Автореферат и диссертация по медицине (14.00.10) на тему:Диагностические возможности ПЦР в верификации диагноза инфекционного мононуклеоза, вызыванного вирусом Эпштейна-Барр

На правах рукописи

003447016

Прохорова Наталья Александровна

Диагностические возможности ПЦР в верификации диагноза инфекционного мононуклеоза, вызванного вирусом Эпштейна-Барр

14 00 10 - инфекционные болезни

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

3 о СЕН 2008

Москва-2008

003447016

Работа выполнена в ГОУ ВПО Московской Медицинской Академии им И М Сеченова

Научные руководители Доктор медицинских наук, профессор Елена Васильевна Волчкова Кандидат медицинских наук Владимир Петрович Чуланов

Официальные оппоненты

Доктор медицинских наук, профессор Наталья Михайловна Беляева Доктор медицинских наук, профессор Анатолий Карпович Токмалаев

Ведущее учреждение ГОУ ВПО Российский государственный медицинский университет Защита диссертации состоится « 13 » октября 2008г в 13 часов на заседании Диссертационного совета Д 208 040 05 при ГОУ ВПО Московской Медицинской Академии им И М Сеченова Росздрава Адрес 119991, Москва, ул Трубецкая, д 8, строение 2

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ГОУ ВПО ММА им И М Сеченова Росздрава (117998, Москва, Нахимовский проспект, д 49)

Автореферат разослан « 5 » сентября 2008г

Ученый секретарь Диссертационного совета

Доктор медицинских наук, профессор Елена Васильевна Волчкова

Актуальность темы.

Проблема специфической диагностики EBV-инфекции, несмотря на длительную историю изучения, чрезвычайно актуальна из-за недостаточного использования в практическом здравоохранении современных лабораторных методов исследования Хотя EBV-инфекция имеет глобальное распространение и к 18 годам более 90% населения земного шара инфицировано вирусом Эпштейна-Барр (Hess R D , 2004), но в большинстве случаев она носит персистирующий характер и не нуждается в противовирусном лечении В тоже время, изменяющиеся условия окружающей среды, увеличение случаев приобретенного и врожденного иммунодифицита, обуславливают нарастание числа тяжелых случаев инфекционного мононуклеоза, реактивации этой инфекции с полиорганной патологией (Goldman, 2007)

Полиморфизм клинических проявлений Эпштейна-Барр вирусной инфекции определяет необходимость улучшения клинической и лабораторной диагностики заболевания Наиболее перспективным является применение на практике молекулярно-генетических методов диагностики и, прежде всего полимеразной цепной реакции, которая позволяет выявлять активную репликацию ДНК вируса Эпштейна-Барр с острого периода до выздоровления, а у части пациентов и длительное время после перенесенного заболевания

Количество исследований, посвященных изучению характера клинико-лабораторных проявлений инфекционного мононуклеоза в зависимости от стадии инфекционного процесса у взрослых пациентов в нашей стране, очень ограничено Нуждается также в уточнении диагностическая значимость специфических методов ИФА и ПЦР на различных стадиях инфекционного процесса

Все это обуславливает актуальность исследований, направленных на изучение клинико-лабораторной диагностики инфекционного мононуклеоза

в динамике инфекционного процесса в сопоставлении с персистенцией вируса в сыворотке крови

Цель исследования - изучить особенности персистенции ДНК EBV в сыворотке крови у больных инфекционным мононуклеозом на разных стадиях заболевания в сопоставлении с серологическими методами исследования (a-EBV VCA IgM, a-EBV VCA IgG, a-EBV EA IgG, a-EBV EBNA IgG, реакцией Хофф-Бауэра)

Задачи исследования:

1 Исследовать динамику серологических маркеров инфекции Эпштейна-Барр (a-EBV VCA IgM, a-EBV VCA IgG, a-EBV EA IgG, a-EBV EBNA IgG) у больных инфекционным мононуклеозом

2 Изучить в динамике данные молекулярно-генетического исследования (ПЦР) у больных инфекционным мононуклеозом на различных стадиях заболевания

3 Сопоставить диагностическую значимость серологической и ПЦР (ДНК) диагностики

4 Проанализировать клинические и лабораторные данные у больных инфекционным мононуклеозом в сопоставлении с данными серологических и молекулярно-генетических (ПЦР) исследований на различных этапах заболевания

Научная новизна:

Впервые прослежена и установлена длительность активной репликации ДНК EBV у больных инфекционным мононуклеозом в динамике инфекционного процесса

Показана возможность длительной (до 24 месяцев) активной репликации ДНК EBV у части больных с инфекционным мононуклеозом после острой фазы заболевания

Проведен анализ и впервые показано преимущество молекулярно-генетического метода (ПЦР) над серологическим (реакцией Хофф-Бауэра) в ранние сроки заболевания

Установлено, что у больных инфекционным мононуклеозом в периоде реконвалесценции через 12-24 месяца выявлено интерметтирующее появление ДНК EBV при отсутствии выраженных клинических данных

Впервые на клиническом материале показано дифференциально-диагностические возможности применения метода ПЦР (ДНК EBV) на ранних этапах инфекционного процесса, учитывая большой полиморфизм клинических проявлений инфекционного мононуклеоза

Практическая значимость:

Впервые определена длительность активной репликации ДНК EBV методом ПЦР в сыворотке крови больных инфекционным мононуклеозом, что позволило установить сроки оптимального применения серологических и ПЦР методов для верификации диагноза

Впервые показано преимущество выявления ДНК EBV в сыворотке крови методом ПЦР в сравнении с общепринятыми серологическими исследованиями (реакция Хофф-Бауэра) как на ранних сроках заболевания, так и при обследовании лихорадящих больных с полилимфоаденопатией для верификации диагноза

Установлено, что метод ПЦР может использоваться для дополнительной верификации диагноза EBV на различных стадиях инфекционного процесса, а также при затянувшейся реконвалесценции

Полученные результаты исследования могут быть рекомендованы для разработки практических рекомендаций по диспансерному наблюдению за переболевшими EBV

Положения, выносимые на защиту:

1 ДНК вируса Эпштейна-Барр персистирует длительно в сыворотке крови у части пациентов после перенесенного инфекционного мононуклеоза, что подтверждается при исследовании сывороток крови методом ПЦР

2 Имеется преимущество метода ПЦР над реакцией Хофф-Бауэра при подтверждении диагноза инфекционного мононуклеоза, вызванного вирусом Эпштейна-Барр

3 Данные по динамике серологических маркеров могут в совокупности с

ПЦР диагностикой использоваться для верификации диагноза Эпштейна-Барр вирусной инфекции

4 У диагностически неясных больных с симптомами сходными с инфекционным мононуклеозом, учитывая полиморфизм клинических проявлений инфекции Эпштейна-Барр, можно рекомендовать как основной метод для верификации диагноза молекулярно-генетическое исследование (ПЦР)

Внедрение результатов исследования в практику.

Полученные практические и теоретические результаты используются в работе отделений Инфекционной Клинической больницы № 2 г Москвы, на кафедре инфекционных болезней ММА им И М Сеченова

Апробация работы.

Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на заседании кафедры инфекционных болезней Московской Медицинской Академии им И М Сеченова

Материалы диссертационной работы были доложены на VII Российском съезде врачей-инфекционистов (октябрь 2006, г Нижний Новгород), VI Всероссийской научно-практической конференции с

международным участием «Молекулярная диагностика» (28-30 ноября 2007г), на обществе врачей-инфекционистов г Москвы в апреле 2008г

Публикации.

По материалам диссертационной работы опубликовано 4 научные работы

Объем и структура диссертации

Работа изложена на 119 страницах печатного текста и состоит из введения, двух частей - обзора литературы, собственных наблюдений, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы (20 отечественных и 110 иностранных работ) Содержит 18 рисунков, 22 таблицы, 3 клинических примера

Материалы и методы исследования

Проведено обследование 77 больных, из которых у 59 был подтвержден диагноз инфекционного мононуклеоза Эпштейна-Барр вирусной этиологии (I группа) и 18 пациентов с различными диагнозами (II группа) Наблюдение проводилось в период с 1 12 2004г по 1 08 2007г в разные сроки заболевания — периоды разгара заболевания и ранней реконвалесценции, через 6, 12, 24 месяца от начала заболевания Обследование выполнено на базе Инфекционной Клинической больницы №2 г Москвы, лаборатории ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора г Москвы

Диагноз устанавливался на основании клинических и лабораторных методов исследования Всем больным проводились лабораторные исследования на базе клинической, биохимической и серологической лабораторий ИКБ № 2 по общепринятым методикам клинический анализ крови, клинический анализ мочи, биохимические исследования (АЛТ, АСТ, билирубин), реакция Хофф-Бауэра При необходимости больным проводилось рентгеновское исследование, УЗИ Все сыворотки крови

больных исследовались молекулярно-генетическим методом (ПЦР) на базе центра молекулярной диагностики ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора с использованием тест-систем «АмплиСенс-200 EBV-290», «АмплиСенс-200 CMV-500/800-BKC)», «АмплиСенс-200 HHV-VI-380» Помимо этого на базе ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора все пациенты обследовались на антитела к структурным белкам EBV VCA IgM, VCA IgG, EBNA IgG, EA IgG и CMV IgM и IgG с использованием коммерческих тест-систем производства DIAGNOSTIC SYSTEMS LABORATORIES INC, USA и производства ЗАО «Вектор-Бест», Россия

Дополнительно всем пациентам в периоде разгара для исключения вирусных гепатитов проводилось обследование сыворотки крови на маркеры вирусных гепатитов (HBs Ag, a-HBcor IgM и a-HBcor сум, a-HCV, a-HAV IgM) и ВИЧ-инфекцию в иммунологической лаборатории ИКБ № 2 (зав лаб к м н Ольшанский А Я) Методом ПЦР определялась ДНК вируса Эпштейна-Барр (EBV), цитомегаловируса (CMV), вируса простого герпеса (HSV) и вируса герпеса VI типа (HHV6) в лаборатории ЦНИИ эпидемиологии МЗ РФ (к м н Чуланов В П)

Клинические и лабораторные показатели регистрировались в специально разработанной карте и обрабатывались на персональном компьютере в программе «Microsoft Exell» При значительных колебаниях значений переменных внутри групп указывалась медиана и стандартное отклонение (М ± s) Частотные признаки (число лиц с наличием или отсутствием признака) выражались в процентах

Все больные I группы (59 человек) перенесли

среднетяжелую форму инфекционного мононуклеоза Среди пациентов было

30 мужчин (51%) и 29 женщин (49%) Возраст заболевших колебался от 15

до 30 лет, самую большую группу составили лица в возрасте от 15 до 20 лет

(рис 1)

Рис. 1. Распределение больных инфекционным мононуклеозом по возрасту.

