медицины (Lewis A.S. et al., 2011). В частности, на Всероссийской научно-практической конференции "Современные вопросы оценки и управления профессиональными рисками для здоровья работников в производстве алюминия" отмечено, что токсическое действие самого алюминия, а также сочетания алюминия с другими повреждающими факторами на здоровье работающих ранее недооценивалось (Измеров Н.Ф. с соавт., 2012). Вместе с тем, данные по гонадотропному действию алюминия крайне малочисленны, противоречивы и встречаются лишь в экспериментальных работах при введении больших доз металла (Llobet J.M. et al., 1995; Yousef M.I. et. a!., 2005).

В настоящее время механизмы повреждающего действия соединений кадмия на репродуктивную функцию экспериментальных животных детально изучены. Кадмий считается специфическим репродуктивным токсикантом, повреждающим структуру гематотестикулярного барьера (ГТБ) и процессы сперматогенеза как непосредственно, нарушая плотные клеточные контакты клеток Сертоли, так и опосредованно через изменение нейроэпдокринной регуляции гамето- и стероидогенеза (Cheng C.Y. et. al., 2002; Yang J.M. etal., 2003). Общепризнано, что психогенный стресс, в том числе профессиональный, является фактором, влияющим на мужскую репродуктивную систему (Sheiner E.K. et. al., 2003). Случаи развития симптоматики субфертильности на фоне психогенного стресса неоднократно регистрировались исследователями, и обусловлены преимущественно, изменениями нейроэндокринной и гормональной регуляции функции гонад (Muzino Т., 2006).

Следует указать, что тщательный информационный поиск в доступных нам научных базах данных не выявил сведений литературы, в том числе

экспериментальных, об эффектах сочетанного действия психогенного стресса и металлов (алюминия или кадмия) на мужскую репродуктивную функцию.

Цель работы: выявить в эксперименте закономерности сочетанного действия психогенного стресса и металлов (алюминия и кадмия) на репродуктивную функцию.

Достижение поставленной цели предполагало выполнение следующих задач:

1. Изучить накопление алюминия/кадмия в семенниках и тканях, участвующих в их нейрогуморалыюй регуляции (головной мозг, кровь) при изолированном поступлении и в сочетании с психогенным стрессом;

2. Оценить степень выраженности изменений морфофункциональных показателей репродуктивной функции при изолированном воздействии психогенного стресса и металлов (алюминий и кадмий) на организм самцов лабораторных животных;

3. Выявить степень выраженности изменений аналогичных показателей при сочетанном воздействии психогенного стресса и металлов;

4. Изучить эмбриотропное действие при изолированном и сочетанном воздействии психогенного стресса и металлов.

Научная новизна исследования:

В диссертации впервые проведено комплексное экспериментальное исследование сочетанного действия психогенного стресса и металлов (алюминия и кадмия) на репродуктивную систему самцов лабораторных крыс. Впервые установлено, что при действии психогенного стресса наблюдается однотипный эффект изменения кинетики распределения обоих металлов, различных по токсичности: дополнительное их накопление в семенниках, головном мозге и крови по сравнению с их изолированным поступлением в организм самцов лабораторных животных. Впервые при сочетанном действии металла (алюминия и кадмия) и психогенного стресса выявлены значимые изменения гормонального баланса, индекса напряженности сперматогенеза, количества сперматозоидов с фрагментацией ДНК, увеличение доимплантационной гибели эмбрионов и общей эмбриональной смертности по сравнению с изолированным действием факторов. Впервые выполнена интегральная оценка

антиоксидантной и окислительной активности в гомогенатах семенников экспериментальных животных потенциометрическим методом.

Теоретическая и практическая значимость работы:

Полученные экспериментальные данные уточняют теоретические представления о механизме действия психогенного стресса на репродуктивную функцию, свидетельствуют о модифицирующем влиянии стресса на кинетику и накопление алюминия/ кадмия в семенниках, головном мозге и крови. Показано, что психогенный стресс при изолированном воздействии достоверно увеличивает долю аберрантных делений и содержание сперматозоидов с фрагментацией ДНК, а также сперматозоидов на стадии некроза. Алюминий при изолированном действии на организм лабораторных животных приводит к гонадотропному эффекту в семенниках: снижает выработку свободного тестостерона, увеличивает содержание неподвижных и патологичных по морфологии форм сперматозоидов, повышает долю аберрантных делений и сперматозоидов с фрагментацией ДНК, снижает антиоксидант/оксидантную активность (АОА) в гомогенате семенника, уменьшает долю сперматид в сперматогенном эпителии. При сочетанном воздействии факторов различной природы психогенного стресса и металла (алюминия, кадмия) выявленные повреждения процессов спермато- и спермиогенеза более выражены, увеличение доимплантационной гибели эмбрионов и обшей эмбриональной смертности в группах сочетанного действия достоверно выше контрольных значений.

Данные, полученные в диссертационной работе, использованы при составлении методических рекомендаций «Разработка гигиенических мероприятий по снижению негативного влияния условий труда на здоровье работников, обслуживающих сверхмощные электролизеры в алюминиевой промышленности» (находятся на утверждении) и при чтении курса гигиены на кафедре «Гигиены и экологии» Уральской государственной медицинской академии.

Совместно с сотрудниками Научно-инновационного центра сенсорных технологий Уральского государственного экономического университета разработан и научно обоснован потенциометрический метод интегральной оценки антиоксидантной и окислительной активности в гомогенате семенников лабораторных крыс, а также в эякуляте и семенной плазме человека. Разработанный метод оценки антиоксидантной и окислительной активности в семенной плазме человека внедрен в качестве

диагностического теста для выявления причин нарушения фертильности у пациентов клиник вспомогательных репродуктивных технологий (ФГБУ «Ростовский НИИ акушерства и педиатрии» Минздрава России, отделение охраны репродуктивного здоровья, Ростов-на-Дону; «Центр семейной медицины», Екатеринбург; «Медицинский центр ЭКО и эндоскопической хирургии в гинекологии», Владивосток).

