Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Биологические свойства координационных соединений серебра и триптофана

На правах рукописи

СУФИЕВ Туй Давлатович

БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА КООРДИНАЦИОННЫХ СОЕДИНЕНИЙ СЕРЕБРА И ТРИПТОФАНА

14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Душанбе-2009

003474286

Работа выполнена на кафедре органической и биологической химии Таджикского государственного педагогического университета им. С.Айни, в обществе с ограниченной ответственностью «Занд».

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор, член-

корреспондент Академии образования при Министерстве образования Республики Таджикистан

Бобиев Гуломкодир Муккамолович,

доктор фармацевтических наук Исуиов Саломудин Джаборович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук

Саидов Алиджон Аброрович,

кандидат биологических наук Гнесов Асомуддин Шамсуддинович

Ведущая организация: лаборатория обмена веществ, биохимии,

иммунологии и фармакологии Государственного научно-исследовательского института питания Министерства энергетики и промышленности Республики Таджикистан

Защита диссертации состоится 30 июня 2009 г. в 1200 часов на заседании диссертационного совета КМ 047.003.01 при Институте химии им. В.И.Никитина АН Республики Таджикистан по адресу: 734063, г.Душанбе, ул. Айни,299/2.

Сайт института: www.cheniistry.tj.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Института химии им.В.И.Никитина АН Республики Таджикистан.

Автореферат разослан «До » МС^Л 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

Рахимов И.Ф.

Введение

Актуальность проблемы. Разнообразие выполняемых функций веществ белковой природы в живом организме определяется природой входящих в их состав аминокислот. При этом наиболее распространенной реакцией этих веществ является комплексообразование с ионами различных металлов, в том числе серебра, применение препаратов которого в медицине расширяется с каждым годом, что объясняется отсутствием у микроорганизмов устойчивости к ним. По имеющимся данным (Кадышев Ю.Г. и соавт., 1995; Савадян Э.Ш. и соавт., 1989; Савадян Э.Ш., 1989; Ульянов Ю., 1998) серебро губительно действует на 650700 видов микроорганизмов. Его механизм действия на микробную клетку заключается в том, что ионы серебра после проникновения в нее ингибируют ферменты дыхательной цепи, а также разобщают процессы окисления и окислительного фосфорилиро-вания, в результате чего клетка гибнет. К таким ферментам относятся каталазы, дегидразы и пероксидазы.

Поскольку препараты серебра очень чувствительны к воздействию различных внешних факторов, то поиск путей повышения их стабильности является достаточно актуальным. Комплексообразование серебра с органическими соединениями позволяет повысить стабильность образующихся веществ. Полученные в последние годы координационные соединения серебра с полиакриловой, глутаминовой кислотами, фенилаланином, пролином и аргинином обладают противомикробным и гемоста-тическим действием (Евстигнеева Р.П. и соавт., 2003). Кроме названных, одним из весьма перспективных компонентов для получения фармакологически активных соединений является триптофан, обладающий иммуно- и нейротропными свойствами (Бело-крылов Г.А. и соавт., 1999).

Исходя из вышеизложенного, координационные соединения на основе серебра и триптофана могут стать основой лекарственных препаратов широкого спектра действия. Для их целенаправленной разработки необходимо первоначально изучить процесс комплексообразования серебра и триптофана.

Цель исследования: изучение биологических свойств координационных соединений серебра и триптофана. г

Для ее достижения были решены следующие задачи: I

- апробированы различные методы получения координационных соединений серебра и триптофана;

- определена возможность применения метода УФ- и производной спектрофотометрии, рН-метрического титрования для определения состава образующихся координационных соединений;

- изучены токсические, антимикробные свойства полученных координационных соединений серебра и триптофана и их влияние на каталазную, дегидразную и пероксидазную активность Е.соН.

Научная новизна. Впервые методами УФ- и производной спектрофотометрии изучен процесс комплексообразования иона серебра и триптофана. Показано, что при непосредственном взаимодействии триптофана и нитрата серебра, через получение промежуточной гидроокиси серебра, возможен синтез различных координационных соединений. Установлено, что с помощью методов обычной спектрофотометрии невозможно однозначно определить функциональные группы, участвующие в образовании координационных соединений. Установлено, что при взаимодействии иона А§+ с триптофаном при значительном избытке последнего, в растворе образуются координационные соединения с составом комплексных ионов [АдЬ]° и [А§Ь2]" со значениями рК[дёц = 8,455, рК^ьг] ~ 24,81. Показано, что в терапевтических дозах они являются нетоксичными, оказывая антимикробное действие, которое соответствует механизму действия серебра на кишечную палочку, приводящему к ингибированию активности клеточных ферментов (каталазы, дегидразы и пероксидазы).

Практическая значимость. Разработанные подходы по использованию методов вторых производных УФ-спектров, а также полученные значения констант образования координационных соединений серебра и триптофана могут применяться при изучении процессов комплексообразования ряда других биологически активных металлов и аминокислот, которые станут составляющими новых лекарственных препаратов.

Положения, выносимые на защиту: - результаты изучения различных методов получения координационных соединений серебра и триптофана,

- результаты изучения состава полученных координационных соединений методами УФ- и производной спектрофотометрии, рН-метрического титрования,

- результаты изучения антибактериального действия полученных координационных соединений,

- результаты изучения влияния координационных соединений серебра и триптофана на ферментные системы E.coli.

- результаты изучения токсических свойств координационных соединений серебра и триптофана.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на: научно-практической конференции Таджикского государственного медицинского университета (с международным участием) «Лекарства и здоровье», посвященной 1025-летию со дня рождения Абуали ибни Сино (Душанбе, 2005), научно-теоретической конференции «Современные проблемы физики и астрофизики» (Душанбе, 2005), научно-практической конференции «Основные достижения и перспективы развития фармацевтического сектора Таджикистана» (с международным участием), посвященной 25-летию фармацевтического факультета ТГМУ им.Абуали ибни Сино (Душанбе, 2006), научной конференции "Адаптационные аспекты функционирования живых систем" (Душанбе, 2007).

Публикации по теме диссертации. Опубликовано 2 тезиса докладов и 9 статей, из которых 4 - в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Вклад автора в работы, выполненные в соавторстве и включенные в диссертацию, состоял в постановке задачи исследования, определении путей и методов их решения, получении и обработке большинства экспериментальных данных, анализе и обобщении результатов экспериментов, формулировке основных выводов и положений диссертации.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 113 страницах компьютерного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 121 источник, включая 31 - из стран дальнего зарубежья.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Экспериментальная химическая часть

Для спектрофотометрического исследования получали растворы изомолярной серии с концентрацией 3,075-10"4 М при соотношениях серебра и триптофана от 1:5 до 6:1. В качестве исходных использовали ОДМ растворы AgN03 и NaOH, точную концентрацию которых устанавливали титриметрически согласно ГФ XI. Остальные растворы получали разбавлением их в рассчитанное количество раз. При получении координационных соединений! 1) смесь рассчитанных количеств растворов AgN03 и триптофана выдерживали при 60°С в течеЕше 30 мин, а также 2) через образование промежуточного гидроксида серебра (I).

УФ-спектры растворов снимали на спектрофотометре СФ-46, вторые производные рассчитывали по специальной программе. При хроматографическом исследовании для проявления триптофана на ТСХ использовали пары иода, свободного иона серебра - хромат калия. рН-метрическое титрование проводили на рН-иономере MS-20 (Чехия) с использованием стеклянного и хлорсеребряного электродов, откалиброванных по буферным растворам. При определении констант кислотной диссоциации

0.1.М раствор триптофана титровали 0,1М растворами NaOH и HCl, растворы координационных соединений - 0,01 М раствором NaOH.

2.2. Экспериментальная биологическая часть 2.2.1. Исследование бактерицидной активности

При этом использовали следующие растворы координационных соединений при различных молярных отношениях триптофана и серебра:

1. равным 1:1, С(Тгр) = C(Ag) = 0,001 М, С(Тгр) - 0,0204%, C(Ag) = 0,0108%,

2. равным 2:1, С(Тгр) = 0,00133 М, C(Ag) = 0,00067 М, С(Тгр) концентрация триптофана = 0,0272%, C(Ag) концентрации серебра = 0,0072%,

3. равным 1:2, С(Тгр) = 0,00067 М, C(Ag) = 0,00133 М, С(Тгр) = 0,0136%, C(Ag) = 0,0144%,

4. раствор нитрата серебра с концентрацией 0,002 М (C(Ag) = 0,0216%).

