Автореферат и диссертация по медицине (14.00.46) на тему:Биохимические и иммунохимические исследования в микроматричном формате на основе видеоцифровой регистрации

ДИССЕРТАЦИЯ
Биохимические и иммунохимические исследования в микроматричном формате на основе видеоцифровой регистрации - диссертация, тема по медицине
АВТОРЕФЕРАТ
Биохимические и иммунохимические исследования в микроматричном формате на основе видеоцифровой регистрации - тема автореферата по медицине
Зайко, Виктория Витальевна Санкт-Петербург 2008 г.
Ученая степень
кандидата биологических наук
ВАК РФ
14.00.46
 
 

Автореферат диссертации по медицине на тему Биохимические и иммунохимические исследования в микроматричном формате на основе видеоцифровой регистрации

На правах рукописи

OG34b erro

ЗАЙКО Виктория Витальевна

БИОХИМИЧЕСКИЕ И ИММУНОХИМИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ В МИКРОМАТРИЧНОМ ФОРМАТЕ НА ОСНОВЕ ВИДЕОЦИФРОВОЙ РЕГИСТРАЦИИ

14.00.46 — клиническая лабораторная диагностика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 I ДРН *

Санкт-Петербург - 2008

003457778

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении здравоохранения «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины имени A.M. Никифорова» МЧС России и Институте Биохимии имени А.Н. Баха РАН.

Научный руководитель:

Доктор биологических наук профессор Венгеров Юрий Юзефович Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук профессор Зыбина Наталья Николаевна Доктор биологических наук профессор Свешников Петр Георгиевич

Ведущая организация:

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» МО РФ

Защита диссертации состоится декабря 2008 г. в ^ часов на

заседании диссертационного совета (шифр Д 205.001.01) при Федеральном государственном учреждении здравоохранения «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины имени A.M. Никифорова» МЧС России (194044, Санкт-Петербург, ул. Лебедева, 4/2).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного учреждения здравоохранения «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины имени A.M. Никифорова» МЧС России (194044, Санкт-Петербург, ул. Лебедева, 4/2).

JU

Автореферат разослан «' '» ноября 2008 г.

Ученый секретарь диссерта) к.м.н.

Санников М.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время придается огромное значение улучшению качества клинических лабораторных исследований, рациональному и эффективному использованию ресурсов, внедрению новой техники, совершенствованию диагностических технологий, В лабораторной диагностике примерами таких перспективных технологических направлений являются подходы миниатюризации и использование видеоцифрового компьютерного анализа (Меньшиков В.В., 2000-2003).

Миниатюризация аналитических технологий позволяет рационально решать некоторые задачи совершенствования лабораторного обеспечения диагностики и лечения пациентов. Преимущества применения миниатюрных аналитических устройств заключаются прежде всего в уменьшении необходимых для анализа объемов исследуемого материала и реагентов, повышении производительности проведения анализов, возможности создания систем серийного и мультиплексного анализа на основе использования матричного формата. Современные видеоцифровые технологии позволяют провести объективную оценку полученных результатов, сохранить данные анализа, что улучшает качество и повышает ценность лабораторных исследований. Сочетание подходов миниатюризации с системами видеоцифровой регистрации создает базу для разработки принципиально новых вариантов диагностических методов, например, таких как технологии иммунологических и ДНК-микрочипов (Чечеткин В.Р. и соавт., 2006). Однако применение микрочипов высокой плотности сталкивается с целым рядом проблем, приводящих к возникновению значительных технологических сложностей. Очевидно, что при увеличении количества исследуемых объектов на единицу площади и уменьшении самих объектов исследования необходимо заменить ручной труд работой автоматов, а визуальную оценку результатов анализа - регистрацией их соответствующей аппаратурой. При этом не только в несколько раз возрастает стоимость одного анализа, но и возникает потребность в специализированной лаборатории и высококвалифицированном персонале (Кпска Ь., 1998). В настоящее время многие научные группы ведут работы по расширению сферы применений микрочиповых технологий для усовершенствования самых распространенных методов клинической лабораторной диагностики. Это обусловлено существенными преимуществами таких подходов перед традиционными типами исследований. При этом необходимо создание простых производительных устройств для проведения анализа в микрообъемах и доступных регистрирующих систем для применения в обычной лабораторной практике и во внелабораторных условиях.

В связи с этим исследования, связанные с разработкой и внедрением новых высокоэффективных способов проведения распространенных клинико-диагностических определений на основе подходов миниатюризации и видеоцифрового анализа с применением современных регистрирующих

систем со специализированным программным обеспечением и производительных приспособлений для лабораторной диагностики, можно считать весьма актуальными.

Цель исследования - разработать технологию проведения биохимических и иммунохимических исследований в микроматричном формате с видеоцифровой регистрацией и оценить ее аналитические характеристики.

Задачи исследования:

]. Разработать приспособления для проведения реакций в микрообъемах на планарных носителях и определить критерии медико-технических требований к специализированным программам для видеоцифровой регистрации результатов этих исследований.

2. Определить возможность проведения анализа содержания глюкозы, С-реактивного белка, ревматоидного фактора, антистрептолизина-0 в сыворотке крови, а также типирования групп крови системы ABO и Резус в серийных и мультиплексных тестах в микроматричном формате с видеоцифровой регистрацией.

3. Провести сравнительный анализ результатов, полученных при исследованиях в микроматричном формате с видеоцифровой регистрацией и референсными лабораторными методами на клиническом материале.

4. Обосновать экономическую эффективность проведения исследований в микроматричном формате с видеоцифровой регистрацией.

Научная новизна работы. Впервые разработана технология микроанализа в матричном формате на основе видеоцифровой регистрации для проведения клинических лабораторных исследований и продемонстрирована возможность ее применения для широкого спектра биохимических и иммунохимических анализов.

Предложены, не имеющие аналогов, варианты проведения в микроматричном формате с видеоцифровой регистрацией: (1)-реакшш латексной агглютинации для определения клинически значимых аналитов; (2)-определения групп крови системы ABO и резус-фактора.

Разработан принципиально новый вариант тестов с сухими реагентами для серийных исследований методами латексной агглютинации и определения групп крови.

Технология проведения анализа в микроматричном формате для биологических жидкостей защищена патентом №2325644. Бюл. №15 от 27.05.2008.

Практическая значимость работы. Разработана технология проведения исследований в микроматричном формате с видеоцифровой регистрацией, позволяющая повысить производительность аналитической работы, уменьшить расход образцов и реагентов, обеспечить документирование и объективную оценку результатов.

Подготовлена нормативно-техническая документация доя производства опытных образцов тестов с сухими реагентами для определения С-реактивного белка, ревматоидного фактора, антистрептолизина-О.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Технология проведения исследований в микроматричном формате с видеоцифровой регистрацией обеспечивает простое и быстрое нанесение микрообъемов образцов и реагентов, одновременное проведение анализа во всех пробах, позволяет производить документирование и объективную оценку результатов клинико-лабораторных исследований.

2. Результаты, полученные при проведении исследований аналитов в серийных и мультиплексных тестах в микроматричном формате с видеоцифровой регистрацией, сопоставимы с результатами референсных лабораторных методов.

3. Разработанная технология проведения исследований в микроматричном формате с видеоцифровой регистрацией, применимая для проведения широкого спектра биохимических и иммунохимических исследований, не снижая качества анализа, существенно повышает его экономическую эффективность.

Личный вклад автора. Автор лично принимала участие в выполнении исследований по всем разделам диссертации: разрабатывала медико-технические требования к специализированным программам оценки результатов биохимических и иммунохимических реакций, отрабатывала новую технологию проведения анализа в микроматричном формате, осуществляла проведение биохимических и иммунохимических исследований, оценку пригодности разработанной технологии для целей и задач лабораторного анализа, статистическую обработку полученных данных.

Апробация работы. Результаты исследования докладывались на всероссийских съездах, симпозиумах и семинарах, в том числе на III съезде Научного общества специалистов клинической лабораторной диагностики (Москва, 2005), семинаре «Аналитические методы в медицинской диагностике» в рамках Международной специализированной выставки аналитического и лабораторного оборудования, технологий и материалов «AnaIyticaExpo-2006» (Москва, 2006), симпозиуме «Ключевые проблемы совершенствования лабораторного обеспечения медицинской помощи» (Москва, 2007), итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП (Москва, 2007).

Присужден Диплом биотехнологической выставки-ярмарки «РосБиоТех-2007» (Москва, 2007) за разработку и внедрение программно-аппаратного комплекса «Эксперт-Лаб».

По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, из них 3 статьи в журналах по перечню ВАК и патент на изобретение.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 117 страницах, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и обсуждения, списка литературы. Работа содержит 37 рисунков, 8 таблиц. Список литературы состоит из 134 работ, из которых 49 - отечественные источники.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы н методы исследования

Контрольные материалы, образцы цельной крови и сывороток были предоставлены ООО «КДЛ-тест» г. Москвы.

Для оценки микроматричного метода определения концентрации глюкозы в сыворотке крови были исследованы ] 19 образцов, из них 26 - от больных сахарным диабетом пациентов.

