Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Эффективность и механизмы противоопухолевого действия вирусных вакцин при экспериментальном онкогенезе

На правах рукописи

УРАЗОВА ЛЮДМИЛА НИКОЛАЕВНА

ЭФФЕКТИВНОСТЬ И МЕХАНИЗМЫ ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО ДЕЙСТВИЯ ВИРУСНЫХ ВАКЦИН ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ

ОНКОГЕНЕЗЕ

14.00.14 - онкология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Работа выполнена в НИИ онкологии Томского научного центра СО РАМН (директор - д.м.н.. профессор Чойнзонов Е.Л.)

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор Чойнзонов Евгений Лхамацыренович Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Бочарова Ольга Алексеевна

доктор биологических наук, профессор Комов Владимир Петрович

доктор медицинских наук, профессор Моисеенко Владимир Михайлович

Ведущее учреждение:

Санкт-Петербургская Государственная медицинская академия им. И.И.Мечникова

Защита состоится «_» _2003 г. в_часов на заседании

диссертационного совета Д208.052.01 ГУН НИИ онкологии им. проф. Н.Н.Петрова МЗ РФ. Санкт-Петербург, Песочный-2, ул. Ленинградская, 68

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГУН НИИ онкологии им.проф. Н.Н.Петрова МЗ РФ.

Автореферат разослан «_»_2003 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, академик РАЕН, д.м.н., профессор

В.В.Худолей

\S7\J

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Терапия опухолей представляет собой сложную, а при злокачественных формах заболевания, не всегда разрешимую задачу. Внедрение в онкологическую практику различных схем комплексной терапии позволило повысить эффективность традиционных методов, что, однако, не изменило ситуации в целом. Показатели общей смертности от рака практически не снизились, при этом, значительный удельный вес занимают местнораспространенные и метастатические формы заболевания (Двойрин В.В. с соавт,1990; Потапов А.И, Васильев Н.В.,1990; Гладких С.П. с соавт., 1997; Аксель Е.М., Бармина Н.М.,1999; Чиссов В.И., Старинский В.В.,2000). Часто гибель больного, на фоне успешно излеченной первичной опухоли, обусловлена метастазами, уже существующими к моменту постановки диагноза. Химиотерапия используется, как самостоятельный метод лечения, лишь при определенных формах быстрорастущих неоплазий. При этом, даже выраженный терапевтический эффект сопровождается тяжелыми побочными явлениями, часто не дающими возможности довести лечение до успешного завершения.

Существующее положение ставит перед исследователями, занимающимися отбором и изучением новых противоопухолевых препаратов, сложную задачу по изысканию принципиально новых методов лечения злокачественных новообразований. Наиболее перспективным в этом плане является использование терапевтических воздействий, позволяющих одновременно оказывать не только повреждающее действие на опухолевые клетки, но и активировать антибластомные потенции организма. В последние годы в число наиболее мощных противоопухолевых воздействий входят модификаторы биологических реакций, такие, как цитокины, трансплантация костного мозга и эмбриональных тканей с высоким иммуно-и гемопоэтическим потенциалом (Гольдберг Е.Д.с соавт.,1992; Кадагидзе З.Г. 1997; Якубовская Р.И., 2002; Rosenberg S. et al.,1986; Toungouz M. et al., 1996; Davis I., 2000; Gavilcmdo I.et al.,2000; Fong I., Englemaa E., 2000). Достаточно перспективными, на сегодняшний день, считаются такие методы биологической терапии рака, как противоопухолевая вакцинация и генотерапия (Имянитов E.H., 1996; Моисеенко В.М. 1998, 1999, 2003; Хансон К.П., Имянитов E.H., 2002; Tanner J., 1991; Nohria А., 1994; De Vita V., 1995; Schmidt-Wolf G.D. et all, 1995; Harada J., Berk A., 1999; Ramachandra M. et al.,2001; Ries S.et al., 2000; Yang С. et al.,2001).

Неоднократно предпринимались попытки применения в качестве необластомных средств различных инфекционных агентов, в том числе, вирусной природы. При репликации онколитических вирусов в опухолевых клетках концентрация их, в сравнении с нормальными, может превышать 104/мл (Муцениеце А.Я., 1978; Фердат А.К., Муцениеце А.Я., 1988; Matsuzaki T. et al., 1987; Hersey P. et al., 1987; Matuza L. et al, 1991; Gasti G., et al., 1992; Markert J.et al., 1993; Whitman E. et al., 1 P^t^ïSiîiR>^h0Ш

БИБЛИОТЕКА

С.Петер4ург Г. ' ОЭ «КО »«W J j

Li Y., et al., 2001; Kirn D., 2001; Nakamura et al., 2002). Перспективно выглядит использование некоторых вакцинных штаммов экзогенных вирусов, апатогенных для человека, но способных индуцировать изменения антигенной и иммуногенной характеристик опухолевых клеток и их лизис, вызывать образование интерферона, а также неспецифически модулировать иммунные реакции организма (Ройзман Б.,1989; Hillman G. et al., 1994; Salminen E. et al., 1997; Khuri F. et al., 2000; Markert J.et al., 2000; Deweese T. et al., 2001; Papanastassiou V. et al., 2002).

Была показана возможность опухолеспецифической иммунизации интактных животных препаратами опухолевых клеток, инфицированных вирусами и подвергнутых разрушению (Bandlow G., Koszinowski U.,1974; Austin F., Boone C.,1979; Wallack M.,1979). Иммуногенными свойствами обладают как естественный материал вирусного онколиза и живые вирус-инфицированные клетки, так и онколизаты - гомогенаты опухолевых культур, зараженных вирусами in vitro (Lindenmann J., 1974; Austin F.,Kobayashi H., Sendo F. 1979). Согласно экспериментальным протоколам, применение в клинической практике вирусных онколизатов достаточно эффективно - активно ингибируется метастазирование, повышается противоопухолевый иммунный ответ, отмечены отдельные случаи полной регрессии опухолей (Hersey Р., 1987; Lehner В. et al.,1990; Ahlert Т.,1997;. Завершились успехом клинические испытания генноинженерных методов терапии злокачественных новообразований онколитическими вирусами (Hunt et al., 1993; Avalosse В. et al., 1995; Nanaka K. et al., 1996; Abrams S. et al.,1997; Hsu S. et al., 1997; Chase M.et al., 1998; Ikeda K. et al., 1999, 2000; Petrowsky H. et al., 2001; Makimoto H. et al.,2002).

Онкотропные вирусы, сочетающие в себе как антибластомные, так и иммуномодулирующие свойства, являются достаточно перспективным объектом исследования. Однако, несмотря на многочисленные публикации, посвященные проблеме использования вирусов в терапии злокачественных опухолей, вопрос о механизмах, обеспечивающих их противоопухолевый эффект, практически не освещен, хотя актуальность его очевидна. Решение его создает реальную перспективу для внедрения этих препаратов в клиническую онкологию и представляет, на наш взгляд, большой практический интерес. Использование для этой цели стандартных вирусных вакцин, многократно апробированных на практике, привлекает возможностью, в случае положительного противоопухолевого эффекта, иметь готовый официнальный препарат для клинического использования.

Цель исследования. Изучить эффективность и механизмы реализации противоопухолевого действия вакцинных штаммов вирусов при экспериментальном онкогенезе.

Задачи:

1. Оценить онкотропные свойства вакцинных штаммов вирусов (венесуэльского энцефаломиелита, паротита, осповакцины) в системах in vivo и in vitro.

2. Изучить онколитические свойства вакцинных штаммов вирусов в отношении первичных опухолей и оценить их влияние на процессы послеоперационного рецидивирования и метастазирования.

3. Изучить степень щггоморфологических нарушений в клетках опухолей экспериментальных животных в процессе терапии вакцинными штаммами вирусов и лизатами клеток, инфицированных in vitro.

4. Исследовать роль внутриопухолевых и системных факторов естественной резистентности в реализации противоопухолевого действия вакцинных штаммов вирусов.

5. Исследовать влияние вакцинных штаммов вирусов на активность иммунокомпетентных клеток на фоне химиотерапии и оперативного вмешательства при экспериментальном онкогенезе.

Положения, выносимые на защиту:

- Вакцинные штаммы вирусов и их онкодизаггы проявляют выраженную противоопухолевую и антиметастатическую активность в отношении изученных опухолей экспериментальных животных.

- Противоопухолевая и антиметастатическая активность вирусов основывается как прямом литическом воздействии на опухолевые клетки, так и на модуляции противоопухолевых иммунных функций организма.

- Основные механизмы противоопухолевого и антиметастатического действия вакцинных штаммов вирусов и их способность повышать эффективность традиционных методов терапии опухолей связаны с нормализацией либо стимуляцией функциональной активности эффекторных клеток системы иммунитета.

- Наиболее эффективным вариантом терапии неоплазий вирусными вакцинами является их системное применение в комбинации с оперативным вмешательством.

Научная новизна.

Впервые изучены противоопухолевые и антиметастатические свойства вакцинных штаммов тога- и парамиксовирусов, а также их онколизатов при экспериментальном онкогенезе.

Механизмы противоопухолевой активности вакцинных штаммов вирусов базируются как на прямом цитодеструктивном действии на опухолевые клетки, так и на модуляции неспецифических параметров иммунного ответа: цитостатической и супрессорной активности лимфоцитов, активности натуральных киллеров, ответе лимфоцитов на митогены.

Выявлена различная степень противоопухолевой активности лимфоцитов из опухолевого узла и иммунокомпетентных органов.

<

j

6

Впервые показано, что вакцинные штаммы вирусов обладают выраженной тропностью и логической активностью в отношении экспериментальных опухолей. Терапия вирусными вакцинами, на фоне оперативного вмешательства, приводит к угнетению послеоперационного рецидивирования и метастазирования опухолей, которое ассоциируется с активацией иммунокомпетентных клеток.

Вакцинные штаммы вирусов индуцируют появление в опухолевых клетках дополнительных ядер, микроядер и вызывают вакуолизацию цитоплазмы клеток. Кроме того, вирусы венесуэльского энцефаломиелита и паротита значительно подавляют митотическую активность опухолевых ,

клеток in vivo.

Вакцинный штамм вируса венесуэльского энцефаломиелита индуцирует в культуре опухолевых клеток достоверное увеличение числа патологических митозов за счет снижения нормальных.

Научно- практическая значимость. Проведенные исследования позволили получить новую информацию относительно спектра вирусных вакцин, которые могут найти применение в терапии злокачественных опухолей.

На основании полученных результатов определена значимость различных звеньев системы иммунитета в реализации противоопухолевого действия вирусных вакцин.

Изученные в эксперименте механизмы противоопухолевого и антиметастатического действия вирусных вакцин дают теоретические предпосылки для их патогенетически обоснованного применения в онкологии.

Проведенные исследования, расширив круг представлений о механизмах, лежащих в основе иммуномодулирующего действия вирусных вакцин, позволяют оценить целесообразность их применения, в сочетании с традиционными методами воздействия, в терапии онкологических заболеваний.

Апробация работы. Основные положения диссертации представлены и обсуждены на International Congress on Anti-Cancer Treatment (Paris, France, 1996,1997,1998); Europian Cancer Conference (Germany, 1997); Международном конгрессе «Человек и лекарство», Москва,1997; Международной конференции «СПИД, рак и родственные проблемы», С.Петербург, 2001, 2002; юбилейной конференции «Медико-биологические аспекты нейрогуморальной регуляции», Томск, 1997; конференции «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины», Москва, 1998; юбилейной конференции НИИО ТНЦ СО РАМН «Проблемы современной онкологии», Томск, 1999; Российской научно-практической конференции «Новые диагностические и лечебные технологии в онкологии», Томск ,2003.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 46 печатных работ, из них 11 - в реферируемых российских и зарубежных изданиях.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 239 страницах, состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов, списка литературы. Работа иллюстрирована 41 таблицей и 46 рисунками. Библиографический указатель включает 411 источников, из них 170 отечественных и 241 зарубежных.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальные модели. Эксперименты проведены на 1220 инбредных половозрелых мышах линий ВАЬВ/с, С57В1/61 и БВАШ массой 18-20 г. разведения питомника научно-исследовательской лаборатории экспериментальных биомоделей НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН. Распределение животных по сериям экспериментов приведено в табл.1.

Таблица 1

Распределение животных в экспериментальных исследованиях

Наименование эксперимента Линия мышей Количество

Исследование степени торможения роста экспериментальных опухолей и процесса их метастазирования BALB/c, C57B1/6J DBA/2JxC57Bl/6J 45 166 86

Изучение онко- и органотропных свойств вакцинных штаммов вирусов BALB/c, C57B1/6J 84 46

Оценка морфологических особенностей опухолей и лимфоузлов, цитоморфологических изменений опухолевых клеток мышей, получивших терапию вакцинными штаммами вирусов. BALB/c, C57B1/6J 240 126

Исследование противоопухолевого эффекта вакцинных штаммов вирусов на фоне оперативного вмешательства BALB/c, C57B1/6J 26 140

Исследование влияния вакцинных штаммов вирусов на эффективность цитостатической терапии C57B1/6J 215

Определение противоопухолевой активности иммунокомпетентных клеток мышей, леченных вакцинными штаммами вирусов C57B1/6J 45

В исследованиях использовали штаммы перевиваемой солидной меланомы В-16 (пигментный и беспигментный варианты), асцитного и

солидного вариантов аденокарциномы Эрлиха, карциномы гортани человека (Нер-2), лимфоцитов больных лимфомой Беркигта (P3HR-1). Штаммы меланомы В16 и карциномы легких Льюис являются высоко адекватными моделями для изучения противоопухолевого действия модификаторов биологических реакций природного происхождения (Трещалина Е.И. с соавт., 1990).

Использовали следующие питательные среды и добавки к ним: RPMI 1640 ("Flow", Англия; "Serva", Германия), Среда 199 (НПО "Вектор", Новосибирск), раствор Хенкса без фенолового красного (НПО "Вектор", Новосибирск), телячья эмбриональная сыворотка (НПО "Вектор"; ИКИ, Новосибирск), бычья сыворотка (НПО "Вектор", Новосибирск), гентамицин ("Pharmacia", Болгария), гепарин ("Reanal", Венгрия), глютамин ("Flow", Англия), HEPES ("Sigma", США; "Flow", Англия), раствор трипсина (НИИЭМ, Свердловск).

Характеристика терапевтических агентов, использованных в работе.