Исследования проведены методом диффузии в агаре со следующими группами микроорганизмов: стафилококки, стрептококки, клебсиелы, протей, кишечная палочка, сальмонелла. Для сравнения эффектов использовали антибиотики: гентамицин, ампициллин, ампиокс, офлоксацин, цефтазидим, налидиксовая кислота, абактал, цефуроксин, клиндомицин, амоксиклав, эритромицин - в виде 5% раствора в количестве ОД мл (5 мг). Для оксациллина использовали диск с содержанием препарата 10 мкг.

2.2.2. Определение влияния растворов координационных соединений на ферментную активность Е.соН

Влияние координационных соединений на каталазную активность Е.соН изучали иодометрическим методом, на дегидраз-ную активность - методом Тунберга, на пероксидазную активность - пирогаллоловым методом (Першин Г.Н., 1971).

2.2.3. Изучение токсических свойств

Для исследования токсических свойств получены следующие растворы:

1. координационные соединения с молярным отношением триптофана и серебра равным 2:1, С(Тгр) = 0,0667 М, С(А§) = 0,0333 М, С(Тгр) концентрация триптофана = 1,36%, C(Ag) концентрации серебра = 0,36%,

2. координационные соединения с молярным отношением триптофана и серебра равным 2:1, С(Тгр) = 0,00667 М, С(А§) = 0,00333 М, С(Тгр) концентрация триптофана = 0,136%, C(Ag) концентрации серебра = 0,036%.

3. координационные соединения с молярным отношением триптофана и серебра равным 2:1, С(Тгр) = 0,000667 М, C(Ag) = 0,000333 М, С(Тгр) концентрация триптофана = 0,0136%, C(Ag) концентрации серебра = 0,0036%.

4. Раствор триптофана с концентрацией С(Тгр) - 0,0667 М (1,36%),

5. Раствор нитрата серебра с концентрацией С(Ад) = 0,0333 М (0,36%),

6. Раствор нитрата серебра с концентрацией C(Ag) = 3,0 М (32,4%),

7. 0,9% физиологический раствор.

Опыт проводили на 40 кроликах весом 2,4-2,6 кг, разделенных на 8 групп по 5 голов в каждой. Исследуемые растворы жи-

вотным вводили внутримышечно: первой группе - раствор № 1 в дозе 5 мл, второй - №1 в дозе 1 мл, третьей - №2 в дозе 1 мл, четвертой - №3 в дозе 1 мл, пятой - №4 в дозе 1 мл, шестой - №5 в дозе 1 мл, седьмой - №6 в дозе 1 мл, восьмой - 0,9% физиологический раствор - в дозе 10 мл. При этом у опытных животных учитывали следующие показатели: внешний вид и поведение, состояние шерстного покрова и видимых слизистых оболочек, отношение к корму, подвижность, ритм и частоту дыхания, время возникновения и характер интоксикации, тяжесть, обратимость, сроки гибели животных или их выздоровления. До введения препаратов и через 14 дней после проводили клинический анализ крови, при котором определяли количество лейкоцитов, эритроцитов, гемоглобина, общего белка и белковых фракций сыворотки крови.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Изучение путей получения координационных соединений серебра и триптофана

Координационные соединения серебра с триптофаном получали несколькими способами.

Первый заключался во взаимодействии соли серебра с триптофаном в водном растворе:

тАёА~ + пН-Тгр-ОН [А§т(Н-Тгр-ОН)п]А т.

Другие два - основаны на способности иона серебра образовывать аммиачные комплексы, для чего использовали галоге-ниды или гидроксид серебра:

шА§НаГ + пН-Тгр-ОН -> [Адт(Н-Тгр-ОН)п]На1 т или

AgNOз + №ОН А§ОЩ + ЖШз

тАёОН + пН-Тгр-ОН [Аёт(Н-Тгр-ОН)п]ОНт.

Свободные ионы серебра в растворе определяли реакцией с хроматом калия. В первом случае в реакционной смеси они появляются при соотношении триптофана и серебра 3:1, в третьем -2:1; во втором - координационные соединения не образуются.

3.2. Хроматографическое изучение координационных

соединений

На следующем этапе работы изучены хроматографические свойства иона серебра и триптофана в кислых и основных системах. В качестве первой применили систему н-бутанол-уксусная кислота-вода (4:1:1), второй - изопропанол-аммиак-диоксан-

хлороформ (50:30:15:15). Парами иода проявлялись как триптофан, так и ион серебра, хроматом калия - только последний.

В кислой системе оба компонента имеют Rf 0,34 и 0,37, соответственно, в основной - 0,5 для триптофана, а ион серебра остается на старте и проявляется в виде темного пятна, что, вероятно, объясняется его взаимодействием с гидроксильными группами, находящимися в составе системы, с образованием нерастворимой гидроокиси серебра, необратимо адсорбирующейся на силикагеле. Исследование показало, что показатели хроматогра-фической подвижности полученных координационных соединений и триптофана не отличались между собой и практически были равнозначными.

3.3. Изучение состава координационных соединений методом УФ-спектрофотометрии

На УФ-спектрах всех растворов имеется максимумы при 218, 276-279 нм и плечи при 270-275 и 285-286 нм, характерные для триптофана. Следовательно, для координационных соединений они обусловлены его поглощением.

Для систем с соотношением триптофана и серебра 1:5 и 1:4 в области 210-220 нм отмечается спад, 1:3 -максимум расположен при 212-214 нм, 1:2-при 214 нм, 1:1 - при 216 нм, 2:1,4:1 и 5:1 - при 216-217 нм, 3:1 - при 216 нм и 6:1 - при 217 нм.

На кривых выхода комплекса от состава раствора изомо-лярной серии отмечается два максимума при Cx/C(L+Ag) равных 0,25 (для областей 212-216, 276-278 и 286-287 нм) и 0,5 (для длин волн 277 и 285 нм).

УФ-спектры координационных соединений, полученных через гидроокись серебра, были аналогичны спектрам предыдущего случая. На кривой зависимости выхода комплекса от состава раствора изомолярной серии имеется максимум при молярном отношении входящих в них компонентов 1:1.

Известно (Демченко А.П., 1981), что ионизация аминогруппы приводит к сдвигу максимума поглощения при 278 нм на 11,5 нм в длинноволновую область, карбоксильной группы - в коротковолновую приблизительно на то же расстояние. Это свидетельствует о том, что при образовании координационных соединений остаток триптофана связывается с ионом серебра через

названные группы, а также может входить в состав комплексного иона в цвиттер-ионной форме.

3.4. Применение вторых производных УФ-спектров для определения взаимодействующих групп при комплексо-образовании серебра и триптофана

Вследствие незначительного влияния ионизации функциональных групп триптофана на положение максимума поглощения при 278 нм и перекрывания максимумов различных ионных форм, для более четкого их разделения рассчитывали вторые производные УФ-спектров, полученных в предыдущих экспериментах. Наибольшие изменения регистрировались в области 225240 нм и 290-300 нм, характер которых подтвердил участие во взаимодействии с ионом серебра амино- и карбоксильной групп триптофана.

Таким образом, в образовании координационных соединений с ионом серебра основную роль играет аминогруппа триптофана, при соотношениях 1:1 и 2:1- и карбоксильная группа, а при двукратном и более превышении содержания серебра, возможно, и индольная группа триптофана.

3.5. Изучение возможности применения вторых производных УФ-спектров для определения состава координационных соединений иона А§+ и триптофана Кривые зависимости выхода комплекса от состава раствора

изомолярной серии, полученного непосредственным взаимодействием нитрата серебра и триптофана, рассчитанные по вторым производным УФ-спектров показали, что при 232 нм максимум расположен при соотношении 1:2, при 284 нм - 1:2 и 1:1, при 293 нм - 1:1.

При получении координационных соединений через образование промежуточной гидроокиси серебра соответствующий максимум на кривой зависимости выхода комплекса от состава раствора изомолярной серии наблюдается при молярном отношении триптофана и серебра, равном 1:1.

Такие результаты свидетельствуют о том, что при непосредственном их взаимодействии в растворе образуются координационные соединения различного состава.