Для оценки аналитических характеристик метода проведения реакции латексагглютинации в микрообъемах было проанализировано: 118 образцов сыворотки крови для определения С-реактивного белка (СРБ), 124 образца для определения ревматоидного фактора (РФ) и 103 образца для определения антистрептолизина-О (АСЛО), от пациентов проходящих первичное и плановое обследование.

Контроль воспроизводимости и чувствительности разработаных методов осуществляли с использованием промышленных сывороточных контрольных аттестованных образцов фирмы Randox (Великобритания) и DiaSys (Германия).

Для оценки изосерологического метода было протестировано 57 образцов крови. Из них было 15 образцов крови I группы, 19 образцов крови - II группы, 14 образцов крови - III группы и 9 образцов крови - IV группы, 39 образцов были положительными по D-антигену. Определение проводилось с цоликлонами анти-А, анти-В, анти-D-cynep фирмы ООО «Медиклон» (Москва, Россия) и стандартными эритроцитами (СПК г. Москвы).

Для серийного анализа глюкозы методом «сухой химии» на мембрану «NDP» (Австралия), помещенную на специальный носитель, наносили образцы сыворотки с помощью разработанной системы позиционирования-смешивания.

В серийном исследовании СРБ, РФ и АСЛО использовали латексные реагенты «BioScience» (Франция), «BioSystems» (Испания). Многолиновым аппликатором забирали микродозы (менее 0,5 мкл) латексной суспензии, образцов двукратных разведений тестируемой сыворотки и контролей из соответствующих микропланшетов. С помощью системы позиционирования-смешивания помещали их последовательно на носитель в виде упорядоченной матрицы точек и перемешивали.

Серийные и мультиплексные исследования групп крови проводились с цоликлонами анти-А, анти-В и анти-D-cynep «Медиклон» (Россия). Суспензию эритроцитов (или образцы крови) и цоликлоны (исследуемые

сыворотки и стандартные эритроциты - для перекрестного метода определения) помещали в различные микропланшеты согласно схеме проведения анализа. Затем компоненты наносились аппликаторами поочередно на стекло и перемешивались.

Тесты с сухим реагентом формировали нанесением аппликатором микрокапель реагентов со стабилизаторами с последующим высушиванием.

Для регистрации результатов использовали изображения объектов, полученные с помощью сканера «Epson Perfection-4990 Photo» («Epson». Япония), и разработанное в ходе исследования программное обеспечение.

Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы «STATISTICA-7 for WINDOWS» с учетом характера распределения и применением параметрических и непараметрических критериев.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Разработка системы для проведения реакций в микроматричном формате

Наиболее перспективными объектами для использования подхода мультимикроанализа в матричном формате с видеоцифровой регистрацией (ВЦР) являются тесты на планарных носителях, где в результате анализа происходит появление окрашенных пятен (тесты «сухой химии») или изменение структуры объекта (тесты на основе реакции агглютинации).

Практической реализацией этого подхода была разработка простого и производительного приспособления для формирования упорядоченных матриц образцов на планарных носителях и проведения соответствующих реакций для анализа проб.

Рис. 1. Система позиционирования-смешивания - разработанное устройство для нанесения и смешивания микрокапель реагентов и образцов

Были предложены многопиновые системы. включающие микропланшеты для внесения образцов и соответствующие мультиаппликаторы с расположением пинов в несколько рядов, позволяющие наносить на планарные объекты воспроизводимые по объему капли

Аппликатор из нержавеющей стали со специальной обработкой торцевых поверхностей пинов позволяет создавать матрицы формата 5хб из 30 аналитических точек с расстояниями 4,4 мм между центрами точек. Каждая аналитическая точка соответствует исследуемему образцу. Для этого аппликатора был разработан вариант микропланшета с 30-лунками объемом 10-15 мкл. Объем капель, переносимых аппликатором менее 0,5 мкл.

С применением такого аппликатора была создана система позиционирования-смешивания (рис. 1), обеспечивающая возможность наносить микрокапли жидкости быстро и точно на геометрически фиксированные места на носителе и при необходимости смешивать капли реагентов и образцов в каждой точке матрицы.

Регистрация результатов реакции

а б

Рис.2. Схема проведения исследований с помощью системы позиционирования-смешивания: а - проведение анализа образца на носителе с реагентом (серийное определение концентрации глюкозы); б - проведение анализа со смешиванием реагентов и образцов (реакция агглютинации)

На рис. 2 показаны схемы, иллюстрирующие применение системы позиционирования-смешивания. На рис. 2а представлен вариант проведения анализа, требующий только переноса образца на носитель: 30 капель одного объема (около 0,5 мкл) одномоментно переносят на носитель, формируя матрицу точек образца. Носитель может содержать реагенты, которые сразу вступают в реакцию с исследуемым веществом в образце, либо происходит

Форхиросэ нис

Проведение

только иммооилизация компонентов ооразца на мембрану для дальнейших, например, иммунохимических. исследований. На рис. 26 представлена схема проведения анализа со смешиванием образцов и реагентов в геометрически фиксированных точках на поверхности носителя. На носителе сначала формируется матрица капель реагента, затем в то же фиксированное положение вносятся капли образца. В результате каждая капля образца смешивается с каплей реагента, уже находящейся на носителе в определенной точке матрицы.

После прохождения соответствующих реакций на носителе, результаты регистрируются видеоцифровой системой с соответствующим программным обеспечением (ПО).

2. Разработка ПО для количественной обработки результатов серийного дот-анализа

Для регистрации результатов дот-анализа в микроматричном формате был разработан пакет ПО «ЭкспертЛаб-Видеодот». При обработке изображения объекта «зоны интереса» - участки изображения, соответствующие матрице аналитических точек, формируемой с помощью системы позиционирования-смешивания, автоматически идентифицировались программой или выбирались оператором. Рассчитывалась средняя интенсивность отраженного света от точек объекта данной зоны, имеющая обратнопропорциональную зависимость от концентрации аналита в данном образце.

Г Калибраторы

и

¡ШШ йЙй ш §и т га

-ОСТ Г" п г—ш 1 -1

Компьютерная интерпретация результатов 1 Л Г"Т 1 н ■ £1 1

■ □и ж

J С

Калибровочная кривая

Рис.3. Окно разработанной программы «Экслерт-Лаб Видеодот»

Использование принципа «многозонного анализа» позволяло одновременно и независимо регистрировать результаты определений в каждой отдельной зоне. Сохранение первичного изображения результатов реакции давало возможность проводить ретроспективный контроль результатов.

Был разработан пользовательский интерфейс ПО для дот-анализа. Принцип организации основного окна ПО «Эксперт-Лаб Видеодот» показан на рис. 3. Представлено первичное изображение матрицы аналитических точек, схематическое изображение этого же теста с указанием месторасположения калибраторов и исследуемых образцов и автоматической интерпретацией результатов по заданному пороговому значению. Концентрации аналитов, рассчитанные по калибровочной кривой, представлены в таблице результатов.

Предложенная аналитическая платформа для мультидот-анализа. включающая систему позиционирования для высокопроизводительного нанесения образцов, видеоцифровую систему регистрации и программное обеспечение «Эксперт-Лаб Видеодот» является перспективной для проведения различных серийных биохимических анализов на основе планарных тестов «сухой химии» и дот-иммунохимических определений.

На базе этой платформы была показана возможность проведения анализа содержания глюкозы в сыворотке крови.

3. Система серийного микроматричного определения глюкозы в сыворотке крови

Серийное измерение глюкозы в сыворотке крови с применением системы матричного дот-нанесения образцов проводилось следующим образом. В микропланшет вносились образцы сывороток и калибраторы по 10 мкл в каждую лунку. Планшет и носитель с мембраной фиксировались в соответствующих отделениях системы позиционирования. С помощью аппликатора капли образца переносились на мембрану, содержащую иммобилизованные реагенты для проведения глюкозооксидазной ферментативной реакции, с формированием цветного пятна, время проявления которого составляло около 60 с. После чего носитель сразу же помешался в сканер для регистрации результатов анализа. Вся процедура (после заполнения планшета) по определению содержания глюкозы в 30 образцах занимала не более 3 минут, причем результаты, представленные в электронной форме, сохранялись в базе данных или распечатывались.

На трех уровнях аттестованных контрольных сывороткок была определена внутрисерийная (вс) и межсерийная (мс) воспроизводимость полученных результатов. Были рассчитаны коэффициенты вариации (СУ), которые оказались ниже предельно допустимого значения СУ=5% при измерении концентрации глюкозы (приказ № 45 МЗ РФ от 07.02.2000). Данные по воспроизводимости результатов для определения содержания глюкозы в контрольных сыворотках отражены в таблице 1.

Для оценки чувствительности метода сывороточный калибратор с содержанием глюкозы 10,4 ммоль/л разводился забуференным раствором альбумина с созданием низких концентраций глюкозы (по данным референсного метода). Чувствительность разработанного метода составила 2,10±0,08 ммолей/л. Диапазон измерений - от 2 до 20 ммоль/л.

