Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:ДНК-ДНК взаимодействия в области микросателлитных повторов как фактор генетической нестабильности, вовлеченный в процесс канцерогенеза

На правах рукописи

КАРПЕЧЕНКО НАТАЛЬЯ ЮРЬЕВНА

ДНК-ДНК ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ В ОБЛАСТИ МИКРОСАТЕЛЛИТНЫХ ПОВТОРОВ КАК ФАКТОР ГЕНЕТИЧЕСКОЙ НЕСТАБИЛЬНОСТИ, ВОВЛЕЧЕННЫЙ В ПРОЦЕСС КАНЦЕРОГЕНЕЗА

Онкология - 14.01.12

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 г ПАЙ 2014

005549026

Москва-2014

005549026

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Российский онкологический научный центр имени H.H. Блохина» Российской Академии Медицинских Наук

Научный руководитель:

Якубовская Марианна Геннадиевна - доктор медицинских наук, заведующий отделом химического канцерогенеза Научно-исследовательского института Канцерогенеза федерального государственного бюджетного учреждения «Российский онкологический научный центр имени H.H. Блохина» Российской Академии Медицинских Наук Официальные оппоненты:

Журков Вячеслав Серафимович - доктор медицинских наук, ведущий научный сотрудник лаборатории генетического мониторинга федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский института экологии и гигиены окружающей среды имени А.Н. Сысина» Минздрава России

Петренко Анатолий Анатольевич - кандидат биологических наук, молекулярный биолог лаборатории молекулярной патологии медицинского центра «Геномед»

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждении высшего профессионального образования «Российской национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Минздрава России

Защита состоится «¿|» 2014 года в /£:_£кЯгасов на заседании

диссертационного совета Д 001.017.01 в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Российский онкологический научный центр имени H.H. Блохина» Российской Академии Медицинских Наук по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, дом 24

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Российский онкологический научный центр имени H.H. Блохина» Российской Академии Медицинских Наук по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, дом 24 и на сайте www.ronc.ru

Автореферат разослан «_» __2014-года

Ученый секретарь диссертационного совета профессор, доктор медицинских

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

Соматическая гомологичная рекомбинация (ГР) - один из ключевых механизмов поддержания стабильности генома клетки, обеспечивающий репарацию двунитевых разрывов ДНК. Дефекты данной репарационной системы повышают вероятность злокачественной трансформации клетки при действии генотоксических факторов и обнаруживаются в опухолевых клетках в виде хромосомных аберраций. Лежащее в основе ГР копирование генетической информации с гомологичной молекулы ДНК в ряде случаев сопровождается потерей гетерозиготности, что, в свою очередь, приводит к манифестации рецессивных мутаций, одному из наиболее распространенных процессов при канцерогенезе. Этот механизм лежит в основе патогенеза наследственной ретинобластомы и опухолей при синдроме Ли-Фраумени.

Многочисленные данные свидетельствуют о неравномерном распределении по геному рекомбинационных событий. «Горячими» точками рекомбинации являются микросателлитные последовательности ДНК, наиболее распространенная из которых -poly(CA/TG). Механизмы, лежащие в основе влияния микросателлитных повторов на частоту ГР до настоящего времени остаются практически неизученными. Одним из возможных объяснений подобного влияния служит наличие конформационных особенностей в области микросателлитных повторов, влияющих на стадии инициации и (или) терминации ГР. Понимание механизмов влияния (СА/ТС)п-повторов необходимо для выявления локусов с наибольшей предрасположенностью к потере гетерозиготности, что раскроет возможности для формирования групп риска и позволит более точно определять прогноз заболевания. Таким образом, изучение закономерностей ДНК-ДНК взаимодействий в области микросателлитных повторов является актуальной задачей современной молекулярной биологии и экспериментальной онкологии.

Цели и задачи исследования

Целью данного исследования являлось изучение важных для инициации и терминации ГР структурно-функциональных особенностей микросателлитных (CA/TG)n-локусов. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи: 1) оптимизация метода визуализации ДНК с использованием флуоресцентного красителя SYBR Gold (SG) по протоколу предокрашивания; 2) анализ влияния poly(CA/TG) на процесс миграции точки перекреста структур Холлидея; 3) изучение закономерностей

взаимодействия (инвазии) олигонуклеотидов d(CA)10 и d(GT)10 с гомологичным участком плазмидной ДНК, а также геномной ДНК человека; 4) анализ возможности олигонуклеотидной инвазии в другие, также широко распространенные, микросателлитные локусы: (CT/GA)n, (AT/TA)n, (CAG/GTC)n, (CTT/GAA)n, (CGG/GCC)n, (GGT/CCA)n и (GGGT/CCCA)n.

Научная новизна

В настоящем исследовании впервые проведено изучение закономерностей ранее показанного в лаборатории М.Г. Якубовской встраивания олигонуклеотидов d(CA),o и d(TG)io во внутреннюю комплементарную последовательность дуплексной ДНК. Установлено, что структурные особенности (СА/ТС)п-повтора, лежащие в основе образования комплекса олигонуклеотид-ДНК, формируются in vivo и остаются стабильными на протяжении экстракции ДНК. Показано, что интенсивность инвазии одноцепочечных фрагментов d(CA)10 и d(GT)i0 в (СА/та)п-повторяющуюся последовательность сверхспирализованной плазмидной ДНК зависит от длины микросателлитного локуса следующим образом:

(СА/Ш)з, = (CA/TG)94 > (CA/TG), о > (CA/TG)15 = (CA/TG)25. При изучении влияния мольного соотношения дуплекс/олигонуклеотид на интенсивность взаимодействия (СА/ТС)п-локуса плазмидной ДНК с комплементарными одноцепочечными фрагментами, обнаружено повышение интенсивности инвазии олигонуклеотидов с увеличением соотношения от 1/10 до 1/1, при достижения которого, дальнейшего возрастания интенсивности встраивания не происходит. Установлено, что интенсивность взаимодействия микросателлитных локусов (CA/TG)3i с одноцепочечными фрагментами d(CA)10 и d(GT)io, не изменяется при использовании ряда солевых буферных растворов, однако снижается в безсолевых условиях. Кроме того, анализ возможности олигонуклеотидного встраивания в другие микросателлитные последовательности показал, что среди (GA/TC)n-, (TA/AT)n-, (CAG/GTC)n-, (CGG/GCC)n-, (CTT/GAA)n-, (GGT/CCA)n- и (GGGT/CCCA)n-noBTopoB, такой способностью обладают только длинные (СТТ/САА)п-локусы, формирующие в условиях отрицательной сверхспирализации неканоническую Н-форму ДНК. В рамках изучения функционирования (СА/ТС)п-повторов в качестве точек терминиции ГР с помощью электронной микроскопии установлено, что гетерология между микросателлитными локусами (CA/TG)n в шесть повторяющихся единиц ингибирует миграцию ветвей

структуры Холлидея, промежуточного продукта рекомбинационного процесса, чего не наблюдается в случае полной гомологии.