3.6. Применение метода рН-метрического титрования для изучения состава координационных соединений серебра и триптофана

Триптофан как лиганд содержит три электронодонорные группы, являющиеся потенциальными центрами координации его с ионом металла: кислород карбоксильной группы, атом азота аминогруппы и атом азота индольного кольца. В справочных данных (Якубке Х.Д., ЕшкайтХ., 1985; CRC Handbook of Chemistry and Physics, 1985) не приводятся константы кислотной диссоциации NH-группы индольного кольца, поэтому кислотно-основные равновесия протонирования триптофана можно выразить следующей схемой:

NH3+ NH3+ NI-I2

СН-СООН <—:-> СН-СОСГ < _ > СН-СОО"

V. -Ч К.

Н

Первоначально были определены константы кислотной диссоциации триптофана: Ki = 6,39-10"3 (pKi = 2,19+0,083), К2 = 9,40-10"10 (рК2 = 9,4±0,17) (литературные значения pKi и рК2, соответственно: 2,44 и 9,38 (Якубке Х.Д., Ешкайт X., 1985), 2,38 и 9,39 (CRC Handbook of Chemistry and Physics, 1985)). Из этих данных следует, что при pH 3-8 триптофан находится в трех ионных формах.

Поскольку координационное число иона Ag+ в комплексных соединениях с различными лигандами равно 2, был изучен состав равновесной системы при 3 и 4-кратном избытке аминокислоты, обеспечивающем максимальное насыщение координационных связей комплексообразователя.

Координационные соединения серебра и триптофана (соотношения металла и лиганда: Cnp/CAg = 4:1 (Стгр = 0,006842, Сде = 0,0017106), Стгр/Сдв = 3:1 (СТгр = 0,005964, CAg = 0,001988)) получали через образование промежуточного гидрокисида серебра.

При этом кривые их титрования в области рН 7-9 лежат ниже кривой титрования триптофана, что свидетельствует об образовании в этой области протонированных координационных соединений (Шаров C.B., 2006), увеличение рН за счет добавляемых в систему гидроксид-ионов приводит к их депротонизации.

Для определения констант устойчивости образующихся комплексных форм рассчитывали функции образования п по формуле - = Сыюн +[н*]-[он ] (Леглер Е.В. исоавт., 2002).

С Me

При определении состава равновесной системы учитывали следующие комплексные формы: [Ag(HL)]+, [Ag(HL)2]+, [Ag(HL)OH], [AgL], [AgL2b [AgL(OH)]-, [AgL(HL)].

Ag+ + H2L+~AgHL+ + H+;p _[AgHL+] -[H+]:

1 [Ag+]-[H2L±]

Ag+ + 2H2L+ ~ Ag(HL)2+ + H+; p _[Ag(HL)+-[H+]2

2 [Ag+].[H2L+]2

AgHL+ + H20 ^ Ag(HL)OH + H+; „ _[Ag(HL)OH] [H+]

3 [AgHL+]

Ag+ + H2L <-> [AgL] + 2H+; R ^ = [AgL]-[H+]2

K4 [Ag+].[H2L]

AgL + H2L <-> [AgL2]~ + 2H+, R = [AgL2]~ -[H+]2

Ps [AgL]

AgL + H20 [AgL(OH)]~ + H+; B = [AgL(OH)]" -[H+]

p6 [AgL]

AgL + H2L <-» [AgL(HL)] + H+; _[AgL(HL)] [H+]

P7 [AgL]-[H2L]

В этом случае теоретическая функция образования имеет

вид:

П = (PrKr[H2L+]-[H+]3 + 2-p2-K,2-[H2L+]2-[H+]2 + Ps-KrlH^]-^]2 + p4-KI-K2-[H2L+]-[H+]2 + 2f5-K,2-K22-[H2L+]2 + |36-K1-K2-[H2L+]-[H+] +2-p7-Ki2'K2-[H2L+]2,[H+]) / ([H*]4 + K[AgOH] • [OH-] • [H4-]4 + Pi'Kr[H2L+]-[H+] + l-fc-K^Vfilf]2 + p3-K,-[H2L+]-[ir]2 + p4-K,-K2-[H2L+]-[H+]2 +2-p5-Ki2-K22-[H2L+]2 + Рб-КгКг-да^-^] + 2f7-K12-K2-[H2L+]2-[H+])

В случае, если функция образования не зависела от величины констант устойчивости гидроксокомплексов и окиси серебра, то последние в дальнейшем считали равными 0. В результате расчета методом последовательных приближений были получены следующие значения логарифмов констант устойчивости комплексных форм: „ = -5,824, кп = -3,523, 1йв

= 4,103, ^в =6,805,1йВ ±0 =5,771.

&Р[АгЬгГ ' ' ^[АаЩНЬ*)]0 '

Эти значения показывают, что до рН 2 комплексообразо-вания не происходит, после - преимущественно образуется сме-шаннолигандная форма [АдЦНЬ)], преобладающая при рН 4-7. В области рН 1-4 происходит также образование незначительных количеств комплексных форм [А§(НЬ)]+ [А§(НЬ)г]+ и [А§Ь]. В области рН выше 8 преобладающей становится комплексная форма [А§Ь2]~.

При изучении состава равновесной системы с максимальным насыщением Ag+ лигандом координационные соединения получали через образование промежуточной гидроокиси серебра и использовали молярные соотношения серебра и триптофана 1:6, 1:5 и 1:4. Соответствующие расчеты проводили с использованием программы №\уОАЬ8РЕК (Кузнецов С.М. и соавт., 2002), Первоначально - с использованием расширенной матрицы. При этом отрицательные логарифмы констант образования комплексных ионов позволили исключить их из рассматриваемой модели. При значительном избытке А§+ в растворе образуются координационные соединения с составом комплексных ионов [АдЬ]° и [А^ЬгГ и значениями рК[Аёц = 8,455, рК[Аёь2] = 24,81.

3.7. Антибактериальные свойства координационных соединений серебра и триптофана

Результаты исследования бактерицидной активности координационных соединений триптофана и серебра показаны в таблице 1.

Как видно из таблицы 1, растворы № 1 и 2 проявили активность в отношении стафилококков, стрептококков, клебсиелы и протея, напротив сальмонеллы и кишечные палочки сохраняли свою устойчивость. При этом активность в отношении стафилококков была равна бактерицидному эффекту гентамицина, ампи-

циллина и эритромицина и меньше, чем у других исследованных антибиотиков. Влияние раствора № 3 в отношении стафилококков и протея было таким же, как и у препаратов № 1 и 2, при этом несколько выше - в случаях с клебсиеллами и стрептококками.

Его активность в отношении Е.соН была такой же, как у абактала, и выше, чем у всех остальных антибиотиков. Сальмонеллы оказались к нему несколько устойчивее, по сравнению с офлоксацином и более низкой сопротивляемостью к ампициллину, клиндомицину и эритромицину. Наиболее перспективным оказался препарат № 4, представляющий собой водный 0,002 М раствор нитрата серебра. По воздействию на кишечную палочку он не уступал абакталу и превосходил все остальные антибиотики.

Таблица 1

Бактерицидная активность препаратов № 1-4 в отношении групп микроорганизмов по сравнению с некоторыми антибиотиками

Группа микроорганизмов Препараты (зона подавления роста, мм) Антибиотики (зона подавления роста, мм)

1 2 3 4 гентамицин 1 ампициллин | амлиокс окезциллин | офлоксацин I к Я & а 1 0 1 Е § 1 3 ■ а; ь абактал цефуроксин клиндомицин 5 § | о Я эритромицин

Стафилококки 15-20 15-20 15-25 20-30 15 20 25 25 30 30 25 25 30 25 30 20

Стрептококки 20-25 15-20 25-30 25-30 15 15 25 20 20 20 20 20 25 25 25 15

Клебсиелы 20 20 20-25 25 15 15 20 25 25 25 25 25 30 25 30

Протей 15-20 15 15-20 20 - - 20 20 25 25 15 20 15 20 20 -

Кишечные палочки - - 30 30 25 15 20 20 25 25 25 30 15 20 25 15

Сальмонеллы - - 20-25 30 20 15 20 20 30 30 25 25 25 15 25 15

Таблица 2

Зона задержки роста микроорганизмов в зависимости от кои_центрации серебра в препарате_

N Концентрация Ag+ Вид микроорганизмов

моль/л % Стафилококки Стрептококки Клебсиелы Протей Е.соН Сальмонеллы

2 6,67-101 0,0072 17,5 17,5 20 15 - -

1 1,0-10"3 0,0108 17,5 22,5 20 17,5 - -

3 1,33-Ш"3 0,0144 17,5 27,5 22,5 17,5 30 22,:5

4 2,0-10'3 0,0216 25 27,5 25 20 30 30

Соответственно на сальмонеллы действовали офлоксацин и цефтазидим, другие апробированные антибиотики проявляли свои свойства значительно хуже. Как можно видеть из таблицы 2, антибактериальная активность исследованных препаратов зависела от содержания иона серебра.