Таблица 1

Данные по воспроизводимости результатов для определения содержания глюкозы в контрольных сыворотках

Концентрация глюкозы в контрольных сыворотках, ммоль/л CVac,% 1 j cvMC % 1 1 1 1 1

4,13-5,7 2,79 3,86 ;

5,30-7,16 2,99 ; 4,01 ;

13,1-17,7 3,08 ; 4,45 j

На рис. 4 представлены данные сопоставления результатов определения содержания глюкозы методом серийного дот-анализа и референсным методом для 119 образцов сывороток клинически здоровых людей и пациентов с сахарным диабетом. Коэффициент корреляции Пирсона равный 0,98 (при р<0,05), показывает, что различия между результатами референсного и тестируемого метода статистически незначимы.

О ; 10 20

анализатор, ммоль/л

Рис. 4. Сопоставление результатов определения глюкозы в сыворотке крови методом дот-анализа и глюкозооксидазным методом на ан&тизаторе «AU-400» фирмы «Olympus« (Япония)

4. Применение системы позиционирования-смешивания для проведения реакций со смешиванием образцов и реагентов

На основе варианта проведения реакций со смешиванием образцов и реагентов в геометрически фиксированных точках на поверхности носителя были разработаны новые модификации методов для обнаружения аналитов с помощью реакции латексной агглютинации (ЛА) и для изосерологических исследований.

Рис. 5. Изображение носителя с проведенной на нем реакцией агглютинации. Вверху справа показано увеличенное сканерное изображение двух рядов матрицы аналитических точек с агглютинировавшими и неагглютировавшими пробами

В ходе реакции из микропланшета аппликатором переносили капли реагента на носитель, формируя матрицу капель на его поверхности. Такую же операцию проводили и с каплями образца. Капли смешивалась. Реакция происходила одновременно в 30 аналитических точках в объеме не более 1 мкл. На рис. 5 представлено изображение носителя с прореагировавшими с латексной суспензией образцами. В верхнем углу рисунка показано увеличенное сканерное изображение двух рядов матрицы аналитических точек, где хорошо различимы агглютинировавшие и неагглютировавшие пробы.

Разработанная нами система позиционирования-смешивания обладает достаточно большой гибкостью для вариации объемов наносимых капель за счет использования аппликаторов с разной площадью торцевых поверхностей пинов, что дает возможность изменять соотношение реагентов и открывает новые перспективы применения микроматричного анализа для других методов биохимии и иммунологии.

5. Разработка ПО для регистрации результатов агглютинационных тестов в матричном формате

Для регистрации результатов агглютинационных тестов в микроматричном формате нами был разработан пакет ПО «Эксперт-Лаб

Агглютинация-Микро».

а б в г

Рис. 6. Сравнение увеличенных изображений аналитических зон с наличием и отсутствием агглютинации в тестируемых сыворотках: первичное (а), контрастированное (б), инвертированное изображение (в) и визуальное аналоговое представление результатов математической обработки (г)

На рис. 6 представлены результаты обработки изображения программными средствами для визуального контроля результата анализа для каждого элемента матрицы индивидуально (рис. ба-в). С помощью программы одновременно выводились на экран увеличенные контрастированные либо инвертированные изображения аналитических зон прореагировавших тестируемых и контрольных образцов для сравнения, что было особенно важно при интерпретации сомнительных результатов реакции. После специальной математической обработки ПО давало возможность получить визуальное аналоговое представление количества образовавшихся комплексов (рис. 6г).

Для численной оценки выраженности агглютинации учитывалось количество элементов в анализируемой зоне, их площадь и усредненная яркость. Численное представление интенсивности агглютинации давало возможность получения количественной оценки результата реакции агглютинации и определения порогового значения для дискриминации положительных и отрицательных образцов.

Таким образом, информация о наличии или отсутствии агглютинации для конкретного образца с помощью предлагаемой системы видеорегистрации фиксировалась и сопоставлялась в различных видах. Такое дублирование информации значительно повышало достоверность результатов проводимых исследований, снижало влияние случайных и систематических ошибок на результат лабораторного теста.

Принципы построения пользовательского интерфейса и основного окна программы были аналогичны описанным выше для программы «Эксперт-Лаб Видеодот».

На рис. 7 представлено основное окно программы «Эксперт-Лаб Агглютинация-Микро» с оценкой результатов реакции агглютинации и дискриминации положительных и отрицательных результатов по пороговому значению. Показана возможность одновременного анализа на экране увеличенных контрастируемых изображений аналитических зон, соответствующих контрольным и исследуемому образцам.

Протокол анализа и компьютерная обработка результатов

Увеличенное изображение

зоны контрольного образца

Численное представление результатов программной

обработки изображения

Увеличенное изображение

зоны тестируемого образца

У

Рис. 7. Основное окно разработанной нами программы «Эксперт-Лаб Агглютинация-Микро»

Сохранение первичного изображения позволяло накапливать результаты в базе данных, ретроспективно корректировать возможные ошибки, а также более полно отслеживать динамику изменения аналитов.

6. Система серийного определения С-реактивного белка, ревматоидного фактора и антистрептолизина-О микрометодом латексной агглютинации в матричном формате

Было проведено исследование по оценке разработанного метода определения СРБ, РФ и АСЛО на контрольных сыворотках и клиническом материале. Для изучения воспроизводимости измерений метода были проведены реакции с контрольными отрицательными и раститрованными контрольными положительными сыворотками с разными концентрациями аналитов. Коэффициент вариации для отрицательных сывороток был равен 0. Для положительных - данные представлены в таблице 2. Чувствительность разработанного метода составила соответственно 6,8±1,27 мг/л - для СРБ, 10,5±4,1 МЕ/мл - для РФ и 234±57 МЕ/мл - для АСЛО, что соответствует паспортным данным латексной системы.

Для оценки правильности метода были проанализированы 345 образцов сывороток на наличие СРБ, РФ и АСЛО полуколичественными методами: классическим методом ЛА на слайдах с визуальной регистрацией, его модификацией в лунках крышек 96-луночных планшетов и микрометодом в матричном формате с ВЦР и количественным

иммунотурбидиметрическим методом на анализаторе «AU640» (фирма «Olympus», Япония).

Таблица 2

Данные по воспроизводимости результатов определения аналитов в контрольных сыворотках «Randox»

Аналиты Концентрация аналита в контрольных сыворотках CV, % данные производителя CV20, %

СРБ, мг/л 25,7±3,9 25 10

52,6±7,9 5

78,3±11,7 5

РФ, МЕ/мл 40,3±8,1 25 15

56,3± 11,3 5

ACJIO, МЕ/мл 354+45 20 15

Для сравнения результатов, полученных количественным и полуколичественными методами, титры сывороток и соответствующие им концентрационные интервалы ранжировались и учитывалось количество сывороток, попадающих в тот или иной интервал. В таблице 3 приведены рассчитанные коэффициенты корреляции Спирмана.

Таблица 3

Данные статистической обработки (коэффициенты корреляции Спирмана, при р<0,05) результатов, полученных в системах с реакцией ЛА на планарных объектах и иммунотурбидиметрическим методом

Референс-методы Сравниваемые методы Иммунотурбидиметрия Классический метод ЛА с визуальной регистрацией

СРБ РФ АСЛО СРБ РФ АСЛО

ЛА в лунках крышки планшета с ВЦР 0,978 0,930 0,951 1,0 0,988 0,988

Микроматричный метод с жидким латексом с ВЦР 0,981 0,923 0,959 0,993 . 0,987 L . . 0,977

Классичесий метод ЛА с визуальной регистрацией 0,978 0,928 0,937 | -

По данным статистической обработки методом корреляционного анализа была выявлена высокая степень совпадения результатов, полученных

разработанным микрометодом ЛА с видеорегистрацией, с результатами макрометода с проведением анализа в крышке планшета и классического полуколичественного метода на слайдах с визуальной регистрацией. Сравнение результатов разработанного нами метода проведения ЛА в микроформате с иммунотурбидиметрическим методом также показывает хорошую корреляцию данных по содержанию аналитов в образцах.

7. Тесты с сухим латексным реагентом

Следующим этапом усовершенствования агглютинацонной микроматричной технологии было создание тестов с высушенным латексным реагентом. Разработанный нами тест с сухим реагентом (рис. 8) представлял собой аналитическую систему нового поколения, характеризующуюся минимизацией операций при проведении анализа. Работа с тестом заключалась в одномоментном нанесении и смешивании с уже имеющимся на носителе сухим реагентом 30-ти исследуемых проб. Регистрация результатов анализа проводилась также с помощью аппаратно-программного комплекса «Эксперт-Лаб» и программы «Эксперт-Лаб Агглютинация-Микро».

Рис 8. Тест с высушенным латексным реагентом

Данные статистической обработки показали высокую корреляцию результатов определения аналитов СРБ, РФ, АСЛО, полученных на тестах с сухими латексными реагентами, количественным

иммунотурбидиметрическим методом и полуколичественным классическим методом реакции ЛА на слайдах (табл.4).

