Автореферат и диссертация по медицине (14.00.11) на тему:Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека

ДИССЕРТАЦИЯ
Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека - диссертация, тема по медицине
АВТОРЕФЕРАТ
Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека - тема автореферата по медицине
Кладова, Анна Юрьевна 0 г.
Ученая степень
кандидата медицинских наук
ВАК РФ
14.00.11
 
 

Автореферат диссертации по медицине на тему Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека

На правах рукописи

КЛАДОВА Анна Юрьевна

АССОЦИАЦИЯ ЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ ОПУХОЛЕЙ КОЖИ С ВИРУСАМИ ПАПИЛЛОМЫ ЧЕЛОВЕКА.

14.00 11.- кожные и венерические болезни

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

иизоБ167Б

Москва-2007

003061676

Работа выполнена в ГОУ ВПО Московской медицинской академии имени И М Сеченова и на базе Центра молекулярной диагностики ФГУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва

доктор медицинских наук, профессор Молочков Владимир Алексеевич доктор биологических наук, профессор Киселев Всеволод Иванович

доктор медицинских наук, профессор Халдин Алексей Анатольевич доктор медицинских наук, профессор Сергеев Юрий Валентинович ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Московский Государственный Медико-Стоматологический Университет (МГМСУ)

Защита диссертации состоится » 2007 г в_

часов на заседании диссертационного Совета Д 208.040.10 при Московской медицинской академии имени И.М Сеченова по адресу 119991, г. Москва, ул Трубецкая, д 8, стр.2

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ММА имени И М Сеченова по адресу. 117998, г Москва, Нахимовский проспект, д 49

Автореферат разослан 2007 г

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

Эрдес Светлана Ильинична

Актуальность проблемы.

Эпителиальные опухоли кожи (ЭОК) - одна из самых распространенных групп опухолей человека, отличающаяся значительным разнообразием Отмечаемый в последние годы неуклонный рост заболеваемости ЭОК некоторые авторы называют «бесшумной эпидемией» [Holme S et al, 2000, Nguen T et al 2002] Этиология и патогенез ЭОК изучены не достаточно Вместе с тем, исследования в данном направлении представляют значительный интерес с точки зрения оптимизации лечения и профилактики этих опухолей [Сергеев ЮВ и соавт, 1999, Снарская Б С ,

2004, Галил-Оглы Г А и соавт, 2005, Мол очков В А и соавт, 2006, Kaplan В et al, 2000, Ariette J et al, 2004]

К факторам, способствующим развитию ЭОК, относят длительную инсоляцию, химические канцерогены, а также ионизирующее излучение [Tolbert Р et al, 1997, Armstrong В et al, 2001] Определенную роль отводят наследственным и иммунологическим нарушениям [Молочков В А, 1993, Снарская ЕС, 2004, Галил-Оглы ГА и соавт, 2005, Grossman D et al, 1997] В последние годы благодаря достижениям в области молекулярной биологии сложились предпосылки для изучения новых аспектов этиологии и патогенеза ЭОК В частности, предпринимаются попытки определить роль вируса папилломы человека (ВПЧ) в развитии отдельных вариантов ЭОК -кератоакантомы, себорейного кератоза, актинического кератоза, болезни Боуэна, базальноклеточного и плоскоклеточного рака кожи [Shamamn V et al, 1996, Berkhout R et al, 2000, Harwood A. et al, 2000, Weissenborn S et al,

2005, de Vffliers E , 2004]

Число больных, страдающих заболеваниями, ассоциированными с ВПЧ, продолжает непрерывно увеличиваться [Киселев В И, 2004, Дмитриев Г А,

2006, zur Hausen H et ai, 1996] В настоящее время известно около 200 генотипов вирусов папилломы, инфицирующих эпителий слизистых оболочек (род alpha) и кожи (род beta, gamma, mu и nu) [de Villiers E, 2004] Опасность ВПЧ-инфекции заключается в высокой онкогенности отдельных

разновидностей вируса [Киселев В И, 2004, zur Hausen Н et al, 2001] Так, ВПЧ-16 и ВПЧ-18, относящиеся к роду alpha, признаны основными этиологическими агентами рака шейки матки и других раков аногенитальной области [ВОЗ, 2004] Эпидемиологические и молекулярно-биологические данные позволяют предполагать, что кожные типы ВПЧ рода beta могут обуславливать формирование ряда ЭОК, однако данная взаимосвязь в настоящее время не достаточно изучена [Orth G., 2004, Pfister Н, 2005] Частота выявления ВПЧ рода beta в различных ЭОК существенно варьирует [Shamanm V et al, 1996, Harwood С et al, 2000, Iftner A et al, 2003, Forslund О et al, 2003] Это обусловлено разнообразием используемых с этой целью лабораторных методов менее чувствительные - способны обнаруживать вирус только при его высокой концентрации, более чувствительные - даже единичные копии вируса в пробе [Meyer Т et al, 2000] Кроме того, предполагают, что ассоциация ВПЧ-инфекции с ЭОК может иметь региональные особенности, различаясь у жителей Восточной Европы, Центральной Европы и Америки [zur Hausen Р. et al, 2005] В России подобные исследования не проводились.

В последнее время становится очевидным, что обнаружение ВПЧ в ЭОК не может являться прямым доказательством этиологической роли вируса в развитии данных состояний Присутствие ВПЧ в патологически измененном эпителии кожи может быть следствием как активной вирусной инфекции, так и бессимптомной персистенции, характерной для условно-патогенных инфекционных агентов В связи с этим, помимо выявления ВПЧ, необходимо проводить измерение вирусной нагрузки (количество геномов ВПЧ в эпителиальных клетках) [Smjders Р., 2003; Stoler М, 2006] Определение вирусной нагрузки является сравнительно новым подходом в генодиагностике, уже продемонстрировавшим высокую значимость в мониторинге течения и прогрессирования генитальной (слизистой) ВПЧ -инфекции [Smjders Р et al, 2003, Stoler М, 2006] В настоящее время не вызывает сомнений необходимость проведения количественного анализа

вирусных геномов в коже Это позволит более объективно судить о состоянии ВПЧ в опухолях кожи, а, следовательно, глубже понимать механизмы, связывающие ЭОК и ВПЧ [Smjders Р, 2003, Harwood С et al, 2004, zur Hausen P et al, 2005, Weissenborn S et al, 2005]

Наиболее интересной нозологической формой для изучения связи вирусной нагрузки ВПЧ с динамикой клинического течения опухолевого процесса является кератоакантома Известно, что эта опухоль быстро проходит стадию роста и стабилизации, а затем спонтанно самоизлечивается с формированием выраженного иммунного ответа на антигены опухоли [Беренбейн и др, 1980, Молочков В А и др, 2003; Schwartz et al, 1994] Однако в «атипичных» случаях кератоакантома персистирует и даже подвергается злокачественному перерождению [Молочков В А и др , 2003, Shwartz R et al, 1994] Клинические особенности течения кератоакантомы представляют удобную модель для изучения вирус - индуцированного канцерогенеза в коже.

С учетом вышеизложенного, изучение ассоциации ВПЧ с различными формами ЭОК (доброкачественными, предраковыми и злокачественными) на основе количественного определения ДНК ВПЧ, является актуальной задачей дерматоонкологии, решение которой будет способствовать дальнейшему пониманию взаимосвязей ЭОК и ВПЧ

Цель исследования: изучить ассоциацию эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека Задачи исследования:

1 Разработать методику выявления и количественного определения ДНК ВПЧ в коже

2 Оценить выявляемость ДНК ВПЧ в эпителиальных опухолях кожи

3 Определить вирусную нагрузку ВПЧ в эпителиальных опухолях кожи

4 На примере кератоакантом изучить изменение вирусной нагрузки ВПЧ в зависимости от динамики клинического течения опухолевого процесса

Научная новизна.

Впервые разработана количественная методика обнаружения кожных типов ВПЧ рода beta с использованием полимеразной цепной реакции (ПНР) «в режиме реального времени»

На основе количественного анализа впервые детально изучена ассоциация доброкачественных (себорейный кератоз, кератоакантома), предраковых (актинический кератоз, болезнь Боуэна) и злокачественных (базальноклеточный рак, плоскоклеточный рак) ЭОК с ВПЧ рода beta

На примере кератоакантом продемонстрировано изменение вирусной нагрузки ВПЧ в зависимости от динамики клинического течения опухолевого процесса Положения, выносимые на защиту:

1 Доброкачественные (себорейный кератоз, кератоакантома) предраковые (актинический кератоз, болезнь Боуэна) и злокачественные (базальноклеточный рак, плоскоклеточный рак) ЭОК не менее, чем в 70% случаев ассоциированы с инфекцией ВПЧ рода beta

2. Концентрация ДНК ВПЧ рода beta у больных ВПЧ-ассоциированными ЭОК достоверно превосходит таковую у бессимптомных носителей ВПЧ (контрольная группа)

3 Динамика вирусной нагрузки ВПЧ может описывать клиническое течение ЭОК, что продемонстрировано на примере кератоакантом Внедрение в практику.

Результаты работы используются в лечебном и учебном процессе на кафедре кожных и венерических болезней ФППОВ ММА им И М Сеченова, кафедре дерматовенерологии и дерматоонкологии ФУВ МОНИКИ им М Ф Владимирского, а также на базе Центра молекулярной диагностики ФГУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на заседании Московского областного общества дерматовенерологов, Москва, 2005г, 2007г, на научно-практической конференции «Пролиферативные заболевания кожи», Москва 25-26 апреля 2006 г, 23rd INTERNATIONAL PAPILLOMAVIRUS CONFERENCE & CLINICAL WORKSHOP 2006 Prague, September 1-7 2006г, на международной научно-практической конференции «Геномные технологии в медицине и медицинское образование на рубеже веков», Алмата 19-20 мая 2006 г, на научно-практической конференции «Социально-значимые заболевания в дерматовенерологии», Москва 29-30 сентября 2006 г, на научно-практической конференции «Современная диагностика и лечение урогенитального хламидиоза», Москва 26-27 апреля 2007 г

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ

Структура диссертации.

Диссертация изложена на 119 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов, выводов и библиографического указателя Указатель литературы включает 29 отечественных и 179 зарубежных работ Работа иллюстрирована 3 фотографиями, 10 рисунками и 16 таблицами

Содержание работы. Материалы и методы.

Общая характеристика исследуемой группы больных.

Группа лиц, вошедших в исследование, была сформирована в соответствии с данными мировой научной литературы, согласно которым ВПЧ рода beta ассоциирован с отдельными вариантами доброкачественных (бородавка, себорейный кератоз, кератоакантома), предраковых (актинический кератоз, болезнь Боуэна) и злокачественных

(плоскоклеточный рак, базальноклеточный рак) ЭОК [8Ьаташп V е1а1 1996, Натоооё С е1а1,2000, Богеме! О й а1,2003, ёе УШюг Е -М. е1 а1,1999]

В настоящее исследование включены 135 больных с доброкачественными, предраковыми и злокачественными новообразованиями кожи, в том числе 10 больных себорейным кератозом (СК), 21 - кератоакантомой (КА), 15 -актиническим кератозом (АК), 5 - болезнью Боуэна (ББ), 74 -базальноклеточным раком (БКР) кожи и 10 - плоскоклеточным раком (ПКР) кожи (табл 1)

Таблица 1.

Распределение больных по нозологиям.

Группа новообразований Нозологическая форма Количество больных Количество исследованных опухолевых очагов

Доброкачественные опухоли кожи Себорейный кератоз 10 16

Кератоакантома 21 21

Предраковые состояния Актинический кератоз 15 15

Болезнь Боуэна 5 5

Злокачественные опухоли кожи Базальноклеточный рак 74 82

Плоскоклеточный рак 10 10

Всего 135 149

Из 135 больных 87 пациентов имели единичные (солитарные) очаги поражения, 49 - множественные Среди них было 69 мужчин и 66 женщин в возрасте от 33 до 79 лет Во всех группах больных преобладали лица пожилого возраста средний возраст при БКР составил 65,2 ± 10,4 года, при ПКР - 69,4 ± 6,9 года, при АК 66,5 ± 12,5 года, при ББ - 60 ± 10,7 года, при КА - 67 ± 10,2 года, при СК - 63,6 ± 11,7 года

В каждом случае диагноз устанавливался впервые и основывался на данных анамнеза, клинической картины, гистологического и/или цитологического исследования Гистологическое подтверждение диагноза было получено у всех пациентов с КА, СК, АК, ББ, ПКР, а также в 63 случаях БКР кожи

Цитологическое исследование проводилось 15 больным БКР кожи при локализации новообразований в местах, труднодоступных для проведения биопсии

Всем пациентам проводили комплексное обследование, включавшее общий анализ крови и мочи, биохимические анализы плазмы крови, ЭКГ, при необходимости - рентгеноскопию органов грудной клетки, УЗИ внутренних органов и др Критерием исключения из исследования были состояния, сопровождающиеся выраженной иммуносупрессией онкологические заболевания внутренних органов и крови, тяжелые системные заболевания, инфекционный гепатит В и С, ВИЧ-инфекция, состояния после трансплантации внутренних органов

Контрольная группа была представлена 49 добровольцами 21 мужчина и 28 женщин в возрасте от 29 до 78 лет (средний возраст 58 ± 14,5 года), у которых кожные заболевания, в том числе ассоциированные с кожными типами ВПЧ, отсутствовали

Взятие и первичная обработка исследуемого материала.

Материалом для молекулярно-биологического исследования служили биоптаты кожи размером 0,2x0,2см, полученные с помощью малоинвазивной модификации взятия биопсии бритвенным способом, или суспензия клеток, полученная методом соскоба Соскоб использовался только для взятия материала из зон новообразований, где имелись нарушения сцепления между клетками, и скарификация обеспечивала получение достаточного количества клеточной массы

Исследуемый материал помещали в отдельные пробирки, содержащие 1 мл транспортной среды (РВБ буфер, ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Москва) Для максимального сохранения количества клеточной и вирусной ДНК пробирки замораживали сразу после взятия материала и хранили до проведения ПЦР - анализа при -70° С

Генодиагностика ВПЧ-инфекции.

Подготовку исследуемого материала осуществлялась методом обработки ткани протеиназой К с последующим выделением ДНК методом аффинной сорбции на силикагеле с использованием набора для выделения «ДНК-сорб-С» согласно инструкции производителя (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора) Экстракция ДНК проводили в 100 мкл ТЕ-буфера. Образцы, содержащие очищенную ДНК, использовали в реакции амплификации нуклеиновых кислот

Для разработки методики количественного определения ВПЧ рода beta, а так же оценки ее чувствительности и специфичности, использовали рекомбинантные плазмидные положительные контроли, содержащие последовательность полных геномов ВПЧ кожных типов рода alpha, gamma, mu, nu и beta - 1, 3,4, 5, 7, 8,15,20,24,27, 37, 38,49, 50, 65 (M Favre Institut Pasteur,Unite Postulante Genetique, Papillomavirus et Cancer Humain, France, E -M de Villiers, Abteilung tumorviras-Charaktensierung Referenzzenturum for Humanpathogene Papillomviren, Germany), а также контрольные плазмиды фрагмента ß-глобинового гена человека (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора)

Для выявления ДНК ВПЧ рода beta (5 видов) были разработаны четыре системы олигонуклеотидов (группоспецифических праймеров и зондов)

1-я - для выявления вида beta 1 (5, 8,12, 14,21,19,25,47, 36 типы),

2-я - для выявления вида beta 2 (9,15,17,22,23, 38,37, 80 типы),

3-я - для выявления вида beta 3 (49, 75, 76 типы),

4-я - для выявления вида beta 4 (92), beta 5 (96), beta 1 (20,24 и 93 типы)

Последовательности всех олигонуклеотидов ВПЧ рода beta были выбраны

при анализе известных последовательностей ВПЧ, взятых из Интернет ресурса "NCBI GeneBank" (http7/www nebí nlm nih gov) и обработаны при помощи программы AlignX пакета Vector NTI6 (InforMax Inc, 2000)

Во все четыре системы введены олигонуклеотиды для выявления и количественного определения ДНК человека (по ß-глобиновому гену

человека), что позволяло проводить оценку адекватности забора, хранения и обработки образцов (принцип внутреннего контроля)

ПЦР проводили в мультиплексном формате. Каждая пробирка содержала одну из групп олигонуклеотидов для выявления ВПЧ, а также олигонуклеотиды для выявления (3-глобинового гена человека

В состав реакционных смесей для ПЦР входили следующие компоненты праймеры и зонды, нуклеотиды в концентрации 0,2 мМ каждого, ПЦР-буфер (66мМ Тт-НС1, РН 8,8, 17 мМ^НО^О,,, 4 мМ 0,01% Tween 20),

TaqF-ДffiC-пoлимepaзa (2И в реакцию) (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Москва), очищенная ДНК, выделенная из клинического материала -10 мкл

В отдельные пробирки (вместо образца ДНК) вносили положительные и отрицательные контрольные образцы (10 мкл) Отрицательный контроль амплификации - представлял обычную реакционную смесь, в которую вместо образца ДНК добавлялся ТЕ-буфер Положительный контроль амплификации - представлял собой фрагмент специфичной ДНК (контрольные плазмиды ВПЧ в концентрации 104 копий ДНК ВПЧ/мл)

Термоциклирование проводили на амплификаторе МхЗОООР (81га1а£епе,США), соединенным с персональным компьютером по следующей программе предварительный этап 95 °С - 15 мин, затем при 95°С - 15 сек , при 60 °С - 30 сек , при 65 °С - 1 мин - 50 циклов

Детекция продуктов амплификации осуществлялась в «реальном времени» путем измерения флуоресцентного сигнала, нарастающего по мере накопления специфического продукта реакции Получаемая зависимость интенсивности флуоресценции от цикла реакции - кривая флуоресценции -имела в случае положительной реакции характерный Б-образный вид В соответствии с этим проводили качественную оценку результатов реакции

Для количественного анализа использовали 10-кратные разведения (6 ^ -1 положительных плазмидных контролей 5, 8, 15, 37, 38, 20, 24,49 типов ВПЧ и ДНК человека (стандарты), по которым осуществляли построение калибровочных прямых и расчет концентрации ВПЧ и ДНК человека

Для построения и математической обработки описанных кривых использовали программу построения, обработки, анализа кривых флуоресценции и ведения документации для метода ПЦР «в реальном времени» - МхЗОООР (Stratagene, США) Расчет нормализованной вирусной нагрузки.

Метод ПЦР в «режиме реального времени», положенный в основу разработки методики количественного выявления ВПЧ рода beta, позволял определять абсолютное количество геномов ВПЧ и ДНК человека в пробе С учетом того, что при взятии клинического материала из очагов ЭОК и нормальной кожи количество эпителиальных клеток (а соответственно и копий вируса), попадающих в образец, существенно варьировало, нами была предложена методика нормирования количества вируса на количество клеток человека Это позволяло получать надежные и достоверные данные о вирусной нагрузке ВПЧ в клетках кожи

Расчет нормализованной вирусной нагрузки (ВН) производился по формуле

ВН = lg ((Кол-во ДНК ВПЧ / Кол-во ДНК чел ) * 103)

Статистическая обработка данных. Достоверность различия частот определяли при помощи критерия «хи-квадрат» Доверительные границы к частотам рассчитывали на основании биномиального распределения Для анализа вирусных нагрузок рассчитывали десятичный логарифм количества вирусов, анализ его связи с другими переменными проводили с использованием метода параметрической статистики достоверность различий средних по группам вычисляли с помощью дисперсионного анализа, а доверительные границы к среднему - на основе распределения Стьюдента

Результаты и обсуждение. Оценка аналитических характеристик разработанной методики выявления и количественного определения ВПЧ рода beta.

Аналитическая специфичность методики оценивалась на высококонцентрированных (108 копий ДНК/мл) образцах контрольной ДНК ВПЧ кожных типов (род beta, gamma, mu, nu: 1, 3, 4, 7, 50, 65, 5, 7, 8, 15, 20, 24, 37, 38, 49 типы), ДНК ВПЧ слизистых типов (род alpha 16,18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73, 82 типы), ДНК, полученную из культур бактерий, потенциально колонизирующих кожные покровы и слизистые оболочки S aureus, S pyogenus, Ps aeroginosa, E coli, U urealiticum, С trachomatis, G vaginalis, T vaginalis, ДНК человека В результате проведенных исследований перекрестных реакций не обнаружено Положительный сигнал был получен в присутствии ДНК ВПЧ кожных типов рода beta

Аналитическая чувствительность оценивалась с использованием 10-кратных разведений контрольной панели 5, 7, 8, 15, 20, 24, 37, 38, 49 типов ВПЧ рода beta После определения последнего проходящего разведения осуществлялисерию 2-кратных разведений из этой точки Далее определялось последнее стопроцентное проходящее разведение (6 точек из 6), которое расценивали как порог аналитической чувствительности

Аналитическая чувствительность разработанной методики позволяла выявлять генотипы вида beta 1 (смесь А) - 1250 копий ДНК ВПЧ/мл, вида beta 2 (смесь В) - 1 ООО копий ДНК ВПЧ/мл, вида beta 3 (смесь С) - 450 копий ДНК ВПЧ/мл, вида beta 4,5 (смесь D) - 300 копий ДНК ВПЧ/мл

Для разработанных систем олигонуклеотидов выявления ДНК ВПЧ рода beta было проведено исследование линейной зависимости между десятичным логарифмом концентрации исходной ДНК-матрицы в образце (lgC) и циклом начала флуоресценции (пороговым циклом, Ct) Такая зависимость лежит в основе проведения количественных измерений в ПЦР «в реальном времени» (рис 1)

Рисунок 1.

Корреляция логарифма концентрации ДНК ВПЧ и порогового цикла (С^) в разработанных системах олигонуклеотидов.

Смесь А Смесь В

40 35 30 25 20 15 10 $ &--, 40 35 30 25 20 6 & — - " " - -1

^ |

Я2 0,9976 | Й' = 0.9988

I

1гС 1

123466789 12345676

Смесь С Смесь £>

3$ 30 25 го 15 10 5 Г&------ т Г 3$ ■& го 15 10 5 а " — " ~~

к' * О.ЭЙВв й3 = 0,9891

--

1§С кс

122456786 1 2 3 4 5 6 7 6

Из рисунка видно, что данные зависимости имели линейный характер в диапазоне для смеси А - от 2,5*103 (3,4 до 109 (9 копий/мл, для смеси В -от 5*102 (2,7 до 2* 107 (7,3 копий/мл , для смеси С - от 7* 102 (2,8до 107 (7 копий/мл , для смеси В - от 5*102 (2,7 до 2*107 (7,3 1§) копий/мл Коэффициент корреляции (К2) во всех случаях составил >0,99

Выявление кожных видов ВПЧ рода beta у больных эпителиальными опухолями кожи.

Выявление и определение вирусной нагрузки кожных видов ВПЧ рода beta у больных ЭОК проводили в два этапа Первоначально все образцы кожи больных ЭОК и контрольной группы были протестированы на присутствие ДНК ВПЧ рода beta (табл 2).

Таблица 2.

Выявляемость ДНК ВПЧ рода beta в эпителиальных опухолях и

образцах нормальной кожи.

Исследуемые образцы Кол-во образцов Образцы ВПЧ- Образцы ВПЧ +

абс. % абс %

Себорейный кератоз 16 4 25,0 12 75,0

Кератоакантома 21 5 23,8 16 76,2

Актинический кератоз 15 1 6,7 14 93,3

Болезнь Боуэна 5 1 20,0 4 80,0

Базальноклеточный рак 82 15 18,3 67 81,7

Плоскоклеточный рак 10 3 30,0 7 70,0

Нормальная кожа 49 26 53,1 23 46,9

Как видно из табл 2, злокачественные (ПКР, БКР), а также предраковые (АК, ББ) и доброкачественные (СК, КА) опухоли кожи в высоком проценте случаев были ассоциированы с ВПЧ последовательности ДНК ВПЧ рода beta выявляли в 75% случаев СК, 76,2% - КА, 93,3% - АК, 80% - ББ, 81,7% - БКР, 70% - ПКР Наряду с этим, ВПЧ beta рода обнаруживали в биоптатах нормальной кожи здоровых доноров в 46,9%

Известно, что потенциальный риск персистенции и прогрессии ВПЧ-инфекции зависит от типа и/или вида ВПЧ, а также от совместной инфицированности клеток эпителия генотипами одного или нескольких видов ВПЧ [Muñoz N et al, 2004] С учетом этого мы проанализировали

данные о частоте обнаружения различных видов ВПЧ рода beta, а также данные о частоте их ассоциаций в образцах ЭОК и нормальной коже

Было установлено, что как в ЭОК, так и нормальной коже выявлялся широкий спектр ВПЧ рода beta, представленный beta 1, beta 2, beta 3, beta 4 и beta 5 видами В образцах доброкачественных ЭОК (СК и КА), а также в нормальной коже различные виды ВПЧ встречались приблизительно с одинаковой частотой В образцах предраковых (АК) и злокачественных ЭОК (БКР и ПКР) beta 1 и beta 2 виды встречались в 1,5-2 раза чаще, чем beta 3, 4, 5 виды (р<0,035) (табл 3)

Таблица 3.

Сравнительная частота обнаружения различных видов ВПЧ рода beta в

эпителиальных опухолях и нормальной коже.

Исследуемые образцы Кол-во ВПЧ+ образцов Виды ВПЧ

beta 1* (%) beta 2* (%) beta 3* (%) beta 4,5* (%)

Себорейный кератоз (п=16) 12 6 (50,0) 7 (58,3) 5(41,6) 6 (50,0)

Кератоакантома (п=21) 16 10 (62,5) 11 (68,7) 8 (50,0) 9 (56,2)

Актинический кератоз (п=15) 14 12 (85,7) 14(100) 7 (50,0) 5 (35,7)

Базальноклеточный рак (п=82) 67 50(74,6) 51 (76,1) 24 (35,8) 11(16,4)

Плоскоклеточный рак (п=10) 7 6(85,7) 5 (71,4) 2 (28,5) 1 (14,2)

Нормальная кожа (п=49) 23 8 (34,8) 11 (47,8) 6(26,1) 11 (47,8)

*в том числе в ассоциация с другими видами

В подавляющем большинстве случаев всех ЭОК (66,6% - 100%) отмечалась ассоциация двух и более видов ВПЧ рода beta Напротив, при изучении образцов здоровой кожи лиц контрольной группы наибольший процент наблюдений (78,3%) составили случаи инфицирования только одним видом ВПЧ рода beta (р<0,01) (табл 4)

Таблица 4.

Встречаемость одного или нескольких видов ВИЧ рода beta в эпителиальных опухолях и нормальной коже.

Исследуемые образцы Кол-во ВПЧ+ образцов Один вид ВПЧ в образце 2 и более видов ВПЧ в образце

абс % абс %

Себорейный кератоз 12 4 33,3 8 66,6

Кератоакантома 16 4 25,0 12 75,0

Болезнь Боуэна 4 - - 4 100

Актинический кератоз 14 - - 14 100

Базальноклеточный рак 67 21 31,4 46 68,6

Плоскоклеточный рак 7 - - 7 100

Нормальная кожа 23 17 78,3 5 21,7

Результаты, полученные при использовании разработанной нами методики по выявлению ДНК ВПЧ рода beta в опухолях и нормальной коже, преобладании в предраковых и злокачественных ЭОК beta 1 и beta 2 видов, а также преимущественном инфицировании ЭОК несколькими видами ВПЧ, не противоречили данным зарубежных исследователей, использовавшим для обнаружения ВПЧ в коже высокочувствительные и высокоспецифичные неколичественные методы ПЦР-анализа [Berchout J et al, 1995, de Villiers E -M et al, 1999, Boxman I et al, 2000, Forslund О et al, 2003] Это позволило использовать полученные данные на следующем этапе исследования при изучении вирусной нагрузки в ВПЧ-ассоциированных ЭОК Определение вирусной нагрузки ВПЧ у больных эпителиальными опухолями кожи.

Широкое распространение ВПЧ как в ЭОК, так и нормальной коже, продемонстрированное в работах зарубежных авторов [Berchout J et al, 1995, de Villiers E 1999, Astori G et al, 1998, Atonsoon A et al, 2000, Boxman I et al, 2000, Forslund О et al, 2003] и подтвержденное нами, не позволяло категорически утверждать о непосредственном участии ВПЧ в

формировании опухолевых заболеваний кожи В связи с этим, на следующем этапе исследования был проведен количественный анализ, включающий определение вирусной нагрузки в ВПЧ - положительных образцах ЭОК и нормальной коже и нормирование количества ДНК ВПЧ на количество геномов человека

В результате проведенного количественного анализа было установлено, что средние показатели вирусной нагрузки ВПЧ рода beta во всех ВПЧ-положительных ЭОК превышали средние показатели вирусной нагрузки ВПЧ в нормальной коже (1,4 ± 0,6 lg/Ю5 клеток человека), причем при СК (3,0 ± 0,7 lg/Ю5 клеток человека), КА (3,2 ± 1,6 lg/Ю5 клеток человека), АК (4,5± 1,2 lg/Ю5 клеток человека) и БКР (2,08 ±1,4 lg/Ю5 клеток человека) различия имели достоверный характер (рис 2)

Рисунок 2.

Вирусная нагрузка (Ig ДНК BIM/105 клеток человека) в эпителиальных опухолях и нормальной коже.

lg ДНК ВПЧ/105 ___клеток

гЬ 1,43

3,21'

3,03'

4,54"

2,09*

2,19

нормальная кожа кератоакантома себорейная

кератома

*- р < 0,05 ** - р < 0,0001

акгиническии кератоз

БКР

ПКР

Таким образом, количественный анализ, примененный нами, продемонстрировал, что вирусная нагрузка в большинстве ЭОК достоверно

превышала этот показатель в нормальной коже. Увеличение вирусной нагрузки в образцах ЭОК по сравнению с нормальной кожей указывает на активацию ВПЧ и может свидетельствовать о важной роли вируса в этиологии и/или патогенезе опухолей кожи

С учетом полученных данных, количественное измерение вирусной ДНК может рассматриваться как предпочтительный метод для изучения связи ВПЧ с развитием, течением или прогрессированием опухолей кожи Анализ вирусной нагрузки ВПЧ с учетом клинического течения опухолевого процесса на примере кератоакантом.

С целью более детального изучения патогенетической роли ВПЧ при ЭОК была проанализирована динамика вирусной нагрузки ВПЧ в образцах КА с учетом цикличности ее течения Было установлено, что в фазу роста КА, т.е в период наиболее интенсивного деления клеток, средняя вирусная нагрузка ВПЧ составила 3,1 ± 1,6 1§./105 клеток человека В фазу стабилизации - 3,9 ± 1,6 ^/105 клеток человека В фазу регресса средняя вирусная нагрузка ВПЧ уменьшилась до 1,6 ± 1,5 ^/105 клеток человека Причем у 5 (71,4%) больных КА, обследованных на стадии регресса опухоли, ДНК ВПЧ вообще не определялась, что могло свидетельствовать о снижении концентрации вируса ниже предела чувствительности метода или же о его полной элиминации (табл 5)

Таблица 5.

Вирусная нагрузка (1^» ДНК ВПЧ/105 клеток человека) в различных

фазах развития кератоакантом.

Фаза развития кератоакантом Кол-во обследованных больных Образцы ВПЧ + Вирусная нагрузка (1^ ДНК ВПЧ/105 клеток)

Рост 6 6(100%) 3,1 ±1,6

Стабилизация 8 8 (100%) 3,9 ± 1,6

Регресс 7 2 (28,6%) 1,6 ± 1,5

Всего 21 16 (76,2%)

Таким образом, концентрации ДНК ВПЧ, измеряемая в различных фазах эволюции КА, менялась в зависимости от стадии опухолевого процесса возрастала в фазу роста и стабилизации и уменьшалась более чем в 20 раз в фазу регресса опухоли Следовательно, динамика вирусной нагрузки ВПЧ отражает этапы клинического течения КА, что, в свою очередь косвенно подтверждает участие ВПЧ в развитии и/или течении КА.

В заключении необходимо подчеркнуть, что, несмотря на многочисленные данные, полученные зарубежными авторами и подтвержденные собственными исследованиями о частом обнаружении ДНК ВПЧ рода beta в различных ЭОК, роль ВПЧ в развитии кожных опухолей остается не ясной В последнее время стало очевидным, что обнаружение ДНК ВПЧ в ЭОК не может являться достаточным доказательством этиологической или патогенетической роли вируса Присутствие ВПЧ в патологически измененном эпителии может быть следствием, как активной вирусной инфекции (при этом количество вирусных частиц должно быть довольно велико и сравнимо с количеством клеток человека), так и бессимптомной персистенции (вирус может определяться в единичных копиях) В связи с этим, необходимо проводить количественный анализ геномов ВПЧ, более точно характеризующий состояние вируса в клетках кожи С учетом современных требований к генодиагностике папилломавирусной инфекции, нами была разработана высокочувствительная и высокоспецифичная методика выявления и количественного определения 5 видов ВПЧ рода beta на основе ПЦР в «режиме реального времени» Было установлено, что доброкачественные (СК, КА), предраковые (АК, ББ) и злокачественные (БКР, ПКР) ЭОК не менее чем в 70% случаев ассоциированы с двумя и более видами ВПЧ рода beta Причем в предраковых (АК) и злокачественных (БКР, ПКР) ЭОК преобладают betal и beta 2 виды ВПЧ рода beta Количественные измерения показали достоверное повышение вирусной нагрузки в ЭОК по сравнению с

нормальной кожей, что позволяет сделать вывод об активации ВПЧ в ЭОК и предполагать важную роль вируса в этиологии и/или патогенезе опухолей кожи. На примере КА продемонстрирована связь вирусной нагрузки с этапами клинического течения опухолевого процесса, что подтверждает патогенетическую роль ВПЧ в развитие ЭОК Дальнейшие исследования в этом направлении, представляющие несомненный интерес для специалистов разных областей медицины, будут способствовать совершенствованию методов лечения и профилактики ЭОК

ВЫВОДЫ

1 Выявление и определение вирусной нагрузки 5 видов ВПЧ рода beta в коже можно проводить с помощью разработанной количественной методики на основе ПНР в «режиме реального времени»

2 С помощью ПЦР в «режиме реального времени» ассоциация ЭОК с ДНК ВПЧ рода beta была выявлена в 75% случаев себорейного кератоза, 76,2% -кератоакантом, 93,3% - актинического кератоза, 80% - болезни Боуэна, 81,7% - базальноклеточного рака кожи и 70% - плоскоклеточного рака кожи В нормальной коже здоровых людей ДНК ВПЧ рода beta обнаруживался в 46,9% случаев

3. В образцах предраковых (актинический кератоз) и злокачественных (базальноклеточный и плоскоклеточный рак кожи) ЭОК папилломавирусы beta 1 и beta 2 видов встречались в 1,5-2 раза чаще, чем представители beta 3,

4, 5 видов В 66,6% ЭОК отмечалась ассоциация 2 и более видов ВПЧ рода beta

4 В ходе количественного анализа было установлено, что вирусная нагрузка ВПЧ во всех ЭОК превышала вирусную нагрузку ВПЧ в нормальной коже (1,4 ± 0,6 lg/ 105 клеток), причем при себорейном кератозе (3,0 ± 0,7 lg/ 105 клеток), кератоакантоме (3,2 ± 1,6 lg/ 105 клеток), актиническом кератозе (4,5± 1,2 lg/ 105 клеток) и базальноклеточном раке кожи (2,08 ± 1,4 lg/ 105 клеток) различия имели достоверный характер

5 На примере кератоакантом продемонстрирована связь вирусной нагрузки ВПЧ с динамикой клинического течения опухолевого процесса в фазу роста кератоакантом вирусная нагрузка составила 3,1 ± 1,6 %/105 клеток, в фазу стабилизации - 3,9 ± 1,6 1^105 клеток, в фазу регресса - 1,6 ± 1,5 1^105 клеток

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Кладова А.Ю , Хлебникова А.Н Козлова Е С К проблеме патогенеза и лечения базалиомы кожи// V научно-практическая конференция «Социально значимые заболевания в дерматовенерологии Диагностика, терапия, профилактика» -М, 2005 - С 58-59,

2 Куевда Д А, Кладова А Ю , Шипулина О Ю , Молочков В А Разработка методики количественного определения папилломавирусов рода Бета// VI научно-практическая конференция «Социально значимые заболевания в дерматовенерологии Диагностика, терапия, профилактика» - М - 2006 -С 97-98,

3 Кладова А Ю , Куевда Д.А., Молочков В А., Шипулина О Ю, Козлова Е С , Прокофьев А А Количественное определение вируса папилломы человека (ВПЧ) в эпителиальных образованиях и других пролиферативных заболеваниях кожи// VI научно-практическая конференция «Социально значимые заболевания в дерматовенерологии Диагностика,терапия,профилактика» -М-2006-С 74-75,

4 Кладова А Ю , Куевда Д А , Молочков В А , Шипулина О Ю , Киселев В И, Хлебникова А Н., Козлова Е С Встречаемость кожных типов вируса папиллом человека в патологиях кожи// Альманах клинической медицины - 2006 - Том IX - С 44-50,

5 Молочков В А, Кладова А Ю Базалиома на фоне невуса сальных желез// Российский журнал кожных и венерических болезней - 2006 - № 3 - С 10-12,

6 Кладова А Ю, Куевда Д А., Молочков В А, Шипулина О Ю Количественное определение папилломавирусов рода Бета новые возможности в оценке роли вирусов папилломы в патологиях кожи// Материалы международной научно-практической конференции «Геномные технологии в медицине и медицинское образование на рубеже веков» -Алмата -19-20 мая 2006г - С 129-135,

7 Kladova А, Kuevda D, Molochkov V, Pokrovskn V, Shipulma О, Kozlova E Human papillomavirus -DNA loads m skin pathologies and normal skin// Abstract in 23-d international papillomavirus conference and clinical workshop -Prague,2006 -P 185,

8 Kuevda D , Kladova A, Shipulma О, Molochkov V , Pokrovskn V Novel Real-time PCR based quantitative assay for detection of broad spectrum of Beta - human papillomaviruses// Abstract m 23-d international papillomavirus conference and clinical workshop - Prague, 2006 - P 285,

9 Кладова А Ю , Куевда Д A, Молочков В A, Кунцевич Ж С , Прокофьев А А К ассоциации кератоакантом с вирусом папилломы человека// Альманах клинической медицины - 2007, - Том IX - С 40-44,

10 Хлебникова А Н, Кладова А Ю , Кириченко Н А, Сарханн ВС К проблеме гигантских базалиом// Клиническая дерматология и венерология -2007 - №1 -С 9-12,

11 Козлова Е С Быков А С , Кладова А Ю , Куевда Д А. Изучение некоторых вирусо-бактериальных ассоциаций при псориазе// Альманах клинической медицины -2007 -Том XV - С 191-194;

12 Кладова А Ю , Куевда Д А, Молочков В А, Шипулина О Ю, Козлова Е С , Прокофьев А А Определение вирусов папилломы человека (ВПЧ) рода beta в патологиях и нормальной коже// Материалы IX съезда всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов - М - 2007 — С 47

Подписано в печать 20 06 2007 г Исполнено 21 Об 2007 Печать трафаретная

Заказ № 566 Тираж 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (495)975-78-56 «пгт.аи1огеГега1 ги

 
 

Оглавление диссертации Кладова, Анна Юрьевна :: 0 ::

Список сокращений

Введение

1. Обзор литературы

1.1. Современные представления о роли вирусов папилломы человека ^ в развитии эпителиальных опухолей кожи

1.2. Вирусная концепция канцерогенеза как теоретическая основа для разработки перспективных методов лечения и профилактики 30 эпителиальных опухолей кожи

1.3. Молекулярно-биологические методы идентификации ДНК вирусов папилломы человека

Глава 2. Материалы и методы исследования

2.1. Общая характеристика исследуемой группы больных

2.2. Генодиагностика папилломавирусной инфекции

Глава 3. Разработка методики выявления и количественного определения вирусов папилломы человека рода beta (5 видов)

Глава 4. Выявление и определение вирусной нагрузки вирусов папилломы человека рода beta (5 видов) у больных эпителиальными 73 опухолями кожи

4.1. Выявление ДНК вирусов папилломы человека рода beta у больных эпителиальными опухолями кожи

4.2. Определение вирусной нагрузки вирусов папилломы человека рода beta в эпителиальных опухолях кожи

4.3. Анализ вирусной нагрузки вирусов папилломы человека с учетом клинического течения опухолевого процесса на примере 82 кератоакантом

 
 

Введение диссертации по теме "Кожные и венерические болезни", Кладова, Анна Юрьевна, автореферат

Актуальность проблемы

Эпителиальные опухоли кожи (ЭОК) — одна из самых распространенных групп опухолей человека, отличающаяся значительным разнообразием. Отмечаемый в последние годы неуклонный рост заболеваемости ЭОК некоторые авторы называют «бесшумной эпидемией» [Holme S. et al., 2000; Nguen Т. et al. 2002]. Этиология и патогенез ЭОК изучены не достаточно. Вместе с тем, исследования в данном направлении представляют значительный интерес с точки зрения оптимизации лечения и профилактики этих опухолей. [Сергеев Ю.В. и соавт., 1999; Снарская Е.С., 2004; Галил-Оглы Г.А. и соавт., 2005; Молочков В.А. и соавт., 2006; Kaplan В. et al., 2000; Arlette J. et al., 2004].

К факторам, способствующим развитию ЭОК, относят длительную инсоляцию, химические канцерогены, а также ионизирующее излучение [Tolbert P. et al., 1997; Armstrong В. et al., 2001]. Определенную роль отводят наследственным и иммунологическим нарушениям [Молочков В.А., 1993; Снарская Е.С., 2004; Галил-Оглы Г.А. и соавт., 2005; Grossman D. et al., 1997]. В последние годы благодаря достижениям в области молекулярной биологии сложились предпосылки для изучения новых аспектов этиологии и патогенеза ЭОК. В частности, предпринимаются попытки определить роль вируса папилломы человека (ВПЧ) в развитии отдельных вариантов ЭОК — кератоакантомы, себорейного кератоза, актинического кератоза, болезни Боуэна, базальноклеточного и плоскоклеточного рака кожи [Shamanin V. et al., 1996; Berkhout R. et al., 2000; Harwood A. et al., 2000; Weissenborn S. et al., 2005; de Villiers E., 2004].

Число больных, страдающих заболеваниями, ассоциированными с ВПЧ, продолжает непрерывно увеличиваться [Киселев В.И., 2004; Дмитриев Г.А., 2006; zur Hausen Н. et al., 1996]. В настоящее время известно около 200 генотипов вирусов папилломы, инфицирующих эпителий слизистых оболочек (род alpha) и кожи (род beta, gamma, mu и nu) [de Villiers E., 2004]. Опасность ВПЧ-инфекции заключается в высокой онкогенности отдельных разновидностей вируса [Киселев В.И., 2004; zur Hausen Н. et al., 2001]. Так, ВПЧ-16 и ВПЧ-18, относящиеся к роду alpha, признаны основными этиологическими агентами рака шейки матки и других раков аногенитальной области [ВОЗ, 2004]. Эпидемиологические и молекулярно-биологические данные позволяют предполагать, что кожные типы ВПЧ рода beta могут обуславливать формирование ряда ЭОК, однако данная взаимосвязь в настоящее время не достаточно изучена [Orth G., 2004; Pfister Н., 2005]. Частота выявления ВПЧ рода beta в различных ЭОК существенно варьирует [Shamanin V. et al., 1996; Harwood С. et al., 2000; Iftner A. et al., 2003; Forslund O. et al., 2003]. Это обусловлено разнообразием используемых с этой целью лабораторных методов: менее чувствительные - способны обнаруживать вирус только при его высокой концентрации, более чувствительные - даже единичные копии вируса в пробе [Meyer Т. et al., 2000]. Кроме того, предполагают, что ассоциация ВПЧ-инфекции с ЭОК может иметь региональные особенности, различаясь у жителей Восточной Европы, Центральной Европы и Америки [zur Hausen P. et al., 2005]. В России подобные исследования не проводились.

В последнее время становится очевидным, что обнаружение ВПЧ в ЭОК не может являться прямым доказательством этиологической роли вируса в развитии данных состояний. Присутствие ВПЧ в патологически измененном эпителии кожи может быть следствием как активной вирусной инфекции, так и бессимптомной персистенции, характерной для условно-патогенных инфекционных агентов. В связи с этим, помимо выявления ВПЧ, необходимо проводить измерение вирусной нагрузки (количество геномов ВПЧ в эпителиальных клетках) [Snijders Р.; 2003; Stoler М., 2006]. Определение вирусной нагрузки является сравнительно новым подходом в генодиагностике, уже продемонстрировавшим высокую значимость в мониторинге течения и прогрессирования генитальной (слизистой) ВПЧ - инфекции [Snijders P. et al., 2003; Stoler М., 2006]. В настоящее время не вызывает сомнений необходимость проведения количественного анализа вирусных геномов в коже. Это позволит более объективно судить о состоянии ВПЧ в опухолях кожи, а, следовательно, глубже понимать механизмы, связывающие ЭОК и ВПЧ [Snijders Р., 2003; Harwood С. et al., 2004; zur Hausen P. et al., 2005; Weissenborn S. et al., 2005].

Наиболее интересной нозологической формой для изучения связи вирусной нагрузки ВПЧ с динамикой клинического течения опухолевого процесса является кератоакантома. Известно, что эта опухоль быстро проходит стадию роста и стабилизации, а затем спонтанно самоизлечивается с формированием выраженного иммунного ответа на антигены опухоли [Беренбейн и др., 1980; Молочков В.А. и др., 2003; Schwartz et al., 1994]. Однако в «атипичных» случаях кератоакантома персистирует и даже подвергается злокачественному перерождению [Молочков В.А. и др., 2003; Shwartz R. et al., 1994]. Клинические особенности течения кератоакантомы представляют удобную модель для изучения вирус - индуцированного канцерогенеза в коже.

С учетом вышеизложенного, изучение ассоциации ВПЧ с различными формами ЭОК (доброкачественными, предраковыми и злокачественными) на основе количественного определения ДНК ВПЧ, является актуальной задачей дерматоонкологии, решение которой будет способствовать дальнейшему пониманию взаимосвязей ЭОК и ВПЧ.

Цель исследования: изучить ассоциацию эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека.

Задачи исследования:

1. Разработать методику выявления и количественного определения ДНК ВПЧ в коже.

2. Оценить выявляемость ДНК ВПЧ в эпителиальных опухолях кожи.

3. Определить вирусную нагрузку ВПЧ в эпителиальных опухолях кожи.

4. На примере кератоакантом изучить изменение вирусной нагрузки ВПЧ в зависимости от динамики клинического течения опухолевого процесса.

Научная новизна

Впервые разработана количественная методика обнаружения кожных типов ВПЧ рода beta с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) «в режиме реального времени».

На основе количественного анализа впервые детально изучена ассоциация доброкачественных (себорейный кератоз, кератоакантома), предраковых (актинический кератоз, болезнь Боуэна) и злокачественных (базальноклеточный рак, плоскоклеточный рак) ЭОК с ВПЧ рода beta.

На примере кератоакантом продемонстрировано изменение вирусной нагрузки ВПЧ в зависимости от динамики клинического течения опухолевого процесса.

Положения, выносимые на защиту:

1. Доброкачественные (себорейный кератоз, кератоакантома) предраковые (актинический кератоз, болезнь Боуэна) и злокачественные (базальноклеточный рак, плоскоклеточный рак) ЭОК не менее, чем в 70% случаев ассоциированы с инфекцией ВПЧ рода beta.

2. Концентрация ДНК ВПЧ рода beta у больных ВПЧ-ассоциированными ЭОК достоверно превосходит таковую у бессимптомных носителей ВПЧ (контрольная группа).

3. Динамика вирусной нагрузки ВПЧ может описывать клиническое течение ЭОК, что продемонстрировано на примере кератоакантом.

Внедрение в практику

Результаты работы используются в лечебном и учебном процессе на кафедре кожных и венерических болезней ФППОВ ММА им. И.М. Сеченова, кафедре дерматовенерологии и дерматоонкологии ФУВ МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского, а также на базе Центра молекулярной диагностики ФГУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены и обсуждены на заседании Московского областного общества дерматовенерологов, Москва, 2005г.; 2007г.; на научно-практической конференции «Пролиферативные заболевания кожи», Москва 25-26 апреля 2006 г.; 23rd INTERNATIONAL PAPILLOMAVIRUS CONFERENCE & CLINICAL WORKSHOP 2006 Prague, September 1-7 2006г.; на международной научно-практической конференции «Геномные технологии в медицине и медицинское образование на рубеже веков», Алмата 19-20 мая 2006 г.; на научно-практической конференции «Социально-значимые заболевания в дерматовенерологии», Москва 29-30 сентября 2006 г.; на научно-практической конференции «Современная диагностика и лечение урогенитального хламидиоза», Москва 26-27 апреля 2007 г.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ.

Структура диссертации

Диссертация изложена на 119 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов, выводов и библиографического указателя. Указатель литературы включает 29 отечественных и 179 зарубежных работ. Работа иллюстрирована 3 фотографиями, 10 рисунками и 16 таблицами.

 
 

Заключение диссертационного исследования на тему "Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека"

выводы

1. Выявление и определение вирусной нагрузки 5 видов ВПЧ рода beta в коже можно проводить с помощью разработанной количественной методики на основе ПЦР в «режиме реального времени».

2. С помощью ПЦР в «режиме реального времени» ассоциация ЭОК с ДНК ВПЧ рода beta была выявлена в 75% случаев себорейного кератоза, 76,2% -кератоакантом, 93,3% - актинического кератоза, 80% - болезни Боуэна, 81,7% -базальноклеточного рака кожи и 70% - плоскоклеточного рака кожи. В нормальной коже здоровых людей ДНК ВПЧ рода beta обнаруживался в 46,9% случаев.

3. В образцах предраковых (актинический кератоз) и злокачественных (базальноклеточный и плоскоклеточный рак) ЭОК beta 1 и beta 2 виды ВПЧ встречались в 1,5-2 раза чаще, чем beta 3, 4, 5 виды. В 66,6% ЭОК отмечалась ассоциация 2 и более видов ВПЧ рода beta.

4. В ходе количественного анализа было установлено, что вирусная нагрузка ВПЧ во всех ЭОК превышала вирусную нагрузку ВПЧ в нормальной коже (1,4 ± 0,6 lg/ 105 клеток), причем при себорейном кератозе (3,0 ± 0,7 lg/ 105 клеток), кератоакантоме (3,2 ± 1,6 lg/ 105 клеток), актиническом кератозе (4,5± 1,2 lg/ 105 клеток) и базальноклеточном раке кожи (2,08 ± 1,4 lg/ 105 клеток) различия имели достоверный характер.

5. На примере кератоакантом продемонстрирована связь вирусной нагрузки ВПЧ с динамикой клинического течения опухолевого процесса: в фазу роста кератоакантом вирусная нагрузка составила 3,1 ± 1,6 lg/Ю5 клеток, в фазу стабилизации - 3,9 ± 1,6 lg/Ю5 клеток, в фазу регресса - 1,6 ± 1,5 lg/Ю5 клеток.

Практические рекомендации

1. Всем больным эпителиальными опухолями кожи (доброкачественными, предраковыми и злокачественными) целесообразно проводить обследование на наличие папилломавирусной инфекции рода beta. Показана необходимость дифференцированного выявления 5 видов вирусов папилломы человека рода beta.

2. Обнаружение вирусов папилломы человека рода beta в эпителиальных опухолях кожи следует проводить с определением вирусной нагрузки, объективно отражающей состояние вирусов (активация или бессимптомная персистенция) в эпителиальных клетках кожи.

3. С целью уточнения клинического течения эпителиальных опухолей кожи обосновано определение динамики вирусной нагрузки.

4. Обнаружение и количественное определение вирусов папилломы человека рода beta в образцах кожи (биоптаты, соскобы) может проводиться с помощью разработанной методики ПЦР в «режиме реального времени».

 
 

Список использованной литературы по медицине, диссертация 0 года, Кладова, Анна Юрьевна

1. Апатенко А.К. Эпителиальные опухоли и пороки развития кожи. М., 1973;

2. Беренбейн Б.А., Студиницин А.А. Дифференциальная диагностика кожных болезней. 2-е изд.- М.б 1989;

3. Галил-Оглы Г. А., Молочков В. А., Сергеев Ю.В. Дерматоонкология. -М.Медицина, 2005;

4. Гистологическая классификация опухолей кожи ВОЗ (2-е изд., 1996);

5. Молекулярная клиническая диагностика// Под ред. С. Херингтона и Дж. Макги -М.: Мир, 1999;

6. Дмитриев Г.А. Биткина О.А. Папилломавирусная инфекция М., 2006;

7. Екимов А.Н., Шипулин Г.А. Бочкарев Е.Г. Новейшие технологии в генодиагностике: полимеразно-цепная реакция в реальном времени (Real-time PCR)// Вестник последипломного медицинского образования. 2001- №3 - С. 3841

8. Злокачественные новообразования в России в 2003г. (заболеваемость и смертность)// Под ред. Чиссова В.И. и др. М., 2004;

9. Ильин И.И., Молочков В.А. Князева Р.А. Некоторые аспекты диагностики и терапии одиночных кератоакантом// Вестн. Дерматол. 1986. - №3. - С.9-15;

10. Киворкова М.Э. Распространенность некоторых эпителиальных новообразований кожи в Ставропольском крае. Иммуноморфологические особенности, лечение и профилактика солнечного кератоза// Дисс. канд. мед. наук.-М., 1991;

11. Киселев В.И. Вирусы папилломы человека в развитии рака шейки матки М., 2004;

12. Киселев В.И., Киселев О.И., Северин Е.С., Исследование специфической активности индол-3карбинола в отношении клеток, инфицированных вирусом папилломы человека// Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2003. - №4. - С.28-32;

13. Киселев Ф.Л. Вирус ассоциированные опухоли человека: Рак шейки матки и вирус папилломы// Биохимия. 2000. -№1.- С. 248-251;

14. Киселев Ф.Л., Мазуренко Н.Н., Киселева Н.П., Кобзева В.К. и др. Молекулярные маркеры рака шейки матки//Мол. Биология. 2002. - С. 8-13;

15. Кубанов А.А. Комплексная иммунологическая и молекулярная диагностика папилломавирусной инфекции у больных и определение формирования злокачественной трансформации эпителиальных тканей//Дисс. докт. мед. наук. -М., 2005;

16. Лихтенштейн А. В., Киселева Н.П. Биохимия. — 2001.-Т. 66, №3 - С. 657-669

17. Малишевская Н.П. Клинико-эпидемиологические особенности злокачественных новообразований кожи на Среднем Урале// Дисс. докт. мед. наук. М., 1999;

18. Мол очков В. А. Кератоакантома и ее трансформация в плоскоклеточный рак. Клиника, патогенез, дифференциальная диагностика, лечение. Особенности краевой патологии// Дисс. докт. мед. наук. — М., 1993;

19. Молочков В.А. Плоскоклеточный рак кожи// Вестник дерматологии и венерологии. 1997. - № 6. - С. 44-48;

20. Молочков В.А., Казанцева И.А., Кунцевич Ж.С., Бочкарева Е.В. Кератоакантома. Клиника, диагностика, лечение, трансформация в рак. — М., 2006;

21. Молочков В.А., Киселев В.И., Рудых И.В., Щербо С.Н. Папилломавирусная инфекция: клиника, диагностика, лечение. М., 2004;

22. Мяделец О.Д., Адаскевич В.П. Морфофункциональная дерматология. М., 2006; ;

23. Писклакова Т.П. Региональный регистр базально-клеточного рака кожи как основа мониторинга, диспансеризации и оптимизации лечения больных// Дисс. докт. мед. наук. — М., 2004;

24. Принцип метода полимеразной цепной реакции//информация с сайта http://www.medigen.ru/9.1.1 .php

25. Скрипкин Ю.К., Мордовцев В.Н. Кожные и венерические болезни. — М., 1999;

26. Снарская Е.С. Иммуноморфологические аспекты патогенеза, дифференциальной диагностики и иммунотерапии язвенной разновидности базальноклеточного и метатипического рака кожи// Дисс. докт. мед. наук. М., 2005;

27. Трапезников Н.Н., Шайн А.А. Онкология. М., 1992;

28. Цветкова Г.М., Мордовцев В.Н. Патоморфологическая диагностика заболеваний кожи. Руководство. — М., 1986;

29. Шанин А.П. Опухоли кожи, их происхождение, клиника и лечение. JL, 1969. -С.269;

30. Actinic Keratosis. Net: American Academy of Dermatology Web site. Available at: http://www.skincarephysicians.com/

31. Alam M., Ratner D. Cutaneous squamous cell carcinoma// N Engl J Med. 2001. — V. 344. - P. 975-983;

32. Antonsson A., Forslund O., Ekberg H., et al. The ubiquity and impressive genomic diversity of human skin papillomaviruses suggest a commensalic nature of these viruses// J Virol. 2000. - V.74. - P. 11636-11641;

33. Arlette J., Trotter M. Squamous cell carcinoma in situ of the skin: history, presentation, biology and treatment// Australas J Dermatol. 2004-V.45 .-P.1-11;

34. Armstrong В., Kricker A. The epidemiology of UV induced skin cancer// J PhotochemPhotobiol. 2001.- V. 63. -P. 8-18;

35. Aroni K., Lazaris A., loakim-Liossi A. et al. Histological diagnosis of cutaneous 'warty' carcinoma on a pre-existing HPV lesion// Acta Derm Venereol. 2000. - V.80. — P. 294-296;

36. Astori G., Lavergne D., Benton C. et al. Human papillomaviruses are commonly found in normal skin of immunocompetent hosts// J Invest Dermatol. 1998. — V. 110. — P. 752-755;

37. Bernard H.-U. The clinical importance of the nonmenclature, evolution and taxonomy of human papillomaviruses// J. Clinical Virology. 2005. — V. 75. - P. 325329;

38. Berkhout R., Bavinck В., ter Schegget J. Persistence of human papillomavirus DNA in benign and (pre)malignant skin lesions from renal transplant recipients// J Clin Microbiol. 2000. - V. 38(6). - P. 2087-96;

39. Biliris К., Koumantakis E., Dokianakis D., et al. Human papillomavirus infection of non-melanoma skin cancers in immunocompetent hosts// Cancer Lett. 2000. - V.161. -P.83-88;

40. Blessing K., McClaren K., Benton E., et al. Histopathology of skin lesions in renal allograft recipients: an assessment of viral features and dysplasia// Histopathology. -1989.-V. 14.-P.129-139;

41. Bosch F., Lorinz A., Munos N., The causal relation between human papillomavirus and cervical cancer// J Clin Pathol 2002. - V. 55. - P. 244-265;

42. Boyle J., McKie R., Briggs J., et al. Cancer, warts and sunshine in renal transplant recipients: a case control study// Lancet. 1984. - V.l. - P. 702-705;

43. Boxman I., Berkhout P., Mulder L., et al. Detection of human papillomavirus DNA in plucked hairs from renal transplant recipients and healthy volunteers// J Invest Dermatol.- 1997.-V. 108.-P. 712-715;

44. Boxman I., Mulder L., Russell A., et al. Human papillomavirus type 5 is commonly present in immunosuppressed and immunocompetent individuals// Br J Dermatol. -1999.-V.141.-P. 246-249;

45. Braun-Falco O., Plewig G., Wolf H., Winkelman R. Dermatologica. 2nd ed.-Berlin: Springer-Verlag, 1991;

46. Butcher R. Malignant potential of keratoacantoma// Laryngoscope. 1979. - Vol. 89. -P. 1092-8;

47. Caldeira S., Zehbe I, Accardi R., Malanchi I., Dong W., et al. The E6 and E7 Proteins of the Cutaneous Human Papillomavirus Type 38 Display Transforming Properties// Journal of Virology. 2003. - Vol. 77 - P. 2195-2206;

48. Caforio A., Forina A., Piaserico S., et al. Skin cancer in heart transplant recipients:risk factor analysis and relevance of immunosuppressive therapy// Circulation 2000. -V. 102.-P. 222-227;

49. Cerroni L., Kerl H. Abberant bcl-2 expression provides a possible mechanism of neoplastic cell growth in cutaneus basal-cell carcinoma// J. Cutan. Pathol. 1994.- V. 21.-P. 398-403;

50. Cooke J., Proby C., Storey A. HPV interference with the DNA damage response identifies viral types that may predispose to skin cancer development// 23rd interanatioal papillomaviruses conference & clinical workshop 2006 Prague, September 1-7. P.77;

51. Derancourt C., Mougia C., Chopard M., et al. Oncogenic human papillomaviruses in extra-genital Bowen disease revealed by in situ hybridization //Ann Dermatol Venereol.- 2001.-V. 128-P. 715-718;

52. Diepgen Т., Mahler V. The epidemiology of skin cancer// Br J Dermatol. 2002. - V. 146. - P. 1-6;

53. Diogenes M., Bomizzo E. Eurtado J. A spoctos evelutiuol observados em 18 cases do keratoacanthoma//An. Brasill. Dermatol. 1985. - Vol. 1. - P. 265-270;

54. Eckert R., Crish J., Balsubramanian S., Rorke F. Transgenic animal models of human papillomavirus-dependent disease// Int J Oncol. 2000. - V. 16. - P. 853-870;

55. Euvrard S., Chardonnet Y., Pouteil-Noble C. Association of skin malignancies with various and multiple carcinogenic and noncarcinogenic human papillomaviruses in renal transplant recipients// Cancer. 1993. - V. 72(7). - P. 2198-206;

56. Favre M., Majewski S., Noszczyk В., Maienfisch F., Рига A., Orth G., Jablonska S. Antibodies to Human Papillomavirus Type 5 are Generated in Epidermal Repair Processes// J Invest Dermatol. 2000. - V. 114. - P.403-407;

57. Favre M., Orth G., Majewski S., et al. Psoriasis, a possible reservoir for human papillomavirus type 5, the virus associated with skin carcinomas of Epidermodysplasia verruciformis// J Invest Dermatol. 1998. - V. 110. - P. 311 -317;

58. Favre M., Majewski S., Noszczyk В., et al. Antibodies to human papillomavirus type 5 are generated in epidermal repair processes// J Invest Dermatol. 2000. — V. 114. — P.403.407;

59. Fife К., Cramer H., et al. Detection of multiple human papillomavirus types in the lower genital tract correlates with cervical dysplasia// J. Medical Virology. 2001. V.64. - P. 550-559;

60. Fisher E., McCoy M., Wechsler H. Analysis of histopathological and electron microscopic determinants of keratoacanthoma and squamous cell carcinoma// Cancer. -1972.-Vol.29. P.1387-1397;

61. Forslund O., Antonsson A., Nordin P., et al. A broad range of human papillomavirus types detected with a general PCR method suitable for analysis of cutaneous tumours and normal skin// J Gen Virol. 1999. - V. 80. - P. 2437-2443;

62. Foslund O., De Angelis P., Beigi M. et al. Identification of human papillomavirus in keratoacanthomas// J.Cutan.Pathol. 2003. - Vol.30. - P. 423-429;

63. Forslund O., Ly H., Higgins G. Improved detection of cutaneous human papillomavirus DNA by single tube nested 'hanging droplet' PCR// J Virol Methods. — 2003.-V. 110(2).-P. 129-36;

64. Franceschi S., Levi F., Randimbison L., La Vecchia C. Site distribution of different types of skin cancer: new aetiological clues// Int J Cancer. 1996. - V. 3. - P. 4-8;

65. Franco E., Rohan Т., Villa L. Epidemiologic evidence and human papillomavirus infection as a necessary cause of cervical cancer// J. Natl. Cancer Inst. 1999. — V. 91. -P. 506-511;

66. Fu F., Cockerell C. The actinic (solar) keratosis: a 21st century perspective// Arch Dermatol. 2003. - V. 139. - P. 66-70;

67. Gallagher R., Hill G., Bajdik C., et al. Sunlight exposure, pigmentary factors, and risk of nonmelanocytic skin cancer// Arch Dermatol. 1995. - V.131 - P. 157-163;

68. Galloway D., Underbrink M., Bedard K. Perez C. Beta-HPV E6 proteins and their role in apoptosis and telomerase activation// 23rd interanatioal papillomaviruses conference & clinical workshop 2006 Prague, September 1-7. P.77;

69. Gassenmaier A., Phister H., Gornstein O. Human papillomavirus 25-related DNA insolitary keratoacanthoma// Arch. Dermatol.Res. 1986. -Vol. 279 - P.73-76;

70. Ghadially F.,Barton В., Kerrige D. The etiology of keratoacanthoma// Cancer. -1963. Vol.16. -P.603-611;

71. Glass A., Hoover R. The emerging epidemic of melanoma and squamous cell skin cancer// JAMA. 1989. - V. 262. - P. 2097-2100;

72. Glogau R. The risk of progression to invasive disease// J Am Acad Dermatol. 2000. - V.42. - P.23-24;

73. Glover M., Niranjan N., Kwan J., Leigh I. Non-melanoma skin cancer in renal transplant recipients: the extent of the problem and a strategy for management// Br J Plastic Surg. 1994. - V.47. - P. 86-89;

74. Goldenhersh M., Olsen T. Invasive squamous cell carcinoma initially diagnosed as a giant keratoacanthoma// J. Am. Acad. Dermatol. 1984. - Vol. 10. - P. 372-378;

75. Grossman D., Lefell D. The molecular basis of non-melanoma skin cancer: new understanding// Arch Dermatol. 1997. - V. 133. - P. 1263-1270;

76. Haagsma E., Hagens V., Schaapveld M., et al. Increased cancer risk after liver transplantation: a population-based study// J Hepatol. 2001. - V.34. - P.84-91;

77. Haber J. Cellular immunopathology in Cutaneus oncology// Miller and Maloney. — Oxford. 1998. - P. 599-601;

78. Han R., Cladel N., Reed C., et al. DNA vaccination prevents and/or delays carcinoma development of papillomavirus-induced skin papillomas on rabbits// J Virol. 2000. — V. 74.-P. 9712-9716;

79. Harwood C., Surentheran Т., McGregor J., et al. Human papillomavirus infection and non-melanoma skin cancer in immunosuppressed and immunocompetent individuals// J Med Virol. 2000. - V. 61. - P. 289-297;

80. Harwood C., Spink P., Surentheran Т., et al. Degenerate and nested PCR; a highly sensitive and specific method for the detection of human papillomavirus infection in cutaneous warts// J Clin Microbiol. 1999. - V. 37. - P. 3545-3555;

81. Harwood C., McGregor J., Proby C. et al. Human papillomavirus and the development of non-melanoma skin cancer// J Clin Pathol. 1999. -V.52.- P.249-253;

82. Harwood C., Proby C. Human papillomavirus and non-melanoma skin cancer// Current Opin Infect Disease. 2002. - V. 15.- P.l01-114;

83. Harwood C., Spink P., Surentheran Т., et al. Detection of human papillomavirus

84. DNA in PUVA-associated non-melanoma skin cancers// J Invest Dermatol. 1998. -V.lll.-P. 123-127;

85. Heid C. Real-time quantitative PCR// Genome Res. 1996. - V.6. - P.986-994;

86. Herman J. Epigenetic changes in cancer and preneoplasia// Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 2005. - V.70. - P. 329-33;

87. Herrigton C., Evans M., Hallan N. et al. Human papillomavirus status in prediction of high grade cervical neoplasia in patients with persistent low- grade cervical cytological abnormalities// Br. J. Cancer. 1995. - V. 71. - P. 206-209;

88. Higuchi R Kinetic PCR Analysis: Real-time monitoring of DNA amplification reactions//J Biotechnology. 1993.-V.ll. - P. 1026-1030;

89. Holcomb S. Nonemelanoma skin cancer// Nursing. 2006. - V.36(6). - P.56-7;

90. Holme S., Malinkovsky K., Roberts D. Changing trends in non-melanoma skin cancer in South Wales, 1988-98//Br J Dermatol. -2000.- V. 143. P. 1211-1216;

91. Hopfil R., Schir M., Fritsch P. Keratoacanthomas: human papillomavirus associated?//Arch. Dermatol.-1992.-Vol.128. P.563-564;

92. Hsi E. et al Detection of human papilloma virus DNA in keratoacanthomas by polymerase chain reaction// Am J Dermatol. 1997. - Vol.19. - P.10; ; '

93. Hundeiker R. Klinische varianten der keratoacanthoma// Z. Hantkrz. 1978. - V. 53. -P. 563-571;

94. Jablonska S., Majewski S. On the immunopathogenesis of psoriasis// Arch Dermatol. -2001.-V.137.-P. 229-230;

95. Jackson S., Storey A. E6 proteins from diverse cutaneous HPV types inhibit apoptosis in response to UV damage// Oncogene. 2000. - Vol. 19. - P. 592-598.

96. Jackson S., Ghali L., Harwood C., Storey A. Reduced apoptotic levels in squamous but not basal cell carcinomas correlates with detection of cutaneous human papillomavirus// British Journal of Cancer. 2002. - V. 87 - P. 319 - 323;

97. Kern W., McCray M. The histopatologic differentiation of keratoacanthoma and squamous cell carcinova of the skin// J. Cutan. Pathol. 1980. - Vol. 7. - P. 318-325;

98. Kiviat N. Papillomaviruses in non-melanoma skin cancer: epidemiological aspects// Semin Cancer Biol. 1999. - V. 9. - P.397-403;

99. Lampert A., Pauwels C., Duboucher C., et al. Detection of human papillomavirus in cutaneous extragenital Bowen's disease in immunocompetent patients// Ann Dermatol Venereol. 2000. -V. 127. - |P.40-45;

100. Lee S., Kang D., et al. Multiple HPV infection in cervical cancer screened by HPV DNA Chip//Cancer Lett. 2003. - V.20. - P.187-192;

101. Leigh Goedert J.J. Infectious causes of cancer: targets for intervention//- Humana Press Inc. Totowa-New Jersey. - 2000. - P. 289-309.

102. Levers histopathology of the skin 8-th-ed// Lippincott-Raven. -Philadelphia-New York.- 1999.-P. 1051-1059;

103. Lindelof В., Sigurgeirsson В., Gabel H., Stern R. Incidence of skin cancer in 5356 patients following organ transplantation// Br J Dermatol. 2000. - V. 143 - P. 614-618;

104. Li Y., Chen G., Dong X., Chen H. Detection of epidermodysplasia verruciformis-associated human papillomavirus DNA in nongenital seborrhoeic keratosis // Br J Dermatol. 2004.-V.151(5)-P.l060-5;

105. Lober В. Actinic keratosis is squamous cell carcinoma// South Med J. 2000; — V.93. - P.650-655;

106. Magee K. et al. Human papillomavirus associated with keratoacanthomas// Arch. Dermatol.-1989. Vol.125.-P.1587-92;

107. Majewski S., Jablonska S. Epidermodysplasia verruciformis as a model of human papillomavirus-induced genetic cancer of the skin// Arch Dermatol. 1995. -V. 131. — P. 1312-1318;

108. Marales-Ducret C., Van de Rijn M. et al. Bcl-2 expression in primary malignancies of the skin//Arch. Dermstol. 1995. - Vol.131. - P. 909-912;

109. Martin J. Scientific American Molecular Neurology// Nature medicine. 1999. - Vol 5.-P. 479-480;

110. Marshall S., Bordea C., Wojnarowska F., et al. P53 codon 72 polymorphism andsusceptibility to skin cancer after renal transplantation// Transplantation. 2000. — V. 69.-P. 994-996;

111. McGregor J., Berkhout R., Rozycka M., et al. P53 mutations implicate sunlight in posttransplant skin cancer irrespective of human papillomavirus status// Oncogene. -1997.-V.15-P. 1727-1740;

112. Meyer Т., Arndt R., Christophers E. et al.Frequency and distribution of HPV types detected in cutaneous squamous-cell carcinomas depends upon the HPV detection system: a comparison of four PCR assays// Dermatology -2000. -V. 201.-P. 204-211;

113. Meyer Т., Arndt R., Nindl I., Christophers E. Importance of human papillomaviruses for the development of skin cancer// Cancer Detect. Prev. 2001. - 25(6). - P.533-47;

114. Michelle S. Longworth A., Lamonis A. Pathogeneis of human papillomaviruses in differentiating epithelia// J Microbiology rew. 2004. - V. 68 (2). - P. 362-372;

115. Mitsuishi Т., Kawahima M., Matsukura Т., Sata T. Human papillomavirus type 58 in Bowen's disease of the elbow// Br J Dermatol. 2001. - V.144 -P.384-386;

116. Molijn A., Kleter В., Quint W., Doom L. Molecular diagnosis of human papillomavirus (HPV) infections// J Clin. Virology. 2005. - V.32. - P.43-51;

117. Monsonegro J. Emerging issues on HPV infections: from science to practice. Basel, Karger - 2006;

118. Moy R. Abido J., Benneth R. T- lymphocyte subpopulation in patients with basall cell carcinoma// Clin Res. 1986. - V. 34. - P. 162-167;

119. Munoz N., Bosch X. et al. Epidemiologic classification of Human Papillomavirus types associated with cervical cancer// New England J. of medicine. 2003. — V.348. -P. 518-527;

120. Munoz N. Human papillomavirus vaccines and their potential use in the prevention and treatment of cervical neoplasia// New developments in cervical cancer screening and prevention. 1997. - P.425-431;

121. Nagano Т., Ueda M., Ichihashi M. Expression of p53 protein is an early event in ultraviolet light-induced cutaneous squamous cell carcinogenesis// Arch Dermatol. -1993. V.129. -P.l 157-1161;

122. Naldi L., Fortina A., Lovati S., et al. Risk of nonmelanoma skin cancer in organ transplant recipients: a registry-based study// Transplantation. 2000. - V. 70 - P. 14791484;

123. Neubauer О. Arsenical cancer. A review// Br J Cancer. 1947. V. 1:192.

124. Nguyen Т., Ho D. Nonmelanoma skin cancer// Curr Treat Options Oncol. 2002. — V.3. -P.193-203;

125. Pincus H., Actinic keratoses actinic skin// Cancer of the skin: biology-diagnosis-management. - Philadelphia: W. B. Saunders. - 1976. - P. 437-457;

126. Pfister H. HPV in skin cancer. Comments on the IARC international evaluation// HPV today. -2005.-V. 7.-P. 11;

127. Pfister H., ter Schegget J. Role of HPV in cutaneous premalignant and malignant tumours// Clin Dermatol. 1997. - V. 15. - P. 335-347;

128. Phister H., Gassenmaier A., Fuchs P. Demonstration of human papillomavirus DNA in two keratoacanthomas// Arch. Dermatol.Res. 1986. - Vol. 278. - P.243-246;

129. Pfister H., Fuchs P., Majewski S., Jablonska S., et al High prevalence of epidermodysplasia verruciformis-associated human papillomavirus DNA in actinic keratoses of the immunocompetent population// Arch Dermatol Res. 2003. - V. 295(7).-P. 273-79;

130. Proby C., Storey A., McGregor J. Does human papillomavirus infection play a role in non-melanoma skin cancer?// Papillomavirus Report. 1996. - V. 7. - P.53-60;

131. Proby C., Purdie K., Sexton C., et al. Spontaenous keratinocyte cell lines representing early and advanced stages of malignant transformation of the epidermis// Exp Dermatol. 2000. — V. 9. -P.104-117;

132. Purdie К., Sexton С., Proby С., et al. Malignant transformation of cutaneous lesions in renal allograft patients: a role for human papillomavirus// Cancer Res. 1993. - V. 53. — P. 5328-5333;

133. Ramoz N., Taieb A., Rueda et al. Evidence for a nonallelic heterogeneity of epidermodysplasia verruciformis with two susceptibility loci mapped to chromosome regions 2p21-p24 and 17q25//J Invest Dermatol. 2000.-V. 14-P. 1148-1153;

134. Ramsey H., Fryer A., Reece S., et al. Clinical risk factors associated with nonmelanoma skin cancer in renal transplant recipients// Am J Kidney Dis. 2000. - V. 36 -P. 167-176;

135. Reizner G., Chuang Т., Elpern D., Stone J., Farmer E. Bowen's disease (squamous cell carcinoma in situ) in Kauai, Hawaii. A population-based incidence report// J Am Acad Dermatol. 1994.-V. 31.-P.596-600;

136. Rodrigo A., Goracke P., Rowhanian K., et al. Quantitation of target molecules from PCR-based limiting dilution assays// AIDS Res. Human. Retrovir. 1997. - Vol. 13. — P. 737-742; := '

137. Ruhland A., de Villiers E. Opposite regulation of the HPV 20-URR and HPV 27-URR promoters by ultraviolet irradiation and cytokines// Int J Cancer 2001. - V. 91 - P. 828-834;

138. Rust A., McGovern R., Gostout В., et al. Human papillomavirus in cutaneous squamous cell carcinoma and cervix of a patient with psoriasis and extensive ultraviolet radiation//J Am Acad Dermatol. 2001.-V.44 - P. 681-686;

139. Sahl W., Snow S., Levine N. Giant basal cell carcinoma. Report of two cases and review of literature// J Am Acad Dermatol. 1994. - V.30 - P. 856-9;

140. Severson J., Evans Т., Lee P., et al. Human papillomavirus infections: epidemiology, pathogenesis, and therapy// J Cutan Med Surg. 2001. - V.5 - P. 43;

141. Scrivener Y., Grosshans E., Cribier B. Variations of basal cell carcinomas according to gender, age, location and histopathological subtype// Br J Dermatol. -2002. V. 147 -P.41-47;

142. Schaper I., Marcuzzi G., Weissenbom S. et al. Development of skin tumors in mice transgenic for early genes of human papillomavirus type 8// Cancer Res. -2005 — V.65(4). -P.1394-400;

143. Schwartz R. Keratoacanthoma// J. Am. Acad. Dermatol. 1994. - Vol.30. - P.l-19;

144. Silverman M., Kopf A., Grin C., Bart R. Recurrence rates of treated basal cell carcinomas// J. Dermatol. Surg. Oncol. 1991. -V. 17. - P. 713-718;

145. Shamanin V., Glover M., Rausch C., et al. Specific types of human papillomavirus found in benign proliferations and carcinomas of the skin in immunosuppressed patients// Cancer Res. 1994. - V. 54 - P.4610-4613;

146. Shamanin V., zur Hausen H., Lavergne D., et al. HPV infections in nonmelanoma skin cancers from renal transplant recipients and non-immuno-suppressed patients// J Natl Cancer Inst. 1996. - V.88 - P.802-811;

147. Sharp D. Quantative use of the electron microscope in virus research. Methods fiid recent results of particle counting// Lab. Invest. 1965. - V.14. - P. 831-863;

148. Shope R. A filtrate virus causing a tumor like conditions in rabbits and its relationship to virus myxomatosum// J. Exp. Med. 1932. - 56. - P.803-822;

149. Snijders P. Chris J. The value of viral load in HPV detection in screening // HPV today.-2006.-V.8.-P. 8-9;

150. SolerC., Chardonnet V., Eurard S. et al. Evaluation of human papillomavirus type 5 on frosen sections of multiple lesions from transplant recipients with hybridization and isotopic problem// Dermatology. 1992. -Vol. 184. - P.248-253;

151. Spence A., Franco E., Ferenczy A. The role of human papillomavirus in cancer: evidence to date// J Amn Cancer. 2005. - V. 4 - P. 49-64;

152. Stark S., Petridis A., Ghim S., et al. Prevalence of antibodies against viruslike particles of Epidermodysplasia verruciformis-associated HPV8 in patients at risk of skin cancer// J Invest Dermatol. 1998. - V.l 11 - P. 696-701;

153. Sterling J. Human papillomaviruses and skin cancer// J Clin Virol. 2005 - V. 32. -P. 67-71;

154. Stockfelth E., Meinke В., Arudt R. Identification of DNA sequences of both genital and cutaneous HPV types in a small number of keratoacanthomas of immunosuppressed patients//Dermatology. -1999. -Vol. 198.- P.122-125;

155. Stockfleth E., Meyer Т., Benninghoff В., Christophers E. Successful treatment ofactininc keratoses with imiquimod cream 5%: a report of six cases// Br J Dermatol. -2001.-V.144-P. 1050-1053;

156. Storey A., Thomas M., Kalita A., et al. Role of p53 polymorphism in the development of human papillomavirus-associated cancer// Nature. 1998. - V. 393. - P. 229-234;

157. Termorshuizen F., Feltkamp M., Struijk L., Frank R. de Gruijl et al. Presence of Human Papillomavirus DNA in Plucked Eyebrow Hairs Is Associated with a History of Cutaneous Squamous Cell Carcinoma// J Invest Dermatol. 2004. — Vol. 122:6. -P.1456-1462;

158. Tolbert PE. Oils and cancer. // Cancer Causes Control. 1997. - 8:386-405.

159. Traenkle H. X-ray induced skin cancer in man//Natl Cancer Inst. 1963. - V. 10. - P. 423-27;

160. Trowell H., Dyall-Smith M. et al//Human papillomavirus associated with keratoacanthomas in Australian patients// Arch. Dermatol. 1990.-Vol.126. - P.1654;

161. Tsambaos D., Monastirli A., Kapranos N., Georgiou S., Detection of human papillomavirus DNA in nongenital seborrhoeic keratoses// Arch Dermatol Res.- 1995. — V. 287(6). -P. 612-5;

162. Staak V., Bergers A. Intranuclear particles in keratoacanthoma: possible association with malignant degeneration// Dermatologica. 1979. — Vol.158. - P.413-416;

163. Visscher JG, van der Val JE Stazink TM Giant keratoacanthoma of the lower lip// Oral Surg. Med. Oral Pathol. Oral. Radiol. 1996 - Vol. 81. - P. 143-146;

164. Viviano E., Sorce M., Mantegna M. Solitare keratoacanthoma in immunocompetents: no detection of papillomavirus DNA by polimerase chain reaction// New Microbiol. -2001. Vol.24.-P.295-297;

165. Walboomers J., Jacobs M., Manos M. Human papillomaviruses is necessary cause of invasive cervical cancer worldwide// J Pathol. 1999. - V. 189 (1). - P. 12-19;

166. Walder В., Robertson M., Jeremy D. Skin cancer and immunosuppression//:Lancet. -1971. V.ll. -P.1282-1283;

167. Weissenborn S., Funke A., Helmich M., et al. DNA loads of oncogenic human papillomaviruses are strongly elevated in HIV-positive women with high grade cervical lesions// J. Clin. Microbiol. 2003. - Vol. 41. - P. 2763-2767;

168. Weissenborn S., Nidi I., Purdie K., et al. Human papillomavirus-DNA-loads in actinic keratoses exceeded those in non-melanoma skin cancer// J. Invest. Dermatol. -2005.-Vol. 125.-P. 93-97;

169. Wieland U., Ritzkowksy A., Stoltidis M., et al. Papillomavirus DNA in basal cell carcinomas of immunocompetent patients: an accidental association// J Invest Dermatol. -2000. -V.l 15 P. 124-128;

170. Weimar V., Ceilley R. Aggressive biological behavior of basal and squamous cell carcinoma in patients with chronic lymphocytic leukemia or chronic lymphocyticlymphoma// J. Dermatol. Surg. Oncol. 1979. - V.5. - P. 331-338;i

171. Weimin Q., Jiang G. et al. PCR Detection of Human Papillomavirus: Comparison between MY09/MY11 and GP5+/GP6+ primer system// J. of Clinical Virology. 1997.-V.35 P.1304-1310;

172. Zelickson A., Linch F. Electron microscopy of virus-like particles in keratoacanthoma// J. Invest. Dermatol. 1961. - V. 37. - P. 79-83;

173. Zur Hausen H. Papillomavirus infections: a major cause of human cancers// Biochim Biophys Acta. 1996. - V.1288. - P/.55-78;

174. Zur Hausen H. Papillomaviruses causing cancer: evasion from host-cell control in early events in carcinogenesis// J Natl Cancer Inst. 2000. - V.92 - P. 690-698;