Вакцинные штаммы вирусов:

1) венесуэльского энцефаломиелита лошадей (вакцинный препарат живой, сухой, производства НПО «Вирион», Томск);

2) паротита (вакцина живая, сухая, производства акционерного общества "Д. Мазай и К°", Москва);

3) осповакцины (вакцина живая, сухая, производства НПО «Вирион», Томск)

Вирусные онколизаты. Онколизаты получали по методу F.Austin (1979): клетки опухоли ресуспендировали в полной ростовой среде RPMI-1640 и, для стабилизации опухолевых антигенов, выдерживали 48 часов при температуре 4°С, затем 24 часа - при 37°С. Инкубацию клеток с вирусами проводили в течение 24 часов при 37°С. Полученную клеточную взвесь облучали дозой 20 Гр (гамма-облучатель"Рокус", Россия). Инактивацию пролиферативной активности онколизата оценивали по отсутствию включения ЗН-уридина. Лизаты вводили мышам внутримышечно, однократно, из расчета 1х106/мышь клеток исходной опухолевой суспензии. В качестве опухолевого контроля использовали адекватное количество облученных, не инфицированных опухолевых клеток.

Иммуногенность онколизата оценивали в реакции бласпрансформации спленоцитов по методике С.Н.Быковской (1987). Аллогенные опухолевые клетки от животных-опухоленосителей контрольных и опытных групп получали в качестве корпускулярного антигена для спленоцитов здоровых мышей. Полученные клетки добавляли в соотношении 1:1 или 1:2 к аллогенным спленоцитам интактных мышей.

В моно- и комплексной терапии экспериментальных опухолей применялись алкилирующий цитостатик циклофосфан (Минмедздравпром, Россия), который вводился внутрибрюшинно в суммарной дозе 180-200 мг/кг на 3, 5,7 сутки после имплантации опухоли, а также алкалоид винбластин из

растения барвинок розовый (Lilly, Франция), который в дозе 0,4 мг/кг вводился животным внутрибрюшинно на 3,10,17 сутки.

В качестве иммуномодулятора использовали Т-активин (АО «Биомед», Москва). Иммунотерапию начинали после удаления первичного опухолевого узла и продолжали в течение 5 суток. Каждому животному ежедневно подкожно вводили по 1 мкг препарата в 0,1 мл физиологического раствора.

Первичные культуры фибробласгов эмбриона курицы (ФЭК). Взвесь фибробластов получали по общепринятой методике. Монослой клеток, сформировавшийся через 48 часов культивирования фибробластов, использовали для размножения и титрования вирусов. В качестве вируссодержащей суспензии использовали криодеструктированный супернатант инфицированных клеток. Инфекционную активность вируса определяли по цитопатическому действию на клетки ФЭК. Готовили 10-кратные разведения вируссодержащей суспензии, одной пробой инфицировали не менее 4-х пробирок с монослоем. Цитопатический эффект оценивали через 72 часа инкубации. Инфекционным титром вируса (lg ТЦЦ50/мл) считается его конечное разведение, при котором не менее 50% клеток дегенерировало.

Методы оценки эффективности вакцинотерапии.

Оценку противоопухолевой а антиметастатической активности исследуемых вирусных вакцин проводили в соответствии с принятыми в экспериментальной онкологии методами.

Динамику роста опухоли оценивали по изменению ее объема. Процент торможения опухолевого роста (по массе опухолевого узла или объему опухолевых клеток в асците) вычисляли по формуле: ТРО = (Vk - Vo)/Vk * 100%, где: ТРО - коэффициент торможения роста опухоли; Vk - средний объем опухоли в контрольной группе животных; Vo - средний объем опухоли в опытной группе животных.

Интенсивность процесса метастазирования оценивали, используя несколько критериев:

- Частоту метастазирования опухолей вычисляли в процентах (отношение числа животных с метастазами к общему количеству животных в группе);

- Среднее количество и площадь метастазов у одного животного определяли, учитывая, что у мышей с карциномой легких Льюис и меланомой В16 метастазы располагались субплеврально (Dingemane К. et al., 1985);

- Степень поражения легких, в зависимости от количества и размера метастатических узлов в легочной ткани, определяли, применяя критерии D.Tarin, J.Price (1983);

- Степень метастазирования характеризовал индекс ингибирования метастазирования: ИИМ = (Ак*Вк) - (А*В)/(Ак*Вк) * 100%, где: Ак и А -количество животных с метастазами в контрольной и опытной группах; В к и В - среднее количество метастазов у животных в контрольной и опытной группах.

- Величину средней массы метастазов в легких определяли путем вычитания из показателя массы легких, пораженных метастазами, средней массы легких интактных животных без опухолей.

Моделирование хирургического вмешательства.

При изучении роста вторичных опухолей Эрлиха, первичные перевивали подкожно в подушечку лапки. Через 6-7 суток опухоли удаляли в асептических условиях, под эфирным наркозом, ампутируя конечность по голеностопному суставу, накладывали жгут и обрабатывали операционную рану клеем БФ-6. После операции животным перевивали вторичные опухоли

- условные метастазы: под кожу бедра задней конечности вводили ту же дозу клеток, что и при индукции первичных опухолей. Динамику роста "условных метастазов" оценивали так же, как и динамику роста первичных опухолей. Кроме того, определяли процент мышей с рецидивами первичных опухолей.

Для оценки послеоперационного метастазирования клетки опухолей перевивали под кожу спины, либо, в подушечку лапки. Их удаление проводили аналогично первичным, на 10 сутки после имплантации. Оценку метастатического поражения легких, основные критерии которой были те же, что и при оценке метастазирования первичных опухолей, проводили на 2325, либо 31 сутки после перевивки первичных опухолей.

Методы определения цитоморфологических нарушений в опухолевых клетках.

Определение количества клеток в суспензии и их жизнеспособности проводили по общепринятой методике, с использованием в качестве красителя 1% раствор трипанового синего на изотоническом физиологическом растворе. Подсчет клеток проводили в камере Горяева и вычисляли по формуле: X = К х А х 104, где: К - разведение; А -количество клеток в 25 больших квадратах камеры.

Мазки готовили по стандартной методике и окрашивали азур II -эозином, либо гематоксилином-эозином. Исследовали следующие цитологические показатели: митотическую активность (подсчет в 1000 клетках количества делящихся); патологии ядра в интерфазе (подсчет в 1000 клетках количества многоядерных и содержащих микроядра); степень вакуолизации ядра и цитоплазмы (подсчет в 100 клетках количества вакуолизированных); патологий митоза (подсчете 1000 митозах количества и разновидностей патологических по классификации В.Н.Блюмкина, В.М.Жданова (1973).

Методы оценки функциональной активности клеток.иммуной системы.

Суспензию спленоцитов селезенки получали по общепринятой методике. Перитонеальные макрофаги (ПМ) выделяли по методу, предложенному КНе^ег (1981). Для получения обогащенной фракции мышам предварительно вводили внутрибрюшинно 1 мл 10% пептона. Использованные в работе суспензии содержали 60-80% макрофагов, в зависимости от вида опухоли. Идентификацию макрофагов проводили,

используя их способность к фагоцитозу туши, зимозана и пиноцитозу нейтрального красного в культуре клеток общепринятыми методами.

Цитотоксическую активность макрофагов по отношению к клеткам карциномы легких Льюис или меланомы В16 определяли по методу В.И.Селедцова с соавт. (1987) по выходу радиоактивной метки из клеток-мишеней.

Для тестирования естественной киллерной активности лимфоцитов применяли метод М.Н. Рыковой с соавт. (1981). В качестве мишеней использовали клетки эритромиелолейкоза человека К-562, меченные ЗН-уридином. Для оценки литического потенциала целого органа активность естественных киллеров выражали в литических единицах (ЛЕ). За единицу принимали количество клеток-эффекторов, лизирующих 30% клеток-мишеней (Ванько Л.В., 1986).

Цитостатическую активность спленоцитов определяли по методике Gadiot et al. (1982) в модификации И.В. Богдашина (1986). В качестве мишеней использовали клетки мастоцитомы Р-815, либо аутологичные опухолевые клетки. Индекс цитостатической активности вычисляли по формуле: ИЦС (%) = (1 - О/К) х 100%, где О - количество импульсов в опытных лунках; К - количество импульсов в лунках с клетками-мишенями.

Статистическая обработка результатов. Математическую обработку полученных результатов проводили методами вариационной статистики с использованием стандартного пакета программ Exell (Microsoft Windows 97). Достоверность различий между двумя независимыми выборками, если распределение изучаемого признака неизвестно, оценивали по непараметрическому критерию Вилкоксона-Манна-Уитни. Достоверность различий между выборочными долями при изучении влияния какого-либо фактора, определяли по критерию углового преобразования Фишера (Гублер Е.В., 1978).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Противоопухолевые и антимётастатические свойства вакцинных штаммов вирусов и их онколизатов. При изучении биологических свойств вируса венесуэльского энцефаломиелита (ВЭЛ), нами была показана его тропность к некоторым опухолям экспериментальных животных -саркоме-37, саркоме-180, подштамму NK/Ly аденокарциномы Эрлиха (Уразова Л.Н., 1986). Исследование онко- и органотропных свойств этого вируса в условиях in vivo проводилось на модели аденокарциномы Эрлиха (табл.2). Обращает на себя внимание аномально высокая концентрация вируса ВЭЛ в опухолевой ткани, что свидетельствует об его повышенной онкотропности. Мы показали, что вакцинный штамм вируса ВЭЛ тропен к опухолевым клеткам и в системе in vitro (табл.3.). Жизнеспособность опухолевых клеток, инфицированных вирусом, существенно снижена, в сравнении с интактными.

Таблица 2

Динамика размножения вакцинного штамма вируса ВЭЛ в органах и тканях мышей линии ВАЬВ/с (Х±т)

Орган Титр вируса ВЭЛ в органах ТЦЦ50/МЛ) Сутки после инфицирования/ кол-во мышей в группе

2/8 3/8 4/8 5/8 6/8 7/8

Л/узел 0 3 ± 0,2* 2± 0,1* 3,5 ± 0,3 3,5±0,4* 0

Селезенка 0 2,5±0,5* 3±0,1* 2,5 ±0,1 0 0

Печень 0 0 2,5±0,1* 0 0 0

Мышца 0 0 0 0 0 0

Опухоль 3 ± 0,2 5 ±0,1 6 ±0,3 3, 5± 0,2 7 ±0,5 5 ±0,1

Примечание: * - различия достоверны (р<0,05) с группой "опухоль"

О репродукции вируса в клетках указанных опухолей свидетельствует их высокая концентрация в супернатантах. Следовательно, вирус ВЭЛ обладает выраженной тропностью к клеткам экспериментальных опухолей мышей как in vivo - при его системном введении в организм опухоленосителей, так и при инфицировании опухолевых клеток in vitro.

Таблица 3

Влияние вакцинного штамма вируса ВЭЛ на жизнеспособность опухолевых

клеток in vitro (X±m)

Штамм опухоли Жизнеспособность клеток (%) Титр вируса в супернатантах (lg ТЩЬо/мл)

Сроки инкубации клеток с вирусом (час)

24 48 24 48

Группы К О К О

Меланома В-16 80±6,4 44±2,5* 26±3,4 8±0,6* 6,0±1,6 Не опр.

Карцинома Эрлиха 76,6±5,0 64,2±7.0 59,2±5,1 1,6±0,2* 6,5±1,8 Не опр.

Примечание: * - различия статистически значимы (р<0.05)

Способность препарата подавлять рост первичного опухолевого очага является одним из основных критериев при оценке его противоопухолевой

активности. При однократном введении вируса ВЭЛ мышам с карциномой Эрлиха, статистически значимое торможение роста опухоли было отмечено на 10-38 сутки (рис.1). Динамика роста, учитывая сроки определения вируса в организме, свидетельствует об его опосредованном воздействии на данный показатель, в том числе, как будет показано далее, модуляцией соответствующих иммунных реакций.

Рис 1. Влияние вируса ВЭЛ на динамику роста первичных опухолей Эрлиха Примечания:: 1 - контрольная группа; 2 - опытная группа; * - на 9-38 сутки наблюдения различия достоверны с группой 1 (р<0,01)

Метастазирование опухоли - один из ключевых признаков ее злокачественности, так как именно этот процесс ограничивает, на ранних стадиях онкогенеза, эффективность всех известных способов терапии необластом (Кавецкий P.E.,1977; Пинчук В.Г.,1979; Roose Е.,1978; Hart I.,1981; Fogler М. et al.,1996). Нами, на моделях перевиваемых опухолей мышей, изучались как противоопухолевая, так и антиметастатическая активность вирусных вакцин. В качестве контроля использовали животных-опухоленосителей, которым вирус не вводился. Было установлено, что вакцинные штаммы вирусов проявляли умеренную самостоятельную противоопухолевую активность, однако, более активно ингибировали развитие метастазов. Так, на 17- 23 сутки после имплантации опухолей индекс ингибирования метастазирования карциномы Льюис вирусами ВЭЛ, оспы, паротита был равен 50-75%, 45-62%, 58-68%, соответственно (рис.2). Уровень метастазирования меланомы В16 составлял 20-78%, в зависимости от штамма вируса и сроков наблюдения. Таким образом, было показано, что вакцинные штаммы исследованных вирусов наиболее активны на ранних стадиях опухолевого процесса, а также в отношении метастазов. Более значимое торможение роста опухолей соотносится с продуктивным циклом

развития вирусов в организме животного-опухоленосителя (7 -14 суток). Однако, антиметастатическая активность вируса наблюдается и в более поздние сроки опухолевого процесса, что может свидетельствовать об его косвенном воздействии на опухолевый рост, в частности, через модуляцию противоопухолевого иммунитета. Очевидно, одну из основных ролей в противоопухолевом эффекте вирусных вакцин играет индуцируемый ими интерферон (ИФН-а). Известно, что (ИФН-а) является связующим звеном между неспецифической резистентностью и адаптивным иммунитетом (Topkins W., 1999). Кроме прямого антипролиферативного действия, он может оказывать модулирующее влияние на мембраны опухолевых клеток, приводя к снижению их метастатического потенциала, а также резистентности к противоопухолевой терапии и действию эндогенных антибластомных механизмов (Воронцова A.JI. с соавт.,1983; Балицкий К.П. с соавт.,1991; Кинзирский A.C., 1995; Ершов Ф.И.,1996; Hillman G.et al., 1994; Salminen E. et al., 1997). Под влиянием ИФН-а ингибируется синтез РНК и протеинов, необходимых для синтеза ДНК, что приводит к угнетению клеточного цикла с переходом раковой клетки в фазу относительного покоя (Matsuoka М. et al., 1996). Кроме того, посредством активации Fas-лигандов лимфоцитов CD8+, индуцируется апоптоз опухолевых клеток (Sellen С. et al., 1996).