Для оценки стабильности работы тестов с сухим реагентом при длительном хранении тесты подвергались испытаниям в течение полугода. Воспризводимость результатов определяли с помощью контрольных сывороток. Коэффициенты вариации соответствовали требованиям, предъявляемым к полуколичественным латексным системам (СУ=20-25%). Чувствительность метода составила 6-10 мг/л для СРБ, 8-16 МЕ/мл для РФ

при титровании образца и 200-300 МЕ/мл для АСЛО. Выявлена стабильная работа тестов в данный промежуток времени.

Таблица 4

Данные статистической обработки (коэффициенты корреляции Спирмана, при р<0,05) результатов, полученных на тестах с сухим реагентом, в классической системе определения аналитов с реакцией ЛА на слайдах и иммунотурбидиметрическим методом.

Реф еренс-методы Иммунотурбидиметрия Классический метод ЛА с визуальной регистрацией

СРБ РФ |АСЛО СРБ ! РФ АСЛО

Микроматричный метод с сухим латексом 0,974 0,924 ¡ 0,946 0,986 0,987 0,947

Данные сравнительного исследования показывают, что разработанные методы определения СРБ, РФ и АСЛО с жидкими и сухими латексными реагентами в микроматричном формате с ВЦР обеспечивают получение достоверных результатов и могут эффективно применяться в лабораторной практике.

8. Система серийного типирования антигенов эритроцитов в матричном формате

На основе микроматричного метода с ВЦР был предложен новый способ определения групп крови системы ABO и резус-фактора.

Схема проведения реакции была аналогична таковой для реакции ЛА. На сухое обезжиренное стекло с помощью соответствующих аппликаторов последовательно наносились цоликлоны и суспензия эритроцитов в физиологическом растворе или пробы крови. Для проведения определения перекрестным методом - соответственно сыворотка исследуемой крови и стандартные эритроциты. После перемешивания проводился учет результатов реакции гемагглютинации с помощью программно-аппаратного комплекса «Эксперт-Лаб» и программы «Эксперт-Лаб Агглютинация-Микро».

На рис. 9 приведены примеры интерпретации результатов исследования эритроцитов на наличие антигенов группы ABO и антигена D системы Резус. Визуальное представление математической обработки изображения помогало объективно оценить результаты реакции агглютинации.

Полученные нами результаты полностью совпали с данными референс-метода прямого и перекрестного определения эритроцитарных антигенов на плоскости, что доказывает возможность использования нового способа определения групп крови ABO и резус-фактора.

Следующим этапом работы было создание и проверка стабильности работы тестов с нанесенными высушенными цоликлонами для определения групп крови ABO.

Цоликлины Группа, 1 Резус-фактор

анти А анти В j анти D анти A j анти В анти D

1 2 3 4 5 Щ ÜÜS ттттшт тштшшя шleiii # Щ ш щ # $ # $ # # щ # É» Ф Ф Ш # А (11), Rh+ 1

АВ (IV), Rh-

В(Ш), Rh+

АВ (IV), Ri+

0(1). | Rhí ;

Рис. 9. Пример интерпретации результатов изосерологического исследования (слева контрастированное изображение аналитических зон, справа - визуальное представление математической обработки изображения)

При анализе всех образцов крови на тестах с сухими цоликлонами наблюдалось полное совпадение результатов с данными, полученными ранее референс-методом и микрометодом с жидкими цоликлонами. После I хранения в течение полугода тесты показали стабильные результаты по определению групп крови ABO.

Проведение исследования в микроматричном формате позволило одновременно проанализировать до 30 образцов на один или несколько параметров. При этом использовалось минимальное количество образца и реагентов, сокращалось время проведения анализа. Видеорегистрация давала возможность повысить объективность оценки результата реакции за счет средств визуализации математической обработки, позволяла документировать полученные данные и сохранять первичное изображение. При необходимости оценку результатов реакции можно повторить, данные распечатать или передать с помощью сетевых технологий в центральную лабораторию. Созданные тесты с сухими реагентами позволили упростить анализ, минимизировать время и трудозатраты на проведение исследования, снизили количество технических ошибок. В сочетании с системой видеорегистрации такие тесты представляют полную аналитическую систему для качественного и высокопроизводительного проведения тестирования как в лабораторных, так и во внелабораторных условиях.

Обоснование экономической эффективности метода.

Ориентировочные экономические расчеты показывают, что проведение мультианалитических исследований в микроматричном формате позволяет

уменьшить требуемый объем образцов и реагентов в 2-25 раз, сократить время, затрачиваемое на единичный анализ в 5-30 раз, при этом повышается объективность оценки результатов тестов и сохраняется первичный документ с данными анализа.

ВЫВОДЫ

1. На основе предложенной системы проведения реакций в микрообъемах и регистрации результатов с использованием разработанных специализированных программ показана возможность биохимических и иммунологических исследований аналитов в биологических жидкостях.

2. Предложенные варианты проведения серийного дот-анализа определения глюкозы в сыворотке крови, латексагглютинационного метода определения содержания аналитов СРБ, РФ, АСЛО и определения групп крови системы ABO и резус-фактора в микроматричном формате с видеоцифровой регистрацией, позволили получить достоверные результаты содержания аналитов и соответствуют требованиям, предъявляемым к стандартным методам клинико-лабораторной диагностики.

3. Аналитические характеристики тестов с сухими реагентами не уступают системам с жидкими реагентами, демонстрируют стабильность работы в течение полугода и могут быть рекомендованы к использованию в клинической практике.

4. При сравнении с референсными методами результатов определения аналитов в крови при проведении исследований в микроматричном формате с видеоцифровой регистрацией на тестах с сухими и жидкими реагентами были получены коэффициенты корреляции 0,92-1,0, что свидетельствует о совпадении полученных результатов.

5. Разработанная технология позволила повысить производительность аналитической работы в 2-25 раз, снизить расход образцов и реагентов в 5-30 раз, что свидетельствует об экономической эффективности метода.

Практические рекомендации

1. Рекомендовать проведение серийного дот-анализа определения глюкозы в сыворотке крови, латексагглютинационного метода определения содержания аналитов СРБ, РФ, АСЛО в микроматричном формате с ВЦР для внедрения в практику клинико-диагностических лабораторий лечебно-профилактических учреждений здравоохранения.

2. Рекомендовать применение тестов с сухими -реагентами для серийных исследований методами латексной агглютинации и определения групп крови системы ABO в сочетании с системами ВЦР для экспресс-диагностики в лабораторных и внелабораторных условиях.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

Статьи в журналах по перечню ВАК Минобрнауки РФ.

1. Зайко В.В. Системы регистрации и анализа изображений для задач клинической лабораторной диагностики / В.В. Зайко, Т.А. Старовойтова, С.Г. Волощук, Н.А. Стериополо, Л.П. Мартынкина, В.А. Кутвицкий, А.Е. Туголуков, Р.Т. Тогузов, Ю.Ю. Венгеров // Клиническая лабораторная диагностика. - 2005. - №10. - С. 25-26.

2. Зайко В.В. Система на основе сканера для документирования, объективизации и регистрации результатов тестов латексной агглютинации / В.В. Зайко, Л.П. Мартынкина, Н.А. Стериополо, О.С. Калачева, В.А. Кутвицкий, А.Е. Туголуков, Е.Е. Егоров, С.Г. Волощук, Р.Т. Тогузов, Т.А. Старовойтова, Ю.Ю. Венгеров // Клиническая лабораторная диагностика. -2006.-№ 12.-С. 18-21.

3. Зайко В.В. Аналитические характеристики микроматричного полуколичественного метода проведения серийных латексных тестов с видеоцифровой регистрацией / В.В. Зайко, Л.П. Мартынкина, Н.А. Стериополо, В.А. Кутвицкий, А.Е. Туголуков, Е.Е. Егоров, С.Г. Волощук, Т.А. Старовойтова, Ю.Ю. Венгеров, Р.Т. Тогузов // Клиническая лабораторная диагностика. - 2008. - № 6. - С. 17-20.

Статьи в журналах, сборниках, методические рекомендации для врачей.

4. Волощук С.Г. Системы видеоцифрового анализа для лабораторной диагностики. Аппаратура и программное обеспечение / С.Г. Волощук, Т.А. Старовойтова, В.А. Кутвицкий, А.Е. Туголуков, В.В. Зайко, Н.А. Стериополо, Е.Е. Егоров, В.Е. Барский, Л.П. Мартынкина, Ю.Ю. Венгеров // Лабораторная медицина. - 2002. - №5. - С. 82-87.

5. Старовойтова Т.А. Видеоцифровой анализ для лабораторной диагностики: комплекс «Эксперт-Лаб» на основе сканера для документирования, объективизации и регистрации результатов латекс-агглютинационных, гемагглютинационных тестов, изосерологических и иммуноферментных исследований / Т.А. Старовойтова, В.В.Зайко, Н.А. Стериополо, О.С. Калачева, Л.П. Мартынкина, В.А. Кутвицкий, А.Е. Туголуков, Е.Е. Егоров, С.Г. Волощук, Р.Т. Тогузов, Ю.Ю. Венгеров // Лаборатория. - 2006. - №1. - С. 19-22.