Таким образом, координационные соединения серебра и триптофана проявляют ее в ярко выраженный форме.

3.8. Изучение влияния координационных соединении триптофана и серебра на ферментные системы Е.соН. 3.8.1. Определение влияния растворов координационных соединений на каталазную активность Е.соН В соответствующих исследованиях использовали иодомет-рический метод (Першин Г.Н., 1971). Результаты приведены в таблице 3.

Таблица 3

Результаты изучения влияния полученных координацион-

ных соединений на каталазную активность Е.соН.

Координационные соединения Концентрация серебра, % Кср Каталазная активность

Стп/Сдс = 2:1 0,0072 0,032654 2,18 • 10"12

Стгр/Сдг= 1:1 0,0108 0,031728 2,12 ■ 10'12

Стп/Сд,, = 1:2 0,0144 0,030779 2,05 ■ 10'12

АЙЖ), 0,0216 0,029137 1,94 • 10"12

Е.соН 0,048844767 3,256 • 10"12

Зависимость активности каталазы от концентрации сереб-

Рис.1. Зависимость каталазной активности оЛйнцентрации иона серебра.

Из полученных результатов следует, что раствор серебра и его координационные соединения с триптофаном оказывают ин-гибирующее действие на каталазную активность кишечной палочки, степень которого соответствует концентрации ионов серебра.

3.8.2. Изучение влияния координационных соединений триптофана и серебра на дегидразную активность Е.соН.

Действие координационных соединений на дегидразную активность кишечной палочки определяли методом Тунберга. Полученные результаты приведены в таблице 4.

Таблица 4

Действие координационных соединений триптофана и сереб-

ра на дегидразу муравьиной кислоты кишечной палочки

Компонент реакционной смеси % № пробирки

1 2 3 4 5 6

Суспензия Е.соН (10 млрд) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Стгг/Сай = 2:1 0,0072 0,5

Стп/Сдх = 1:1 0,0108 0,5

Стф/Сдг = 1:2 0,0144 0,5

АвШз 0,0216 0,5

Дистиллированная вода 0,5 0,5

Буферный раствор (рН 7,4) 0,8

Формиат натрия 2% 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Метиленовый синий (1:1000) 0,2

Результаты эксперимента

Время обесцвечивания, мин 9 10,5 13,5 16,5 8 8

Активность дегидразы, % 88,9 76,2 59,3 48,5 100 100

Угнетение, % 11,1 23,8 40,7 51,5 0 0

Как видно из таблицы 4, координационные соединения оказывают на дегидразную активность угнетающее действие, которое зависит от концентрации в растворе серебра.

3.8.3. Изучение влияния координационных соединений триптофана и серебра на пероксидазную активность Е.соН.

Исследование влияния антибактериальных препаратов на пероксидазу кишечной палочки.

В опытах применялись 2-4-миллиардные суспензии Е.соН. Эталоном служили контрольные пробирки с нагретой суспензией и пробирки без перекиси водорода.

Как видно из таблицы 5, полученные координационные соединения оказывают ингибирующее действие на пероксидазную активность кишечной палочки.

Таблица 5

Действие координационных соединений триптофана и серебра на пероксидазу кишечной палочки

№ пробирки 5 6 7 8 9 10 11

Е.соИ 20 млрд 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Суспензия Е.со1(, инактиви-рованная нагреванием 0,5

Стф/СЛе = 2:1, СА8 = 0,0072% 0,5

Стп/Сав= 1:1,САе = 0,0108% 0,5

Стп/САв= 1:2,0,0144% 0,5

АЙМОз, 0,0216% 0,5

Вода, контроль 0,5 0,5

Инкубация при температуре 37°С

Буферный раствор (рН 7,4) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

Пирогаллол 0,5% 0Д5 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25

Перекись водорода 1% 0.25 0,25 0,25 0,25 0Д5 0,25 0Д5

1 - - - - - -

2 - - - - + - -

3 - - - - ++ - -

4 + + - - +-Н- - -

5 ++ ++ + + -Н-++ - -

10 +++ +++ ++ ++ 1 1 Н 1 - -

3.9. Изучение токсических свойств координационных соединений серебра и триптофана

Координационные соединения серебра и триптофана содержат два компонента различной природы - ион серебра и триптофан, каждый из которых обладает токсичными свойствами. Данных о соответствующих дозах первого в научной литературе не обнаружено.

При установлении его терапевтической дозы остановились на данных С.Б.Авакимяна и соавт. (2006), которые применяли при лечении злокачественных опухолей электрохимический раствор серебра в концентрации до 0,1 мг/кг веса животного. Именно эта доза была нами принята в качестве терапевтической, соответственно в отношении триптофана мы исходили из дозы применения тимогена - 0,1 мг на 100 кг живого веса.

Рассчитанное, исходя из этих данных, введенное каждой группе животных, количество терапевтических доз приведено в таблице 6.

Координационные соединения были получены из раствора триптофана с максимальной его растворимостью. Для провер-

ки токсичности иона серебра животным шестой и седьмой групп вводили растворы нитрата серебра.

Результаты клинического наблюдения показали, что отклонений в поведении животных не отмечалось: температура тела находилась в пределах 38,5-39,5°С, количество дыхательных движений - 56, частота

Таблица 6

Количество терапевтических доз, введенных опытным

животным

№ группы Препарат* Доза, мл Количество терапевтических доз

по иону по триптофану

1 КС - Ст,р = 0,0667 М (1,36%), СЛб = 0,0333 М (0,36%) 5 72 27200

2 КС - СТф = 0,0667 М (1,36%), СЛЕ = 0,0333 М (0,36%) 1 14,4 5440

3 КС - СТф = 0,00667 М (0,136%), Сд8 = 0,00333 М (0,036%) 1 1,44 544

4 КС - СТф = 0,000667 М (0,0136%), САб = 0,000333 М (0,0036%) 1 0,144 5,44

5 Раствор триптофана СТ1р = 0,0667 М (1,36%) 1 - 5440

6 Раствор АёЫОз, Сав = 0,0333 М (0,36%) 1 43,2 -

7 Раствор АйШ,, Сац = 3,0 М (32,4%), 1 1296 -

8 0,9% №С1 10 - -

* КС - раствор координационных соединений

сердечных сокращений - 128. Для примера в таблицах 7-9 приведены данные клинических и биохимических анализов крови животных первой, пятой и седьмой групп.

Отсутствие токсичности у раствора нитрата серебра в количестве 1296 терапевтических доз и у растворов координационных соединений показывает, что координационные соединения серебра и триптофана являются нетоксичными.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Изучение способов получения координационных соединений показало, что при взаимодействии триптофана с нитратом или с гидроокисью серебра образуются комплексные формы различного состава. Их хроматографическое изучение показало, что хроматографическая подвижность последних не отличается от таковой триптофана.

Таблица 7

Данные клинических и биохимических анализов крови жи-_вотных первой группы__

Показатель Норма* До введения После введения

Лейкоциты, 6,5-9,5 (8,0) 7,4±0,4 7,5±0,2

Эритроциты, млн 4,5-7,5 (6,0) 6,2±0,2 6,0±0,2

Общий белок, г% 6,0-8,2 (7,5) 7,1 ±0,3 6,8±0,3

Альбумины, % 55,0-65,0 (60) 58,3±3,2 60,3±2,8

а-глобулины, % 8,0-12,0 (10,0) 11,4±0,3 10,8±0,18

р-глобулины, % 7,0-13,0(10,0) 9,3±0,2 9,6±0,22

у-глобулины, % 17,0-23,0 (20,0) 21,0±0,31 19,3±0,26

Гемоглобин, г% 10,5-12,5(11,5) 10,8±0,3 10,5±0,2

Температура тела, °С 38,5-39,5 38,7±2,5 39,0±1,9

Дыхательные движения, мин 50-60 54±4,6 56±3,9

Число сердечных сокращений, мин 120-140 128±9,3 131±7,6

* в скобках средние значения (Кудрявцев A.A. и соавт., 1968)