Кроме того, при проведении данного исследования предложен новый подход в использовании для визуализации ДНК флуоресцентного красителя SYBR Gold (SG), основанный на отсутствии влияния последнего на электрофоретическую подвижность ДНК при низких соотношениях SG/ДНК. Оптимизированный метод окрашивания нуклеиновых кислот позволяет более рационально использовать этот дорогостоящий краситель.

Научно-практическая значимость исследования

Настоящая работа посвящена изучению актуальной проблемы, касающейся молекулярных механизмов канцерогенеза. В данном оригинальном исследовании продемонстрированы закономерности взаимодействия дуплексной ДНК с одноцепоченым фрагментом в области микросателлитных повторов, объясняющие их функционирование в качестве «горячих» точек соматической ГР. Полученные данные о взаимодействии микросателлитных локусов (CA/TG)n с комплементарной одноцепочечной ДНК, влиянии на этот процесс длины повторяющейся последовательности и мольного соотношения дуплекс/олигонуклеотид, а также о способности гетерологии в области (CA/TG)n-noBTopa ингибировать миграцию ветвей структуры Холлидея расширяют представление о молекулярных механизмах рекомбинационной репарации и причинах генетической нестабильности. Результаты исследования важны для сравнительной оценки вероятности соматической ГР по различным повторяющимся последовательностям, что в перспективе должно позволить выявлять предрасположенность к потере гетерозиготности по определенным локусам и, соответственно, определять риск развития онкологического заболевания и способствовать составлению более точного прогноза его течения. Кроме того, оптимизированный в ходе данной работы протокол использования флуоресцентного красителя ДНК SYBR Gold расширяет возможности его применения в молекулярно-биологических исследованиях, позволяя в целом ряде случаев избежать использования мутагенных и токсичных соединений.

Методы исследования

Работа выполнена с использованием классических молекулярно-биологических методов исследования (полимеразная цепная реакция, культивирование бактериальных

клеток, выделение и очистка ДНК из клеток и тканей, молекулярное клонирование, электрофоретическое разделение ДНК в агарозном геле), электронной микроскопии и статистической обработки полученных данных. Кроме того, в настоящей работе для изучения ДНК-ДНК взаимодействий, наряду с введением радиоактивной метки, применен более современный подход, основанный на использовании флуоресцентно-меченных олигонуклеотидов и флуоресцентного красителя последнего поколения SYBR Gold.

Положения, выносимые на защиту

1. В структуре микросателлитных (САЛХЗ)п-локусов in vivo возникают конформационные особенности, обуславливающие возможность их спонтанного взаимодействия с одноцепочечными фрагментами d(CA)10 и d(GT)10.

2. Среди других микросателлитных локусов способностью к спонтанному взаимодействию с гомологичной одноцепочечной ДНК обладают только длинные (CTT/GAA)n-noBTopbi, формирующие в условиях отрицательной сверхспирализации неканоническую Н-форму ДНК.

3. Интенсивность взаимодействия d(CA)10 и d(GT)10 с (САЛЧЗ)п-локусом дуплексной ДНК зависит от длины повтора, соотношения дуплекс/олигонуклеотид и солевых условий.

4. Обладающие полной гомологией (СА/ТС)п-микросателлитные локусы не влияют на миграцию ветвей структуры Холлидея, промежуточного продукта гомологичной рекомбинации, в то время как гетерология в области повторяющейся последовательности ингибирует данный процесс, что может способствовать ее ферментативному разрешению в этих участках генома.

5. Оптимизированный в ходе данной работы протокол визуализации ДНК с помощью флуоресцентного красителя последнего поколения SYBR Gold позволяет сократить финансовые и временные затраты на этапе пробоподготовки ДНК и избежать использования токсичных и мутагенных соединений.

Апробаиия результатов

Результаты работы были представлены 28 сентября 2012 года на совместной научной конференции лабораторий отдела химического канцерогенеза, лабораторий отдела трансформирующих генов опухолей, лаборатории онкогеномики и лаборатории молекулярной эндокринологии НИИ Канцерогенеза ФГБУ «РОНЦ им. H.H. Блохина»

РАМН. Основные положения диссертации представлены на 4 международных научных конференциях. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ.

Структура и объем диссертационной работы

Диссертация изложена на 131 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, экспериментальную часть, включающую изложение и обсуждение результатов, заключение, выводы и список цитируемой литературы. Материал иллюстрирован 25 рисунками и 9 таблицами. Библиографический указатель включает 197 цитированных работ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Оптимизация метода визуализации ДНК с помощью флуоресцентного красителя SYBR Gold по протоколу предокрашиваиия

SYBR Gold (SG) - наиболее чувствительный флуоресцентный краситель нуклеиновых кислот, важным достоинством которого является возможность его применения для препаративного электрофореза с использованием ДНК в последующих экспериментах, что представляется актуальным при изучении ДНК-ДНК взаимодействий. В виду влияния SG на электрофоретическую подвижность ДНК фирмой-производителем рекомендовано применение процедуры постокрашивания, однако такой подход требует большого количества этого дорогостоящего красителя и характеризуется невысоким качеством получаемых электрофореграмм. Таким образом, первоочередной задачей настоящего исследования являлась оптимизация протокола предокрашиваиия с SG при проведении агарозного гель-электрофореза.