Положения, выносимые на защиту:

1. Изолированное действие кадмия или алюминия вызывает однотипные морфофункциональные изменения репродуктивной функции самцов крыс, различающиеся по степени выраженности: снижение уровня свободного тестостерона в крови, возрастание количества аберрантных делений половых клеток, увеличение патолога ческих по морфологии форм сперматозоидов и сперматозоидов с фрагментацией ДНК, снижение подвижности сперматозоидов, уменьшение доли половых клеток в сперматогенном эпителии, изменение копулятивного поведения.

2. При изолированном воздействии психогенного стресса на фоне повышенного уровня кортикостерона в крови установлено увеличение количества аберрантных делений половых клеток, повышение содержания сперматозоидов с фрагментацией ДНК и сперматозоидов на стадии некроза.

3. Психогенный стресс изменяет кинетику металлов (алюминия и кадмия) в организме животных, вызывая увеличение их накопления в гонадах, в головном мозге и крови. Сочетанное воздействие стресс+апюминий и стресс+кадмий приводит к синергизму по следующим показателям репродуктивной функции: индексу напряженности сперматогенеза и митотически-мейотическому индексу, количеству аберрантных делений, уровню кортикостерона и доле сперматозоидов с фрагментацией ДНК, уровню ранних эмбриональных потерь, в группе «кадмий+стресс» также и по уровню свободного тестостерона. В группе «алюминий+стресс» по концентрации тестостерона отмечается слабое антагонистическое действие.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на конкурсе молодых ученых Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Современные вопросы организации медицины труда и

управления профессиональными рисками», Екатеринбург 27-28 октября 2011 г.; Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Современные вопросы оценки и управления профессиональными рисками в производстве алюминия» Екатеринбург, 24-25 октября 2012 г., «28th annual meeting of the European society of human reproduction and embryology» Стамбул, 1-4 июля 2012; XI Всероссийском конгрессе «Профессия и здоровье» 27-29 ноября 2012 г., Москва.

Публикации. По теме диссертационного исследования опубликовано 16 печатных работ, в том числе 4 работы в периодических изданиях из перечня ведущих рецензируемых научных журналов, утвержденных ВАК Министерства образования и науки России и рекомендованных для публикации основных научных результатов диссертации на соискание искомой ученой степени.

Личный вклад автора. Диссертантом осуществлено планирование, организация и проведение эксперимента, сбор первичного материала, определены объем и методы исследований. Анализ первичного материала автор проводил самостоятельно либо непосредственно принимал участие. Доля автора в статистическом анализе собранного материала составляет 100%.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, глав аналитического обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов и библиографического. Диссертация изложена на 116 страницах компьютерной верстки, содержит 15 таблиц и иллюстрирована 10 рисунками. Список литературы содержит 220 источников, из них 25 отечественных и 195 зарубежных авторов.

Содержание работы Материалы, методы и объем исследования.

Исследования проведены на половозрелых самцах крыс линии Вистар (86 особей) и беспородных самках (86 особей) в соответствии с этическими нормами работы с животными, на основе руководства ВОЗ, зарубежных и отечественных методических рекомендаций и указаний по оценке репродуктивной токсичности химических соединений. В соответствие с поставленной целью и задачами, проведены исследования по схеме, представленной на рисунке 1.

Обзор научной литературы по проблеме, анализ информации по действию кадмия алюминия и стресса на репродуктивную систему

Определение накопления металлов при изолированном поступлении и в сочетании с психогенным стрессом в семенниках, головном мозге и крови

Эмбриотропность

Общетоксическое действие

Сперматогенез

-обзорная гистология

- морфометрия клеток Лейдига

- антиоксидантная активность ткани семенника

- цитологическое исследование мазков клеточных гомогенатов семенника

Спермиогенез

- параметры подвижности сперматозоидов

- морфология сперматозоидов

- апоптоз/некроз

Тестостерон

продуцирующая

функция

семенников

- места имплантации

- желтые тела

- резорбции

- количество живых плодов

- количество мертвых плодов и т.д.

кортикостерон поведенческие реакции - Суммация подпороговых импульсов

1

Анализ полученных данных

Рисунок 1. Схема экспериментальных исследований.

Выделено шесть групп животных (равномерно с учетом массы тела): 1-я группа - самцы, подвергавшиеся стрессированию методом кратковременной иммобилизации (в течение 30 минут) два раза в неделю; 2-я группа - животные, получающие кадмий в виде внутрибрюшинных инъекций хлорида кадмия (0,3 мг С<12+ на кг массы тела) два раза в неделю; 3-я - сочетанное действие кадмия и психогенного стресса в тех же дозировках; 4-я - животные, получающие алюминий в виде внутрибрюшинных инъекций нитрата алюминия (3,8 мг А]3* на кг массы) два раза в неделю; 5-я — сочетанное действие алюминия в тех же дозах и стресса: 6-я —

контрольная группа. Дозы соединений металлов для внутрибрюшинного введения соответствовали 1/10 LD50 и входили в диапазон «минимально действующих» по параметрам общей токсичности (Draft toxicological profile for aluminum, 2006; NIOSH criteria for a recommended standard occupational exposure to cadmium, 1986). По окончанию сперматогенного цикла (54 дня) часть животных каждой группы была умерщвлена передозировкой анестетика. Получены образцы нативных проб эпидимальных сперматозоидов, проб семенников для гистологических и морфометрических исследований, с последующей криоконсервацией оставшейся части образцов (суспензии эпидидимальных сперматозоидов, сыворотки крови, гомогената семенников) для цитологических и инструментальных методов исследований. Изучены весовые коэффициенты следующих внутренних органов самцов: печень, почки, головной мозг, надпочечники, семенники, семенные пузырьки. В образцах семенников, головного мозга и цельной крови определяли концентрацию металлов на атомно-абсорбционном спектрофотометре АА 665 «Shimadzu» по стандартной методике (Методика МУК 4.1.1897-04).