Госпитализация больных I группы в стационар осуществлялась с 4 по 32 день болезни, но в основном с 4 по 10 день (рис. 2). В среднем больные госпитализировались на 8,3±3,8 день болезни. Один больной госпитализирован на 32 день болезни со второй волной лихорадки и изменением в клиническом анализе крови: увеличением лимфоцитов до 91%, наличием атипичных мононуклеаров. Средний койко-день для больных I группы составил 12,1±3,9. Все больные были без сопутствующей патологии. Все пациенты поступали в стационар в период разгара заболевания.

1 (2%)-i 1 (2%)

□ 1-10 день 0 11-20день

□ 21-30день

□ свыше ЗОдней

Рис. 2. Госпитализация больных инфекционным мононуклеозом в стационар в зависимости от дня болезни.

На этапе первичного скриннинга в исследование вошли 77 больных, у 18 из которых (II группа) на основании клинико-лабораторных данных и отрицательных данных ПЦР EBV, диагноз острой Эпштейна-Барр вирусной инфекции был отвергнут. Эти пациенты находились под наблюдением только в периоде нахождения в стационаре и поступали с направительным диагнозом инфекционного мононуклеоза. В этой группе больных было 11 (61%) мужчин и 7 (39%) женщин. Пациенты были госпитализированы на 5,5±1,8 день болезни. Средний койко-день составил 9,5±2,8. В клинической картине у этих больных были следующие симптомы, которые представлены в таблице № 1.

Таблица 1

Клинические проявления в периоде разгара заболевания у больных I и II групп

Симптомы I группа (59 чел ) II группа (18 чел)

Абсолютное число % Абсолютное число %

Лихорадка 45 76% 13 72%

Увеличение лимфоузл 59 100% 18 100%

Заложенность носа 19 32% 1 6%

Боль в горле 43 73% 7 39%

Налеты в ротоглотке 43 73% 6 33%

Увеличение миндалин 49 83% 13 72%

Увеличение печени 53 90% 16 89%

Увеличение селезенки 28 47% 2 11%

Сыпь 34 58% 8 44%

При сравнении клинических симптомов у больных с инфекционным мононуклеозом (I группа) и группы пациентов, у которых данный диагноз не подтвердился (II группа), установлено, что лихорадка встречалась в обеих группах более чем у 70% больных, увеличение лимфатических узлов у 100%

пациентов, увеличение печени у 89-90%, увеличение небных миндалин у 7283%, сыпь у 44-58% Такие симптомы как заложенность носа, боль в горле, увеличение селезенки выявлялись у пациентов II группы гораздо реже

Из 59 пациентов I группы, которые находились под наблюдением, 14 (24%) поступило с нормальной температурой, 25 (42%) - с субфебрильной температурой, 20 (34%) - с фебрильной лихорадкой Продолжительность лихорадочного периода колебалась от 0 дней у 1 пациента до 33 дней у 2-х больных У 59 (100%) больных наблюдалось увеличение шейной группы лимфатических узлов, у 41 (69%) - подчелюстных, у 18 (31%) -подмышечных, у 20 (34%) - затылочных, у 17 (29%) - паховых, у 4 (7%) -надключичных

В I группе увеличение небных миндалин I степени было выявлено у 19 (32%) больных, II ст - у 22 (37%) пациентов, III ст - у 8 (14%) Налеты в ротоглотке выявлялись у 43 (73%) пациентов I группы, в виде некротической у 2 человек, лакунарной у 21 и фолликулярной ангины у 20 больных

Из 34 (58%) больных I группы, поступавших с сыпью, у 31 пациента она была связана с приемом амбулаторно антибактериальных препаратов флемоксина у 10 (33%), амоксиклава у 8 (26%), ампициллина у 2 (6%), аугментина у 8 (26%), амоксициллина у 2 (6%), пенициллина у 1 (3%) больных Сыпь носила разнообразный характер пятнисто-папулезный у 25 (73%) пациентов, папулезный у 6 (18%), пятнистый у 2 (6%), петехиальный у 1 (3%)

В периоде разгара заболевания у больных I группы в общем анализе крови выявлялись следующие изменения лейкоцитоз у 44 (75%), средние значения 13±6,6 (M±s), лимфоцитоз у 51 (86%), колебания в пределах 61±18,5, повышение моноцитов у 10 (17%) пациентов, у 35 (59%) обнаруживались атипичные мононуклеары, у 22 (37%) - снижение тромбоцитов При анализе полученных данных во II группе лимфоцитоз отмечался у 13 (72%) больных, атипичные мононуклеары выявлялись у 6 (33%) пациентов, лейкоцитоз у 8 (44%)