При описании различных флуоресцентных красителей ДНК определяющей характеристикой принято считать соотношение краситель/ДНК (отношение количества молекул красителя к числу пар оснований ДНК). Поскольку молярная концентрация SG, в поставляемых фирмой «Invitrogen» (США), растворах не раскрывается, в настоящем исследовании для определения этого параметра использовался коэффициент экстинкции минимально возможный для данной группы соединений (50000 М"1) как это делали другие авторы (Cosa et al„ 2001). Таким образом, на основании выполненных спектрофотометрических измерений, концентрация SG в поставляемом фирмой растворе (10000-кратный) должна составляет порядка 1,3 х 10"2 М. Это значение и используется в дальнейшем для расчета соотношений краситель/ДНК в анализируемых растворах.

1.1. Определение стабильности комплекса SG-ДНК при проведении агарозного гель-электрофореза

Одним из важнейших критериев возможности использования красителя для предокрашивания является стабильность образуемого им с ДНК комплекса в условиях проведения электрофореза. Устойчивость комплекса SG-ДНК в настоящей работе определялась на основании измерения скорости его движения в агарозном геле, а также по изменению интенсивности флуоресценции данного комплекса с течением времени. В результате серии экспериментов было показано, что скорость движения комплекса SG-ДНК оставалась постоянной, по крайней мере, на протяжении 3-х часов проведения электрофореза и составляла 5,26±0,04 мм/час при соотношении краситель/ДНК 1/25 и 4,86±0,04 мм/час при соотношении 2/5. Полученные данные свидетельствуют о высокой стабильности комплекса SG-ДНК, поскольку вымывание красителя неизбежно привело бы к изменению скорости движения молекул ДНК (рис. 1). Кроме того, сравнение электрофореграмм, полученных после 1, 2 и 3 часов проведения электрофореза не выявило уменьшения интенсивности свечения полос геля, содержащих исследуемый комплекс.

м 12 м 12 jjjim^g щм

30' 60' 90' 120' 150' 180'

Соотношения SG/ДНК: 1 - 1/25; 2 - 2/5; М - маркер молекулярной массы UBstEll (1000 нг). Внизу указано время в минутах от начала эксперимента.

Рисунок 1 - Элекггрофореграммы ДНК, окрашенной SYBR Gold, при проведении электрофореза в течение различных интервалов времени

1.2. Выявление несвязавшегося с ДНК SG в растворах при различных количественных соотношениях краситель/ДНК

В рамках оптимизации метода предокрашивания с SG необходимо было оценить количество красителя, способного провзаимодействовать с ДНК. Выявление несвязавшегося с ДНК SG осуществлялось двумя способами. В первом случае - путем измерения спектров поглощения растворов, полученных после удаления из них уже сформировавшихся комплексов SG-ДНК, что достигалось методом центрифугирования на колонках Microcon YM-30 («Millipore», США). В результате было показано, что, свободный краситель обнаруживается в фильтратах образцов, где изначально

соотношение краситель/ДНК составляло 8/1 и 4/1. Их оптическая плотность равна 0,43 и 0,40 соответственно. В то же время, оптическая плотность фильтрата, где первоначальное соотношение краситель/ДНК было 4/5, оказалась всего 0,0034, что составляет менее 1% исходной концентрации (рис. 2А).

' 650*"К НМ

А. Спектры поглощения фильтратов растворов: 1-3 мкл стокового раствора SG в 400 мкл ТЕ-буфера1; 2 - тот же раствор с добавлением 3 мкг геномной ДНК; 3 - тот же раствор с добавлением 6 мкг геномной ДНК; 4 - тот же раствор с добавлением 30 мкг геномной ДНК. Б. Электрофореграммы ДНК: 1-4 - 500 нг ПЦР-продукта размером 464 п.о.2, окрашенного фильтратом, полученным после удаления уже сформированного комплекса SG - ПЦР-продукт 1129 п.о. (500 нг); 5-8- ранее образовавшийся комплекс SG - ПЦР-продукт 1129 п.о.; 1,5 - 2,5 нл; 2,6 - 25 нл; 3,7 - 50 нл; 4,8 - 250 нл стокового раствора красителя.

Рисунок 2 - Определение несвязавшегося с ДНК SYBR Gold в растворах после удаления

комплекса краситель-ДНК

Во-втором случае, несвязавшийся с ДНК SG выявлялся в фильтрате путем повторного окрашивания вновь добавленного фрагмента ДНК. Электрофореграмма, представленная на рисунке 2Б, свидетельствует о том, что окрашивание вновь добавленной ДНК в фильтратах образцов не происходит, если соотношение краситель/ДНК в образце до фильтрации не превышает 4/5. Суммируя все полученные данные, можно сделать вывод, что в растворах ДНК с низкими значениями соотношения

1 ТЕ-буфер: 10 мМ Трис-НС1, 1 мМ ЭДТА, рН 7.6

2 п.о. - пары оснований

80/ДНК практически весь краситель должен находиться в комплексе с нуклеиновой кислотой.

1.3. Зависимость электрофоретической подвижности окрашенной ДНК от соотношения вв/ДИК

Для выявления характера влияния 80 на скорость ДНК в агарозном геле, проведено сравнение электрофоретической подвижности ДНК, окрашенной до проведения электрофореза и после него. Для этого в ходе эксперимента были приготовлены серии проб объемом по 10 мкл каждая, содержащие различное количество очищенного ПЦР-продукта размером 1129 п.о. (пар оснований) и Бв в количестве эквивалентном его содержанию в 5 нл стокового раствора. Сравнение электрофореграмм показало, что снижения электрофоретической подвижности не наблюдалось в пробах, где соотношение краситель/ДНК было меньше или равно 1/25 (рис. 3).

1 2 3 4 5

7 M

(Я

-—

...