Таблица 8

Клинические и биохимические анализы крови животных

пятой группы

Показатель Норма До введения После введения

Лейкоциты 6,5-9,5 (8,0) 7,2±0,3 7,3±0,25

Эритроциты, млн 4,5-7,5 (6,0) 5,1±0,2 5,0±0,1

Общий белок, г% 6,0-8,2 (7,5) 7,0±0,2 6,9±0,2

Альбумины, % 55,0-65,0 (60) 59,7±4,3 58,3±2,7

а-глобулины, % 8,0-12,0 (10,0) 11,1±2,1 10,9*1,9

р-глобулины, % 7,0-13,0(10,0) 9,9±3,2 10Д±2,8

у-глобулины, % 17,0-23,0(20,0) 18,9±2,3 19,3±2,25

Гемоглобин, г% 10,5-12,5(11,5) 11,9±3,1 12,0±2,8

Температура тела, °С 38,5-39,5 38,9±4,7 39,1±3,9

Дыхательные движения, мин 50-60 55±5,1 58±4,5

Число сердечных сокращений, мин 120-140 125±10,2 128±9,5

* в скобках средние значения (Кудрявцев A.A. и соавт., 1968)

С помощью спектроскопии в УФ-области показано, что взаимодействие триптофана и нитрата серебра приводит к образованию координационных соединений с молярным соотношением компонентов 1:3, 1:2 и 1:1, при получении через образование промежуточной гидроокиси серебра - 1:2, 1:1 и 2:1. С использованием УФ-спектров и их вторых производных установлено, что во взаимодействии с ионом серебра при всех соотношениях компонентов принимает участие аминогруппа триптофана, при соотношениях 1:1 и 2:1 наряду с аминогруппой - и карбок-

сильная группа, а при двукратном и более превышении содержания серебра, возможно, и индольная группа, что является следствием одновременного присутствия в растворе координационных соединений различного состава.

Таблица 9

Клинические и биохимические анализы крови животных седьмой группы

Показатель Норма До введения После введения

Лейкоциты 6,5-9,5 (8,0) 8Д±2,2 8,1±1,9

Эритроциты, млн 4,5-7,5 (6,0) 5,8±1,5 5,7±1,3

Общий белок, г% 6,0-8,2 (7,5) 7,4±1,9 7,5±1,7

Альбумины,% 55,0-65,0 (60) 60,7±5,3 61,1±4,9

а-глобулины, % 8,0-12,0 (10,0) 10,7±2,4 10,9±2,1

Р-глобулины, % 7,0-13,0(10,0) 9,2±3,1 9,4±2,8

•у-глобулины, % 17,0-23,0 (20,0) 19,7±2,9 20,0±2,7

Гемоглобин, г% 10,5-12,5 (11,5) 11,3±1,8 11,7±1,7

Температура тела, °С 38,5-39,5 38,8±3,3 L39,0±3,15

Дыхательные движения, мин 50-60 53±4,5 57±4,1

Число сердечных сокращений, мин 120-140 129±8,8 126±7,9

* в скобках средние значения (Кудрявцев A.A. и соавт., 1968)

Методом рН-метрического титрования было показано, что при получении координационных соединений через образование промежуточной гидроокиси серебра образуются комплексные формы [Аё(НЬ)]\ [Аё(НЬ)2]+, [Аё(НЬ)ОН], [ЛёЬ], [АёЬ2]~ [АдЦОН)] , (у^ЦНЬ)], преобладающими среди них являются [А§Ь(НЬ)] и при значительном избытке аминокислоты -

^(Н21Ч-Тгр-СОСГ)]0 и [Аё(Н2№Тгр-СОО")2]~.

Для исследования бактерицидной и бактериостатической активности использовали 4 раствора с молярным отношением триптофана и серебра равным 1:1 (С(Тгр) = C(Ag) = 0,001 М, С(Тгр) = 0,0204%, C(Ag) = 0,0108%), 2:1 (С(Тгр) - 0,00133 М, С(Аё) = 0,00067 М, С(Тгр) = 0,0272%, С(Аё) = 0,0072%), 1:2 (С(Тгр) = 0,00067 М, С(Аё) = 0,00133 М, С(Тгр) = 0,0136%, С(Аё) = 0,0144%) и раствор нитрата серебра с концентрацией 0,002 М (С(Аё) = 0,0216%).

Растворы под № 1 и 2 проявили бактерицидную активность в отношении стафилококков, стрептококков, клебсиелы и протея, против сальмонеллы и кишечной палочки ее отмечено не было,

причем их биологический эффект не уступал по значимости ген-тамицину, ампициллину и эритромицину и был меньше, чем у других исследованных антибиотиков. Активность препарата № 3 в отношении стафилококков и протея была такой же, как и у препаратов № 1 и № 2, несколько выше - в отношении клебсиел-лы и стрептококков. Препарат № 3 на кишечную палочку влиял так же, как абактал и даже лучше, чем все остальные антибиотики. Однако на сальмонеллы его воздействие было несколько хуже, чем бактерицидность офлоксацина и лучше, чем ампициллина, клиндомицина и эритромицина.

Наиболее активным оказался препарат № 4, особенно в отношении кишечной палочки, соответствуя абакталу и превышая активность всех остальных антибиотиков. В отношении сальмонеллы его активность равнялась таковой офлоксацина и цефтази-дима, превышая ее всех остальных антибиотиков.

Исследования показали, что константа реакции расщепления перекиси водорода E.coli равна 0,048844767, каталазная активность - = 3,256 • 10~12; для координационных соединений с молярным отношением триптофана и серебра равным 1:1, С(Тгр) = C(Ag) = 0,001 М, С(Тгр) = 0,0204%, C(Ag) = 0,0108% Кср = 0,031728, каталазная активность = 2,12 • 1042; для координационных соединений с молярным отношением триптофана и серебра равным 2:1, С(Тгр) = 0,00133 М, C(Ag) = 0,00067 М, С(Тгр) концентрация триптофана = 0,0272%, C(Ag) концентрации серебра = 0,0072% Кср = 0,032654, каталазная активность = 2,18 • 10"12; для координационных соединений с молярным отношением триптофана и серебра равным 1:2, С(Тгр) = 0,00067 М, C(Ag) = 0,00133 М, С(Тгр) = 0,0136%, C(Ag) = 0,0144% Кср = 0,030779, каталазная активность = 2,05 • 10"12; для раствора нитрата серебра с концентрацией 0,002 М (C(Ag) = 0,0216%) Кср = 0,029137, каталазная активность = 1,94 • 10"12. таким образом, полученные результаты показали, что раствор серебра и его координационные соединения с триптофаном оказывают ингибирующее действие на каталазную активность кишечной палочки, которое зависит от концентрации ионов серебра в растворе. Полученные координационные соединения оказали ингибирующее влияние на дегид-разную и пероксидазную активность E.coli зависящее от концентрации серебра в растворе координационного соединения.

Отсутствие токсичности у раствора нитрата серебра в количестве 1296 терапевтических доз и у растворов координационных соединений показывает, что координационные соединения серебра и триптофана в количестве 72 терапевтических доз (по серебру) являются нетоксичными соединениями.

Выводы

1. Полученные в результате непосредственного взаимодействия триптофана и нитрата серебра и через образование промежуточной гидроокиси серебра координационные соединения имеют различный состав и хроматографическая подвижность, соответствующую триптофану.

2. Методом обычной спектрофотометрии нельзя однозначно определить функциональные группы триптофана, участвующие в образовании координационных соединений.

3. При взаимодействии иона Ag+ с триптофаном при значительном избытке последнего, в растворе образуются координационные соединения с составом комплексных ионов [AgL]0 и

со значениями рК{Аёц = 8,455, рК[Леи] = 24,81.

4. Антимикробное действие координационных соединений серебра и триптофана на кишечную палочку зависит от концентрации серебра, а его механизм действия заключается в ингибирова-нии активности ферментов, участвующих в процессах клеточного дыхания и окислительно-восстановительного фосфорилирова-ния.

5. Координационные соединения серебра и триптофана в количестве 72 терапевтических доз (по серебру) не являются токсичными для лабораторных животных.

Основные материалы диссертации изложены в следующих работах:

1.Суфиев Т., Шахматов А.Н., Бобиев Г.М. Комплексообразова-ние серебра и триптофана. I. Исследование с использованием качественных реакций // Мат. 53-й годичной науч.-практ. конф. ТГМУ (с международным участием) «Лекарства и здоровье», посвящен. 1025-летию со дня рождения Абуали ибни Сино. 3 окт. 2005 г., Душанбе.-С.84-86.