LLC LLC+парот LLC+оспа

Юсупси *"""—""* 17 сутки

¡20 сути. Л 10 сутки НИМ

17 сутки ИИМ — •"20сут™ИИМ

Рис. 2. - Влияние вирусных вакцин на метастазирование в легкие мышей С57В1/6 карциномы Льюис

Терапевтический подход, при котором одним из обязательных этапов является оперативное удаление первичного опухолевого узла - один из наиболее близких к клинической ситуации. Нами удаление первичных

опухолей проводилось в сроки, когда, согласно литературным данным (Козлов A.M., 1984), основные метастатические узлы уже образованы. Препараты, тестируемые на способность предотвращать метастазирование, предпочтительно вводить на 2-3 сутки после имплантации первичных опухолей. При тестировании антиметастатической активности терапевтических агентов их необходимо вводить на 6-7 сутки после перевивки опухолей. В связи с вышеизложенным, вакцинный штамм вируса ВЭЛ вводились мышам с карциномой Льюис однократно, на 3, 6 либо 11 сутки после перевивки первичных опухолей. У мышей, получивших вирус на 3 сутки, количество послеоперационных метастазов в легкие снижено в 5,5 раз в сравнении с соответствующим показателем в контроле (рис.3). При инъекции вируса на 6 и 11 сутки после имплантации опухолей ингибирование метастазирования составляло 78 и 56%, соответственно.

□ контрольная группа

т Щ опытная группа

—3—-я

i-Tf-

J! й Й 1

3 6 и

дни вирусной инфекции

Рис 3. Послеоперационное метастазирование в легкие карциномы Льюис у мшпей линии С57В1/6: Примечание: * - различия статистически значимы (р<0,05)

У животных с меланомой В16 при введении вируса ВЭЛ на 6 сутки эксперимента индекс ингибирования метастазирования приближался к 70%, что несколько ниже соответствующего показателя при терапии карциномы Льюис (78%). Кроме того, после удаления опухоли у мышей-опухоленосителей как карциномы Льюис, так меланомы В16, развивались рецидивы первичных опухолевых узлов, тогда как при дополнительном введении вируса ВЭЛ, независимо от срока, рецидивов, практически, не наблюдалось.

Следует отметить, что способность вирусов ингибировать метастазирование значительно усиливается при удалении опухоли. Так, у мышей с нсоперированной карциномой Льюис, получивших вирус ВЭЛ,

индекс ингибирования метастазирования равен 69%, у мышей с удаленными узлами, получивших вирус в те же сроки - 78%. Соответствующие показатели у мышей с меланомой В16 - 56% и 70% (р<0,05).

Многочисленные экспериментальные и клинические данные свидетельствуют о существовании постоянного взаимодействия между организмом, развивающейся в нем злокачественной опухолью и метастазами (Лазарев Н.В.,Грех И.В.,1971; Хунданова Ю.,1978; Lee S., 1979). Удаление развивающейся локально первичной опухоли нередко приводит к усилению метастазирования (Хунданова Л.Л.,1978; Greene Н.,1964; Gorelic Н.,1979), что является косвенным доказательством ее способности ингибировать этот процесс. К факторам, связанным с первичной опухолью и тормозящим образование метастазов, относят антитела, комплексы антиген-антитело и даже некоторые компоненты системы комплемента (Jurin М.,1972; Hyarni М.,1973; Auerbach Р.,1980).

Нами оценивалось влияние удаления первичного опухолевого узла на метастазирование карциномы Льюис. Полученные результаты показали, что хирургическое вмешательство увеличивало общий объем метастазов в легких мышей, однако, введение вируса нивелировало эти различия (табл.4).

Таблица 4

Влияние оперативного вмешательства и вакцины вируса ВЭЛ на общий объем метастазов в легких экспериментальных животных (Х±ш)

Группы Объем метастазов у:

животных оперированных неоперированных

животных животных

Мыши с LLC (6) 4,4 ± 0,36 2,43 ± 0,38

Мыши с LLC + вирус ВЭЛ (10) 0,57 ±0,04* 1,33 ±0,24*

Примечание: * - различия статистически значимы (р< 0,05); в скобках -количество животных в группе

При доклиническом изучении препаратов, обладающих антиметастатической активностью, представляется целесообразным, одновременно с оценкой индивидуального действия исследуемого агента, провести изучение его влияния на эффективность цитостатической терапии, так как она является общепринятой в условиях онкологической клиники (Гольдберг Е.Д.,1992). Известно, что иммунодепрессанты, в частности, циклофосфан (ЦФ), способны активировать инапарентно протекающую инфекцию (Бардина Л.Н., 1981; Фролова Т.С, с соавт., 1982). Интересны результаты, полученные О.С.Данилюк с соавт. (1983): в условиях подавления циклофосфаном как гуморальных, так и клеточных факторов иммунитета, вакцинальный процесс, вызванный осповакциной, протекает значительно

тяжелее. Животные, получившие иммунодепрессант, гибнут чаще, при этом вирус выделялся в повышенных титрах и в более отдаленные, чем в контроле, сроки.

В проведенных экспериментах циклофосфан вводился экспериментальным животным в умеренных терапевтических дозах (суммарно 180 мг/кг в 2-3 приема). Мышам с меланомой В16 вирус вводился однократно, на 5 сутки после имплантации опухолевых клеток. Число метастазов и массу опухолевых узлов определяли на 23 сутки эксперимента. Введения вируса, на фоне терапии циклофосфаном, приводило к снижению противоопухолевого эффекта (табл.5), что, по-видимому, связано с подавляющим действием цитостатика на различные звенья иммунной системы опухоленосителей (Агеенко А.И.,1982; Гершанович M.JI., 1982; Stocman G., 1973: Sharma D., 1983). Напротив, применение Т-активина, который широко используется как стимулятор клеточного звена иммунитета (Попугайло Л.И., 1986; Гадалов В.П., 1988; Михна М.Г., 1988; Арион В.Я., 1990), потенцировало противоопухолевую активность как вируса, так и онколизата. Нами показано, что в поздние сроки развития опухолевого процесса, когда животные контрольных групп погибали, у мышей, получивших сочетанную терапию вирусом и онколизатом, на фоне иммунотерапии Т-активином, метастазы и рецидивы отсутствовали.

Таблица 5

Рост и метастазирование меланомы В16 при комбинированной терапии мышей С57В1 /6 циклофосфаном и вирусом ВЭЛ (Х±т)

Группы мышей Средняя масса опухолей (г) Торможение роста опухолей (%) Среднее число метастазов Ингибирова ние метастазиро вания (%)

МеланомаВ16 1,51 ±0,31 19,0 ± 1,47

В16+ ВЭЛ 0,53 ±0,12 35,0 8,4 ±1,92 56,0

В16 + ЦФ 0,38 ±0,11 75,0 8,3 ± 2.27 56,0

В16 + ЦФ + ВЭЛ 0,25 ± 0,04 83,0 11,8 ± 1,87 38,0*

Примечание: различие достоверно с группой «В 16 + ВЭЛ» (р<0,05)

Опираясь на результаты собственных экспериментов in vivo и литературные данные (Restifo N., 1996; Schirmacher V., 1995,1996), мы предположили, что при инфицировании вирусом опухолевых клеток in vitro также происходит модификация поверхностных клеточных структур, приводящая к изменению антигенного потенциала клеток. Это предположение подтвердилось при использовании лизата клеток меланомы В16, инфицированных вирусом ВЭЛ in vitro, в качестве антигена в реакции

бласттрансформации спленоцитов интактных мышей, что и явилось предпосылкой для применения его в послеоперационной терапии опухолей. Нами показано, что на 24-25 сутки у мышей, которым вводили онколизат, либо вирус, индексы ингибирования послеоперационного метастазирования практически равны и достаточно высоки (80-88%). При комплексной терапии мышей вирусом и лизатом эти показатели приближались к 100%. Таким образом, в опытах in vivo онколизат вакцинного штамма вируса ВЭЛ, даже при однократном применении, обладал отчетливо выраженным антиметастатическим действием (табл.6).

Таблица 6

Послеоперационное метастазирование меланомы В16 у мышей линии С57В1/6 (Х±ш)

Группы мышей Среднее количество метастазов в легких

23 сутки 31 сутки

Меланома В16 50,80 ±4,25 Мыши погибли

В16 + ВЭЛ 6,25 ±1,41* 14,00 ±2,12*

В16+опух.контроль 37,6 ±3,12* Не опр.

В16+онколизат 4,20 ± 1,20* 11.80 ±2,33*

В16+Т-активин 20,08 ± 2,55 36,00 ± 2.83*

В16+ВЭЛ+Т-активин Не опр. 5,82 ± 1,43*

В16+онкол+Т-активин Не опр. 4,75 ±0,89

В16+ВЭЛ+опух.контр 6,00 ±1,42* 9,33 ± ,60*

В16 +ВЭЛ+онколизат 0 1,71 ±0,82*

В16+онкол+Т-активин Не опр. 0,10 ±0,00*

Примечание: различия достоверны с группой «Меланома В16» (р<0,05)

Так как механизмы противоопухолевой активности изученных вирусных вакцин тесно связаны с модуляцией иммунного ответа, мы провели, на фоне введения вируса и онколизата, дополнительную терапию иммуномодулятором. Как указывалось выше, Т-активин способен восстанавливать многие функции иммунитета клеточного типа (Попугайло Л., 1986; Михна М.Г., 1988; Арион В.Я. с соавт., 1990; Гадалов В.П. с соавт.,1998). При проведении моно-терапии Т-активином индекс ингибирования метастазирования, на 23-25 сутки после перевивки опухолей, составлял около 42%. Так как ранее было показано, что в эти сроки, при сочетанном применении вируса и онколизата, метастазы у животных полностью отсутствовали, их количество учитывалось на 31 сутки, когда подавляющая часть животных контрольной группы уже погибала. Установлено, что иммунотерапия Т-активином существенно потенцирует

противоопухолевые свойства как самого вируса ВЭЛ, так и его онколизата (табл.6).

Морфологические нарушения, индуцированные в опухолевых клетках вирусными вакцинами. Важную роль в морфологической характеристике клеток играет исследование характера митотического деления, главной особенностью которого, применительно к клеткам злокачественных опухолей, является резкий рост числа патологических митозов и разнообразие их видов (Блюмкин В.Н., Жданов В.М., 1973; Казанцева И.А., 1981; Караевский H.A. с соавт.,1993).

Наше исследование показателей митотического режима клеток асцитного варианта карциномы Эрлиха при заражении вирусом ВЭЛ in vitro показало, что после 48-часового культивирования достоверно уменьшается процентное содержание нормальных митозов, наряду с существенным снижением количества нормальных анафаз. Под воздействием вируса ВЭЛ статистически значимо увеличивается процентное содержание таких нарушений митоза, как отставание одиночных хромосом в анафазе, образование хроматидных мостов, неравномерное расхождение хромосом в анафазе, а также формирование много- и неравнополюсных анафаз и телофаз (рис.4). Одновременное увеличение количества клеток с микроядрами можно связать с особенностями воздействия вируса ВЭЛ преимущественно на мигготический аппарат клеток асцитного рака Эрлиха, что и проявляется в увеличении процента патологических митозов (рис. 4).

S24 ч с ВЭЛ

□ 48 ч контроль

■ 48 ч с ВЭЛ 1

&Ж ¡Н^гаД Лг

абвгдежз

Рис.4. Процентное соотношение патологических форм митозов в клетках асципюй

карциномы Эрлиха, инфицированных вирусом ВЭЛ ш у^о: А - отставание одиночных хромосом в анафазе; Б - хромагидные мосты в анафазе; В - неравномерное расхождение хромосом в анафазе; Г - трех-,четырех- и многополюсная анафаза; Д - неравномерная телофаза; Е - трех-,четырех- и многополюсная телофаза Ж -частота микроядер; 3 - комбинированные формы патологических телофаз, * - различия достоверны с контролем (р<0,05)

Эти изменения, являющиеся характерными для инфекции вирусами полиомиелита, Коксаки В, везикулярного стоматита и венесуэльского энцефаломиелита лошадей, были описаны А.Н. Мосоловым с соавт. (1971).

Мы установили, что максимальные цитопатические изменения клеток асцитной карциномы Эрлиха in vitro, сопровождающиеся статистически значимым снижением их жизнеспособности (с 76% до 1,5%), митотической активности (с 2,5% до 0,2-0,4%), а также увеличением процентного содержания в культуре клеток с микроядрами и симпластами (3,6-9,6%), вызываются вирусом ВЭЛ. Менее выраженные, чем при инфицировании данным вирусом, цитопатический и цитостатический эффекты обнаруживались при воздействии вируса паротита. Все исследуемые вирусные штаммы показали умеренно выраженное цитопатическое действие в отношении клеток эритромиелолейкоза человека К-562. Максимальный эффект наблюдался при действии на клетки Нер-2 вируса паротита, несколько менее выраженное цитопатическое действие оказывал вирус ВЭЛ (табл.7).

Таблица 7

Влияние вакцинных штаммов вирусов на цитоморфологические показатели опухолевых клеток (X ± гп)

Регистрируемые показатели, % Интактные клетки Клетки инфицированы вирусами:

ВЭЛ | гриппа паротита

Клетки рака гортани человека (Нер-2)

Многоядерные 2,2 ± 0,4 5,2 ± 0,9* 3,8 ±0,6* 8,8 ± 1,2**

Вакуолизированные 42,8 ± 5,3 58,4 ±6,8» 10,2 ± 1,5** 77,2 ±9,0**

Содерж. микроядра 3,6 ±0,5 9,6 ±2,8* 1,0 ±0,4* 3,6 ± 1,2

Митотическая активн. 8,2 ±1,6 4,0+1,7* 1,6 ±0,6* 5,2 ±0,6*

Клетки эритромиелолейкоза человека (К-562)

Многоядерные 0,6 ± 0,2 2,6 ±0,4* 0,2 ± 0,2* 4,6 ±0,5*

Вакуолизированные 5,4 ± 0,9 39,0 ±1,8** 20,4 ± 1,2** 28,8 ±1,1**

Содерж. микроядра 10,0 ±5,5 26,0 ±5,0** 21,0 ±6,0** 52,1±8,2**

Митотическая активн. 7,4 ±0,5 5,8 ±0,6* 5,8 ± 0,6* 13,2 ±0,2*

Клетки лимфомы Беркитга (P3HR-I)

Многоядерные 3,6 ± 0,5 5,8 ± 0,8* 7,8 ± 0,3* 11,2 ±0,2*

Вакуолизированные 8,2 ± 2,6 29,6 ±1,9** 17,0 ±2,8* 29,6 ±2,8**

Содерж. микроядра 18,2 ±4,1 28,2 ±1,2** 14,2 ±0,5 29,0 ±1,3**

Митотическая актив. 3,6 ± 0,7 3,4 ±0,5 7,0 + 0,7* 3,8 ±0,7

Примечания: здесь и далее в табл.8, 9 различия статистически значимы: * -р<0,05; ** - р<0,01

В клетках РЗНП1 максимальный цитопатический эффект отмечен, в виде значительной вакуольной деградации, при воздействии вирусов паротита и ВЭЛ. При этом, как и при действии вирусов болезни Ньюкастла, Сендай и герпеса, наблюдается пульверизация хромосом, в основе которой лежит нарушение связи их репликонов с ядерной оболочкой (Мосолов А.Н. с соавт., 1971). Известно, что многие из парамиксовирусов, к которым относится вирус паротита, вызывают образование симпластов на ранней стадии инфекции (Фернер Ф. с соавт., 1977). Весь цикл репликации вируса паротита протекает в цитоплазме, с чем, видимо, и связан высокий процент вакуолизации клеток. Вирусные гликопротеины включаются в клеточную мембрану, замещая белки, что и вызывает слияние клеток, вследствие чего в инфицированной клеточной культуре формируются многояцерные синцитии, процент которых относительно высок (табл.7). Наши исследования показали, что вирус ВЭЛ подавляет жизнеспособность клеток асцитной карциномы Эрлиха, в то время как вирусы паротита и гриппа ее стимулируют. Обратный эффект наблюдался в отношении данного показателя для клеточных линий эритромиелолейкоза человека и лимфомы Беркитга (табл.8).