Оценку подвижности и морфологии нативных сперматозоидов осуществляли методом компьютерной микровидеографии на автоматическом анализаторе спермы (Microptic, Испания) по программе производителя дня лабораторных животных. Процентное содержание сперматозоидов на стадиях раннего, позднего апоптоза и некроза проводили на проточном цитофотометре Cytomics FC 500 (Beckman Coulter, США) с использованием комбинированной окраски аннексином V и 7-AAD (BD Bioscienses, США). Степень фрагментации эпидидимальных сперматозоидов определяли на наборе для лабораторных животных Sperm Halomax kit (Microptic, Испания), являющимся модификацией Sperm Chromatin Dispersion теста (тест на дисперсию хроматина).

Гистологическое исследование семенников в исследуемых группах проводили после окраски гематоксилином Эрлиха с докраской эозином (Ухов Ю.И. с соавт., 1983). При обзорной микроскопии отмечали дегенеративные изменения извитых семенных канальцев, интерстициальной ткани и т.д.

В гомогенате семенников цитометрическими методами исследовали процентное содержание различных популяций сперматогенных клеток (сперматогонии.

сперматоциты, сперматиды), клеток Лейдига и Сертоли, рассчитывали отношение суммы клеток сперматогенного эпителия к наиболее резистентным к токсическому воздействию клеткам Сертоли, а также "индекс напряженности сперматогенеза", "герминативный индекс", "митотически-мейотический индекс" (Иванов Ю.И.. 1990).

Антиоксидантную активность (АОА) в аликвотах гомогената тестикулярной ткани измеряли потенциометрическим методом (Brainina Kh. Z. et. al., 2012) на анализаторе для исследования антиоксидантной активности биосубстратов МПА-1 (НПВП ИВА, Россия).

Гормональный профиль самцов оценивали по концентрации в сыворотке крови свободного тестостерона и основного глюкокортикоида у грызунов - кортикостерона методом иммуноферментного анализа (ИФА) на наборах для лабораторных крыс ("Corticosterone" IDS, Великобритания; "Free Testosterone" DSL, Канада) по методикам производителей.

Содержание в сыворотке крови антиспермальных антител (АСАТ) определяли на проточном цитофотометре Cytomics FC500 непрямым методом с FITC-антикрысиной поликлоналыгой сывороткой (Sigma, США) по методике М.А. Николаевой (Nikolaeva М.А. et. al., 2000).

Эмбриотропные эффекгы после спаривания оставшихся самцов с интактными девственными самками оценивали в соответствие с «Методами экспериментального исследования по установлению порогов действия промышленных ядов на генеративную функцию с целью гигиенического нормирования» (1977).

Статистическая обработка данных проводилась при помощи пакета прикладных программ «STATISTICA 6.0» фирмы Install Shield Software Corporation (США) параметрическими и непараметрическими методами. Количественные показатели представлены в виде М ± ш (среднее значение ± стандартная ошибка среднего). В связи с тем, что совокупность данных по каждому оцениваемому параметру внутри группы не превышала 14, для оценки достоверности различий сравниваемых средних между малыми выборками использовали параметрический критерий t Стьюдента (доверительный коэффициент t) и непараметрическим критерием Манна - Уитни. Нулевую гипотезу отвергали при р<0,05. Для оценки сопряженности процессов

использовали корреляционный анализ с определением коэффициентов достоверности корреляций (различия считали достоверными при р<0,05).

Результаты исследований и их обсуждение

Кумуляция алюминия и кадмия в семенниках, головном мозге и крови при изолированном поступлении и в сочетании с психогенным стрессом.

Результаты исследований по оценке содержания металлов в семенниках, головном мозге и в цельной крови представлены в таблицах 1, 2 и на рисунках 2 и 3.

Таблица 1 - Уровни накопления кадмия (Сс12+) в семенниках, головном мозге и в крови самцов крыс.

Показатель/ группа Контроль Стресс Кадмий Кадмий+стресс

Семенник:

Концентрация СсЗ (мкг/г) н.о. н.о. 0,184± 0,016 0,220± 0,030*

% от введенной дозы С(1 на н.о. н.о. 3,147± 0,168 3,756± 0,113*

грамм массы органа

Головной мозг:

Концентрация Сс1 (мкг/г) н.о. н.о. 2,047± 0,136 2,802± 0,248*

% от введенной дозы Сё на н.о. н.о. 34,995±2,328 47,902±5,955*

грамм массы органа

Цельная кровь:

Концентрация Сд (мкг/г) н.о. н.о. 0,036± 0,013 0,059± 0,002*

% от введенной дозы Сс1 на н.о. н.о. 0,608± 0,137 1,010± 0,051*

грамм массы ткани

Примечание: н.о. - ниже порога определения вещества на приборе.

(*) - статистически значимые различия по критерию Вилкоксона-Манна-Уитни (р<0,001) между группами животных при изолированном и сочетанном со стрессом воздействии кадмия.