1929 > 1371 V ■

Ез

< 1264 ' 1

А. Электрофореграмма ДНК (предокрашивание). Б. Электрофореграмма ДНК (постокрашивание). Количество ПЦР-продукта в образцах: 1 - 2000 нг, 2 - 1000 нг, 3 - 500 нг, 4 -250 нг, 5 - 100 нг, 6 - 50 нг, 7 - 20 нг. М - 1000 нг маркера молекулярной массы X/BstEII. Рисунок 3 - Визуализация ДНК с использованием SYBR Gold по протоколам пред- и

постокрашивания

Для более полного представления о характере влияния SG на подвижность окрашенной им ДНК проанализирована электрофоретическая подвижность фракций ДНК, содержащих 1000, 100 и 10 нг ПЦР-продукта размером 1129 п.о. при трех значениях соотношения краситель/ДНК (1/50; 1/25 и 2/5). На электрофореграмме представлены данные об отсутствии влияния SG на подвижность ДНК при соблюдении соотношения краситель/ДНК 1/50 и 1/25 (рис. 4). При соотношении же краситель/ДНК равном 2/5 уменьшение электрофоретической подвижности наблюдается во всех пробах, причем, снижение электрофоретической подвижности возрастает с увеличением количества ДНК в пробе (рис. 4, дорожки 7-9).

1 2 3456789М

1929 М371 Г1264

M - маркер молекулярной массы "UBstEU, 1000 нг. Количество ПЦР-продукта длиной 1129 и.о.: 1,4,7 - 1000 нг; 2,5,8 - 100 нг; 3,6,9 - 10 нг. Соотношения краситель/ДНК 1-3 - 1/50; 4-6 - 1/25; 7-9 -2/5.

Рисунок 4 - Электрофоретическая подвижность ДНК в зависимости от соотношения

SG/ДНК

Таким образом, полученные данные свидетельствуют об отсутствии изменений подвижности ДНК при образовании комплексов с SG, если соотношение краситель/ДНК не превышает 1/25, что позволяет использовать данный высокоэффективный краситель по протоколу предокрашивания для образцов с известным количеством ДНК.

2. Изучение структурно-функциональных особенностей (САУТС)п-повторов, важных для процессов инициации и терминации гомологичной рекомбинации

Poly(CAZTG) - один из наиболее распространенных микросателлитных повторов млекопитающих, включая человека. Многочисленные данные свидетельствуют об их функционировании в качестве «горячих» точек рекомбинации (Wahls, 1998; Majewski et al., 2000). Однако, механизм влияния (СА/ТО)п-повторов на этот процесс остается неизвестным. Вероятнее всего он связаны со структурными особенностями данной последовательности ДНК. В настоящей работе продолжено, ранее начатое в лаборатории М.Г. Якубовской, изучение этих особенностей с точки зрения процессов инициации и терминации ГР.

2.1. Анализ влияния poly(CAZTG) на процесс миграции точки перекреста структур

Изучение влияния СА-микросателлитов на процесс «миграции ветвления» структур Холлидея осуществлялось с помощью модельной системы, основанной на образовании симметричных крестообразных структур ДНК в высококонцентрированных водных растворах гомологичных линейных дуплексов (УакиЬоуякауа ег а!., 2001). Полученные, таким образом, популяции структур Холлидея визуализировались с помощью электронной микроскопии и подразделялись на три группы исходя из расположения

Холлидея

точки перекреста (рис. 5) с последующим проведением статистической обработки полученных данных.

А

(САУТЗ)п .-1-.

дуплекс

ДНК

II

фракция дуплексной ДНК

штшшШШёШт^шётттт^тМ:

т ' Ж Р ш

..........-......—

фракция четырехцепочечных структур

щщш^ш^тштшшм

распределение четырехцепочечных структур по группам

■■ шя ш

А. Схема строения дуплексной ДНК, образующей анализируемые структуры Холлидея. Б. Электронная микрофотография контрольной фракции дуплексной ДНК. В. Электронная микрофоторгафия структур Холлидея. Цифрами I, II и III обозначена локализация точек перекреста структур Холлидея, лежащая в основе их распределения по группам. Увеличение в 10000 раз.

Рисунок 5 - Формирование структур Холлидея линейными фрагментами ДНК

В

Анализ локализации точки перекреста в популяциях структур Холлидея. образованных ПЦР-продуктами. Статистический анализ показал, что в популяции структур Холлидея, образованных фрагментами неповторяющейся последовательности, максимальное число крестообразных структур принадлежит I группе. Во фракции же структур Холлидея, образованных дуплексами, содержащими (СА/ТС)31-повтор, максимальное число структур принадлежит II группе с локализацией точек перекреста в районе повтора (таблица 1).

Таблица 1 - Локализация точки перекреста в популяциях структур Холлидея, образованных ПЦР-продуктами

Структуры Холлидея Содержащие (СА/ГС)з 1-повтор, % Рэндомная последовательность, %

I — структуры Холлидея с локализацией точки перекреста ветвей в области 1-248 п.о. 38,4 ± 5,8* 49,1 ±3,71*

11 - структуры Холлидея с локализацией точки перекреста ветвей в области 248-496 п.о. 52,27 ±4,94** 38,2 ±2,52**

III - структуры Холлидея с локализацией точки перекреста ветвей в области 496-745 п.о. 9,3 ± 3,75 12,1 ±3,07

*, ** - различия статистически значимы (р<0,01)

Анализ локализации точки перекреста в популяциях структур Холлидея, образованных фрагментами плазмидной ДНК. Статистический анализ полученных данных показал, что как во фракциях структур Холлидея, образованных (САЛХЗ)зг содержащими фрагментами плазмиды, так и плазмидными фрагментами, не содержащими повторов, большинство структур принадлежит I группе (таблица 2).

Таблица 2 - Локализация точки перекреста в популяциях структур Холлидея, образованных фрагментами плазмидной ДНК

Структуры Холлидея Содержащие (CA/TG)3i-повтор, % Рэндомная последовательность, %

I - структуры Холлидея с локализацией точки перекреста ветвей в области 1-150 п.о. 58,7 ± 12,27 60,7 ±9,51

II - структуры Холлидея с локализацией точки перекреста ветвей в области 150-300 п.о. 24,03 ± 7,87 23,4 ±8,45

III - структуры Холлидея с локализацией точки перекреста в области 300-450 п.о. 13,5 ± 8,2 15,9 ±7,68

Анализ локализации точки перекреста в популяциях структур Холлидея. образованных фрагментами плазмидной ДНК, несущими разное число ("СА/ТОп-повторов. Анализ данных электронной микроскопии показал, что локализация точки перекреста в области повторяющейся последовательности встречается достоверно чаще в популяции структур Холлидея, имеющих (СА/ТС)25/з1-гетерологию, по сравнению со структурами, образованными полностью гомологичными дуплексами (таблица 3).