В I группе в биохимическом анализе крови в периоде разгара заболевания выявлялось повышение АЛТ у 52 (88%) пациентов, средние значения 156,5±131,5, ACT у 55 (93%) больных, 131,5±118 (M±s) Лишь у 3 больных было выявлено повышение билирубина до 66-67 ммоль/л и трансаминаз свыше 600 Ед/л, что соответствовало развитию у этих пациентов острого гепатита Эпштейна-Барр вирусной этиологии, который протекал доброкачественно, не увеличивал средний койко-день (от 11 до 14 дней), не имел осложнений и не приобретал затяжное, хроническое течение У 10 (56%) пациентов II группы были увеличены трансаминазы, причем у 2 больных с вирусными гепатитами более 40 норм Билирубин был повышен у 2(11%) человек, но не более 25 млмоль/л

У 5 (8%) пациентов в периоде разгара заболевания при молекулярно-генетическом исследовании в сыворотке крови установлена ДНК HHV-6, что аналогично данным зарубежных авторов (Brooks, 2004) Роль такого симбиотического взаимодействия в различных патологических процессах

установлена только у ВИЧ-инфицированных пациентов, те что HHV-6 совместно с EBV участвует в развитии лимфомы Беркитга, Ходжкинской лимфомы и злокачественных лимфом (Brooks, 2004)

Данные по результатам реакции Хофф-бауэра у пациентов I группы представлены в таблице № 2

Таблица 2

Анализ результатов реакции Хофф-Бауэра в зависимости от сроков заболевания у пациентов I группы

Сроки Всего Полож. Отриц. Отр. Х-Б при %

заболевания обследова- р-ция р-ция первичном больных с

но Хофф- Х-Б исследовании, положитель-

больных Бауэра неодно- полож.при не- ной р-цией

кратно однократном Х-Б

С 1 по 10 37 28 4 5 75%

день болезни

С 11 по 20 20 18 1 1 90%

день болезни

С 21 по 30 1 1 - - 100%

день болезни

Свыше 30 1 - 1 - 0%

дня болезни

Реакция Хофф-Бауэра у пациентов I группы на ранних сроках заболевания была положительной в 75% случаев, но и у 4 (22%) больных II группы она также была положительной

В периоде разгара заболевания у всех больных I группы 59 человек (100%) методом ПЦР выявлялась ДНК EBV, тогда как у всех больных II группы ДНК ЕВУ не определялась Из серологических маркеров у больных II группы, в том числе с положительной реакцией Хофф-Бауэра, выявлялись

антитела, характерные для перенесенного заболевания (a-EBV VCA IgG, а-EBV EBNA IgG)

Проанализировав данные по больным I и II групп, мы установили, что ни клинические симптомы, такие как лихорадка, боль в горле, увеличение лимфатических узлов, гепатомегапия, наличие сыпи, ни изменения в общем анализе крови (лимфоцитоз, наличие атипичных мононуклеаров) - не являются абсолютным при проведении дифференциальной диагностики у больных с симптомами схожими с инфекционным мононуклеозом Серологическая реакция Хофф-Бауэра, которой активно пользуются в практическом здравоохранении, оказалась положительной у 22% пациентов II группы и отрицательной у 25% пациентов I группы Данные молекулярно-генетического исследования (ПЦР) с ДНК EBV оказались отрицательными у всех пациентов II группы и у всех положительными в I группе Специфические серологические реакции (обнаружение a-VCA IgG и a-EBNA IgG) подтвердили перенесенную в прошлом EBV-инфекции у больных II группы

В II группе заключительные диагнозы распределились следующим образом гепатит С - 1 больной (подтвержден обнаружением a-HCV в сыворотке крови), гепатит А - 1 (подтвержден наличием a-HAV IgM в сыворотке крови), аденовирусная инфекция - 2, острая цитомегаловирусная инфекцией - 3 (доказательством явилось выявление в сыворотке крови ДНК CMV и a-CMV IgM), ВИЧ-инфекция - 6 (определялись специфические белки в иммунном блоте и был положительный ИФА), краснуха - 1 (определялись IgM в ИФА), шейный лимфоаденит - 1, лакунарная ангина - 1 (в мазке из ротоглотки выделялся str aureus), лимфома печени - 1 (в биоптате печени -

клетки лимфомы), болезнь Стилла - 1 (ACJIO - 300 мг/л, С реактивный белок

- 6 г/л), диагноз подтвержден в ревматологическом центре

В дальнейшем под наблюдением находились пациенты только I группы

- 59 человек При выписке больных из стационара, которая осуществлялась на 23±5,9 день болезни, в периоде ранней реконвалесценции, у всех 59 больных (100%) сохранялось увеличение лимфатических узлов, у 53 (90%) -увеличение печени, у 25 (42%) - селезенки

В общем анализе крови сохранялся лимфоцитоз у 53 (90%) больных при нормальном количестве лейкоцитов, и у 7 (12%) пациентов обнаруживались атипичные мононуклеары

В биохимическом анализе крови повышение AJIT оставалось у 47 (80%) больных, средние значения 89±67,5, ACT у 39 (66%) пациентов, 82±58,3 При выписке билирубин у 3 (5%) пациентов был повышен, но не более чем 25 ммоль/л

В периоде ранней реконвалесценции у 3 (5%) больных выявлялась ДНК HHV-6 При дальнейшем наблюдении у этих пациентов ДНК этого вируса не установили

При катамнестическом наблюдении, через 6 месяцев от начала заболевания, среди оставшихся под наблюдением 45 пациентов увеличение лимфатических узлов сохранялось у 17 (38%) человек за счет шейной группы, увеличение печени у 11 (24%) В общем анализе крови у 18 (40%) пациентов сохранялся лимфоцитоз, средние значения 38,4±12,2

Через 12 месяцев от начала заболевания из оставшихся под наблюдением 32 пациентов у 10 (31%) выявлялись увеличенные шейные лимфатические узлы, у 3 (9%) человек сохранялась гепатомегалия У 8 (25%) сохранялся лимфоцитоз

Через 24 месяца из 19 находившихся под наблюдением пациентов у 3 (16%) выявлялись увеличенные шейные лимфатические узлы, и у 3 (16%) человек был выявлен лимфоцитоз, однако не превышающий 45%

За время наблюдения было выявлено 3 пациента, у которых через 12 месяцев наблюдения при молекулярно-генетическом исследовании не обнаруживалась ДНК вируса Эпштейна-Барр, но при обследовании через 24 месяца вновь установлена ДНК ЕВУ Эти данные свидетельствуют о незавершенном иммунном ответе, длительной персистенции вируса и необходимости в длительном наблюдении за пациентами, перенесшими острую стадию Эпштейна-Барр вирусной инфекции

Таким образом, у ряда пациентов, перенесших инфекционный мононуклеоз, в течение длительного времени (более 6 месяцев) сохраняются изменения, как лабораторных показателей, так и в клинической картине, что требует более длительного, чем в настоящее время, наблюдения за этой группой больных

В периоде разгара заболевания у всех 59 (100%) больных инфекционным мононуклеозом методом ПЦР выявлена в сыворотке крови ДНК ЕВУ Тогда как реакция Хофф-Бауэра оказалась положительной лишь у 47 (80%) больных при однократном исследовании на ранних сроках

поступления Лимфоцитоз установлен у 51 (86%) пациентов, а атипичные мононуклеары у 35 (59%) больных Увеличение шейной группы лимфатических узлов также у всех 59 (100%) больных Из серологических маркеров в остром периоде выявлялись a-EBV VCA IgM у 50 (85%) пациентов, a-EBV ЕА IgG у 40 (68%), a-EBV VCA IgG у 31(53%), a-EBV EBNA IgG у 6 (10%)

В периоде ранней реконвалесценции, что совпадало с выпиской больных из стационара, в сыворотке крови у всех 59 (100%) больных по-прежнему определялась ДНК вируса Эпштейна-Барр При трехкратном обследовании реакция Хофф-Бауэра была положительна у 53 (90%) больных Лимфоцитоз определялся у 53 (90%) пациентов, но вот атипичные мононуклеары сохранялись лишь у 7 (12%) человек, в тоже время a-EBV VCA IgM выявлялись у 53 (90%) больных, a-EBV ЕА IgG у 41 (70%), a-EBV VCA IgG у 36 (61%), a-EBV EBNA IgG у 4 (7%) пациентов

После выписки из стационара, через 6 месяцев от начала заболевания, из обследованных 45 человек, в сыворотке крови у 30 (67%) пациентов установлена ДНК EBV, сохранялись увеличенными шейная группа лимфатических узлов у 17 (38%) человек, у 18 (40%) выявлялся лимфоцитоз Из серологических маркеров у всех больных (100%) на сроках 6, 12 и 24 месяца a-EBV VCA IgM и a-EBV ЕА IgG отсутствовали У 37 (82%) пациентов установлены a-EBV EBNA IgG и у 27 (60%) a-EBV VCA IgG

Через 12 месяцев от начала заболевания находилось под наблюдением 32 пациента У 11 (34%) методом ПЦР в сыворотке крови определялась ДНК

EBV Сохранялись увеличенными шейные лимфатические узлы у 10 (31%) человек, у 8 (25%) выявлялся лимфоцитоз Из серологических маркеров определялись a-EBV VCA IgG у 28 (88%) пациентов и a-EBV EBNA IgG у 31 (97%)

Через 24 месяца, из обследуемых 19 пациентов, у 6 (32%) обнаруживалась ДНК EBV в сыворотке крови У 3-х из этих 6 пациентов сохранялись увеличенными шейные лимфоузлы и выявлялся лимфоцитоз У обследуемых пациентов присутствовали a-EBV VCA IgG у 16 (84%) человек и a-EBV EBNA IgG у 18 (95%)

Результаты наших исследований совпадают с данными зарубежных аналогов (Wolter,1997, Gray, 1995, Hess,2004), те установлено, что в периоде разгара заболевания у больных появляются a-EBV VCA IgM и а-EBV ЕА IgG, которые сохраняются в периоде ранней реконвалесценции, а к 6 месяцу полностью пропадают и выявляются только при реактивации инфекции по данным зарубежных авторов (Hess, 2004) Тогда как a-EBV EBNA IgG появляются в периоде реконвалесценции и сохраняются пожизненно (Wolter, 1997, Gray, 1995, Hess, 2004), a-EBV VCA IgG определяются уже в остром периоде более чем у 50% больных и в дальнейшем в периоде поздней реконвалесценции персистируют более чем у 80% пациентов В остром периоде и в периоде ранней реконвалесценции у 100% больных в сыворотке крови методом ПЦР определяется ДНК EBV, что позволяет отдифференцировать диагноз инфекционного мононуклеоза Эпштейна-Барр вирусной этиологии от других заболеваний Длительно

сохраняющаяся персистенция вируса у 1/3 больных, обнаруживаемая через 12 и 24 месяца от начала заболевания, заставляет пересмотреть сроки наблюдения за этими пациентами Длительная персистенция EBV более 12, 24 месяцев заставляет длительно наблюдать за этой когортой пациентов, так как по данным зарубежных авторов (Jeffrey, 2000, Murray, 2002), эта группа больных имеет высокий риск развития назофарингеальной карциномы, лимфомы Беркитта, В-лимфом Следовательно, при диагностике Эпштейна-Барр вирусной инфекции необходимо использовать как методы серологической, так и молекулярно-генетической диагностики Сводные результаты, полученные по данным нашей работы о роли молекулярно-генетических и серологических методов исследования в верификации диагноза Эпштейна-Барр вирусной инфекции представлены на рисунке 3

120

100

80

-♦-ДНК EBV

60

-s-VCAIgM VCA IgG

40

EBNA IgG -*- EA IgG

20

0

II

III

IV

V

I - острый период, II - период ранней реконвалесценции, периоды поздней реконвалесценции' III - через 6 месяцев от начала болезни, IV - через 12 месяцев от начала заболевания, V - через 24 месяца от начала заболевания

Рис 3 Сопоставление результатов молекулярно-геиетических исследований методом ПЦР с динамикой специфических серологических маркеров у больных инфекционным мононуклеозом в различные фазы инфекционного процесса

ВЫВОДЫ:

1 Молекулярно-генетическое исследование (ПЦР) можно рекомендовать как основной метод для верификации диагноза у диагностически неясных больных с симптомами сходными с инфекционным мононуклеозом, учитывая полиморфизм клинических проявлений инфекции Эпштейна-Барр

2 В периоде разгара острой EBV-инфекции у 100% больных методом молекулярно-генетической диагностики (ПЦР) подтвержден диагноз инфекционного мононуклеоза, вызванного вирусом Эпштейна-Барр, тогда как используемый метод Хофф-Бауэра подтверждает диагноз лишь в 75% случаев

3 В периоде реконвалесценции инфекционного мононуклеоза, вызванного вирусом Эпштейна-Барр, через 6 месяцев от начала заболевания у 67% больных, через 12 - у 34%, через 24 месяца у 32% пациентов методом ПЦР в сыворотке крови сохраняется персистенция вируса Эпштейна-Барр

4 В периоде разгара EBV-инфекции у 85% , а в периоде ранней реконвалесценции у 90% больных выявляются a-EBV VCA IgM В

дальнейшем через 6, 12 и 24 месяца a-EBV VCA IgM не определялись, т е a-EBV VCA IgM являются антителами острого периода заболевания

5 В периоде разгара EBV-инфекции у 68% больных, а в периоде ранней реконвалесценции у 70% пациентов установлены a-EBV ЕА IgG, в дальнейшем через 6, 12, 24 месяца от начала заболевания эти антитела не выявляются

6 В периоде разгара EBV-инфекции a-EBV EBNA IgG выявлены у незначительного количества больных - до 10%, тогда как к 12 месяцам у 97%, а к 24 месяцам они установлены у 95% пациентов, следовательно, эти антитела можно рассматривать как маркер перенесенного заболевания

7 В периоде разгара заболевания и периоде ранней реконвалесценции a-EBV VCA IgG присутствовали у 53-61% больных, к 12 и 24 месяцам - у 84-88% пациентов Полученные данные могут в совокупности с другими маркерами использоваться для верификации диагноза Эпштейна-Барр вирусной инфекции, но не имеют самостоятельного значения для установления фазы инфекционного процесса

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ:

1 В диагностически неясных случаях у больных с симптомами инфекционного мононуклеоза целесообразно применять метод молекулярно-генетического исследования (ПЦР), который позволяет в короткие сроки при однократном исследовании подтвердить или отвергнуть диагноз инфекции Эпштейна-Барр

2 В периоде разгара заболевания необходимо рекомендовать исследование сыворотки крови на наличие а-ЕВУ УСА ^М, которые позволяют дифференцировать первичное инфицирование от реактивации

3 В периоде реконвалесценции через 6, 12, 24 месяца необходимо обследовать больных методом ПЦР для выявления сохраняющейся персистенции вируса

4 Для подтверждения перенесенной Эпштейна-Барр вирусной инфекции целесообразно определять а-ЕВУ ЕВЫА

5 Полученные результаты исследования могут быть рекомендованы для разработки практических рекомендаций по диспансерному наблюдению за переболевшими ЕВУ

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Г В Михалевская, Н А Прохорова, Е А Богачева, Н Ю Прошин, В П Чуланов, Е В Волчкова Современные возможности лабораторной диагностики инфекции, вызванной вирусом Эпштейна-Барр Сборник тезисов VII Российского съезда врачей-инфекционистов, 25-27 октября 2006 года, Нижний Новгород, с 166

2 Н А Прохорова, Е В Волчкова, В П Чуланов, Е А Богачева, О В Дарвина, Г В Михалевская, С Г Пак Диагностические возможности ПЦР и специфических серологических методов в верификации инфекционного мононуклеоза, вызванного вирусом Эпштейна-Барр // Материалы VI Всероссийской научно-практической конференции «Молекулярная диагностика» - Москва, 28-30 ноября 2007г, стр 353-354

3 Н А Прохорова, Е В Волчкова, В П Чуланов, Е А Богачева, О В Дарвина, Г В Михалевская, С Г Пак Значение молекулярно-генетического метода (ПЦР) в верификации диагноза инфекции Эпштейна-Барр // Материалы Международного научного Конгресса - Витебск, май 2008,том 1, 190-191

4 Н А Прохорова, Е В Волчкова, В П Чуланов, Е А Богачева, О В Дарвина, Г В Михалевская, С Г Пак Клинико-диагностическое значение молекулярно-генетического и серологического исследования сыворотки крови больных инфекционным мононуклеозом // Эпидемиология и инфекционные болезни, Москва, 2008, 2, стр 17-20

Список сокращений

AJIT - аланиновая трансаминаза ACT - аспарагиновая трансаминаза ИФА - иммуноферментный анализ ПЦР - полимеразная цепная реакция CMV - цитомегаловирус EBV - вирус Эпштейна-Барр ЕА - ранний антиген EBNA - ядерный антиген HHV-6 - вирус герпеса 6 типа VCA - капсидный антиген

Заказ № 22/09/08 Подписано в печать 29 08 2008 Тираж 80 зкз Уел пл 1,5

Д ООО "Цифровичок", тел (495) 797-75-76, (495) 778-22-20 V \v\vw с/г ги, е-тай т/о@с/г ги

Актуальность темы.

Проблема специфической диагностики ЕВУ-инфекции, несмотря на длительную историю изучения, чрезвычайно актуальна из-за недостаточного использования в практическом здравоохранении современных лабораторных методов исследования. Хотя ЕВУ-инфекция имеет глобальное распространение (к 18 годам более 90% населения земного шара инфицировано вирусом Эпштейна-Барр [7, 54, 102]), но в большинстве случаев она носит персистирующий характер и не нуждается в противовирусном лечении. В тоже время, изменяющиеся условия окружающей среды, увеличение случаев приобретённого и врождённого иммунодефицита, обуславливают нарастание числа тяжёлых случаев инфекционного мононуклеоза, реактивации этой инфекции с полиорганной патологией [102].

Полиморфизм клинических проявлений Эпштейна-Барр вирусной инфекции обуславливает необходимость улучшения клинической и лабораторной диагностики заболевания. Наиболее перспективным является применение на практике молекулярно-генетических методов диагностики и, прежде всего полимеразной цепной реакции, которая позволяет выявлять присутствие ДНК вируса Эпштейна-Барр с острого периода до выздоровления, а у части пациентов и длительное время после перенесенного заболевания.

Количество исследований, посвященных изучению характера клинико-лабораторных проявлений инфекционного мононуклеоза в зависимости от стадии инфекционного процесса у взрослых пациентов в нашей стране, очень ограничено. Нуждается также в уточнении диагностическая значимость специфических методов ИФА и ПЦР в различные стадии инфекционного процесса.

Вышеизложенные данные обуславливают актуальность исследований, направленных на изучение клинико-лабораторной диагностики инфекционного мононуклеоза в динамике инфекционного процесса в сопоставлении с персистенции вируса в крови.

Цель исследования:

Изучить особенности персистенции ДНК EBV в сыворотке крови у больных инфекционным мононуклеозом на разных стадиях заболевания в сопоставлении с серологическими методами исследования (a-EBV VCA IgM, a-EBV VCA IgG, a-EBV EA IgG, a-EBV EBNA IgG, реакцией Хофф-Бауэра).

Задачи исследования:

1. Исследовать динамику серологических маркеров инфекции Эпштейна-Барр (a-EBV VCA IgM, a-EBV VCA IgG, a-EBV EA IgG, a-EBV EBNA IgG) у больных инфекционным мононуклеозом на различных стадиях обследования.

2. Изучить в динамике данные молекулярно-генетического исследования (ПЦР) у больных инфекционным мононуклеозом на различных стадиях обследования.

3. Сопоставить диагностическую значимость серологической и ПЦР (ДНК) диагностики в различные периоды инфекционного мононуклеоза.

4. Проанализировать клинические и лабораторные данные у больных инфекционным мононуклеозом в сопоставлении с данными серологических и молекулярно-генетических (ПЦР) исследований на различных этапах заболевания.

Научная новизна:

Впервые прослежена и установлена длительность активной репликации ДНК EBV у больных инфекционным мононуклеозом в динамике инфекционного процесса.

Показана возможность длительной (до 24 месяцев) активной репликации ДНК EBV у части больных с инфекционным мононуклеозом после острой фазы заболевания.

Проведен анализ диагностической значимости метода ПЦР, серологических методов (динамика антител к структурным белкам EBV и реакции Хофф-Бауэра) при динамическом наблюдении.

Установлено, что у больных инфекционным мононуклеозом в периоде реконвалесценции через 12-24 месяца выявлено интерметтирующее появление ДНК EBV при отсутствии выраженных клинических данных.