6. Zaiko V. Microarray Method for Multiplex and Sériai Latex Agglutination Tests with Digital Image Registration / V. Zaiko, L. Martinkina, N. Steriopolo, V. Kutvitsky, A. Tugolukov, E. Egorov, S. Voloshchuk, T. Starovoitova, R. Toguzov, Yu. Vengerov // ClinLab. - 2008. - N 54. - P. 273279.

Патенты.

7. Пат. 2325644 Рос. Федерация, МПК G 01N 33/48, G 01N 33/53. Способ проведения клинического и биохимического анализа биологических

жидкостей / Ю.Ю. Венгеров, В.Е. Барский, С.Г. Волощук, Е.Е. Егоров, А.Е. Туголуков, В.А. Кутвицкий, Л.П. Мартынкина, В.В. Зайко, B.C. Черных, Т.А. Старовойтова, H.A. Стериополо, О.С. Калачева - № 2005123717/15; заявл. 26.07.2005; опубл. 27.05.2008, Бюл. № 15.

Тезисы докладов и статей.

8. Старовойтова Т.А. Видеоцифровой анализ для лабораторной диагностики: комплекс «Эксперт-Лаб» на основе сканера для документирования и регистрации результатов латекс-агглютинационных тестов и иммуноферментных исследований / Т.А. Старовойтова, H.A. Стериополо, В.В. Зайко, О.С. Калачева, Л.П. Мартынкина, В.А. Кутвицкий,

A.Е. Туголуков, Е.Е. Егоров, С.Г. Волощук, Р.Т. Тогузов, В.В. Венгеров // Тезисы докладов семинаров и конференции в рамках выставки «AnalyticaExpo-2006». - М„ 2006. - С. 42-43.

9. Зайко В.В. Мультиплексная аналитическая система для проведения тестов латексной агглютинации в микроформате с видеоцифровой регистрацией / В.В. Зайко, Л.П. Мартынкина, H.A. Стериополо, В.А. Кутвицкий, А.Е. Туголуков, Е.Е. Егоров, С.Г. Волощук, Т.А. Старовойтова, Ю.Ю. Венгеров, Р.Т. Тогузов // Клиническая лабораторная диагностика. -2007. - № 9, С. 39

10. Старовойтова Т.А. Видеоцифровая система «Эксперт-Лаб» для регистрации и объективизации результатов латекс-агглютинационных тестов в формате 96-луночного планшета / Т.А. Старовойтова, H.A. Стериополо,

B.В. Зайко, Л.П. Мартынкина, О.С. Калачева, В.А. Кутвицкий, А.Е. Туголуков, С.Г. Волощук, Ю.Ю. Венгеров, Р.Т. Тогузов // Клиническая лабораторная диагностика. - 2007. - № 9. - С. 37.

Автор выражает искреннюю благодарность всем участникам работы, чей вклад адекватно отражен в совместных публикациях. Автор выражает свою глубокую признательность сотрудникам кафедры клинической лабораторной диагностики Факультета усовершенствования врачей Российского Государственного Медицинского Университета им. Н.И.Пирогова за плодотворные дискуссии, способствовавшие более четкому построению структуры работы и, особенно, заведующему кафедрой профессору доктору медицинских наук Руслану Тимофеевичу Тогузову за постоянное содействие и ценные консультации. Особую благодарность автор приносит коллегам за совместную работу, помощь при проведении различных экспериментов и обработке полученных результатов.

 
 

Оглавление диссертации Зайко, Виктория Витальевна :: 2008 :: Санкт-Петербург

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ПРОВЕДЕНИЯ И РЕГИСТРАЦИИ РЕЗУЛЬТАТОВ БИОХИМИЧЕСКИХ И ИММУНОХИМИЧЕСКИХ АНАЛИЗОВ НА ПЛАНАРНЫХ НОСИТЕЛЯХ, АГГЛЮТИНАЦИОННЫХ ТЕСТОВ И НАПРАВЛЕНИЯ ИХ УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЯ

1.1. Введение

1.2. Видеоцифровая регистрация

1.3. Обзор тестов, используемых в лабораторной диагностике: биохимические и иммунохимические мембранные тесты и агглютинационные тесты

1.3.1. Биохимические тесты на планарных носителях

1.3.2. Иммунологические методы анализа на планарных носителях

1.3.3. Агглютинационные тесты

1.4. Усовершенст вование методов лабораторной диагностики на основе подходов мультиапализа, миниатюризации и видеоцифровой регистрации

1.4.1. Мультианалитические исследования

1.4.2. Миниатюризация тест-систем в матричном формате

1.4.3. Технология биочипов как пример мультианализа в матричном формате

1.4.4. Перспективы развития иммунодот-тестов, тестов «сухой химии» и агглютинационных тестов (технология чипов низкой плотности)

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Введение

3.2. Разработка системы формирования упорядоченных матриц точек и базового программного обеспечения для серийных дот-определений на модели глкжозного теста

3.2.1. Разработка многопиновых систем формирования матриц точек для серийных определений

3.2.2. Разработка исходных требований и программного обеспечения для дот-определений

3.3. Система серийного определения глюкозы крови

3.4. Разработка системы смешивания реагентов и образцов и базового программного обеспечения для регистрации результатов агглютинаци01 шых тестов

3.4.1. Разработка системы позиционирования-смешивания реагентов и образцов

3.4.2. Разработка требований и базового программного обеспечения для регистрации результатов агглютинационных тестов

3.5. Система серийного определения С-реактивного белка, ревматоидного фактора, антистрептолизина-О в реакции латексной агглютинации в микроматричном формате

3.6. Тесты с сухим латексным реагентом

3.7. Система серийного типирования антигенов эритроцитов в микроматричном формате

3.8. Обоснование экономической эффективности микроматричного метода

ВЫВОДЫ

 
 

Введение диссертации по теме "Клиническая лабораторная диагностика", Зайко, Виктория Витальевна, автореферат

Актуальность проблемы

В настоящее время придается огромное значение улучшению качества клинических лабораторных исследований, рациональному и эффективному использованию ресурсов, внедрению новой техники, совершенствованию диагностических технологий. («Концепция развития службы клинической лабораторной диагностики Министерства здравоохранения Российской Федерации на 2004-2010 годы»). Повышение эффективности и качества лабораторной аналитики может быть достигнуто за счет использования передовых методов, современного оборудования и модернизации рутинных процедур [31-34]. Необходимо создание базы разработки лабораторных диагностических методологий с применением новых современных технологий. В лабораторной диагностике примерами таких перспективных технологических направлений являются подходы миниатюризации и использование видеоцифрового компьютерного анализа.

Миниатюризация аналитических технологий позволяет рационально решать ряд задач совершенствования лабораторного обеспечения диагностики и лечения пациентов. Преимущества применения миниатюрных аналитических устройств заключаются прежде всего в уменьшении необходимых для анализа объемов исследуемого материала и реагентов, повышении производительности проведения анализов, возможности создания систем серийного и мультиплексного анализа на основе использования матричного формата.

Современные видеоцифровые технологии позволяют провести более объективную оценку полученных результатов, сохранить и передать данные анализа, что улучшает качество и повышает ценность лабораторных исследований.

Сочетание подходов миниатюризации с системами видеоцифровой регистрации создает базу для разработки принципиально новых вариантов диагностических методов, например, таких как технологии иммунологических и ДНК-микрочипов [49]. Однако применение микрочипов высокой плотности сталкивается с целым рядом проблем, приводящих к возникновению значительных технологических сложностей. Очевидно, что при увеличении количества исследуемых объектов на единицу площади и уменьшении самих объектов исследования необходимо заменить ручной I труд лаборантов работой автоматов, а визуальную оценку результатов анализа регистрацией их соответствующей аппаратурой. При этом не только в несколько раз возрастает стоимость одного анализа, по и возникает потребность в специализированной лаборатории и высококвалифицированном персонале [90, 91]. В настоящее время многие научные группы ведут работы по расширению сферы применений микрочиповых технологий для усовершенствования самых распространенных методов клинической лабораторной диагностики. Это обусловлено существенными преимуществами таких подходов перед традиционными типами исследований. При этом необходимо создание простых, производительных устройств для проведения анализа в микрообъемах и доступных регистрирующих систем для применения в обычной лабораторной практике и во внелабораторных условиях.

В связи с этим исследования, связанные с разработкой и внедрением новых высокоэффективных способов проведения распространенных в медицинской практике клинико-диагностических определений на основе подходов миниатюризации и видеоцифрового анализа, на базе современных комплексов аппаратуры, производительных приспособлений и программного обеспечения (ПО) для лабораторной диагностики можно считать весьма актуальными.

Цель исследования — разработать технологию проведения биохимических и иммунохимических исследований в микроматричном формате с видеоцифровой регистрацией и оценить ее аналитические характеристики.

Задачи исследования:

1. Разработать приспособления для проведения реакций в микрообъемах на планарных носителях и определить критерии медико-технических требований к специализированным программам для видеоцифровой регистрации результатов этих исследований.

2. Определить возможность проведения анализа содержания глюкозы, С-реактивного белка, ревматоидного фактора, антистрептолизина-О в сыворотке крови, а также типирования групп крови системы АВО и Резус в серийных и мультиплексных тестах в микроматричном формате с видеоцифровой регистрацией.