Таблица 3 - Локализация точки перекреста в популяциях структур Холлидея, образованных фрагментами плазмидной ДНК, несущими (САЛГС)п-повторы с разным числом повторяющихся единиц

Структуры Холлидея Содержащие (СА/Ш)з1Я5-повтор, % Содержащие (САЛХЗ)25-повтор, %

I - структуры Холлидея с локализацией точки перекреста ветвей в области 1-150 п.о. 53,8 ±2,3* 66 ± 5,42*

II - структуры Холлидея с локализацией точки перекреста ветвей в области 150-300 п.о. 34,76 ±3,92** 20,5 ± 5,65**

III - структуры Холлидея с локализацией точки перекреста ветвей в области 300-450 п.о. 8,55 ± 2,27 13,5 ±4,74

*, ** - различия статистически значимы (р<0,01)

Таким образом, по результатам исследования можно сделать вывод, о том, что гетерология в области (СА/ТО)п-локуса ингибирует миграцию ветвей структуры

Холлидея, промежуточного продукта гомологичной рекомбинации, и, тем самым, может способствовать ее ферментативному разрешению в этих участках генома.

2.2. Особенности олигонуклеотидной инвазии во внутреннюю комплементарную последовательность дуплексной ДНК

Ранее продемонстрирован феномен инвазии олигонуклеотидов <3(СА)ю и <1(ТС)ю в линейную и кольцевую молекулы ДНК, содержащие (СА/ТС)31-последовательность (Гасанова и др., 2010). При этом в случае неповторяющейся последовательности подобное взаимодействие обнаружено не было. Полученные данные свидетельствуют о существовании конформационных особенностей в области (САЛХ})п-повтора, по всей видимости, лежащие в основе синаптической стадии ГР. Соответственно, представляло интерес дальнейшее изучение этого феномена.

2.2.1. Оптимизация метода визуализации ДНК-ДНК взаимодействий с помощью флуоресцентно меченных олигонуклеотидов Во всех предыдущих исследованиях, касающихся ДНК-ДНК взаимодействий для визуализации олигонуклеотидной инвазии в дуплексную ДНК использовались олигонуклеотиды, содержащие на 5'-конце радиоактивный фосфор 32Р. В настоящей работе оптимизирован более современный подход, основанный на введении в состав олигонуклеотида флуоресцентной метки. В ходе оптимизации были выбраны два флуоресцентных красителя: карбоксифлуоресцеин (РАМ) и тетраметилкарбоксиродамин (ТАМЯА), а в качестве модели - ранее изученное В.К. Гасановой встраивание олигонуклеотида в комплементарный концевой участок линейного дуплекса случайной последовательности (Гасанова и др., 2005). В результате было показано, что расположение флуоресцентного красителя на З'-конце, как в случае РАМ, так и ТАМЯА, препятствует встраиванию олигонуклеотида в комплементарный ему концевой участок ПЦР-продукта (рис. 6). Таким образом, в ряде последующих экспериментов по изучению олигонуклеотидной инвазии использовались олигонуклеотиды, несущие ТАМЫА на З'-конце (далее обозначенные как 5'Т), так как, в отличие от БАМ, данный краситель был менее подвержен фотовыцветанию.

А

II

I - электрофореграмма, II -скан геля3, III - олигонуклеотиды, меченные флуоресцентным красителем. М - маркер молекулярной массы ШбШП (1000 нг). ПЦР-продукт (800 нг) инкубировался4 со следующими олигонуклеотидами: 1 - З'-метка- РиС19-У8Р-8, 2 - 5'-метка-РиС19-У8Р-5, 3 - Кл-гаБ-З'-метка, 4 - Кл-га5-5'-метка; олигонуклеотиды 1,2 - комплементарны концевому участку линейного дуплекса, 3,4 - не комплементарны концевому участку линейного дуплекса.

Рисунок 6 - Визуализация инвазии в линейный концевой участок ПЦР-продукта олигонуклеотидов, меченных флуоресцентными красителями ТАМКА (А) или РАМ (Б)

2.2.2. Инвазия олигонуклеотидов 11(СА)10 и а(ТС)10 в эукариотическую ДНК

Ранее исследования по изучению закономерностей олигонуклеотидной инвази выполнялись с использованием прокариотической (плазмидной) ДНК. В настоящей работе в рамках дальнейшего исследования особенностей встраивания олигонуклеотидов с!(СА)ю и с1(ТС)ю во внутренний комплементарный участок дуплексной ДНК проведен анализ возможности инвазии (1(СА)10 и ё(ТС)ю в ДНК эукариот. В качестве объекта исследования была выбрана геномная ДНК, выделенная из нормальной и опухолевой тканей молочной железы и обработанная эндонуклеазами рестрикции Нтс1Ш или ЕсоМ («СибЭнзим», Россия). В результате эксперимента встраивание в геномную ДНК показано для олигонуклеотида 5'Т-ё(ТС)10 (рис. 7, дорожки 3,5,7), в то время как инвазии 5'Т-<1(СА)1о обнаружено не было (рис. 7, дорожки 2,4,6).

3 Получен с помощью лазерного сканера гелей высокого разрешения Typhoon (GE Healthcare, Германия).

4 Здесь и далее инкубация проводилась в буфере, содержащем 6 мМ Трис-НС1, 1 мМ ЭДТА, 300 мМ NaCl (рН 7.5), при 37°С в течение суток.