2.Суфиев Т., Шахматов А.Н., Бобиев Г.М. Комплексообразова-ние серебра и триптофана. И. Исследование с использованием спектрофотометрических методов // Там же.-С.86-87.

3.Суфиев Т., Шахматов А.Н., Абдулов Х.Ш., Бобиев Г.М. Применение вторых производных УФ-спектров для определения взаимодействующих групп при комплексообразовании серебра и триптофана // Вестник педагогического университета.-2005.-№

3.-С.9-12.

4.Суфиев Т., Шахматов А.Н., Абдулов Х.Ш., Бобиев Г.М. Изучение возможности применения вторых производных УФ-спектров для определения состава координационных соединений иона Ag+ и триптофана // Там же.-2005.-№ 3.-С.15-18.

5.Суфиев Т., Шахматов А.Н., Бобиев Г.М. Применение программы New Dalsfek для изучения состава координационных соединений серебра и триптофана // Там же.-2005.-№ 4.-С.61-65.

6.Суфиев Т., Шахматов А.Н., Бобиев Г.М. Координационные соединения серебра и триптофана как перспективные антибактериальные средства // Тез. докл. науч.-теор. конф. «Современные проблемы физики и астрофизики». Душанбе, 2005.-С.51-52.

7.Суфиев Т., Шахматов А.Н., Бобиев Г.М., Хайдаров К.Х., Ису-пов С.Д., Изучение комплексообразования триптофана и серебра // Вестник Авиценны (Мат. науч.-практ. конф. «Основные достижения и перспективы развития фармацевтического сектора Таджикистана» с международным участием, посвященной 25-летию фармацевтического факультета ТГМУ им.Абуали ибни Сино, 29 мая 2006 г.).-Душанбе, 2006.-№ 1-2.-С.393-398.

8.Бобиев Г.М., Исупов С.Д., Шахматов А.Н., Холназаров Б.М., Суфиев Т., Кадамов И., Наботов М., Файзуллоева М., Хайдаров К.Х. Перспектива разработки новых терапевтических агентов на основе биокоординационных соединений аминокислот и низкомолекулярных пептидов с биометаллами // Там же.-С.491-503.

9. Бобиев Г.М., Шахматов А.Н., Суфиев Т. Изучение состава и бактерицидной активности координационных соединений серебра и триптофана // Мат. конф. «Адаптационные аспекты функционирования живых систем».-2007.

10. Бобиев Г.М., Суфиев Т., Шахматов А.Н., Антибактериальные свойства координационных соединений серебра и триптофана // Химико-фармацевтический журнал.-Т.42, № 11 .-С. 10-11

11. Бобиев Г.М., Суфиев Т., Шахматов А.Н., Абдулов Х.Ш. Получение и изучение состава координационных соединений серебра и триптофана // Химико-фармацевтический журнал.-Т.42, № 12.-С.36-39.

Типография ТГМУ им. Абуали ибни Сино

Сдано в печать 20.05.2009г. Подписано к печати 22.05.2009г. Формат 60/84,/16 Бумага офсетная %(?/м2. Тираж 100 экз. Заказ Кг 504.

Актуальность проблемы. Разнообразие выполняемых функций веществ белковой природы в живом организме определяется природой входящих в их состав аминокислот. При этом наиболее распространенной реакцией этих веществ является комплексообразование с ионами различных металлов, в том числе серебра, применение препаратов которого в медицине расширяется с каждым годом, что объясняется отсутствием у микроорганизмов устойчивости к ним. По имеющимся данным (Кадышев Ю.Г. и соавт., 1995; Савадян Э.Ш. и соавт., 1989; Савадян Э.Ш., 1989; Ульянов Ю., 1998) серебро губительно действует на 650-700 видов микроорганизмов. Его механизм действия на микробную клетку заключается в том, что ионы серебра после проникновения в нее ингибируют ферменты дыхательной цепи, а также разобщают процессы окисления и окислительного фосфорилирования, в результате чего клетка гибнет. К таким ферментам относятся каталазы, дегидразы и пероксидазы.

Поскольку препараты серебра очень чувствительны к воздействию различных внешних факторов, то поиск путей повышения их стабильности является достаточно актуальным. Комплексообразование серебра с органическими соединениями позволяет повысить стабильность образующихся веществ. Полученные в последние годы координационные соединения серебра с полиакриловой, глутаминовой кислотами, фенилаланином, пролином и аргинином обладают противомикробным и гемостатическим действием (Евстигнеева Р.П. и соавт., 2003). Кроме названных, одним из весьма перспективных компонентов для получения фармакологически активных соединений является триптофан, обладающий иммуно- и нейротропными свойствами (Белокрылов Г.А. и соавт., 1999).

Исходя из вышеизложенного, координационные соединения на основе серебра и триптофана могут стать основой лекарственных препаратов широкого спектра действия. Для их целенаправленной разработки необходимо первоначально изучить процесс комплексообразования серебра и триптофана.

Цель исследования: изучение биологических свойств координационных соединений серебра и триптофана.

Для ее достижения были решены следующие задачи: апробированы различные методы получения координационных соединений серебра и триптофана;

- определена возможность применения метода УФ- и производной спектрофотометрии, рН-метрического титрования для определения состава образующихся координационных соединений; изучены токсические, антимикробные свойства полученных координационных соединений серебра и триптофана и их влияние на каталазную, дегидразную и пероксидазную активность E.coli.

Научная новизна. Впервые методами УФ- и производной спектрофотометрии изучен процесс комплексообразования иона серебра и триптофана. Показано, что при непосредственном взаимодействии триптофана и нитрата серебра, через получение промежуточной гидроокиси серебра, возможен синтез различных координационных соединений. Установлено, что с помощью методов обычной спектрофотометрии невозможно однозначно определить функциональные группы, участвующие в образовании координационных соединений. Установлено, что при взаимодействии иона Ag+ с триптофаном при значительном избытке последнего, в растворе образуются координационные соединения с составом комплексных ионов [AgL]° и [AgL2]~ со значениями pK[AgL] = 8,455, pK[AgL2] = 24,81. Показано, что в терапевтических дозах они являются нетоксичными, оказывая антимикробное действие, которое соответствует механизму действия серебра на кишечную палочку, приводящему к ингибированию активности клеточных ферментов (каталазы, дегидразы и пероксидазы).

Практическая значимость. Разработанные подходы по использованию методов вторых производных УФ-спектров, а также полученные значения констант образования координационных соединений серебра и триптофана могут применяться при изучении процессов комплексообразования ряда других биологически активных металлов и аминокислот, которые станут составляющими новых лекарственных препаратов.

Положения, выносимые на защиту:

- результаты изучения различных методов получения координационных соединений серебра и триптофана,

- результаты изучения состава полученных координационных соединений методами УФ- и производной спектрофотометрии, рН-метрического титрования, результаты изучения антибактериального действия полученных координационных соединений,

- результаты изучения влияния координационных соединений серебра и триптофана на ферментные системы Е.соН.

- результаты изучения токсических свойств координационных соединений серебра и триптофана.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на: научно-практической конференции Таджикского государственного медицинского университета (с международным участием) «Лекарства и здоровье», посвященной 1025-летию со дня рождения Абуали ибни Сино (Душанбе, 2005), научио-теоретической конференции «Современные проблемы физики и астрофизики» (Душанбе, 2005), научно-практической конференции «Основные достижения и перспективы развития фармацевтического сектора Таджикистана» (с международным участием), посвященной 25-летию фармацевтического факультета ТГМУ им.Абуали ибни Сино (Душанбе, 2006), научной конференции "Адаптационные аспекты функционирования живых систем" (Душанбе, 2007).

Публикации по теме диссертации. Опубликовано 2 тезиса докладов и 9 статей, из которых 4 - в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Вклад автора в работы, выполненные в соавторстве и включенные в диссертацию, состоял в постановке задачи исследования, определении путей и методов их решения, получении и обработке большинства экспериментальных данных, анализе и обобщении результатов экспериментов, формулировке основных выводов и положений диссертации.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 113 страницах компьютерного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 121 источник, включая 31 - из стран дальнего зарубежья.

Выводы

1. Полученные в результате непосредственного взаимодействия триптофана и нитрата серебра и через образование промежуточной гидроокиси серебра координационные соединения имеют различный состав и хроматографическую подвижность, соответствующую триптофану.

2. Методом обычной спектрофотометрии нельзя однозначно определить функциональные группы триптофана, участвующие в образовании координационных соединений.

3. При взаимодействии иона Ag+ с триптофаном при значительном избытке последнего, в растворе образуются координационные соединения с составом комплексных ионов [AgL]0 и [А^Ьг]- со значениями рК[Аёь] = 8,455, РК[Л2ь2] = 24,81.

4. Антимикробное действие координационных соединений серебра и триптофана на кишечную палочку зависит от концентрации серебра, а его механизм действия заключается в ингибировании активности ферментов, участвующих в процессах клеточного дыхания и окислительно-восстановительного фосфорилирования.

5. Координационные соединения серебра и триптофана в количестве 72 терапевтических доз (по серебру) не являются токсичными для лабораторных животных.

Заключение

Благородные металлы, в том числе и серебро, даже в следовых количествах играют очень важную роль в нормальной жизнедеятельности организма, некоторые их производные обладают противовирусной и противоопухолевой активностью, противомикробное и гемостатическое действие (Клименко С.К. и соавт., 2001; Воронков М.Г. и соавт., 2001).

Весьма перспективной аминокислотой для изучения биологической активности ее серебряных производных является триптофан, обладающий иммунотропной активностью (Белокрылов Г.А. и соавт., 1999), активирующий центральные серотонинергические регуляторные механизмы, инициирующие эндогенную опиоидную систему и продукцию гипофизотропных гормонов (Лобов В.В., 1998), предотвращающий увеличение содержания возбуждающих аминокислот в головном мозге (Разводовский Ю.Е. и соавт., 2003).

Исходя из вышеизложенного координационные соединения на основе серебра и триптофана могут стать основой для получения лекарственных препаратов широкого спектра действия. Для целенаправленной разработки таких препаратов необходимо первоначально изучить процесс комплексообразования серебра и триптофана.

Первоначально было необходимо исследовать процесс взаимодействия иона серебра с триптофаном.

Получение координационных соединений серебра с триптофаном можно осуществлять несколькими способами.

Первый способ заключается в непосредственном взаимодействии соли серебра с аминокислотой. шАёА- + пН-Тгр-ОН -> ^т(Н-Тгр-ОН)„]А"т

Второй способ основан на способности иона серебра образовывать аммиачные комплексы. При взаимодействии с аминокислотой роль аммиака может сыграть аминогруппа триптофана. В этом случае для комплексообразования могут быть использованы галогениды серебра и гидроксид серебра, которые растворяются в растворе аммиака вследствие образования комплексных соединений.

При использовании галогенидов серебра: тА&Ы~ + пН-Тгр-ОН ^т(Н-Тгр-ОН)п]На1"т При использовании гидроксида серебра: АвЫОз + ЫаОН -> А§ОЩ + ЫаЫОэ шА§ОН + пН-Тгр-ОН [Аёт(Н-Тгр-ОН)п]ОНт Для получения координационных соединений были использованы все три подхода. При этом было показано, что при взаимодействии триптофана и галогенидов серебра образования координационных соединений не происходит. Взаимодействие триптофана с нитратом серебра или с гидроокисью серебра приводит к образованию координационных соединений различного состава, о чем свидетельствовало появление в растворе свободных ионов серебра при различном соотношении аминокислоты и металла.

Отсутствие данных по изучению координационных соединений методом тонкослойной хроматографии и, следовательно, данных о влиянии комплексообразования на хроматографическую подвижность лиганда или металла-комплексообразователя побудило нас к изучению этого вопроса.

Одним из этапов проведения тонкослойной хроматографии является ее проявление. Если для аминокислот проявители (нингидрин, бензидин, пары иода) давно известны, то для проявления иона металла необходимо его подбирать. Поскольку ион серебра является бесцветным, то проявить его можно только реагентом, образующим с этим ионом окрашенное соединение.

Для этого можно применить реагенты, обычно используемые для качественного определения ионов металлов. Однако в том случае, если константа образования окрашенного соединения выше, чем константа образования координационного соединения, то при проявлении таким реагентом будет разрушаться координационное соединение металла с аминокислотой.

В предыдущих экспериментах нами было установлено, что хромат калия образует с ионом серебра окрашенное в красный цвет соединение и не разрушает координационное соединение серебра с триптофаном, поэтому с помощью этого реагента можно будет определить ион серебра, не вршедший в состав координационного соединения.

Исследования, проведенные с кислыми и основными хроматографическими системами показали: в кислой системе и ион серебра и триптофан обладают средней хроматографической подвижностью: = 0,34 и 0,37 соответственно; триптофан в этой системе также имеет удовлетворительную хроматографическую подвижность (Яр = 0,5), а серебра остается на линии старта из-за взаимодействия с гидроксильными группами, находящимися в составе системы с образованием нерастворимой гидроокиси серебра, необратимо сорбирующейся на силикагеле.

При хроматографировании координационных соединений с молярным соотношением иона серебра и триптофана 1:6, 1:1 и 6:1 было установлено, что хроматографическая подвижность координационных соединений не отличается от хроматографической подвижности триптофана.

Для изучения состава координационных соединений разработано большое количество методов. Одними из наиболее распространенных являются спектрофотометрические методы - метод изомолярных серий и метод молярных отношений (Гринберг A.A., 1966; Булатов М.И. и соавт., 1986).

При изучении состава координационных соединений с использованием спектрофотометрических методов координационные соединения были получены двумя методами. Первым методом осуществляли взаимодействие раствора нитрата серебра и триптофана.

Исследование методом изомолярных серий (С = 3,0-10"4 М) показало, что УФ-спектры всех растворов соответствуют УФ-спектру триптофана, основные отличия наблюдаются только в интенсивности поглощения и положении и ширине максимума поглощения при 278 нм. Такой характер УФ-спектров свидетельствует о том, что электронный спектр координационных соединений обусловлен поглощением триптофана в УФ-об ласти.

Анализ спектров показал, что наибольшие сдвиги в положении максимумов поглощения отмечаются в областях 212-216, 276-278 и 286287 нм. Для этих областей были рассчитаны кривые выхода комплекса от состава раствора изомолярной серии (Булатов М.И., Калинкин И.П., 1986), которые показали, что для длин волн 214, 277 и 285 нм, отмечается максимум при молярном соотношении триптофана и серебра, равном 1:3, а для длин волн 277 и 285 нм - 1:2.

При получении координационных соединений через образование промежуточной гидроокиси серебра также были использованы растворы с концентрацией изомолярной серии, равной 3,0-10"4 М. УФ-спектры растворов изомолярной серии имели характер, аналогичный спектрам, полученным в предыдущем случае. На кривой зависимости выхода комплекса от состава раствора изомолярной серии, полученной в этом случае, максимум наблюдается при молярном отношении триптофана и серебра, равном 1:1.

Однако эти данные не согласуются с данными Е.В.Леглера и др. (Леглер Е.В. и соавт., 2001), которые сообщали о получении биядерных координационных соединений серебра с аргинином и глутаминовой кислотой состава А§2:Ь, где Ь — аминокислота.

Основываясь на данных УФ-спектрофотометрии можно предположить, какие группы в остатке триптофана подвергаются ионизации при образовании координационных соединений. Из данных литературы (Демченко А.П., 1981) известно, что при ионизации аминогруппы у триптофана максимум поглощения сдвигается в длинноволновую область на 1-1,5 нм, при ионизации карбоксильной группы - в коротковолновую приблизительно на то же расстояние. Анализ полученных данных с этой точки зрения показал, что в зависимости от молярного соотношения лиганда и металла-комплексообразователя в образовании координационных соединений принимают участие и амино- и карбоксильная группа триптофана вместе или, каждая из них по отдельности.

Приведенные выше результаты показали, что с помощью методов обычной спектрофотометрии вследствие незначительного влияния ионизации функциональных групп триптофана на положение максимума поглощения при 278 нм и перекрывания максимумов поглощения, соответствующих ионизированным функциональным группам, нельзя однозначно определить функциональные группы, участвующие в образовании координационных соединений. Одним из методов разделения перекрывающихся максимумов поглощения является использование вторых производных УФ-спектров (Демченко А.П., 1981). Поэтому дальнейшие исследования были проведены с использованием вторых производных УФ-спектров, полученных в предыдущих экспериментах.

Вторые производные УФ-спектров рассчитывали по специальной программе. Анализ вторых производных УФ-спектров растворов, полученных при взаимодействии растворов нитрата серебра и триптофана показал, что в этом случае наибольшие изменения отмечаются в области 225-240 нм и 290-300 нм.