Таблица 8

Цитологические изменения клеток асцитной карциномы Эрлиха, индуцированные вирусными вакцинами in vivo (X ± ш)

Регистрируемые показатели, клетки: Интактные мыши Мыши инфицированы вирусами:

гриппа | паротита | ВЭЛ

9 сутки

Многоядерные 0,7 + 0,11 0,12 ±0,01 1,9 ±0,4* 1,6 ±0,22*

Вакуолизированные 17,9 ±3,3 24,2 ± 8,6 19,8 ±2,3 21,6 ±3,8

Содерж. микроядра 17,3 ±2,6 18,8 ±4,7 16,9 ±6,1 19,2 ±5,5

Митотическая актив. 1,1 ±0,1 1,4+0,3 0,74±0,2* 0,13±0,01*

11 сутки

Многоядерные 0,9 ±0,1 0,8 ± 0,2 0,9 ±0,08 0,6 ± 0,07

Вакуолизированные 9,2 ±1,8 8± 1,1 11,8 ±2,3 12,4 ± 4,2

Содерж. микроядра 16,1 ±7,9 19,0 ±5,5 16,0 ±5,8 17,3 ±3,3

Митотическая актив. 0,9 ±0,1 | 1,1 ±0,1 0,6 ±0,09 0,2 ±0,02*

Из литературных источников известно, что вирус гриппа обладает выраженными онкотропными свойствами в отношении клеток асцитных и солидных опухолей, что, однако, редко сопровождается онколизом (Муцениеце А.Я., 1972; Орловский A.A., 1992). Нами показано, что при инфицировании мышей-носителей асцитной карциномы Эрлиха вирусом гриппа ни один из регистрируемых показателей не обнаружил достоверного

различия с контролем. Однако, на модели солидного варианта карциномы Эрлиха было выявлено статистически значимое снижение митотической активности клеток на 7 сутки наблюдения. Следовательно, влияние вируса гриппа на опухолевые клетки асцитного и солидного вариантов карциномы Эрлиха in vivo оказалось минимальным (табл.8, 9). Вирус ВЭЛ, в отличие от вируса гриппа, активно, особенно на поздних стадиях эксперимента, воздействовал на цитоморфологию клеток как асцитного, так и солидного вариантов опухоли Эрлиха (табл.8,9).

Таблица 9

Цитологические изменения клеток солидного рака Эрлиха, индуцированные вирусными вакцинами in vivo (X ± ш)

Регистрируемые показатели, клетки: Интактн. мыши Мыши инфицированы вирусами:

гриппа паротита ВЭЛ

7 сутки

Многоядерные 1,2 ±0,62 1 ± 0,31 1,6 ±0,24 1,6 ±0,39

Вакуолизированные 46,4 ± 3,97 51,4 ±3,7 35,6 ± 3,54 45,0 ±2,7

Содерж. микроядра 16,0 + 4,47 13,9 ±4,2 16,1 ±2,73 16,0 ±6,7

Митотическая актив. 1,2 ±0,1 0,8 ± 0,08* 0,5 ±0,02* 0,2 ±0,03*

14 сутки

Многоядерные 1,3 ±0,37 1 ± 0,31 1,2 ± 0,58 1,6 ±0,5

Вакуолизированные 48,2 ± 7,34 43,2 ± 3,16 60,8 ± 2,98* 52,6 ±3,4

Содерж. микроядра 8,0 ±3,78 10,5 ±3,75 16,0 ±6,74* 16,0 ±6,74*

Митотическая актив. 0,8 ± 0,04 0,66 ± 0,08 0,42 ± 0,09* 0,16 ±0,06*

21 сутки

Многоядерные 1,3 ±0,62 1,4 ±0,5 1,62 ±0,89 1,6 ±0,77

Вакуолизированные 44 ± 9,35 28 ±1,83 57,8 ±2,12* 48,4 ±2,28*

Содерж. микроядра 6,0 ±3,99 8 ±1,99 12 ±5,8* 14 ±3,99*

Митотическая актив. 0,78 ±0,07 i 0,6 ±0,05 0,4 ±0,03* 0,14 ±0,02*

Мы показали, что вакцинные штаммы вирусов ВЭЛ и паротита увеличивали процентное содержание многоядерных клеток асцитной карциномы Эрлиха и содержащих микроядра - солидной. Особого внимания заслуживает вопрос о влиянии этих вирусов на митотическую активность опухолевых клеток. Вирус ВЭЛ достоверно снижал ее на всем протяжении эксперимента (до 11 суток для асцитного варианта карциномы Эрлиха; до 21 - для солидного). Вирус паротита достоверно снижал данный показатель в клетках солидной карциномы и только на 7 сутки - в опухоли мышей с асцитным вариантом (табл.8,9).

Мы провели оценку цитологических показателей клеток асцитной карциномы Эрлиха при комплексной терапии вакцинным штаммом вируса ВЭЛ и винкристином (ВК). Двум группам мышей-опухоленосителей был 3-кратно введен винкристин в дозе 0,4 мг/кг, при этом, животные одной из них получили дополнительно 104/мышь вируса ВЭЛ. При сочетанной терапии вирусом ВЭЛ и винкристином на ранних стадиях онкогенеза (4, 11 сутки) отмечено статистически значимое снижения процентного содержания клеток с вакуолизированной цитоплазмой и делящихся (табл.10). Отсутствие этого феномена на поздних сроках эксперимента может свидетельствовать о том, что гипертрофированная способность вируса ВЭЛ вызывать дистрофические изменения клеток, потенцируемая винкристином, приводит к интенсивной гибели вакуолизированных клеток на начальном этапе лечения. С другой стороны, терапия винкристином, не вызывая на 4 сутки вакуольной дистрофии опухолевых клеток, достоверно снижала данный показатель на 11 и 18, что может свидетельствовать о гибели этих клеток на ранних стадиях опухолевого процесса, либо о неспособности препарата индуцировать такого рода изменения.

Таблица 10

Влияние комплексной терапии вирусом ВЭЛ и винкристином на цитологические характеристики асцитного рака Эрлиха (Х±ш)

Клетки, % Группы мышей Сутки эксперимента

4 11 18

Делящиеся Контроль 1,98 ±0,2 1,76 ±0,1 1,34 ±0,4

ВЭЛ+ ВК 0,21 ± 0,04* 0,13 ±0,05* 1,02 ±0,2*

ВК 0,22 ± 0,01* 0,16 ±0,02* 0,25 ±0,01*

С вакуолизир. цитоплазмой Контроль 39,1 ±3,2 43,7 ± 2,5 34,1 ± 3,6

ВЭЛ+ ВК 19,8 ±1,2* 21,5 ±2,3* 52,2 ± 6,3*

ВК 33,1 ±2,4* 24,9 ± 3,6* 34,1 ± 2,8*

Перитонеальн. иммуноциты Контроль 0,085 ± 0,01 1,0 ±0,2 0,99 ±0,1

ВЭЛ+ВК 2,27 ±0,1* 1,97 ±0,05* 1,88 ±0,2*

ВК 1,09 ±0,1 0,66 ± 0,05 0,64 ±0,02

Примечание: * - различия статистически значимы (р<0,05)

Таким образом, нами показано, что комплексная терапия асцитного рака Эрлиха вакцинным штаммом вируса ВЭЛ и винкристином вызывает статистически значимое снижение митотической активности опухолевых клеток на ранних стадиях онкогенеза. При этом, в течение всего срока наблюдения, происходит значительное увеличение количества перитонеальных иммунокомпетентных клеток, достоверно коррелирующее с

аналогичным показателем для клеток с вакуолизированной цитоплазмой на всех этапах экспериментального онкогенеза (г=0,60; р<0,05).

Механизмы противоопухолевого действия вирусных вакцин. Данные, свидетельствующие о воздействии вируса на антигенный потенциал опухолевой клетки мы получили при оценке реакции бластгрансформации лимфоцитов здоровых мышей в ответ на аутологичные клетки аденокарциномы Эрлиха, выделенные на 8 сутки после введения вируса ВЭЛ. Установлено, что индекс стимуляции пролиферации клеток-эффекторов на 40-70% выше при действии на лимфоциты клеток опухоленосителей, получивших вирус (рис.5). Эти результаты указывают на способность вируса, помимо оказания прямого цитолитического воздействия на опухолевые клетки, стимулировать неспецифическую резистентность организма-опухоленосителя и влиять на формирование иммунного ответа на опухоль.

Рис 5. Бластгрансформация спленоцитов мышей линии BALB/c в ответ на опухолевые клетки аденокарциномы Эрлиха.

Примечания: 1 -клетки контрольных животных; 2 -клетки мышей, получивших вирус; соотношение эффекторы / опухолевые клетки: - А- 2:1;Б —1:1 * - различия достоверны с соответствующими значениями группы 1 (р<0,01)

При оценке характера опосредованного воздействия вакцинных штаммов вирусов на различные звенья иммунной системы в опытах in vitro нами установлено, что прогрессирующий рост первичных опухолей Эрлиха приводит к постепенному угнетению иммунных функций. Определение на 10 сутки после введения вируса ВЭЛ спонтанной пролиферативной активности лимфоцитов и их ответа на Т- и В-клеточные митогены показало, что эти параметры были снижены в группе опухоленосителей, но у животных, которым был введен вирус ВЭЛ, были сопоставимы со здоровым контролем. Кроме того, в указанный срок у мышей, которым вводили вакцину, была

отчетливо снижена супрессорная активность спленоцитов (22%) в сравнении с таковой у нелеченных животных (50,4%). Однако, на 20 сутки наблюдения эти различия нивелируются, что ассоциируется с прогрессированием опухолевого процесса у мышей опытных групп. Сопоставимы индексы цитостатической и мембранотоксической активности спленоцитов мышей групп 2 и 3, которые также ниже аналогичных показателей, полученных на 10 сутки после введения вируса и существенно ниже, чем у интактных животных. Та же тенденция наблюдается и в активности супрессорных клеток: на 20 сутки после введения вируса индекс супрессии у мышей контрольной и опытной групп был равен, соответственно, 80,5 и 77%, что, примерно, в 3 раза выше, чем у интактных животных.

Мы также оценили активность иммунокомпетентных клеток при введении вируса на фоне оперативного вмешательства. Вирус ВЭЛ вводился мышам с карциномой легких Льюис на 6 супси после имплантации опухолей, удаление которых проводилось на 10 сутки. У неоперированных животных инфицирование вызывало существенное повышение цитостатической активности спленоцитов и активности натуральных киллеров. Этот эффект наблюдался и на фоне удаления первичной опухоли (рис.6,7).

SE

J 40

'Д>

I;

L-

JL-

" 1 2 3 4 5

группы мышей

Рис 6. Цитостатическая активность спленоцитов мышей линии С57В1/6 с карциномой

легких Льюис

Примечания: 1 - интактные мыши; 2 - опухоленосители, 3 - группа 2 + вирус ВЭЛ; 4 -мыши с удаленными опухолями; 5 - группа 4 + вирус ВЭЛ; * - различия достоверны с группой 1 при р<0,05; ** - то же при р<0,01

Кроме того, согласно полученным нами данным, у мышей с LLC операция приводила к увеличению массы метастазов в легких. Однако, в сроки, когда проводилось тестирование этих показателей, мы не наблюдали описанного в литературе снижения перечисленных параметров активности иммунокомпетентных клеток. Это, по-видимому, объясняется небольшим

объемом проводимой операции и выбором относительно позднего срока исследования, т.е., в период восстановления функциональной активности иммунокомпетентных клеток. С другой стороны, известно, что избыток опухолевого антигена может тормозить развитие иммунного ответа, стимулируя Т-супрессоры (Матэ Ж.,1980; Хаитов P.M.,1984; Ройт А.,1991). В связи с этим, удаление опухолей, в сочетании с терапией вирусом, приводило к усилению активности противоопухолевых эффекторов, в результате чего, на наш взгляд, и происходило более выраженное снижение послеоперационного метастазирования у животных, которым был введен вирус. Аналогичные результаты получены при исследовании влияния вирусных вакцин на активность иммунокомпетентных клеток на фоне «условного метастазирования» у мышей BALB/c с карциномой Эрлиха.

группы мышей

Рис 7. Мембранотоксическая активность спленоцитов мышей линии С57В1/6 с карциномой легких Льюис Примечания: те же, что в рис.6; * - различия достоверны с группой 1 (р<0,01); ** - то же с группой 2 (р<0,05); *** -тоже с группой 4 (р<0,01)

Известно, что часто макрофаги составляют до 90% всех инфильтрирующих опухоль иммунокомпетентных клеток, что указывает на их важную роль во взаимоотношениях опухоли и организма (Haskill S. et al., 1975; Steele J. et al., 1985). Эти клетки способны продуцировать свыше 100 биологически активных соединений - от простейших молекул, до высокомолекулярных соединений с цитотоксической или

ростстимулирующей активность (Окулов Б.В., 1997; Nathan С.,1987; Cavaillon J., 1994). Мы попытались оценить вклад макрофагов в реализацию противоопухолевой активности вакцинных штаммов вирусов. Установлено, что на 10 сутки наблюдения цитостатичеекая активность

перитонеальных макрофагов (ПМФ) в группах животных с LLC, которым была проведена терапия исследуемыми вирусными вакцинами, достоверно превышает аналогичные показатели у интактных животных и опухоленосителей (табл. 11).

Мы исследовали влияние комплексной терапии неоплазм вирусными вакцинами и ЦФ на противоопухолевую активность перитонеальных МФ. Было показано, что на 17 сутки наблюдения супернатанты перитонеальных макрофагов от мышей-опухоленосителей оказывают более выраженное цитостатическое действие на клетки-мишени, чем клетки интактных животных. Циклофосфан умеренно снижал цитостатическую активность ПМФ у мышей с опухолью, однако введение вируса оспы на этом фоне существенно ее усиливало. Вирус паротита подобного действия не оказывал.