Ют- яа^кймМНМ «-свободный-*

раивв^^^^^^ш™—— . олигонуклеотид

Электрофореграмма (вверху) и скан геля (внизу) геля: М - маркер молекулярной массы ШзШП (1000 нг); геномная ДНК (2000 нг) инкубировалась: 1 - без олигонуклеотида; 2, 4, 6 - с 5'Т-<1(СА)ю; 3,5,7 - с 5'Т-(1(ТС)1о. Количество олигонуклеотида - 17 пмоль на пробу. Рисунок 7 - Инвазия олигонуклеотидов 5Т-(1СЛ10 и 5Т-(1ТОю в эукариотическую геномную ДНК, обработанную эндонуклеазами рестрикции H¡ndIП (А) и ЕсоШ (Б)

2.2.3. Олигонуклеотидная инвазия в ди-, три- и тетрануклеотидные последовательности

Для того чтобы понять, является ли олигонуклеотидная инвазия свойством всех микросателлиных последовательностей, или она характерна только для ро1у(СА/ТС), проанализирована возможность подобного взаимодействия в области ди-, три- и тетрануклеотидных повторов. В ходе первого эксперимента оценивалась возможность олигонуклеотдного встраивания в геномную ДНК, полученную из опухолевой и нормальной тканей молочной железы. При этом, были выбраны следующие олигонуклеотиды: 5"Г-ё(СТ)10, бТ-ё^А),* 5'Т-а(АТ)10, 5'Т-с1(ССА)7, 5'Т-<1(ООТ)7) 5'Т-(1(СССА)5 и 5НМ(ОООТ)5. В результате эксперимента встраивания ни одного из вышеуказанных олигонуклеотидов в геномную ДНК обнаружено не было, в то время как инвазия 5Т-ё(ОТ)ю выявлялась на обычном уровне (рис. 8).

М123 45678

свободный ш олигонуклеотид

ННЧЙЧВ __■__

Электрофореграмма (вверху) и скан геля (внизу) геля: М - маркер молекулярной массы Х/ВвЙШ (1000 нг); геномная ДНК (2000 нг) инкубировалась: 1-е олигонуклеотидом случайной последовательности 5'Т-К1-газ, 2 - 5'Т-с1(ОА),о, 3 - 5'Т-с1(СТ),о, 4 - 5Т-ё(АТ)10, 5 - 5"Т-<1(ССА)7, 6

- 5Т-ё(ООТ)7, 7 - 5'Т-с1(СССА)5, 8 - 5Т-а(СООТ)5, 9 - 5'Т-а(СТ)ю. Количество олигонуклеотида

- 17 пмоль на пробу.

Рисунок 8 - Инвазия олигонуклеотидов различных повторяющихся последовательностей в эукариотическую геномную ДНК

Для второго эксперимента использовались плазмиды, содержащие следующие последовательности: (САО/СТС)80, (СОй/ОСС)«, (СТТЛЗАА)20 и (СГШАА)114. Данные плазмиды инкубировались с радиоактивно меченными олигонуклеотидами (далее обозначенные как <1(Х)*), комплементарными повторяющейся последовательности дуплексной ДНК. В результате было показано, что формирование комплекса происходит лишь в случае совместной инкубации с1(ОАА)7* с плазмидой, содержащей (СТТ/ОАА)114-повтор. Полученный результат хорошо согласуется с литературными данными о способности длинных (СТТЛЗАА)п-последовательностей образовывать неканоническую Н-форму ДНК, при которой (СТТ)-нить остается свободной и доступной для взаимодействия.

I Электрофореграмма, II авторадиограмма комплекса, III авторадиограмма олигонуклеотидов. М

- маркер молекулярной массы A/BstEII (1000 нг). Плазмиды содержат следующие повторы: 1,2 -(CAG)so; 3,4 - (CGG)40; 5,6 - (СТТ)2о; 7,8 - (CTT)ii4. Радиоактивно меченные олигонуклеотиды: 1

- d(CAG)7*; 2 - d(CTG)7*; 3 - d(GCC)7*; 4 - d(CGG)75,7 - d(CTT)7*; 6,8 - d(GAA)7*.

Рисунок 9 - Олигонуклеотидная инвазия в плазмиды, содержащие тринуклеотидные

повторы

2.2.4. Анализ возможности олигонуклеотидной инвазии в (CA/TG)n-последовательность дуплексной ДНК после удаления ранее сформированного

комплекса

Для того чтобы понять являются ли структурные особенности (СА/ГС)п-повтора, лежащие в основе олигонуклеотидной инвазии, его динамической характеристикой или они формируются только в условиях in vivo проведено исследование, в рамках которого, изучалась возможность повторного образование межмолекулярных комплексов после удаления из раствора уже сформированных (рис. 10). В результате было показано, что повторного образования комплекса ДНК-олигонуклеотид ни в случае d(CA)10 , ни в случае d(TG)m* не происходит (рис. 10Б, дорожки 3,4,7,8). Полученные данные свидетельствуют о том, что структурные особенности (СА/ТО)п-последовательности,

обуславливающие возможность олигонуклеотидной инвазии, возникают в клетке и остаются стабильными на протяжении процесса выделения ДНК.

1. Первая инкубация ДНК с олигонуклеотидами (биотинилированными)

линеаризованная рЕ10

6йо™„ (САГО)».

ьк?

. с9»-~о

'1 —юЬ

сверхспирализованная рЕЮ (СА/ТС),, биотин 0=><ОГ у-»'«—• 0=01~* - г*

с<»о У

олигонуклеотид

* (

1

олигонуклеотид

2. Удаление ДНК-ДНК комплексов из раствора

Сх»<Э

О

стрептавидин

3. Вторая инкубация с олигонуклеотидами (радиоактивно меченными)

ОоО _ Г^Г4* оаг*

* I

«-ц^

4. Электрофорез с целью выявления радиоактивно меченных комплексов

М 1 2 3 4 5 6 7

9 10

п.о.