При изолированном поступлении алюминия и кадмия решстрируется следующее увеличение концентрации металлов в исследуемых органах и тканях: головной мозг > семенники > кровь в соотношениях 1: 0,1: 0,02 и 1: 0,05: 0,02, соответственно. Показатели стабильности гистогематических барьеров (соотношение металла в цельной крови и в исследуемых органах) составили при введении кадмия для гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) - 17,6 х 10"3, для гематотестикулярного барьера (ГТБ) ~ 195,6 х 10'\ при поступлении алюминия данное соотношение

составило для ГЭБ ~ 16,4 х 10"3, для ГТБ ~ 318,6 х 10"3. Анализ стандартизованных величин накопления металлов (доли от введенной дозы на грамм массы органа и общую массу животного) показал практически одинаковые величины кумуляции в семенниках самцов при воздействии обоих металлов, при значительном возрастании накопления алюминия в головном мозге по сравнению с кадмием.

Таблица 2 - Уровни накопления алюминия (А13+) в семенниках, головном мозге и в крови самцов крыс

Показатель/ группа Контроль Стресс Алюминий. Алюминий+стресс

Семенник: н.о. н.о. н.о. н.о. 2,997± 0,476 3,755± 0,597 4,622± 0,428* 5,792± 0,573*

Концентрация А1 (мкг/г) % от введенной дозы А1 на грамм массы органа

Головной мозг: н.о. н.о. и.о. н.о. 58,222± 4,074 72,960* 5,107 81,493± 7,059* 102,121±9,97 0*

Концентрация А1 (мкг/г) % от введенной дозы А1 на грамм массы органа

Цельная кровь: н.о. н.о. н.о. н.о. 0,95 5± 0,104 1,196± 0,131 1,238± 0,475* 1,744± 0,151*

Концентрация А1 (мкг/г) % от введенной дозы А1 на грамм массы ткани

Примечание: н.о. - ниже порога определения вещества на приборе. (*) - статистически значимые различия по критерию Вилкоксона-Манна-Уитни (р<0,001) между группами животных при изолированном и сочетанием со стрессом воздействии алюминия.

При сочетании с психогенным стрессом зарегистрировано статистически значимое увеличение содержания металла (алюминия/кадмия) по всем изученным показателям. Так, дополнительное накопление алюминия у стрессированных животных в семенниках, головном мозге и крови достигало 40%, 54%, 30%, соответственно; кадмия - 37%, 22% и 66%. В связи с тем, что ГТБ и ГЭБ являются специализированными гистогематическими барьерами организма, изменение их проницаемости для химических соединений под влиянием психогенного стресса может оказывать воздействие на нейрогуморапьную регуляцию, . морфо-функциональное состояние и выраженность клеточных повреждений в семенниках, а также иметь отдаленные последствия для потомства.

0,3

0,25

0,2

0,1

0,05

I

♦ кадмии семенник

■ кадмий+стресс семенник

А кадмий кровь

• кадмий+стресс кровь

Семенник кровь

Рисунок 2. Концентрация кадмия в левом семеннике и в крови, мкг/г

1 1

1 1

■ ♦ ♦

♦ 1

1

--ж-+--—.

♦ алюминии семенник

■ алюминий+стресс семенник

▲ контроль семенник

X стресс семенник

▲ алюминий кровь

• алюминий+стресс кровь контроль кровь

— стресс

Семенник кровь

Рисунок 3. Концентрация алюминия в левом семеннике и в крови, мкг/г

Влияние психогенного стресса, алюминия и кадмия на морфофункциональные показатели репродуктивной функции самцов лабораторных крыс при изолированном действии.

Полученные результаты представлены в таблицах 3 и 4.

Установлено, что по сравнению с интактной группой при изолированном воздействии психогенного стресса уровень кортикостерона в сыворотке крови возрастает в четыре раза (659 ± 214 нг/мл против 225 ± 69 нг/мл в интактной группе, р<0,001), в два раза увеличивается количество сперматозоидов в стадии некроза (1,8 ±1,2% против 0,8 ± 0,4%, р<0,01) и количество аберрантных делений половых клеток различных генераций (16,4 ± 6,3% по сравнению с 8,8 ± 2,8% в фоне, р<0,01), достоверно повышается доля сперматозоидов с фрагментацией ДНК (7,5 ± 1,5% против 5,8 ± 1,1%, р<0,05). Обзорная микроскопия гистологических срезов семенников в группе "стресс" выявила наличие дегенеративных изменений в виде частичной атрофии извитых семенных канальцев, в отдельных канальцах - слущивание сперматогенного эпителия. Нарушения процесса сперматогенеза проявляются снижением частоты наступления беременности интактных самок на 15%.

В условиях эксперимента при изолированном действии кадмия выявлено достоверное увеличение весовых коэффициентов надпочечников (0,22 ± 0,05 против 0,12 ± 0,02 в интактной группе, р<0,03), снижении весовых коэффициентов левого (3,09 ± 1,73 против 5,01 ± 0,73, р<0,03) и правого семенников (3,45 ± 1,54 против 4,91 ± 0,75, р<0,03) и семенных пузырьков (1,60 ± 0,94 против 3,84 ± 1,36, р<0,01). Повреждающее сперматогенез действие кадмия проявляется также в двукратном снижении количества сперматогоний (2,3 ± 1,4% против 3,8 ± 1,0% в контрольной группе, р<0,05) и сперматид (38,6 ± 16,8% против 59,7 ± 16,1%, р<0,05) в сперматогенном эпителии, в двукратном снижении герминативного индекса и индекса напряженности сперматогенеза, подавлении системы антиоксидантной защиты (3,3 ± 2,0 niM-экв против 5,8 ± 1,3 mM-экв, р<0,05). Установлено нарушение процессов спермиогенеза: повышение патологических по морфологии форм сперматозоидов более чем в два раза (10,5±2,1% против 4,2±3,0% в контроле, р<0,05) и сперматозоидов, содержащих фрагментированную ДНК (11,1±2,3% против 5,8±1,1%, р<0,01 в контроле), достоверное увеличение неподвижных сперматозоидов (84,3±11,1%

против 68,8 ± 13,3%, р<0,05) и трехкратное возрастание доли аберрантных делений половых клеток сперматогенного эпителия (23,8 ± 3,0% против 8,8 ± 2,8%, р<0,001). При проведении обзорной микроскопии гистологических срезов семенников в группе "кадмий" установлено наличие выраженных дегенеративных изменений в виде частичной атрофии извитых семенных канальцев и слухцивания сперматогенного эпителия (рисунок 4А, Б, В).