Таблица 11

Влияние вирусных вакцин на цитостатическую активность перитонеальных

макрофагов

Группы мышей Индекс цитостазиса (%)

Перитонеальные макрофаги Супернатант

Интактные 7,7 ± 0,97 25,7 ± 8,56 -

Карцинома Льюис (LLC) 49,8 ±0,75* 66,4 ± 0,86*

LLC+ паротит 58,67 ± 2,74*** 55,5 ± 3,83*

LLC + оспа 64,2 ±1,87*** 96,4 ±0,32***

LLC + ВЭЛ 61,32 ± 1,0*** 84,1 ±20,51***

Примечания: здесь и далее: * - различия достоверны с интактной группой (р<0,05); ** - различия достоверны с группой LLC (р<0,05)

Известно, что действие экстремальных факторов, в частности, операции, приводит к снижению естественной резистентности организма, что может сопровождаться стимуляцией процессов опухолевого роста и метастазирования (Сухих Г.К.,1985; Varany J.,1981). Оценивая вклад иммунокомпетентных клеток в реализацию антибластомного действия вирусных вакцин, мы установили, что терапия опухолей вирусами оспы и паротита, в сочетании с удалением первичных опухолей, сопровождалось достоверным повышением цитостатической активности перитонеальных макрофагов (табл. 12). Следует также отметить, что введение животным, на фоне оперативного вмешательства, вируса оспы, приводило к усилению цитотоксической активности перитонеальных макрофагов.

Поскольку, взаимоотношения противоопухолевых эффекторов с опухолевыми клетками осуществляется в опухолевом очаге, мы сочли целесообразным оценить влияние вирусных вакцин на функциональную

активность опухолеассоциированных макрофагов. При этом, отмечена достоверная стимуляция мембранотоксической активности этих клеток только в группах мышей, получивших, на фоне терапии цгаслофосфаном, вирус оспы. Применение других схем терапии положительного эффекта не давало, что не противоречит встречающимся в литературе данным об уменьшении, либо отсутствии цитотоксичности к опухолевым клеткам у опухолеассоциированных макрофагов (Окулов В.Б.,1997; Yanagawqa Е. й а1., 1985).

Таблица 12

Влияние вирусных вакцин и оперативного вмешательства на цитостатическую активность перитонеальных макрофагов

Группы животных Индекс цитостазиса (%)

интактные LLC LLC+паротит LLL+ocna

1 55,8 ± 3,62 79,6 ± 2,44* 59,7 ±3,98** 79,2 ± 3,47*

2 69,1 ± 2,77 64,0 ± 1,06 92,1 ±0,03** 88,5 ±0,06**

Примечания: 1 - неоперированные животные; 2 -животные с удаленными первичными опухолями

К тому же, представленные данные отражают состояние исследуемых клеток в период максимального роста и метастазирования опухоли, что не могло не сказаться на полученных результатах. Известно, что активация иммунокомпетентных клеток, в частности, макрофагов, различными агентами, носит волнообразный характер и зависит как от исходного уровня функциональной активности, так и от определяющих ее факторов. В частности, на ранних этапах активации макрофагов in vivo и in vitro (2-5 сутки) проявляются их цитотоксические свойства, которые к 15 суткам сменяются фазой продукции цитокинов с преобладающей рост-стимулирующей активностью (Зубова С.Г. с соавт.,1996). Аналогичная ситуация выявлена нами в отдельных экспериментах - отсутствие цитотоксичности у макрофагов опухоленосителей и появление выраженного фидерного эффекта при действии цитостатиков. Выявленное корригирующее влияние вирусных вакцин обусловлено, очевидно, активирующим действием индуцированного ими интерферона-a на все звенья системы иммунитета (цитостатические эффекторы, макрофаги, натуральные киллеры, Т-лимфоциты).

Мы также оценили функциональное состояние спленоцитов по их способности проявлять - неспецифическое цитостатическое действие на клетки мастоцитомы Р-815 и мембранотоксическое действие на клетки-мишени эритромиелолейкоза К-562 в условиях терапии вирусными вакцинами. При изучении влияния вирусных вакцин на цитостатическую активность спленоцитов установлено, что на 10 сутки опухолевого роста (7

сутки после введения вируса) индекс цитостазиса в группах животных, инфицированных вирусами паротита и ВЭЛ достоверно превышает аналогичные показатели в группах интактных животных и опухоленосителей. При этом супернатант спленоцитов проявляет более высокую цитостатическую активность в отношении тест-клеток Р-815 во всех группах мышей, получавших вирусные вакцины (табл.13). Это согласуется с отмеченной нами ранее высокой антиметастатической активностью изученных вирусных вакцин, которая может быть связана с повышением антипролиферативного потенциала спленоцитов в период формирования метастазов: есть литературные данные о взаимосвязи ингибиции метастазирования с цитостатической активностью лимфоцитов (Oguri Н. et al, 1992; Black Р. et al., 1993; Wallace P., Morahan P.,1994).

Сочетанное применение вирусов осповакцины или паротита с циклофосфаном достоверно увеличивало цитостатическую активность спленоцитов в группах мышей, получивших эту терапию. Способность лимфоцитов контактно ингибировать пролиферацию опухолевых клеток-мишеней снижается у мышей, получавших ВЭЛ либо винбластин, либо их сочетание. Однако супернатанты спленоцитов обладают более выраженным цитостатическим эффектом, хотя следует отметить, что ВЭЛ не усиливает действие цитосгатика. В целом, вирусные вакцины не оказывают существенного действия на активность иммунокомпетентных клеток у мышей с опухолями, леченных цитостатиками. Это согласуется с полученными нами данными о том, что эффективность цитостатической терапии как в отношении первичного опухолевого узла, так и метастазов, не повышается на фоне введения вирусов при использованных в работе схемах сочетанного применения цитостатиков и вирусных вакцин.

Таблица 13

Влияние вирусных вакцин на цитостатическую активность спленоцитов

Спленоциты

Интактн LLC LLC+парот. LLC+оспа LLC+ВЭЛ

ицс % 14,3 ±0,85 63,6 ±1,6* 70,2 ±2,6*** 34,7 ± 3* 81,4 ±2***

Суточный супернатант спленоцитов

ИЦС % 39,5 ±1,5 45,2 ± 1,96 | 70 ±4,6*** | 77 ±1,5*** 67 ±5,1***

Примечания: различия достоверны: * - с группой интактных мышей; ** - с группой опухоленосителей (р<0,05)

При оценке влияния оперативного вмешательства и вирусных вакцин на цитостатическую активность спленоцитов, зафиксировано существенное повышение ее при удалении первичной опухоли LLC во всех обследованных

группах животных. При этом в группах животных, получивших терапию вирусными вакцинами паротита и оспы, отмечено их потенцирующее действие на изученный показатель. На 17 сутки опухолевого роста активность натуральных киллеров в группах животных, получивших комплексную терапию, несколько снижена, в сравнении с соответствующими группами неоперированных. В группах как оперированных, так и не подвергавшихся оперативному вмешательству мышей, цитостатическая и мембранотоксическая активность спленоцитов существенно превышает соответствующие показатели у интактных животных.

Таким образом, результаты проведенных исследований показали, что вирусные вакцины способны модифицировать функциональную активность спленоцитов и макрофагов как интактных животных, так и мышей-опухоленосителей. При использовании цитостатиков, в частности, циклофосфана, снижение цитостатической активности спленоцитов нивелировалось введением вирусов оспы или паротита. Следует отметить, что вирусные вакцины не оказывали существенного влияния на активность естественных киллерных клеток селезенки в большинстве используемых модельных ситуациях. Однако, не исключена их активация в опухоли, вносящая вклад в торможение первичного опухолевого узла, это может быть особенно важным моментом в условиях, когда не обнаружено активации ассоциированных с опухолью макрофагов, однако отмечено уменьшение первичной опухоли при использовании вирусных вакцин. Рядом авторов показано повышение тропности ЕКК к опухолевой ткани под действием цитокин-индуцирующих агентов (КагавЫта А. й а1.,1991; Fogler М. с{ а1.,1996). Также не отмечено модуляции противоопухолевой активности макрофагов, инфильтрирующих опухолевый узел.

Согласно полученным нами данным, использование вирусных вакцин наиболее эффективно в отношении метастазирования гематогенно метастазирующих опухолей, условного метастазирования на модели карциномы Эрлиха, или на фоне оперативного удаления первичной опухоли с последующей оценкой послеоперационного метастазирования. Иначе говоря, вирусные вакцины проявляют регулирующее действие на процессы метастазирования. Во всех перечисленных модельных ситуациях предполагается вовлечение различных иммунологических факторов в реализацию антиметастатического действия вирусов, так как известно, что максимальная эффективность иммунологической защиты проявляется при наличии небольшого количества опухолевых клеток. Взаимодействие иммунной системы с опухолевыми клетками более эффектно, чем в первичном опухолевом узле, проявляется на этапах метастазирования. Это связано как с системным ингибирующим влиянием опухоли на иммунокомпетентные клетки, так и со способностью опухолевых клеток модулировать опухолевое микроокружение таким образом, что механизмы противоопухолевой защиты становятся неэффективными.

Иммуноопосредованные механизмы могут быть связаны со стимуляцией формирования вирусами специфического иммунного ответа на опухолевые клетки, особенно вероятной при моделировании условного метастазирования, активацией неспецифических эффекторных клеток (макрофагов и лимфоцитов), способных ингибировать пролиферацию или оказывать цитотоксическое действие на опухолевые клетки на этапах диссеминации. Показанная нами способность изучаемых вирусов повышать иммуногенность опухолевых клеток, стимулировать пролиферативную активность лимфоцитов, модулировать цитостатическую и цитотоксическую активность макрофагов и спленоцитов, - все эти механизмы, очевидно, вносят вклад в антабластомное действие вирусных вакцин.

Таким образом, результаты проведенных исследований показали, что изученные вакцинные штаммы вирусов, проявляя высокую тропность к клеткам экспериментальных опухолей, способны индуцировать их лизис и влиять на процессы метастазирования, изменяя антигенные и иммуногенные характеристики этих клеток, а также модулируя эффекторные неспецифические реакции организма-опухоленосителя.

ВЫВОДЫ

1. Вакцинные штаммы вирусов ВЭЛ, паротита и осповакцины обладают высокой тропностью к клеткам изученных экспериментальных опухолей in vivo: уровень их вирулентности в клетках опухолей составил 6,5-7,0 lg ТЦЦ50/мл, при низких концентрациях (2,0-3,5 lg ТЦД5о/мл) в таких органах животных, как лимфатические узлы, селезенка, печень и мозг.

2. Изученные вакцинные штаммы вирусов обладают высокой тропностью к клеткам экспериментальных опухолей in vitro: при снижении в течение 48 часов жизнеспособности опухолевых клеток меланомы В16 и аденокарциномы Эрлиха до 8,0% и 1,6%, вирулентность соответствующих супернатантов составила 6,0 и 6,5 lg ТЦД50/МЛ, соответственно, при исходной концентрации вируса 3,0 lg ТЦД5(/мл.

3. Все исследованные вакцинные штаммы вирусов проявляют противоопухолевые и антиметастатические свойства: на 16-20 сутки эксперимента наблюдается статистически значимое снижение роста экспериментальных опухолей (вирусом ВЭЛ - до 80%, паротита - до 45%, осповакцины - до 37%). При этом индекс ингибирования метастазирования составил до 92%, 68% и 62%, соответственно.

4. Механизмы противоопухолевой активности вакцинных штаммов вирусов базируются как на прямом цитодеструктивном действии на опухолевые клетки, так и на модуляции отдельных параметров иммунной системы: цитостатической и супрессорной активности лимфоцитов, активности натуральных киллеров, способности лимфоцитов к пролиферации.

5. Вакцинные штаммы вирусов ВЭЛ, паротита и оспы индуцируют в опухолевых клетках такие цитоморфологические нарушения, как появление многоядерных, с микроядрами и вакуолизированной цитоплазмой клеток (4,4-8,8%; 3,6-9,6%; 58,4-77,2%, соответственно). Кроме того, вирусы ВЭЛ и паротита значительно подавляют митотическую активность опухолевых клеток in vivo (0,2% и 0,4%, соответственно, при митотической активности интактных клеток - 2,4%,).

6. Вакцинный штамм вируса ВЭЛ индуцирует в культуре опухолевых клеток статистически значимое увеличение числа патологических митозов за счет снижения нормальных: отставание одиночных хромосом в анафазе (с 0,1% до 0,3%); хроматидные мосты в анафазе (с 0,1 до 2,0%); неравномерное расхождение хромосом в анафазе (с 1% до 3%); многополюсные ана- и телофазы (с 2% до 13%); неравномерные телофазы (с 2% до 8%).

7. Терапия вакцинными штаммами вирусов на фоне удаления первичных опухолей приводила к статистически значимому угнетению послеоперационного метастазирования и рецидивирования опухолей (78,0-82,1%; 60,0-100%, соответственно), которое ассоциировало с усилением цитостатической активности перитонеальных макрофагов и спленоцитов.

8. Вакцинный штамм вируса ВЭЛ, при сочетанном применении с онколизатом инфицированных им опухолевых клеток, полностью подавлял послеоперационное метастазирование изученных экспериментальных опухолей.

9. Вакцинный штамм вируса ВЭЛ усиливал, преимущественно, противоопухолевые свойства циклофосфана (торможение роста первичных опухолевых узлов до 83,0%), в то время, как вирус паротита более активно потенцировал антиметастатические (индекс ингибирования метастазирования до 92,0%).

Ю.Перитонеальные макрофаги животных-опухоленосителей,

инфицированных вирусными вакцинами, проявляли выраженное цитостатическое действие, которое превышало аналогичный показатель опухолеассоциированных макрофагов (59,3-96,01%; 29,5-38,4%, соответственно).

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Уразова Л.Н. Сравнительный хроматографический анализ популяции штаммов вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей с различной патогенностью // Мат-лы регионарной научно-практ. конф.- Томск.- 1974,-С.84-87.

2. Уразова Л.Н. Исследование плавучей плотности некоторых арбовирусов в линейном градиенте плотности сахарозы, гемагглютинирующей и

инфекционной активности их фракций // В кн.: «Вирусные и бактерийные препараты».- 1978.- С.28-33.

3. Уразова Л.Н.. Рузаев Л.Н. Характеристика крупнобляшечного клона, изолированного из популяции аттенуированного штамма вируса венесуэльского энцефаломиелита // В кн.: «Вирусные и бактерийные препараты»,- 1978.- С.34-39.

4. Уразова Л.Н.. Подоплекин В.Д. Некоторые свойства дезинтегрированного вируса венесуэльского энцефаломиелита // В кн.: «Биологические препараты и иммунологическая реактивность организма». - Томск,-1981.-С.27-29.

5. Подоплкина Л.Е., Унгер Г.Н., Уразова Л.Н.. Тымчишин П.Н. Разработка антигенов некоторых арбовирусов для контроля специфической активности эритроцитарных диагностикумов в реакции непрямой гемагглютинации. В кн.: Арбовирусы. Сб. докл. Всесоюзной проблемной комиссии.- Таллинн.- 1984.- С.109-110.