3675ч| 2323' 1929

тж ЩГ — ШР

ямп т — —

А. Схема проведения эксперимента. Б. Электрофореграмма (вверху) и авторадиограмма (вниз;/) геля. М - маркер молекулярной массы Х/ВвШН (1000 нг). 1-6 - линеаризованная плазмида рЕЮ , 7-10 - плазмида рЕЮ. Инкубация дуплексной ДНК с радиоактивно меченным олигонукпеотидом с1(СА)1о*: 1, 3, 5, 7, 9; инкубация дуплексной ДНК с радиоактивно меченным олигонукпеотидом (1(ТС)к>*: 2,4, 6, 8,10. Первая инкубация дуплексной ДНК со следующими биотинилированными олигонуклеотидами: к1-га5-Ыойп-5' - 1, 2; сКСА)ю-Ью1т-5' - 3, 7; а(ТС)ю-Ью1т-5' - 4, 8; без олигонуклеотидов - 5,6,9,10.

Рисунок 10 - Анализ встраивания олигонуклеотидов (1САю* и (1ТСю* в дуплексную ДНК, содержащую (СА/ТС)31-повтор, после удаления ранее сформированного комплекса

5 Плазмида рЕ 10 является производной плазмиды Р11С19, содержащей (СА/ТС)згповтор.

2.2.4. Встраивание олигонуклеотидов d(CA)10 и d(TG)10 в дуплексную ДНК с разной

длиной (CA/TG)n-noBTopa

Проведен анализ влияния длины (СА/ТС)п-повтора дуплексной ДНК на процесс олигонуклеотидной инвазии. С этой целью предварительно была получена коллекция плазмид, производных PUC19, содержащих разное число повторов, а именно: (СА/ТС)ю, (CA/TG)u, (CA7TG)25, (CA/TG)3] и (CA/TG)94. В результате анализа показано, что инвазия 5'T-d(CA)io или 5'T-d(TG)io олигонуклеотидов происходит в комплементарную повторяющуюся последовательность плазмидной ДНК при любой длине poly(CA/TG), но с разной интенсивностью. А именно, наблюдается резкое снижение интенсивности флуоресценции в случае плазмид, содержащих (CA/TG)i5- и (САЛЧЗ)25-повторы (рис. 11, дорожки 3,4), по сравнению с теми, которые несли (CA/TG)i0, (CA/TG)3i и (CA/TG)94 (рис. 11, дорожки 2, 5, 6).

А Б

М 1 2 3 4 5 6 23456

I - электрофореграмма, II - скан геля, III - скан олигонуклеотидов, меченных ТАМИЛ по 5'-концу. А. Инкубация плазмид с 5'Т-аСШ)ю. Б. Инкубация плазмид с 5'Т-а(СА),0. Количество повторов в плазмидах: 1 - без повторов, 2 - (СА/Ш)ш, 3 - (САЯО)15, 4 - (СА/ТО)г5, 5 - (СА/ГО)зь 6 - (СА/Ш)94. М- маркер молекулярной массы )УВз1ЕН (1000 нг).

Рисунок 11 - Инвазия 5гМ(СА)ю и 5'Т^(ТС)юолигонуклеотидов в плазмиды, содержащие

разное число (САЛГС)п-повторов

2.2.5. Зависимость интенсивности инвазии олигонуклеотидов d(CA)lo и d(TG)lo в плазмиду, содержащую (САЛГС)31-повтор, от мольного соотношения плазмида/олигонуклеотид

В рамках изучения особенностей встраивания олигонуклеотидов d(CA)lo и d(TG)lo в комплементарную повторяющуюся последовательность дуплексной ДНК, проведен анализ влияния на этот процесс мольного соотношения плазмидная ДНК/олигонуклеотид. В ходе проведения исследования показано, что количество

олигонуклеотидов, встроившихся в дуплекс, возрастает с повышение соотношения дуплекс/олигонуклеотид от 1/10 до 1/1, после достижения которого происходит выход на плато без дальнейшего повышения интенсивности встраивания (рис. 12).

II

III

I - элекгрофореграмма, II -скан геля, III - олигонуклеотиды, меченные TAMRA по 5'-концу. Мольное соотношение плазмида/олигонуклеотид: 1,6 - 1/50; 2,7 - 1/20; 3, 8 - 1/1; 4, 9 - 5/1; 5, 10 - 10/1. Плазмида инкубировалась с 5'T-d(CA)i0: 1-5 и 5'T-d(TG)io: 6-10.

Рисунок 12 - Интенсивности инвазии олигонуклеотидов 5'T-d(CÄ)i0 и 5'T-d(TG)ioB плазмиду, содержащую (CA/TG)3i-noBTop, от мольного соотношения плазмида/олигонуклеотид

2.2.6. Олигонуклеотидная инвазия в разных солевых условиях

Принимая во внимания, что одним из возможных объяснений олигонуклеотидной инвазии в области СА-микросателлитов является способность данной повторяющейся последовательностью формировать неканонические формы ДНК, образование которых сильно зависит от условий микроокружения, проведено сравнение интенсивности встраивания dCA!0 и dTGI0 при различных солевых условиях. В результате этого исследования было показано, что интенсивность олигонуклеотидной инвазии остается практически постоянной при использовании ряда солевых растворов, однако снижается в бессолевых условиях (рис. 13).

А. 30-кратный мольный избыток 5'T-d(CA)io по отношению к плазмиде (вверху -элктрофореграмма, внизу - скан геля). Б. Эквимолярное количество 5'T-d(CA)io по отношению к плазмиде (вверху - элктрофореграмма, внизу - скан геля). М - 1000 нг маркера молекулярного веса X/BstEII. К - плазмида UC-CA31, инкубированная без олигонуклеотида в TES-буфере. Условия инкубации: 1 - dd, 2 - ТЕ-буфер, 3 - TES-буфер, 4 - TSM-буфер, 5 - PBS, 6 - G-буфер6.

Рисунок 13 - Инвазия олигонуклеотида 5'T-d(CA)m в плазмиду, содержащую (CA/TG)3i-повтор в разных солевых условиях

ВЫВОД

1. Микросателлитные локусы (CA/TG)n обладают способностью к спонтанному взаимодействию с одноцепочечной ДНК d(GT)i0, что было продемонстрировано на сверхспирализованной, релаксированной и линеаризованной плазмидной ДНК, а также геномной ДНК человека.

