Автореферат и диссертация по медицине (14.01.09) на тему:Аутоиммунные проявления у больных вирусными гепатитами

На правах рукописи

И04608156

УМБЕТОВА Карина Туракбаевна

АУТОИММУННЫЕ ПРОЯВЛЕНИЯ У БОЛЬНЫХ ВИРУСНЫМИ ГЕПАТИТАМИ

14.01.09 - инфекционные болезни

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва-2010

2 4 ИЮН 2010

004608156

Работа выполнена в ГОУ ВПО Московской Медицинской Академии им. И.М. Сеченова

Научный консультант:

Доктор медицинских наук, профессор Елена Васильевна Волчкова

Официальные оппоненты: Заслуженный деятель науки РФ,

доктор медицинских наук, профессор Нина Михайловна Грачёва

доктор медицинских наук, профессор Галина Михайловна Кожевникова

доктор медицинских наук Татьяна Никифоровна Ермак

Ведущее учреждение:

Государственное образовательное учреждение дополнительного профессионального образования «Российская медицинская академия последипломного образования Росздрава»

Защита диссертации состоится «^^Уу) Юг. в 13 часов на заседании Диссертационного совета Д.208.040.05 в Московской Медицинской Академии им. И.М. Сеченова Росздрава (119992, Москва, ул. Трубецкая, д.8, строение 2)

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ГОУ ВПО ММА им. И.М. Сеченова Росздрава (117998, Москва, Нахимовский проспект, д.49)

Автореферат разослан « ' » '_ 20 Юг.

Ученый секретарь

Диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор

Елена Васильевна Волчкова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

В патогенезе вирусных поражений печени особое место отводится аутоиммунным нарушениям, т.к. высокая частота внепечёночных проявлений при хронических гепатитах В и С в сочетании с выявлением широкого спектра аутоантител позволяет предположить роль гепатотропных вирусов в этиологии некоторых аутоиммунных заболеваний. В тоже время остаётся открытым вопрос о значении и месте аутоиммунных нарушений в патогенезе вирусных поражений печени.

В настоящее время существует гипотеза, что прогрессирование вирусных инфекций ассоциируется со специфическими дефектами и дисбалансом в системе Thl и Th2 типа (Царегородцева Т.М., Серова Т.И. 2003, Наследникова И.О., Белобородова Е.В. 2005, Hempel G. 2000, McClary H. 2000, Gramenzi A. 2005). Для Thl типа характерен цитокиновый ответ, ассоциирующийся с продукцией ИФН-у и ИЛ-2 в результате антигенной или митогенной стимуляции мононуклеаров периферической крови, а для Th2 типа цитокиновый ответ ассоциируется с продукцией ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6 и ИЛ -10. Существует гипотеза, что у лиц, формирующих иммунный ответ по первому типу, хронизация вирусных инфекций маловероятна. В случае же формирования персистирующей вирусной инфекции иммунный ответ формируется по второму варианту, причём независимо от возбудителя обязательно присутствует аутоиммунный компонент (Walker B.D., 1996). Предполагается, что основой развития аутоиммунных реакций может быть нарушение баланса цитокинов (ИЛ-1|3 и ФНО-а) за счет активации аутореактивных Т-клеток антигенпредставляющими клетками, в том числе мононуклеарами периферической крови (МНПК). Следствием этого является развитие иммунодефицитного состояния при котором снижается толерантность организма к собственным антигенам (Чепель Э., 2008), но когда происходит присоединение аутоиммунного компонента, в острый или хронический период заболевания, остаётся неустановленным. На этом фоне нарушение дифференцировки Т-клеточного звена приводит к дисбалансу синтеза провоспалительных цитокинов, что способствует реактивации пула аутореактивных лимфоцитов и развитию аутоиммунного процесса.

Известно, что высокий уровень ФНО-а характеризуется иммунологическими реакциями, опосредованными ИФН-у, и в конечном итоге активацией Т-клеточного звена иммунитета, усилением активности натуральных киллеров (NK), росту и дифференцировке В-клеток (Рязанцева Н. В. с соавт. 2005, Сепиашвили Р.И. с соавт. 2000, Ohta A., Sekiraoto M., Sato M. 2000). В настоящее время установлено, что ассоциированный с макрофагами выброс ФНО-а и экспрессируемые Тх1 -лимфоцитами ИЛ-2, ИФН-у связан с активацией и прогрессированием аутоиммунных процессов в паренхиме печени (Лейшнер У. 2005).

В настоящее время рядом авторов при онкологических заболеваниях выявлена особая субпопуляция Т-клеток - комплекс Т-регуляторных клеток CD4+/CD25+ (Т per.), которые проявляют гипопролиферативную активность, обладают способностью угнетать активацию и ингибировать секрецию цитокинов CD4+/CD25+ Т-хелперами и CD8+ и таким образом препятствуют развитию реакций,

направленных на элиминацию чужеродного антигена (Boettler Т, Spangenberg НС, 2005, Fu JL, Xu DP, Shi M, 2006, Xu D, Fu J, Jin L„ 2006),в тоже время комплекс CD4+/CD25+ (Т per.) сдерживают активацию аутореактивных Т и В лимфоцитов, тем самым препятствуют развитию аутоиммунных реакций (Рабсон А., Ройт А., Делвз П., 2006). Но все эти исследования были проведены при изучении пула регуляторных Т лимфоцитов в сыворотке крови. Данных по изучению роли комплекса Т per. лимфоцитов (CD4+/CD25t) в паренхиме печени при хронических вирусных гепатитах в инициации иммунного ответа в доступной нам литературе отсутствуют.

В связи с выше изложенным представляло интерес установить наличие аутоиммунных проявлений (ASMA, ANA, AMA, РФ, КГ) у больных острыми и хроническим вирусными гепатитами в сопоставлении с показателями цитокинового профиля (ФНО-а, HJI-ip, ИЛ-6). Так как при хронических вирусных гепатитах аутоиммунные нарушения достигают максимальной выраженности, необходимо было изучить в органе-мишени (печени) морфологическую основу формирования этих реакций. С этой целью необходимо проанализировать популяционный состав лимфоцитов в гепатобиоптате и в сыворотке крови. Особое место следует уделить выявлению комплекса Т-регуляторных клеток (CD4+CD25+> в биоптате на фоне изучения гистологической активности и фиброза в сопоставлении со спонтанной и индуцированной продукцией цитокинов МНПК в сыворотке крови. На основании полученных данных попытаться определить роль этих показателей в развитии аутоиммунных проявлений при хронических вирусных гепатитах и возможные пути коррекции этих нарушений.

Цель исследования - сопоставить уровень процитокинов воспаления в сыворотке крови, субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови и характер клеточной популяции в печеночной ткани для определения их роли в реализации аутоиммунных проявлений в патогенезе вирусных гепатитов.

Задачи исследования:

1. Изучить у больных острыми и хроническими вирусными гепатитами наличие ASMA, AMA, ANA, a-LKM-1, криоглобулинов и ревматоидного фактора в сыворотке крови при различной степени тяжести болезни и активности процесса в ткани печени.

2. Исследовать в динамике заболевания уровни цитокинов (ИЛ-ip, ИЛ-6, ФНО-а) в сыворотке крови при ОВГ различной этиологии.

3. Исследовать уровни цитокинов (ИЛ-10, ИЛ-6, ФНО-а) в сыворотке крови при ХВГВ и С.

4. Сопоставить изменения цитокинового профиля в сыворотке крови у больных острым и хроническими ВГ с наличием у них аутоиммунных нарушений и без них.

5. Изучить концентрацию цитокинов ИФН-а, ИФН-у, ФНО-а.ИЛ-ip, ИЛ-4, ИЛ-6 в сыворотке крови у больных хроническими вирусными гепатитами В и С в сопоставлении с показателями гистологической активности и фиброза в печеночной ткани.

6. Изучить спонтанную и индуцированную NDV и ФГА продукцию цитокинов ИФН-а, ИФН-у, ФНО-а, ИЛ-lp, ИЛ-4, ИЛ-6 МНПК у больных ХГВ и С с различными показателями гистологической активности и фиброза в печеночной ткани.

7. Определить субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови в сопоставлении с уровнем гистологической активности и фиброза в печеночной ткани у больных хроническими вирусными гепатитами В и С.

8. Исследовать особенности лейкоцитарной инфильтрации печени у больных хроническими вирусными гепатитами В и С в сопоставлении с активностью гепатита и выраженностью фиброза.

9. Определить фенотип печень-ассоциированных лимфоцитов иммуногистохимическим и иммуноцитохимическим методом у больных ХГВ и ХГС.

Научная новизна исследования.

Впервые у больных острыми вирусными гепатитами в динамике заболевания и у больных ХВГВ и ХВГС различной степени активности проведено комплексное определение маркеров аутоиммунных проявлений (аутоанител, криоглобулинемии и ревматоидного фактора).

Показана динамика аутоантител, ревматоидного фактора и криоглобулинов у больных с острыми вирусными гепатитами на ранних этапах инфекционного процесса. У больных хроническими вирусными гепатитами В и С выявлены аутоантитела, криоглобулины и ревматоидный фактор в высоких титрах.

Установлено, что наличие аутоиммунных проявлений у больных ОВГ не зависят от выраженности цитолитического синдрома.

Изучена динамика цитокинов у больных ОВГ и ХВГ в сопоставлении с наличием аутоантител и показано, что у больных ОВГА и ОВГВ с аутоантителами концентрации ИЛ-1Р и ФНО-а значительно выше, чем у больных без аутоантител, а у больных ОВГС легкого течения с аутоантителами уровень ИЛ-1Р умеренно превышает контрольные значения на фоне нулевых значений ФНО-а и ИЛ-6. У больных ХВГС с умеренной степенью активности и у больных с ХВГС с исходом в цирроз без аутоиммунных проявлений уровни ИЛ-6 и ФНО-а были достоверно выше, чем у больных с аутоиммунными нарушениями.

Выявлена прямая связь между уровнем ИЛ-1(3, ФНО-а и наличием аутоиммунных проявлений, что связано с дисбалансом провоспалительных цитокинов, активацией В-лимфоцитов, их клональной пролиферацией и продукцией широкого спектра аутоантител с образованием иммунных комплексов.

Впервые установлено, что у больных хроническими вирусными гепатитами отсутствуют резервные возможности МНПК вырабатывать ИФН-а, следовательно, развивается иммунодефицитное состояние при котором снижается толерантность организма к собственным антигенам.

Впервые расшифрован фенотип иммунных клеток лейкоцитарных инфильтратов паренхимы печени у больных ХГВ и ХГС, выявлены популяции Т-лимфоцитов СОЗ+, цитоксических лимфоцитов С08+, Т регуляторных. лимфоцитов С04+СБ25+, Ж- клеток С016+С056+, ЫКТ- клеток С03+С016+СБ56+.

Впервые в гепатобиобтатах у больных ХВГС умеренной и высокой степени активности обнаружен комплекс Т регуляторных лимфоцитов (СБ4+СБ25+), что свидетельствует о возможности развития персистирующей вирусной инфекции с аутоиммунным компонентом.

Практическая значимость работы.

Выявленное наличие аутоиммунных проявлений у больных вирусными гепатитами на ранних этапах заболевания позволяет рекомендовать исследование сыворотки крови больных ОВГ на наличие маркеров аутоиммунных нарушений (неорганоспецифические аутоантитела, ревматоидный фактор, криоглобулины) для решения вопроса о необходимости дальнейшего наблюдения и прогнозирования течения заболевания.

Для адекватной оценки активности и прогноза инфекционного процесса необходимо проводить комплексное обследование больных хроническими вирусными гепатитами В и С, включающее в себя выявление аутоиммунных проявлений, концентрации цитокинов не только в сыворотке крови, но и изучение стимулированной ЫЭУ и ФГА продукции цитокинов МНПК, а также определение субпопуляции лимфоцитов периферической крови для подбора адекватного противовирусного лечения

Снижение стимулированной №)У продукции ИФН-а МНПК может рассматриваться в качестве диагностического критерия состояния иммунодефицита, а также применяться для определения лечебной тактики.

При оценке морфофункционального состояния гепатобиобтатов у больных хроническими вирусными гепатитами В и С прогностическим критерием является не только гистологическая активность и выраженность фиброза, но и субпопуляционный состав лейкоцитарных инфильтратов в паренхиме печени.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. На ранних этапах острых вирусных гепатитов выявляются клинико-лабораторные признаки формирования аутоиммунных проявлений.

2. Характер изменений провоспалительных цитокинов находится в соответствии с выявленными нами аутоиммунными проявлениями у больных ОВГ.

3. У больных хроническими вирусными гепатитами выявляются клинико-лабораторные признаки формирования аутоиммунных проявлений не зависимо от степени гистологической активности .

4. Характер изменений баланса цитокиновой продукции ТЫ/ТЬ2 находится в соответствии с выявленными нами аутоиммунными проявлениями у больных ХВГ.

5. Отражением аутоиммунных процессов у больных ХВГ, не зависимо от этиологии, по мере нарастания выраженности перипортальных некрозов и портального воспаления, внутридольковой дегенерации и фиброза, является нарушение субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови.

6. Характер лимфоидной инфильтрации в ткани печени у больных хроническими вирусными гепатитами В и С является основой для реализации аутоиммунных реакций в клинике данных нозологических форм.

Внедрение полученных результатов в практику.

Результаты проведенного исследования и практические рекомендации используются в процессе преподавания на кафедре инфекционных болезней ММА имени И.М. Сеченова и в практике работы 2-й клинической инфекционной больницы г.Москвы.

Апробация работы.

Работа выполнена на кафедре инфекционных болезней Московской медицинской академии имени И.М. Сеченова (зав. кафедрой, член-корр. РАМН, профессор С.Г. Пак).

Тема диссертационной работы является фрагментом комплексной темы кафедры «Интоксикация при бактериальных, и вирусных инфекциях: патогенез и механизмы адаптации», № 01.200.110439.

Материалы диссертационной работы были доложены на научно-практической конференции «Инфекционные болезни на рубеже XXI века» (2426 мая 2000г.), на Шестой Российской конференции «Гепатология сегодня» (20-23 марта 2001г., Москва), на научно-практической конференции «Инфекционные и паразитарные болезни в современном обществе. Клинико-лабораторное обеспечение инфектологии» (22-23 мая 2003 г., Москва), на научно-практической конференции КИБ №2 (5июня 2003 г.), на VI Российском съезде врачей-инфекционистов С.Петербург 2003 г., на Пятой научно-практической конференции «Инфекционные болезни и антимикробные средства» (4-5 ноября 2007г., Москва), на научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы гастроэнтерологии» (14 декабря, 2007 г., Москва), на Евроазиатском конгрессе инфекционистов (4-6 июня 2008 г., г. Витебск, Беларусь).

Отдельные фрагменты работы опубликованы в журналах «Терапевтический архив», «Военно-медицинский журнал», «Эпидемиология и инфекционные болезни», «Врач», «Российский журнал Гастроэнтерологии, Гепатологии, Колопроктологии».

Диссертация апробирована на совместном заседании кафедры инфекционных болезней МПФ и лаборатории по изучению токсических и септических состояний при кафедре ММА имени И.М. Сеченова 4 марта 2010г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 44 научные работы.

Объем и структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 7 глав собственных наблюдений, заключения с обсуждением полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа изложена на 343 страницах машинописного текста, иллюстрирована 84 таблицами, 98 рисунками и 8 фотографиями. Библиографический указатель содержит 412 источников литературы (отечественных 67, зарубежных 345).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования.

Проведено клиническое обследование 606 больных вирусными гепатитами различной этиологии, из них 447 больных острыми вирусными гепатитами (167 больных ОВГА, 125 ОВГВ, 137 ОВГС, 18 ОВГД) и 159 больных хроническими вирусными гепатитами (15 больных ХВГВ и 144 ХВГС) на базе ИКБ №2 г. Москвы с 1997-2008 г.

Больные были разделены на группы по степени тяжести в соответствии с инструкцией Министерства Здравоохранения СССР № 408 от 12.07.88г и приказу Комитета Здравоохранения г. Москвы №283 от 06.07.2000г «О совершенствовании медицинской помощи больным вирусными гепатитами» (таблицы 1,2).

Больные острыми вирусными гепатитами обследовались двухкратно: в разгар клинических проявлений, на высоте выраженности интоксикационного

синдрома (1 период) и в периоде ранней реконвалесценции, т.е. в момент клинического выздоровления, но на фоне отсутствия полной нормализации биохимических показателей функции печени (2 период). Больные хроническими вирусными гепатитами обследовались однократно.

В целях верификации этиологии вирусного поражения печени определялись серологические маркеры в сыворотке крови методом ИФА: HBsAg, anti-HBcor IgM, anti-HAV IgM, anti-HCV IgM, anti-HCV IgG, anti-HDV IgM, anti-HDV IgG. Для дополнительного подтверждения диагноза ОВГС в сыворотке крови этой группы больных определяли белки core, NS3, NS4, NS5.

Активная репликация вируса у больных хроническим вирусным гепатитом С подтверждена полуколичественным методом ПЦР на HCV-PHK в сыворотке крови с определением генотипа вируса. Всем больным с хроническим вирусным гепатитом В был выполнен полуколичественный анализ для выявления HBV-ДИК методом ПЦР в сыворотке крови.

Методом непрямой иммунофлуоресценции установлены ASMA, AMA, ANA (набор реагентов ATS COMVI-I IMMCO Diagnostic США). Anti-LKM-1 были определены методом иммуноферментного анализа (набор реагентов ImmuLisa Anti-Liver-Kindey Microcomal (anti-LKM-1) Antibody ELAISA IMMCO Diagnostic США). Криоглобулины исследованы качественным визуализационным методом. Ревматоидный фактор (РФ) определялся в сыворотке полуколичественным методом латекс-агглютинации на слайде производства фирмы HUMAN (Германия) в соответствии с рекомендациями фирм производителей.

Для оценки цитокинового профиля у больных острыми и хроническими вирусными гепатитами изучена концентрация цитокинов (ИФН-а, ИФН-у, ФНО-а, ИЛ-lß, ИЛ-4, ИЛ-6) в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа (тест-системы ООО «Протеиновый контур» С-Петербург), а у больных с ХВГ также спонтанная и стимулированная NDV и ФГА продукции данных цитокинов МНПК. Иммунный статус у больных ХВГ изучен с помощью определения CD3, CD4, CD8, CD16, CD25, HLADR, CD20, CD38 антигенов методом иммунофлюоресценции. Данные исследования проведены в лаборатории клеточного иммунитета ГУ РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН (зав. лабораторией д.м.н., проф. М.В. Киселевский).

Больным с ХВГ проводилась аспирационная пункционная биопсия печени по Менгини с последующим гистологическим и морфологическим исследованием полученных биоптатов печени. Полученные гистологические препараты окрашивали гематоксилин-эозином для выявления лимфоидной инфильтрации печени и пикрофуксином по Ван-Гизону для выявления соединительной ткани. В лаборатории клеточного иммунитета ГУ РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН методом иммуногистохимии на криосрезах и иммуноцитохимии на мононуклеарных клетках, выделенных из биоптатов, определяли иммунофенотип клеток печени. Из мононуклеарных лейкоцитов гепатобиоптатов были приготовлены мазки, которые окрашивались эозин-азуром по Романовскому-Гимза и по Браше с контрольной обработкой РНК-азой. Световую микроскопию и фотографирование иммунных клеток печени в окрашенных мазках проводили с помощью фотовидеосистемы Axioplan 2 (фирмы Carl Zeiss, Германия).

Проводили традиционные общеклинические анализы крови и мочи, биохимическое исследование крови, а также по показаниям проводилось ультразвуковое исследование печени.

Таблица 1.

Распределение больных острыми вирусными гепатитами А. В. С и Д по тяжести течения заболевания, полу и возрасту.

Этиология и степень тяжести кол-во больных пол Возраст больных (в годах) средний возраст

муж жен 15- го 2130 3140 41 и выше

А л/т 48 46 2 17 17 11 3 27,19±1,35

с/т 119 90 29 48 47 18 6 24,72±0,79

В л/т 21 19 2 5 13 2 1 25,33±1,42

с/т 104 89 15 39 45 16 4 24,80±0,72

С л/т 44 39 5 20 19 3 2 23,70±1,11

с/т 93 85 8 34 38 14 7 25,76±0,97

д л/т 0 - - - - - - -

с/т 18 17 1 8 9 - 1 23,17±1,73

итого 447 385 62 171 188 64 24 25,09±0,40

Таблица 2.

Распределение больных хроническими вирусными гепатитами В и С по возрасту и полу.

Этиология и степень тяжести кол-во бол-х пол Возраст больных (в годах) средний возраст

м ж 15- го 2130 3140 41 и >

минимап. 6 5 1 1 4 - 1 27,0±4,34

В низкая 4 3 1 1 2 1 - 24,5±3,66

умеренная 1 1 0 - - 1 - 31

С минимал. 46 37 9 9 13 7 17 36,2±2,25

низкая 35 26 9 5 11 5 14 37,9±2,85

умеренная 35 28 7 4 18 4 9 32,94±2,62

цирроз 28 14 14 - 2 2 24 54,36±2,70

Д низкая 1 1 - - 1 - - 21

умеренная 2 2 - - 1 1 - 32,0±2,82

цирроз 1 1 - - 1 - - 24

итого 159 118 41 20 53 21 65 38,10±1,34

Результаты клинических и лабораторных исследований внесены в карты индивидуального обследования. При статистической обработке результатов исследования количественные признаки выражались как M±s (среднее ± стандартное отклонение). Частотные признаки (число лиц с наличием или отсутствием признака) выражались в процентах. Для выявления межгрупповых различий при условии нормального распределения количественного признака использовался критерий Стьюдента, в других случаях применялись методы непараметрической статистики: критерий %2, коэффициент корреляции Пирсона (г) и Спирмена (rS) Все различия считались достоверными при значении р<0,05. Статистическая обработка данных проводилась с использованием стандартного пакета программ Statistica for Windows (2000, версия 6.0) фирмы Statsoft Inc. и пакета программ Microsoft Excel (2003) корпорации Microsoft.