6. Уразова Л.Н. Онколитические свойства аттенуированного штамма вируса венесуэльского энцефаломиелита // В кн.: «Актуальные вопросы современной онкологии»,- Томск,-1986,- В.4.- С.53-56.

7. Уразова Л.Н., Подоплекин В.Д. Тропизм вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей к некоторым злокачественным опухолям в эксперименте // В кн. «Актуальные вопросы биомедицинской технологии».-1991.- С.116-118.

8. Urazova L.. Podoplyokin V. Study of possibility of using Venezuelan encephalomyelitis virus in oncology experiment // The 2Ы Far-Eastern International Symposium Multimodality Treatment of Cancer.- 1994.-Vladivostok.- P.127.

9. Уразова Л.Н., Подоплекин В.Д. Возможности применения вируса венесуэльского энцефаломиелита в онкологическом эксперименте // Акт.пробл.соврем.онкол..-Томск,-1994,- Вып.П.--стр.152-154.

10.Urazova L.. Gromova A. Study of oncotropic and oncolytic properties of Venezuelan encephalomyelitis virus.- 6th International Congress of Anti-cancer Treatments (France).- 1996.- Abstr.489.

11.Urazova L..Gromova A. Anti-metastatic therapy of mice with metastatic melanoma В16.- Seven Internati-onal Congress on Anti-Cancer Treatment: 1997: Paris - France: Abstr.703.

12.Urazova L„ Gromova A. Study of oncotropic and oncolytic properties of Venezuelan encephalomyelitis virus 13th Asia Pasific. Canccr Conference.3rd International Cancer Congress. Hong Kong, 1996, Abstr.H 4.8.

13.Urazova L., Gromova A. Therapy by Vaccinal strain of Venezuelan Encephalomyelitis Virus and Its Oncolisats in Mice with Melanoma B16 in Experiment.- 14th Asia Pasific. Cancer Conference 4th International Cancer Congress. Hong Kong, 1997.- Abstr.P181.

РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ I БИБЛИОТЕКА I СПетербург j ОЭ ТОЙ »w ___\

14.Urazova L.. Rogozin E., Ilyinskikh N. Action of Venezuelan encephalomyelitis, parotitis, polyomyelitis and influence viruses on Erlich carcinoma cells in vitro.- 14th Asia Pasific Cancer Conference 4th International Cancer Congress. Hong Kong, 1997.- Abstr.P57.

15.Urazova L., Gromova A. Antimetastatic activity of viral oncolysates // The European Journal of Cancer.-1997.- V.33- Suppl.8.- P.391.

16.Громова А.Ю., Уразова Л.Н.Терапия вакцинньм штаммом вируса венесуэльского энцефаломиелита мышей с меланомой В16 // В сб. «Медико-биологические аспекты нейро-гуморальной регуляции».-Томск.-1997.-С.301-303.

17.Urazova L.. Gromova A. Vaccine strain of Venezuelan encephalomyelytis virus in the treatment of Erlich carcinoma bearing mice//Expcrim. Oncol.-1997.-V19.-N3.-P.253-254. Соавт. Громова A.

18.Urazova L.. Gromova A. Antimetastatic activity of a vaccinal strain of Venezuelan encephalomyelitis virus// J. of B.U.ON..-1997.-V.2.-N 4. - P.363-366.

19. Рогозин E.A., Уразова Л.Н. Патологические изменения ядер и митозов клеток аденокарциномы Эрлиха под действием вируса энцефаломиелита лошадей (ВЭЛ) // Материалы конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины».- Москва.-1998.- С. 53-54.

20.Urazova L.. Gromova A., Perelmuter V. Immunologic mechanisms in the antitumor effect of a vaccine strain of Venezuelan encephalomyelitis virus // J.Exp.Oncol.- 1998.- V.20.- P.60-65.

21.Urazova L.. Gromova A., Combined therapy with the use of vaccinal virus, viral oncolysates and immunomodulator of mice with B16 melanoma// 17 International Cancer Congress: Rio de Janeiro - Brazil: 1998: Abstr.508.

22.Urazova L.. Rogozin E., Ilyinskirh N. Influence of vaccine strain of Venezulan encephalomyelitis virus on cell of ascitic Erlich carcinoma in vitro // Eighth International Congress oti Anti-Cancer Treatment: 1998: Paris - France: Abstr.786.

23 .Уразова Л.Н.. Рогозин E.A., Ильинских H.H. Изменение жизнеспособности и цитогенетических параметров клеток асцитного рака Эрлиха под действием вакцинных штаммов РНК-вирусов в системе in vitro // БЭБ и М.- 1999, приложение 1, с. 107-109.

24.Уразова Л.Н.. Громова А.Ю. Комбинированная терапия экспериментальных опухолей вакцинньм штаммом вируса венесуэльского энцефаломиелита // Пробл.совр.онкологии.- Томск.-1999.- С.315.

25.Уразова Л.Н.. Рогозин Е.А., Ильинских Н.Н. Влияние вируса венесуэльского энцефаломиелита на жизнеспособность и уровень цитогенетических нарушений в клетках карциномы Эрлиха in vitro // Экспер.онкол,- 1999,- N 21,- С.70-72.

26.Уразова JI.H.. Рогозин Е.А., Ильинских H.H. Цитопатические изменения, происходящие под действием вирусных вакцин в клетках опухоли гортани в системе in vitro II Пробл.совр. онкол.-Томск.-1999.- С.263-264.

27.Уразова Л.Н.. Громова А.Ю. Комбинированная терапия экспериментальных опухолей // III ежегодная Российская онкологическая конференция,-1999,- С. 193.

28.Уразова Л.Н.. Рогозин Е.А., Ильинских H.H. Цитоморфологические изменения, происходящие под действием вирусных вакцин в клетках эритромиелолейкоза (К-562) в системе in vitro // Материалы 5-го Всероссийского съезда онкологов «Высокие технологии в онкологии». Казань (4-7 октября) 2000. - Т.2 -С.249-250.

29.Уразова Л.Н. Противоопухолевые свойства живых вирусных вакцин. // 2-й съезд онкологов стран СНГ с участием ученых Европы, Америки и Азии май 23-26: 2000: Киев - Украина: приложение к журналу "Экспериментальная онкология",- 2000.-Т.22.-С.1363.

30.Уразова Л.Н.. Видяева И. Г., Ильинских Н. Н Влияние некоторых вакцинных штаммов вирусов на развитие аденокарциномы Эрлиха в экспериментах на мышах. // Акт.вопросы клин, онкологии и преканцерогенеза. - Якутск, 2000. - с. 175 - 176.

31.Видяева И. Г., Уразова Л.Н. Влияние вакцинных штаммов вирусов на цитогенетические характеристики аденокарциномы Эрлиха. //4-я ежегодная российская онкологическая конференция: 21 - 23 ноября, 2000 . - Сб. науч. работ. - М., 2000. - С. 81.

32.Уразова Л.Н.. Громова А.Ю. Комбинированная терапия экспериментальных опухолей вакцинным штаммом вируса венесуэльского энцефаломиелита // Вопр.онкол.- 2001.- N 1.- С.78-81.

33.Видяева И. Г., Уразова Л.Н. Влияние вирусных вакцин на цитоморфологию клеток перевиваемых опухолей в эксперименте in vivo. // Акт. вопросы онкологии. - Кызыл, 2001. - С. 58 - 60.

34.Видяева И. Г., Уразова Л.Н. Влияние вирусных вакцин на цитоморфологию клеток карциномы Льюис // Акт. проблемы инфектологии и паразитологии. Материалы 1-ой междун. юбил. конф. посвящ. 110 -летию проф. К.Н. Виноградова: 2 -5 апреля, - Томск 2001. -С. 77.

35.Уразова Л.Н.. Кузнецова Т.М., Видяева И.Г. К вопросу о механизмах противоопухолевого действия вирусных вакцин / 9-я Межд. конф «СПИД, рак и родств. пробл.- С-Петербург,-2001 // Русский журнал ВИЧ/СПИД и родственные проблемы.- 2001.- Т.5.- N1.- С. 32-33.

36.11yinskikh Е., Novitskiy V., Urazova L„ Darroudi W., Albertson P., Ilyinskikh I.& Ilyinskikh N.Assessment of the relationship of chronic opistorchiasis to Epstein - Barr virus infection as well as some cytogenetical and immunological parameters in two Siberian region// Europ.J.Epidemiol.- 2000.- 16 .- 993-1002.

37.Уразова Л.Н.. Видяева И.Г. , Кузнецова Т. И. Вирусные вакцины в терапии злокачественных новообразований II Актуальн. вопр. клин. мед. Материалы научно-практической конференции, Северск -2001,- С.144-145.

38. Уразова Л.Н.. Опыт применения вирусных вакцин в терапии экспериментальных опухолей // VI ежегодная российская онкологическая конференция: 26 - 28 ноября, 2002 . - Сб. научн. работ. - М. , 2002. -С.201.

39.Уразова Л.Н.. Видяева И.Г.,Кузнецова Т. И. Влияние вирусных вакцин на цитоморфологию клеток перевиваемых опухолей в эксперименте / 10-я Межд. конф «СПИД, рак и родств. пробл.- С-Петербург,-2002.- // Русск. журн. ВИЧ/СПИД и родств.пробл.- 2002.- T.6.-N1.- С.106-107.

40.Уразова Л.Н.. Рогозин Е.А., Видяева И.Г., Кузнецова Т. И. Цитогенетические изменения, индуцированные вирусными вакцинами в опухолевых клетках in vitro // Сибирск.онкол. журн.- 2002.- N 1.- С.62-64.

41.Рогозин E.H.., Уразова Л.Н.. Видяева И.Г. Биотерапия экспериментальных опухолей вирусными вакцинами венесуэльского энцефаломиелита, паротита, гриппа и оценка ее эффективности с использованием цитологических показателей // Вопр.онкол.- 2002.- Т.48,-N6.-710-713.

42.Уразова Л.Н.. Видяева И.Г., Кузнецова Т. И. Противоопухолевое действие вирусных вакцин в эксперименте // Бюлл. СО РАМН.- 2002.- N 4.- С. 107-110.

43.Rogozin Е., Urazova L.. Serebrov V. Influence of Venezuelan equine encephalitis Influenza and mumps vaccine viral strains on morphological patterns and viability of human tumor cells in vitro // J. of BUON.- 2003.-V.8.- P.39-43.

44.Видяева И.Г., Уразова Л.Н.. Кузнецова Т.И. изучение противоопухолевой активности онколизатов вирусных вакцин в эксперименте // Новые диагностические и лечебные технологии в онкологии. Мат-лы научно-практической конференций НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН, Томск,-2003.- С.60-61.

45.Кузнецова Т.И., Уразова Л.Н.. Видяева И.Г. Роль макрофагов в реализации противоопухолевого действия вакцинных штаммов вирусов // Новые диагностические и лечебные технологии в онкологии. Мат-лы научно-практической конференции НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН, Томск.- 2003,- С.12Г-128.

46.Уразова Л.Н.. Громова А.Ю., Кузнецова Т.И. Онкотропные свойства вируса венесуэльского энцефаломиелита // Новые диагностические и лечебные технологии в онкологии. Мат-лы научно-практической конференции НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН, Томск.- 2003.- С.232-233.

I

! t

i i

! i

í

i

§15717 ;

I

Тираж 100. Заказ 788 Томский государственный университет систем управления и радиоэлектроники пр. Ленина, 40

Актуальность. Терапия опухолей представляет собой сложную, а при злокачественных формах, не всегда разрешимую задачу. Одну из главных ролей среди противоопухолевых воздействий общего типа играет химиотерапевтическое, которое предусматривает прямой цитотоксический эффект. Внедрение в онкологическую практику различных схем комбинированного и комплексного лечения с применением новых химиопрепаратов, гормоно- и адъювантной терапии, позволило повысить эффективность традиционных методов и добиться, в отдельных случаях, полной ремиссии, что, однако, не изменило ситуации в целом. Показатели общей смертности от рака практически не снизились, при этом, значительный удельный вес занимают местнораспространенные и метастатические формы заболевания [7, 47, 55, 113, 156]. Часто гибель больного, на фоне успешно излеченного первичного опухолевого узла, обусловлена метастазами, которые уже существуют к моменту постановки диагноза. То есть, в подавляющем большинстве случаев, системная химиотерапия, применяемая для предотвращения и контроля метастазов, не приводит к желаемому эффекту [156]. Известно, что в настоящее время химиотерапия используется, как самостоятельный метод лечения, лишь при определенных формах быстрорастущих новообразований, при этом они либо полностью излечиваются, либо подвергаются глубокому угнетению с длительным исчезновением клинических симптомов. Однако, существует целый ряд препятствий при применении этого метода лечения. Даже в тех случаях, когда наблюдается ярко выраженный терапевтический эффект, он, обычно, сопровождается тяжелыми побочными явлениями, не дающими, порой, возможности довести лечение до успешного завершения [127].

Существующее положение ставит перед исследователями сложную задачу по изысканию принципиально новых методов и схем лечения злокачественных новообразований, причем, эти воздействия должны обладать высокой избирательностью, т. е. не поражать нормальных органов, либо вызывать в них минимальные изменения, не препятствующие проведению терапии основного заболевания.

Основная тенденция современной онкологии — комплексная терапия, главной целью которой является оптимизация и повышение эффективности традиционных методов. Этот подход обусловлен достижениями современной науки, позволившими получить новые сведения о многообразии факторов, участвующих в процессе онкогенеза, и его тонких механизмах. Вышесказанное служит достаточно веским основанием для формирования терапевтических подходов, при которых предусмотрено не только прямое повреждающее действие на опухолевые клетки, но и возможность влияния на различные регуляторные процессы, включающие факторы естественной противоопухолевой резистентности, рост и дифференцировку клеток, иммунные механизмы.

Использование такого терапевтического воздействия, которое позволяет одновременно оказывать повреждающее действие на опухолевые клетки и активировать защитные силы организма, способные оказывать антибластомный эффект, было бы наиболее перспективным в этом плане. В последние годы в число наиболее мощных биотерапевтических воздействий входят модификаторы биологических реакций (МБР), такие, как цитокины, генотерапия, трансплантация костного мозга и эмбриональных тканей с высоким иммуно- и гемопоэтическим потенциалом [50, 70, 167, 216, 227, 234, 336, 384]. Достаточно перспективными на сегодняшний день считаются такие методы биологической терапии рака, как противоопухолевая вакцинация и генотерапия [67, 90-94, 151, 219, 245, 328, 330, 377, 407].

Неоднократно предпринимались попытки применения в качестве антибластомных средств различных инфекционных агентов, в том числе, и вирусной природы [96, 143, 233, 276, 290, 303, 305, 319, 402]. Интерес к проблеме противоопухолевого действия вирусов, возникшей в начале нашего столетия, переживал подъемы и спады. Это было обусловлено диссонансом между обнадеживающими экспериментальными данными и результатами их практической реализации в клинике.

При репликации онколитических вирусов в опухолевых клетках концентрация их, в сравнении с нормальными, может превышать 104/мл [175, 210, 290, 319, 363]. При этом, перспективно выглядит использование в терапии неоплазм некоторых вакцинных штаммов экзогенных вирусов, апатогенных для организма человека. Они могут вызывать образование интерферона, индуцировать изменения антигенной и иммуногенной характеристик опухолевых клеток, оказывая модулирующее действие на систему иммунитета [217, 256, 274, 304, 324, 340].

Однако, онкотропные и онколитические свойства вирусов, принадлежащих к разным семействам, несколько отличны друг от друга и, по мнению А.Я. Муцениеце (1972), целесообразно заниматься изучением вопросов, связанных с различной чувствительностью опухолей к вирусам, путем регуляции этого процесса в желаемом направлении. Последний вопрос представляется особенно важным для решения проблем виротерапии, ибо она только тогда встанет на практическую почву, когда «случайность» тропизма вирусов к определенным опухолям станет закономерностью.

При изучении свойств онкотропных вирусов была показана возможность опухолеспецифической иммунизации интактных животных препаратами опухолевых клеток, инфицированных вирусами и подвергнутых разрушению, или их фракциями [181, 185, 398]. Иммуногенными свойствами обладают как естественный материал вирусного онколиза и живые вирус-инфицированные клетки, так и онколизаты - гомогенаты опухолевых культур, зараженных вирусами in vitro [181, 296]. Индуцированные вирусами иммуногенные свойства опухолевых клеток позволяют использовать онколизаты для профилактической или послеоперационной противоопухолевой вакцинации с целью стимуляции противоопухолевых иммунных реакций организма [172, 286]. Феномен онкотропизма вирусов лежит в основе методов геннотерапевтического воздействия на опухолевый рост [171, 179, 206, 261, 263, 264, 325].

В клинической практике продолжается начатое в начале 90-х годов изучение вирусных онколизатов: препараты вводятся, в основном, после удаления первичного опухолевого узла, с целью усиления противоопухолевых иммунных реакций организма. В целом, согласно экспериментальным протоколам, применение данного вида терапии достаточно эффективно — активно ингибируется метастазирование, повышается противоопухолевый иммунный ответ, отмечены отдельные случаи полной регрессии опухолей [172, 202, 286]. Завершились успехом клинические испытания генноинженерных методов повышения иммуногенности злокачественных новообразований [171, 179, 259, 261,329].

Онкотропные вирусы, сочетающие в себе как антинеобластомные, так и иммуномодулирующие свойства, являются достаточно перспективным объектом исследования. Однако, несмотря на многочисленные публикации, посвященные проблеме использования вирусов в терапии злокачественных опухолей, вопрос о механизмах, обеспечивающих их противоопухолевый эффект, практически не освещен, хотя актуальность его очевидна. Решение его представляет, на наш взгляд, большой практический интерес, так как дает возможность для реального внедрения этих препаратов в онкологическую практику. Применение в терапии опухолей стандартных вирусных вакцин снимает проблему высокой вирулентности патогенных штаммов и привлекает возможностью, в случае положительного эффекта, иметь готовый официнальный препарат для клинического использования. Цель исследования. Изучить эффективность и механизмы реализации противоопухолевого действия вакцинных штаммов вирусов при экспериментальном онкогенезе.

Задачи:

1. Оценить онкотропные свойства вирусных вакцин (венесуэльского энцефаломиелита, паротита, гриппа, осповакцины) в системах in vivo и in vitro.

2. Изучить онколитические свойства вакцинных штаммов вирусов в отношении первичных опухолей и оценить их влияние на процессы послеоперационного рецидивирования и метастазирования.

3. Изучить степень цитоморфологических нарушений в клетках опухолей экспериментальных животных в процессе терапии вакцинными штаммами вирусов и лизатами клеток, инфицированных in vitro.

4. Исследовать роль внутриопухолевых и системных факторов естественной резистентности в реализации противоопухолевого действия вакцинных штаммов вирусов.

5. Исследовать влияние вакцинных штаммов вирусов на активность иммунокомпетентных клеток на фоне химиотерапии и оперативного вмешательства при экспериментальном онкогенезе.

Положения, выносимые на защиту:

- Вакцинные штаммы вирусов и их онколизаты проявляют выраженную противоопухолевую и антиметастатическую активность в отношении перевиваемых опухолей экспериментальных животных.

- Механизмы противоопухолевой и антиметастатической активности вирусных вакцин базируются как на прямом литическом воздействии на опухолевые клетки, так и на модуляции противоопухолевых иммунных функций организма.

- Основные механизмы противоопухолевого и антиметастатического действия вакцинных штаммов вирусов и их способность повышать эффективность традиционных методов терапии опухолей связаны с нормализацией, либо стимуляцией функциональной активности отдельных звеньев системы иммунитета.

- Наиболее эффективным вариантом терапии неоплазий вирусными вакцинами является их системное применение в комбинации с оперативным вмешательством

Научная новизна. Впервые изучены противоопухолевые и антиметастатические свойства вакцинных штаммов тога- и парамиксовирусов, а также их онколизатов при экспериментальном онкогенезе.

Механизмы противоопухолевой активности вакцинных штаммов вирусов базируются как на прямом цитодеструктивном действии на опухолевые клетки, так и на модуляции неспецифических параметров иммунного ответа: цитостатической и супрессорной активности лимфоцитов, активности натуральных киллеров, ответе лимфоцитов на митогены.

Выявлена различная степень противоопухолевой активности лимфоцитов из опухолевого узла и иммунокомпетентных органов.

Впервые показано, что вакцинные штаммы вирусов обладают выраженной тропностью и литической активностью в отношении экспериментальных опухолей. Терапия вирусными вакцинами, на фоне оперативного вмешательства, приводит к угнетению послеоперационного рецидивирования и метастазирования опухолей, которое ассоциируется с активацией иммунокомпетентных клеток.

Вакцинные штаммы вирусов индуцируют появление в опухолевых клетках дополнительных ядер, микроядер и вызывают вакуолизацию цитоплазмы клеток. Кроме того, вирусы венесуэльского энцефаломиелита и паротита значительно подавляют митотическую активность опухолевых клеток in vivo.

Вакцинный штамм вируса венесуэльского энцефаломиелита индуцирует в культуре опухолевых клеток достоверное увеличение числа патологических митозов за счет снижения нормальных.

Теоретическая и практическая значимость.

Проведенные исследования позволили получить новую информацию относительно спектра вирусных вакцин, которые могут найти применение в терапии злокачественных опухолей.

На основании полученных результатов определена значимость различных звеньев системы иммунитета в реализации противоопухолевого действия вирусных вакцин.

Изученные в эксперименте механизмы противоопухолевого и антиметастатического действия вирусных вакцин дают теоретические предпосылки для их патогенетически обоснованного применения в онкологии.

Проведенные исследования, расширив круг представлений о механизмах, лежащих в основе иммуномодулирующего действия вирусных вакцин, позволили оценить целесообразность их применения, в сочетании с традиционными методами воздействия, в терапии онкологических заболеваний.

Апробация работы.

Основные положения диссертации представлены и обсуждены на International Congress on Anti-Cancer Treatment (Paris, France, 1996,1997,1998); Europian Cancer Conference (Germany, 1997); Международном конгрессе "Человек и лекарство", Москва, 1997; Международной конференции "СПИД, рак и родственные проблемы", С.

Петербург, 2001, 2002; юбилейной конференции "Медико-биологические аспекты нейрогуморальной регуляции", Томск 1997; конференции "Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины", Москва, 1998; IV ежегодной российской онкологической конференции, Москва, 2000; VI ежегодной российской онкологической конференции, Москва, 2002; юбилейной конференции НИИО ТНЦ СО РАМН "Проблемы современной онкологии", Томск, 1999.

Публикации: по теме диссертации опубликовано 46 печатных работ, из них 11 - в реферируемых российских и зарубежных изданиях.

Структура и объем диссертации: Диссертация изложена на 239 страницах, состоит из введения, 5 глав, выводов, списка литературы. Работа иллюстрирована 41 таблицей и 46 рисунками. Библиографический указатель включает 411 источников, из них 170 отечественных и 241 зарубежных.

ВЫВОДЫ

1. Вакцинные штаммы вирусов ВЭЛ, паротита и осповакцины обладают высокой тропностью к клеткам изученных экспериментальных опухолей in vivo: уровень их вирулентности в клетках опухолей составил 6,5-7,0 Ig ТЦД50/мл, при низких концентрациях (2,0-3,5 lg ТЦД5о/мл) в таких органах животных, как лимфатические узлы, селезенка, печень и мозг.

2. Изученные вакцинные штаммы вирусов обладают высокой тропностью к клеткам экспериментальных опухолей in vitro: при снижении в течение 48 часов жизнеспособности опухолевых клеток меланомы В16 и аденокарциномы Эрлиха до 8,0% и 1,6%, вирулентность соответствующих супернатантов составила 6,0 и 6,5 lg ТЦД5о/мл, соответственно, при исходной концентрации вируса 3,0 lg ТЦД5о/мл.

3. Все исследованные вакцинные штаммы вирусов проявляют противоопухолевые и антиметастатические свойства: на 16-20 сутки эксперимента наблюдается статистически значимое снижение роста экспериментальных опухолей (вирусом ВЭЛ - до 80%, паротита - до 45%, осповакцины — до 37%). При этом индекс ингибирования метастазирования составил до 92%, 68% и 62%, соответственно.

4. Механизмы противоопухолевой активности вакцинных штаммов вирусов базируются как на прямом цитодеструктивном действии на опухолевые клетки, так и на модуляции отдельных параметров иммунной системы: цитостатической и супрессорной активности лимфоцитов, активности натуральных киллеров, способности лимфоцитов к пролиферации.

5. Вакцинные штаммы вирусов ВЭЛ, паротита и оспы индуцируют в опухолевых клетках такие цитоморфологические нарушения, как появление многоядерных, с микроядрами и вакуолизированной цитоплазмой клеток (4,4-8,8%; 3,6-9,6%; 58,4-77,2%, соответственно). Кроме того, вирусы ВЭЛ и паротита значительно подавляют митотическую активность опухолевых клеток in vivo (0,2% и 0,4%, соответственно, при митотической активности интактных клеток — 2,4%,).

6. Вакцинный штамм вируса ВЭЛ индуцирует в культуре опухолевых клеток статистически значимое увеличение числа патологических митозов за счет снижения нормальных: отставание одиночных хромосом в анафазе (с 0,1% до 0,3%); хроматидные мосты в анафазе (с 0,1 до 2,0%); неравномерное расхождение хромосом в анафазе (с 1% до 3%); многополюсные ана- и телофазы (с 2% до 13%); неравномерные телофазы (с 2% до 8%).

7. Терапия вакцинными штаммами вирусов на фоне удаления первичных опухолей приводила к статистически значимому угнетению послеоперационного метастазирования и рецидивирования опухолей (78,0-82,1%; 60,0-100%, соответственно), которое ассоциировало с усилением цитостатической активности перитонеальных макрофагов и спленоцитов.

8. Вакцинный штамм вируса ВЭЛ, при сочетанном применении с онколизатом инфицированных им опухолевых клеток, полностью подавлял послеоперационное метастазирование изученных экспериментальных опухолей.

9. Вакцинный штамм вируса ВЭЛ усиливал, преимущественно, противоопухолевые свойства циклофосфана (торможение роста первичных опухолевых узлов до 83,0%), в то время, как вирус паротита более активно потенцировал антиметастатические (индекс ингибирования метастазирования до 92,0%).

Ю.Перитонеальные макрофаги животных-опухоленосителей, инфицированных вирусными вакцинами, проявляли выраженное цитостатическое действие, которое превышало аналогичный показатель опухолеассоциированных макрофагов (59,3-96,01%; 29,5-38,4%, соответственно).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Ежедневно в результате различного рода внешних воздействий, ошибок репаративной системы ДНК и прочих, в организме возникает некоторое количество трансформированных клеток. Однако, не все они становятся злокачественными — иммунная система организма способна достаточно успешно противостоять опухолевому росту [117]. Это положение является отправной точкой для различных молекулярно-биологических приемов воздействия на клеточный и гуморальный иммунитет опухоленосителя, обозначаемых в литературе термином «биологическая терапия рака» [219]. Молекулярно-биологические технологии выводят современную медицину, в том числе и онкологию, на качественно новый этап. Однако, внедрение биотерапевтических методов в клинику требует предварительных детальных исследований в условиях эксперимента. Онкотропные вирусы - один из наиболее перспективных агентов для подобного рода терапии, так как способны сочетать в себе как векторные функции, так и литическую и иммуномодулирующую активность.

К настоящему времени накоплено значительное количество данных, свидетельствующих о том, что совместная эволюция организма-хозяина и ассоциированной с ним вирусной флоры в отдельных случаях взаимовыгодна. Избирательная тропность некоторых вирусов к опухолевым клеткам - один из природных феноменов, механизмы которого до сих пор неясны. Возможно, это связано с усиленными процессами метаболизма быстрорастущей опухолевой ткани, что генетически предпочтительно для размножения вирусов, так как обеспечивается быстрое формирование и массовый выход вирусных частиц из клетки. По характеру протекания вирусная инфекция в малигнизированных клетках практически не отличается от таковой в нормальных [100, 101, 102]. Вирусы могут репродуцировать инфекционную форму, находиться в латентном состоянии, индуцируя, при этом, образование интерферона и изменение антигенных и иммуногенных характеристик опухолевых клеток. На перечисленных свойствах и покоятся механизмы противоопухолевого действия уже относительно исследованных онкотропных вирусов, такие как: онколиз — прямое литическое воздействие на опухолевые клетки; модуляция их антигенных и иммуногенных свойств -гетерогенизация опухолей; неспецифическая иммуномодуляция - активация естественных защитных сил организма [100, 101, 102, 355]. Однако, характер проявления этих свойств различен у каждого конкретного представителя указанной группы и, зачастую, слабо выражен. В связи с изложенным, не случаен наш интерес к представителям семейств тога- и парамиксовирусов, так как известны такие их свойства, как репродукция путем почкования, что связано с переносом клеточных антигенов, а также выраженное цитодеструктивное действие на клетки-мишени, являющиеся эталонными, в том числе, опухолевые [1, 165].

Современные представления о механизмах канцерогенеза, а также противоопухолевого действия МБР различной природы позволяют предполагать активное участие иммунологических факторов в реализации этих свойств. Наиболее важными медиаторами, обеспечивающими межклеточные и межсистемные взаимодействия, являются цитокины, которые продуцируются иммунокомпетентными клетками. Экзогенные цитокины и их индукторы нашли широкое применение в качестве МБР, причем, наиболее перспективным в этом плане является интерферон-а (ИФН-а). Однако применение этого препарата в высоких дозах часто вызывает нежелательные побочные эффекты, что делает актуальным использование в онкологической практике агентов, обладающих способностью продуцировать, либо индуцировать продукцию эндогенного интерферона-а. Вирусы, в частности, представители указанных семейств -наиболее универсальные и высокоактивные индукторы интерферона, о различных аспектах антитуморогенного эффекта которых в системах in vivo и in vitro накоплена обширная информация [62]. Кроме того, применяемые штаммы являются вакцинными, то есть, апатогенными и обладающими высокой антигенной активностью [85, 111].

Проведенное нами исследование показало, что изученные вирусы проявляют выраженную противоопухолевую и антиметастатическую активность в отношении таких высоко адекватных экспериментальных моделей для тестирования противоопухолевого действия МБР природного происхождения, как аденокарцинома Эрлиха, меланома В16, карцинома легких Льюис. Средние показатели торможения как роста, так и метастазирования опухолей в отдельных сериях экспериментов достигали 100%, причем, более выраженным был именно антиметастатический эффект указанных препаратов. Известно, что такие эффекторные клетки иммунной системы, как макрофаги, цитотоксические Т-лимфоциты, естественные киллерные клетки наиболее успешно проявляют свои антибластомные потенции в отношении небольшого количества опухолевых клеток, что возможно на ранних стадиях развития первичной опухоли, при формировании метастазов [228]. Следовательно, выявленные нами антиметастатические свойства вирусных вакцин дают основание для предположения об участии в инициации этих свойств эффекторных клеток организма-опухоленосителя.

Полученные данные не противоречат аналогичным, описанным Н.П. Коноваловой с соавт. (1994-1996) в отношении саназола - препарата из группы триазолов, и Н.В.Чердынцевой с соавт. (1997,1999,2001) в отношении рекомбинантного интерферон-продуцирующего пробиотика субалина. Согласно результатам, полученным этими авторами, одним из основных медиаторов действия саназола и субалина является эндогенный интерферона (ИФН-а), выработка которого в организме идуцируется этим прапаратом, что и приводит в активации эффекторных функций естественных киллерных клеток, макрофагов и цитостатических эффекторов. Кроме прямого антипролиферативного действия против опухолевых клеток, ИФН-а может оказывать модулирующее влияние на их мембраны, приводя к снижению антиметастатических потенций и повышению чувствительности к действию эндогенных противоопухолевых механизмов [62, 13, 72]. Данные об ингибирующем влиянии субалина in vivo на рост опухоли, клетки которой резистентны к прямому повреждающему действию ИФН, свидетельствуют о вовлечении клеток иммунной системы в реализацию описанных эффектов. Один из механизмов противоопухолевого действия вирусов -высокооактивных природных индукторов интерферона, судя по всему, сходен с таковым, выявленным для субалина.

Как известно, многие вирусы оказывают прямое иммуносупрессивное действие на организм, что может усиливать прогрессию опухоли [3, 34, 104, 144]. Однако, у некоторых онкотропных вирусов выявлена способность активировать противоопухолевые иммунные реакции организма [99, 100, 101, 102, 355]. Данные проведенных нами иммунологических и морфологических исследований показали, что в реализации противоопухолевой активности изученных вакцинных штаммов вирусов задействованы, также, механизмы системы иммунитета.

Общая картина репродуции вирусов выглядит следующим образом: через 2-3 часа после инфицирования вирусные гликопротеиды обнаруживаются в опухолевых клетках, к 6-8 часам их уровень становится максимальным, что соответствует выходу созревшего вируса, достигающего максимальной концентрации к 16-18 часу, что сопровождается частичным лизисом клеток. Вирус ВЭЛ в опухолевой ткани экспериментальных животных обнаруживается в течение 7 суток после его введения [134]. К этому сроку у мышей-опухоленосителей, получивших вирус, регистрируется значительное торможение опухолевого роста, являющееся результатом размножения вируса в опухолевых клетках. При этом показано, что чувствительность использованных в работе штаммов экспериментальных опухолей к необластомному действию вирусов различна — максимально чувствительна опухоль Эрлиха, минимально - меланома В-16. Торможение роста опухолей на более поздних этапах канцерогенеза связано, как подтвердили проведенные исследования, с модуляцией вирусами иммунного ответа: повышается антигенный и иммуногенный потенциал опухолевых клеток, активируется противовирусный иммунитет и, как следствие, повышается естественная резистентность организма-опухоленосителя. Так, на 8 сутки после введения вируса ВЭЛ опухолевые клетки опытных мышей более иммуногенны для спленоцитов интактных мышей в реакции бласттрансформации, чем клетки контрольных животных. Так же высок этот показатель у опухолевых клеток, зараженных вирусом в условиях in vitro. Опосредованно стимулируются реакции бласттрансформации спленоцитов в ответ на В- и Т- клеточные митогены, цитотоксическая и цитостатическая активность спленоцитов и реакция натуральных киллеров. У мышей с «условными метастазами» все перечисленные выше процессы происходят в более поздние сроки, чем у животных с первичными опухолями. Полученные нами результаты не противоречат данными литературы относительно противоопухолевой активности других онкотропных вирусов [98, 100, 101, 102,335].

Интересен факт полного подавления аттенуированным штаммом вируса ВЭЛ роста вторично-привитых опухолей у мышей, перенесших первичный опухолевый процесс и оперативное вмешательство. Очевидно, в процессе роста первичных опухолевых узлов в организме опухоленосителей активизируются противоопухолевые иммунные реакции [52, 155, 136, 307, 315]. Однако, по мнению D. Mason (1986), их недостаточно для подавления роста вторично-привитых опухолей у контрольных животных. На наш взгляд, подавление роста «условных метастазов» у мышей опытных групп — суммарный результат противоопухолевой активности вируса и активированной к моменту их имплантации противоопухолевой резистентности организма.

Согласно полученным нами данным, вакцинные штаммы изученных вирусов достаточно эффективны в отношении первичных узлов метастазирующих опухолей мышей, однако, более активно исследуемые агенты ингибируют развитие метастазов.

Как известно, метастазирование опухоли является одним из ключевых признаков ее злокачественности, который ощутимо ограничивает эффективность всех известных способов терапии [69, 91, 92, 110, 149, 150, 246, 335]. Несмотря на значительные успехи химио- и лучевой терапии, хирургический метод в условиях онкологической клиники все еще остается лидирующим. В связи с вышесказанным, а также учитывая полученные нами данные относительно высокой антиметастатической активности вирусов, при дальнейшем изучении их свойств был избран метод терапии экспериментальных опухолей, предполагающий удаление первичного опухолевого узла на фоне заложившихся в организме метастазов, что адекватно наиболее часто встречающейся клинической ситуации [74]. Полученные данные позволяют предполагать, что наряду с подавлением формирования метастазов, изученные штаммы вирусов обладают значительной антиметастатической активностью в отношении уже существующих у животных с удаленными первичными опухолями метастатических узлов.

Заражение вирусом ВЭЛ в условиях культивирования in vitro клеток меланомы В16 приводило к выраженному усилению иммуногенности их онколизата в реакции бласттрансформации лимфоцитов интактных мышей, что стало предпосылкой к использованию этого препарата в терапии данного опухолевого штамма. В основе применения онколизата лежит принцип вакцинации [332, 347], что предполагает введение в организм ослабленного болезнетворного агента, либо соответствующих антигенов. Например, осуществляются попытки лечения онкологических больных пептидами мембран опухолевых клеток [213]. Концепция противоопухолевой вакцинации разрабатывается достаточно давно и основной проблемой этого подхода является низкая иммуногенность опухолевых клеток [225]. Предпринимаются попытки усилить ее с помощью агентов различной природы, в том числе, бактериальной [114, 162] и вирусной [204, 355]. Согласно результатам собственных исследований и литературным данным [134, 361], введение только убитых или облученных опухолевых клеток, либо набора опухолевых маркеров, не приводит к выраженной опухолевой регрессии. Онколизаты, содержащие 20-40% живых, но потерявших, в результате облучения, способность к пролиферации, опухолевых клеток, успешно презентирующих измененный вирусом антиген, обладают, благодаря индукции противоопухолевого иммунитета, значительными противоопухолевыми и антиметастатическими свойствами [214, 332, 374].

В условиях клиники с целью поддержания эффективности противоопухолевого иммунитета, как подтверждают литературные данные [172, 286], предполагается длительное (1-2 месяца), многократное (с интервалами 2 недели) введение онколизата. Нами в условиях экспериментального онкогенеза проводилось однократное введение онколизата на фоне удаления первичного опухолевого узла. Однако, даже при такой облегченной терапевтической схеме, достигался достаточно высокий уровень ингибирования послеоперационного метастазирования.

При комбинированной терапии опухолей вирусом ВЭЛ и его онколизатом, даже на поздних этапах развития опухолевого процесса, когда животные контрольных групп погибали, у мышей, получивших это лечение, рецидивы и метастазы отсутствовали. С нашей точки зрения, однократное введение вируса до операции приводило к описанным выше результатам, последствием которых, ко времени введения онколизата, была достаточно высокая противоопухолевая иммуноопосредованная активность организмаопухоленосителя. Таким образом, как и в ситуации со вторично-привитыми опухолями, предварительная стимуляция противоопухолевых иммунных функций приводила к более выраженному действию вирусного препарата, применяемого впоследствии.

При определении противоопухолевой активности вакцинных штаммов вирусов следует учитывать, что в системе «хозяин-опухоль-вирус» иммунный ответ складывается из таких факторов, как ответ организма на: опухолевый рост; введение чужеродного антигена, каковым является вирус; модифицированные вирусом маркеры опухолевых клеток. Кроме того, определенный вклад в этот процесс вносит и вызываемый вирусом онколизис. Однако, ответ на вопрос о степени соотношения этих факторов в механизме противоопухолевой активности вируса неоднозначен. Сложно ответить и на вопрос, каким образом вирус воздействует на формирование метастазов. По-видимому, индуцируемое вирусами значительное снижение метастазирования экспериментальных опухолей связано как с литической активностью вирусов, предотвращающей распространение опухолевых клеток на начальных этапах развития опухолевого процесса, когда метастазы только закладываются в организме, так и с опосредованным иммунным отторжением возникающих и развивающихся метастатических узлов.

Однако, интересен тот факт, что при терапии животных только онколизатом, который вводился после удаления опухолей, в относительно поздние сроки опухолевого процесса, показатели ингибирования послеоперационного метастазирования были достаточно высоки и сопоставимы с таковыми, полученными при начатой в ранние сроки онкогенеза монотерапии вирусом. Тем не менее, очевидно, что в основе противоопухолевого действия онколизата лежит лишь принцип стимуляции соответствующих иммунных функций организма-опухоленосителя. Возможным объяснением этого факта может быть следующее: инфицирование опухолевых клеток вирусом in vitro оказалось более эффективным, чем его непосредственное введение в организм опухоленосителя. Так, при максимальной по времени инкубации опухолевых клеток с вирусом in vitro, независимо от инфицирующей дозы, достигается 80-100% гибель клеток [134]. Однако, in vivo, при однократной инъекции вируса животным-опухоленосителям, к моменту исчезновения его из организма (7 сутки после введения) наблюдается только 30-50% торможение роста первичных опухолей, являющееся, очевидно, результатом литической активности вируса. Это различие, на наш взгляд - следствие активации противовирусной защиты организма-опухоленосителя, приводящей к биологической нейтрализации определенного количества вируса в процессе его миграции к опухоли.

При доклиническом изучении средств, обладающих антиметастатической активностью, принято проводить изучение их влияния на эффективность цитостатической терапии. Однако, учитывая то обстоятельство, что противоопухолевая активность вирусов носит иммуномодулирующий характер, представлялось целесообразным провести, на фоне применения схемы «вирус + цитостатик (иммунодерессант)» иммуностимулирующую терапию. Применение курса виротерапии на фоне введения циклофосфана не приводило к усилению противоопухолевого эффекта, что, по-видимому, связано с подавляющим воздействием цитостатика на различные звенья иммунной системы опухоленосителей [3, 46, 344, 362]. Напротив, применение в качестве иммуномодулятора Т-активина, который широко используется как стимулятор клеточного звена иммунитета [11, 42, 89] потенцировало противоопухолевую активность как вируса, так и онколизата. Нами показано, что в поздние сроки развития опухолевого процесса, когда животные контрольных групп погибали, у мышей, получивших сочетанную терапию вирусом и онколизатом, на фоне иммунотерапии Т-активином, метастазы и рецидивы отсутствовали. При оценке влияния различных схем терапии вакцинным штаммом вируса ВЭЛ и винкристином (ВК) на цитологические показатели экспериментальных опухолей было отмечено снижение митотической активности опухолевых клеток на ранних стадиях онкогенеза.

Согласно общепризнанному мнению [257, 346, 349], для успеха иммунотерапии необходимо уменьшение размеров или удаление первичной опухоли с помощью традиционных методов, применяемых в клинике (хирургическое вмешательство, химио- и радиотерапия). В противном случае организму не удается справиться собственными силами с большой опухолевой массой и, кроме того, избыток «слущивающегося» с опухолевых клеток антигена тормозит развитие иммунного ответа, стимулируя Т-супрессоры [86, 117, 148]. Следовательно, мишенью иммунотерапии могут быть лишь вторичные метастазы относительно небольшого размера.

Нами неоднократно упоминалось о том, что механизмы антибластомной активности вирусных вакцин достаточно сложны и основываются, помимо рассмотренных ранее иммунологических параметров, на прямом цитодеструктивном действии инфекционных агентов на опухолевые клетки. В морфологической характеристике опухолевых клеток большую роль играет исследование митотического режима. Определены основные направления возможного использования этого показателя. Среди них - оценка степени терапевтического повреждения опухоли. Главной особенностью митотического режима клеток злокачественных опухолей является резкий рост числа патологических митозов и разнообразие их видов. Известно, что вирусы влияют на клеточный метаболизм, изменяя нормальный ход процессов транскрипции и трансляции, а также нарушают естественное течение клеточного цикла. Действие вирусов на клеточный цикл во многом зависит от свойств инфицирующих вирусов и от особенностей клеточных культур [128].

Анализ изменений показателей митотического режима клеток асцитной карциномы Эрлиха (АКЭ) при инфицировании вирусом ВЭЛ в системе in vitro показал, что свойственная альфавирусам задержка митотически делящихся клеток в телофазе и их гибель при переходе в очередную интерфазу, остается в силе и при взаимодействии их с опухолевыми клетками. Она проявляется в виде увеличения процентного содержания нормальных телофаз при значительном падении показателя жизнеспособности клеток. Одновременное увеличение числа микроядрасодержащих клеток можно объяснить выраженной активностью вируса ВЭЛ в анафазе, где хромосомы или их фрагменты утрачивают связь с нитями ахроматинового аппарата. Можно предположить, что вирус ВЭЛ действует преимущественно на митотический аппарат клеток асцитной карциномы Эрлиха, что проявляется в увеличении процента патологических митозов за счет патологических анафаз и телофаз.