3. Провести сравнительный анализ результатов, полученных при исследованиях в микроматричном формате с видеоцифровой регистрацией и референсными лабораторными методами на клиническом материале.

4. Обосновать экономическую эффективность проведения исследований в микроматричном формате с видеоцифровой регистрацией.

Научная новизна работы

Впервые разработана технология микроанализа в матричном формате на основе видеоцифровой регистрации для проведения клинических лабораторных исследований и продемонстрирована возможность ее применения для широкого спектра биохимических и иммунохимических анализов.

Предложены не имеющие аналогов варианты проведения в микроматричном формате с видеоцифровой регистрацией: (1)-реакции латексной агглютинации для определения клинически значимых аналитов; (2)-определения групп крови системы АВО и резус-фактора.

Разработан принципиально новый вариант тестов с сухими реагентами для серийных исследований методами латексной агглютинации и определения групп крови.

Технология проведения анализа в микроматричном формате для биологических жидкостей защищена патентом №2325644. Бюл. №15 от 27.05.2008.

Практическая ценность работы

Разработана технология проведения исследований в микроматричном формате с видеоцифровой регистрацией, позволяющая повысить производительность аналитической работы, уменьшить расход образцов и реагентов, обеспечить документирование и объективную оценку результатов.

Подготовлена нормативно-техническая документация для производства опытных образцов тестов с сухими реагентами для определения С-реактивного белка, ревматоидного фактора, антистрептолизина-О.

Данные разработки направлены на существенное усовершенствование проведения тестов, наиболее широко распространенных в практике клинических биохимических лабораторий медицинских учреждений.

Апробация работы. Результаты исследования докладывались на III съезде Научного общества специалистов клинической лабораторной диагностики (Москва, 2005), семинаре «Аналитические методы в медицинской диагностике» в рамках Международной специализированной выставки «AnalyticaExpo-2006» (Москва, 2006), симпозиуме «Ключевые проблемы совершенствования лабораторного обеспечения медицинской помощи» (Москва, 2007), итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП (Москва, 2007).

По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, из них 3 статьи в журналах по перечню ВАК и патент на изобретение.

 
 

Заключение диссертационного исследования на тему "Биохимические и иммунохимические исследования в микроматричном формате на основе видеоцифровой регистрации"

102 ВЫВОДЫ

1. На основе предложенной системы проведения реакций в микрообъемах и регистрации результатов с использованием разработанных специализированных программ показана возможность биохимических и иммунологических исследований аналитов в биологических жидкостях.

2. Предложенные варианты проведения серийного дот-анализа определения глюкозы в сыворотке крови, латексагглютинационного метода определения содержания аналитов: С-реактивного белка, ревматоидного фактора, антистрептолизина-О и определения групп крови системы АВО и-резус-фактора в микроматричном формате с видеоцифровой регистрацией позволили получить достоверные результаты содержания аналитов и соответствуют требованиям, предъявляемым к стандартным методам клинико-лабораторной диагностики.

3. Аналитические характеристики тестов с сухими реагентами не уступают системам с жидкими реагентами, демонстрируют стабильность работы в течение полугода и могут быть рекомендованы к использованию в клинической лабораторной практике.

4. При сравнении с референсными методами результатов определения аналитов в крови при проведении исследований в микроматричном формате с видеоцифровой регистрацией на тестах с сухими и жидкими реагентами были получены коэффициенты корреляции 0,92-1,0, что свидетельствует о совпадении полученных результатов.

5. Разработанная технология позволила повысить производительность аналитической работы в 2-25 раз, снизить расход образцов и реагентов в 5-30 раз, что свидетельствует об экономической эффективности метода.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Рекомендовать проведение серийного дот-анализа определения глюкозы в сыворотке крови, латексагглютинационного метода определения содержания аналитов: С-реактивного белка, ревматоидного фактора, антистрептолизина-О в микроматричном формате с видеоцифровой регистрацией для внедрения в практику клинико-диагностических лабораторий лечебно-профилактических учреждений здравоохранения.

2. Рекомендовать применение тестов с сухими реагентами для серийных исследований методами латексной агглютинации и определения групп крови системы АВО в сочетании с системами видеоцифровой регистрации для экспресс-диагностики в лабораторных и внелабораторных условиях.

 
 

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2008 года, Зайко, Виктория Витальевна

1. Анализ наркотических средств. Руководство по химико-токсикологическому анализу наркотических и других одурманивающих средств / Под ред. Изотова Б.Н. - М.: Мысль, 1993. - 272 с.

2. Анализаторы и программное обеспечение для видеоцифровой регистрации результатов электрофоретических и иммуноферментных определений / А.А. Папченко и др. // Клиническая лабораторная диагностика . 1999. - №9. — С. 50.

3. Аппаратно-программный комплекс для серологической диагностики сифилиса методом РПГА «Критерий-2» / М.В. Коноплева и др. // Клин, дерматология и венерология. 2006. - №4. - С. 17-22.

4. Белковые микрочипы / А.Ю. Рубина и др. // Доклады академии наук. -2001. Том 381. - №5. - С.701-704.

5. Белковый иммуноблот и иммунодот в биохимических исследованиях / Н.Ф. Стародуб и др. // Укр. Биохим. Ж. 1987. -№ 59. - С. 108-120.

6. Биологические микрочипы, содержащие иммобилизованные в гидрогеле нуклеиновые кислоты, белки и другие соединения: свойства и приложения в геномике / В.Е. Барский и др. // Молекулярная биология. 2002. - Т. 36. - №4. - С. 563-584.

7. Бромилов И.М. Гелевая технология в серологии групп крови / И.М. Бромилов // Вестник службы крови России. 1998. - № 1. - С. 14-17.

8. Быстрые и простые методы определения вирусных инфекций в лабораторной службе России: Методические рекомендации. Под ред. Покровского В.В. М. - 2004. - 147 с.

9. Вельков В.В и др. Новые возможности современного комплексного анализа мочи: от измерения рН до иммунотурбидиметрии специфических белков: Справочное пособие / В.В. Вельков, Е.С. Иванова, С.В. Кононова. Пущино, 2007 - 79 с. - С.36-45.

10. Венгеров Ю.Ю. Иммунохроматографические «быстрые» тесты с компьютерной видеоцифровой регистрацией эффективная лабораторная технология для массовых анализов / Ю.Ю. Венгеров // Клиническая лабораторная диагностика. — 2000. — № 9. — С. 19.

11. Венгеров Ю.Ю. Микроминиатюризация лабораторных технологий: перспективы и проблемы / Ю.Ю. Венгеров // Клиническая лабораторная диагностика. — 1999. — N9. — С. 5.

12. Ворошилов Н.А. Автоматический анализ мочи зачем он нужен / Н.А. Ворошилов // Лаборатория. - 2003. - № 3. - С.8-10.

13. Высокопроизводительные скрининг методы на основе микро-дот анализа с видеоцифровой регистрацией / Т.А. Старовойтова и др. // Клиническая лабораторная диагностика . 1999. - №10. - С. 16.

14. Гринберг П. и др. Аллергические болезни: диагностика и лечение / П.Гринберг, Л. Грэммер, Р. Паттерсон. М.: ГЭОТАР МЕД, 2004. -768 с.

15. Гупалова Т.В. и др. Новый метод определения микроальбумипурии при диабетической нефропатии: Методические рекомендации. / Т.В. Гупалова, С.Н. Орлова, В.Г Палагнюк, А.А.Тотолян. СПб: НИИ экспериментальной медицины РАМН, 1996. — 13 с.

16. Дедов И.И., Фадеев В.В. Введение в диабетологию. Руководство для врачей. М.: Берег, 1998. - 200 с.

17. Денисова О.В. Групповые системы крови человека. Методы определения. Проблемы несовместимости крови: Учебное пособие. -М., 2000. -44 с.

18. Диагностическое значение определения уровня тропонина Т в крови пациентов с инфарктом миокарда / М.Б. Филипенко и др. // Клиническая лабораторная диагностика. 2003. - № 12. - С. 11-13.

19. Долгов В.В. и др. Фотометрия в лабораторной практике / В.В. Долгов, Е.Н. Ованесов, К.А. ХЦетникович. СПб.: Витал Диагностике, 2004. -192 с.

20. Долгова Н.П. Современная панель тест-полосок ФАН позволяет на основе анализа мочи проводить целенаправленную диагностику широкого спектра заболеваний / Н.П. Долгова, В.А. Томшик // Лаборатория. 2001. - № 2. - С. 12-14.

21. Донсков С.И. Групповые антигены эритроцитов. Концепция совместимости: Руководство для иммуносерологов и трансфузиологов / С.И. Донсков, В.А. Мороков, И.В. Дубинкин. М., 2008. - 184 с.

22. Дробченко С.Н. Быстрые простые тесты ИммуноКомб / С.Н. Дробченко, Ф.С. Носков, М. Хершберг // Вторая международная конференция. «Высокие медицинские технологии XXI века». Мат. конференции. Бенидорм, Испания. - 2003. - С. 41.