Рисунок 4. Дегенеративные изменения в семенных канальцах самцов групп сочетанного действия металлов (алюминия и кадмия) и психогенного стресса. Окраска гематоксилином Эрлиха с докраской эозином. А) На месте гибели клеток образуются пустоты (П). Увеличение х 600. Б) Разрушение стенки семенного канальца (РСК). Увеличение х 375. В) Слущивание сперматогенного эпителия. Увеличение х 240. Г) Семенные канальца с отсутствием сперматогенеза - атрофия канальцев (АК). Увеличение х 375.

Зарегистрировано подавление тестостерон синтезирующей функции гонад, что проявилось в снижении уровня свободного тестостерона в сыворотке крови более чем в пять раз по сравнению с интактным контролем (0,4 ± 0,3 нг/мл против 2,2 ± 1,3 нг/мл,

р<0,02). При спаривании с интактными самками обнаружено снижение частоты наступления беременности по сравнению с контролем в 2 раза, отмечается тенденция к росту доимплантационной гибели эмбрионов и общей эмбриональной смертности.

Таблица 3 - Морфофункциональные показатели семенников, процессов сперматогенеза и спермиогенеза самцов крыс при изолированном и сочетанном воздействии кадмия и психогенного стресса.

Показатель/группа Контроль Стресс Кадмий Кадмий + стресс

Патологические формы гамет (%) Сперматозоиды неподвижные (%) 4,2±3,0 68,8±13,3 5,0±3,0 58,4±20,6 10,5± 2,1*/+ 84,3± 11,1*/+ 11,8±5,1 */+ 88,8± 12,9*/+

Кортикостерон (нг/мл) Свободный тестостерон (нг/мл) 225±69 2,2±1,3 943 ± 105* 5,7 ± 3,9 659 ±214*/+ 0,4 ± 0,3 */+ 1280 ±276*/+/° 10,5 ±5.1°

Клетки Лейдига (%) Сперматогонии (%) Сперматиды (%) Герминативный индекс Напряженность сперматогенеза Митотически-мейотический индекс Доля аберрантных целений, % U ±0,5 3,8±1,0 59,7±16,1 0,4 ±0,1 10,8±2,5 6,2 ± 1,1 8,8 ±2,8 1,0±0,5 3,5 ±1,7 55,6± 19,6 0,3± 0,1 7,9±2,1 6,1 ± 1,1 16,4 ±6,3* 0,9±0,5 2,3± 1,4*/+ 38,6±16,8*/+ 0,2 ±0,1* 7,1±1,6 2,6 ± 0,9*/+ 23,8 ± 3,0*/+ 0,6±0,3* 1,8± 0,5*/+ 42,4±15,2*/+ 0,1± 0,05*/+ 5,8±1,1*/° 1,7 ±0,8*/+ 29,8 ± 9,3*/+

Ранний ano птоз (%) Поздний апотоз (%) Некроз гамет (%) АСАТ (%) 3,7±1,4 0,4±0,3 0,8± 0,4 2,5±1,1 1,9±1,7 0,4±0,5 1,8±1,2* 3,2±0,8 1,1±0,5* 0,7±0,2 1,2±0,6 3,7±1,5 1,4±0,3* 0,5±0,3 1,3±1,2 3,9±1,6

% сперматозоидов, содержащих фрагментарную ДНК 5,8± 1,1 7,5 ± 1,5* 11,1± 2,3*/+ 21,1 ±5,5*/+/°

АОА семенника (тМ -экв) 5.8 ±1,3 5,7 ±1,4 3,3 ± 2,0 */+ 3,6±1,4 */+

Доимплантационная гибель эмбрионов Общая эмбриональная смертность 0,4 ± 0,5 0,7 ± 1,0 1,6 ± 1,1 2,0 ± 1,6 1,8 ± 1,7 1,8 ± 1,7 1,9 ±0,8* 2,3 ± 0.9*

Примечание: (*) - статистически значимые различия показателей по критерию Манна-Уитни (р< 0,05) по сравнению с контрольной группой; (+) - статистически значимые различия показателей по критерию Манна-Уитни (р< 0,05) по сравнению с группой стресс; (°) - статистически значимые различия показателей по критерию Манна-Уитни (р<0,05) между группами«кадмий» и «кадмий + стресс»

Таблица 4 - Морфофункциональные показатели семенников, процессов сперматогенеза и спермиогенеза самцов крыс при изолированном и сочетанном воздействии алюминия и стресса. _

Показатель/группа

Контроль Стресс

Алюминий

Алюминий + стресс

Патологические формы гамет (%) Сперматозоиды неподвижные (%)_

4,2±3,0 68,8±13,3

Кортикостерон (нг/мл) Свободный тестостерон (нг/мл)_

225±69

2,2±1,3

Клетки Лейдига (%) Сперматогонии (%) Сперматиды (%) Герминативный индекс Напряженность сперматогенеза Митотически-мейотический индекс Доля аберрантных делений, %_

1.1 ±0,5 3,8±1,0

59,7±16,1 0,4±0,1

10,8±2,7

6.2 ± 1,1

8,8 ± 2.8

Ранний апоптоз (%) Поздний апотоз (%) Некроз гамет (%) АСАТ (%)_

3,7±1,4 0,4±0,3 0,8±0,4 2,5±1,1

5,0±3,0 58,4±20,6

10,2±2,4*/+ 94,9±8,2*/+

12,0±3,1*/+ 96,0±2,9*/+

943±105* 5,7±3,9

620±206*/+ 0,5*0,3 +

1315±210*/+/° 3,5±1,9°

1,0±0,5 3,5±1,7 55,6±19,6 0,3±0,1

7,9±1,8 6,1 ± 1,1

16,4 ±6,3*

0,8±0,5 3,1±1,0 49,0±15,8* 0,3±0,1

9,0±2,4 4,2 ± 1,4*/+

20,4 ± 7,0*

0,8±0,4 3,4±1,9 22,4±10,2*/'° 0,2±0,1*

5,8±1,2*/+/° 2,7± 0,8*/+/°

25,8 ±8,1*/+

1,9±1,7 0,4±0,5 1,8±1,2* 3,2±0,8

1,1±0,7* 0,2±0,1 1,2±0,8 3,0±0,8

1,2±0,8* 0,1±0,1 1,1 ±0,4 3,8±0,9

% сперматозоидов, содержащих фрагментарную ДНК

5,8 ±1,1

7,5 ± 1,5*

9,4+2,1*/+

16,7± 1,8*/+/°

АОА семенника (шМэкв)

5,8 ±1,3

5,7 ±1,4

2,7 ±0,8 */+

2,8 ± 0,6 */+

Доимплантационная гибель эмбрионов Общая эмбриональная смертность_

0,4±0,5

0,7±1,0

1,6± 1,1

2,0± 1,6

1,8± 1,7 2,3± 1,9

2,0±1,0*

2,3*1,1*

Примечание: (*) - статистически значимые различия показателей по критерию Манна-Уитни (р< 0,05) по сравнению с контрольной группой; ('<) - статистически значимые различия показателей по критерию Манна-Уитни (р<0,05) по сравнению с группой стресс; (°) -статистически значимые различия показателей по критерию Манна-Уитни (р< 0,05) между группами «ачюминий» и «алюминий + стресс».

Алюминий, при изолированном воздействии, показал сходные с предыдущим металлом изменения содержания гормонов в сыворотке крови: трехкратное увеличение концентрации кортикостерона (620 ± 206 нг/мл против 225 ± 69 нг/мл в

контроле, р<0,001) и снижение свободного тестостерона (0,5 ± 0,3 нг/мл против 2,2 ± 1,3 нг/мл, р<0,02).

Изменение весовых коэффициентов внутренних органов коснулось только печени (36,07 ± 1,79 против 32,94 ± 2,90, р<0,01). Обзорная микроскопия гистологических срезов семенников выявила развитие дегенеративных изменений по периферии органа: слущивание сперматогенного эпителия, а также появление атрофических извитых семенных канальцев (рисунок 4А, Б, В). В гомогенате ткани гонад самцов при изолированном воздействии алюминия по сравнению с интактным контролем отмечены нарушения процессов сперматогенеза: снижение процентного содержания сперматид (49,0 ± 15,8% против 59,7 ± 16,1% в контрольной группе, р<0,05), двукратное увеличение количества аберрантных делений половых клеток (20,4 ± 7,0% против 8,8 ± 2,8%, р<0,01) и рост количества сперматозоидов с фрагментацией ДНК (9,4 ± 2,1% против 5,8 ± 1,1%, р<0,05), подавление активности антиоксидантной системы в семенниках (2,7 ± 0,8 тМ-эвк против 5,8 ± 1,3 шМ-экв, р<0,05). Отмечено двукратное снижение частоты наступления беременности у интактных самок и тенденция к увеличению доимплантационной гибели эмбрионов и обшей эмбриональной смертности.

Таким образом, проведенные исследования показали, что кадмий, алюминий и психогенный стресс при изолированном воздействии нарушают процесс сперматогенеза, изменяя уровень кортикостерона и свободного тестостерона в сыворотке крови, процентное содержание половых клеток различных генераций сперматогенного эпителия, увеличение доли аберрантных делений половых клеток, увеличение количества эпидидимальных сперматозоидов с фрагментацией ДНК, изменение копулятивного поведения.

Сочетанное воздействие психогенного стресса и кадмия/алюминия на морфофункциональные показатели репродуктивной функции самцов лабораторных крыс.

Сочетанное действие психогенного стресса и металлов в группах "стресс+кадмий" и "стресс+алюминий" при зарегистрированной дополнительной кумуляции обоих металлов в головном мозге и семенниках проявилось более выраженным негативным воздействием на гонады по сравнению с группами

изолированного действия: полной атрофией извитых семенных канальцев левого семенника у 25% животных (как в ipynne «кадмий+стресс», так и в группе «алюминий+стресс») (рисунок 4Г), увеличением уровня кортикостерона в крови (1280 ± 276 нг/мл «кадмий+стресс» против 659 ± 214 нг/мл «кадмий», р<0,008; 1315 ± 210 нг/мл «алюминий+стресс» против 620 ± 206 нг/мл «алюминий», р<0,01), двукратным снижением индекса напряженности сперматогенеза, повышением содержания сперматозоидов с фрагментацией ДНК (21,1 ±5,5 % «кадмий+стресс» против 11,1 ± 2.3 % «кадмий», р<0,01); 16,7 ± 1,8 % «алюминий+стресс» против 9,4 ± 2,1 % «алюминий», р<0,01). Синергизм установлен по концентрации кортикостерона в сыворотке крови в обеих изученных группах, что может свидетельствовать о развитии патологической формы стресса - дистресса, приводящего к выраженному нарушению гомеостаза организма и дисбалансу регуляторных систем. При сочетанном действии алюминия и психогенного стресса обнаружен слабый антагонистический эффект по тестостеронсинтезирующей функции семенников (таблица 4). В противоположность этому, при сочетанном действии кадмия и стресса наблюдается резкое увеличение концентрации свободного тестостерона в сыворотке крови почти в 20 раз по сравнению с изолированным воздействием кадмия (10,5 ± 5,1 нг/мл против 0,4 ± 0,3 нг/мл, р<0,008). Тенденция к увеличению доимплантационной гибели эмбрионов в группах сочетанного действия приобретает статистическую значимость.

Таким образом, экспериментальное изучение сочетанного действия металлов (кадмий и алюминий) и психогенного стресса выявило наличие разнообразных по характеру, направленности, выраженности эффектов по большинству изученных показателей, отражающих как проявления синдрома дистресса, так и повреждающее действие металлов. Избыточное накопление металлов в гонадах самцов, обнаруженное при поступлении металлов на фоне психогенного стресса, проявилось в более выраженном изменении ряда показателей гонадотропности по сравнению с изолированным действием: по количеству и соотношению различных генераций половых клеток сперматогенного эпителия и индексов сперматогенеза, повышению содержания сперматозоидов с фрагментацией ДНК и достоверному увеличению доимплантационной гибели эмбрионов, что свидетельствует об усилении повреждающего действия металлов в сочетании с психогенным стрессом.

Выводы:

1. В условиях эксперимента установлено, что не только кадмий (металл с известной репродуктивной токсичностью), но и алюминий (репродуктивная токсичность не является доказанной по данным литературы) накапливается в органах, ограниченных клеточными барьерами в головном мозге и в семенниках: концентрация кадмия в семенниках и головном мозге составила 0,184 ± 0,016 мкг/г и 2,047 ± 0,136 мкг/г, соответственно; алюминия - 2,997 ± 0,476 мкг/г и 58,222 ± 4,074 мкг/г, соответственно. При изолированном воздействии на организм лабораторных животных все три фактора (алюминий/ кадмий/ психогенный стресс) приводят к схожим гонадотропным эффектам в семенниках, действуя на разных этапах сперматогенеза и спермиогенеза: повышение уровня кортикосгерона в крови в 3-5 раз, увеличение количества аберрантных делений половых клеток сперматогенного эпителия в 2-3 раза, повышение содержания сперматозоидов с фрагментацией ДНК в 2-3 раза, уменьшение количества сперматозоидов на стадии апоптоза в 2-3 раза, снижение процента оплодотворенных самок в 1,5-2 раза. Исключением является тестостеронсинтезирующая функция семенников: при воздействии металлов (алюминия, кадмия) продукция тестостерона достоверно снижена (группа «кадмий» 0,4 ± 0,3 нг/мл, группа «алюминий» 0,5 ± 0,3 нг/мл против 2,2 ± 1,3 нг/мл в интактной группе, р<0,02), тогда как при длительном стрессировании в течение сперматогенного цикла отмечена тенденция к увеличению уровня тестостерона в крови самцов лабораторных крыс (группа «стресс» 5,7 ± 3,9 нг/мл, р<0,02 ).

2. При сочетанием воздействии факторов различной природы: психогенного стресса и металла (кадмия/алюминия) обнаружена дополнительная кумуляция металлов в семенниках и головном мозге экспериментальных животных, что свидетельствует о возможном влиянии психогенного стресса на проницаемость клеточных барьеров: в группе «кадмий+стресс» концентрация кадмия в семенниках и головном мозге составила 0,220 ± 0,030 мкг/г и 2,802 ± 0,248 мкг/г, соответственно (против 0,184 ± 0,016 мкг/г и 2,047 ± 0,136 мкг/г в группе «кадмий», р<0,001); в группе «алюминий+стресс» концентрация алюминия в семенниках и головном мозге составила 4.622 ± 0,428 мкг/г и 81,493 ± 7,059 мкг/г (против 2,997 ± 0,476 мкг/г и 58,222 ± 4.074 мкг/г в группе «алюминий», р<0.001).

3. Изменение гормонального баланса и усиление проницаемости ГТБ под действием психогенного стресса приводит к более выраженному повреждению процессов спермато- и спермиогенеза по сравнению с изолированным действием алюминия/кадмия: полной атрофии ИСК левого семенника у 25% животных (как в группе «кадмий+стресс», так и в группе «алюминий+стресс»), достоверному снижению индекса напряженности сперматогенезаи увеличению количества сперматозоидов с фрагментацией ДНК в 2 раза.

4. Сочетанное действие металла (алюминия, кадмия) и психогенного стресса приводит к нарушению копулятивного поведения самцов лабораторных крыс и достоверному увеличению доимплантационной гибели и общей эмбриональной смертности в потомстве интактных самок по сравнению с контрольной группой

(р<0,05).

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Балезин С.Л., Макутина В.А., Морозова О.Б. Опыт использования лазерного теста по определению жизнеспособности неподвижных сперматозоидов в программах вспомогательных репродуктивных технологий. // Материалы международной научной конференции «Эмбрион человека как клинический и лабораторный объект». -Екатеринбург, 2005. — С. 11.

2. Квашнина Е.В., Балезин С.Л., Беломестнов С.Р., Макутина В.А. Проточная цитометрия криоэякулята как критерий отбора доноров в программе внутриматочной инсеминации.// Материалы международного конгресса «Проблемы репродукции». Москва. 2006. - С.149-150.