Впервые на клиническом материале показано дифференциально-диагностические возможности применения метода ПЦР (ДНК EBV) на ранних этапах инфекционного процесса, учитывая большой полиморфизм клинических проявлений инфекционного мононуклеоза.

Практическая значимость:

Впервые определена длительность активной репликации ДНК EBV методом ПЦР в сыворотке крови больных инфекционным мононуклеозом, что позволило установить сроки оптимального применения серологических и

ПЦР методов для верификации диагноза.

Впервые показано преимущество выявления ДНК EBV в сыворотке крови методом ПЦР в сравнении с общепринятыми серологическими исследованиями (реакция Хофф-Бауэра) как на ранних сроках заболевания, так и при обследовании лихорадящих больных с полилимфоаденопатией.

Установлено, что метод ПЦР может использоваться для дополнительной верификации диагноза EBV на различных стадиях инфекционного процесса, а также при затянувшейся реконвалесценции.

Полученные результаты исследования могут быть рекомендованы для разработки практических рекомендаций по диспансерному наблюдению за переболевшими EBV.

Апробация работы и внедрение в практику:

Работа выполнена на базе Инфекционной Клинической больницы №2 Департамента Здравоохранения г. Москвы, лаборатории ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора г. Москвы.

Тема диссертационной работы является фрагментом комплексной темы кафедры инфекционных болезней Московской Медицинской Академии им. И.М.Сеченова (зав. кафедрой, член-корреспондент РАМН, профессор С.Г.Пак) «Интоксикация при бактериальных и вирусных инфекциях. Патогенез и механизмы адаптации» 01.200.110439.

Рекомендации, полученные в результате исследования, внедрены в практику на кафедре инфекционных болезней ММА им. И.М.Сеченова, инфекционных отделений ИКБ №2 г. Москвы.

Все основные положения диссертации опубликованы в научных работах.

Материалы диссертационной работы были доложены на VII Российском съезде врачей-инфекционистов (октябрь 2006 года, Нижний Новгород), VI Всероссийской научно-практической конференции «Молекулярная диагностика» (28-30 ноября 2007 года, г. Москва)

Работа апробирована на заседании кафедры инфекционных болезней ММА им. И.М.Сеченова.

ВЫВОДЫ:

1. Молекулярно-генетическое исследование (ПЦР) можно рекомендовать как основной метод для верификации диагноза у диагностически неясных больных с симптомами сходными с инфекционным мононуклеозом, учитывая полиморфизм клинических проявлений инфекции Эпштейна-Барр.

2. В периоде разгара острой EBV-инфекции у 100% больных методом молекулярно-генетической диагностики (ПЦР) подтвержден диагноз инфекционного мононуклеоза, вызванного вирусом Эпштейна-Барр, тогда как используемый метод Хофф-Бауэра подтверждает диагноз лишь в 75% случаев на ранних сроках заболевания.

3. В периоде реконвалесценции инфекционного мононуклеоза, вызванного вирусом Эпштейна-Барр, через 6 месяцев от начала заболевания у 67% больных, через 12 - у 34%, через 24 месяца у 32% пациентов методом ПЦР в сыворотке крови сохраняется персистенция вируса Эпштейна-Барр.

4. В периоде разгара EBV-инфекции у 85% , а в периоде ранней реконвалесценции у 90% больных выявляются a-EBV VCA IgM. В дальнейшем через 6, 12 и 24 месяца у наших пациентов a-EBV VCA IgM не определялись, т.е. a-EBV VCA IgM являются антителами острого периода заболевания.

В периоде разгара EBV-инфекции у 68% больных, а в периоде ранней реконвалесценции у 70% пациентов установлены a-EBV ЕА IgG; в дальнейшем через 6, 12, 24 месяца от начала заболевания эти антитела не выявляются.

В периоде разгара EBV-инфекции a-EBV EBNA IgG определялись у незначительного количества больных - 10%, тогда как к 12 месяцам они установлены у 97%, а к 24 месяцам -у 95% пациентов, следовательно, эти антитела можно рассматривать как маркер перенесенного заболевания. В периоде разгара заболевания и периоде ранней реконвалесценции a-EBV VCA IgG присутствовали у 53-61% больных, к 12 и 24 месяцам они выявлялись у 84-88% пациентов. Полученные данные могут в совокупности с другими маркерами использоваться для верификации диагноза Эпштейна-Барр вирусной инфекции, но не имеют самостоятельного значения для установления фазы инфекционного процесса.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ:

1. В диагностически неясных случаях у больных с симптомами инфекционного мононуклеоза целесообразно применять метод молекулярно-генетического исследования (ПЦР), который позволяет в короткие сроки при однократном исследовании подтвердить диагноз инфекции Эпштейна-Барр.

2. В периоде разгара заболевания необходимо рекомендовать исследование сыворотки крови на наличие a-EBV VCA IgM, которые позволяют дифференцировать первичное инфицирование от реактивации.

3. В периоде реконвалесценции через 6, 12, 24 месяца необходимо обследовать больных методом ПЦР для выявления сохраняющейся персистенции вируса.

4. Для подтверждения перенесенной Эпштейна-Барр вирусной инфекции целесообразно определять a-EBV EBNA IgG.

5. Полученные результаты исследования могут быть рекомендованы для разработки практических рекомендаций по диспансерному наблюдению за переболевшими EBV.