Результаты исследований и их обсуждение.

В результате проведённого исследования, у больных ОВГА, ОВГВ, ОВГС и ОВГД нами установлено наличие аутоантител на раннем этапе клинических проявлений, в разгар интоксикации (в 1-ом периоде) и в периоде ранней реконвалесценции (во 2-ом периоде).

Среди больных ОВГА в разгар клинических проявлений ASMA определялись в диагностических тирах у 50% больных легкого и 70,8% больных ОВГА среднетяжелого течения, в периоде ранней реконвалесценции у 42,9% и 63% соответственно; AMA диагностировали у 25% больных легкого течения и у 17% больных среднетяжелого течения в 1-ом периоде, а во 2-ом периоде у 14,3% и 6,2% больных соответственно. ANA обнаружили у больных ОВГА легкого течения в

1-ом периоде у 7,2% и во 2-ом периоде у 3,6% больных, у больных среднетяжелого течения у 4,6% больных в 1-ом периоде и у 6,2% больных во

2-ом периоде (таблица 3). По сравнению с ASMA и AMA ANA определялись реже (до 4 больных). Однако, ANA диагностировали как среди больных ОВГА легкого, так и среднетяжелого течения в разгар клинических проявлений и в периоде ранней реконвалесценции в тирах от 1:5 до 1:80. Следует отметить, что среди больных ОВГА легкого течения ANA в 1 периоде выявляли в титре 1:40 и 1:80, во 2-м периоде в титре 1:40, а среди больных среднетяжелого течения от 1:5 до 1:40, причем титр 1:40 диагностировали только во 2 периоде заболевания. ANA - антитела против основных компонентов ядра клетки (нуклеопротеида и белка хроматина) и появляются они при более глубокой деструкции гепатоцитов. Невысокая частота выявления ANA от 3,6% до 6% среди больных ОВГА свидетельствует об отсутствии длительного течения цитолитического синдрома с выраженной деструкцией гепатоцитов до ядерного материала, что подтверждает патогенез ВГА, для которого характерна кратковременная вирусемия, сопровождающаяся непродолжительным цитолизом без глубоких деструктивных поражений паренхимы печени (Шейлок Ш. 1999), сменяющаяся быстрой элиминацией вируса.

Существуют различные точки зрения на патогенетическое значение аутоантител, причем часть авторов считает, что они не имеют клинического значения (Fried M.W,et al. 1993, Meyer zum Buschenfelde K.H. et al. 1995.), другие же указывают на развитие аутоиммунного гепатита I типа после перенесенного ВГА как у взрослых (Vento S. et al. 1991, Clifford BD. .et al.1995, Tagle Arrospide M., leon Barua R. 2003), так и y детей (Huppertz H.I. et al. 1995), причём вирус гепатита A выполняет роль триггера в развитии АИГ.

Частота выявления аутоантител у больных ОВГА

Луто-антитеяя титр легкое течение (п=28) среднетяжелое течение (п=65)

1 пе □иод 2 пе риод 1 пе эиод 2 пе эиод

АБМА абс. % абс. % абс. % абс. %

отр. 14 50 16 57,1 19 29,2 24 37

1 10 0 0 0 0 1 1,5 2 3

1 20 4 14,3 3 10,7 12 18,5 15 23

1 40 1 3,6 5 17,9 22 33,8 18 27,7

1 80 4 14,3 4 14,3 9 13,8 5 7,7

1:160 5 17,9 0 0 2 3,1 1 1,5

АЫА отр. 26 92,8 27 96,4 62 95,4 61 93,8

1:5 0 0 0 0 0 0 2 3,1

1:10 0 0 0 0 2 3,1 0 0

1:20 1 3,6 0 0 1 1,5 0 0

1:40 1 3,6 1 3,6 0 0 2 3,1

1:80 0 0 0 0 0 0 0 0

АМА отр. 21 75 24 85,7 54 83 61 93,8

1:20 0 0 0 0 2 3,1 1 1,5

1:40 7 25 4 14,3 6 9,2 1 1,5

1.80 0 0 0 0 3 4,6 2 3,1

Таблица 4

Сравнительная характеристика биохимических показателей больных ОВГА легкого течения заболевания в зависимости от наличия аутоантител_

Б\х Показ. Билирубин прямой (мкмоль/мл) Билирубин непрямой (мкмоль/мл) АЛТ (ед/л) АСТ (ед/л)

Период 1 2 1 2 1 2 1 2

Л/т с АТ п=14 116,2 ±15,0 21,7 ±4,5 * 70,9 ±12,5 23,0 ±4,2 * 1534,4 ±207,8 300,1 ±37,4 * 975,2 ±184,8 197,7 ±32,3 *

Л/т без АТ п=14 100,4 ±25,2 18,7 ±5,2 * 54,1 ±6,4 20,5 ±3,1 * 1554,3 ±254,6 267,2 ±39,4 * 1271,6 ±343,4 147,3 ±25,8 *

Норма 0-5 До 24,4 До 40 До 40

*- достоверные различия показателей в динамике заболевания, достоверные различия между группами больных

Таблица 5.

Сравнительная характеристика биохимических показателей больных

ОВГА легкого течения заболевания в зависимости от наличия аутоантител

Показатель Общий белок (Г\л) ЩФ (ед\л) ГГТ (ед\л)

Период 1 2 1 2 1 2

Л/т с АТ 67,2 ± 72,4 589,4 433,2 239,9 142,0

п=14 2,0 ±2,3 ±60,8** ±28,0** ±73,9 ±18,4

Л/т без АТ 73,9 72,6 479,5 333,7 214,8 134,0

п=14 ±2,5 ± 1,6 ±37,0 ±30,4 ±44,1 ±31,5

Норма 60-80 До 170 До 70

*- достоверные различия показателей в динамике заболевания. **- достоверные различия между группами больных

Таблица 6

Сравнительная характеристика биохимических показателей больных ОВГА среднетяжелого течения заболевания в зависимости от наличия аутоантител.

Б\х Показ. Билирубин прямой (мкмоль/мл) Билирубин непрямой (мкмоль/мл) АЛТ (ед/л) АСТ (ед/л)

Период 1 2 1 2 1 2 1 2

С/т с АТ п=46 121,3 ±7,9** 17,0 ±2,3* 55,9 ±3,9 25,8 ±1,7* 1547,7 ±84,4 317,3 ±20,9* 979,3 ±90,0 201,9 ±15,3*

С/т без АТ п=19 79,4 ±7,7 10,7 ±2,9* 44,8 ±4,9 26,6 ±1,9* 1404,6 ±104,3 350,7 ±29,4* 742,2 ±93,8 215,0 ±25,0*

Норма 0-5 До 24,4 До 40 До 40

*- достоверные различия показателей в динамике заболевания. **- достоверные различия между группами больных

Таблица 7

Сравнительная характеристика биохимических показателей больных ОВГА среднетяжелого течения заболевания в зависимости от наличия аутоантител

Показатель Общий белок ЩФ (ед\л) ГГТ (ед\л)

(г\л)

Период 1 2 1 2 1 2

С/т с АТ 78,9 ± 90,4 528,7± 369,6± 216,9 225,5

п=46 2,0 ±11,0 91,7 35,2 ±53,7 ±44,7

С/т без АТ 73,6 81,7 489,6 365,1 229,5 108,1

п=19 ±2,6 ±2,9 ±34,4 ±28,6 ±57,2 ±18,3

Норма 60-80 До 170 До 70

*- достоверные различия показателей в динамике заболевания. **- достоверные различия между группами больных

1 период 2 период □ л/т Ос/т

1 период 2 период Нл/т Шс/т

Рисунок 1. Распределение криоглобулинов у больных ОВГА в зависимости от тяжести течения заболевания.

Рисунок 2. Распределение ревматоидного фактора у больных ОВГА в зависимости от тяжести течения заболевания

Частота выявления аутоантител у больных

1 период 2 период

Аутоантитела Титр Количество больных

абс % абс %

отр. 13 31 16 38,1

1 10 2 4,8 0 0

ASMA 1 20 12 28,5 9 21,4

1 40 12 28,5 15 35,7

1 80 3 7,2 2 4,8

1:160 0 0 0 0

отр 40 95,2 42 100

1:5 1 2,4 0 0

ANA 1 10 1 2,4 0 0

1 20 0 0 0 0

1 40 0 0 0 0

1 80 0 0 0 0

Таблица 9

Сравнительная характеристика биохимических показателей больных ОВГВ среднетяжелого течения заболевания в зависимости от наличия аутоантител.

Б\х Показ. Билирубин прямой (мкмоль/мл) Билирубин непрямой (мкмоль/мл) АЛТ (ед/л) ACT (ед/л)

Период 1 2 1 2 1 2 1 2

С/т с AT п=29 139,2 ±12,9 14,3 ±1,9 * 64,2 ±6,6 25,5 ±1,3 * 1466,6 ±52,5 304,1 ±13,3 * 834,7 ±42,3 288,6 ±17,6 *

С/т без AT п=13 140,6 ±16,4 17,3 ±4,4 * 82,5 ±8,9 28,8 ±2,7 * 1503,8± 63,4 295,8 ±17,9 * 815,4 ±35,8 280,3 ±26,6 *

Норма 0-5 до 24,4 до 40 до 40

*- достоверные различия показателей в динамике заболевания.

Рисунок 3. Частота выявления аутоантител у больных ОВГД тяжелого течения

В связи с этим представляло интерес изучить динамику биохимических показателей цитолиза гепатоцитов у больных с наличием иммунных нарушений и при их отсутствии в сопоставлении с тяжестью заболевания (таблицы 4-7).У больных ОВГА легкого течения с наличием аутоиммунных нарушений и без аутоиммунных проявлений показатели цитолиза (AJIT, ACT),

уровень ГГТ достоверно не отличались. Также не было достоверных различий в показателях уровнях билирубина и общего белка. Уровень ЩФ у больных с аутоиммунными нарушениями был выше по сравнению с группой больных без аутоантител в 1 и 2-ом периоде. Известно, что образование AMA связано с перекрестными реакциями антигена клеток желчных протоков и микроорганизмов (Шерлок Ш. 1999, Чепель Э. 2008) и сопровождается нарушением оттока желчи и накоплением её в канальцах, возможно, из-за разрушения желчных протоков среднего калибра. AMA перекрестно реагируют с субклеточным компонентом грамотрицательных и грамположительных бактерий, белки чувствительные для AMA выявляются в некоторых видах энтеробактерий и вероятно эти аутоантитела изначально направлены против антигенов энетробактерий (Шерлок Ш. 2002), возможно с этим и связан большой процент встречаемости синдрома холестаза у взрослых. Следовательно, у больных с аутоиммунными нарушениями риск развития холестаза выше

У больных ОВГА среднетяжелого течения с наличием аутоиммунных нарушений уровень билирубина был достоверно выше в 1 периоде заболевания (р<0,05) по сравнению с группой больных среднетяжелого течения без аутоиммунных нарушений. Достоверных различий в показателях цитолиза (AJIT, ACT), уровнях ГГТ, ЩФ и общего белка между больными ОВГА с аутоантителами и без них не было (таблицы 6-7).

При ОВГА о писаны системные иммунные нарушения в виде криоглобулинемии (КГ), появление ревматоидного фактора (РФ), развитие васкулитов, нефрита.

Поэтому представляло интерес изучить динамику уровня КГ и РФ у 20 больных ОВГА легкого течения и у 25 больных ОВГА среднетяжелого течения в сыворотке крови в 1-ом и 2-ом периоде заболевания. Было установлено наличие КГ у 45% больных ОВГА легкого течения в 1-ом периоде и у 15% во 2-ом периоде, у больных ОВГА среднетяжелого течения КГ были определены у 64% больных в 1-ом периоде и у 36% больных во 2-ом периоде (рисунок 1). У 45% больных ОВГА легкого течения и 64% больных среднетяжелого течения было установлено наличие КГ в 1-ом периоде и выявлен мочевой синдром ("мочевой синдром" входит протеинурия, гематурия, лейкоцитурия и цилиндрурия), который сохранялся к моменту реконвалесценции у 15% больных ОВГА легкого течения и 36% больных среднетяжелого течения. Полученные нами данные свидетельствуют, что у больных ОВГА развитие мочевого синдрома, вероятно, связано со смешанной криоглобулинемией, так как первый тип мембранопролиферативного гломерулонефрита в настоящее время ассоциируется с вирусной инфекцией (Crovatto М. et al. 2002).

РФ установлен у 6 (30%) больных ОВГА легкого течения в 1-ом периоде наблюдения и у 4 (20%) во 2-м периоде. В группе больных ОВГА среднетяжелого течения РФ выявлен у 11(44%) больных в 1-ом периоде наблюдения и у 7 (28%) во 2-ом периоде (рисунок 2). Частота выявления РФ в диагностических титрах как в 1-ом, так и во 2-ом периоде заболевания достоверно выше у пациентов группы среднетяжелого течения. Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что подобные аутоиммунные проявления возникают уже на ранних стадиях ОВГА, что совпадает с единичными сообщениями, имеющимися в доступной нам литературе.

Среди больных ОВГВ аутоантитела определялись у больных среднетяжелого течения. При обследовании 42 больных ОВГВ среднетяжелого течения мы обнаружили ASMA у 69% из них в 1-ом периоде и у 62% во 2-ом периоде, ANA у 4,7% больных только в 1-ом периоде и ни у одного больного во 2-ом периоде, AMA мы не установили ни в 1-ом ни во 2-ом периоде (таблица 8).

Наличие аутоантител при острых вирусных гепатитах в разгар клинических проявлений объясняется массивным распадом гепатоцитов и обнаружение этих аутоантител отражает выраженность цитолитического синдрома. Следовательно, отсутствие аутоантител при ОВГВ легкого течения можно объяснить тем, что время обследования этих больных совпало с периодом стихания интоксикационного синдрома и купированием синдрома цитолиза.

У больных ОВГВ среднетяжелого течения с наличием аутоиммунных нарушений и без аутоиммунных проявлений показатели цитолиза (AJIT, ACT) достоверно не отличались, также не было достоверных различий в показателях уровня билирубина (таблица 9). Полученные результаты свидетельствуют об отсутствии прямой зависимости аутоиммунных нарушений от распада гепатоцитов. Появление аутоантител, вероятно, связано с активацией аутореактивных Т-клеток путем молекулярной мимикрии собственных антигенов высоким уровнем вирусемии.

При обследовании 18 больных ОВГД тяжелого течения на наличие AMA, ASMA и anti-LKM-1 были обнаружены AMA в титре 1:160 у 11% больных, ASMA в титре 1:160 и anti-LKM-ly 1 5,5% больных как в 1-ом, так и во 2-ом периоде (рисунок 3). Обнаружение AMA и ASMA в высоких титрах у больных ОВГД подтверждает общепринятое мнение о выраженной деструкции гепатоцитов при ОВГД.

У больных ОВГС аутоантитела определялись как у больных легкого, так и среднетяжелого течения. Среди 43 больных ОВГС легкого течения мы обнаружили ASMA у 23,3% из них в 1-ом периоде и у 9,3% во 2-ом периоде, ANA у 4,7% больных в 1-ом периоде и у 3 7% больных во 2-ом периоде, AMA выявили у 16,2% больных в 1-ом периоде и не обнаружили ни у одного больного во 2-ом периоде, анти-LKM-l мы не выявили в разгар клинических проявлений и только в периоде реконвалесценции обнаружили у 2,3% больного. При обследовании 92 больных ОВГС среднетяжелого течения мы установили ASMA у 29,3% больных в 1-ом периоде и у 15,2%во 2-ом периоде, ANA в 1-ом и во 2-ом периоде определялся у 4,3% больных, AMA выявили у 15,2% больных в 1-ом периоде и у 4,3% больных во 2-ом периоде, anti-LKM-1 были установлены у 3,3% больных в разгар клинических проявлений и сохранялись к периоду реконвалесценции (таблица 10).

Обнаруженные ASMA, AMA и ANA в разгар клинических проявлений у больных ОВГС легкого течения отражают выраженность цитолитического синдрома в результате деструкции гепатоцитов, что косвенно подтверждается отсутствием ANA и исчезновением у основного числа пациентов ASMA и AMA к периоду реконвалесценции в результате раннего купирования синдрома цитолиза.

Выявление у больных ОВГС среднетяжелого течения ASMA, AMA и ANA как в 1-ом, так и во 2-ом периоде - это следствие продолжающейся персистенции HCV, в результате которой происходит активация аутореактивных Т-клеток путем молекулярной мимикрии собственных антигенов с антигенами вируса. AMA, как правило, выявляются редко и в низких титрах.

Таблица 10

Частота выявления аутоантител у больных ОВГС_

Ауто-антитела титр легкое течение (п=43) среднетяжелое течение (п=92)

1 период 2 период 1 период 2 период

АБМА абс. % абс. % абс. % абс. %

отр. 33 76,7 39 90,6 65 70,6 78 84,8

1:20 1 2,3 0 0 1 1,1 1 1,1

1:40 3 7 2 4,7 10 10,9 9 9,8

1:80 5 11,7 2 4,7 10 10,9 3 3,2

1:160 1 2,3 0 0 6 6,5 1 1,1

АИА отр. 41 95,3 40 93 88 95,7 88 95,7

1:20 0 0 0 0 0 0 0 0

1:40 2 4,7 3 7 3 3,3 4 4,3

1:80 0 0 0 0 1 1 0 0

АМА отр. 36 83,7 43 100 78 84,8 88 95,6

1:20 2 4,7 0 0 5 5,4 1 1,1

1:40 4 9,3 0 0 7 7,6 2 2,2

1:80 1 2,3 0 0 2 2,2 1 1,1

апй-ЬКМ-1 есть 0 0 1 2,3 3 3,3 3 3,3

Таблица 11

Сравнительная характеристика биохимических показателей больных ОВГС легкого течения заболевания в зависимости от наличия аутоантител_

Б\х Показ. Билирубин прямой (мкмоль/мл) Билирубин непрямой (мкмоль/мл) АЛТ (ед/л) АСТ (ед/л)

Период 1 2 1 2 1 2 1 2

Л/т с АТ п=10 3,7 ±0,9 1,9 ±0,5 25,8 ±4,1 22,9 ±4,6 171,5 ±19,5 195,1 ±31,4 138,1 ±20,3 109,4 ±14,2

Л/т без АТп=33 13,7 ±8,5 3,5 ±0,7* 22,2 ±3,1 17,1 ±1,5 192,7 ±25,2 150,3 ±21,2 182,5 ±37,9 95,6 ±15,0*

Норма 0-5 до 24,4 до 40 до 40

- достоверные различия показателей в динамике заболевания. *- достоверные различия между группами больных

Таблица12 .

Сравнительная характеристика биохимических показателей больных ОВГС легкого течения заболевания в зависимости от наличия;

Показатель Общий белок (Г\л) ЩФ (ед\л) ГГТ (ед\л)

Период 1 2 1 2 1 2

Л/т с АТ 74,7 ± 77,4 172,4±4 193,2± 90,0 89,3

п=10 2,5 ±2,5 7,3 34,8 ±39,6 ±38,8

Л/т без АТ 84,7 76,8 242,8 244,1 92,7 97,0

п=33 ±25,5 ±1,1 ±23,7 ±20,2 ±23,8 ±12,5

Норма 60-80 до 170 до 70

•-достоверные различия показателей в динамике заболевания. **- достоверные различия между группами больных

В нашем исследовании AMA диагностировались только в 1-ом периоде заболевания. Известно, что у млекопитающих и бактерий есть общность митохондрий, особенно у грамотрицательных энтеробактерий, что может обусловливать перекрестные реакции AMA с субклеточными компонентами грамотрицательных бактерий, в избытке циркулирующих у больных ОВГ при недостаточной дезинтоксикационной функции печени в разгар инфекционного процесса (Шерлок Ш. 2002). Возможно, что AMA с самого начала направлены против антигенов энтеробактерий, и таким образом поддерживают аутоиммунный процесс. Следовательно, появление AMA объясняется перекрестными реакциями с субклеточными компонентами грамотрицательных бактерий, которые активируются в толстом кишечнике в разгар интоксикации. Обнаружение анти-LKM-l напрямую связывают с молекулярной мимикрией между антигенными структурами квазивидов вируса и эпитопами клеток хозяина. У обследованных нами больных ОВГС легкого течения анти-LKM-l определялись только во 2-ом периоде, т.е. при длительной персистенции HCV вируса и достаточном уровне вирусемии, обеспечивающем в результате сходства антигенов HCV с эпитопами клеток хозяина аутореактивность цитолитических лимфоцитов на эпитопы цитохрома Р450 2Д (Kammer A.R, Van der Burg S.H.1999).

У больных ОВГС легкого и среднетяжелого течения с наличием аутоиммунных нарушений и без аутоиммунных проявлений показатели цитолиза (АЛТ, ACT), уровень ГГТ достоверно не отличались. Также не было достоверных различий в показателях уровня билирубина, щелочной фосфатазы, общего белка (таблица 11-14). Появление аутоантител, вероятно, связано с активацией аутореактивных Т-клеток путем молекулярной мимикрии собственных антигенов на фоне высокого уровня вирусемии. Ряд авторов считают, что выявление криоглобулинов и ревматоидного фактора резко нарастает с длительностью инфицирования, т.е. эти аутоиммунные нарушения появляются только на стадиях хронической HCV-инфекции. Поэтому необходимо было изучить динамику уровня КГ и РФ у больных ОВГС в связи с доказанным влиянием криоглобулинов на тяжесть и прогноз патогенетического процесса при ХВГС.

Нами было установлено наличие КГ у 25 (56,8%) больных ОВГС легкого течения в 1-ом периоде и у 12 больных (27,2%) во 2-ом периоде, у больных ОВГС среднетяжелого течения КГ были выявлены у 59 больных (64%) в 1-ом периоде и у 35 больных (38%) во 2-ом периоде (рисунок 4).

В группе больных ОВГС легкого течения РФ установлен у 14 (31,8%) больных в 1-ом периоде наблюдения и у 10 (22,7%) во 2-м периоде. В группе больных ОВГС среднетяжелого течения РФ установлен у 28 (30,4%) больных в 1-ом периоде наблюдения и у 25 (27,2%) во 2-ом периоде (рисунок 5).

Достоверных отличий в частоте выявления РФ у больных ОВГС легкого и среднетяжелого течения в динамике заболевания не было. Обнаруженные КГ и РФ на ранних этапах инфекционного процесса свидетельствуют, что подобные аутоиммунные проявления возникают уже на ранних стадиях инфекционного процесса, в то время, когда большинство исследователей считает, что развитие криоглобулинемии является итогом длительной персистенции вируса (Игнатова Т.М. 2000, Hwang S.J. et al. 1997,Okuda К. et al. 1998, Sim R.B._et al. 1998).

Таблица 13.

Сравнительная характеристика биохимических показателей больных ОВГС среднетяжелого течения заболевания в зависимости от наличия аутоантител._

Б\х Показ. Билирубин прямой (мкмоль/мл) Билирубин непрямой (мкмоль/мл) АЛТ (ед/л) АСТ (ед/л)

Период 1 2 1 2 1 2 1 2

С/т с АТ п=31 39,2 ±8,4 8,7 ±3,0* 38,3 ±5,1 22,2 ±2,4 1162,7 ±150,6 281,1 ±35,9* 565,9 ±89,9 140,8 ±24,5*

С/т без АТ п=61 50,8 ±5,3 12,6 ±1,8* 48,3 ±5,4 20,8 ±1,7* 1264,1 ±102,5 398,8 ±47,7* 780,7 ±82,3 180,2 ±23,5*

Норма 0-5 до 24,4 до 40 до 40

*- достоверные различия показателей в динамике заболевания. **- достоверные различия между группами больных

Таблица 14.

Сравнительная характеристика биохимических показателей больных ОВГС среднетяжелого течения заболевания в зависимости от наличия аутоантител. _ _

показатель Общий белок (г\л) ЩФ (ед\л) ГГТ (ед\л)

Период 1 2 1 2 1 2

С/т с АТ 77,0 ± 79,8 342,0±3 270,3± 143,9 100,4

п=31 3,5 ±1,9 3,5 12,8 ±26,0 ±16,6

С/т без АТ 72,9 73,1 395,0 280,3 177,7 125,3

п=61 ± 1,6 ±1,8 ±31,5 ±21,8 ±18,8 ±13,7

Норма 60-80 до 170 до 70

*- достоверные различия показателей в динамике заболевания. **- достоверные различия между группами больных.

1 период 2 период Ил/т ЕЭс/т

1 период 2 период Ил/т Пс/т

Рисунок4.Распределение криоглобулинов у больных ОВГС в зависимости от тяжести течения заболевания

Рисунок 5. Распределение ревматоидного фактора у больных ОВГС в зависимости от тяжести течения заболевания.

Динамика уровней ИЛ-1р. ИЛ-6 и ФНО-а у больных

Показ. ИЛ-1Р (пг\мл) ИЛ-6 (пг\мл) ФНО-а (пг\мл)

Период 1 2 1 2 1 2

ОВГА л\т X19,15 ± 91,29 ± 5,32 ± 1,0 ± 46,08± 19,54 ±

п=48 37,75 26,89 3,57 0,52 16,71 10,25

#•• #" ** ** #" #"

ОВГА с\т 394.44± 296,54± 22,16± 8,71± 220,45 ± 88,06 ±

п=68 74,79#" 78,3#** 9,20#" 3,42" 61,24#" 18,42#"

ОВГВ л\т 132,1 ± 147,95 ± 2,67± 5,02± 72,95 ± 49,62 ±

п=21 72,52# 89,91# 1,72" 2,80 40,74# 24,39#

ОВГВ с\т 295,27 ± 189,87 ± 26,34± 46,93± 62,7 ± 43,59 ±

п=63 63,05# 53,62# 8,25#" 18,53# 18,85# 18,08#

ОВГС л\т 249,91 ± 35,63 ± 12,83 ± 5,74 ± 105,97 ± 22,27 ±

л=35 105,78 13,13 8,83 6,33 61,48 9,75

# #*" # #*

ОВГС с\т 342,07 ± 202,89 ± 1,91 ± 6,33 ± 107,05± 56,59±

п=59 80,93 49,53 0,77 4,17 25,08 16,02

# #" #

ОВГДт\т 534,35± 313,07± 13,94 ± 0,35± 231,83± 65,0±

п=18 234,96# 197.37# 11,01 0,25 129,67# 42,63#*

Контроль п=20 5,0±0,25 5,0±0,25 5,0±0,25 5,0±0,25 5,0±0,25 5,0 ±0,25

*- достоверные различия показателей в динамике заболевания. **- достоверные различия между группами больных. #- достоверное отличие от контроля.

Таблица 16

Сравнительная характеристика цитокинов у больных ОВГА. ОВГВ. ОВГС

легкого и среднетяжелого течения заболевания в зависимости от наличия аутоантител

цитокины ИЛ-1Р (пкг/мл) ФНО-а (пкг/мл) ИЛ-6 (пкг/мл)

период 1 2 1 2 1 2

ОВГА л/т с АТ 47,7±13,4 43,3±18,1 29,7±9,4 3,8 ± 1,5 0 0

(п=14) # # # *

ОВГА л/т без АТ 117,4±27,7 63,9±17,4 22,6±6,7 3,3 ± 1,6 0 0

(п=14) *# # *

ОВГА с/т с АТ 642,0±81,7 »*# 532,9±61,3 251,3±44,4 88,7± 0 5,2±0,5 *

(п=46) "# 42,9 »#

ОВГА с/т без АТ 423,9±68,0 391,6±51,3 130,3±26,7 83,1±38,5# 0,5±0,1 0

(п=19) "# •»# •»# **

ОВГВ с/т с АТ 734,0± 90,0±28,1 42,0±5,4 3,8 ±1,5 27,0± 6,3±0,9

(п=29) 130,4# ♦# # * 11,5# *

ОВГВ с/т без АТ 170,3± 87,2±30,2 35,2±6,7 5,6±0,9 12,8± 5,2±1,8

(п=13) 98,5**# »# # * 2,9# *

ОВГС л/т с АТ 60,0±13,4# 34,3±9,6 0,5±0,2 12,0 ±1,4 0 0

(п=10)

ОВГС л/т без АТ 317,7±40,2**# 38,3±15,1 138,5±29,7» 27,5±2,0»# 17,3±1,9» 8,6±3,1

(п=33) *# »#

ОВГС с/т с АТ 358,9±45,8# 313,8±58,6# 119,1±20,1# 88,9 ± 24,5# 1,2±0,4 2,3±0,8

(п=10)

ОВГС с/т без АТ 342,2±50,5 144,4±37,8 102,2±33,2 37,5± 11,4 1,9±0,9 7,8±1,6

(п=33) # * "# # ***# # **

Контр, группа п=20 5,0±0,25 5,0±0,25 5,0±0,25 5,0±0,25 5,0±0,25 5,0 ±0,25

*- достоверные различия показателей в динамике заболевания. **- достоверные различия между группами больных. #- достоверное отличие от контроля

Развитие инфекционного процесса сопровождается усилением синтеза провоспалительных цитокинов, стимуляцией экспрессии молекул адгезии и других факторов, способствующих реактивации аутореактивных лимфоцитов и нарастанию аутоиммунного процесса. Учитывая, что в реализации патогенетических механизмов поражения печени основную роль играют провоспалительные цитокины, в частности ИЛ-1Р, ИЛ-6, ФНО-а, которые вырабатываются в результате взаимодействия Т-хелперов с антигенпредставляющими клетками в ответ на внедрение вирусов гепатитов, была изучена динамика уровней этих провоспалительных цитокинов в сыворотке крови у больных с острыми вирусными гепатитами различной этиологии. Уровень ИЛ-1Р, ИЛ-6 и ФНО-а в контрольной группе, представленной 20-ю здоровыми донорами, не превышал 5 пг/мл

У больных ОВГА легкого и среднетяжелого течения концентрация ИЛ-10 превышала контрольные значения (таблица 15) как в 1-ом, так и во 2-ом периоде заболевания, причём у больных ОВГА среднетяжелого течения концентрация ИЛ-1(3 была достоверно выше как в 1-ом, так и во 2-ом периоде заболевания (р<0,05). Содержание ФНО-а в группе ОВГА легкого течения не значительно превышало контрольные значения на высоте интоксикации, и снижалось к периоду ранней реконвалесценции не достигая контрольных значений. Показатели уровней ФНО-а при ОВГА средней тяжести были высокими в 1-м периоде заболевания (р<0,01), достоверно снижаясь в периоде ранней реконвалесценции (р<0,05), но не достигая контрольных значений. При сопоставлении значений ФНО-а у больных ОВГА легкого и среднетяжелого течения было установлено, что концентрация ФНО-а была достоверно выше у больных ОВГА среднетяжелого течения как в 1-ом, так и во 2-ом периоде заболевания. Уровень ИЛ-6 в группе больных ОВГА легкого течения был в пределах нормальных значений, как в 1-м периоде, так и в периоде ранней реконвалесценции, а у больных ОВГА среднетяжелого течения концентрация ИЛ-6 превышала контрольные значения на высоте интоксикации и снижалась к периоду ранней реконвалесценции до контрольных значений.

Высокие значения ИЛ-1Р, ФНО-а и низкий уровень ИЛ-6 у больных ОВГА свидетельствуют о превалировании ответа Тх1типа над Тх2 типа, и подтверждают патогенетическую роль цитотоксических Т-лимфоцитов при ОВГА. В группе больных гепатитом А легкого течения нормальные значения ИЛ-6 сочетаются с повышенным уровнем ИЛ-1(5 и с умеренно повышенным ФНО-а, что вероятно соответствует снижению активности клеточного звена иммунитета на фоне сформированного антительного ответа, поскольку при ОВГА элиминация вируса у основной части больных наступает до развития желтухи.

У больных ОВГА среднетяжелого течения концентрация ИЛ-1(3 и ФНО-а была достоверно выше, чем у больных ОВГА легкого течения, что соответствует более выраженному синдрому цитолиза в данной группе больных. У больных ОВГА среднетяжелого течения максимально повышенный уровень ИЛ-1(3, повышенный уровень ФНО-а и незначительно повышенный уровень ИЛ-6 с максимально повышенным АЛТ по-видимому свидетельствуют о сбалансированном антителоопосредованном и клеточном иммунном ответе, что приводит к быстрому стиханию инфекционного процесса и цитолитического синдрома.

Учитывая господствующее представление о развитии аутоиммунных реакций в результате дисбаланса выработки цитокинов, была изучена динамика цитокинов как у

больных ОВГА с наличием иммунных нарушений, так и при их отсутствии в сопоставлении с тяжестью заболевания (таблицы 16).

У больных ОВГА легкого течения без аутоиммунных реакций уровень ИЛ-1(5 в разгар клинических проявлений был достоверно выше, чем у больных с аутоантитедами, что по-видимому свидетельствует об активном клеточном иммунном ответе, но значения ФНО-а и ИЛ-6 достоверно не отличались как в 1-ом, так и 2-ом периодах у больных с аутоиммунными реакциями и без них. У больных ОВГА среднетяжелого течения с аугоантителами и без них в разгар клинических проявлений концентрации ИЛ-ip и ФНО-а превышала контрольные значения, однако у больных с аутоиммунными реакциями уровень этих цитокинов был достоверно значительно выше. К периоду реконвалесценции уровень ИЛ-ip и ФНО-а снизился, но не достиг контрольных значений.

Высокий уровень ИЛ-ip и ФНО-а у больных ОВГА с аугоантителами в разгар клинических проявлений свидетельствует о более выраженной деструкции гепатоцитов с вовлечением желчных протоков и с возможным развитием холестаза. Вероятно, присутствие ASMA отражает повреждение клеток печени (Шерлок Ш. 1999), так как ASMA относятся к классу IgM к S-акгину гладких и скелетных мышц, который присутствует в клеточной мембране и цитоскелете печеночных клеток. Таким образом, разрушение гепатоцитов подтверждается высокой частотой встречаемости ASMA у больных ОВГА среднетяжелого течения (у 70,8% больных в разгар клинических проявлений и сохранение ASMA у 63% к периоду ранней реконвалесценции). Образование AMA, по-видимому, связано с перекрестными реакциями антигена клеток желчных протоков и микроорганизмов (Чепель Э. 2008.) и сопровождается нарушением оттока желчи и накоплением её в канальцах, возможно, из-за разрушения желчных протоков среднего калибра, что и приводит к развитию синдрома холестаза. Полученные нами результаты подтверждают большую вероятность развития холестаза у больных с аутоантитедами, поскольку у больных ОВГА среднетяжелого течения с аугоантителами уровень ЩФ превышал контрольные значения как 1-ом, так и во 2-ом периоде и был выше, чем у больных без аутоантител.

У больных ОВГВ легкого течения и средней тяжести уровень ИЛ-ip был достоверно высокий как в 1-м, так и во 2-м периоде заболевания (р<0,05) (таблица 15). Концентрация ФНО-а у больных ОВГВ легкого и среднетяжелого течения превышала контрольные значения в 1-м периоде заболевания и имела тенденцию к снижению ко 2 периоду. Уровень ИЛ-6 у больных ОВГВ легкого течения не превышал контрольных значений как в 1-м, так и во 2-м периоде заболевания, а у больных ОВГВ средней степени тяжести концентрация ИЛ-6 как на высоте интоксикации, так и в периоде ранней реконвалесценции превышала контрольные значения.

Общеизвестен факт, что при HBV-инфекции цитолиз гепатоцитов носит антителоопосредованный характер (Шейлок Ш. 1999, Волчкова Е.В. 2004). Это нашло отражение в цитокиновом профиле у больных ОВГВ легкого течения, у которых нормальный уровень ИЛ-6 сочетался с незначительным повышением ИЛ-ip и ФНО-а, что, по-видимому, объясняется временем первичного обследования этих больных, совпадающим со стиханием воспалительного процесса. Высокий уровень ИЛ-1 [i в группе больных ОВГВ средней тяжести на фоне умеренно повышенных значений ИЛ-6 и ФНО-а, косвенно свидетельствует о несбалансированном, незавершенном

иммунном ответе в этой группе больных. Подобный вывод основывается на представлениях о ведущей роли ИЛ-6 и ФНО-а в дифференцировке В-лимфоцитов. Сопоставляя динамику интерлейкинов у больных ОВГВ с динамикой интерлейкинов при ОВГА мы установили, что при ОВГА ведущее значение играет Т-клеточное звено иммунитета, а при ОВГВ преобладает гуморальное, что соответствует общепринятой точке зрения.

Изучена динамика цитокинов у больных ОВГВ средней тяжести с наличием иммунных нарушений и при их отсутствии (таблица 16). В разгар клинических проявлений у больных ОВГВ среднетяжелого течения с аутоиммунными проявлениями выявлена высокая концентрация ИЛ-1р, умеренное повышение ФНО-а и достоверно превышающий контрольные значения уровень ИЛ-б. Полученные результаты свидетельствуют о преобладании клеточного звена иммунитета при адекватном гуморальном ответе в разгар заболевания у больных ОВГВ среднетяжелого течения на фоне аутоиммунных реакций.

В группе больных ОВГС легкого течения уровень ИЛ-1Р был достоверно повышен на высоте интоксикации и снижался к периоду ранней реконвалесценции (таблица 15). Значения ИЛ-1р в группе больных ОВГС средней тяжести достоверно превышали норму на всем протяжении наблюдения (р<0,001), с тенденцией к снижению к периоду ранней реконвалесценции. У больных ОВГС среднетяжелого течения в 1-ом и 2-ом периоде заболевания концентрация ИЛ-1Р была выше, чем у больных легкого течения. Уровень ИЛ-6 у больных ОВГС легкого и среднетяжелого течения достоверно не превышал контрольных значений как на высоте интоксикации, так и в периоде ранней реконвалесценции. Концентрация ФНО-а в группе больных ОВГС как легкого, так и среднетяжелого течения, превышала контрольные значения в разгар клинических проявлений и достоверно снижалась к периоду реконвалесценции, но не достигала контрольных значений, хотя достоверных отличий в концентрации ФНО-а между данными группами не было (р>0,05).

Изучена динамика уровней ИЛ-1Р, ИЛ-6 и ФНО-а у больных ОВГС легкого и среднетяжелого течения с аутоиммунными проявлениями в сопоставлении с группой больных у которых аутоантитела не выявлялись (таблица 16). В разгар клинических проявлений у больных ОВГС легкого течения с аутоиммунными реакциями уровень ИЛ-1Р умеренно превышал контрольные значения на фоне нулевых значений ФНО-а и ИЛ-6. К периоду реконвалесценции концентрация ИЛ-1Р снизилась, не достигая контрольных значений, хотя незначительно повысился уровень ФНО-а. Можно предположить, что нулевые значения ИЛ-6 и ФНО-а в разгар интоксикации свидетельствуют о подавлении клеточного и гуморального звена иммунитета у больных ОВГС легкого течения с аутоиммунными проявлениями. У больных ОВГС легкого течения без аутоантител достоверно высокие значения ИЛ-1р и ФНО-а в разгар клинических проявлений снижались ко 2-ому периоду, не достигая контрольных значений. Уровень ИЛ-6 умеренно превышал контрольные значения и снижался до контрольных показателей к периоду реконвалесценции. Анализируя полученные данные, можно предположить, что у больных ОВГС легкого течения без аутоиммунных нарушений клеточное и гуморальное звено иммунитета находятся в сбалансированном состоянии. Среди больных ОВГС среднетяжелого течения с аутоантителами и без них в разгар клинических проявлений достоверных различий в концентрации ИЛ-1р, ИЛ-6 и ФНО-а не было. Ко 2-ому периоду у больных с аутоиммунными нарушениями уровень ИЛ-1Р, ИЛ-6 и ФНО-а в динамике

заболевания достоверно не изменялся. В в группе больных без аутоиммунных проявлений концентрация ИЛ-10 и ФНО-а во 2-ом периоде достоверно снижалась, что по-видимому свидетельствует о снижении функциональной активности макрофагов и клеток Купфера на фоне уменьшения вирусной нагрузки к периоду ранней реконвалесценции. В то же время, в данной группе больных хотя и отмечено повышение уровня ИЛ-6 в динамике заболевания, но это повышение не носило достоверный характер. Следовательно, у больных ОВГС среднетяжелого течения без аутоиммунных нарушений клеточный и гуморальный иммунный ответ находятся в сбалансированном состоянии. Полученные нами данные, вероятно, свидетельствуют о том, что дисбаланс цитокинов у больных ОВГС легкого течения с наличием аутоантител является результатом неадекватного иммунного ответа, что может играть существенную роль в поддержании персистенции вируса (ЯеИегтапп В. е[ а1. 1996, Ивашкин В.Г. 2001). Возможно сохраняющаяся высокая концентрация ФНО-а отражает развитие аутоиммунных механизмов, так как ассоциированный с макрофагами ФНО-а вместе с экспрессируемым Тх1-лимфоцитами ИЛ-2 отвечает за активацию аутоиммунных механизмов в органе мишени, в данном случае, в печени (Лейшнер У. 2005).

Нами изучена динамика уровней ИЛ-10, ИЛ-6 и ФНО-а у больных ОВГД. (таблица 15). У больных ОВГД тяжелого течения уровень ИЛ-10 был значительно повышен, как в 1-м, так и во 2-м периоде наблюдения, но с тенденцией к снижению ко 2 периоду. Уровень ИЛ-6 не превышал контрольных значений, однако тенденция к снижению ИЛ-6 наблюдалась к периоду ранней реконвалесценции. Уровень ФНО-а был достоверно высоким как в 1-м (р<0,001), так и во 2-м периодах заболевания (р<0,01), но к периоду ранней реконвалесценции уровень ФНО-а достоверно снижался (р<0,01).

Сравнивая уровень ФНО-а у больных ОВГД с аналогичными показателями при вирусных гепатитах другой изученной нами этиологии, мы пришли к выводу, что содержание ФНО-а в сыворотке крови больных ОВГД на высоте интоксикации достоверно выше, чем при ОВГВ и ОВГС среднетяжелого течения (р<0,05).Таким образом, у наблюдавшихся нами больных ОВГД тяжелого течения выявлено повышение уровня ФНО-а (р<0,05) по сравнению с больными ОВГВ и ОВГС среднетяжелого течения на фоне значительного достоверного по сравнению с нормой повышения уровня ИЛ-10 (р<0,05) и нормальных значений ИЛ-6. Подобный цитокиновый профиль (Ройт А. 2000) сочетается с активацией макрофагов, усилением активности натуральных киллеров, что характерно для патогенеза вирусных инфекций, обладающих прямым цитопатическим действием. Как известно, дельта-агент обладает прямым цитопатическим действием, что очевидно и сочетается с крайне высокими значениями ФНО-а и повышенной активностью >1К-клеток.

При ХВГВ и ХВГС развиваются внепеченочные проявления, следовательно, ХВГ рассматривается не просто как заболевание печени, а скорее, как системный патологический процесс. Вирусы гепатита В и С могут играть роль триггера в развитии АИГ, причём мы в своих исследованиях выявили аутоантитела уже на ранних этапах инфекционного процесса, при ОВГВ и ОВГС. Поэтому представляло интерес с целью расшифровки развития интимных механизмов аутоиммунных реакций при НВУ и НСУ-инфекции исследовать сыворотку крови на наличие аутоантител у больных хроническими вирусными гепатитами.

7-/

1:20 1:40 1:80 1:160

HASMA SANA 0АМА

Рисунок 6. Частота выявления аутоантител у больных ХВГВ

Таблица 17

Частота выявления аутоантител у больных ХВГС _различной степени активности процесса Сп=13П____

Аутоан-тигела титр Количество больных

миним. ст. активности (п=44) низкая ст. активности (п=33) умерен. ст. активности (п=28) цирроз (п=2б)

АБМА абс. % абс. % абс. % абс. %

отр. 37 84,1 11 33,3 14 50 16 61,5

1:20 1 2,3 5 15,2 4 14,3 0 0

1:40 3 6,8 4 12,1 4 14,3 5 19,2

1:80 2 4,5 8 24,2 6 21,4 3 11,5

1:160 1 2,3 5 15,2 0 0 2 7,7

АЫА отр. 44 100 28 84,8 25 89,3 22 84,6

1:20 0 0 1 3 1 3,6 0 0

1:40 0 0 3 9,1 2 7,1 4 15,4

1:80 0 0 1 3 0 0 0 0

АМА отр. 38 86,4 17 51,5 18 64,3 15 57,7

1:20 3 6,8 8 24,2 4 14,3 4 15,4

1:40 3 6,8 6 18,2 6 21,4 6 23,1

1:80 0 0 2 6,1 0 0 1 3,8

апй-ЬКМ-! есть 6 13,6 4 12 4 14,3 3 И,5

16.7 ИКГсмин И КГ с низ 14,3 Щек Н|11з5,7 \ ЧШИГишт В КГ с умер 3 КГ с цирр

Рисунок 7. Частота выявления криоглобулинов у больных ХВГС в зависимости от степени активности процесса.

И РФ с мин а РФ с низ Н РФ с умер И РФ с цирр

Рисунок 8. Распределение ревматоидного фактора у больных ХВГС в зависимости от степени активности процесса

Таблица 18

Сравнительная характеристика биохимических показателей больных ХВГС в зависимости от наличия аутоантител

Б\х показ. Билирубин прямой (мкмоль/мл) Билирубин непрямой (мкмоль/мл) АЛТ (ед/л) АСТ (ед/л)

степень тяжести с АТ без АТ с АТ без АТ с АТ без АТ с АТ без АТ

миним ст. активност (п=44) б,5± 1,3 9,7± 1,1 16,1± 3,2 13,5± 1,4 67,0± 11,1 -н о Ч; '■О ся 33,2± 4,7 33,7± 1,9

низкая ст. активност (п=33) 18,1± 5,2** 10,6± 2,7 13,8± 2,1 17,3± 3,5 148,6± 57,1** 86,1± 8,6 50,7± 4,9 46,6± 6,0

умерен, ст. активн. (п=28) 11,9± 1,4 10,9± 1,5 10,1± 1,7 10,2± 1,9 116,8± 5,9** 122,2± 4,7** 61,0± 5,3 65,1± 7,1

цирроз (п=26) 35,3± 11,2** 21,6± 3,1** 18,7± 3,5 15,6± 2,8 64,7± 10,7 81,1± 8,6 49,0± 5,9 48,1± 5,0

Норма 0-5 До 24,4 До 40 До 40

* - достоверные различия между группами больных с АТ и без АТ

**- достоверные различия между группами больных по степени активности.

Таблица 19

Сравнительная характеристика биохимических показателей _больных ХВГС в зависимости от наличия аутоантител._

Показатель Общий белок (г\л) ЩФ (ед\л) ГГТ (ед\л)

с АТ без АТ с АТ без АТ с АТ без АТ

миним ст. 71,6± 74,1± 204,3± 224,9± 84,2± 70,3±

активности (п=44) 1,4 1,1 29,6 42,8 17,1 5,4

низкая ст. 74,6± 69,8± 185,7± 167,2± 62,6± 84,2±

активности (п=33) 1,8 1,5 17,6 18,4** 6,5 22,7

умерен, ст. 72,2± 76,0± 216,7± 216,3± 91,3± 97,9±

аетивности (п=28) 2,6 1,8 30,3 32,5 14,3 12,6

цирроз (п=26) 76,4± 2,5 68,8± 1,5 262,8± 67,8" 248,1± 36,2 139,2± 44,2 100,2± 25,6

Норма 60-80 До 170 До 70

* • достоверные различия между группами больных с АТ и без АТ

* *- достоверные различия между группами больных по степени активности

При HBV-инфекции у 11 больных ХВГВ проведено однократное исследование сыворотки крови на аутоантитела - ASMA, AMA, ANA, anti-LKM-1, а также РФ. ASMA обнаружены у 36,4% больных в диагностическом титре 1:160, AMA выявлены у 54,5% больных, у 18,2% больных были выявлены ANA, и у 9% - anti-LKM-1. РФ в концентрации 200 ME/мл определен у 18,2% больных (рисунок 6). Полученные нами результаты даже на небольшой выборке больных свидетельствуют, что длительная персистенция HBV приводит к развитию аутоиммунных механизмов.

Мы изучили аутоиммунные проявления у больных ХВГС (таблица 17). У больных ХВГС ASMA определялись в диагностических титрах от 1:20 до 1:160: у 15,9% больных ХВГС с минимальной степенью активности, у 66,7% низкой степени активности, у 50% больных умеренной степенью активности и у 38,5% больных с циррозом. Среди больных ХВГС с низкой и умеренной степенью активности наибольшее количество составили больные с титром 1:80 - 24,2% и 21,4% соответственно, среди больных с циррозом наибольшее количество составили больные (19,2%) с титром 1:40. AMA определялись в тире 1:20 - 1:40 у 13,6% больных ХВГС с минимальной степенью активности и у 35,7% больных с умеренной степенью активности. В тирах от 1:20 до 1:80 AMA выявлялись у 48,5% больных ХВГС с низкой степенью активности и у 42,3% больных ХВГС с исходом в цирроз. Причём среди больных ХВГС с низкой степенью активности наибольшую группу составили больные с титром 1:20 (24,2%) и с титром 1:40 (18,2%), а среди больных ХВГС с исходом в цирроз наибольшую группу составили больные (23,1%) с титром 1:40. Среди больных ХВГС с минимальной степенью активности ANA не были выявлены ни у одного больного. У 15,2% больных ХВГС с низкой степенью активности ANA были установлены в титрах от 1:20 до 1:80 и у 10,7% больных ХВГС с умеренной степенью активности в титрах от 1:20 - 1:40. У 15,4% больных с циррозом печени ANA выявлены в титре 1:40. Anti-LKM-1 присутствовали у 13,6% больных ХВГС с минимальной степенью активности, у 12% больных с низкой степенью активности, в группе больных с умеренной степенью активности anti-LKM-1 обнаружены у 14,3% и у 11,5% больных ХВГС с исходом в цирроз.

Обобщая полученные результаты (таблица 17) можно сделать заключение, что во всех группах больных ХВГС ASMA определялись в диагностически значимых титрах, причём наибольшее количество больных с ASMA было в группе с низкой степенью гистологической активности (66,7%). Наибольший процент AMA зарегистрирован у больных с низкой степенью активности ХВГС. Скорее всего частота выявления ASMA, AMA в диагностически значимых титрах не зависит от степени активности ХВГС. ANA не обнаружены нами у больных ХВГС с минимальной степенью активности. Но выявлены у больных ХВГС с низкой, умеренной степенью активности и с циррозом, причём наибольшая частота встречаемости ANA зарегистрирована у больных с циррозом печени. Можно предположить, что частота встречаемости ANA зависит от степени активности заболевания и наиболее характерна для больных с глубокими поражениями печени.

Изучение динамики биохимических показателей цитолиза гепатоцитов у больных с наличием аутоиммунных нарушений и при их отсутствии в сопоставлении с тяжестью заболевания позволило бы расшифровать интимные механизмы развития аутоиммунных процессов (таблицы 18-19). Как видно из таблицы 18 в группах больных ХВГС с низкой и умеренной степенью гистологической активности с наличием аутоиммунных нарушений показатель цитолиза (АЛТ) был выше по сравнению с другими группами, в которых есть

аутоиммунные нарушения. Анализ таблицы 19 показал, что в группе больных ХВГС с исходом в цирроз с наличием аутоантител и без них уровень ЩФ достоверно выше по сравнению в другими группами. У больных с циррозом печени клиническая картина заболевания отличается от течения заболевания в других группах больных и не зависит от наличия или отсутствия аутоантител.

Динамика уровня криоглобулинов и РФ у больных ХВГС в зависимости от степени активности заболевания хорошо изучена и доказано влияние криоглобулинов на тяжесть и прогноз патогенетического процесса при ХВГС (Okuda К., et al. 1998, Игнатова 2000, Алленов М.Н. 2006).

Обследована сыворотка крови больных ХВГС на наличие КГ и РФ, чтобы сопоставить эти данные с результатами, полученными у больных хроническими вирусными гепатитами и ОВГ другой этиологии и попытаться выявить их патогенетическую роль. Обследовано 119 больных ХВГС на наличие КГ и РФ, исследование проводилось однократно. КГ были выявлены нами у больных ХВГС с минимальной степенью активности у 14,3%; с низкой степенью активности - у 35,7%; с умеренной степенью активности - у 44% и с циррозом - у 16,7%. Распределение КГ между группами больных достоверно различалось с р=0,02 (%2). В результате проведенных исследований установлено, что наиболее высокая частота встречаемости криоглобулинов выявлена у больных с низкой 35,7% и умеренной 44% степенью активности (рисунок 7). Достоверной разницы в частоте встречаемости РФ среди больных ХВГС различной степени активности выявлено не было, что свидетельствует об отсутствии прямой зависимости наличия РФ у больных ХВГС от гистологической активности (рисунок 8). В наших исследований КГ и РФ были выявлены в сыворотке крови у больных гепатитом С как на ранних стадиях заболевания, так и на стадии хронического поражения печени различной степени активности, что свидетельствует о возникновении аутоиммунных нарушений уже на начальных этапах инфекционного процесса при HCV. Полученные результаты подтверждают глубокое поражение иммунной системы с развитием патологических, аутоиммунных системных реакций.

Считается, что основой иммунокомплексных реакций с развитием аутоиммунных системных проявлений являются нарушения цитокинового статуса (Manns М.Р., Strassburg С.Р. 2001, Лейшнер У. 2005), поскольку именно цитокины принимают непосредственное участие в развитии воспаления, иммунного ответа и регенерации печени. Доказано, что длительная активация Thl-лимфоцитов с гиперпродукцией IFN-y и ФНО-а способствуют активному течению заболевания и элиминации вируса. В последних исследованиях показано, что ассоциированный с макрофагами ФНО-а и экспрессируемые Txl-лимфоцитами ИЛ-2, ИФН-7 скорее всего отвечают за активацию и прогрессирование аутоиммунных механизмов в печени, т.е. действуют провоспалительно (Лейшнер У. 2005). Преобладание в патологическом процессе цитокинов, продуцируемых ТЬ2-клетками ассоциируется с вирусной персистенцией и хронизацией процесса (Курамшин Д.Х. и др. 2002, Собчак Д.М. 2004, Fan X.G. et al. 1998, Abayli В. 2003). Таким образом, изменение цитокинового статуса в виде нарушения баланса Thl/Th2 цитокиновой продукции и является одним из механизмов неадекватного иммунного ответа, играющего ключевую роль в развитии, прогрессировании заболевания и его хронизации вирусных гепатитов В и С (Ивашкин В.Г. 2001, Napoli J. 1996, Gage JR. 2004).

Сравнительная характеристика уровней ИЛ-1В. ИЛ-6 и ФНО-а _ в сыворотке крови у больных ХВГВ_

Цитокины ИЛ-1(5 (пг\мл) ИЛ-6 (пг\мл) ФНО-а (пг\мл)

ХВГВ (п=11) 214,67±176,19* 6,33±6,03* 484,33±408,33*

Контроль п=10 5,0 ±0,25 5,0 ±0,25 5,0 ±0,25

* - достоверные отличия от контроля

Таблица 21

Сравнительная характеристика уровней ИЛ-1р. ИЛ-б и ФНО-а у больных ХВГС различной степени гистологической активности.

Группы ИЛ-1Р (пг\мл) ИЛ-6 (пг\мл) ФНО-а (пг\мл)

минимальная ст. активности(п=44) 180,02±47,52*# 61,03 ±23,24* 86,05 ±19,25*

низкая степень активности (п=33) 123,67±28,01* 67,22±29,41* 91,85±27,24*

умеренная ст. активности (п=28) 127,89±59,35* 61,27+27,52* 106,50146,66*

цирроз (п=26) 129,62±37,5* 70,40±41,22* 70,35±33,37*

Контроль п=40 5,0 ±0,25 5,0+0,25 5,0 ±0,25

* - достоверные отличия от контроля ^-достоверные различия между подгруппами

Уровень цитокинов в сыворотке крови у больных ХВГС

Таблица 22

Показатель ИЛ-1Р ФНО-а ИЛ-6

с АТ без АТ с АТ без АТ с АТ без АТ

миним ст. активности (п=44) 84,2± 6,0 202,5± 55,2* 99,2± 13,8 79,8± 12,1 35,5±7,9 66,8±17,4

низкая ст. активности (п=33) 164,5± 35,5 86,2± 13,2* 128,6± 40,8 70,5± 17,5 100,5± 15,5 39,7±4,1*

умерен, ст. активности (п=28) 170,3± 30,2 11б,0± 28,1 90,8± 16,2 145,5± 18,8* 33,2±5,1 101,3± 16,7*

цирроз(п=26) 151,7± 16,4 128,3± 15,6 36,5± 9,3 96,5± 15,1* 19,3±10,0 108,5± 17,5*

Контроль (п=40) 5,0 ±0,25

* - достоверные различия между группами больных с АТ и без АТ **- достоверные различия между группами больных по степени активности

Сравнительная характеристика стимулированных ФГА и КРУ МНПК уровней ФНО-а, ИЛ-1В и ИЛ-б в сыворотке крови больных ХВГВ

Таблица 23

Цитокины

ФНО-а спонт.

ФНО-а ФГА

ФНО-а ШУ

ИЛ-1Р споит.

ИЛ-1Р ФГА

ИЛ-1Р ШУ

ИЛ-б спонт.

ИЛ-6 ФГА

ИЛ-6 ШУ

ХВГВ (п=11)

497,0± 110,6

587,8± 158,5

815,0± 235,7*

230,3± 87,5*

75,0±23 ,8*

62,3± 14,8«

17,3± 9,5

474,7± 108,9«

261,7± 38,9*

Контр. (п=10)

5,0 ±0,25 - 50,0±0,25

* - достоверные отличия от контроля

Нами была изучена сывороточная концентрация ИЛ-1Р, ИЛ-6 и ФНО-а у 11 больных ХВГВ. В связи с малым количеством больных в данной группе мы рассматривали уровень интерлейкинов в совокупности, не разделяя на группы по гистологической активности.

У больных ХВГВ уровень ИЛ-1Р и ФНО-а в сыворотке значительно превышал контрольные значения на фоне нормальных значений уровня ИЛ-6, что отражает подавление гуморального звена иммунитета (таблица 20).

У 131 больного ХВГС различной степени гистологической активности была изучена сывороточная концентрация ИЛ-1Р, ИЛ-6 и ФНО-а (таблица 21). Для уточнения связи между уровнями изучаемых цитокинов и степенью активности заболевания у больных ХВГС мы провели расчет критерия соответствия у\

При анализе полученных данных установлено, что уровень ИЛ-1Р у больных ХВГС различной степени активности во всех группах превышал контрольные значения, причём у больных с минимальной степенью активности этот показатель был наиболее высоким и достоверно отличался от контроля, тогда как в других группах больных значения ИЛ-ф достоверно не отличался от контроля. Концентрация ИЛ-6 во всех группах больных ХВГС была достоверно выше контроля, но не отличалась в группах больных с различной степенью активности. Уровень ФНО-а у больных ХВГС различной степени активности во всех группах превышал контрольные значения. У больных с умеренной степенью активности этот показатель был несколько выше, чем в других группах больных, но достоверно от них не отличался (р> 0,05) , в то время как у больных с циррозом печени уровень ФНО-а хотя и был ниже в сравнении с другими группами больных, но эти отличия не носят достоверного характера (р> 0,05).

Полученные нами результаты свидетельствуют, что во всех группах больных ХВГС с различной степенью гистологической активности уровни ИЛ-1Р, ИЛ-6 и ФНО-а в сыворотке крови превышали контрольные значения, но достоверно не отличались среди больных с различной степенью активности.

Мы рассмотрели динамику цитокинов в группах больных ХВГС с наличием аутоиммунных проявлений и при их отсутствии в сопоставлении с различной степенью гистологической активности заболевания (таблица 22). Уровень ИЛ-6 и ИЛ-1Р у больных с минимальной степенью активности без аутоантител был достоверно выше, чем у больных с аутоантителами. Уровень ИЛ-1Р, ИЛ-6 и ФНО-а были достоверно выше у больных с низкой степенью гистологической активности с аутоиммунными реакциями, чем у больных с низкой степенью активности без аутоантител. А у больных с умеренной степенью активности и у больных с ХВГС с исходом в цирроз без аутоиммунных реакций уровень ФНО-а и ИЛ-6 были достоверно выше, чем у больных с аутоиммунными нарушениями. Полученные результаты свидетельствуют о подавлении как гуморального, так и клеточного звена иммунитета у больных с аутоиммунными нарушениями с умеренной степенью активности ХВГС и с ХВГС с исходом в цирроз печени.

Общепризнано, что для цитокинов характерен короткий период полужизни, они быстро инактивируются и разрушаются, кроме того, цитокины присутствуют в крови больных в «скрытых» комплексах, что делает затруднительным измерение их количества в системном кровотоке. В связанном состоянии цитокины не инактивированы, а нековалентный характер связывания с рецепторами обеспечивает

возможность диссоциации цитокинов, что может сопровождаться повторным увеличением их концентрации в сыворотке крови. Следовательно, установленные нами низкие уровни цитокинов также могут быть обусловлены высоким содержанием растворимых рецепторов к этим цитокинам, т.к. уровень свободных рецепторов превышает концентрацию цитокинов в сыворотке крови, т.е. определяемые методом ИФА сывороточные уровни свободных цитокинов не отражают истинных концентраций цитокинов в сыворотке крови. Поэтому у больных ХВГ диагностическое значение имеет не только определение концентрации свободных цитокинов в сыворотке крови, но и изучение функциональных резервов способности МНПК вырабатывать цитокины в ответ на стимуляцию (Grakoui A., et al. 2003; Paul S„ et al.- 2004).

Большинство работ посвящено изучению количественного содержания цитокинов в сыворотке крови у больных ХВГС и ОВГС, а исследование резервной продукции цитокинов МНПК на фоне ХВГ в сопоставлении с выраженностью показателей гистологической активности и фиброза, а также установление фенотипа иммунных клеток печени для определения роли этих показателей в хронизации вирусных гепатитов изучено не было.

Для исследования резервных возможностей МНПК крови мы исследовали уровень стимулированных ФГА и NDV ФНО-а , KJI-ip и ИЛ-6 у больных ХВГВ (таблица 23). У больных ХВГВ стимулированный ФГА и NDV уровень ФНО-а значительно превышал контрольные значения, в то время как концентрация ИЛ-ip после стимуляции наоборот снижалась, а низкий уровень ИЛ-6 после стимуляции достигал высоких значений. Снижение выработки ИЛ-ip после стимуляции МНПК ФГА и NDV вероятно можно объяснить истощением резервных возможностей макрофагов, клеток Купфера на фоне раздражения Тх1 -лимфоцитов длительной вирусемией. Повышение ФНО-а после стимуляции МНПК ФГА и NDV вероятно отражает присутствие скрытых механизмов развития аутоиммунных механизмов, так как известно, что ассоциированный с макрофагами ФНО-а и экспрессируемые Txl-лимфоцитами ИЛ-2, ИФН-у скорее всего отвечают за активацию и прогрессирование аутоиммунных механизмов в печени (Лейшнер У. 2005). Повышенная стимулированная NDV и ФГА продукция МНПК ИЛ-6 отражает сохранение резервных возможностей МНПК к антителообразованию. Низкая афинность данных антител обуславливает их низкую вируснейтрализующую возможность, что способствует формированию хронического процесса, так как преобладание в патологическом процессе цитокинов, продуцируемых ТЬ2-клетками, ассоциируется с вирусной персистенцией и хронизацией процесса. По-видимому, циркулирующие при ХВГ антитела не обеспечивают элиминацию вируса.

У больных ХВГВ уровень ИЛ-4 в сыворотке крови был достоверно ниже контрольных значений, уровень спонтанного ИЛ-4 соответствовал нулю. После стимуляции ФГА и NDV МНПК концентрация ИЛ-4 значительно превышала контрольные значения (таб. 24). Как известно, ИЛ-4 стимулирует Т - лимфоциты, способствуя дифференцировке Т112-лимфоцитов и усиливая тем самым антителообразование. Поэтому повышенная стимулированная NDV и ФГА продукция МНПК ИЛ-4 вместе с ИЛ-6 отражает сохранение резервных возможностей МНПК к антителообразованию при недостаточности клеточного звена иммунитета, что автоматически при вирусных инфекциях ведет к формированию хронического процесса, в основе которого лежит персистенция вируса. Следует отметить, что после стимуляции Т-клеточным митогеном ФГА концентрации ИЛ-6 и ИЛ-4 значительно

повышаются, нежели после стимуляции NDV, что косвенно отражает резервные возможности Т - лимфоцитов.

У больных ХВГВ в сыворотке крови IFN-a и IFN-y определялись в пределах контрольных значений, однако после стимуляции NDV уровень IFN-a значительно возрастал, а уровень ¡FN-у увеличивался после стимуляции МНПК ФГА (таб. 25). Максимальное повышение IFN-a после стимуляции NDV отражает резервные возможности МНПК, которые реализуются только после стимуляции NDV, который стимулирует выработку интерферонов и ФНО-a, что ведет в свою очередь к активации естественных клеток-убийц, макрофагов и сенсибилизированных Т-клеток. Полученные нами результаты подтверждают литературные данные о том, что концентрация ФНО-a и IFN-a достигает максимальных значений после стимуляции NDV МНПК. В свою очередь ФГА стимулирует выработку IFN-y, что и нашло подтверждение в наших результатах, когда после стимуляции ФГА МНПК уровень IFN-y был наиболее высоким. Полученные результаты свидетельствуют, что уровень цитокинов в сыворотке крови не отражает резервные возможности МНПК. После стимуляции МНПК NDV усиливается выработка IFN-a, что может найти практическое применение для лечения больных ХВГВ.

У 25 больных ХВГС для оценки резервной продукции цитокинов МНПК были изучены спонтанная и стимулированная NDV и ФГА продукция IFN-a, IFN-y, ФНО-a, ИЛ-ip, ИЛ-4, ИЛ-6 в сопоставлении с гистологической активностью (таблицы 26-28).

Сывороточный и спонтанный уровень IFN-a в МНПК у больных ХВГС с минимальной степенью активности и у больных с циррозом не превышали контрольных значений, но достоверно отличались в сравнении с другими группами (р<0,05). Стимуляции МНПК NDV и ФГА у больных ХВГС с минимальной степенью активности не привела к повышению уровня IFN-a, что свидетельствует об отсутствии резервных возможностей МНПК. У больных с низкой степенью активности сывороточный и спонтанный уровень IFN-a соответствовал нулевым значениям. После стимуляции NDV МНПК уровень IFN-a значительно превысил контрольные значения у больных с низкой степенью активности, а больных с умеренной степенью активности и с циррозом IFN-a после стимуляции NDV МНПК достоверно не превышал контрольного значения. Стимуляция ФГА МНПК не вызвала активной выработки IFN-a, что вполне объяснимо, так как именно NDV стимулирует выработку IFN-a, в то время как ФГА стимулирует выработку IFN-y, а не IFN-a.

Анализируя полученные результаты можно предположить, что у больных ХВГС с низкой степенью активности сохраняются резервные возможности МНПК вырабатывать IFN-a, тогда как у больных с умеренной степенью активности и с циррозом резервные возможности МНПК истощены. IFN-a является мощным ингибитором активной репликации вирусов, усиливает пролиферацию разных типов клеток, в т.ч. Т - и В - лимфоцитов, стимулирует цитотоксическую активность NK и повышает устойчивость близлежащих, соседних клеток к вирусной инфекции (Змушко Е.И. 2001, Царегородцева Т.М., Серова Т.Н. 2003, Peters М. 1996). Интенсивными продуцентами IFN-a являются инфицированные вирусом тканевые клетки.

Сравнительная характеристика уровня ИЛ-4

Цитокины ИЛ-4 сывор. ИЛ-4 спонт. ИЛ-4 ФГА ИЛ-4 ШУ

ХВГВ (п=11) 0,02±0,01» 0« 850,0±270,6* 112,0±56,5*

Контр. (п=10) 5,0 ±0,25

' - достоверные отличия от контроля

Сравнительная характеристика уровней ^N-0. ШЫ-у в сыворотке крови

Таблица 25

Группы ШЫ-а спонт №N-0 ФГА №N-0 ШУ №N-7 спонт №N-7 ФГА та-г ШУ

ХВГВ (п=> 1) 9,67± 5,2 9,67± 3,8 10,0± 2,8 1076,33± 335,6 16,0± 5,1 13,67± 6,4 175,3± 61,8 85,0± 25,9

Контр. (п=10) 5,0 ±0,25

■ достоверные отличия от контроля

Таблица 26

Сравнительная характеристика уровней ШЫ-а и ШЫ-у

Группы 1ТО-а ПТС-а спонт №N-0 ФГА №N-0 ШУ №N-7 спонт ШЫ-у ФГА ^Ы-у ШУ

миним. ст. 28,0± 29,0± 29,0± 29,0± 446,0± 34,0± 29,0± 26,0±

акгивн. (п=4) 10,0 12,1 13,5* 12,8 391,0* 10,2* 8,2* 4,8*

низкая ст. 0 0 40,0± 678,8± 0 0 185,0± 192,5±

активн. (п=7) 12,5' 609,0» 109,5* 150,8*

умерен, ст. 0 0 0 57,5± 0 0 110,0± 24,0±

активн.(п=10) 15,8* 100,1* 9,4*

цирроз(п=4) 14,5± 15,0± 14,5± 43,0± 116,5± 13,0± 35,0± 10,0±

7,1 6,2 8,6 25,0 36,2* 6,2* 5,9* 4,8

Контр оль(п=10) 5,0 ±0,25- 50,0 ±0,25

' - достоверные отличия от контроля

Таблица 27

Сравнительная характеристика уровня ИЛ-4в сыворотке крови

Группы ИЛ-4сывор. ИЛ-4спонт. ИЛ-4 ФГА ИЛ-4 ШУ

миним. ст. акт. (п=4) 13,0±5,9 0,2±0,07 355,0±121,5 312,0±96,7

цирроз(п=4) 636,0±211,9 0 0 142,0±62,3

Контроль (п=10) 5,0 ±0,25 - 50,0 ±0,25

Таблица 28

Сравнительная характеристика уровней ФНО-а. ИЛ-1В и ИЛ-6 в сыворотке крови у больных ХВГС __различной степени гистологической активности_

Группы ФНО-а спонт. ФНО-а ФГА ФНО-а ШУ ИЛ-ф спонт. ИЛ-1Р ФГА ИЛ-1р ШУ ИЛ-6 спонт. ИЛ-6 ФГА ИЛ-6 ШУ

миним. ст. актив. п=4 13,0± 6,2 7,0± 3,5 0,4± 0,1 3,0± 1,1 22,0± 5,8 30,0± 10,1 0,2± 0,05 355,0±1 20,5 912,0± 242,5

низкая ст. актив. п=7 8,0± 2,6 501,8± 282,5 319,0± 281,5 20,0± 11,5 180,0 ±72,9 295,0± 174,2 12,5± 7,5 193,7± 154,5 346,0± 198,6

умерен, ст. акт. п=10 34,7± 27,6 635,0± 374,2 270,0±9 9,8 33,3± 24,0 120,0±3 0,5 52,0± 28,0 40,0± 23,2 80,0± 52,6 115,0± 52,1

цирроз п=4 16,5± 5,9 166,0±5 9,4 14,5± 0,5 33,0± 13,0 961,5± 295,2 387,0± 128,9 5,5± 1,5 1000,5 ±325,5 36,0± 24,0

контр. п=10 5,0 ±0,25 - 50,0 ±0,25

достоверные отличия от контроля

Таблица 29

Выявленные изменения концентрации цитокинов периферической крови в сопоставлении с выраженностью перипортальных некрозов

ПЕРИПОРТАЛЬНЫЕ НЕКРОЗЫ

0 баллов 1 балл 2 балла 3 балла 4 балла 5 баллов

| инд. ШУ №N-0* нет изменений нет изменений нет изменений нет изменений | инд. ШУ ШЫ-а* | инд. ШУ ПТС-у* | инд. ШУ ТШ-а* 1 инд. ФГА ТОТ-а* | спонт. ТШ-а | спонт. II,-10 | спонт. 1Ь-6

Примечание.*- достоверное различие с группой здоровых доноров (р<0,01)

Таблица 30

Выявленные изменения концентрации цитокинов периферической крови в сопоставлении с выраженностью внутридольковой дегенерации

ВНУТРИДОЛЬКОВАЯ ДЕГЕНЕРАЦИЯ

1 балл

| инд. ШУ №N-0*

2 балла

нет изменении

3 балла

нет изменении

4 балла

| инд. ШУ ШЫ-а*

| инд. ШУ Т№-а*

| инд. ФГА ТШ-а* | инд. КРУ 1Ь-6*

Т спонт. 1Ь-1Р

Примечание.*- достоверное различие с группой здоровых доноров (р<0,01)

Таблица 31

Выявленные изменения концентрации цитокинов периферической крови

ПОРТАЛЬНОЕ ВОСПАЛЕНИЕ

1 балл 2 балла 3 балла 4 балла

нет изменений нет изменений 1 инд. ШУ №N-0* | спонт. 1Ь-1Р

| инд. ШУ ТШ-а*

1 инд. ШУ 1Ь-6*

Примечание.*- достоверное различие с группой здоровых доноров (р<0,01)

Таблица 32

Выявленные изменения концентрации цитокинов периферической крови

ФИБРОЗ

0 баллов 1 балл 2 балла 3 балла

нет изменений нет изменений 1 инд. ШУ ШЫ-а* | инд. ШУ ШМ-сс*

1 инд. ШУ ТШ-а* 1 инд. ШУ ТШ-а*

[ инд. ШУ 11,-6*

Т сыв. ТШ-а | спонт. 1Ь-1Р

Т сыв. 1Ь-4

Примечание.*- достоверное различие с группой здоровых доноров (р<0,01)

Следовательно, у больных ХВГС с умеренной степенью активности сохраняются резервные возможности и поэтому вероятно, что для лечения этой группы больных целесообразно рассмотреть вопрос о назначении стимуляторов интерфероногенеза, в отличие от больных с циррозом печени, у которых отсутствует резервные возможности МНПК вырабатывать IFN-a и что определяет необходимость его назначения.

У больных с минимальной степенью активности ХВГС уровень IIFN-y в сыворотке крови достоверно превышал контрольные значения, что скорей всего является неблагоприятным диагностическим признаком, поскольку гиперпродукция IFN-y способствует активному прогрессирующему течению заболевания (Курамшин Д.Х. 2002, Brady М.Т. 2003, Lucey D.R. et al. 1996), что нашло подтверждение в истощении резервных возможностей МНПК после индуцирования их NDV и ФГА, когда уровень IIFN-y снизился до контрольных значений.

У больных с циррозом печени IIFN-y в сыворотке крови превышал контрольные значения в 2 раза, а после стимуляции NDV и ФГА МНПК уровень IIFN-y снижался до контрольных значений. Повышение продукции IIFN-y в сыворотке крови и отсутствие ответа на стимуляцию свидетельствуют об отсутствии резервных возможностей МНПК у больных циррозом печени в результате длительного раздражения МНПК вирусемией. У больных с низкой и умеренной степенью активности уровень IFN-y в сыворотке крови спонтанный не определялся, а после индуцирования NDV и ФГА МНПК превышал контрольные значения (таб. 26). Полученные результаты свидетельствуют о сохранении резервных возможностей МНПК у больных ХВГС с низкой и умеренной степенью активности. Следует отметить, что после стимуляции ФГА МНПК уровень IIFN-y был выше по сравнению со стимуляцией NDV МНПК у больных ХВГС с умеренной степенью активности, а у больных с низкой степенью активности концентрация IIFN-y после индуцирования NDV МНПК и после стимуляции ФГА МНПК достоверно не отличалась. Полученные результаты можно объяснить тем, что основным стимулятором для выработки IIFN-y является ФГА.

У больных ХВГС с минимальной степенью активности концентрация спонтанного ИЛ-ip и ФНО-а находились в пределах контрольных значений и не изменялась после стимуляции NDV и ФГА МНПК. Уровень спонтанных ИЛ-6 и ИЛ-4 были в пределах контрольных значений, а после стимуляции NDV и ФГА МНПК отмечалось достоверное нарастание их концентрации в сыворотке крови. Полученные результаты отражают отсутствие у больных ХВГС с минимальной степенью активности адекватного клеточного иммунного ответа при сохранении резервных возможностей гуморального ответа. Известно, что ИЛ-4 ингибирует синтез макрофагами ИЛ-ip, ФНО-а, что и объясняет низкий уровень этих интерлейкинов после стимуляции NDV и ФГА МНПК на фоне высоких значений ИЛ-4.

У больных ХВГС с низкой и с умеренной степенью активности уровень спонтанных ИЛ-ip, ФНО-а, ИЛ-6 соответствовал контрольным значениям, а после индуцирования NDV и ФГА МНПК их концентрация достоверно увеличилась (р<0,05). Полученные результаты свидетельствуют о сохранении резервных возможностей МНПК у данных больных, чем и можно объяснить длительный период ремиссии до 20 лет в течении ХВГС.

У больных ХВГС с исходом в цирроз нормальные уровни спонтанных ИЛ-ip, ФНО-а, ИЛ-6 увеличивались после стимуляции ФГА МНПК, причем концентрация ИЛ-ip и ИЛ-6 достигала очень высоких значений. Следует отметить, что стимуляция

МНПК вызвала незначительное повышение ФНО-а, ИЛ-6 и умеренное повышение ИЛ-1р. Полученные результаты можно объяснить тем, что Т-клеточный митоген ФГА отражает резервные возможности Т-лимфоцитов, в то время как основной стимулятор выработки ФНО-а ЫОУ не индуцировал его выработку. Концентрация ИЛ-4 в сыворотке крови больных с циррозом была значительно выше контрольных значений. Спонтанный уровень ИЛ-4 не определялся, а после индуцирования КОУ МНПК хотя и повышался, но не достигал контрольных значений, при этом после стимуляции ФГА МНПК сохранялись нулевые значения ИЛ-4.

Полученные результаты свидетельствуют о глубоком дисбалансе в выработке регуляторных цитокинов, а также об отсутствии резервных возможностей МНПК у больных ХВГС с исходом в цирроз.

Известно, что ИЛ-1Р является триггерным цитокином в реализации клеточного звена иммунитета и определяет санацию организма от чужеродных антигенов. В результате проведённых исследований нами установлено, что у всех больных ХВГ, независимо от этиологии, нет достоверных отличий в уровне ИЛ-1Р, поэтому для изучения резервных возможностей МНПК мы рассматривали цитокиновый профиль в сопоставлении с гистологической картиной в пунктате печени у больных ХВГ в совокупности, не разделяя по этиологии.

В настоящее время ведущим диагностическим критерием при обследовании больных с хроническим поражением печени является прижизненное морфологическое исследование ткани печени, что позволяет определить степень активности процесса, уточнить стадию болезни, выявить начальные признаки цирроза, прогнозировать течение и исход заболевания, и напрямую связать цитокиновый профиль с морфофункциональными изменениями печени, поскольку именно цитокины принимают непосредственное участие в развитии воспаления, иммунного ответа и регенерации печени. Наиболее широко распространенным методом полуколичественной оценки гистологической активности хронического гепатита вне зависимости от его этиологии является метод Кноделя (Апросина З.Г. 1981, Игнатова Т.М. 2000, Майер К.-П. 1999). В настоящее время гистологическая активность оценивается по морфологическим изменениям и не учитывается популяционный состав клеток, который определяет течение и исход инфекционного процесса в печеночной ткани и напрямую связан с цитокиновым профилем, так как под влиянием ИЛ-1Р и ФНО-а происходит дифференцировка предшественников Т-клеток (Рабсон. А., Ройт А., Делвз П. 2006)

Изучена сывороточная, спонтанная и стимулированная ЫБУ и ФГА продукция цитокинов МНПК у больных хроническими вирусными гепатитами различной этиологии в зависимости от уровня гистологической активности.

Анализируя содержание цитокинов 1Ш-а, 1КЫ-у, ФНО-а, ИЛ-1Р, ИЛ-4, ИЛ-6 в сыворотке крови, а также их спонтанную и индуцированную продукцию МНПК у больных хроническими вирусными гепатитами мы установили, что статистически значимые отличия от здоровых доноров выявлены только в отношении индуцированной КОУ и ФГА продукции цитокинов МНПК. В группе больных с минимальной степенью гистологической активности, а также у больных с отсутствием перипортальных некрозов (0 баллов) и с минимальной выраженностью внутридольковой дегенерации (1 балл) определено достоверное снижение индуцированной ЫБУ продукции 1Ш-а МНПК по сравнению со здоровыми донорами. У больных с высокой степенью гистологической активности и с

максимальной выраженностью перипортальных некрозов (5 баллов), внутридольковой дегенерации (4 балла), портального воспаления (3 балла), фиброза (2-3 балла) установлено статистически значимое снижение стимулированной NDV продукции целого ряда цитокинов (IFN-a, IFN-y, ФНО-a, ИЛ-6) и индуцированной ФГА продукции ФНО-a МНПК по сравнению с контрольной группой (таблицы 2932). Ни в одной группе больных с различными уровнями гистологической активности, различной выраженностью перипортальных некрозов, внутридольковой дегенерации, портального воспаления, фиброза не выявлено статистически значимых отличий концентрации IFN-a, IFN-y, ФНО-a, ИЛ-ip, ИЛ-4, ИЛ-6 в сыворотке крови и их спонтанной продукции МНПК по сравнению со здоровыми донорами. Нами была определена только тенденция к увеличению концентрации ИЛ-4, ИЛ-6, ФНО-a в сыворотке крови и спонтанной продукции ФНО-a, ИЛ-ip, ИЛ-6 МНПК у больных с высокой гистологической активностью и с максимальной выраженностью перипортальных некрозов, внутридольковой дегенерации, портального воспаления и фиброза по сравнению с группой контроля.

В результате проведенных исследований нами, как и рядом других авторов (Наследникова И.О., Белобородова Е.В. 2005, Скляр Л.Ф., Никифоров Н.Д. 2005) установлена тенденция к увеличению концентрации ИЛ-4, ИЛ-6, ФНО-a в сыворотке крови и спонтанной продукции ФНО-a, ИЛ-ф, ИЛ-6 у больных с высокой гистологической активностью и с максимальной выраженностью морфологических изменений в печени по сравнению с группой контроля, что соответствует представлениям о роли данных цитокинов при хронических вирусных гепатитах. В ряде работ показано статистически значимое значительное повышение концентрации ФНО-a, ИЛ-6, IFN-y, IFN-a в сыворотке крови по сравнению со здоровыми донорами, в то же время по данным других авторов наблюдается выраженное снижение концентрации ФНО-a на фоне повышения уровня ИЛ-4 в сыворотке крови, а также достоверное увеличение концентрации ИЛ-1р и снижение уровня IFN-y (Курамшин Д.Х., Толоконская Н.П. 2002, Свиридова М.Б. 2003, Ataseven Н. 2006, Falasca К. 2006). Столь разноречивые данные, полученные разными авторами при изучении концентрации цитокинов в сыворотке крови, подтверждают значительную вариабельность этого признака и требуют пересмотра их роли в качестве диагностического критерия у больных с хроническим вирусным гепатитом. В данных работах определялся только уровень свободных цитокинов методом ИФА в сыворотке крови, что не отражает их реальное содержание в сыворотке крови после стимуляции МНПК, т.е. резервные, скрытые возможности продукции цитокинов. Поэтому большое диагностическое значение имеет не определение концентрации цитокинов в сыворотке крови, а изучение функциональной способности МНПК вырабатывать цитокины в ответ на стимуляцию NDV и ФГА у больных хроническим вирусным гепатитом.

Установленное нами снижение способности МНПК вырабатывать ФНО-a в ответ на стимуляцию NDV и ФГА у больных хроническими вирусными гепатитами с высокой гистологической активностью является результатом глубокой дизрегуляции иммунного ответа. Дефицит ФНО-a свидетельствует о недостаточности клеточного звена иммунитета, что приводит к нарушению активации цитотоксических лимфоцитов и реализации апоптотической гибели клеток, в том числе вирусинфицированных, так как ФНО-a обладает цитотоксичностью по отношению к инфицированным вирусом клеткам и действует синергично с IFN-y. Следовательно, снижение продукции ФНО-a может пародоксально способствовать длительной

персистенции вируса и хронизации вирусного гепатита и приводить к изменению состава клеточной популяции в печёночной ткани. В то же время, ограничение продукции ФНО-а в условиях длительной вирусной персистенции, является адаптивной реакцией системы иммунитета, направленной на предотвращение реализации проапоптотического потенциала вирусов и развития необратимого повреждения органов и тканей (Рабсон А., Ройт А., Делвз П. 2006).

У большинства обследованных нами больных с хроническим вирусным гепатитом установлено снижение индуцированной NDV продукции IFN-a по сравнению со здоровыми донорами. IFN-a играет важнейшую роль в осуществлении противовирусной защиты организма, обладает широким спектром иммунологической активности: стимулирует фагоцитоз, цитотоксическую активность NK - клеток, выработку цитокинов, эффекторных клеток иммунной системы, усиливает экспрессию продуктов генов МНС 1 класса и является мощным ингибитором активной репликации вирусов. В свою очередь экспрессия МНС II класса на поверхности АПК активирует непримированные аутореактивные Т-лимфоциты, кроме того молекулы МНС могут быть необходимы для того, чтобы клетка стала мишенью для примированных аутореактивных Т-лимфоцитов, таким образом, запуская развитие аутоиммунных механизмов (Царегородцева Т.М., Серова Т.Н. 2003, Lau J.Y. 1993, Par G. 2006).

Отклонения в экспрессии молекул МНС II класс на поверхности гепатоцитов в следствии вирусемии способствуют презентации неизменённых компонентов клеточной мембраны АПК, что может приводить к активации аутологичных клонов цитотоксических Т-лимфоцитов и сопровождается синтезом и секрецией цитокинов (ИФН-у, ИЛ-2), вызывающих повреждение паренхимы печени с развитием аутоиммунных реакций (Чепель Э., Хейни М., Мисбах С. 2008).

Выработка IFN-a относится к ранним событиям иммунного ответа, осуществляется активированными макрофагами под действием чужеродного антигена. Триггерное действие IFN-a опосредовано стимуляцией синтеза ИЛ-Iß для совместного представления антигена Т-лимфоцитам и дальнейшего развития специфического иммунитета и санации организма от вируса (Trobonjaca Z. et al. 2001, Царегородцева Т.М., Серова Т.И. 2003).

Статистически значимое снижение индуцированной NDV продукции IFN-a МНПК у больных хроническими вирусными гепатитами В и С как при минимальной гистологической активности, так и при отсутствии морфологических изменений в паренхиме печени, подтверждает суждение о хроническом вирусном гепатите как об иммунокомпрометированном состоянии и отражает снижение функциональной способности МНПК отвечать выработкой IFN-a в ответ на вирусную инфекцию. Дополнительным подтверждением отсутствия способности к адекватному иммунному ответу при вирусных гепатитах является достоверное снижение индуцированной NDV продукции IFN-a МНПК у больных с высокой активностью гепатита и с максимально выраженными морфологическими изменениями в печени. В настоящее время большинство авторов признают, что нарушение именно иммунного ответа приводит к длительной персистенции вируса и хроническому течению вирусных гепатитов (Семененко Т.А. 2002, Jacobson Brown P.M., Neuman M.G. 2001, Prilmiagi LS, Tefanova V.T. et al. 2003), однако, нет четких и однозначных критериев оценки недостаточности иммунного ответа. Показанное снижение стимулированной NDV продукции IFN-a МНПК может рассматриваться в качестве диагностического критерия состояния иммунодефицита, а также применяться для определения

лечебной тактики с возможным использованием препаратов интерферона или индукторов интерферона у больных хроническими вирусными гепатитами.

Таким образом, в результате проведенных исследований не выявлено статистически значимых отличий концентрации цитокинов в сыворотке крови у больных хроническими вирусными гепатитами по сравнению со здоровыми донорами. Установленные нами тенденции изменения содержания отдельных цитокинов в сыворотке крови у больных хроническими вирусными гепатитами В и С в общем соответствуют данным других авторов, но эти изменения не носят достоверного характера и поэтому не могут быть использованы в качестве диагностического критерия. Однако, спонтанные значения ИФН-а у больных ХВГС с низкой и умеренной степенью активности соответствуют нулевым значениям, что не отражает резервные возможности МНПК и, следовательно, развитие аутоиммунных реакций опосредованных ИФН-а носит скрытый характер, что находит отражение в отсутствии морфологических признаков характерных для АИГ. При АИГ только в периоде обострения выявляется картина хронического гепатита высокой степени активности с преимущественно лимфо-плазмоцитарной инфильрацией. Однако в периоде ремиссии наблюдается снижение активности, что соответствует отсутствию различий в гистологической картине при ХВГ и AHIXCzaja A.J. 2005, Апросина З.Г. 2009). Следовательно, определение концентрации цитокинов только в сыворотке крови малоинформативно, необходимо также исследование стимулированной продукции цитокинов МНПК, которая отражает функциональную способность МНПК отвечать выработкой цитокинов в ответ на антигенное воздействие, в том числе на вирусную инфекцию. Исследование стимулированной NDV продукции IFN-а и стимулированной NDV и ФГА продукции ФНО-а МНПК может использоваться в качестве прогностического фактора, а также для коррекции лечения. Хронические вирусные гепатиты В и С являются иммунокомпроментированными заболеваниями с аутоагрессией против собственных клеток организма, в данном случае гепатоцитов, поэтому представляло интерес изучить показатели клеточного звена иммунитета посредством которого и реализуются аутоиммунные реакции in situ у больных хроническими вирусными гепатитами различной этиологии в сопоставлении с уровнем гистологической активности, а также в сопоставлении с отдельными параметрами, характеризующими уровень гистологической активности (таб.33-37).

Анализируя показатели иммунного статуса (относительное содержание субпопуляций лимфоцитов периферической крови, несущих маркеры CD3, CD4, CD8, CD16, CD25, HLADR, CD20, CD38) у больных хроническими вирусными гепатитами В и С в сопоставлении с уровнем гистологической активности и с отдельными параметрами, характеризующими гистологическую активность установлено, что у больных с высоким уровнем гистологической активности и в группе больных с выраженностью перипортальных некрозов 5 баллов снижение иммунорегуляторного индекса носит достоверный характер, при этом во всех группах больных определена тенденция к снижению иммунорегуляторного индекса по сравнению с контрольной группой. Одним из важнейших критериев, отражающим состояние иммунодефицита, является иммунорегуляторный индекс, который может рассматриваться в качестве диагностического критерия наличия иммунодефицита у больных хроническими вирусными гепатитами В и С.

Субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови

Содержание в % СПЗ СВ4 ст ИР СП 16 спи нипл сто спзя

инимапьная стивность ■3 балла медиана мин.макс 75,1 57:88,7 39,5 30:45,8 31 18,1:40,7 1,13 0,9:2,2 12 5,8:27 3 1:6,9 12 8:36,1 9,4 6,2:32,4 27,9 20;39,1

изкая стивность ■8 баллов медиана мин: макс «9,5 48:83 34,5 24:55 27,5 22:43,3 1,2 0,6:2,5 12 2:25 2 0,5:6,9 12 5:20 10,3 3:19,5 25 18,5:34,3

меренная стивность ■12 баллов медиана мин.макс 71 52:80,6 35,9 21:56 26 21:49,8 1,25 0,5:2,7 12 4:24,9 2,6 0,5:8,7 14 7,4:24,9 12,1 6,2:23 25,8 17,5:39

ысокал стивность 3-18 баллов медиана мин:макс 62 43:75 33 22:42,5 27 23:32 0,9:1,2 12 8:15,5 2 0,2:4,4 8 6:12,3 3 3:9,6 29 20:38,2

энтроль медиана мин:макс 70 43:97 42,5 25:60 29,5 12:47 1,75 1,3:2,3 15 7:23 2,5 0:5,5 11 5:17 10,5 2,5:18,5 32 16:48

Таблица 34

Субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови

Содержание в % соз СВ4 сои ИР со 16 СВ25 Ш.ЛПК сом спзя

ерипортальные екрозы баллов медиана мин:макс 79,5 57:88,7 40,9 30:45,8 34,4 24:40,7 1,1 0,9:1,6 10,2 5,8:27 4,8 3:6,9 11,6 8:14,5 8,2 5,8:12 28,7 20:39,1

ерипортальные екрозы балл медиана мин:макс 62 57:72,5 32 30:37 29 21:34 1,1 1:1,6 12 7:17 2,5 2:5 8 5:11 12 7:19,5 25,5 25:36

ерипортальные екрозы балла медиана мин:макс 66 48:77 32 22:47 28 23:40 1 0,7:2,4 11 6:25 2 0,5:4 12 8:20 9,5 3:18 25 21:27

ерипортальные екрозы балла медиана мин:макс 69,5 52:72,5 35,9 21:49 28 22:43,3 1,2 0,6:1,8 13,7 10:16,6 6 0,5:8,7 17,5 12:24,9 12,3 7:16. 23,3 18,5:34,3

ерипортальные екрозы балла медиана мин:макс 73,1 52:80,6 35,5 23,6:56 26,5 21:49,8 1,3 0,5:2,7 13 4:25 2,6 2:4 13,5 7,4:24 12,1 6,2:23 32,2 17,5:39

ерипортальные екрозы баллов медиана мин:макс 68,5 53:77 37,8 31:47,5 29,5 27:38 1,1 0,7:1,2 13,8 11:27 2,3 0,2:4,8 10,2 8:15,6 6,3 3:9,6 33,6 29:38

онтроль медиана мнн:макс 70 43:97 42,5 25:60 29,5 12:47 1,75 1,3:2,3 15 7:23 2,5 0:5,5 11 5:17 10,5 2,5:18,5 32 16:48

Таблица 35

Субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови

в сопоставл ениис выраженностью внутрияольковои дегене рации

Содержание в % сиз С 1)4 СПИ ИР ст 6 СП25 тлт> я сто спзх

нутридольков [егенерация балл медиана мин:макс 67,6 57:88,7 35,5 22:45,8 31 24:49,8 1,09 0,5:1,6 14,5 5,8:27 3,5 2:6,9 и,1 7,4:16 8,2 6,2:12 27,5 20:37,3

1Нутридольков ^генерация ! балла медиана мин:макс 72,5 48:83,8 37 24:49 29 23:43,3 1,1 0,6:2,4 8 6:25 3,6 0,5:6,9 14 8:20 12 3:18 25 17,5:39,1

1нутридольков (егенерация 1 балла медиана мин: макс 57 52:77 33 21:47 27 22:30,8 1,23 0,95:1,7 12 7:25 2 0,5:8,7 12 5:24,9 12 7:23 24,8 22:39

Знутридальков (егенерация 1 балла медиана мин:макс 73 62:77 44,3 33:56 26 21:32 1,55 1,2:2,7 11 4:15,5 2,3 0,2:4,4 13,7 8:22 12,8 3:18 33,6 29:38,2

сонтроль медиана мин:макс 70 43:97 42,5 25:60 29,5 12:47 1,75 1,3:2,3 15 7:23 2,5 0:5,5 И 5:17 10,5 2,5:18,5 32 16:48

Субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови в сопоставлении с выраженностью портального воспаления

Содержание в % С1)3 С1Н см ИР СП ¡6 СП25 шли к СП20 СОЗВ

портальное воспаление 1 балл медиана ин:макс 62 57:88,7 34 30:45,8 29,5 24:40,7 1,1 0,9:1,6 12 7.27 3 0,2:6,9 10,8 5:16 1 3:19,5 27,5 20:39,1

портальное воспаление 2 балла медиана мин:мак с 67 57:77 37 22:49 28 23:40 1.1 0,7;2,4 12 6:19 2 0,5:5 12 8:20 7 3:18 23 18,5:27

портальное воспаление 3 балла медиана мин:мак с 69,5 48:80,6 30 21:47 27 22:43,3 1,1 0,6:1,7 12 6,6:25 3,2 0,5:6,9 14 12:24 12 7:23 27 17,5:34,3

портальное воспаление 4 балла медиана мингмак с 72,1 52:77 3%г 23,6:56 28,9 21:49,8 1,3 0,5:2,7 14,6 4:25 4,2 2:8,7 13,7 7,4:24,9 12,7 6,2:18 37,8 24,6:39

Таблица 37

Субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови _в сопоставлении с выраженностью фиброза_

Содержание в % СШ С04 СС8 ИР СВ16 Сй25 тлт С020 СОЗ&

фиброз 0 баллов медиана мин:мак с 79,5 65:88,7 42,7 27:45,8 38,4 23:40,7 1.1 0,9:1,5 7,9 5,8:12 4,8 2:6,9 11,2 8:16 7,8 5,8:19,5 29,5 25:39,1

фиброз 1 балл медиана мин:мак с 59,5 48:80,6 33 21:49 27,5 22:43,3 1,2 0,6:2,4 15,1 6,6:27 3 0,5:8,7 12 5:24,9 12 3:23 25 17,5:39

фиброз 2 балла медиана мин:мак с 75 73:77 37 32:44 33 26:40 1,2 0,9:1,1 7 6:9 2 1:4 16 12:25 15 12:19 27 21:38

фиброз 3 балла медиана мин.мак с 74,1 62:77 37,8 23,6:56 29,5 21:49,8 1,3 0,5:2,7 13,8 4:24,9 4 0,2:4,4 10,2 7,4:15 7,9 3:18 37,3 29:38,2

Контроль медиана мин:мак с 70 43:97 42,5 25:60 29,5 12:47 1,75 1,3:2,3 15 7:23 2,5 0:5,5 11 5:17 10,5 2,5:18,5 32 16:48

У больных во всех группах выявлена тенденция к снижению содержания натуральных киллеров (ЫК-клетки), Т- хелперов периферической крови (С04+ лимфоцитов) на фоне повышения содержания субпопуляции Т-лимфоцитов (СЭЗ+) у больных с минимальным уровнем гистологической активности и с отсутствием перипортальных некрозов и фиброза. У большинства больных наблюдается снижение содержания лимфоцитов, несущих маркер СБ38+ ,по сравнению со здоровыми донорами. Наиболее выраженные изменения, установленные при высоком уровне гистологической активности, характеризуются снижением относительного содержания субпопуляций лимфоцитов СБЗ+, С04+, СБ 16+, С020+, СБ38+ и НЬАБ11+ и иммунорегуляторного индекса. Характер изменений у больных с 4 баллами портального воспаления носит несколько иной характер и сопровождается увеличением количества В-лимфоцитов периферической крови (С020+) и лимфоцитов, экспрессирующих активационные молекулы СВ25, СЭ38, НЬАОИ, что

отражает формирование аутоиммунных нарушений по мере нарастания некротических процессов в паренхиме печени. Натуральные киллеры являются основными эффекторами врожденного иммунитета и наряду с нейтрофилами представляют первую линию обороны от чужеродных агентов, обеспечивая реализацию иммунных реакций еще до развития приобретенного иммунитета. Таким образом, снижение у всех больных содержания лимфоцитов, экспрессирующих маркеры CD4+ и CD16+, свидетельствует о недостаточности клеточного звена иммунитета, что подтверждается в работах многих отечественных и зарубежных исследователей (Chang K.M. et al. 2001, Покровский В.И., Непомнящих Г.И., Толоконская Н.П. 2003). В свою очередь снижение у всех больных содержания лимфоцитов, экспрессирующих маркеры CD4+ приводит к нарушению подавления активности аутореактивных Т-клеток и реализации аутоиммунных проявлений.

Описанные изменения наблюдаются на фоне повышения содержания субпопуляции лимфоцитов CD3+ (субпопуляция Т-лимфоцитов) на начальной стадии развития патологического процесса в печени - у больных с минимальным уровнем гистологической активности (1-3 балла), у больных с отсутствием перипортальных некрозов (0 баллов) и у больных с отсутствием фиброза (0 баллов). Повышение содержания лимфоцитов CD3+ периферической крови может быть отражением активации приобретенного иммунитета в процессе формирования специфического иммунного ответа. Однако уже на начальном этапе наблюдается снижение субпопуляции CD4+ лимфоцитов периферической крови, участвующих в развитии клеточного иммунного ответа и являющихся продуцентом IL-2 - неспецифического сигнала для формирования специфического клона цитотоксических лимфоцитов (CD8+) (Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. 2000, Никитин В.Ю., Жданов К.В. 2004). Во всех группах больных отмечается снижение иммунорегуляторного индекса, который в настоящее время рассматривается как важнейший показатель иммунодефицита, а у больных с высоким уровнем гистологической активности и в группе больных с выраженностью перипортальных некрозов 5 баллов снижение иммунорегуляторного индекса носит достоверный характер по сравнению с контрольной группой. Сходные данные были получены и в исследованиях других авторов (Комарова Д.В., Цинзерлинг В.А. 1999, Chang K.M. et al. 2001, Hempel G., Galle P.R. 2000). У большинства больных наблюдается снижение содержания лимфоцитов, несущих маркер CD38+ по сравнению со здоровыми донорами. Поверхностная молекула CD38+ экспрессируется на активированных Т- и В- лимфоцитах и снижение содержания этой субпопуляции лимфоцитов отражает нарушение процессов активации и пролиферации лимфоцитов .

Наиболее выраженные изменения найдены нами при высоком уровне гистологической активности, когда наблюдается не только снижение субпопуляций лимфоцитов, отвечающих за развитие клеточного иммунного ответа (CD3+, CD4+, CD 16+ лимфоцитов) и иммунорегуляторного индекса, но и снижение содержания лимфоцитов CD20+, отвечающих за развитие гуморального иммунитета, а также снижается содержание активационных молекул CD38+ Снижение содержания. CD38+ может приводить к нарушению представления антигена, что в конечном итоге препятствует развитию приобретенного иммунитета. Другой характер изменений наблюдается у больных с 4 баллами портального воспаления, когда увеличивается количество B-лимфоцитов периферической крови (CD20+) и лимфоцитов, экспрессирующих активированные молекулы CD25+, CD38+, HLADR+, что является предпосылкой для развития аутоиммунных проявлений.

Следовательно, у большинства обследованных больных нами выявлена тенденция к изменению содержания субпопуляций лимфоцитов периферической крови, отвечающих за развитие клеточного иммунного ответа, что, возможно, имеет решающее значение в развитии длительной персистенции вируса и хронизации вирусного гепатита (Соколов Е.И. 1998, Ferrari С. et al. 1999).При изучении субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови по каждому параметру индекса гистологической активности установлено, что у больных по мере нарастания выраженности перипортальных некрозов и портального воспаления, внутридольковой дегенерации и фиброза имеется морфофункциональная основа для формирования аутоиммунных процессов, так как увеличивается количество лимфоцитов, экспрессирующих HLADR+ и снижается популяция CD4+ лимфоцитов по сравнению со здоровыми донорами.

Совокупность описанных изменений в популяции лимфоцитов периферической крови не отражают в полной мере основные реакции иммунитета, направленные против вирусных антигенов, которые происходят в ткани печени. В тоже время, участие Т лимфоцитов в иммунных реакциях in situ находит отражение в образовании в ткани печени лимфоидных скоплений, причём именно с этими лимфоцитами связывают продукцию цитокинов напрямую увеличивающих количество активированных форм лимфоцитов в периферической крови как проявление системного иммунного ответа на фоне местной иммунной реакции (Апросина З.Г., Серов В.В. 1995, Жданов К.В., Лобзин Ю.В. 2003, Mosnier JF. et al. 1993, Cecere A. et al. 2004). Т-лимфоцитам отводится ключевая роль в развитии АИГ. В пользу клеточных иммунных реакций с вовлечением цитотоксических Т-лимфоцитов, как наиболее вероятных эффекторов, свидетельствует состав клеточных инфильтратов в ткани печени при АИГ: повышенное количество лимфоцитов-хелперов в портальных трактах, преобладание супрессорных/цитотоксических лимфоцитов в участках ступенчатого некроза, наличие В-клеток и натуральных киллеров. Морфологические изменения печени при АИГ являются характерными, но неспецифичными: выявляется картина хронического гепатита высокой степени активности - перипортальный гепатит со ступенчатыми или мостовидными некрозами с преимущественно лимфо-плазмоцитарной инфильтрацией. Могут обнаруживаться признаки лобулярного гепатита с выраженной плазматической реакцией. Эти морфологические изменения печени при АИГ наблюдаются также с различной частотой у больных с ХВГ. Ни один гистологический признак не является специфичным для АИГ, а отсутствие плазматических клеток в портальных инфильтратах не исключает этот диагноз (Czaja A.J., Freese D.K. 2002).

В связи с вышеизложенным представляло интерес изучить особенности лимфоидной инфильтрации в ткани печени у больных хроническими вирусными гепатитами В и С по данным гистологического исследования гепатобиоптатов с последующим определением фенотипа иммунных клеток методом иммуноцитохимии и иммуногистохимии. При ХГС и ХГВ, установлена выраженная лейкоцитарная инфильтрация печени, которая возникала, а затем распространялась внутрь печеночных долек на ранних этапах инфекционного процесса. В лейкоцитарных инфильтратах преобладали клетки лимфоидного ряда, при активизации процесса в этих инфильтратах появлялись в большем количестве активированные лимфоциты и макрофаги. Внутридольковые синусоидные капилляры были расширены и в них выявлялись в большом количестве лимфоциты, макрофаги и активированные купферовские клетки. При изучении препаратов печени, окрашенных по Ван-Гизону

установлено, что локализация участков развития соединительной ткани печени совпадает с конфигурацией области лейкоцитарной инфильтрации, что подтверждает участие МНК печени в развитии фиброза печеночной ткани.

Известно, что при АИГ клеточные инфильтраты преимущественно состоят из лимфоцитов и плазматических клеток, которые проникают между печёночными клетками на фоне формирования фиброза. Однако, при спонтанной или лекарственной ремиссии, сопровождающейся снижением активности в паренхиме печени, может наблюдаться исчезновение плазматических клеток на фоне сохранения лимфоидной инфильтрации. Следовательно, ни один гистологический признак не является специфичным для АИГ, в то же время, отсутствие плазматических клеток в портальных инфильтратах не исключает этот диагноз. Большинство изменений аутоиммунного характера является следствием отложения в тканях внеклеточных матриксных белков. Полученные нами результаты гистологического исследования гепатобиоптатов соответствуют морфологическим изменениям в печени как при АИГ, так и при ХВГ, поскольку для АИГ нет специфичных гистологических признаков.

Для иммуноцитологического анализа достаточное количество фиброз развивается в результате пролиферации фибробластов, т.е. при АИГ и ХВГ формирование фиброза имеет общие механизмы, мононуклеарных лейкоцитов удалось выделить только из гепатобиоптатов пациентов с выраженной лимфоидной инфильтрацией, что в основном наблюдалось у больных ХГВ и ХГС с умеренной и высокой гистологической активностью гепатита. Согласно литературным данным морфологическая картина АИГ соответствует тяжелому течению ХВГ, активность процесса выражена неравномерно, и некоторые участки могут быть практически нормальными. (Ш. Шейлок. 2002).

Нам удалось определить, что лейкоцитарные инфильтраты печени у больных хроническими вирусными гепатитами В и С представлены преимущественно следующими субпопуляциями лимфоцитов: 1) Т-лимфоцитами (CD3+); 2) NKT-клетками (CD3+CD16+CD56+); 3) NK-клетками (CD16+CD56+); 4) Т per. лимфоцитами (CD4+CD25+); 5) цитотксическими лимфоцитами (CD8+).

Выявленные в лейкоцитарном инфильтрате печени у больных хроническими вирусными гепатитами цитотоксические лимфоциты (CD8+) и NK-клетки (CD16+CD56+) сходны по составу с клетками в инфильтратах ткани печени при АИГ (Апросина З.Г. 2002). В паренхиме печени этих больных нами впервые был выявлен комплекс Т-регуляторных клеток (CD4+CD25+). Комплекс этих Т-регуляторных клеток (CD4+CD25+) вызывает супрессию клеточного иммунного ответа при элиминации вируса и поврежденных тканей и обеспечивает развитие персистирующей вирусной инфекции с аутоиммунным компонентом (Kondo Y.. 2006). В нормальных условиях комплекс Т-регуляторных клеток анергичен, но способен к распознаванию и к прямой пролиферации в ответ на антигенемию. Следовательно, выделенный нами в лейкоцитарном инфильтрате печени комплекс Т-регуляторные клеток (CD4+CD25+) свидетельствует о формировании аутоиммунных реакций в печеночной ткани.

У обследованных нами больных мы выявили в гепатобиоптате лимфоидное воспаление и не выявили признаков некроза. Данную морфологическую картину можно объяснить присутствием в печеночной ткани комплекса Т-регуляторных клеток (CD4+CD25+).

Следовательно, выявленные нами аутоиммунные проявления в сыворотке крови находят своё отражение и в морфологических изменениях печеночной ткани,

причём морфологические изменения, характерные для ЛИГ, наблюдаются в основном у больных ХГВ и ХГС с умеренной и высокой гистологической активностью гепатитами, что в основном соответствует тяжести течения хронических вирусных гепатитов.

Выявленный в гепатобиоптате у больных хроническими вирусными гепатитами комплекс Т регуляторных лимфоцитов (CD4+CD25+) свидетельствует о наличии морфофункциональной основы для формирования аутоиммунных проявлений на фоне персистирующей вирусной инфекции у больных вирусными гепатитами.

ВЫВОДЫ

1. Установлено наличие аутоантител (ASMA, ANA, AMA, anti-LKM-1), ревматоидного фактора, криоглобулинов у больных острыми вирусными гепатитами различной этиологии легкого и среднетяжелого течения в разгар клинических проявлений и в периоде ранней реконвалесценции.

2. Наиболее высокий процент встречаемости аутоантител, с преимущественным преобладанием ASMA, зарегистрирован у больных острыми вирусными гепатитами А (50%) и В (69%).

3. Выявлено наличие аутоантител (ASMA, ANA, AMA, anti-LKM-1), ревматоидного фактора, криоглобулинов у больных хроническими вирусными гепатитами В и С.

4. Аутоантитела, ревматоидный фактор и криоглобулины выявляются с одинаковой частотой у больных хроническими вирусными гепатитами независимо от степени гистологической активности.

5. Исследование концентрации ИЛ-ip и ФНО-а в сыворотке крови у больных ОВГ в разгар клинических проявлений и в периоде ранней реконвалесценции выявило достоверное повышение их уровня на фоне низких значений ИЛ-6 в сравнении с контролем, в то время как у больных ХВГС различной степени активности уровни всех трёх цитокинов (ИЛ-ip, ФНО-а и ИЛ-6) достоверно превышали контрольные значения.

6. Аутоиммунные проявления у больных ОВГА и ОВГВ сопровождались значительным повышением концентрации ИЛ-ip и ФНО-а, в отличие от группы больных без наличия аутоантител.

7. Аутоиммунные проявления у больных ОВГС легкого течения сопровождались умеренным повышением уровня цитолитических ферментов на фоне незначительного повышения концентрации ИЛ-ip и нулевых значений ФНО-а и ИЛ-6.

8.У больных ХВГС умеренной степенью активности и ХВГС с исходом в цирроз без аутоиммунных проявлений уровни ИЛ-6 и ФНО-а были достоверно выше, чем у больных ХВГС умеренной степенью активности и ХВГС с исходом в цирроз аутоиммунными нарушениями.

9. Установлено снижение продукции ИФН-а МНПК индуцированными NDV у больных с ХВГС независимо от степени гистологической активности по сравнению со здоровыми донорами, что отражает отсутствие резервных возможностей МНПК и вероятно обусловливает развитие аутоиммунных проявлений, опосредованных ИФН-а.

10. У больных ХВГ по мере нарастания выраженности перипортальных некрозов и портального воспаления, внутридольковой дегенерации и фиброза выявлено увеличение количества лимфоцитов, экспрессирующих HLADR и снижение

популяции CD4+ лимфоцитов по сравнению со здоровыми донорами, что является морфофункциональной основой для формирования аутоиммунных процессов.

11. Выявленный в гепатобиоптате у больных хроническими вирусными гепатитами комплекс Т регуляторных лимфоцитов (CD4+CD25+) свидетельствует о наличии морфофункциональной основы для формирования аутоиммунных проявлений на фоне персистирующей вирусной инфекции..

12. Для всесторонней оценки клинического течения и прогноза у больных хроническим вирусным гепатитом В и С необходимо наряду с определением показателей гистологической активности и фиброза оценивать выраженность, распространенность и субпопуляционный состав лейкоцитарных инфильтратов печени в комплексе с определением аутоантител (ASMA, ANA, AMA, anti-LKM-1) и ФНО-а в сыворотке крови.

Практические рекомендации

1.У больных вирусными гепатитами различной этиологии на ранних этапах инфекционного процесса рекомендуется определять ревматоидный фактор, криоглобулины и аутоантитела (ASMA, ANA, AMA, anti-LKM-1), для подбора адекватной, в том числе и противовирусной терапии.

2. Учитывая, что сывороточные уровни свободных цитокинов не отражают истинных концентраций цитокинов в сыворотке крови рекомендуется определение стимулированной NDV и ФГА продукции цитокинов МНПК с изучением субпопуляции лимфоцитов в периферической крови для прогноза течения заболевания.

3. При выявлении у больных хроническими вирусными гепатитами аутоиммунных проявлений (ревматоидного фактора, криоглобулинов, ASMA, ANA, AMA, anti-LKM-1) рекомендуется при оценке морфофункционального состояния гепатобиоптатов определять субпопуляционный состав лейкоцитарных инфильтратов в паренхиме печени с целью выявления комплекса Т регуляторных лимфоцитов (CD4+CD25+), также определять выраженность и распространенность лейкоцитарных инфильтратов для адекватной оценки активности патологичесекого процесса.

Список печатных работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Волчкова Е.В., Умбетова К.Т., Данилина Г.А. Клинико-патогенетические особенности течения вирусного гепатита А. //Вторая международная конференция «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями». Материалы конференции. Санкт-Петербург, 1998, с.115.

2. Умбетова К.Т., Волчкова Е.В., Изимбергенова Т.Т., Прошин Н.Ю., Алленов М.Н., Кокорева Л.Н. Патогенетические особенности иммунного ответа у больных вирусным гепатитом А // V Всероссийский съезд врачей-инфекционистов. Тезисы докладов. Москва, 1998, с.397.

3. Умбетова К.Т., Волчкова Е.В., Данилина Г.А., Кокорева Л.Н., Баулина A.A., Полуэктова В.Б., Студенникова Л.Н. Проявления цитотоксической реакции у больных вирусным гепатитом А. // V Всероссийский съезд врачей-инфекционистов. Тезисы докладов. Москва, 1998, с.398.

4. Волчкова Е.В., Умбетова К.Т., Данилина Г.А., Кокорева Л.Н., Прошин Н.Ю., Зуевская С.Н. Прогностическое значение белков острой фазы у больных острым вирусным гепатитом В. //Гепатит В, С и D - проблемы диагностики, лечения и профилактики. Тезисы докладов Ш-ей Российской научно-практической конференции с международным участием. Москва, 22-24 июня 1999, с.40-41.

5. Пак С.Г., Волчкова Е.В., Умбетова К.Т. Клинико-патогенетические особенности течения вирусного гепатита А. //Терапевтический архив, 1999, №11, с.8-10.

6. Пак С.Г., Волчкова Е.В., Умбетова К.Т., Данилина ГА., Зуевская С.Н. Иммунно-адаптационные механизмы при развитии интоксикационного синдрома у больных вирусными гепатитами. //Современные проблемы диагностики и терапии гепатитов. Материалы научно-практической конференции с международным участием. Харьков, 2000, с. 99-101.

7. Умбетова К.Т., Волчкова Е.В., Свиридова М.Б., Грачев C.B. Особенности иммунного ответа у больных вирусным гепатитом А. //Инфекционные болезни на рубеже XXI века. Материалы научно-практической конференции. Москва, часть II, 2000, с.60-61

8. Волчкова Е.В., Алленов М.Н., Умбетова К.Т., Потекаева С.А., Свиридова М.Б. Гуморальные адаптационные механизмы при развитии синдрома интоксикации у больных острыми и хроническими вирусными гепатитами. // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. Приложение №9. Материалы пятой Российской конференции «Гепатология сегодня», Москва, 2000, №1, том X, с.6, Абстракт №8.

9. Волчкова Е.В., Алленов М.Н., Умбетова К.Т., Свиридова М.Б., Данилина Г.А., Грачев C.B. Патогенетическая роль регуляторных цитокинов в течении вирусного гепатита А. // Инфекции, обусловленные иерсиниями (иерсиниоз, псевдотуберкулез) и другие актуальные инфекции. Материалы международной конференции. Санкт-Петербург, 29-31 мая 2000, с.84.

10. Волчкова Е.В., Свиридова М.Б., Умбетова К.Т., Данилина Г.А., Иванова И.В., Грачев C.B., Пак С.Г. Динамика уровня регуляторных цитокинов у больных вирусным гепатитом С. //«Гепатит С (Российский консенсус)». Тезисы докладов научно-практической конференции. Москва, 2000, с.24-25

11. Умбетова К.Т., Иванова И.В., Петрова Е.В., Свиридова М.Б., Нечаева И.П., Волчкова Е.В. Роль регуляторных цитокинов в патогенезе вирусного гепатита А. //"Актуальные проблемы инфекционной патологии" Материалы юбилейной научно-практической конференции посвященной 100-летию клинической инфекционной больницы №1. Казань, 2000, с.226-227

12. Волчкова Е.В., Пак С.Г., Умбетова К.Т. Динамика уровня белков острой фазы при вирусных поражениях печени. // Терапевтический архив, 2000, №11, с. 18-21.

13. Волчкова Е.В., Алленов М.Н., Умбетова К.Т., Свиридова М.Б., Грачев C.B., Пак С.Г. Сравнительная характеристика динамики регуляторных цитокинов у больных вирусными гепатитами А, В, С. //Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. Приложение №12. Материалы шестой Российской конференции «Гепатология сегодня». Москва, март 2001, №1, том XI, с.7, Абстракт №11.

14. Умбетова К.Т., Свиридова М.Б., Грачев C.B., Волчкова Е.В. Место и значение регуляторных цитокинов в течении вирусного гепатита А. //«Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины». Материалы II Российской конференции молодых ученых России с международным участием. Москва, 24-28 апреля 2001, том I, с. 212

15. Свиридова М.Б., Алленов М.Н., Умбетова К.Т., Прошин Н.Ю., Грачев C.B., Волчкова Е.В. Динамика уровней ИЛ-1р, ИЛ-6 и ФНО-а у больных вирусными гепатитами В и С. //Гепатит В, С и D - проблемы диагностики, лечения и профилактики. Тезисы докладов IV Российской научно-практической конференции, г. Москва, 2001г., с.309-310.

16. Волчкова Е.В., Белая О.Ф., Зуевская С.Н., Умбетова К.Т., Данилина Г.А., Петрова Е.В., Иванова И.В. Этиологическая структура острых вирусных поражений печени у больных с первичным выявлением anti-HCV. //Гепатит В, С и D - проблемы диагностики, лечения и профилактики. Тезисы докладов IV Российской научно-практической конференции, г. Москва, 2001г., с.63-64.

17. Умбетова К.Т., Свиридова М.Б., Алленов М.Н., Грачёв C.B., Волчкова Е.В. Значение провоспалительных цитокинов в течении и исходах вирусных гепатитов А, В и С. //Клиническая лабораторная диагностика. 2001, №10, с. 18.

18. Волчкова Е.В., Алленов М.Н., Сундукова А.Н., Умбетова К.Т., Данилина Г.А., Свиридова М.Б., Грачёв C.B., Пак С.Г. Спектр антител к HCV в сыворотке крови больных хроническим гепатитом С. //Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. Приложение №16. Материалы седьмой Российской конференции «Гепатология сегодня». Москва, 18-20 марта 2002, №1, том XII, с.25, Абстракт №74.

19. Умбетова К.Т., Волчкова Е.В., Свиридова М.Б., Алленов М.Н., Данилина Г.А., Грачёв C.B. Динамика провоспалительных цитокинов у больных вирусными гепатитами А, В и С. //Материалы VIII съезда всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. Москва, 26-28 марта 2002,том 3, с.78.

20. Иванова И.В., Волчкова Е.В., Умбетова К.Т., Сундукова А.Н., Свиридова М.Б., Данилина Г.А., Беликов Д.В., Пак С.Г. Аутоиммунные проявления при остром вирусном гепатите С. //Тезисы докладов. III Всероссийская конференция «Гомеостаз и инфекционный процесс». Сочи, 2002, с.45

21. Умбетова К.Т., Алленов М.Н., Иванова И.В., Волчкова Е.В., Грачев C.B. Спектр аутоантител при острых вирусных гепатитах. //Инфекционные и паразитарные болезни в современном обществе. Клинико-лабораторное обеспечение инфектологии. Материалы юбилейной научно-практической конференции, посвященной 80-летию образования кафедры инфекционных болезней ММА им. И.М. Сеченова. Москва, 2003, с.15-17.

22. Свиридова М.Б., Умбетова К.Т., Аленов М.Н., Волчкова Е.В., Богачева Е.А., Грачев C.B., Пак С.Г. Роль цитокинов ИЛ-lß, ИЛ-6 и ФНО-а в патогенезе острых вирусных гепатитов А, В, С. //Инфекционные и паразитарные болезни в современном обществе. Клинико-лабораторное обеспечение инфектологии. Материалы юбилейной научно-практической конференции, посвященной 80-летию образования кафедры инфекционных болезней ММА им. И.М. Сеченова. Москва, 2003, с. 156-158.

23. Умбетова К.Т., Свиридова М.Б., Волчкова Е.В., Грачев C.B., Пак С.Г. Уровни ИЛ-lß, ИЛ-6 и ФНО-а у больных дельта-гепатитом в динамике инфекционного процесса. //Инфекционные и паразитарные болезни в современном обществе. Клинико-лабораторное обеспечение инфектологии. Материалы юбилейной научно-практической конференции, посвященной 80-летию образования кафедры инфекционных болезней ММА им. И.М. Сеченова. Москва, 2003, с. 158-159

24. Волчкова Е.В., Алленов М.Н., Иванова И.В., Умбетова К.Т., Пак С.Г. Выявление аутоиммунных антител при острых вирусных гепатитах. // Российский журнал Гастроэнтерологии, Гепатологии, Колопроктологии. Приложение№18. Материалы Восьмой Российской конференции «Гепатология сегодня», 17-19 марта 2003, Москва. №1,том XIII, стр.19, Абстракт №55.

25. Волчкова Е.В., Алленов М.Н., Умбетова К.Т., Иванова И.В., Богачева Е.А., Грачев C.B., Пак С.Г. Спектр аутоантител в динамике инфекционного процесса при острых вирусных гепатитах. // Гепатиты в практике терапевта, семейного врача и инфекциониста. Современные методы диагностики и терапии. Материалы научно-практической конференции с международным участием. Харьков, 11-12 березня 2003, с. 53-54.

26. Свиридова М.Б., Аленов М.Н., Умбетова К.Т., Богачева Е.А., Данилина Г.А., Грачёв C.B. Динамика уровня регуляторных цитокинов у больных острыми вирусными гепатитами А, В, С и Дельта. //VI Российский съезд врачей-инфекционистов. Санкт-Петербург, 29-31 октября 2003, с. 126

27. Умбетова К.Т., Волчкова Е.В., Аленов М.Н., Иванова И.В., Сундукова А.Н., Пак С.Г. Выявление аутоантител в динамике инфекционного процесса при острых вирусных

гепатитах различной этиологии. // VI Российский съезд врачей-инфекционистов. Санкт-Петербург, 29-31 октября 2003, с.342.

28. Волчкова Е.В., Алленов М.Н., Умбетова К.Т., Иванова И.В., Пак С.Г. Аутоиммунные проявления при острых вирусных гепатитах. //Терапевтический архив, 2003, №11, с.11-14.

29. Волчкова Е.В., Алленов М.Н., Умбетова К.Т., Иванова И.В., Пак С.Г. Аутоиммунные нарушения при острых вирусных гепатитах различной этиологии. //Врач, 2003, №12, с.21-23.

30. Пак С.Г., Волчкова Е.В., Умбетова К.Т. Гуморальные и клеточные адаптационные механизмы при развитии интоксикационного синдрома у больных острыми вирусными гепатитами. // Терапевтический архив, 2004, №11, с.61-65.

31. Иванова И.В., Волчкова Е.В., АпеновМ.Н., Сундукова А.Н., Умбетова К.Т., Чуланов В.П., Богачева Е.А., Прохорова H.A. Выявление аутоиммунных нарушений у больных вирусным гепатитом С на ранних этапах инфекционного процесса. //Российский журнал Гастроэнтерологии, Гепатологии, Колопроктологии. Приложение №2 Материалы девятой Российской конференции «Гепатология сегодня». Москва, 22-24 марта 2004, №1, том XIV, с.13, Абстракт №39

32. Умбетова К.Т., Волчкова Е.В., Иванова И.В., Свиридова М.Б., Прохорова H.A. Аутоиммунные проявления при вирусном гепатите А. // Российский журнал Гастроэнтерологии, Гепатологии, Колопроктологии. Приложение №2 Материалы девятой Российской конференции «Гепатология сегодня». Москва, 22-24 марта 2004, №1, том XIV, с.26, Абстракт №92

33. Алленов М.Н., Иванова И.В., Волчкова Е.В., Богачева Е.А., Прошин Н.Ю., Свиридова М.Б., Умбетова К.Т., Пак С.Г.Аутоиммунные нарушения на ранних этапах заболевания вирусным гепатитом С. //Актуальные вопросы экспериментальной и клинической медицины. Материалы научно-практической конференции, посвященной 35-летию лечебного факультета МГМСУ. Москва, 2004 г., с.258-259.

34. Свиридова М.Б., Умбетова К.Т., Волчкова Е.В., Грачев С.В.Концентрация провоспалительных цитокинов ИЛ-lß, ИЛ-6 и ФНО-а у больных острыми вирусными гепатитами А, В, С в динамике заболевания. //Актуальные вопросы экспериментальной и клинической медицины. Материалы научно-практической конференции, посвященной 35-летию лечебного факультета МГМСУ. Москва, 2004 г., с.316-317.

35. Умбетова К.Т., Алленов М.Н., Свиридова М.Б., Иванова И.В., Волчкова Е.В., Лазарева A.C. Динамика аутоантител при острых вирусных гепатитах. //Актуальные вопросы экспериментальной и клинической медицины. Материалы научно-практической конференции, посвященной 35-летию лечебного факультета МГМСУ. Москва, 2004 г., с.322-323.