3. Калюга A.B., Балезин C.JI., Жовтяк Е.П., Квашнина Е.В., Макутина В.А., Янчук Т.В. Актуальные вопросы реабилитации репродуктивной функции в условиях региона среднего Урала.// Материалы 8-го научного форума «Мать и дитя». -Екатеринбург, 2006. -С.633-634.

4. Макутина В.А., Рослый О.Ф., Балезин C.JI., Федорук A.A., Саг.имов Д.Ф., Морозова О.Б. Фрагментация ДНК в мужских половых клетках как критерий оценки репродуктивной функции.// Материалы Всероссийской конференции «Медицина труда: реализация глобального плана действий по здоровью работающих на 20082011 гг». - Москва, 2008,- с. 202.

5. Квашнина Е.В., Макутина В.А., Салимов Д.Ф., Морозова О.Б., Балезин СЛ., Портнов И.Г. Дисперсия хроматина в мужских половых клетках как критерий оценки репродуктивной функции.// Материалы XVIII международной конференции РАРЧ «Репродуктивные технологии сегодня и завтра». - Самара, 2008. - С. 31.

6. Брайнина Х.З., Герасимова Е.Л., Портнов И.Г., Балезин С.Л., Морозова О.Б., Макутина В.А. Потенциометрический метод оценки антиоксидантной активности семенной жидкости.// Материалы XVIII международной конференции РАРЧ «Репродуктивные технологии сегодня и завтра». - Самара, 2008. - С. 32.

7. Макутина В.А., Балезин СЛ., Турчанинова Е.В., Салимов ДФ. Клиническое использование теста для определения дисперсии хроматина в мужских половых клетках. // Материалы XIX международной конференции РАРЧ «Репродуктивные технологии сегодня и завтра». - Иркутск, 2009. - С. 99-100.

8. Брайнина Х.З., Герасимова Е.Л., Балезин С.Л., Макутина В.А., Турчанинова Е.В., Портнов И.Г. Новый метод оценки соотношения антиоксидатной и оксидантной активности в семенной жидкости мужчин.// Материалы XIX международной конференции РАРЧ «Репродуктивные технологии сегодня и завтра». - Иркутск, 2009. -С. 109.

9. Макутина В.А., Рослый О.Ф., Балезин СЛ., Салимов Д.Ф., Шейко Л.Д. Исследование гонадотропного и эмбриотропного эффекта после воздействия стресса на самцов экспериментальных животных // Материалы. Всероссийской научно-практической конференции «Охрана здоровья населения промышленных регионов: стратегия развития, инновационные подходы и перспективы». - Екатеринбург, 2009.-С.305-308.

10. Brainina K.Z., Gerasimova E.L., Balezin S.L.. Morozova O.B., Portnov I.G., Makutina V.A. Evaluation of sperm antioxidant/oxidant activity and its correlation with pathological states.//9th Workshop on (Bio) sensors and Bioanalytical microtechniques in environmental and clinical analysis. - Montreal, 2009.

11. Макутина B.A., Балезин С.Л., Рослый О.Ф., Шейко Л.Д. Фрагментация ДНК в мужских половых клетках: влияние на репродукцию, причины происхождения и методы диагностики. // Уральский медицинский журнал.- 2010. -МЗ (68). -С. 123-128.

12. Макутина В.А. Влияние иммобшшзационного стресса на некоторые токсикокинетические параметры металлов (кадмия, алюминия) у самцов лабораторных крыс// Уральский медицинский журнал. - 2011. - №9 (87). - С. 5052.

13. Brainina Kh. Z.,Gerasimova E.L., Varzakova D.P., Balezin S.L., PortnovI.G., Makutina V.A. Potentiometric method for evaluating oxidant/antioxidant activity of seminal and follicular fluids and clinical significance of this parameter. // The Open Chemical and Biomedical Methods Journal. -2012. - №5. -p. 1-7.

14. Макутина B.A., Рослый О.Ф., Балезин С.Л., Мамина В.П., Паншина И.А. Сочетанное действие алюминия н иммобнлизацнонного стресса на репродуктивную систему самцов лабораторных крыс.// Медицина труда и

промышленная экология. — 2012. - №11. - с. 37-41.

15. Makutina V.A., Baiezin S.L., Rosly O.F., Slishkina TV. Effect of short-term immobilization stress on some toxicokinetics paramétrés of metals (cadmium, aluminum) in male rats.// Abstracts of 28th annual meeting of the European society of human reproduction and embryology.- Human reproduction.- V.27, 2012.- p.146.

16. Макутина В.А., Рослый О.Ф., Балезин С.Л., Мамина В.П., Пашнина И.А. Влияние кратковременной иммобилизации на состояние репродуктивной системы самцов лабораторных крыс. // Материалы XI Всероссийского конгресса «Профессия и здоровье». - Москва, 2012. - с.307-308

МАКУТИНА ВАЛЕРИЯ АНДРЕЕВНА

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОЦЕНКА СОЧЕТАННОГО ДЕЙСТВИЯ ПСИХОГЕННОГО СТРЕССА И МЕТАЛЛОВ

(НА ПРИМЕРЕ АЛЮМИНИЯ И КАДМИЯ) НА РЕПРОДУКТИВНУЮ СИСТЕМУ САМЦОВ ЛАБОРАТОРНЫХ КРЫС

14.02.04 - Медицина труда

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Автореферат напечатан по решению диссертационного совета Д.001.012.01 при ФГБУ «Научно-исследовательском институте медицины труда» РАМН

от 22 апреля 2013 г.

Подписано в печать 22.04.2013 г. Формат 60x84 1/16 Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 138. Отпечатано в типографии ГБОУ ВПО УГМА Минздрава России, г. Екатеринбург, ул. Репина, д. 3