Для идентификации ионизируемой функциональной группы были рассчитаны вторые производные УФ-спектров триптофана в кислой и щелочной среде. На второй производной УФ-спектра триптофана отмечаются максимумы при 230, 275, 284 и 2 частично перекрывающихся максимума при 291 и 293 нм. На второй производной спектра триптофана в кислой среде (протонизация аминогруппы) отмечается сдвиг на 1 нм в коротковолновую область максимума при 275 нм и снижение интенсивности максимума при 293 нм. На второй производной спектра триптофана в щелочной среде (диссоциация карбоксильной группы) отмечается сдвиг на 1 нм в длинноволновую область максимумов при 230, 284 и 293 нм и снижение интенсивности максимума при 291 нм. Максимум при 275 нм не изменяется.

Анализ вторых производных УФ-спектров растворов изомолярной серии показал, что в образовании координационных соединений с ионом серебра при всех соотношениях компонентов принимает участие аминогруппа триптофана, при соотношениях 1:1 и 2:1 наряду с аминогруппой взаимодействует и карбоксильная группа, а при двукратном и более превышении содержания серебра, возможно, и индольная группа триптофана, что является следствием одновременного присутствия в растворе координационных соединений различного состава.

Дальнейшей задачей нашего исследования являлось изучение возможности применения вторых производных УФ-спектров для определения состава координационных соединений иона Ag+ и триптофана.

По вторым производным УФ-спектров также были построены для различных длин волн кривые зависимости выхода комплекса от состава раствора изомолярной серии, анализ которых показал, что в растворе мгут присутствовать координационные соединения с молярными соотношениями триптофана и серебра, равными при соотношениях триптофана и серебра равных 1:3, 1:2 и 1:1.

Для растворов, полученных через образование промежуточной гидроокиси серебра, подобный анализ показал, что в растворе могут присутствуют координационные соединения с соотношением триптофана и серебра 1:2 и 2:1.

Таким образом, применение вторых производных УФ-спектров можно использовать для более четкого разделения перекрывающихся максимумов поглощения при определении состава координационных соединений методом изомолярных серий.

Для определения констант устойчивости образующихся координационных соединений мы использовали метод рН-метрического титрования.

Триптофан является а-аминокислотой, содержащей индольный цикл и три различные электронодонорные группы, являющиеся потенциальными центрами координации аминокислоты с ионом металла: кислород карбоксильной группы, атом азота аминогруппы и атом азота индольного кольца. Поскольку в справочных данных не приводятся константы кислотной диссоциации NH-группы индольного кольца, то при определении состава образующихся координационных соединений мы учитывали только диссоциацию амино- и карбоксильной групп триптофана.

Определение констант кислотной диссоциации триптофана показало хорошее соответствие полученных значений с литературными данными: Ki = 6,39-10"3 (рК, = 2,19+0,083), К2 = 9,40-10'10 (рК2 = 9,4±0,17) (литературные значения pKi и рК2, соответственно: 2,44 и 9,38 (Якубке Х.Д. и соавт., 1985), 2,38 и 9,39 (CRC Handbook of Chemistry and Physics, 1985)).

Кривая распределения, построенная по полученным значениям показала, что в исследуемой области рН триптофан находится в цвиттер-ионной и анионной формах.

Поскольку координационное число иона Ag+ в комплексных соединениях равно 2, то состав равновесной системы, образующейся в растворе при взаимодействии триптофана и иона серебра, изучали при 3 и 4-кратном избытке аминокислоты, предполагая максимальное насыщение координационных связей комплексообразователя.

Координационные соединения в этом случае получали через образование промежуточной окиси серебра Ag20. Ход кривых титрования показывает, что в области рН 7-9 образуются наряду с координационными соединениями и протонированные координационные соединения (Шаров C.B., 2006). При дальнейшем увеличении рН за счет добавляемых в систему гидроксид-ионов происходит депротопизация координационных соединений.

Расчет констант устойчивости образующихся комплексных форм проводили методом последовательных приближений теоретической функции образования к экспериментальной.

При расчете состава равновесной системы учитывали образование следующих комплексных форм: [Ag(HL)]+, [Ag(HL)2]+, [Ag(HL)OH], [AgL], [AgL2l~, [АёЦОН)Г, [AgL(HL)].

В результате были получены следующие значения логарифмов констант устойчивости комплексных форм: lgp[A[i(HL±)r = -5,824, lgP[Ag(HLl)jr =

-3,523, lgPlAeL)„ =4,103, IgpiAeL|r = 6,805, lgp[A№t)jU =5,771.

Диаграмма распределения комплексных форм в зависимости от рН показала, что до рН = 2 образования комплексных форм не происходит. С рН = 2 происходит преимущественное образование смешаннолигандной комплексной формы [AgL(HL)], которая является преобладающей в пределах рН 4-7. В области рН 1-4 происходит также образование комплексных форм [Ag(HL)]+ [А^(НЬ)2]+ и [AgL]. Максимальное содержание комплексной формы [А^(НЪ)]+ равное 9,49-10-5% отмечается при рН = 2, при рН = 3 отмечается максимальное содержание комплексных форм ^(НЬ)2]+ (0,12%) и [А%Ц (0,3%). В области рН выше 8 преобладающей становится комплексная форма [AgL2]-.

Таким образом, при образовании координационных соединений серебра и триптофана через промежуточную окись серебра преобладающими являются комплексные формы [AgL(HL)] и [AgL2]~.

Изучение состава равновесной смеси при максимальном насыщении иона-комплексообразователя ионами лиганда показало, что при взаимодействии иона Ag+ с триптофаном при значительном избытке последнего, в растворе образуются координационные соединения с составом комплексных ионов [AgL]0 и [А§Ь2]~ со значениями рК[Аёц = 8,455, РК[Аеь2] = 24,81.

Таким образом, при взаимодействии иона серебра и триптофана при значительном избытке аминокислоты образуются координационные соединения с составом комплексного иона [Ag(H2N-Trp-COCГ)]0 и

Аё(Н2М-Тгр-С0012]-.

В последние годы все более широким становится применение препаратов серебра в медицине. Это объясняется отсутствием у микроорганизмов устойчивости к препаратам серебра. По различным данным (Кадышев Ю.Г. и соавт., 1995; Савадян Э.Ш. и соавт., 1989; Савадян Э.Ш., 1989; Ульянов Ю., 1998) серебро губительно действует на 650-700 видов микроорганизмов. Перспективными в плане разработки новых антибактериальных препаратов могут стать координационные соединения серебра и триптофана, обладающего иммунотропной активностью (Белокрылов Г.А. и соавт., 1999). Поэтому была поставлена цель изучить антибактериальные свойства координационных соединений серебра и триптофана.

Для исследования бактерицидной и бактериостатической активности были получены следующие координационных соединений иона серебра и триптофана (растворы 1-4):

1. координационные соединения с молярным отношением триптофана и серебра равным 1:1, С(Тгр) = С(А%) = 0,001 М, С(Тгр) = 0,0204%, С^) = 0,0108%,

2. координационные соединения с молярным отношением триптофана и серебра равным 2:1, С(Тгр) = 0,00133 М, С(А%) = 0,00067 М, С(Тгр) концентрация триптофана = 0,0272%, C(Ag) концентрации серебра = 0,0072%,

3. координационные соединения с молярным отношением триптофана и серебра равным 1:2, С(Тгр) = 0,00067 М, С(А%) = 0,00133 М, С(Тгр) = 0,0136%, С^) = 0,0144%,

4. раствор нитрата серебра с концентрацией 0,002 М (С(А§) = 0,0216%).

Растворы координационных соединений были получены путем смешивания рассчитанных количеств растворов нитрата серебра и триптофана с последующим выдерживанием при 60°С в течение 30 мин.

Исследование было проведено методом диффузии в агар. Для проведения исследований были использованы следующие группы микроорганизмов: стафилококки, стрептококки, клебсиела, протей, кишечная палочка, сальмонелла. Для сравнения были использованы антибиотики: гентамицин, ампициллин, ампиокс, оксациллин, офлоксацин, цефтазидим, налидиксовая кислота, абактал, цефуроксин, клиндомицин, амокциклан, эритромицин. Все антибиотики использовали в виде 5%-ного раствора в количестве 0,1 мл (5 мг), для оксациллина использовали диск с содержанием препарата 10 мкг.