2. Среди других микросателлитных локусов, а именно, (GA/TC)n, (ТА/АТ)п, (CAG/GTC)n, (CGG/GCC)n, (CTT/GAA)n, (GGT/CCA)n и (GGGT/CCCA)n, способностью к спонтанному взаимодействию с гомологичной одноцепочечной ДНК обладают только длинные (CTT/GAA)n-noBTopbi, формирующие в условиях отрицательной сверхспирализации неканоническую Н-форму ДНК.

3. Топологические особенности ДНК в области микросателлитных локусов (CA/TG)n, определяющие их способность к взаимодействию с одноцепочечными фрагментами d(CA)10 и d(GT)10, формируются in vivo.

4. При изучении влияния длины повторяющегося локуса (CA/TG)n, находящегося в составе сверхспирализованной плазмидной ДНК, на особенности встраивания в дуплекс одноцепочечных фрагментов d(CA)I0 и d(GT)10 было установлено,

6 ТЕ-буфер (10 мМ Трис-НС1, 1 мМ ЭДТА, рН 7.6), TES-буфер (6 мМ Трис-НС1, 1 мМ ЭДТА, 300 мМ NaCl, рН 7.5), TSM-буфер (6 мМ Трис-НС1, 300 мМ NaCl, 6 мМ MgCl2, рН 7.8), PBS (137 мМ NaCl, 2,7 мМ КС1, 10 мМ Na2HP04, 1,76 мМ КН2Р04, рН 7.4), G-буфер (20 мМ HEPES, 140 мМ NaCl, 50 мМ КС1, рН 7.3).

что интенсивность ДНК-ДНК взаимодействия убывает в ряду: (CA/TG)31 = (CA/TG),4 > (С A/TG) ,о > (С A/TG) 15=(CA/TG)25.

5. Интенсивность взаимодействия микросателлитных локусов (CA/TG)3I сверхспирализованной плазмидной ДНК с комплементарными одноцепочечными фрагментами зависит от их мольного соотношения и возрастает с повышением соотношения дуплекс/олигонуклеотид от 1/10 до 1/1, после достижения которого, выходит на плато.

6. Интенсивность взаимодействия микросателлитных локусов (CA/TG)3I с одноцепочечными фрагментами d(CA)i0 и d(GT)10, не изменяется при использовании ряда солевых буферных растворов, однако снижается в бессолевых условиях.

7. Обладающие полной гомологией (СА/ТС)п-микросателлитные локусы не влияют на миграцию ветвей структуры Холлидея, промежуточного продукта гомологичной рекомбинации, в то время как гетерология в области повторяющейся последовательности ингибирует данный процесс, что может способствовать ее ферментативному разрешению в этих участках генома.

8. Флуоресцентный краситель нуклеиновых кислот SYBR Gold не влияет на электрофоретическую подвижность ДНК при его низких соотношениях с биополимером, что позволило оптимизировать протокол визуализации ДНК и сократить финансовые и временные затраты на этапе пробоподготовки ДНК и избежать использования токсичных и мутагенных соединений при проведении исследования.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ В ЖУРНАЛАХ РЕКОМЕНДОВАННЫХ ВАК РФ:

1. Карпеченко, Н.Ю. Визуализация ДНК при гель-электрофорезе флуоресцентным красителем sybr gold по протоколу предокрашивания / Н.Ю. Карпеченко, В.К. Гасанова, Н.В. Ряднинская, Е.А. Лесовая, К.И. Кирсанов, Г.А. Белицкий, М.Г. Якубовская // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - 2012. - №10. - С. 6973.

2. Карпеченко, Н.Ю. Влияние СА-микросателлитов на гомологичную рекомбинацию / Н.Ю. Карпеченко, В.К. Гасанова, В.И. Попенко, М.Г. Якубовская // Технологии живых систем. - 2013 -№ 9. - С. 33-39.

3. Шалгинских, Н.А. Эпигенетические механизмы регуляции экспрессии генов в химическом канцерогенезе / Н.А. Шалгинских, Н.Ю. Карпеченко, A.M. Оглоблина, Е.А. Лесовая, К.И. Кирсанов, Д.С. Набережное, Г.А. Белицкий, М.Г. Якубовская // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - 2014. - №3. - С. 46-68.

4. Карпеченко, Н.Ю. Спонтанная олигонуклеотидная инвазия в (САЛЧЗ)п-повторы как основа их функционирования в качестве «горячих» точек рекомбинации / Н.Ю. Карпеченко, В.К. Гасанова, Н.Г. Долинная, Д.С. Набережное, М.Г. Якубовская И Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - 2014 - № 4. - С. 3035.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

5. Gasanova, V. Homology-mediated oligonucleotide invasion into the repetitive region of linear and supercoiled DNA / V. Gasanova, N. Karpechenko, G. Belitsky, C. Gaillard, F. Strauss, N. Dolinnaya, M. Yakubovskaya II FASEB, Biological consequence of alternatively structured DNA, Abstractbook - 2010. - p. 39.

6. Karpechenko, N. Peculiarities of SYBR Gold-DNA interaction which are important for nucleic acid visualization / N. Karpechenko, E. Lesovaya, V. Gasanova, A. Ivanov, K. Kirsanov, G. Belitsky, M. Yakubovskaya // The Biophysical Society 55th Annual Meeting Abstractbook- 2011.-p. 213.

7. Gasanova, V. Invasion of d(CA)10- and d(TG)10-oligonucleotides into (CA/TG)31-repetitive region of linearized and supercoiled plasmid / V. Gasanova, N. Karpechenko, C. Gaillard, F. Strauss, G. Belitsky, N. Dolinnaya, M. Yakubovskaya // Recombination. Keystone Symposia on Molecular Cell Biology, Abstractbook - 2011. - p. 25.

8. Karpechenko, N. CA-microsatellite instability as a factor of branch migration impeding in Holliday junctions / N. Karpechenko, V. Gasanova, N. Dolinnaya, V. Popenko, M. Yakubovskaya //Cancer Research.-2012. -№ 8(Suppl.)-doi:1538-7445.AM2012-2112.

Подписано в печать:

22.04.2014

Заказ № 9979 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru