Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Аутоантитела к фактору некроза опухоли при ревматоидном артрите и бронхиальной астме

На правах рукописи

Голикова Елена Алексеевна

аутоантитела к фактору некроза опухоли при ревматоидном артрите и бронхиальной астме

14.03.09 -Клиническая иммунология, аллергология

автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

8 и;0Л 2013

Новосибирск-2013

005531597

005531597

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт клинической иммунологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор

Сенников Сергей Витальевич

Официальные оппоненты:

Останин Александр Анатольевич, доктор медицинских наук, профессор, главный научный сотрудник лаборатории клеточной иммунотерапии отдела клинической иммунологии Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательского института клинической иммунологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Симбирцев Андрей Семенович, доктор медицинских наук, профессор, директор Федерального государственного унитарного предприятия Государственного научно-исследовательского института особо чистых биопрепаратов Федерального медико-биологического агентства России

Ведущая организация: Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова, г. Москва

Защита диссертации состоится «20» июня 2013 г. в часов на заседании

диссертационного совета Д 001.001.01 в ФГБУ «НИИКИ» СО РАМН по адресу: 630099, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИКИ» СО РАМН.

Автореферат разослан « |Г|.» мая 2013 г. Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат медицинских наук

Белогородцев С.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Аутоантитела к цитокинам привлекают все большее внимание специалистов, а поступление большого объема данных привело к тому, что представления об их роли в организме претерпели значительные изменения. На сегодняшний день аутоантитела к иммунорегуляторпым цитокинам признаются исследователями как весьма важные биологические эффекторные молекулы, способные регулировать иммунный ответ in vivo [Watanabe М., 2010]. Установлено, что аутоантитела, специфичные к интерферонам, интерлейкинам, факторам роста и фактору некроза опухолей, присутствуют в системной циркуляции как в норме, так и при различных инфекционных и аутоиммунных заболеваниях [Bendtzen К., 1998, 2000; Wadhwa М 2000; Watanabe М„ 2007; van der Meide Р.Н., 1997]. Аутоантитела участвуют в регуляции биологической активности цитокинов наряду с растворимыми и мембраносвязанными рецепторами. Образуя иммунные комплексы с цитокинами, аутоантитела могут приводить к нейтрализации специфических функций цитокинов или их связыванию с увеличением времени полужизни/циркуляции последних, а в некоторых случаях - даже к усилению биологических эффектов цитокинов [Watanabe М„ 2010].

Одним из важнейших иммунорегулягорных цитокинов, обладающих широким спектром действия, является фактор некроза опухоли (TNF). В сыворотке крови здоровых людей TNF определяется на низком уровне, однако, его содержание возрастает при различных заболеваниях [Robak Т., 1998] и в ряде случаев положительно коррелирует с тяжестью их течения. В частности, установлено, что дапный цитокин играет ключевую роль в прогрессировании ревматоидного артрита (PA) [Choy E.H., 2001; Graves D.T., 2003], поскольку способен вызывать образование остеокластов [Azuma Y., 2000; Kobayashi К., 2000] и резорбцию кости in vitro [Azuma Y., 2000; Yogesha S.D., 2009]. Кроме того, данному цитокину отводится важная роль в патогенезе бронхиальной астмы (БА) [Berry М., 2007]. При данном заболевании механизм действия фактора некроза опухоли, может быть обусловлен прямым влиянием TNF на гладкие мышцы дыхательных путей [Adner М., 2002] или высвобождением цистеинил-лейкотриенов LTC4 и LTD4 [Huber М., 1988]. Показано также, что TNF непосредственно индуцирует выброс гистамина из человеческих тучных клеток [van Overveld F.J., 1991] и участвует в положительной аутокринной регуляции, при которой усиливается секреция цитокинов тучными клетками человека [Coward W.R., 2002].

Помимо самого фактора некроза опухоли, в патогенезе воспалительных заболеваний, таких как РА и БА, важное место принадлежит молекулам, регулирующим активность TNF [Klimiuk P.A., 2003]. К таким молекулам относятся мембраносвязанные рецепторы к TNF, которые осуществляют проведение цитокииового сигнала в клетку, и растворимые рецепторы к TNF 1-го и 11-го типов (sTNFRI и sTNFRII), ограничивающие активность медиатора при выходе его в системную циркуляцию [Gupta S., 2001; Kollias G., 1999, 2005; Wajant H., 2003]. Многочисленными данными подтверждено участие аутоантител к цитокинам, как молекул, способных регулировать биологическую активность цитокинов, в патогенезе заболеваний, в которых эти медиаторы играют важную роль [Нага А.,

з

2008; Hellmich В., 2002; Kitamura Т., 1999; Kurdowska A., 2001; Madariaga L., 1998; Meager A., 2006; Patel S.Y., 2005; Uchida K., 2004]. Несмотря на то, что при некоторых патологиях показано увеличение содержания аутоантител к TNF [Fomsgaard А., 1989], участие их в патогенетических процессах также до конца не определено.

Таким образом, при воспалительных заболеваниях необходимо учитывать не только вклад TNF, но и участие молекул, регулирующих его биологическую активность, таких, как рецепторы к TNF и аутоантитела к TNF.

На сегодняшний день в большинстве работ содержание аутоантител к цитокинам выражают в относительных единицах. Так, например, при использовании иммуноферментного анализа с применением меченых антител результаты получают в единицах оптической плотности, которые зависят от активностей каждого из применяемых ферментов и характеристик приборов, используемых разными исследовательскими группами [Meager А., 1999, 2003; Puel А., 2010]. Однако такой подход создает трудности при сравнении данных, полученных различными группами исследователей, и делает невозможным сравнение содержания аутоантител различных классов и подклассов в пределах каждой исследуемой группы доноров. В связи с этим представляется необходимым разработка новых подходов, позволяющих определять абсолютное содержание аутоантител к цитокинам, в частности, аутоантител к фактору некроза опухоли.

Изучение факторов, влияющих на активность TNF, представляет наибольший научный и практический интерес при тех заболеваниях, в патогенезе которых иммунорегуляторный цитокин TNF занимает значимое место. К таким заболеваниям относятся РА и БА, при этом данные заболевания имеют разный иммунопатогенез с преимущественной активацией Thl и Th2 иммунного ответа соответственно. Таким образом, представляется актуальным сравнение содержания аутоантител к TNF у больных и условно здоровых доноров, а также изменение их содержания в сыворотке крови при ответе на терапию у больных РА и при переходе от неконтролируемого к контролируемому течению БА, что позволит получить новые данные о функционировании медиатора TNF при патогенетических процессах при воспалительных заболеваниях.

Цель работы: изучить содержание классов и подклассов IgG аутоантител к иммунорегуляторному цитокину TNF и выявить взаимосвязи между медиатором, растворимыми рецепторами и подклассами аутоантител к TNF в норме и при ревматоидном артрите и бронхиальной астме.

Задачи исследования:

1) Определить содержание TNF и растворимых рецепторов I и II типа к TNF у больных РА в стадии обострения и после ответа на терапию, больных БА с неконтролируемым и контролируемым течением заболевания и у условно здоровых доноров.

2) Определить относительное содержание аутоантител к TNF классов IgG, IgA и IgM и подклассов IgG у больных РА в стадии обострения и после ответа на терапию, больных БА с неконтролируемым и контролируемым течением заболевания и у условно здоровых доноров.

3) Разработать способ получения чистых препаратов аутоантител к TNF с помощью методов аффинной хроматографии.

4) Определить абсолютное содержание подклассов IgG аутоантител к TNF у больных РА в стадии обострения и после ответа на терапию, больных БА с неконтролируемым и контролируемым течением заболевания и у условно здоровых доноров.

5) Провести корреляционный анализ между абсолютным содержанием подклассов IgG аутоантител к TNF, содержанием TNF и растворимых рецепторов I и II типа к TNF для больных РА в стадии обострения и после ответа на терапию, больных БА с неконтролируемым и контролируемым течением и условно здоровых доноров.

Научная новизна работы.

Впервые показано наличие аутоантител классов IgG, IgA и IgM и подклассов IgG к TNF в сыворотках крови больных БА.

Впервые получены данные по распределению аутоантител к TNF подклассов IgG, и показано превалирование среди подклассов IgG в сыворотках крови больных РА в стадии обострения, больных РА, ответивших на терапию, больных БА с контролируемым и неконтролируемым течением и условно здоровых доноров аутоантител к TNF IgGl и IgG3 подклассов.

Впервые получены данные по увеличению содержания аутоантител к TNF подклассов IgG2, IgG3 и IgG4 в сыворотках крови больных РА и БА по сравнению с условно здоровыми донорами, а также по снижению содержания IgG2 и IgG4 подклассов аутоантител к TNF при ответе на терапию при РА, и по снижению содержания IgG2 и IgG4 и увеличению абсолютного содержания IgGl подклассов аутоантител к TNF при переходе от неконтролируемого к контролируемому •сечению БА.

Теоретическая и практическая значимость работы.

Представленные результаты по содержанию аутоантител к иммунорегуляторному цитокину TNF в норме и при патологических состояниях расширяют представление о регуляции биологических эффектов цитокинов и вносят существенный вклад в понимании активности этих факторов в патогенезе заболеваний человека.

Выявленные изменения в содержании подклассов IgG у больных РА в стадии обострения и после ответа на терапию, а также у больных БА при переходе от неконтролируемого к контролируемому течению заболевания, свидетельствуют об активном участии аутоантител к TNF в воспалительных реакциях и могут быть использованы в разработке методов диагностики и прогнозирования заболеваний с воспалительным патогенезом.

Создан протокол выделения аутоантител класса IgG к TNF из сыворотки крови человека, включающий методы аффинной хроматографии и процедуру магнитной сепарации, позволяющий получать чистые фракции аутоантител к TNF. На основании представленных данных подана заявка на патент «Способ аффинного выделения аутоантител класса IgG к иммунорегуляторному цитокину TNF».

Положения, выносимые на защиту.

1. Аутоантитела к TNF классов IgG, IgA, IgM обнаруживаются в сыворотках крови больных РА и БА, при этом содержание аутоантител к TNF

подклассов IgG2, IgG3 и IgG4 в сыворотках крови больных указанными заболеваниями выше по сравнению с показателями условно здоровых доноров.

2. При ответе на терапию больных РА снижается содержание аутоантител к TNF подклассов IgG2 и IgG4, а при переходе от неконтролируемого к контролируемому течению БА снижается содержание аутоантител к TNF подклассов IgG2 и IgG4 и повышается абсолютное содержание аутоантител к TNF подкласса IgGl.

Апробация материалов диссертации

Материалы диссертации доложены и обсуждены на следующих конференциях: 1) IX Российской конференции иммунологов Урала, посвященной 90-летию профессора Л.Я. Эберта (г. Челябинск, 2011); 2) XIV Всероссийском форуме с международным участием им. академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (г. Санкт-Петербург, 2011); 3) XIII Итоговой конференции НИИКИ СО РАМН, посвященной 30-летию создания института (г. Новосибирск, 2011); 4) Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Дни иммунологии в Сибири» (г. Абакан, 2011); 5) X Российской конференции иммунологов Урала (г. Тюмень, 2012); 6) Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Дни иммунологии в Сибири» (г. Иркутск, 2012).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 12 научных работ, в том числе 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК для публикации материалов диссертационных работ. Подана 1 заявка на патент.

Личный вклад автора в проведение исследования.

Результаты, представленные в данной работе, получены лично автором на базе лаборатории молекулярной иммунологии ФГБУ «НИИКИ» СО РАМН.

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 120 страницах машинописного текста, состоит из обзора литературы, описание материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения, заключения и выводов. Библиографический указатель включает 252 источника, из них 223 зарубежных. Работа иллюстрирована 12 рисунками и 5 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования

В работе использовалась полученная в пункте заготовки крови №1 ГБУЗ НСО «Новосибирского центра крови» периферическая кровь от 24 условно здоровых доноров, включенных в группу по результатам опроса и результатам латекс-теста на С-реактивный белок (ООО «Ольвекс диагностикум», Россия). В группу включались доноры с концентрацией СРБ в сыворотке крови < 6 мкг/мл.

Группа больных РА составила 17 человек, находившихся на госпитализации в клинике ФГБУ «НИИКИ» СО РАМН г. Новосибирск. Диагноз РА верифицирован в соответствии с критериями ACR 1987г. Все пациенты на момент поступления в клинику ФГБУ «НИИКИ» СО РАМН имели высокую активность заболевания

(DAS28>5.1). У каждого пациента была взята кровь для исследования в стадии обострения заболевания и после коррекции базисной терапии, включая добавление глюкокортикостероидов или биологических агентов (мабтера), при условии эффективности лечения (по критерию EULAR) и выявления положительной клинической и/или лабораторной динамики: изменение индекса DAS28 >1.2 при исходном значении >5.1(далее - больные, ответившие на терапию).

Группа больных Б А составила 15 человек, находившихся на госпитализации в клинике ФГБУ «НИИКИ» СО РАМН г. Новосибирска. Диагноз БА верифицирован в соответствии с критериями GINA 2008г. У каждого пациента была взята кровь для исследования в период отсутствия контроля БА и у 11 больных с контролируемым течением после проведения курса системного лечения и коррекции базисной терапии.

Выделение аутоантител класса IgG из сыворотки крови человека

Перенос сыворотки в соответствующий буферный раствор, необходимый для дальнейших процедур аффинной очистки антител, осуществлялся с помощью колонки с Bio-Gel Р6 DG (Bio-Rad, США). В качестве рабочего буферного раствора использовался 20 mM PB S (рН=7,4), объем сорбента в колонке - 10 мл, объем вносимой пробы - 3 мл, скорость потока - 0,2-0,6 мл/мин. Высокомолекулярные фракции с Bio-Gel Р6 DG наносили на колонку с Protein G Sepharose Fast Flow аффинным сорбентом (GE Healthcare, США). Использовались следующие буферные растворы: рабочий буферный раствор - 20 mM PB S (рН=7,4), буферный раствор для удаления неспецифически связавшихся компонентов - 20 mM PBS, содержащий тритонХЮО (0,1%) (рН=7,4), буферный раствор для элюции - 0,1 M Gly -Cl (рН=2,5). Объем сорбента в колонке составил 1,5 мл, объем вносимой пробы - 3 мл, скорость потока - 0,1-0,5 мл/мин. При проведении элюции полученную фракцию нейтрализовали титрованием IM Tris-HCI буферным раствором (pH 9,0) до физиологических значений pH. Выделенные фракции антител объединяли и диализовали при +4°С против не менее чем 100-кратного по объему 20 mM PB S (рН=7,4) в течении 12 часов. Диализованные фракции антител наносились на колонку со связанным с TNF аффинным сорбентом Affi-Gel 15 (Bio-Rad, США).

Выделение аутоантител к TNF из общего пула аутоантител класса IgG

Для проведения хроматографии использовались следующие буферные растворы: рабочий буферный раствор - 20 mM PB S (рН=7,4), буферный раствор для удаления неспецифически связавшихся компонентов - 1М гуанидин-HCl (рН=7,4), буферный раствор для элюции - 0,1 M Gly-HCl (рН=2,5). Объем сорбента в колонке составил 1,5 мл, объем вносимой пробы - 3 мл, скорость потока - 0,4 мл/мин. При проведении элюции полученную фракцию нейтрализовали титрованием IM Tris-HCI буферным раствором ¿>Н 9,0) до физиологических значений pH. Выделенные фракции антител объединяли и диализовали при +4°С против не менее чем 100-кратного по объему 20 mM PB S (рН=7,4) в течении 12 часов.

Магнитная сепарация

Для магнитной сепарации [Темежникова Н.Д., 2001; Bangs L.B., 1996; Peraski А.Н., 2003] использовали магнитные частицы (Dynabeads М-280, Dynal Biotech, Норвегия), покрытые стрептавидином, и кроличьи поликлональные антитела к TNF, которые предварительно метили биотином (ORIGEN, США).

Определение количественного содержания TNF электрохеми-люмииесцептным методом

В проведенной работе использовались меченные TAG полнклональные антитела к TNF (R&D Systems, Великобритания), а также рекомбинантный человеческий TNF (R&D System, Великобритания) для создания калибровочного стандарта. Подготовку реактивов и определение каждого цитокина проводили, как описано ранее [Sennikov S.V., 2003].

Электрофорстический анализ белков проводили по методу Лэммли [Laemmli U.K., 1970] в присутствии 2-меркаптоэтанола.

Иммуноферментный анализ

Определение содержания подклассов IgG, TNF и растворимых рецепторов к TNF I и II типов проводили с помощью иммуноферментного анализа с использованием коммерческих тест-систем.

Определение сывороточного содержания аутоантител к TNF проводили методом твердофазного ИФА [Вербов В.Н., 1998; Sioud M., 1994]. Относительное содержание антител классов IgG, IgA и IgM и подклассов IgGl, IgG2, IgG3, IgG4 определяли с использованием набора для проведения ИФА, включающего рекомбинантный человеческий TNF (ФБУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», Россия), реактивы фирмы Иммунотех (Россия): фосфагно-солевой буферный раствор, 1-компонентный раствор ТМБ и стоп-раствор, а также моноклональные антитела к классам и субклассам иммуноглобулинов человека, меченные пероксидазой хрена фирмы «Полигност» (Россия). В качестве калибровочного материала для определения содержания аутоантител подклассов IgGl, IgG2, IgG3, IgG4 использовалась полученная с помощью методов аффинной хроматографии фракция аутоантител к TNF, выделенная из сыворотки крови условно здоровых доноров. Предварительно в очищенной фракции методом ИФА было измерено содержание подклассов IgG.

Статистическая обработка данных

Статистическая обработка результатов проводилась с помощью программы «Statistica 7.0». Проверка выборки на нормальность распределения проводилась с помощью критерия Колмогорова-Смирнова. Данные представлялись в виде среднего и ошибки среднего, а также в виде медианы и диапазона значений квартилей (25% и 75%). Для проверки гипотез о достоверности различий использовали непараметрический критерий Манна-Уитни и критерий знаков. В пояснениях к иллюстрациям количество лиц в группе обозначено п.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Показано, что при патологических состояниях аутоиммунной и аллергической этиологии, а именно при РА и БА, наблюдаются выраженные воспалительные реакции, ключевым медиатором которых является TNF [Berry M., 2007; Butler D.M., 1995; Rho Y.H., 2009; Thomas P.S., 1996].

В нашей работе методом твердофазного ИФА с использованием коммерческих тест-систем была проведена оценка содержания TNF (рис. 1).

Было показано, что содержание TNF в сыворотках крови больных РА в стадии обострения, больных РА, ответивших на терапию, и больных БА с неконтролируемым

и контролируемым течением достоверно выше такового в сыворотках крови условно здоровых доноров, а также достоверное снижение уровня TNF при ответе на терапию больных РА и при переходе от неконтролируемого к контролируемому течению БА, что подтверждает активное участие данного цитокина в патогенезе исследуемых заболеваний.

Рис. 1. Содержание TNF в сыворотках крови больных РА, БА и условно здоровых доноров. Результаты представлены как среднее ±ошибка среднего (пг/мл) для пяти различных групп: группа 1 - больные РА в стадии обострения (п=17), группа 2 - больные РА, ответившие на терапию (п=14), группа 3 - больные БА с неконтролируемым течением (п=15)! группа 4 - больные БА с контролируемым течением (n=l 1) и группа 5 - условно здоровые доноры (п=24). Достоверность разгачий определена с помощью критерия знаков. Стрелками обозначены достоверные (р<0,005) отличия.

Одним из путей регуляции биологической активности TNF в организме человека служат растворимые рецепторы к цитокину двух типов, и в нашей работе методом ИФА с использованием коммерческих наборов были измерены уровни sTNFRI и sTNFRII (табл. 1). Было показало преобладание содержания рецептора II типа по сравнению с содержанием рецептора I типа во всех исследованных группах, что согласуется с литературными данными [Robak Т., 1998]. Также было определено, что содержание рецепторов к TNF обоих типов в сыворотках крови больных РА в стадии обострения, больных РА, ответивших на терапию, и больных БА с неконтролируемым и контролируемым течением достоверно выше по сравнению с условно здоровыми донорами, что говорит об активном вовлечении растворимых рецепторов к TNF в протекание патологических процессов при РА и БА [Robak Т 1998; Yoshida S., 1996].

Еще одним из факторов, способных регулировать активность иммуномодулирующих молекул в организме, являются аутоантитела. На настоящий момент в литературе имеется небольшое количество работ, посвященных исследованию аутоантител к фактору некроза опухоли. Так аутоантитела к TNF были обнаружены в сыворотках крови здоровых доноров, пациентов с грамотрицательной бактериальной септицемией, кистозным фиброзом, хронической легочной инфекцией, а также с различными ревматическими заболеваниями, в том числе с PA [Fomsfaard А., 1989; SioudM, 1994].

В данной работе с помощью метода ИФА было измерено относительное содержание аутоантител классов IgA, IgM и IgG к TNF (табл. 2). Для определения относительных значений использовали условные единицы оптической плотности.

Таблица 1.

Содержание бТОТШ и эТЮТКИ в сыворотке крови больных РА в стадии обострения, больных РА, ответивших на терапию, больных БА с неконтролируемым и контролируемым течением и условно здоровых доноров.

Группа sTNFSI (пг/мл) sTNFRII (пг/мл)

Больные РА в стадии обострения 1407,9* (1217,9-2187,4) 2999,0*# (2543,0-3702,1)

Больные РА, ответившие на терапию 1386,5* (1122,7-1837,6) 2795,4*# (2635,3-3198,2)

Больные БА с неконтролируемым течением 909,3* (728,7-1533,8) 2851,6*# (2650,9-2972,0)

Больные БА с контролируемым течением 1052,3* (816,6-1481,6) 2688,2*# (2650,9-3051,8)

Условно здоровые доноры 92,7 (24,4-212,8) 1710,3 # (1068,2-2209,2)

Данные представлены в виде медианы и межквартильного интервала. Достоверность различий определена с помощью критерия Манна-Уитни. * - достоверно (р<0,05) по сравнению с условно здоровыми донорами; # - достоверно (р<0,05) по сравнению с содержанием sTNFRI.

Таблица 2.

Относительное содержание аутоантител к TNF классов IgA, IgM н IgG в сыворотке крови больных РА в стадии обострения, больных РА, ответивших на терапию, больных БА с неконтролируемым и контролируемым течением и условно здоровых доноров.

Группа IRG IgA IgM

Больные РА в стадии обострения (п=12) 1,687 (1,562-2,136) 0,473 (0,337-0,577) 1,496 (1,331-1,752)

Больные РА, ответившие на терапию (п=12) 1,787 (1,266-2,412) 0,415 (0,247-0,514) 1,555 (1,388-1,667)

Больные БА с неконтролируемым течением (п=7) 1,642 (1,505-2,014) 0,634 (0,425-0,744) 1,305 (1,206-1,725)

Больные БА с контролируемым течением (п=7) 1,432 (1,396-1,760) 0,488 (0,436-0,554) 1,327 (1,320-1,445)

Условно здоровые доноры (п=12) 1,592 (1,275-2,327) 0,491 (0,396-0,641) 1,364 (1,292-1,553)

Данные представлены в виде медианы и межквартильного интервала и выражены в единицах оптической плотности.

Аутоантитела к TNF классов IgA, IgG, IgM и подклассов иммуноглобулина G были обнаружены во всех исследованных группах. Значимых достоверных отличий в относительном содержании измеренных классов аутоантител между исследованными группами не было показано, при этом были найдены достоверные отличия в относительном содержании подклассов IgG (табл. 3).

Таблица 3.

Относительное содержание подклассов иммуноглобулина класса G аутоантител к TNF в сыворотке крови больных РА в стадии обострения, больных РА, ответивших на терапию, больных БА с контролируемым и неконтролируемым течением и условно здоровых доноров.

Группа IgGl IgG2 IgG3 IKG4

Больные РА в стадии обострения 0,057 (0,049-0.066) (п=17) 0,090 * (0,066-0,124) (п-16) 0,107 * (0,078-0,148) (п-16) 0,063 * (0,040-0,089) (ч=13)

Больные РА, ответившие на терапию 0,057 (0,051-0,069) (п=13) 0,072 # (0,051-0,091) (п=12) 0,089 (0,071-0,119) (п=11) 0,036 # (0,029-0,055) (п=10)

Больные БА с некошролиру емым течением 0,054 (0,050-0,059) (п=12) 0,096 * (0,090-0,168) (11=11) 0,114* (0,085-0,155) (п-13) 0,056 * (0,047-0,075) (п=10)

Больные БА с контролируем ым течением 0,069 (0,062-0,092) (п=8) 0,074 $ (0,056-0,104) (п=10) 0,087 (0,084-0,091) (п=9) 0,043 S (0,039-0,047) (4=9)

Условно здоровые доноры 0,057 (0,048-0,063) (п=18) 0,074 (0,055-0,081) (п=14) 0,081 (0,064-0,102) (п=15) 0,034 (0,028-0,055) (п— 16)

Данные представлены в виде медианы и межквартнльного интервала и выражены в единицах оптической плотности. Достоверность различий определена с помощью критерия Манна-Уитни. * -достоверно (р<0,05) по сравнению с условно здоровыми донорами; # - достоверно (р<0,05) по сравнению с больными РА в стадии обострения; S - достоверно (р<0,05) по сравнению с больными БА с неконтролируемым течением.

Было показано достоверное повышение относительного содержания подклассов IgG2, IgG3 и IgG4 в сыворотках крови больных РА в стадии обострения и больных БА с неконтролируемым течением по сравнению с условно здоровыми донорами. При этом относительное содержание подклассов IgG2 и IgG4 достоверно понижалось при ответе на терапию у больных РА и при переходе от неконтролируемого к контролируемому течению БА, что может указывать на участие аутоантител к TNF подклассов IgG2, IgG3, IgG4, и в особенности IgG2 и IgG4, в патогенезе рассматриваемых патологий.

На сегодняшний день в большинстве работ по изучению роли аутоантител к цитокинам их содержание выражают в относительных единицах. Так, например, при использовании ИФА с применением меченых антител результаты получают в единицах оптической плотности, которые зависят от активностей каждого из применяемых ферментов и характеристик приборов, используемых разными исследовательскими группами [Meager А., 1999, 2003; Puel А., 2010]. Однако такой

подход создает трудности при сравнении данных, полученных различными группами исследователей, вследствие использования различных реагентов и методов для определения аутоантител и делает невозможным сравнение содержания аутоантител различных классов и подклассов в пределах каждой исследуемой группы. В связи с этим в нашей работе методом ИФА были определены абсолютные количества аутоантител к TNF с использованием в качестве калибровочного материала чистой фракции аутоантител к TNF, полученной из сыворотки крови условно здоровых доноров.

Для получения чистой фракции аутоантител к TNF из сыворотки крови человека был разработан протокол, включающий комплекс хромат ографических процедур с использованием колонок с сорбентами Bio-Gel Р-6 DG (Bio-Rad, США), Protein G Sepharose 4 Fast Flow (GE Healthcare, США) и Affi-Gel 15 (Bio-Rad, США), и процедуру магнитной сепарации с использованием магнитных бус (Dynal Biotech, Норвегия) и кроличьих поликлональных антител к TNF, меченых биотином.

Согласно разработанному протоколу получения чистой фракции аутоантител к TNF, на первом этапе выделения был осуществлен перенос сыворотки в соответствующий буферный раствор, необходимый для дальнейших процедур аффинной очистки антител, с помощью колонки с Bio-Gel Р6 DG сорбентом (рис. 2).

Рис. 2. Типичный вид хроматограммы, полученной при использовании колонки с сорбентом Bio-Gel Р6 DG, при переводе всей фракции белков сыворотки в буферный раствор. По оси абсцисс - время элюции, мин; по левой оси ординат - оптическая плотность элюента при 280 нм, A.U.; по правой оси ординат - электропроводность элюента, mS/cm. В качестве рабочего буферного раствора использовался 20 тМ фосфатно-солевой буферный раствор (PBS) (рН=7,4), объем сорбента в колонке - 10 мл, объем вносимой пробы - 3 мл, скорость потока -0,2-0,6 мл/мин.

Высокомолекулярные фракции, собранные с колонки с сорбентом Bio-Gel Р6 DG, были нанесены на колонку с Protein G Sepharose Fast Flow аффинным сорбентом (рис. 3). Использование колонки с сорбентом Protein G позволило выделить аутоантитела класса IgG всех четырех подклассов, что может весьма существенно, поскольку большинство ауантител к цитокинам относятся к классу высокоаффинных IgG [WatanabeM., 2010].

Рис. 3. Типичный вид хроматограммы, полученной на колонке с сорбентом Protein G Sepharose 4 Fast Flow, для выделения фракции аутоантител класса IgG. По оси абсцисс - время элюции, мин; по левой оси ординат - оптическая плотность элюента при 280 нм, A.U.; по правой оси ординат - электропроводность элюента, mS/cm. Использовались следующие буферные растворы: рабочий буферный раствор - 20 mM PBS (рН=7,4), буферный раствор для удаления неспецифически связавшихся компонентов - 20 mM PBS, содержащий тритонХЮО (0,1%) (рН=7,4), буферный раствор для элюции - 0,1 М Gly -С1 (рН=2,5). Объем сорбента в колонке составил 1,5 мл, объем вносимой пробы — 3 мл, скорость потока — 0,1-0,5 мл/мин.

Для выделения специфических аутоантител к TNF в предложенном протоколе выделения был использован предварительно связанный с цигокином сорбент Affi-Gel 15 (рис. 4). Выбор сорбента был обусловлен его способностью быстро и с высокой степенью эффективности связывать все лиганды, имеющие первичные аминогруппы, и лиганды с низким молекулярным весом, а также соответствием изоэлектрической точки TNF (pl=5,3) параметрам эффективного связывания белка с сорбентом [DorinG., 1990]. Ранее в ряде работ была показана эффективность данного сорбента для проведения аффинной хроматограф™ [Thevananther S., 1999; West I., 1994].

Рис. 4. Типичный вид хроматограммы, полученной на колонке с сорбентом AffiGel 15, связанным с TNF, в целях выделения фракции специфических аутоантител к TNF класса IgG. По оси абсцисс - время элюции, мин; по левой оси ординат -оптическая плотность элюента при 280 нм. A.U.; по правой оси ординат - электропроводность элюента, mS/cm. Связывание TNF с аффинным сорбентом проводили согласно инструкции производителя. Использовались следующие буферные растворы: рабочий буферный раствор — 20 шМ PBS (рН=7,4), буферный раствор для удаления неспецифически связавшихся компонентов - 1М гуанидин-HCl (рН=7,4), буферный раствор для элюции - 0,1 М Gly-HCl (рН=2,5). Объем сорбента в колонке составляет 1,5 мл, объем вносимой пробы - 3 мл, скорость потока — 0,4 мл/мин.

Полученная после осуществления всего комплекса процедур аффинной хроматографии фракция аутоантител к TNF, как было показано в результате проведения предварительного опыта, содержала примесь самого цитокина, которая при проведении последнего хроматографического этапа выделения неизбежно в небольшом количестве смывается с колонки. В связи с этим было принято решение об использовании дополнительной стадии, в качестве которой была выбрана процедура магнитной сепарации, что было обусловлено возможностью проведения эффективной очистки фракции аутоантител благодаря высокоаффинному связыванию биотина, конъюгированного с кроличьими поликлональными антителами к TNF, и стрептавидина, которым покрыты магнитные бусы. Выбранная процедура очистки делает возможным удаление не только свободного TNF, но и связанного с аутоантителами, что подтверждается применением метода

элекгрохемилюминесценции для определения оставшегося в растворе TNF.

Согласно полученным данным, до проведения процедуры магнитной сепарации на 100000 пг белка (концентрация белка была определена с помощью системы NanoDrop 2000с) содержание примеси составило 82,8 пг, после проведения магнитной сепарации примесь TNF во фракции аутоантител к TNF отсутствовала.

После проведения магнитной сепарации чистота полученных фракций была дополнительно подтверждена с использованием методов ИФА и электрофореза белков по Леммли, также с помощью метода электрофореза белков по Леммли было подтверждено соответствие по молекулярному весу иммуноглобулинам класса G

Рис. 5. Электрофореграмма фракции иммуноглобулинов IgG к TNF, полученная после проведения комплекса процедур аффинной хроматографии и магнитной сепарации. Электрофоретический анализ белков проводили по методу Лэммли в присутствии 2-меркаптоэтанола. Концентрирующий гель содержал 4% акриламид, разделяющий гель - 10 % акриламид. На дорожку наносили по 5-10 мкг белка. На рисунке: 1-проскок (колонка Affi-Gel), 2 - целевая фракция иммуноглобулинов IgG к ТИ-Хколонка Afñ-Gel), 3 - стандарт (SDS-Page Molecular Weight Standarts, Broad Range).

проделанной работы подана заявка на патент «Способ аффинного выделения аутоантител класса IgG к иммунорегуляторному цитокину TNF».

Получение фракции аутоантител к TNF, содержащей все четыре подкласса IgG, и отсутствие в ней примеси самого медиатора дает возможность проведения иммуноферментного анализа для определения абсолютного содержания аутоантител к TNF в сыворотках крови человека с использованием в качестве калибровочных образцов полученных фракций аутоантител к TNF, поскольку отсутствует конкуренция сорбированного в лунках планшета TNF с растворимым медиатором.

(рис. 5).

\ ¡Sh

mm

На основании

Таблица 4.

Содержание подклассов IgG аутоантител к TNF в сыворотке крови больных РА в стадии обострения, больных РА, ответивших на терапию, больных БА с неконтролируемым и контролируемым течением и условно здоровых доноров.

Группа IgGl (нг/мл) IgG2 (нг/мл) IgG3 (нг/мл) IgG4 (нг/мл)

Больные РА в стадии обострения 176,100 (138,500-218,400) (11=17) 78,675 * (53.555-114,775) (п—16) 161,955 * (116,900-227,545) (11=16) 74,180 * (44,910-107.270) (п=13)

Больные РА, ответившие на терапию 176,100 (147.900-232,500) (п—13) 60,355 # (37,860-80,240) (п=12) 134,290 (105,840-181,710) (п-11) 39,820 # (30,910-64,000) (11=10)

Больные БА с неконтролиру емым течением 162,000 (143,200-185,500) (ч=12) 85,470 * (79.190-160,820) (п-11) 173,810 * (127,970-238,610) (п=13) 64,635 * (53,820-89,450) (п=10)

Больные БА с контролируем ьш течением 232,500 * $ (199,600-340,600) (п=8) 62,450 $ (43,620-93,850) (п=10) 131,130 (126,390-137,450) (п-9) 48,730 $ (43,640-53,820) (п=9)

Условно здоровые доноры 176,100 (133.800-204,300) (п=18) 62,450 (42,570-69,780) (п=14) 121,650 (94,770-154,840) (£1=15) 36,635 (29,000-63,360) (п=16)

Данные представлены в виде медианы и межквартильного интервала и выражены в нг/мл. Достоверность различий определена с помощью критерия Манна-Уитни. * - достоверно (р<0,05) по сравнению с условно здоровыми донорами; # - достоверно (р<0,05) по сравнению с больными РА в стадии обострения; $ - достоверно (р<0,05) по сравнению с больными БА с неконтролируемым течением.

В данной работе методом твердофазного ИФА было измерено абсолютное содержание аутоантител к TNF всех четырех подклассов IgG, при этом в качестве калибровочного материала была использована чистая фракция аутоантител, полученная из пулированных сывороток крови условно здоровых доноров (табл. 4). Предварительно в очищенной фракции аутоантител к TNF с использованием коммерческого ИФА-набора было измерено содержание подклассов IgG, которое составило 46 нг/мл субкласса IgGl, 102 нг/мл субкласса IgG2, 24 нг/мл субкласса IgG3 и 48 нг/мл субкласса IgG4.

В нашей работе для больных РА, как в стадии обострения, так и больных РА, ответивших на терапию, было показано, что среди подклассов аутоантител к TNF достоверно превалируют IgGl и IgG3 (рис. 6). При этом была получена положительная корреляция между содержанием подклассов IgG2 и IgG3 у больных РА в стадии обострения.

45» 4»

358

258 Я» 158 108 58

О

45Г

Э5Й

жг

Щ 10$

О 25%-75% иив-шм

IgGl IgG3 Ist*

IgGl IgG2 IgG3 IgG4

А Б

Рис. 6. Содержание подклассов IgG аутоантител к TNF

в сыворотке крови

больных РА в стадии обострения (А) и больных РА, ответивших на терапию (Б).

Данные представлены в виде медианы и межквартильного интервала и выражены в нг/мл. Достоверность различий определена с помощью критерия Манна-Уитни. * - достоверно (р<0,05).

Также была получена положительная корреляция между содержанием в сыворотках крови условно здоровых доноров аутоантител к TNF подклассов IgGl и IgG3.

Для больных БА с неконтролируемым течением заболевания было показано, что среди подклассов аутоантител к TNF достоверно превалируют IgGl и IgG3 (рис. 7А). В тоже время в сыворотках крови больных БА с контролируемым течением (рис. 7Б) и условно здоровых доноров (рис. 8) содержание аутоантител к TNF подкласса IgGl достоверно превышает содержание прочих подклассов, а содержание аутоантител к TNF подкласса IgG3 достоверно выше IgG2 и IgG4.

700 «Я»

sao

400

300 200 190

зав

200

100

1

1

J * Г

□ 2S%-75% J mm-raax

lg«I IgtiZ igra Jj>№l

leGI HSGZ Igßä IgG4

А Б

Рис. 7. Содержание подклассов IgG аутоантител к TNF в сыворотке крови больных БА с неконтролируемым (А) и контролируемым (Б) течением. Данные представлены в виде медианы и межквартильного интервала и выражены в нг/мл. Достоверность различий определена с помощью критерия Манна-Уитни. * - достоверно (р<0,05).

Ш

200

* Г

100

1 *

о медвяк*

. Q 25%-75% J ийа-гааж

IgGl lgG2 1&G4

Рис. 8. Содержание подклассов IgG аутоантител к TNF в сыворотке крови условно здоровых доноров. Данные представлены в виде медианы и межкваргильного интервала и выражены в нг/мл. Достоверность различий определена с помощью критерия Манна-Уитни. * - достоверно (р<0,05).

Ранее в работах нескольких групп исследователей было показано, что у пациентов с аутоиммунными заболеваниями специфические аутоантитела чаще всег о представлены подклассами IgGl и IgG3 [Gharavi А.Е., 1988; Maran R., 1997; Yount W.J., 1988]. Так у больных РА аутоантитела к нативному коллагену II типа являются комплементсвязываюгцими и принадлежат к IgGl (55%) и IgG3 (47%) подклассам [Cook A.D., 1997]. Полученные результаты также указывают на то, что распределение аутоантител к TNF по подклассам как в сыворотках больных РА и БА, так и условно здоровых доноров не совпадает с известным распределением антител к чужеродным антигенам (IgGl > IgG2 > IgG3 > IgG4) [Furukawa К., 1991], a IgGl и IgG3 подклассы доминируют над IgG2 и IgG4. Превалирование среди аутоантител к TNF IgGl и IgG3 подклассов может указывать на активное участие аутоантител к TNF в активации системы комплемента, так как известно, что по способности взаимодействовать с Clq компонентом комплемента иммуноглобулины IgGl и IgG3 подклассов стоят на первом месте, при этом IgG2 способен к слабому связыванию, a IgG4 вовсе не связывается с Clq [van Loghem Е., 1986].

Полученная для условно здоровых доноров корреляция связывает два комплементсвязывающих подкласса аутоантител к TNF. При обострении РА данная корреляционная зависимость нарушается, и появляется корреляция между IgG2 и IgG3 подклассами аутоантител к TNF.

Было показано, что у больных РА в стадии обострения и больных БА с неконтролируемым течением абсолютное содержание подклассов аутоантител IgG2, IgG3 и IgG4 достоверно выше по сравнению с условно здоровыми донорами (табл. 4). При переходе от неконтролируемого к контролируемому течению БА, а также после ответа на терапию при РА достоверно снижается содержание IgG2 и IgG4. Из двух подклассов аутоантител, уровень которых падает при переходе от неконтролируемого к контролируемому течению БА и при ответе на терапию больных РА один, IgG2, способен слабо активировать комплемент, а второй, IgG4, вовсе не активирует

систему комплемента по классическому пути. При этом существует положительная корреляция между содержанием IgG2 и TNF у больных БА с контролируемым течением. Исходя из чего, можно предположить, что аутоантитела к TNF подклассов IgG2 и IgG4 регулируют иммунные реакции при РА и БА путем связывания TNF посредством образования иммунных комплексов с увеличением длительности его существования в системной циркуляции и транспорта иммунных комплексов с органы и ткани, а также, возможно, способны усиливать эффект цитокина.

Анализ содержания подкласса IgGl показал, что при БА содержание данного подкласса достоверно повышается при переходе от неконтролируемого к контролируемому течению заболевания, и при этом содержание IgGl у больных Б А с контролируемым течением достоверно выше по сравнению с условно здоровыми донорами, и, таким образом, можно сделать предположение о нейтрализующем действие аутоантител данного подкласса в отношении TNF.

В дополнение к вышесказанному, наличие положительной корреляции между содержанием подкласса IgG2 у больных РА в стадии обострения и больных РА, ответивших на терапию, может указывать на возможность рассмотрения снижения содержания IgG2 в качестве показателя ответа на терапию больных РА. Аналогично, положительная корреляция между содержанием подкласса IgGl у больных Б А с неконтролируемым и контролируемым течением может указывать на возможность рассмотрения повышения содержания IgGl в качестве показателя перехода от неконтролируемого к контролируемому течению БА, соответственно.

Полученные достоверные отличия в содержании как IgG2 и IgG4, так и IgG3 подклассов у больных РА в стадии обострения по сравнению с условно здоровыми донорами могут говорить об их участии в патогенезе РА, а достоверные отличия в содержании IgGl у больных Б А с контролируемым течением и IgG2, IgG3 и IgG4 подклассов у больных БА с неконтролируемым течением по сравнению с условно здоровыми донорами могут свидетельствовать об участии в патогенезе БА всех четырех подклассов IgG.

ВЫВОДЫ

1. Содержание TNF и растворимых рецепторов к TNF достоверно выше у больных ревматоидным артритом и бронхиальной астмой по сравнению с условно здоровыми донорами, при этом после ответа на терапию больных ревматоидным артритом и при переходе к контролируемом}' течению бронхиальной астмы уровень TNF достоверно снижается, что подтверждает активное участие цитокина TNF в патогенезе обоих заболеваний.

2. Разработанный способ получения аутоантител к TNF из сыворотки крови, включающий методы аффинной хроматографии и процедуру магнитной сепарации, позволяет получить фракции аутоантител к TNF с подтвержденным, методами ИФА и электрофореза, соответствием и чистотой.

3. Аутоантитела к TNF обнаруживаются в сыворотке крови условно здоровых доноров и больных ревматоидным артритом и бронхиальной астмой, при этом для них характерно преобладание IgGl и IgG3 подклассов над IgG2 и IgG4 подклассами, что совпадает с распределением по подклассам IgG специфических аутоантител у пациентов с аутоиммунными заболеваниями.

4. Показано достоверное увеличение относительного и абсолютного содержания аутоантител подклассов IgG2, IgG3 и IgG4 в сыворотках крови больных ревматоидным артритом в стадии обострения и бронхиальной астмой с неконтролируемым течением по сравнению с условно здоровыми донорами, что свидетельствует об участии аутоантител к TNF в патогенезе данных заболеваний.

5. Обнаружено снижение абсолютного и относительного содержания аутоантител подклассов IgG2 и IgG4 у больных ревматоидным артритом после ответа на терапию, и снижение абсолютного и относительного содержания IgG2 и IgG4 и повышение абсолютного содержания аутоантител подкласса IgGl у больных бронхиальной астмой при переходе от неконтролируемого к контролируемому течению, что указывает на функциональную роль подклассов IgG аутоантител к TNF в изменении активности воспалительного процесса при ревматоидном артрите и бронхиальной астме.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Киреев Ф.Д., Голикова Е.А.. Соснина A.B., Аутеншлюс А.И. Уровни ФНО-а, растворимых рецепторов I и II типов и аутоантител к ФНО-а у больных туберкулезом легких и здоровых доноров // Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2011. - Т. 35. - № 2/1. - С. 147.

2. Киреев Ф.Д., Лопатникова Ю.А., Соснина A.B., Голикова Е.А.. Аутеншлюс А.И., Сенников C.B. Аутоантитела к фно-альфа у здоровых доноров: содержание и биологическая активность // Дни иммунологии в Сибири: материалы Всероссийской научно-практической конференции. - 2011. - С. 58.

3. Голикова Е.А.. Лопатникова Ю.А., Шкаруба Н.С., Сизиков А.Э., Сенников C.B. Система ФНО-альфа у больных ревматоидным артритом // Медицинская иммунология: материалы XIV Всероссийского научного форума с международным участием имени академика В.И.Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» 2326 мая 2011.-2011. - Т. 13. -№4-5. - С. 364.

4. Лопатникова Ю.А., Киреев Ф.Д., Голикова Е.А., Сенников C.B. Эффекты аутоантител к ФНО-альфа в тестах in vitro // Медицинская иммунология: материалы XIV Всероссийского научного форума с международным участием имени академика

B.И.Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» 23-26 мая 2011. - 2011. - Т.13. -№4-5.-С. 316.

5. Голикова Е.А.. Лопатникова Ю.А., Шкаруба Н.С., Киреев Ф.Д., Сизиков А.Э. Система ФНО-а у больных ревматоидным артритом и условно-здоровых доноров // Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2011. - Т. 35. -№2/1.-С. 125.

6. Лопатникова Ю.А., Киреев Ф.Д., Голикова Е.А.. Аутеншлюс А.И., Соснина A.B., Сенников C.B. Содержание растворимых рецепторов и аутоантител к TNF-a у здоровых индивидов и биологическая активность анти-TNF-a аутоантител // Российский иммунологический журнал. -2011. - Т. 5(14).-№3-4. - С. 360-366.

7. Голикова Е.А.. Лопатникова Ю.А., Шкаруба Н.С., Сизиков А.Э., Сенников

C.B. Система ФНО-альфа: медиатор, растворимые рецепторы и аутоантитела, в норме и при ревматоидном артрите // Иммунопатогенез и иммунотерапия основных заболеваний человека: от эксперимента к клинике: материалы 8-й отчетной конференции НИИКИ СО РАМН. - 2011. - С. 99-101.

8. Лопатникова Ю.А., Киреев Ф.Д., Голикова Е.А.. Сенников С.В. Биологическая активность аутоантител к ФНО-альфа // Иммунопатогенез и иммунотерапия основных заболеваний человека: от эксперимента к клинике: материалы 8-й отчетной конференции НИИКИ СО РАМН. - 2011. - С. 40-42.

9. Голикова Е.А.. Лопатникова Ю.А., Ковалевская-Кучерявенко Т.В., Непомнящая В.М., Сенников С.В. TNF, растворимые рецепторы и аутоантитела к TNF при бронхиальной астме и у условно здоровых доноров // Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2012. - Т. 41. - № 4. - С. 104-105.

10. Голикова Е.А.. Лопатникова Ю.А., Шкаруба Н.С., Сизиков А.Э., Сенников С.В. TNF, растворимые рецепторы и аутоантитела к TNF у больных ревматоидным артритом и условно здоровых доноров. // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН.-2012.-Т. 85.-№3.-Ч. 2.-С. 67-71.

И. Sennikov S.V.. Golikova Е.А.. Kireev F.D., Lopatnikova J.A. Purification of human immunoglobulin G autoantibodies to tumor necrosis factor using affinity chromatography and magnetic separation. // J. Immunol. Methods. - 2013. - V. 390. - P. 92-98.

12. Golikova E.A.. Lopatnikova J.A., Kovalevskaya-Kucheryavenko T.V., Nepomnyashih V.M., Sennikov S.V. Levels of TNF, TNF autoantibodies, and soluble TNF receptors in patients with bronchial asthma. // J. Asthma. - 2013. -doi: 10.3109/02770903.2013.796972.

Заявка на патент РФ, приоритетная справка на изобретение № 2012124854 от 14.06.2012. «Способ аффинного выделения аутоантител класса IgG к иммунорегу.таторному цитокину TNF». Сенников С.В., Лопатникова Ю.А., Голикова Е.А.. Киреев Ф.Д.

Подписано к печати 15.05.2013 Формат 60х84/16.Бумага офсетная. Печать офсетная. 0бъем:0,75 п л. Тираж: 110 экз. Заказ №.51-35 Отпечатано в типографии ООО «Копи-Р Групп» 190000, Россия,Санкт-Петербург,пер. Гривцова, д. 6, лит. Б