23. Зенцова О.А. Особенности организации работы клинической лаборатории при использовании современных анализаторов для исследования мочи / О.А. Зенцова , И.И. Свещинская, Г.А. Демидченко // Лаборатория. 2000. - № 1. С.7-8.

24. Иммуноферментный анализ. Тест-полоски Immunodot. Полная экспресс-система на основе иммуноферментной технологии для скрининга нескольких диагностически значимых^ компонентов. Каталог / Группа компаний «БиоХимМак».- М., 2002.

25. Иммунохимические экспресс-тесты для медицинской диагностики / Б.Б. Дзантиев и др. // Клиническая лабораторная диагностика. 2003.- №9. С. 31.

26. Иммунохроматографические тесты определеия онкомаркеров с видеоцифровой регистрацией перспективы для первичной диагностики злокачественных образований / Т.А. Старовойтова и др. // Клиническая лабораторная диагностика . - 2000. - №10. — С. 14-15.

27. Клиническая лабораторная аналитика. Т. I. Основы клинического лабораторного анализа . / Под ред. Меньшикова В.В. М.: Агат Мед,2002. 860 с.

28. Козлов А.В. Аналитические возможности методов латекс-агглютинации / А.В. Козлов // Terra Medica nova. 2005. - №1(6). - С. 11-17.

29. Медицинская лабораторная диагностика (программы и алгоритмы) // Под ред. Карпищенко А.И. Санкт-Петербург: Интермедика, 1999. -656 с.

30. Меньшиков В.В. Анализ по месту лечения. "Юнимед-пресс", М.2003, 159с.

31. Меньшиков В.В. В центре проблем лабораторной службы / В.В. Меньшиков // Лаб. медицина. 2001. - № 4. - С.7-18.

32. Меньшиков В.В. Лабораторные исследования возле пациента / В.В. Меньшиков // Клиническая лабораторная диагностика. — 2002. — №4.1. С.23-34.

33. Меньшиков В.В. Современные возможности клинической лабораторной аналитики /В.В. Меньшиков // Клиническая лабораторная диагностика. — 2000. № 3. — С.26-38.

34. Мидитрон М+Комбур-10-Тест М. Описание технических и аналитических характеристик / Берингер Маннхайм ГмбХ, Германия,2003.

35. Навольнев С.О. Программа для анализа оцифрованного изображения и применение ее в ультрамикрометоде определения белка / С.О. Навольнев // Клиническая лабораторная диагностика. — 2005. — №10. -С. 26.

36. Об утверждении инструкций по иммуносерологии. Приказ N 2 от 9 января 1998 г. Министерство Здравоохранения Российской Федерации -М., 1998.-96 с.

37. Определение микроальбуминурии с применением рекомбинантного альбуминового рецептора / Т.В. Гупалова и др. // Клиническая лабораторная диагностика. — 1997. — № 2. С. 14-16.

38. Полтавченко А. Г. Многопрофильная иммунохимическая индикация возбудителя инфекционных заболеваний / А. Г Полтавченко, А. М. .Яковченко, Н. А. Кривенчук // Клиническая лабораторная диагностика . -2006. -№5.-С. 39-43.

39. Применение сканера для регистрации результатов иммуноферментного анализа в стандартных микропланшетах. / Н.А Стериополо и др. // Клиническая лабораторная диагностика. 2006. - № 11. - С. 44-47.

40. Рефлотрон Плюс. Биохимическая лаборатория на вашем столе. Описание технических характеристик / ЗАО «Рош-Москва» М., 2003.

41. Серодиагностика сифилиса / Ниармедик Плюс — М., 2006.

42. Системы видеоцифрового анализа для лабораторной диагностики. Аппаратура и программное обеспечение / С.Г. Волощук и др. // Лабораторная медицина. 2002. - №5. - С. 82-87.

43. Системы экспрессной иммунодетекции биологически активных соединений / Б.Б. Дзантиев и др. // Клиническая лабораторная диагностика. 2002. - № 8. - С. 25-32.

44. Титов В.Н. Микроальбуминурия: патофизиология, диагностическое значение и методы ее изучения / В.Н. Титов. А.В. Тарасов // Тер. архив. 1988.-№ 6.-С. 134-140.

45. A fully automated blood typing system for hospital transfusion services. ABS2000 Study Group / S.G.Sandler et al. // Transfusion. 2000. - Vol. 40(2). - P. 201-207.

46. A microplate reader for blood grouping / A.R. Bowley et al. // Med Lab Sci. 1988. - Vol. 45(1). - P.19-27.

47. A new generation of scanners for DNA chips / Perraut F. et al. // Biosens Bioelectron. 2002. - Vol. 17-P. 803-813.

48. Adesa TLi System. Technical and Analytical Features Description. / Adesa Biomedical Sunnyvale, USA, 2003.

49. Afshar A. Simple and rapid dot-enzyme immunoassay for visual detection of rinderpest antibodies in bovine and caprine sera / A. Afshar, D. J Myers // Trop Anim Health Prod. 1986. - Vol.18(4). - P.209-216.

50. Allergy Screen Immunoblot for analysing IgE in human serum / R-BIOPHARM. Germany, 2004.

51. An enzyme immunofiltration assay useful for detecting human monoclonal antibody / M.C. Glassy et al. // J. Immunol. Methods. 1983. - Vol. 58. -P. 119-26.

52. AT Platform. The Array Tube (AT) Array Technology for Eveiy Lab. Analytical and Technical Features Description. // CLONDIAG chip technologies GmbH. - Jena, Germany, 2002.

53. Betachek. Indicator Strips for Blood Glucose Testing. Instruction for Visual or Meter Reading. Analytical Features Description. / National Diagnostic Products PTY. Ltd. Sydney, Australia, 2004.

54. BioDot Chip Catalog. / BioDot Inc. Irvine, С A, 2006.

55. BloodChip. Technical Feature Description. / Progenika Biopharma Ltd. -Spain, 2006.

56. Bonnardeaux A. A study on the reliability of dipstick urinalysis / A. Bonnardeaux, P. Somerville, M. Kaye // Clin. Nephrol. 1994. - Vol. 41.-P. 167-172.

57. Ching S. Process for Immunochromatography with Colloidal Particles / S. Ching, P. A. Billing, J. Gordon // United States Patent № 6 534 320. March 18,2003.

58. Collinson P.O. Troponin T or troponin I or CK-MB (or none?) / P.O. Collinson // Eur. Heart. J. 1998. - Vol. 19. - P.16-24.

59. CombiChip Autoimmune 1.0 / Schleicher &Schuell GmbH Whatman Group San Francisco, CA, USA, 2005.

60. CombiScan500 Urine Test Analyzer. Technical Features Description. / Analyticon Biotechnologies AG Lichtenfels, Germany, 2003.

61. Compact reader 100 200 300 400 500. / Matest Systemtechnik GmbH. -Mossingen, Germany, 2004.

62. Compendium. Visual Urinalysis with Test Strips / Roche Diagnostics -Mannheim, Germany, 2000. 110 p.

63. Constantine N.T. HIV testing technologies after two decades of evolution / N.T. Constantine, H. Zink // Indian J Med Res. 2005. - Vol. 121(4). - P. 519-538.

64. Detection of anti-HAV antibody with dot immunogold filtration assay / J. Z. Shao et al. // World J Gastroenterol. 2003. - Vol. 9. -N. 7. - P. 15081511.

65. Development and evaluation of immunochromatographic rapid tests for screening of cannabinoids, cocaine, and opiates in urine / R. Wennig et al. //J Anal. Toxicol. 1998.-Vol. 22.-P. 148-155.

66. Diagnostic efficiency of home pregnancy test kits. A metaanalysis / L.A. Bastian et al. // Arch. Farm. Med. 1998. - Vol. 7. - P. 465-469.

67. Dykman L.A. Use of the dot-immunogold assay for the rapid diagnosis of acute enteric infections / L.A. Dykman, V.A. Bogatyrev // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2000. - Vol. 27. - P. 135-137.

68. Endoncard. Instruction for use / Endon Biologycal. Denmark, 2005.

69. Evaluation of various tests for the detection of antigen and antibodies in the diagnosis of primary HIV infection / V. Soriano et al. // Enferm. Infecc. Microbiol. Clin. 1990. - Vol. 8. - P. 434-437.

70. Evidence. Biochip Array Technology / Randox Laboratories Ltd. Crumlin, - 2007.

71. Faulstich K. Developing rapid mobile РОС systems / K. Faulstich, M. Eberhard, R. Gruler // IVD Technology 2007.

72. Forward and reverse blood grouping with lateral flow based assays / P. Schwind et al. // Vox Sang. -2005. Vol. 89 (1). - P. 151-152.

73. Gammon R. R. Evaluation of capturer CMV solid phase testing over the allowable shelf-life of red blood cells (adenine-saline added) / R. R. Gammon, N. Avery, P. D. Mintz // Transfusion Science. 1998. - Vol. 19(3).-P. 225-228.

74. Geisen C. Performance evaluation of a novel lateral flow device for rapid multi-parameter blood grouping without centrifugation / C. Geisen, P. Schwind, E. Seifried // Transfus Med Hemother. 2006. - Vol. 33(1). - P. 49-50.