36. Умбетова К.Т., Свиридова М.Б., Иванова И.В., Волчкова Е.В Динамика аутоантител при остром вирусном гепатите В. //Вирусный гепатит В - диагностика, лечение и профилактика (к 40-летию открытия HbsAg). Тезисы докладов Российской научно-практической конференции с международным участием. 19-20 мая 2004 г. Москва, с. 197-198

37. Умбетова К.Т., Волчкова Е.В., Киселевский М.В., Чжан М.Ю., Петрова Е.В., Лазарева A.C. Цитокиновый профиль у больных хроническими вирусными гепатитами. // VI Российской научно-практической конференции с международным участием «Вирусные гепатиты-проблемы эпидемиологии, диагностики, лечения и профилактики». Москва, 24-26 мая 2005, с. 424-425

38. Лазарева А. С., Умбетова К. Т. Уровень цитокинов у больных хроническим вирусным гепатитом С. // Материалы VI Международной научно-практической конференции «Здоровье и Образование в XXI веке». Москва, 8-10 декабря 2005, с. 277.

39. Алленов М.Н., Умбетова К. Т., Сундукова А.Н., Иванова И.В., Свиридова М.Б., Волчкова Е.В. Динамика уровней криоглобулинов и ревматоидного фактора у больных хроническим гепатитом С в зависимости от степени активности процесса. // Материалы Российской научно-практической конференции, посвященной 110-летию кафедры инфекционных болезней Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова «Инфекционные болезни: проблемы здравоохранения и военной медицины». С.Петербург, 22-24 марта, 2006г., с.21.

40. Алленов М.Н., Умбетова К. Т., Иванова И.В., Волчкова Е.В. Динамика криоглобулинов и ревматоидного фактора у больных острым вирусным гепатитом С. //Российский журнал Гастроэнтерологии, Гепатологии, Колопроктологии. Приложение №27. Материалы Одиннадцатой Российской конференции «Гепатология сегодня». Москва, 27-29 марта 2006, с.37.

41. Алленов М.Н., Волчкова Е.В., Умбетова К.Т., Иванова И.В., Сундукова А.Н., Зуевская С.Н., Свиридова М.Б., Пак С.Г. Уровень цитокинов воспаления и характер аутоиммунных нарушений у больных гепатитом С. // Эпидемиология и инфекционные болезни, 2006, №5, с.45-49.

42. Лазарева A.C., Чжан М.Ю., Умбетова К.Т., Петрова Е.В., Волчкова Е.В., Аленов М.Н., Верескунова Н.В., Пак С.Г., Киселевский М.В. Особенности иммунного статуса и цитокинового профиля у больных вирусными гепатитами В и С. // Военно-медицинский журнал, 2006, №3, 66-67.

43. Лазарева A.C., Волчкова Е.В., Умбетова К.Т., Пак С.Г. Сопоставление показателей иммунного статуса с морфологическими изменениями в печени у больных хроническими вирусными гепатитами В и С. //Инфекционные болезни. Приложение №1. Материалы I Ежегодного Всероссийского Конгресса по инфекционным болезням. 30 марта-1 апреля 2009, с.251.

44. Лазарева A.C., Волчкова Е.В., Умбетова К.Т., Чуланов В.П., Пархоменко Ю.Г., Киселевский М.В., Пак С.Г. Особенности цитокинового профиля и субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови у больных хроническими вирусными гепатитами В и С в сопоставлении с выраженностью морфологических изменений печени. //Терапевтический архив, 2009, №4, с.55-60.

Список сокращений

AJIT • аланиновая трансаминаза

ACT - аспарагиновая трансаминаза

AMA - антимитохондриальные антитела

ANA - антинуклеарные антитела

ASMA - антитела к гладкомышечной мускулатуре

Anti-LKM-1 - печеночо-почечные микросомальные антитела

ИЛ-1-ß - интерлейкин 1-ß

ИЛ-4 -интерлейкин 4

ИЛ-6 - интерлейкин - 6

ИФН-а - интерферон а

ИФН-у - интерферон у

КГ - криоглобулины

МНПК - мононуклеары периферической крови

NDV - вирус Ньюкасла

NK - натуральные киллеры

ОВГА - острый вирусный гепатит А

ОВГВ - острый вирусный гепатит В

ОВГС - острый вирусный гепатит С

ОВГД - острый вирусный гепатит Д

РФ - ревматоидный фактор

Thl -Т-хелперы 1 типа

Th2 - Т-хелперы 2 типа

ФГА - фитогемагглютинин

ФНО-а - фактор некроза опухолей

ХВГВ - хронический вирусный гепатит В

ХВГС - хронический вирусный гепатит С

ЩФ - щелочная фосфатаза

Актуальность темы.

В настоящее время в патогенезе вирусных поражений печени особое место отводится аутоиммунным нарушениям, т.к. высокая частота внепечёночных проявлений при хронических гепатитах В и С в сочетании с выявлением широкого спектра аутоантител позволяет предположить роль гепатотропных вирусов в этиологии некоторых аутоиммунных заболеваний. В то же время остаётся открытым вопрос о значении и месте аутоиммунных проявлений в патогенезе вирусных поражений печени.

В настоящее время существует гипотеза, что прогрессирование вирусных инфекций ассоциируется со специфическими дефектами и дисбалансом в системе Thl и Th2 типа. Для Till типа характерен цитокиновый ответ, ассоциирующийся с продукцией ИФН-у и ИЛ-2 в результате антигенной или митогенной стимуляции мононуклеаров периферической крови. Второй вариант - это цитокиновый ответ, присущий Th 2 типа и ассоциирующийся с продукцией ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6 и ИЛ -10. Существует гипотеза, что у лиц, формирующих иммунный ответ по первому типу, хронизации вирусных инфекций не происходит. В случае же формирования персистирующей вирусной инфекции иммунный ответ формируется по второму типу, причём независимо от возбудителя обязательно присутствует аутоиммунный компонент (Walker B.D. 1996). Причиной развития аутоиммунных реакций может служить нарушение баланса цитокинов за счет активации аутореактивных Т-клеток антигенпредставляющими клетками (АПК). Ведущую роль в формировании аутоиммунных реакций играют нарушения дифференцировки именно Т-клеточного звена (63), популяционный состав клеток напрямую связан с цитокиновым профилем, так как под влиянием ИЛ-ip и ФНО-а происходит дифференцировка предшественников Т-клеток (45). Но, не установлено на каком этапе инфекционного процесса острый период или хронический) подключаются эти аутоиммунные реакции.

Нарушение дифференцировки Т-клеточного звена приводит к дисбалансу синтеза провоспалительных цитокинов, которые в свою очередь способствуют реактивации пула аутореактивных лимфоцитов и развитию аутоиммунного процесса.

Известно, что высокий уровень ФНО-а характеризуется иммунологическими реакциями, опосредованными ИФН-у, и в конечном итоге активацией Т-клеточного звена иммунитета, усилением активности натуральных киллеров (NK), росту и дифференцировке В-клеток (17,39,47,51,289). Последние исследования показали, что ассоциированный с макрофагами ФНО-а и экспрессируемые Txl-лимфоцитами ИЛ-2, ИФН-у скорее всего отвечают за активацию и прогрессирование аутоиммунных механизмов в печени (т.е. действуют провоспалительно) (32).

Недавно выявлена особая субпопуляция Т-клеток - комплекс Трегуляторных клеток CD4+/CD25+ (Т per.), которые проявляют i гипопролиферативную активность, обладают способностью угнетать активацию и ингибировать секрецию цитокинов* CD4+/CD25+ Т-хелперами и CD8+ и таким образом препятствуют развитию реакций, направленных на элиминацию чужеродного антигена (91,163,403),. в то же время CD4+/CD25+ (Т per.) сдерживают активацию аутореактивных Т и В^ лимфоцитов, тем самым препятствуют развитию аутоиммунных реакций (45). Данные о роли Т per. лимфоцитов в инициации иммунного ответа в паренхиме печени при хронических вирусных гепатитах и их роли очень малочисленны и противоречивы.

В связи с вышеизложенным представляло интерес установить наличие аутоиммунных проявлений (ASMA, ANA, AMA, РФ, КГ) у больных острыми и хроническим вирусными гепатитами в сопоставлении с показателями цитокинового профиля (ФНО-а, ИЛ-lß, ИЛ-6). Так как. при хронических вирусных гепатитах аутоиммунные нарушения достигают максимальной выраженности необходимо было изучить морфологическую основу формирования этих реакций в печеночной ткани и сопоставить полученные результаты с популяционным составов лимфоцитов в гепатобиоптате и на периферии. Также необходимо было изучить Т-регуляторные клетки (CD4+CD25+) в комплексе со спонтанной и индуцированной продукцией цитокинов МНПК на фоне изучения гистологической активности и фиброза. На основании полученных данных следовало попытаться^ определить роль этих показателей в развитии аутоиммунных проявлений при хронических вирусных гепатитах и возможной коррекции этих нарушений.

Цель.и задачи работы Цель работы сопоставить уровни провоспалительных цитокинов в сыворотке крови, субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови и характер клеточной популяции в печеночной ткани в реализации аутоиммунных нарушений в патогенезе вирусных гепатитов. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить у больных острыми и хроническими ВГ наличие ASMA, AMA, ANA, a-LKM-1, криоглобулинов и ревматоидного фактора в сыворотке крови при различной степени тяжести болезни и активности процесса в ткани печени:

2. Исследовать в динамике заболевания* уровни цитокинов (ИЛ-lß, ИЛ-6, ФНО-а) в сыворотке крови у больных ОВГ различной этиологии.

3. Исследовать уровни цитокинов (ИЛ-lß, ИЛ-6, ФНО-а) в сыворотке крови у больных ХВГВ и С.

4. Сопоставить изменения цитокинового профиля в сыворотке крови у больных острыми и хроническими ВГ при наличии или отсутствии у них аутоиммунных нарушений.

5. Изучить концентрацию цитокинов ИФН-а, ИФН-у, ФНО-а,ИЛ-1(3, ИЛ-4, ИЛ-6 в сыворотке крови у больных хроническими вирусными гепатитами В и С в сопоставлении с показателями гистологической активности и фиброза в печеночной ткани.

6. Изучить спонтанную и индуцированную 1МОУ и ФГА продукцию цитокинов ИФН-а, ИФН-у, ФНО-а, ИЛ-1(3, ИЛ-4, ИЛ-6 МНПК у больных ХГВ и С с различными показателями гистологической активности и фиброза в печеночной ткани.

7. Определить субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови в сопоставлении с уровнем гистологической активности и фиброза в печеночной ткани у больных хроническими вирусными гепатитами В и С.

8. Исследовать особенности лейкоцитарной инфильтрации печени у больных хроническими вирусными гепатитами В и С в сопоставлении с гистологической активностью гепатита и выраженностью фиброза.

9. Определить иммуногистохимическим и иммуноцитохимическим методами фенотип печень-ассоциированных лимфоцитов у больных ХГВ и ХГС.

Научная новизна исследования.

Впервые у больных острыми вирусными гепатитами в динамике заболевания и у больных ХВГВ и ХВГС различной степени гистологической активности проведено комплексное определение маркеров аутоиммунных проявлений (аутоантител, криоглобулинемии и ревматоидного фактора).

Показана динамика аутоантител, ревматоидного фактора и криоглобулинов у больных с острыми вирусными гепатитами на ранних этапах инфекционного процесса. У больных хроническими вирусными гепатитами В и С выявлены аутоантитела, криоглобулины и ревматоидный фактор в высоких титрах.

Установлено, что наличие аутоиммунных проявлений у больных ОВГ не зависит от выраженности цитолитического синдрома.

Изучена динамика цитокинов у больных ОВГ и ХВГ в сопоставлении с наличием аутоантител и показано, что у больных ОВГА и ОВГВ с аутоантителами концентрации ИЛ-1(3 и ФНО-а значительно выше, чем у больных без аутоантител, а у больных ОВГС легкого течения с аутоантителами уровень ИЛ-1(3 умеренно превышает контрольные значения на фоне нулевых значений ФНО-а и ИЛ-6. У больных ХВГС с умеренной степенью активности и у больных с ХВГС с исходом в цирроз без аутоиммунных проявлений уровни ИЛ-6 и ФНО-а были достоверно выше, чем у больных с аутоиммунными нарушениями.

Выявлена прямая связь между уровнем ИЛ-1Р, ФНО-а и наличием аутоиммунных проявлений, что связано с дисбалансом провоспалительных цитокинов, активацией В-лимфоцитов, их клональной пролиферацией и продукцией широкого спектра аутоантител с образованием иммунных комплексов.

Впервые установлено, что у больных хроническими вирусными гепатитами отсутствуют резервные возможности МНПК вырабатывать ИФН-а, следовательно, развивается иммунодефицитное состояние, при котором снижается толерантность организма к собственным антигенам.

Впервые расшифрован фенотип иммунных клеток лейкоцитарных инфильтратов паренхимы печени у больных ХГВ и ХГС, выявлены популяции Т- лимфоцитов СБЗ+, цитотоксических лимфоцитов С08+, Т регуляторных. лимфоцитов СБ4+СБ25+, Ж- клеток СВ16+СБ56+, ЖТ-клеток СБЗ+СБ16+С056+.

Впервые в гепатобиоптатах у больных ХВГС умеренной и высокой степени гистологической активности обнаружен комплекс Т регуляторных лимфоцитов (С04+СВ25+), что свидетельствует о возможности развития персистирующей вирусной инфекции с аутоиммунным компонентом.

Практическая значимость работы.

Выявленное наличие аутоиммунных проявлений у больных вирусными гепатитами на ранних этапах заболевания позволяет рекомендовать исследование сыворотки крови больных ОВГ на наличие маркеров аутоиммунных нарушений (неорганоспецифические аутоантитела, ревматоидный фактор, криоглобулины) для решения вопроса о необходимости дальнейшего наблюдения и прогнозирования течения заболевания.

Для адекватной оценки активности и прогноза инфекционного процесса необходимо проводить комплексное обследование больных хроническими вирусными гепатитами В и С, включающее в себя выявление аутоиммунных проявлений, концентрации цитокинов не только в сыворотке крови, но и изучение стимулированной МЗУ и ФГА продукции цитокинов МНПК, а также определение субпопуляций лимфоцитов периферической крови для подбора адекватного противовирусного лечения

Снижение стимулированной МЗУ продукции ИФН-а МНПК может рассматриваться в качестве диагностического критерия состояния иммунодефицита, а также применяться для определения лечебной тактики с возможным использованием препаратов интерферона.

При оценке морфофункционального состояния гепатобиоптатов у больных хроническими вирусными гепатитами В и С прогностическим критерием является не только гистологическая активность и выраженность фиброза, но и субпопуляционный состав лейкоцитарных инфильтратов в паренхиме печени.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. На ранних этапах острых вирусных гепатитов выявляются клинико-лабораторные признаки формирования аутоиммунных проявлений.

2. Характер изменений уровней провоспалительных цитокинов находится в соответствии с выявленными нами аутоиммунными проявлениями у больных ОВГ.

3. У больных хроническими вирусными гепатитами выявляются клинико-лабораторные признаки формирования аутоиммунных проявлений не зависимо от степени гистологической активности .

4. Характер изменений баланса цитокиновой продукции ТЬ1/ТЬ2 находится в соответствии с выявленными нами аутоиммунными проявлениями у больных ХВГ.

5. Отражением аутоиммунных процессов у больных ХВГ, не зависимо от этиологии, по мере нарастания выраженности перипортальных некрозов и портального воспаления, внутридольковой дегенерации и фиброза, является нарушение субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови.

6. Характер лимфоидной инфильтрации в ткани печени у больных хроническими вирусными гепатитами В и С является основой для реализации аутоиммунных реакций в клинике данных нозологических форм.

Апробация работы.

Работа выполнена на кафедре инфекционных болезней Московской медицинской академии имени И.М. Сеченова (зав. кафедрой, член-корр. РАМН, профессор С.Г. Пак).

Тема диссертационной работы является фрагментом комплексной темы кафедры «Интоксикация при бактериальных и вирусных инфекциях: патогенез и механизмы адаптации», № 01.200.110439.

Материалы диссертационной работы были доложены на Шестой Российской конференции «Гепатология сегодня» (20-23 марта 2001г., Москва), на научно-практической конференции «Инфекционные и паразитарные болезни в современном обществе. Клинико-лабораторное обеспечение инфектологии» (22-23 мая 2003 г., Москва), на научно-практической конференции КИБ №2 (5июня 2003 г.), на VI Российском съезде врачей-инфекционистов С.Петербург 2003 г., на Пятой научно-практической конференции «Инфекционные болезни и антимикробные средства» (4-5 ноября 2007г., Москва), на научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы гастроэнтерологии» (14 декабря, 2007 г., Москва), на Евроазиатском конгрессе инфекционистов (2930 апреля 2008 г., г. Витебск, Беларусь).

Отдельные фрагменты работы опубликованы в журналах «Терапевтический архив», «Военно-медицинский журнал», «Эпидемиология и инфекционные болезни», «Врач», «Российский журнал Гастроэнтерологии, Гепатологии, Колопроктологии».

Диссертация апробирована на совместном заседании кафедры инфекционных болезней МПФ и лаборатории по изучению токсических и септических состояний при кафедре ММА имени И.М. Сеченова 4 марта 2010г.

Внедрение полученных результатов в практику.

Результаты проведенного исследования и практические рекомендации используются в процессе преподавания на кафедре инфекционных болезней ММА имени И.М. Сеченова и в практике работы 2-й клинической инфекционной больницы г. Москвы.

ВЫВОДЫ

1. Установлено наличие аутоантител (ASMA, ANA, AMA, anti-LKM-1), ревматоидного фактора, криоглобулинов у больных острыми вирусными гепатитами различной этиологии легкого и среднетяжелого течения в разгар • клинических проявлений и в периоде ранней реконвалесценции.

2. Наиболее высокий процент встречаемости аутоантител, с преимущественным преобладанием ASMA, зарегистрирован у больных острыми вирусными гепатитами А (50%) и В (69%).

3. Выявлено наличие аутоантител (ASMA, ANA, AMA, anti-LKM-1), ревматоидного фактора, криоглобулинов у больных хроническими вирусными гепатитами В и С.

4. Аутоантитела, ревматоидный1 фактор и криоглобулины выявляются с одинаковой частотой у больных хроническими вирусными гепатитами независимо от степени гистологической'активности.

5. Исследование концентрации ИЛ-1(3 и ФНО-а в сыворотке крови у больных ОВГ в разгар клинических проявлений и в, периоде ранней реконвалесценции выявило достоверное повышение их уровня на фоне низких значений ИЛ-6 в сравнении с контролем, в то время как у больных ХВГС различной степени активности уровни всех трёх цитокинов (ИЛ-1(3, ФНО-а и ИЛ-6) достоверно превышали контрольные значения.

6. Аутоиммунные проявления у больных ОВГА и ОВГВ сопровождались значительным повышением концентрации ИЛ-ip и ФНО-а, в отличие от группы больных без наличия» аутоантител.

7. Аутоиммунные проявления у больных ОВГС легкого течения сопровождались умеренным повышением уровня цитолитических ферментов на фоне незначительного повышения концентрации ИЛ-1(3 и нулевых значений ФНО-а и ИЛ-6.

8.У больных ХВГС умеренной степенью активности и ХВГС с исходом в цирроз без аутоиммунных проявлений уровни' ИЛ-6 и ФНО-а были достоверно выше, чем у больных ХВГС умеренной степенью активности и ХВГС с исходом в цирроз аутоиммунными' нарушениями.

9. Установлено снижение продукции ИФН-а МНПК индуцированными NDV у больных с ХВГС независимо от степени гистологической активности по сравнению со здоровыми донорами, что отражает отсутствие резервных возможностей МНПК и вероятно обусловливает развитие аутоиммунных проявлений, опосредованных ИФН-а.

10. У больных ХВГ по мере нарастания выраженности перипортальных некрозов и портального воспаления, внутридольковой дегенерации и фиброза выявлено увеличение количества лимфоцитов, экспрессирующих HLADR и снижение популяции CD4+ лимфоцитов по сравнению со здоровыми) донорами, что является морфофункциональной основой, для формирования аутоиммунных процессов.

11. Выявленный в гепатобиоптате у больных хроническими, вирусными! гепатитами^ комплекс Т регуляторных лимфоцитов (CD4+CD25+) свидетельствует о наличии морфофункциональной основы для формирования аутоиммунных проявлений на фоне персистирующей вирусной инфекции.

12. Для всесторонней оценки клинического течения и прогноза у больных хроническим вирусным гепатитом В и С необходимо наряду ct- , определением показателей гистологической активности и фиброза оценивать выраженность, распространенность и субпопуляционный состав лейкоцитарных инфильтратов печени в комплексе с определением аутоантител (ASMA, ANA, AMA, anti-LKM-1) и ФНО-а в сыворотке i крови.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1.У больных вирусными гепатитами различной этиологии на ранних этапах инфекционного процесса рекомендуется определять ревматоидный фактор, криоглобулины и аутоантитела (ASMA, ANA, AMA, anti-LKM-1), для подбора адекватной, в том числе и противовирусной терапии.

2. Учитывая, что сывороточные уровни свободных цитокинов не отражают истинных концентраций цитокинов в сыворотке крови рекомендуется определение стимулированной NDV и ФГА продукции цитокинов МНПК с изучением субпопуляции лимфоцитов в периферической крови для прогноза течения заболевания.

3. При выявлении у больных хроническими вирусными гепатитами аутоиммунных проявлений (ревматоидного фактора, криоглобулинов, ASMA, ANA, AMA, anti-LKM-1) рекомендуется при оценке морфофункционального состояния гепатобиоптатов определять субпопуляционный состав лейкоцитарных инфильтратов в паренхиме печени с целью выявления комплекса Т регуляторных лимфоцитов (CD4+CD25+), также определять выраженность и распространенность лейкоцитарных инфильтратов для адекватной оценки активности патологичесекого процесса.