75. Gella F. J.Latex agglutination procedures inimmunodiagnosis / F. J.Gella, J. Serraa, J. Generx //Pure & Appl.Chem. 1991. - Vol.63. - N. 8. - P. 11311134.

76. H-300 Urine Analyzer. Technical Features Description. / Dirui Industrial Co.,Ltd. Changchun, China, 2003.

77. Hawkes R. Identification of concanavalin A-binding proteins after sodium dodecyl sulfate-gel electrophoresis and protein blotting / R. Hawkes // Anal. Biochem. 1982.-Vol. 123.-P. 143-146.

78. Herbrink P. The antigen spot test (AST): a highly sensitive assay for the detection of antibodies / P. Herbrink, F.J. Van Bussel, S.O. Warnaar // J. Immunol. Meth. 1982. - Vol. 48. - P. 293-298.

79. High-throughput microarray-based enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) / L.G. Mendoza et al. // Biotechniques. 1999. - Vol. 27. - P. 778-780, 782-786, 788.

80. Hydrogel-Based protein microchips: manufacturing, properties and applications / A.Yu. Rubina, et al. // Bio.Techniques. 2003. - Vol. 34. -P. 1008-1022.

81. Innovative instrumentation for microarray scanning and analysis: application for characterization of oligonucleotide duplexes behavior / E.B.

82. Khomyakova et al. // Cell. Mol. Biol. (Noisy-le-grand). 2004. - Vol. 50. -P. 217-224.

83. Jain K.K. Nanotechnology in clinical laboratory diagnostics / K.K. Jain // Clin Chim Acta. 2005. - Vol. 358(1-2): - P. 37 - 54.

84. Kline T. ABO, D blood typing and subtyping using plug-based microfluidics /Т. Kline, M.K. Runyon , M. Pothiawala // Anal Chem. 2008. - Vol. 80(16). - P. 6190-6197.

85. Kricka L.J. Miniaturization of analytical systems / L.J. Kricka // Clin. Chem. 1998.-Vol. 44.-N9.-P. 2008-2014.

86. Kricka L.J. Multianalyte Testing / L.J. Kricka // Clin. Chem. 1992. - Vol. 38.-N 3.-P. 327-328.

87. LabUReader. Technical Features Description. / 77 Electronica К ft. -Budapest, Hungary, 2003.

88. Larsen S.A. A Manual of Tests for Syphilis / S.A. Larsen, E.F., Hunter, S.J. Draus // 8th ed. American Public Health Association Washington, 1990.

89. LifeSign MI. From the Original Maker of Rapid Cardiac Tests. Analytical Features Description / LifeSign New Jersey, USA - 2003.

90. MAKROmed Reagent Strips. MAKROmed Urine Strip Analyser. Analytical and Technical Features Description. / MAKROmed Manufacturing (PTY) Ltd. Johannesburg, South Africa. — 2003.

91. Martin C.L. Quality control issues in point of care testing / Martin C.L. // Clin Biochem Rev. 2008. - Vol. 29. - P. 79-82

92. Medicines and healthcare products regulatory agency. Evaluation Report: Six automated blood grouping systems. / MHRA. UK, 2003.

93. Microarrays for the screening of allergen-specific IgE in human serum B.I. Fall et al. // Anal. Chem. 2003. - Vol. 75. - P. 556-562.

94. Micronics' ABO™ Card. Instruction for use. / Micronics. Redmond, USA, 2006.

95. Microplates. Product catalogue. / DiaMed. Cressier sur Morat, Switzerland, 2005.

96. MiraWell. Rapid HBV/H1V/HCV Combination Screen Test. Analytical Features Description / MedMira NovaScotia, Canada, 2003.

97. Multifield image analysis approach: imagers, hardware, software / Y.Y. Vengerov et al. // 1st International Meeting on Imaging Technique in Planar Chromatography (ITPC'99). 1999. - Jezersko (Slovenia), eds. Vovk I., Prosek M., Medja A. - P.73-76.

98. Multispot HIV-l/HIV-2. Analytical Features Description / Bio-Rad Laboratories. Hercules, USA, 2003.

99. Multi-variant genotyped donor panels in usage for performance comparaison of three commercially available RHD/ABO serotyping methods / C. Gassner et al. // Transfusion. . 2006. - Vol. 46 (9S). - P. 142A-143A.

100. Noya O. The multiple antigen blot assay (MABA): a simple immunoenzymatic technique for simultaneous screening of multiple antigens / O. Noya, B. Alarcon de Noya // Immunol. Lett. 1998. - Vol. 63. - P. 5356.

101. NucoCard ридер II. / Группа компаний «БиоХимМак» Москва, Россия, 2004.

102. One-Step Drug Screen Card in Multi-Panel. / IND Diagnostic Inc. Product Catalogue. — Delta, Canada, 2003-2004.

103. Overview of a microarray scanner:design essentials for an integrated acquisition and analysis platform / T. Basarsky et al. // MicroarrayBiochip Technology (ed. Schena M.). Eaton Publ., Natick, MA, 2000. - P. 265-284.

104. Peele J. Semi-automated vs. visual reading of urinalysis dipsticks / J. Peele, Gadsden R., Crews R. // Clin. Chem. 1977. - Vol. 23. - P. 2242-2246.

105. Portable system for microbial sample preparation and oligonucleotide microarray analysis S.G. Bavykin et al. // Appl. Environ Microbiol. 2001 -Vol.67.-P. 922-928.

106. Reliability of the third-generation recombinant immunoblot assay for hepatitis С virus / M. Damen et al. // Transfusion. 1995. - Vol. 35. - P. 745-749.

107. Rogers P. H. Selective, Controllable, and Reversible Aggregation of Polystyrene Latex Microspheres via DNA Hybridization / P. H. Rogers, E. Michel, C. A. Bauer // Langmuir. 2005. - Vol. 21. - P. 5562-5569.

108. Rogers R. Evaluation of a novel dry latex preparation for demonstration of infectious mononucleosis heterophile antibody in comparison with three established tests / R. Rogers, A. Windust, J. Gregory // J Clin Microbiol. -1999. Vol.37(l).-P. 95-98.

109. Sampson H.A. Food Allergies / H.A.Sampson, D.D. Metcalfe. // JAMA -1992.-P. 2840-2844.

110. Semi-quantitative immunochromatographic test for prostate specific antigen in whole blood: tossing the coin to predict prostate cancer? / F. Oberpenning et al. // Eur. Urol. 2003. Vol. 43. - P.478-484.

111. Simultaneous multianalyte ELISA performed on a microarray platform / R. Wiese et al. // Clin. Chem. 2001. - Vol. 47. - N 8. - P. 1451-1457.

112. Single-molecule reader for proteomics and genomics / J. Hesse et al. // J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 2002. - Vol. 782. - P. 127-135.

113. Spotchem. Technical Features Description. / Arkray Inc. Japan, 2004.

114. Status DS. Rapid Drugs of Abuse Test. Analytical Features Description / LifeSign New Jersey, USA - 2003.

115. Templin M.F. Protein microarray technology / M.F. Templin, D. Stoll, M. Schrenk // Trends Biotechnol. 2002. - Vol. 20. - P. 160-166.

116. TurboScan. The universal and flexible high-performance densitometer for your clinical laboratory. / BIOTEC-FISCHER GmbH. Germany, 2005.

117. Urine Reagent Strips / Teco Diagnostics. Product Catalogue. Anaheim, USA, 2003-2004.

118. Utterback K. Matching point-of care devices to clinicians for positive outcomes / K. Utterback, B.H. Waldo // Home Healthc Nurse. 2005. - Vol. 23(7). - P. 452-459.

119. Vitros. Systems chemistry. Technical Features Description. / Johnson&Johnson Clinical Diagnostics, Ltd. USA, 2003.

120. Vlasov G.S. Dot immunoenzyme analysis in biological research / G.S. Vlasov, V.E. Sudovtsov, I.B. Shepeleva //Nauchnye Doki Vyss Shkoly Biol Nauki. 1991. - Vol.4. -P.5-21.

121. Wellcolex colour latex tests added to Oxoid Range / Oxoid Basingstoke, UK, 2007.

122. Wide-field luminescence microscopes for analyzing biologicalmicrochips / Ya. Barsky et al. // J. Opt. Technol. 1998. - Vol. 65. - No. 11. - P. 938941.

123. Wu B.R. A new immune complex dot assay for detection of rotavirus antigen in faeces / B.R. Wu, J.B. Mahony, M.A. Chernesky // J. Virol. Methods. 1990.-Vol. 29.-P. 157-166.

124. Xiang X. Development of a rapid, sensitive, dye immunoassay for schistosomiasis diagnosis: a colloidal dye immunofiltration assay / X. Xiang, W. Tianping. T. Zhigang // J. Immunol. Methods. 2003. - Vol. 280. - P. 49-57.

125. Особую благодарность автор приносит сотрудникам ФГУЗ «Всероссийского центра экстренной и радиационной медицины имени A.M. Никифорова» МЧС России за теплый прием, терпимость, ценные советы по подготовке и представлению работы к защите.